JP2003502633A

JP2003502633A - ポリマーを識別するための方法および装置

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Publication number: JP2003502633A
Application number: JP2001503506A
Authority: JP
Inventors: ウォルフベルトリンク; イエルクハスマン
Original assignee: ノヴェンバーアクティエンゲゼルシャフトゲゼルシャフトフューアモレクラーレメディツィーン
Priority date: 1999-06-14
Filing date: 2000-06-10
Publication date: 2003-01-21
Also published as: DE50011693D1; DE19927051C2; ATE310948T1; WO2000077496A1; CA2371710A1; DE19927051A1; EP1188042A1; US7067253B1; EP1188042B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、電磁波を反射する第１のフェーズ（５）に結合される第１のポリマー（４、７）を識別するための方法に関する。前記方法は、以下のステップを含む：ａ）前記第１のポリマー（４、７）を、電磁波を透過する固体第２のフェーズ（１）に金属クラスタ（２）を介して結合される第２のポリマー（３、８）に接触させ、ｂ）前記第２のフェーズ（１）に対して電磁波を照射し、ｃ）反射された前記電磁波の特性の変化を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、電磁波を反射する第１のフェーズに結合される第１のポリマーを識
別するための方法および装置に関する。

【０００２】国際公開番号ＷＯ９８／４８２７５は、核酸、タンパク質、およびそれらの配
位子を検出するために用いることができる光学センサを開示している。検出のた
めには、光学センサは、たとえば、核酸を含んだ溶液に少し浸される。センサは
、洗浄および乾燥後、その光学特性について判断可能となる。既知のセンサを用
いたこの方法は、数段階の処理を必要とするものであり、時間がかかる。

【０００３】国際公開番号ＷＯ９７／０４１２９は、核酸配列を検出する方法を開示してい
る。この方法では、第１の核酸配列が、固体表面に固定化される。特定の条件下
において、表面を検出する方法を用いて、第２の相補的核酸とのハイブリダイゼ
ーションが検出される。

【０００４】国際公開番号ＷＯ９１／０２９８１は、表面プラズモン共鳴分光法を用いて検
体を検出する方法を説明している。この場合も、検体は、金属表面に固定化され
る。したがって、検出のためには、検体は、溶液に接触するようにしなければな
らない。

【０００５】さらに、米国特許第５，４８５，２７７号は、表面プラズモン共鳴分光法を行
うセンサを開示している。当該センサは、多数の反射面を有する平面波導体を有
する。

【０００６】本発明の目的は、先行技術の不利な点をなくすことにある。特に、本発明は、
固体フェーズに結合するポリマー、特に生化学分子を迅速かつ容易に検出するの
に用いることができる方法および装置に関する。

【０００７】この目的は、請求項１および１５の特徴によって達成される。本発明の好適な
改良は、後続の請求項２〜１４および１６〜２８の特徴に示されている。

【０００８】本発明によれば、電磁波を反射する第１のフェーズに結合される第１のポリマ
ーを識別するための方法が提供される。本方法は、以下のステップを含む：ａ）第１のポリマーを、電磁波を透過する固体第２のフェーズに金属クラスタを
介して結合されかつ第１のポリマーに対して親和性を有する第２のポリマーに接
触させ、ｂ）第２のフェーズに対して電磁波を照射し、ｃ）反射した電磁波の特性の変化を検出する。

【０００９】本発明に係る方法によれば、検出すべきポリマー、たとえば生化学分子は、必
ずしも溶液中に存在する必要はない。たとえば、ラベリング目的のために、バン
クノートのような固体に結合されうる。電磁波を透過する第２のフェーズに接触
させて、反射光の光学特性を測定するだけで、検出すべきポリマーが第１の固体
フェーズに結合するかどうかを即座に決定することができる。本方法は、迅速か
つ簡単に行うことができる。

【００１０】利点として、用いられる電磁波は、光、好ましくはレーザ光からなる。反射光
の特性は、特に簡単な方法で決定することができる。

【００１１】測定される特性の変化は、第１および第２のポリマーが接触する前および／ま
たは後の所定のスペクトラムにおける吸収であってもよい。さらに、単色光を用
いる場合には、測定される特性の変化は、スペクトルシフトであってもよい。さ
らに、測定される特性の変化は、第１および第２のポリマーが接触および／また
は分離するときの吸収および／または反射についての経時的な変化であってもよ
い。特性の変化は、互いに異なる数個の入射角で測定されてもよい。反射光の特
性についての他の変化を測定することを想定することもできる。どの変化を測定
するかは、所定の状況による。

【００１２】金属クラスタは、第２のフェーズ上に直接蒸着被膜されてもよいし、または第
２のポリマーから形成される層を介して第２のフェーズに結合されてもよい。第
２のポリマーから形成される層は、第２のフェーズの表面に塗布されてもよい。
第２のポリマーは、たとえば、ポリ（Ｄ−グルコサミン）であってもよい。第１
のポリマーから形成される少なくとも１つの層が、表面に塗布された層と金属ク
ラスタに結合される層との間に介在してもよい。第１と第２のポリマーからなる
層配列も、介在していてもよい。そのような層配列があれば、特に明確かつ迅速
に識別することが可能な信号を形成するのに役立つ。第１のポリマーから形成さ
れた層が、第１のフェーズの表面に塗布されてもよい。当該表面は、金属の酸化
層から形成されてもよく、たとえば、アルミニウム酸化層から形成される。第１
および第２のポリマーから形成される層配列が、当該表面に与えられてもよく、
それにより、最も外側の層や当該表面に結合される層が、第１のポリマーから形
成されることが可能となる。第１のポリマーは、たとえばポリアクリル酸（＝Ｐ
ＡＡ）であってもよい。

【００１３】ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、またはそれらの合成類似体、タン
パク質、ペプチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはそれらの配位子、ポリアクリ
ル酸、ポリ（Ｄ−グルコサミン）、ならびにポリエチレンイミンなどのようなポ
リヌクレオチド分子が、第１および／または第２のポリマーとして好適に用いら
れる。原理的には、組み換え特性を有するすべての生化学分子が特に適している
。

【００１４】文字ａで示すステップにおいて、第１のフェーズに結合される少なくとも１つ
のさらなるポリマーも、第２のポリマーに接触させるようにしてもよい。これに
よって、複数の識別実験を同時に行うことができる。よって、ポリマーを用いて
、たとえば第１のフェーズの表面上に、たとえばバーコードや同様のパターンを
形成してもよい。

【００１５】本発明によれば、電磁波を反射する第１のフェーズに結合される第１のポリマ
ーを識別するための装置において、第１のポリマーに対して親和性を有する第２
のポリマーが、電磁波を透過する第２のフェーズの表面に、金属クラスタを介し
て結合される。

【００１６】本発明に係る装置は、第１のポリマーを迅速かつ簡単に識別できる。用いられ
た電磁波の特性を測定するために、装置を洗浄したり乾燥したりする必要はない
。親和性とは、ポリマーが、相互作用によって、結合または連合状態となること
ができることを意味するものとして理解される。このような結合は、たとえば、
水素結合、イオン結合、疎水結合、または共有結合であってもよい。他の適切な
結合としては、複合結合や、ステアリン効果から誘導される結合がある。たとえ
ば、ＤＮＡなどのような、互いに相補的であって生体分子に存在する系統は、互
いに親和性があると見なされる。よって、これらは、ハイブリット化が可能であ
る。

【００１７】金属クラスタを形成するには、銀、金、アルミニウム、銅、またはインジウム
を用いるのが好適であることがわかった。ポリマーは、これらの金属に対して、
特によく結合する。

【００１８】電磁波として、光、特にレーザ光を用いることが可能である。利点として、第
２のフェーズは、透明な物質、たとえばプラスチックまたはガラスなどから生成
される。第１および／または第２のポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、
ペプチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはそれらの配位子、ポリアクリル酸、
ポリ（Ｄ−グルコサミン）、もしくはポリエチレンイミンであってもよい。しか
しながら、用いられるポリマーは、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、またはそれらの合
成類似体であってもよい。

【００１９】反射光の光学特性を決定するため器具が、本装置の付加的構成要素として備え
られていてもよい。本器具は、第１および第２のポリマーが接触する前および／
または後の所定のスペクトラムにおける吸収を測定するために用いられてもよい
。さらに、本器具は、反射光のスペクトルシフトを測定するために用いられても
よい。

【００２０】好適には、本器具は、互いに異なる数個の入射角における光学特性を測定する
ために用いられてもよい。

【００２１】金属クラスタは、第２のポリマーから形成される層を介して第２のフェーズに
結合されてもよい。さらに、第２のポリマーから形成された層は、第２のフェー
ズの表面に塗布されてもよい。好適には、第１のポリマーから形成される少なく
とも１つの層も、当該表面上に与えられた層と金属クラスタに結合される層との
間に介在する。第１のポリマーから形成される層が、第１のフェーズの表面に塗
布されてもよく、および／または第２のポリマーから形成される層が、当該表面
上に与えられた層に塗布されてもよい。上記の層の複合体により、ラベリングが
可能となり、また、ラベルを簡単かつ迅速に識別することが可能となる。

【００２２】以下に、図面に示されている実施例を用いて、本発明をより詳細に説明する。
図面において、

【００２３】図１は、装置の模式図を示し、

【００２４】図２は、ハイブリッド化がない場合の、図１に係る装置を示し、

【００２５】図３は、ハイブリッド化がある場合の、図１に係る装置を示し、

【００２６】図４は、他の装置の模式図を示し、

【００２７】図５は、ラベルの検出を示す。

【００２８】図１〜３において、第２の固体フェーズが、たとえばガラス支持体１から生成
される。金属クラスタ２は、たとえば金クラスタであって、ガラス支持体１の一
方表面に存在する。一本鎖ＤＮＡ３は、第２のポリマーとして、クラスタ２に結
合する。他の一本鎖ＤＮＡ４は、第１のポリマーとして、金属片５に結合する。
そして、金属片５は、たとえばラベリング目的のために、バンクノート（ここで
は図示せず）に固定されてもよい。

【００２９】ＤＮＡ３と他のＤＮＡ４との接触について、２つの場合に分けられる。

【００３０】図２に示す第１の場合において、ＤＮＡ３は、他のＤＮＡ４に対して相補的で
ない。ハイブリダイゼーションは生じない。第１の距離ｄ₁が、クラスタ２によ
って形成された層と金属片５との間に生じる。

【００３１】図３に示す第２の場合において、ＤＮＡ３は、他のＤＮＡ４に対して相補的で
ある。ＤＮＡ３と他のＤＮＡ４とは、ハイブリッド化する。より短い第２の距離
ｄ₂が、クラスタ２によって形成された層と金属片５との間に生じる。

【００３２】ガラス支持体１を通って入射するレーザ光（ここでは図示せず）は、金属片５
によって（欠文）において反射される。反射光の特性は、金属片５からクラスタ
２によって形成された層までの距離ｄ₁またはｄ₂に基づく。よって、たとえば吸
収が変化する。この吸収を測定すれば、簡単な方法で、ハイブリダイゼーション
があるか否かを決定することが可能である。これにより、第１のポリマー４を識
別することができる。

【００３３】図１〜３に示す光学検出器を製造するためには、ガラス支持体１に金を付着さ
せる。このために、ガラス支持体１を真空室に吊し、そこにおいて、同時に金箔
を載置する。真空室を１０^-2ｍｂａｒまで減圧してから、アルゴンガスを注入し
た後に、真室の圧力を１０^-1ｍｂａｒに調節する。その後、プラズマを点火する
と、金の原子が箔から放出される。金の原子は、ガラス支持体１の表面に付着す
るようになる。スパッタ電流４０ｍＡにおいて、厚さ約５ｎｍの金薄膜が、約１
０秒で形成される。その後、金薄膜は約２００度で処置される。所望の色補力効
果（ｃｏｌｏｒｉｎｔｅｎｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔ）に適した、
球状の金クラスタ２が形成される。その後、金クラスタ２によって被膜されたガ
ラス支持体１を、チオール基が５’末端に与えられたオリゴヌクレオチド３を含
む溶液に少し浸す。オリゴヌクレオチド３は、チオール結合の形成によって、金
クラスタ上に沈澱する。

【００３４】たとえば、アルミニウム基板５が、参照符号４および５によって示されるサン
プルを生成するために用いられる。アルミニウム基板５に対して、たとえば、３
００ｍＡ、５０Ｖの５％シュウ酸に浸けるといった規定の電気化学的酸化を施す
ことによって、アルミニウム基板５を、溶液に段階的にさらに深く浸けることに
よって、異なる厚みを有する酸化層が生成される。干渉効果の結果、これらの酸
化層は、異なる色となる。

【００３５】アミノ基が５’末端に与えられた他のオリゴヌクレオチド４を共有結合させる
ためには、酸化層は、フリーのアミノ基を有する層によって被膜される。このた
め、アルミニウム基板５を、約３０分間、ｐＨが約９で約１０％のアミノプロピ
ルトリエトキシシラン水溶液に浸す。その後、アルミニウム基板は、水で洗浄さ
れ、約８０℃の乾燥炉で約１時間乾燥される。

【００３６】このようにして生成されたシラン処理後のアルミニウム基板５を、５０ｍｍｏ
ｌのＮａＣＮＢＨ₃／ｌを含む２．５％グルタルアルデヒド溶液中にて、１２時
間培養する。その後、水で完全に洗浄する。

【００３７】他のオリゴヌクレオチド４に対して結合させるために、アルミニウム基板５を
、１μｍｏｌ／１の濃度の他のオリゴヌクレオチド４と、０．１倍リン酸緩衝食
塩水と、５０ｍｍｏｌのＮａＣＮＢＨ₃／ｌとを含む緩衝液中にて、４℃で一晩
培養する。その後、アルミニウム基板５を再び水で完全に洗浄する。そうすると
、面上に、共有結合された他のオリゴヌクレオチド４があるようになる。

【００３８】他の詳細に関して、特にクラスタ２の大きさと距離パラメータについては、読
者は国際公開番号ＷＯ９８／４８２７５を参照されたい。本引用文献の開示内容
は、本願に合体される。

【００３９】ＤＮＡ３または検出用オリゴヌクレオチドと、他のＤＮＡ４またはラベリング
用オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出するために、ガラス支
持体１と、金属片５、たとえば上述の方法によって準備されたアルミニウム基板
とを圧着する。反射アルミニウム表面と金クラスタ２との間の距離の違いから、
特徴的な色パターンを認識することができる。これによって、ラベリング用オリ
ゴヌクレオチドと検出用オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションが
あるか否かを判断することができる。

【００４０】図４は、本発明の他の実施例を示す。酸化アルミニウム層６が、アルミニウム
を加工した金属片５上に置かれる。酸化アルミニウム層６は、ＰＡＡ層７によっ
て被覆される。この上面には、ポリ（Ｄ−グルコサミン）層８がくる。ＰＡＡと
ポリ（Ｄ−グルコサミン）とからなるこのような層配列が、数層与えられる。最
上層は、ＰＡＡ層７によって形成される。

【００４１】検出器は、基板を形成するガラス支持体１からなる。その表面には、ポリ（Ｄ
−グルコサミン）層８が置かれる。その上部には、ＰＡＡ層７が置かれる。ポリ
（Ｄ−グルコサミン）８とＰＡＡ７とからなるこのような層配列が、数層与えら
れる。金クラスタ２は、ポリ（Ｄ−グルコサミン）層８に表面付近で結合する。
この上には、さらにポリ（Ｄ−グルコサミン）層８が置かれる。試験目的のため
に、この層の一部が、ＰＡＡ層７に重ね合わされる。

【００４２】被膜アルミニウム片５を生成するには、後者を、ポリアクリル酸を含む溶液と
ポリ（Ｄ−グルコサミン）溶液とに交互に浸けることによって被膜する。各場合
において、被膜時間は１５分間で、溶液濃度は、０．５ｇ／ｌである。金クラス
タ２で被膜するには、検出器を、直径２５ｎｍの金クラスタを約０．４％含む溶
液に浸す。金クラスタ２は、吸着により結合する。その後、金クラスタが圧着し
て層配列となるように、検出器を再びポリ（Ｄ−グルコサミン）溶液に浸す。こ
の方法がうまくゆくことを検出するために、検出器の半分程度をＰＡＡに少し浸
す。このようにして、検出器の一部が、ＰＡＡ層７によって被膜される。

【００４３】上記の機構において、明確にするために、ラベルが検出器に与えられる。実際
には、ラベルは、類似の方法によって、サンプルに与えられる。

【００４４】図５は、環状検出器が被膜された酸化アルミニウム基板５と接触していること
を示す。この図において、左上から右下に境界線が認められる。明るい領域は、
ポリ（Ｄ−グルコサミン）層８によって被膜された検出器の領域に対応する。暗
い領域は、表面にＰＡＡ層７を有する検出器の部分に対応する。検出器上のＰＡ
Ａ層７の表面と、基板のＰＡＡ層７との斥力による相互作用によって、アルミニ
ウム基板５上のＰＡＡ層７と作用し合う層である、検出器上のポリ（Ｄ−グルコ
サミン）層８の接触領域とは異なる光の反射が生じる。その結果、たとえばＰＡ
Ａやその他のポリマー、特に生体高分子から形成され、かつアルミニウム基板５
に塗布されるラベルが検出器に対して親和性を有するかどうかを、明確に識別す
ることが可能となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ベルトリンクウォルフドイツ連邦共和国エルランゲン 91056 マイゼンヴェーク 22 (72)発明者ハスマンイエルクドイツ連邦共和国エルランゲン 91052 ホフマンシュトラーセ 118ａＦターム(参考） 2G045 BB21 DA13 DA36 FA12 GC11 2G059 AA05 BB08 BB12 BB15 CC16 EE02 EE12 FF04 GG01 4B029 AA07 AA23 BB15 BB20 FA15

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】電磁波を反射する第１のフェーズ（５）に結合される第１の
ポリマー（４、７）を識別するための方法であって、以下のステップを含む：ａ）前記第１のポリマー（４、７）を、電磁波を透過する固体第２のフェーズ
（１）に金属クラスタ（２）を介して結合され、かつ前記第１のポリマー（４、
７）に対して親和性を有する第２のポリマー（３、８）に接触させ、ｂ）前記第２のフェーズ（１）に対して電磁波を照射し、ｃ）反射された前記電磁波の特性の変化を検出する。
【請求項２】光，好ましくはレーザ光を前記電磁波として用いることを特
徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】測定される前記特性変化は、前記第１のポリマー（４、７）
が前記第２のポリマー（３、８）に接触する前および／または後の所定のスペク
トラムにおける吸収であることを特徴とする、上記請求項のいずれかに記載の方
法。
【請求項４】単色光を用いる場合は、測定される前記特性変化は、スペク
トルシフトであることを特徴とする、上記請求項の１つに記載の方法。
【請求項５】測定される前記特性変化は、前記第１のポリマー（４、７）
と前記第２のポリマー（３、８）とが接触および／または分離するときの吸収お
よび／または反射についての経時的な変化であることを特徴とする、上記請求項
の１つに記載の方法。
【請求項６】測定される前記特性変化は、互いに異なる数個の入射角で測
定されることを特徴とする、上記請求項の１つに記載の方法。
【請求項７】前記金属クラスタ（２）は、前記第２のフェーズ（１）に直
接蒸着被膜されるか、または前記第２のポリマー（３、８）から形成される層を
介して前記第２フェーズ（１）に結合されることを特徴とする、上記請求項の１
つに記載の方法。
【請求項８】前記第２のポリマー（３、８）から形成された層が，前記第
２のフェーズ（１）の表面に塗布されることを特徴とする、請求項７に記載の方
法。
【請求項９】前記第１のポリマー（４、７）から形成された少なくとも１
つの層が、前記表面に塗布された層と前記金属クラスタ（２）に結合される層と
の間に介在することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記第１のポリマー（４、７）から形成された層が、前記
第１のフェーズ（５）の表面に塗布されることを特徴とする、上記請求項の１つ
に記載の方法。
【請求項１１】前記第１のポリマー（４、７）と前記第２のポリマー（３
、８）とから形成される層配列が、前期表面に塗布されることを特徴とする、請
求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記第１のポリマー（４、７）および／または前記第２の
ポリマー（３、８）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ、または
それらの合成類似体、タンパク質、ペプチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または
それらの配位子、もしくはポリアクリル酸、ポリエチレンイミン、もしくはポリ
（Ｄ−グルコサミン）であることを特徴とする、上記請求項の１つに記載の方法
。
【請求項１３】文字ａで示す前記ステップにおいて、前記第１のフェーズ
（５）に結合される少なくとも１つのほかのポリマーを、前記第２のポリマー（
３、８）に接触させることを特徴とする、上記請求項の１つに記載の方法。
【請求項１４】前記ポリマー（３、４、７、８）は、バーコードの形式で
前記第１のフェーズ（５）に塗布されることを特徴とする、請求項１３に記載の
方法。
【請求項１５】電磁波を反射する第１のフェーズ（５）に結合される第１
のポリマー（４、７）を識別するための装置であって、前期第１のポリマー（４
、７）に対して親和性を有する第２のポリマー（３、８）が、電磁波を透過する
第２のフェーズ（１）の表面に、金属クラスタ（２）を介して結合されることを
特徴とする、装置。
【請求項１６】前記金属クラスタ（２）は、銀、金、アルミニウム、銅、
またはインジウムから形成されることを特徴とする、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】前記電磁は、光、好ましくはレーザ光であることを特徴と
する、請求項１５または１６に記載の装置。
【請求項１８】前記第２のフェーズ（１）は、透明な物質、例えばプラス
チックまたはガラスから生成されていることを特徴とする、請求項１５から１７
の１つに記載の装置。
【請求項１９】前記第１のポリマー（４、７）および／または前記第２の
ポリマー（３、８）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、またはｓｓＲＮＡ、また
はそれらの合成類似体、タンパク質、ペプチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、また
はそれらの配位子、もしくはポリアクリル酸、ポリ（Ｄ−グルサコミン）、もし
くはポリエチレンイミンであることを特徴とする、請求項１５から１８の１つに
記載の装置。
【請求項２０】反射光の光学特性を決定するための器具を備えることを特
徴とする、請求項１５から１９の１つに記載の装置。
【請求項２１】前記器具は、前記第１のポリマー（４、７）と前記第２の
ポリマー（３、８）とが接触する前および／または後の所定のスペクトラムにお
ける吸収を測定するために用いることができることを特徴とする、請求項２０に
記載の装置。
【請求項２２】前記器具は、前記反射光のスペクトルシフトを測定するた
めに用いることができることを特徴とする、請求項２０または２１に記載の装置
。
【請求項２３】前記器具は、互いに異なる数個の入射角で前記光学特性を
測定するために用いることができることを特徴とする、請求項１５から２３の１
つに記載の装置。
【請求項２４】前記金属クラスタ（２）は、前記第２のポリマー（３、８
）から形成される層を介して、前記第２のフェーズ（１）に結合されることを特
徴とする、請求項１５から２３の１つに記載の装置。
【請求項２５】前記第２のポリマー（３、８）から形成される層が、前記
第２のフェーズ（１）上の表面に塗布されることを特徴とする、請求項２４に記
載の装置。
【請求項２６】前記第１のポリマー（４、７）から形成された少なくとも
１つの層が、前記表面上に与えられた層と前記金属クラスタ（２）に結合した層
との間に介在することを特徴とする、請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】前記第１のポリマー（４、７）から形成された層が、前記
第１のフェーズ（５）の表面に塗布されることを特徴とする、請求項１５から２
６の１つに記載の装置。
【請求項２８】前記第２のポリマー（３、８）から形成された層が、前期
表面上に与えられた層に塗布されることを特徴とする、請求項２７に記載の方法
。