DE10205506C1 - Verfahren zur Markierung von Gegenständen - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zum Nachweis der Authentizität eines Gegenstandes beschrieben, wobei der Gegenstand auf einer Oberfläche zumindest einen Flächenabschnitt aufweist, auf dem Partner eines spezifisch bindenden Paares in einer vorgegebenen Anordnung gebunden sind, die Oberfläche mit einer zweiten Oberfläche, die korrespondierende Flächenabschnitte aufweist, auf denen zumindest in ausgewählten Bereichen komplementäre Bindungspartner vorliegen, so in Kontakt gebracht wird, dass die Partner miteinander reagieren können, wobei mindestens ein Teil der Partner eine nachweisbare Markierung trägt, die Flächen dann getrennt werden und auf mindestens einer der beiden Flächen die entstandene Anordnung der Markierungen nachgewiesen wird, wobei sich die nach dem Trennen auf mindestens einer der beiden Oberflächen entstandene Anordnung der Partner und/oder Markierungen von der ursprünglichen Anordnung der gebundenen Partner und/oder der Markierungen auf der Oberfläche des Gegenstandes unterscheidet.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Authentizität eines Ge­ genstandes.

In vielen Bereichen ist es notwendig oder wünschenswert, die Authentizität eines Gegenstandes festzustellen oder seinen Weg zu verfolgen. So gibt es ein Inte­ resse daran, hochwertige oder sicherheitsrelevante Produkte zu identifizieren, um sie von Nachahmungen unterscheiden zu können. Hierzu sind viele Metho­ den bekannt, z. B. Seriennummern, Barcodes, Magnetstreifen, Stempel, reflektie­ rende Folien oder Fäden, Holographien und ähnliche kennzeichnende Mittel. Andererseits ist es notwendig, Dokumente wie Geldscheine, Ausweise, Karten etc. fälschungssicher zu machen. Darüber hinaus besteht ein Interesse daran, den Weg von Produkten oder auch Schadstoffen über Verteiler- oder Verkäufer­ netzwerke zu verfolgen. In all diesen Fällen ist es notwendig, auf den Produkten eine Markierung anzubringen, die zweifelsfrei erkennen lässt, ob es sich um ein Originalprodukt oder um eine Nachahmung oder Fälschung handelt. Generell muss das Produkt, das zur Produktmarkierung verwendet wird, die Sicherheit bieten, dass es selbst nicht gefälscht werden kann.

Zur Produktmarkierung wurden bereits vielfältige Möglichkeiten vorgeschlagen, die sich unter anderem auch der spezifischen Bindung von biologischen Molekü­ len bedienen.

So ist beispielsweise aus WO 87/06383 A1 ein Verfahren zur Markierung von Ge­ genständen bekannt, bei dem eine als Signalverbindung bezeichnete makromo­ lekulare Verbindung auf den Gegenstand aufgebracht wird, ohne deren Identität preiszugeben, und dann die Gegenwart dieser Signalverbindung nachgewiesen wird. Als Signalverbindung wird ein DNA-Strang aus einem Bakterium vorge­ schlagen, der auf oder in den Gegenstand gebracht wird. Zum Nachweis wird dann eine Hybridisierung mit einem komplementären DNA-Strang durchgeführt, und die erfolgreiche Hybridisierung bestätigt die Authentizität des Gegenstands.

Einem ähnlichen Ansatz folgt die Lehre von WO 01/51652 A2, wonach auf einem Gegenstand ein Biopolymer immobilisiert wird und anschließend in einem einstu­ figen Detektionsverfahren durch Reaktion des Biopolymers mit einem damit bin­ defähigen zweiten Biopolymer sichtbar gemacht wird.

Weiterhin beschreibt WO 99/47702 A2 ein Verfahren zum Identifizieren eines Festkörpers, bei dem eine Nukleotidsequenz an einem Festkörper immobilisiert wird und zum Nachweis mit einer zweiten Nukleotidsequenz hybridisiert wird, wobei dann, wenn die zweite Nukleotidsequenz an die erste Nukleotidsequenz bindet, eine an der zweiten Nukleotidsequenz gebundene fluorophore Gruppe entweder verstärkt oder gelöscht wird, was zu einer nachweisbaren Änderung der Fluoreszenz bei Bindung führt.

Weiterhin wird in EP 0 409 842 B1 ein Verfahren zum Identifizieren der Herkunft einer Chemikalie oder chemischen Zusammensetzung vorgeschlagen, bei dem eine Markerverbindung der Chemikalie oder Zusammensetzung zugegeben wird und dann das Vorhandensein der Markerverbindung in dieser Chemikalie oder Zusammensetzung nachgewiesen wird. Gemäß EP 0 409 842 B1 können auch mehrere Markerverbindungen verwendet werden, wobei die Analyse erfolgt, in­ dem die Markerverbindungen dann aus oder von der Chemikalie extrahiert wer­ den und z. B. über eine Chromatographiesäule aufgetrennt werden.

Ein ähnlicher Ansatz wird auch in WO 98/33162 A1 verfolgt, wo ein Marker ver­ wendet wird, der nur in bestimmten Konzentrationen physikalisch nachweisbar ist. Dieser Marker wird in nicht nachweisbarer Konzentration dem Produkt zuge­ fügt und dann über eine Affinitätssäule abgetrennt, angereichert und nachgewie­ sen.

Die Lehre des Dokuments WO 98/28728 A1 befasst sich mit dem Problem, nach­ zuweisen, ob ein Behälter, der mit einem Siegeletikett versehen ist, noch origi­ nalverschlossen ist oder bereits geöffnet wurde. Dazu wird ein Siegeletikett vor­ gesehen, das so ausgebildet ist, dass sich beim Öffnen vorbestimmte Teile ablö­ sen, während andere Stellen haften bleiben, wodurch eine untere gefärbte Schicht ihr Aussehen verändert. Dadurch lassen sich die Teile des Etiketts nicht mehr in den Ursprungszustand bringen.

Einen anderen Weg geht der Erfinder von WO 00/77496 A1. Hier wird ein Verfah­ ren zur Identifizierung eines Gegenstandes vorgeschlagen, bei dem die Reflexion elektromagnetischer Wellen als Nachweismittel verwendet wird, wobei die Refle­ xion beeinflusst wird durch Reaktion von zwei Polymeren miteinander, wobei das eine Polymer über metallische Cluster gebunden ist.

Weiterhin ist aus US 5,445,970 A ein Verfahren zur Durchführung von Bindung­ sassays bekannt, bei dem als nachweisbare Markierung ein magnetisches Mate­ rial verwendet wird. Der Assoziationsgrad von Wechselwirkungspartnern, z. B. Antikörpern kann dabei durch eine von außen angelegte Zugkraft gemessen werden.

Vielen dieser bekannten Verfahren ist gemeinsam, dass jeweils eine spezifisch bindefähige Substanz an dem zu identifizierenden Gegenstand angebracht oder ihm zugesetzt wird und später dann das Vorhandensein dieser Substanz nach­ gewiesen wird. Nachteil der bekannten Verfahren ist es aber, dass die Möglich­ keiten der Variation beschränkt sind und dass, sobald die verwendete Substanz bekannt ist, die Produktmarkierung nachgeahmt werden kann. In den Fällen, in denen die Verwendung mehrerer Markermoleküle vorgeschlagen wird, ist deren Nachweis aufwändig, da eine Auftrennung der Markierungen über Chroma­ tographiesäulen erfolgen muss.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Ge­ genstände sicher markiert werden können, wobei eine große Vielfalt an Codie­ rungen möglich ist, so dass praktisch fälschungssicherer Schutz erreicht wird. Außerdem war es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren unter Verwendung meh­ rerer oder vieler verschiedener Markierungen und/oder Codierungen bereitzustel­ len, ohne dass es notwendig wird, Chromatographiesäulen oder andere Vorrich­ tungen zur Auftrennung einzusetzen.

Zur Lösung dieses Problems wird die Fähigkeit biologischer Moleküle, spezifi­ sche Bindungen mit spezifischen Bindungspartnern einzugehen, ausgenutzt. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Möglichkeiten herangezogen, die ein differenzieller Krafttest bietet, der Bindungskräfte vergleichen und auswerten kann.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Nachweis der Authentizität eines Ge­ genstandes zur Verfügung gestellt, wobei der Gegenstand auf einer Oberfläche zumindest einen Flächenabschnitt aufweist, auf dem Partner eines spezifisch bindenden Paares in einer vorgegebenen Anordnung gebunden sind, die Ober­ fläche mit einer zweiten Oberfläche, die korrespondierende Flächenabschnitte aufweist, auf denen zumindest in ausgewählten Bereichen komplementäre Bin­ dungspartner vorliegen, so in Kontakt gebracht wird, dass die Partner miteinan­ der reagieren können, wobei mindestens einer der beiden Partner eine nach­ weisbare Markierung trägt, die Flächen dann getrennt werden und auf einer der beiden Flächen die entstandene Anordnung der Markierungen nachgewiesen wird, wobei sich die nach dem Trennen auf mindestens einer der beiden Oberflä­ chen entstandene Anordnung der Markierungen von der ursprünglichen Anord­ nung von der gebundenen Partner und/oder Markierungen auf der Oberfläche des Gegenstands unterscheidet.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, Gegenstände zu identifi­ zieren, indem nachweisbare Muster erzeugt werden, die erst dann entstehen, wenn zwei verschiedene Oberflächen, eine davon auf dem zu identifizierenden Gegenstand oder mit ihm verbunden, miteinander in Kontakt gebracht und an­ schließend getrennt werden. Das Muster wird erzeugt, indem auf den beiden Oberflächen jeweils korrespondierende Partner eines spezifisch bindenden Paa­ res gebunden werden, von denen mindestens einer mit einer nachweisbaren Markierung versehen ist.

Erfindungsgemäß wird somit ein nachahmungssicheres System zur Verfügung gestellt.

Generell ist es schon nahezu unmöglich, das auf dem zu authentifizierenden Ge­ genstand vorgesehene Muster nachzuweisen, da für eine Analyse nur sehr we­ nig Material zur Verfügung steht und da nicht bekannt ist, welche Bindungspart­ ner verwendet werden. Selbst wenn das auf dem Gegenstand vorhandene Mus­ ter nachgewiesen werden könnte, würde dies aber nicht zu der Kenntnis über das nach dem Trennen entstehende Muster führen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wesentlich sind somit zwei spezifisch miteinander bindende Partner, von denen mindestens einer eine Markierung trägt, sowie die Anordnung der jeweiligen Partner auf der Oberfläche. Außerdem ist es wesentlich, dass sich mindestens ein Teil der Bindepartner und/oder deren Markierung bzw. deren Position durch die Bindung mit dem jeweiligen komple­ mentären Partner verändert, d. h. durch die Bindung mit dem komplementären Partner müssen einige der Bindepartner oder Teile davon den Ort wechseln oder die Markierung muss sich nachweisbar verändern.

Zur Authentifizierung sind alle Gegenstände geeignet, die eine Oberfläche auf­ weisen, auf der entweder eine Markierung angebracht werden kann, oder auf die eine Markierung aufgebracht werden kann. Weiterhin sind zur Authentifizierung auch Verpackungen geeignet. Gegenstände, die gegen Nachahmung geschützt werden sollen, sind wie oben ausgeführt unter anderem teure Produkte, wie Uh­ ren, sicherheitsrelevante Produkte, wie Ersatzteile für Flugzeuge, Dokumente, wie Ausweise und Kreditkarten. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es da­ bei nur wichtig, dass auf dem Gegenstand ein Flächenabschnitt zur Verfügung steht, auf dem die Bindepartner aufgebracht werden können. Bevorzugt sollte es sich dabei um einen ebenen Flächenabschnitt handeln, obwohl auch nicht ebene Oberflächen für das Verfahren geeignet sind.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind zwei Oberflächen notwendig, an oder auf denen sich Partner befinden. Die eine Oberfläche befin­ det sich auf dem Gegenstand, dessen Authentizität nachgewiesen werden soll. Je nach dem zu identifizierenden Gegenstand kann die Oberfläche direkt durch diesen Gegenstand gebildet werden oder aber, z. B. als Schicht, Beschichtung, Aufkleber oder Etikett, auf den Gegenstand aufgebracht werden. Die zweite O­ berfläche wird getrennt von der ersten Oberfläche auf einem Träger gebildet. Beide Oberflächen müssen so ausgebildet sein, dass sie die Partner des spezi­ fisch bindenden Paares aufnehmen und halten können. Darüber hinaus müssen die Oberflächen so beschaffen sein, dass zumindest in einem Flächenabschnitt die Bindungspartner in engen Kontakt gebracht werden können.

Nicht notwendigerweise müssen die beiden Oberflächen, die in Kontakt gebracht werden sollen, flächengleich sein. Die einzige Voraussetzung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass es auf jeder der beiden Oberflä­ chen mindestens einen Flächenabschnitt gibt, in dem Bindungspartner aufeinan­ der treffen können. Flächenabschnitte, die aufeinandertreffen können und Bin­ dungspartner aufweisen, die miteinander reagieren können, werden hier als "kor­ respondierende Flächenabschnitte" bezeichnet. Diese Flächenabschnitte können jede mögliche Geometrie aufweisen, d. h. es können ebene Dreiecke, Quadrate, Rechtecke, Kreise, andere ebene Flächen oder auch gekrümmte oder dreidi­ mensional geformte Flächen sein, die in mindestens einem Abschnitt konturen­ gleich sind oder durch ihre Beschaffenheit geeignet sind, miteinander in Kontakt gebracht zu werden. So können eine der beiden Oberflächen oder beide Ober­ flächen aus einem solchen Material sein oder eine solche Form haben, dass sie sich anpassen können, z. B. kann eine der Oberflächen die Form einer Walze oder einer Folie haben oder das Material für die Oberfläche kann weich oder gummiartig sein. Es kann auch eine gelartige Beschichtung sein.

Es kann beispielsweise auf dem Gegenstand, dessen Authentizität nachgewie­ sen werden soll, ein Oberflächenabschnitt mit spezifisch bindefähigen Partnern, die in einem Muster angeordnet sind, vorhanden sein und die zweite Oberfläche nur einen kleinen Abschnitt davon überdecken. Selbst dann, wenn das Muster auf der ersten Oberfläche sichtbar oder nachweisbar ist, ist nicht vorhersehbar, in welchem Bereich die zweite Oberfläche Bindepartner zur Verfügung stellt. Auch hierdurch wird die Nachahmungssicherheit weiter erhöht.

Das Material, aus dem die beiden Oberflächen bestehen, kann gleich oder ver­ schieden sein und eine der beiden oder beide Oberflächen können in geeigneter Weise beschichtet sein. Bevorzugt ist entweder eine Oberfläche aus einem stei­ fen Material und die andere aus einem elastischen Material gebildet oder beide Oberflächen sind aus elastischem Material, sodass sich die jeweiligen Flächen­ abschnitte der ersten und zweiten Oberfläche beim Inkontaktbringen genau an­ einander anpassen können und damit ein optimaler Kontakt der einzelnen Bin­ dungspartner möglich ist. Die Oberflächen können beispielsweise aus Glas, Po­ lydimethylsiloxan (PDMS), Nylon, Polystyrol oder anderen Kunststoffen gebildet werden. Bevorzugt wird mindestens eine der beiden Oberflächen aus einem e­ lastischen Material hergestellt, bevorzugt einem elastischen Kunststoff. Beson­ ders bevorzugt wird mindestens eine Oberfläche aus einem Siloxan, insbesonde­ re Polydimethylsiloxan, gebildet. Es sind verschiedene andere flexible Materialien oder Mischungen davon möglich. Ein anderes mögliches Material ist Polyacryla­ midgel, dessen elastische Eigenschaften durch das Molekulargewicht und den Vernetzungsgrad den experimentellen Bedürfnissen angepasst werden können. Die Oberfläche kann aus einem einzigen Material, einem Gemisch von Materia­ lien oder auch einem System von Elementen aus einem oder verschiedenen Ma­ terialien aufgebaut sein.

In einer Ausführungsform wird die erste Oberfläche auf dem Gegenstand selbst gebildet. Es ist aber auch möglich auf dem Gegenstand eine Schicht oder Be­ schichtung aufzubringen. Möglich ist auch die Bereitstellung einer Festphase aus Glas, das derivatisiert ist, um Bindungsgruppen für die Immobilisierung eines Partners bereitzustellen. Als Beispiel kann hier silanisiertes Glas genannt wer­ den. Diese Festphase kann dann z. B. auf der Verpackung des Gegenstandes angeordnet werden.

Auf den beiden Oberflächen werden Bindungspartner in vorbestimmten Anord­ nungen gebunden. Die Anordnung der Bindungspartner auf ihren jeweiligen Oberflächen kann gleich oder verschieden sein. So können beide Oberflächen nur korrespondierende Flächenabschnitte aufweisen oder aber einander nicht kongruent überdeckende Flächenabschnitte aufweisen, in denen jeweils Bin­ dungspartner gebunden sind. Auch die Anordnung der Bindungspartner muss in den kongruenten Flächenabschnitten nicht deckungsgleich sein, sondern kann unterschiedlich sein. So kann es sein, dass z. B. einem Bindungspartner kein Bindungspartner oder ein damit nicht spezifisch bindender Partner gegenüber­ steht.

In einer weiteren Ausführungsform kann eine der beiden Oberflächen, in der Re­ gel die nicht auf dem Gegenstand befindliche Oberfläche, eine solche Beschich­ tung tragen, dass eine Diffusion von Bindepartnern möglich ist, wobei rasterartig Bereiche abgetrennt sind. In diesem Fall wird dann der Kontakt der spezifisch bindefähigen Partner dadurch ermöglicht, dass beide Oberflächen so zueinander gebracht werden, dass der in der Oberflächenschicht vorhandenen Bindepartner zu der anderen Oberfläche wandern und dort auf den komplementären Binde­ partner treffen kann. Für diese Ausführungsform ist eine der beiden Oberflächen bevorzugt mit einem Gel beschichtet.

Zumindest bei einem Teil der Bindepartner ist mindestens einer der beiden Bin­ dungspartner mit einer Markierung versehen. Diese Markierungen bilden wieder­ um Muster. Die durch die Markierungen gebildeten Muster können vielfältig sein, der Phantasie sind hier keine Grenzen gesetzt. Erfindungswesentlich ist dabei nur, dass das vor dem In-Kontakt-Bringen der Oberflächen auf den jeweiligen Oberflächen vorhandene Muster und das nach dem In-Kontakt-Bringen und Trennen sich auf mindestens einer der beiden Oberflächen ergebende Muster voneinander verschieden sind. Unter Muster wird dabei nicht die Anordnung der Bindungspartner, sondern die Anordnung der Markierungen verstanden. Die An­ ordnung der Markierungen bietet viele Variationsmöglichkeiten.

Weitere Variationsmöglichkeiten ergeben sich auch durch die Auswahl der Mar­ kierung. Als Markierung kann für das erfindungsgemäße Verfahren jede analy­ tisch nachweisbare Gruppe oder Substanz eingesetzt werden. Unter Markierung wird im Rahmen der Erfindung dabei eine Eigenschaft verstanden, durch die sich einige Bindungspartner von anderen unterscheiden, und die nachweisbar ist. Bevorzugt werden physikalisch nachweisbare Parameter herangezogen. Insbe­ sondere kommen für die Markierung radioaktive Atome oder Gruppen, die eine Änderung optischer oder elektrischer Eigenschaften bewirken, in Betracht. Alle dem Fachmann bekannten Reportergruppen sind hier geeignet. Beispiele sind radioaktive Marker wie ³H, ¹⁴C, ³⁵S, fluoreszierende, lumineszierende, chro­ mophore Gruppierungen oder Farbstoffe, Metalle oder leitfähige Gruppen, aber auch Substrate von Enzymen oder Reporterenzyme. Bevorzugt werden fluores­ zierende oder chromophore Gruppen als Markierung verwendet. Bei der Ver­ wendung von Proteinen als Bindungspartner kommt auch eine Anfärbung der an der Oberfläche gebundenen Proteinsubstanz, z. B. mit Silber oder mit Coomas­ sie-Blue in Betracht.

Mindestens einer der beiden spezifisch bindenden Partner weist eine Markierung auf. Vorzugsweise handelt es sich bei der Markierung um einen Fluoreszenz­ farbstoff, beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Fluorescein, Rhoda­ min. Tetramethylrhodamin-5-(und-6)-isothiocyanat (TRITC), Texas Red, Cyanin­ farbstoffe (CY3 oder CY5) usw. Fluoreszenzfarbstoffe sind vorteilhaft, da sie in sehr geringer Menge nachgewiesen werden können. In der Regel ist die Markie­ rung kovalent mit dem Bindepartner verbunden.

Es können pro spezifisch bindendem Paar auch mehrere Markierungen verwen­ det werden und es können für jeweils gleiche Bindungspartner unterschiedliche Markierungen verwendet werden, wobei z. B. Partner verschiedener Bindungs­ paare oder z. B. die beiden Partner eines Paares unterschiedlich markiert sein können. Im letzteren Fall könnte beispielsweise für den Fall fluoreszierender Markierungen ein Muster erzeugt werden, wobei an Stellen, an denen eine spezi­ fische Bindung erfolgt ist, eine "Mischfarbe" entsteht, während an Stellen, an de­ nen nur ein Bindungspartner ist, die reine Farbe erhalten bleibt. Auch dies erwei­ tert die Möglichkeiten für Variationen. Bei der Verwendung von verschiedenen fluoreszierenden Markierungen können solche verwendet werden, die jeweils durch Licht gleicher Wellenlänge oder durch Strahlung verschiedener Wellenlän­ gen angeregt werden.

Wesentlich für die Erfindung ist es, dass sich die Anordnung der Markierungen durch das Inkontaktbringen der spezifisch bindenden Partner und deren Bindung verändert. Dies kann z. B. geschehen, indem die Markierung bei der Bindung verändert wird, indem zumindest die Teile eines Bindepartners, die die Markie­ rung tragen, den Ort wechseln oder indem durch das Zustandekommen der spe­ zifischen Bindung der Bindepartner die Oberfläche, an der er immobilisiert ist, verlässt. Bevorzugt verändert sich die Anordnung der Markierungen dadurch, dass einige der Bindepartner durch Eingehen der spezifischen Bindung von ih­ rem Immobilisierungsort gelöst werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Vergleich der Bindungskräfte verschiedener Bindungen ausgenutzt, wie in der Anmeldung der Anmelderin, PCT/EP 01/09206, mit dem Titel "Verfahren und Vorrichtung zur Charakterisierung und/oder zum Nachweis eines Bindekom­ plexes" beschrieben, um einen von zwei Bindepartnern eines spezifisch binden­ den Paares von der Oberfläche, an die er anfangs gebunden ist, zu entfernen. Dabei kann es sich sowohl um den an dem zu authentifizierenden als auch den auf der zweiten Oberfläche immobilisierten Bindepartner handeln.

Als spezifisch bindefähige Paare kommen die verschiedensten miteinander bin­ defähigen Partner in Betracht, wobei sich die Spezifität der Bindung sowohl auf einen speziellen Partner beziehen kann, wie z. B. Antigen-zugehöriger Antikörper oder Biotin-Avidin/Streptavidin, als auch auf eine Gruppe oder Klasse von Ver­ bindungen, z. B. Antikörper-Protein A. Beispiele für spezifisch bindende Partner sind: Antikörper, Peptide, andere Scaffold-Proteine, DNA, RNA, RNA-Aptamere und somit die Paare Antigen-Antikörper, Hapten-Antikörper, Anti-Idiotyp- Antikörper-Antikörper, DNA-DNA, RNA-RNA, DNA-RNA, RNA-Aptamer-Peptid, Rezeptor-Ligand, Lectin-Zucker, Zinkfingerprotein-DNA, Enzym-Substrat, Biotin- Avidin/Streptavidin usw., sowie die jeweiligen Derivate oder Analoga. So können an Stelle von Antikörpern deren bindefähige Fragmente und an Stelle von DNA Nucleinsäurederivate etc. verwendet werden.

In einer Ausführungsform werden als Bindungspaar Antikörper und eine Sub­ stanz mit einem von diesem erkannten Epitop, wie Antigene, Haptene oder Anti- Idiotyp-Antikörper, verwendet. Unter dem Begriff "Antikörper" werden in der vor­ liegenden Beschreibung auch Antikörperfragmente oder Antikörperderivate, so­ wie funktionelle Fragmente von Antikörpern oder Derivate davon, die das Epitop erkennen und binden können, verstanden. Die Antikörper können polyklonale oder monoklonale Antikörper sein, bevorzugt sind aber monoklonale Antikörper. Bekannte Fragmente und Derivate sind Fv-, Fab-, Fab'- oder F(ab')₂-Fragmente, "single-chain antibody fragments", bispezifische Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper sowie Fragmente, die CDRs (complementarity determi­ ning regions) enthalten, die ein Epitop des Bindungspartners erkennen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden als Partner des spezi­ fisch bindenden Paares Nucleinsäuren wie DNA (Desoxyribonucleinsäure) oder RNA (Ribonucleinsäure) und künstliche Nucleinsäuren wie LNA (Locked Nucleic Acid) und PNA (Peptide Nucleic Acid) und dreidimensionale Strukturen aus Nuc­ leinsäuren, bevorzugt Aptamere, verwendet.

Die Immobilisierung der Bindepartner, z. B. der Antikörper, Fragmente oder Deri­ vate davon oder von Nucleinsäuren, kann in an sich bekannter Weise erfolgen, es kommen sowohl kovalente als auch nicht-kovalente Bindungen und Bindun­ gen direkt an die Oberfläche oder über Brückenmoleküle inbetracht. Bevorzugt ist einer der beiden Partner des spezifisch bindenden Paares permanent immobi­ lisiert und der andere so gebunden, dass die Bindung an die Oberfläche aufgeht, sobald die Bindung zum Bindungspartner erfolgt. Unter einer permanenten Bin­ dung wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Bindung verstanden, die vor dem Inkontaktbringen der Oberflächen im Wesentlichen stabil bleibt und sich auch durch Bindung des Bindungspartners an sein spezifisches Pendant nicht löst. Eine permanente Bindung kann z. B. über funktionelle Gruppen, die der Bin­ departner aufweist oder die in das Molekül eingeführt wurden, an funktionelle Gruppen, die die Oberfläche bereitstellt, erfolgen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass mindestens einer der beiden Partner des spezifisch bindefähigen Paares nicht direkt an die Oberfläche bindet, sondern entweder über Brückenmoleküle, die auf der Oberfläche immobi­ lisiert sind, oder über ein weiteres spezifisch bindendes Paar.

Eine bevorzugte Methode besteht darin, einen Partner zu biotinylieren und über ein Streptavidinmolekül mit der ebenfalls biotinylierten Oberfläche zu verbinden. Monoklonale Antikörper können chemisch aktiviert werden, indem man bestimm­ te Gruppen ihrer Glycosylierungen zu Aldehydgruppen oxidiert. Diese Alde­ hydgruppen können wiederum Aminogruppen oder Hydrazidgruppen einer modi­ fizierten Oberfläche binden (siehe Solomon et al., Journal of Chromatographie, 1990, Bd. 510, 321-329). Eine weitere Methode, die dem Fachmann geläufig ist, ist die Konjugation von Aminogruppen des Antikörpers mit Carboxygruppen einer Oberfläche durch den Einsatz von Ethyl-(Dimethylamino)-Carbodiimid/N- Hydroxy-Succinimid.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis der Authentizität eines Gegenstandes wird jeweils einer der Partner über eine Haftbindung an die Oberfläche gebunden und der andere über eine Detektorbindung gebunden, wobei die Bindungskraft der Detektorbindung bei einer von außen angelegten Zugkraft kleiner als die Bindungskraft der spezifi­ schen Bindung der beiden Partner und kleiner als die Bindungskraft der Haftbin­ dung ist.

Die Bindung der beiden Partner erfolgt in dieser Ausführungsform derart, dass nur einer der beiden Partner über eine hier als Haftbindung bezeichnete Bindung an eine Oberfläche gebunden wird, während der andere zugehörige Partner über eine hier als Detektorbindung bezeichnete Bindung an die andere Oberfläche gebunden wird.

"Haftbindung" ist dabei eine Form der permanenten Bindung und bedeutet, dass die Bindung des Partners an die Oberfläche so stark ist, dass bei einem auf bei­ de über die spezifische Bindung verbundenen Partner ausgeübten Zug die Haft­ bindung nicht geöffnet wird und der Partner immobilisiert bleibt, dass sich statt­ dessen vielmehr die Detektorbindung löst, und dass die Haftbindung nicht ohne weiteres unter den Anwendungsbedingungen gelöst wird.

Unter "Detektorbindung" wird hier eine Bindung verstanden, deren Bindungsaffi­ nität groß genug ist, um den anderen Partner des spezifisch bindenden Paares an der Oberfläche gebunden zu halten, solange bis der Kontakt mit dem anderen Partner entsteht, deren Bindungskraft unter einem von außen angelegten Zug aber schwächer ist, als die Kraft der spezifischen Bindung zwischen den Part­ nern und die Kraft der Haftbindung, mit der der andere Partner gebunden ist, so dass dann, wenn auf beide über die spezifische Bindung verbundenen Partner ein Zug ausgeübt wird, die Detektorbindung gelöst wird und damit der über die Detektorbindung gebundene Partner an dem über die Haftbindung gebundenen Partner haften bleibt und von der Oberfläche abgelöst wird. Die Detektorbindung wird bevorzugt so ausgebildet, dass sie unter den Versuchsbedingungen unter einer angelegten Kraft stärker ist, als die unspezifische Bindung an eine ggf. in geeigneter Weise präparierte korrespondierende Oberfläche, so dass der über die Detektorbindung immobilisierte Partner an "seiner" Oberfläche gebunden bleibt, wenn er nicht auf einen spezifisch bindefähigen Partner trifft.

Unter "Bindepartner" oder Partner eines spezifisch bindenden Paares wird in der Regel im Rahmen der Erfindung ein einzelner Partner eines Paares verstanden. Auf einem Flächenabschnitt können viele gleiche Partner, jeweils eine Anzahl von beiden Partnern eines Bindungspaares oder aber verschiedene Partner von verschiedenen Paaren gebunden sein.

Bei einem Kraftvergleich, wie er bei dieser Ausführungsform ausgenutzt wird, kann die Größe der Kraft von der Zugrate abhängig sein. In diesem Fall kann daher die Rate der angelegten Zugkraft unter Umständen ein wichtiger Parame­ ter sein, da die Trennkräfte bei verschiedenen Kraftraten variieren können. In diesen Fällen sollte daher, um die Kräfte vergleichen zu können, die Zugrate be­ achtet werden. Bei anderen Ausführungsformen, z. B. den weiter unten beschrie­ benen "Unzip"-Systemen ist dagegen die Zugrate unter den beschriebenen Be­ dingungen nicht wichtig.

Wenn somit zwei Oberflächen miteinander in Kontakt gebracht werden, wobei z. B. auf einer Oberfläche Partner eines spezifisch bindenden Paares durch Haft­ bindung immobilisiert sind, während auf der anderen Oberfläche Partner durch Detektorbindung gebunden sind, und die Partner Gelegenheit haben, miteinan­ der die spezifische Bindung einzugehen, was durch das Inkontaktbringen ermög­ licht wird, so entsteht beim Trennen der Oberflächen auf die drei bestehenden Bindungen - Haftbindung, spezifische Bindung, Detektorbindung - ein Zug und es wird die unter der angelegten Kraft schwächste der drei Bindungen - die De­ tektorbindung - getrennt. Die Haftbindung und die spezifische Bindung bleiben bestehen. Dadurch wandert der über eine Detektorbindung immobilisierte Part­ ner, wenn er auf seinen Bindepartner trifft, mit diesem mit und auf die andere Oberfläche.

Da in der Regel mindestens einer der beiden Partner eines spezifisch bindenden Paares eine Markierung trägt, ist nach dem Trennen der beiden Oberflächen bei Paaren, die dem Krafttest ausgesetzt waren, die Markierung auf der Oberfläche, an der ein Partner über die Haftbindung gebunden ist, während an der Oberflä­ che, an der ein Partner durch eine Detektorbindung gebunden war und dieser Partner auf einen komplementären Partner traf, die Markierung verschwunden ist. Für das erfindungsgemäße Verfahren können beide Fälle ausgewertet wer­ den, d. h. es kann sowohl die Markierung bestimmt als auch deren Fehlen oder ihre Veränderung festgestellt werden.

Auf diese Weise ist es möglich, eine Vielzahl von Mustern zu erzeugen, die auch in einfacher Weise variiert werden können, so dass es unmöglich ist, die Muster nachzuahmen. Da sowohl die Art der bindenden Partner als auch deren Position und Anzahl als auch die Art ihrer jeweiligen Bindung variiert werden kann, ist es unmöglich, herauszufinden, wie das nach Inkontaktbringen und Trennen der bei­ den Oberflächen erzeugte Muster aussehen wird, selbst wenn das Muster auf einer der beiden Oberflächen bekannt ist. Da außer der Art der Markierung auch die Art der Bindung für das entstehende Muster wesentlich ist, lässt sich aus der Kenntnis der auf einer Oberfläche gebundenen Partner nicht ableiten, wie dieses Muster verändert und/oder ergänzt wird durch Kontakt mit der zweiten Oberflä­ che und dem anschließenden Trennen der beiden. Darüber hinaus kann nicht nur die Art, Anzahl, und Position der bindenden Partner und Markierung und die Art der Bindung beliebig variiert werden, sondern es ist auch möglich, für einen Bindungspartner eines Bindungspaares verschiedene damit spezifisch bindende Partner vorzusehen, z. B. einerseits verschiedene Antikörper und andererseits Protein A etc. Auch die Verteilung der Markierung(en) auf die Bindepartner kann variiert werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, sowohl die Art, Position und Anzahl der Markierungen, als auch Position und Anzahl der bindenden Part­ ner als auch die Art der Bindung als auch Vorhandensein oder nicht eines Binde­ partners beliebig zu variieren. Es werden daher verschiedene Muster erhalten, je nachdem ob bzw. wo für ein Bindepaar die Haftbindung an der ersten oder zwei­ ten Oberfläche vorgesehen wird, je nachdem welche Markierung an welcher Stel­ le oder an welchem Bindepartner jeweils verwendet wird, je nachdem wie viele verschiedene Partner an welcher Stelle verwendet werden, je nachdem wie viele verschiedene Markierungen verwendet werden und ob jeweils für einen Partner an der korrespondierenden Stelle der anderen Oberfläche ein Bindepartner vor­ handen ist. So kann beispielsweise auf dem zu authentifizierenden Gegenstand ein Muster gebildet werden, das dann nach Inkontaktbringen und anschließen­ dem Trennen verändert oder ergänzt wird. Es ist auch möglich, dass der Flä­ chenabschnitt, der zur Identifizierung des Gegenstandes dient, gleichförmig mit Partnern eines spezifisch bindenden Paares, die entweder alle eine Markierung aufweisen oder die alle unmarkiert sind, versehen ist und sich erst nach Inkon­ taktbringen und Trennen ein Muster ergibt. Ein Muster kann sowohl auf einer der beiden Oberflächen als auch auf beiden entstehen. Das entstehende Muster kann beispielsweise ein Logo, ein Markenzeichen, ein Hinweis etc. sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform, die unten noch weiter erläutert wird, wird einer der beiden Bindepartner über ein weiteres spezifisch bindendes Paar, be­ sonders bevorzugt über komplementäre Nucleinsäurestränge, an einer Oberflä­ che immobilisiert.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass an beide Oberflächen, insbesondere den auf dem Gegenstand angeordneten Flächenabschnitt, nicht nur jeweils eine Art von Partnern eines Bindepaares, sondern entweder beide Arten von Partnern oder sogar Partner verschiedener Bindepaare gebunden werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Partner des spezifisch bin­ denden Paares in vorbestimmten Bereichen angeordnet, wobei die Bereiche ras­ terartig angeordnet sind. Dabei werden einzelne Bereiche als "Spot" bezeichnet. Für die Anordnung der Partner gibt es dabei vielfältige Möglichkeiten.

Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Auswahl der zu bindenden Part­ ner sehr flexibel gestaltet werden kann. So können eine, wenige oder viele ver­ schiedene Arten von Partnern auf beiden Oberflächen angeordnet werden. Es können z. B. viele verschiedene Partner bzw. Partner vieler verschiedener Binde­ paare spezifisch in ausgewählten Spots auf dem Flächenabschnitt gebunden werden.

Die beiden Oberflächen werden so miteinander in Kontakt gebracht, dass die Bindepartner in ausreichend hoher Effizienz binden können.

Um unspezifische Wechselwirkungen der Bindepartner mit der Oberfläche zu minimieren, kann die Oberfläche entweder durch die Anbindung von Proteinsub­ stanzen oder Polymeren, z. B. durch die Anbindung von Polyethylenglycol passi­ viert werden und/oder es können Polymere zur Bindung der Bindepartner an die Oberfläche eingesetzt werden.

Die Partner werden jeweils auf einem vorbestimmten Bereich immobilisiert, wobei dieser Bereich durchgehend, rasterartig, in beliebigen Mustern angelegt sein kann. Die Gestaltung der Bereiche ist beliebig unter der Voraussetzung, dass bei dem Inkontaktbringen der zwei Oberflächen Flächenabschnitte vorliegen, in de­ nen bindefähige Partner aufeinander treffen können. Erfindungsgemäß ist es dabei durchaus möglich, dass auch in einem Flächenabschnitt nicht jeder Binde­ partner auf einen entsprechenden komplementären Partner trifft, sondern dass einigen Partnern auch kein Partner oder ein nicht bindefähiger Partner gegenü­ berliegt. All dies dient dazu, die Variabilität der entstehenden Muster groß zu hal­ ten. In einer Ausführungsform ist eine Oberfläche durchgehend mit Bindungs­ partnern belegt, während die zweite Oberfläche nur in bestimmten Abschnitten Bindungspartner aufweist. In anderen Ausführungsformen sind auf beiden Ober­ flächen jeweils in vorbestimmten Bereichen Bindungspartner vorhanden, wobei nach Bedarf die Bereiche, die sich gegenüberliegen, deckungsgleich sind oder einander überlappen können. So ist es auch möglich, dass auf den beiden Ober­ flächen jeweils unterschiedliche Muster von gebundenen Partnern vorgesehen sind, von denen jeweils nur Teilbereiche beim Inkontaktbringen der Oberfläche miteinander in Berührung kommen, während andere Teilbereiche beim Kontakt ohne gegenüberliegenden Partner oder zumindest ohne bindefähigen Partner sind.

Die Bindung der Partner an die Oberflächen kann in unterschiedlicher Weise er­ folgen. Um die Zugänglichkeit der für die spezifische Bindung verantwortlichen Region optimal zu gewährleisten, erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform die Bindung an die Oberfläche über brückenartige oder rechenartige Moleküle, deren einer Teil an die Oberfläche bindet, z. B. über speziell vorgesehene funkti­ onelle Gruppen, und deren anderer Teil für die Bindung des Partners zur Verfü­ gung steht.

Die Bindung der Partner an die beiden Oberflächen kann über gleiche oder un­ terschiedliche Moleküle erfolgen. Die Brückenmoleküle können auf die jeweiligen Bindungspartner zugeschnitten werden. Es können sowohl kurzkettige Brücken­ moleküle als auch langkettige Polymere zur Bindung der Bindungspartner ver­ wendet werden. Bei kurzkettigen Partnern liegt die Länge der Kette in der Regel in einem Bereich von 2 bis 20 Atomen, wobei die Kettenatome in der Regel Koh­ lenstoffatome, Stickstoffatome, ggf. in Kombination mit Sauerstoff sind und wobei Brückenatome Seitengruppen tragen können. Auch die Verwendung von Metall­ komplexen wird in Betracht gezogen. Falls Polymere zur Anbindung der Bin­ dungspartner verwendet werden, so kommen hier die für diesen Zweck bekann­ ten Polymere in Betracht. Die Kettenlänge sollte dabei so eingestellt werden, dass der zu bindende Partner einen geeigneten Abstand von der Oberfläche hat und für den anderen Bindungspartner zugänglich ist. Das Polymer kann dabei gleichzeitig dazu dienen, die Oberfläche abzuschirmen, um unspezifische Bin­ dungen zu unterdrücken.

Die Partner des spezifisch bindefähigen Paares, die in einer Haftbindung an die Oberfläche gebunden werden, können, wie vorher beschrieben, über ein Brü­ ckenmolekül gebunden werden, und/oder über ein weiteres spezifisch bindendes Paar. In diesem Fall sollte das weitere spezifisch bindende Paar eine solche Bin­ dungskraft aufweisen, dass die Bindung unter dem auf die sich bildenden Bin­ dungen ausgeübten Zug nicht aufgeht und den Bindungspartner an der Oberflä­ che hält. Beispiele hierfür sind z. B. biotinylierte Antikörper und eine mit Streptavi­ din beschichtete Oberfläche etc.

Wenn zur Immobilisierung eines Bindungspartners ein weiteres spezifisch bin­ dendes Paar verwendet wird, das im folgenden als Detektorpaar bezeichnet wird, so liefert dieses die Detektorbindung und hat eine ausreichend hohe Affinität bzw. eine ausreichend geringe Dissoziationsrate. Dadurch wird verhindert, dass der Bindungspartner sich von der Oberfläche löst oder abdissoziiert, bevor er mit dem anderen Bindungspartner in Kontakt kommen konnte. Gewünscht ist für die Detektorbindung also eine hohe Affinität bzw. eine geringe Dissoziationsrate bei gleichzeitig geringer Stabilität unter einer von außen angelegten Zugkraft. Wird die Bindungsweite bei gleicher Aktivierungsenergie größer, vermindert sich die Kraft, die ausreicht, um die Bindung zu trennen. Die Stabilität der Detektorbin­ dung wird so eingestellt, dass sie unter einer von außen angelegten Zugkraft schwächer als die Haftbindung ist.

Bevorzugt werden als Detektorpaar zur Immobilisierung eines Bindepartners an der Oberfläche zwei komplementäre Nucleinsäurestränge verwendet. Die für die Immobilisierung verwendeten komplementären Nucleinsäurestränge können je­ weils sowohl über das 3'- als auch das 5'-Ende gebunden werden. Für das erfin­ dungsgemäße Verfahren ist es nun vorteilhaft, wenn die Bindung so erfolgt, dass beim Ausüben einer Zugkraft auf die hybridisierten Stränge, die Bindungen reiß­ verschlußartig aufgehen können. In einer Ausführungsform wird der Bindepartner an dem komplementären Strang so gebunden, dass es bei Anwendung einer Zugkraft ebenfalls zu einer reißverschlußartigen Trennung kommt. Dies wird wie folgt erreicht. Wenn der immobilisierte erste Strang mit seinem 3'-Ende an der Oberfläche fixiert ist, wobei das 5'-Ende unfixiert bleibt, wird der Bindepartner an dem komplementären zweiten Strang am 5'-Ende gebunden, so dass dann, wenn auf den Bindepartner Zug ausgeübt wird, die Kraft am 5'-Ende des kom­ plementären zweiten Strangs angreift und damit jeweils nur auf eine Basenpaa­ rung wirkt, die eine nach der anderen aufgehen können, so dass die Stränge reißverschlußartig getrennt werden. Wird der Bindepartner in diesem Fall am 3'- Ende gebunden, so ist die Kraft, die zur Trennung der Stränge erforderlich ist, viel größer, da sie auf alle Basenpaarungen gleichzeitig wirkt. Wenn der immobi­ lisierte erste Strang mit dem 5'-Ende immobilisiert wird, muß der Bindepartner entsprechend am 3'-Ende des zweiten Strangs gebunden werden, um die reiß­ verschlußartige Trennung zu bewirken.

Die Bindung des Bindepartners an den komplementären Nucleinsäurestrang soll­ te so erfolgen, dass weder die Hybridisierung der komplementären Nucleinsäu­ restränge noch die Bindung des Bindepartners mit dem anderen Partner sterisch behindert wird.

In einer weiteren Ausführungsform ist ein Bindepartner ein Polypeptid, an dessen C-terminalem Ende kovalent eine Nucleinsäure gekoppelt ist. Derartige Verbin­ dungen können beispielsweise durch die in WO 01/04265 offenbarten Verfahren hergestellt werden. Das Verfahren arbeitet mit mRNA-Molekülen, die mit einem Puromycin-Tag modifiziert werden, und die an den C-Terminus ihres Polypeptids binden, nachdem sie in vitro exprimiert wurden.

Möglichkeiten zur Immobilisierung von Nucleinsäuresträngen sind dem Fach­ mann bekannt und bedürfen hier keiner näheren Erläuterung.

Ein Vorteil von Nucleinsäureduplexen als Detektorpaar zur "Aufhängung" oder Immobilisierung von Bindepartnern besteht darin, dass die grosse Bindungsaffini­ tät zwischen Nucleinsäuresträngen mit ausreichender Anzahl an Basenpaarun­ gen gewährleistet, dass der Komplex nicht frühzeitig von der Oberfläche abdis­ sozüert, ohne dass eine Interaktion zwischen den Partnern des spezifisch bin­ denden Paares möglich war und/oder ohne dass eine äußere Kraft angelegt wurde. Ein weiterer Vorteil ist es, dass durch Variationen der Basen, insbesonde­ re des GC-Gehalts, die Trennkraft des Duplexes genau eingestellt werden kann. Dem Fachmann ist bewusst, dass neben den Basen A, T, G, C und U auch an­ dere Basen wie z. B. Inosin oder künstliche Nucleinsäuren wie PNA und/oder LNA verwendet werden können und so die Trennkraft weiter variiert werden kann. Ebenfalls kann die Trennkraft durch Modifikationen von Basen variiert wer­ den. Dadurch kann der Fachmann ein "Feintuning" der Trennkraft vornehmen.

Es ist in der Regel nicht notwendig, die exakten Trennkräfte von Detektorpaar bzw. Detektorbindung und der Bindung der spezifisch bindenden Partner zu ken­ nen. Es ist in der Regel ausreichend, die Größenordnung zu kennen, wenn sich die Trennkräfte der zwei Komplexe stark unterscheiden. So ist beispielsweise die Trennkraft zwischen Antigen und Antikörper in der Regel deutlich höher als die Kraft, die erforderlich ist, um einen Nucleinsäureduplex in der oben beschriebe­ nen Weise "reißverschlussartig" zu trennen.

Für den Fall, dass die Trennkräfte sehr genau eingestellt werden sollen, besteht die Möglichkeit die Trennkraft zwischen zwei Molekülen mit einem Kraftmikro­ skop direkt zu messen. In verschiedenen wissenschaftlichen Veröffentlichungen wurde diese Technik im Detail beschrieben. Antikörper-Antigen-Trennkräfte lie­ gen im Bereich von 50 pN bis 150 pN (Schwesinger et al., PNAS, 2000, Bd. 97, 18, 9972-9977); um einen Nucleinsäureduplex "reißverschlussartig zu trennen, müssen bei einer reinen A/T-Sequenz 9 ± 3 pN und bei einer reinen C/G- Sequenz 20 ± 3 pN aufgewendet werden (Rief et al., Nature structural biology, 1999, Bd. 6, 4, 346-349). Um dagegen einen Nucleinsäureduplex zu trennen, indem man eine Kraft an das 5'-Ende des ersten und am 5'-Ende des zweiten Stranges bzw. auf die 3'-Enden ausübt, müssen je nach Anzahl der beteiligten Basenpaare 30 bis 150 pN aufgebracht werden. Eine unter äußerer Kraft beson­ ders stabile Bindung bildet Biotin zu Avidin aus. Um diese Bindung zu trennen, müssen 160 ± 20 pN aufgebracht werden (Florin et al., Science, 1994, Bd. 264, 415-417).

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine weitere Stufe vorgeschaltet. Diese Ausführungsform ist vorgesehen für Behälter, die hochwertige Flüssigkeiten enthalten, z. B. Parfums. In dieser Ausführungsform wird auf den Behälter außen eine erste Oberfläche aufgebracht, die zumindest in einem Flächenabschnitt Partner eines spezifisch bindenden Paares aufweist. Der Flüssigkeit in dem Behälter werden komplementäre Partner des spezifisch bin­ denden Paares zugesetzt in einer Menge, die so gering ist, dass sie nicht ohne weiteres in der Flüssigkeit analysierbar ist. Weiterhin wird eine zweite Oberfläche vorgesehen, an der Partner gebunden sind, die mit dem in der Flüssigkeit vorlie­ genden spezifisch bindenden Partner bindefähig sind. Soll die Authentizität des Produktes nachgewiesen werden, so wird die in dem Behälter enthaltene Flüs­ sigkeit auf die außen auf dem Behälter befindliche Oberfläche aufgetragen und anschließend die zweite Oberfläche mit dieser Oberfläche in Kontakt gebracht und danach getrennt. Anschließend wird auf einer der beiden Oberflächen oder auf beiden Oberflächen das den Gegenstand identifizierende Muster sichtbar gemacht. So kann z. B. auf einer Parfumflasche ein Flächenabschnitt angeordnet werden, auf dem Antikörper gegen ein Antigen kovalent gebunden sind. In dem in der Parfumflasche enthaltenen Parfum kann in geringen Anteilen ein Antigen enthalten sein. Für den Fall, dass nachgewiesen werden soll, dass es sich um ein Originalprodukt handelt, wird etwas von dem Parfum auf den Flächenab­ schnitt mit den Antikörpern aufgebracht und reagieren gelassen und anschlie­ ßend gespült, um nicht gebundene Komponenten zu entfernen. Anschließend wird eine zweite Oberfläche, die Antikörper gegen ein anderes Epitop des Anti­ gens aufweist, auf die erste Oberfläche aufgebracht in solcher Art und Weise, dass ein Kontakt zwischen den an beiden Oberflächen gebundenen Partnern möglich ist. Nach einer vorbestimmten Kontaktzeit werden die beiden Oberflä­ chen wieder getrennt. Danach wird festgestellt, wo sich die Markierung befindet. Ergibt sich das vorgesehene Muster, handelt es sich um ein Originalprodukt, wird das Muster nicht festgestellt, handelt es sich um eine Fälschung, wobei sowohl der Inhalt des Behälters als auch der Behälter selbst gefälscht sein kann.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der letzteren Variante wird einer der Inhaltsstoffe der Flüssigkeit als Partner eines spezifisch bindenden Paares vorgesehen. Des weiteren werden für diesen Fall auf einem Flächenab­ schnitt des Behälters spezifisch bindende Partner eines oder mehrerer Inhalts­ stoffe der Flüssigkeit immobilisiert, und zwar mit Detektorbindung und/oder Haft­ bindung in vorbestimmtem Muster. Als Gegenfläche wird beispielsweise ein stempelartiges Substrat bereitgestellt, wobei ein fester Körper mit einer elasti­ schen Auflage versehen ist, die als Stempelfläche dient. Auf dieser Stempelflä­ che werden wiederum mit Substanzen aus der in dem Behälter vorliegenden Flüssigkeit spezifisch bindefähige Partner immobilisiert, wobei ebenfalls bevor­ zugt wiederum diese Partner mit Detektorbindung und/oder Haftbindung in vor­ bestimmtem Muster gebunden werden. Zur Authentifizierung wird dann auf die an dem Behälter befindliche Identifikationsfläche etwas von der Flüssigkeit auf­ getragen und reagieren gelassen. Nach Spülen der Oberfläche, um nicht gebun­ dene und überschüssige Komponenten zu entfernen, wird anschließend der Stempel auf diesen Flächenabschnitt aufgesetzt in solcher Art und Weise, dass ein Kontakt zwischen beiden Oberflächen zustande kommt und die entsprechen­ den Bindepartner reagieren können. Danach werden die beiden Oberflächen getrennt. An den Stellen, an denen ein passender Bindepartner zur Verfügung stand, wurde auch eine Markierung übertragen, sodass das neu entstandene Muster der Bindepartner bzw. der gebundenen Markierung nun sichtbar wird.

Eine weitere Verbesserung dieser Verfahrensvariante wird erzielt, wenn der Bin­ departner in vorbestimmten Abschnitten entweder mit Haftbindung oder Detek­ torbindung gebunden wird. Dabei werden die Bindepartner, die über eine Detek­ torbindung jeweils an ihre Oberflächen gebunden sind, auf die von den spezifisch bindenden Partnern mitgenommen, während die Bindepartner, die über eine Haftbindung gebunden sind, an den jeweiligen Oberflächen haften bleiben. Es entsteht dadurch ein Muster, wobei die Partner, die durch Haftbindung an der Oberfläche gebunden sind, bestehen bleiben und sowohl die mit ihnen bindefä­ higen Partner als auch die mit diesen Partnern wiederum bindefähigen Partner tragen. Wenn einer dieser drei Partner eine Markierung trägt, befindet sich diese Markierung somit an dem über die Haftbindung gebundenen Partner und damit auf dieser Oberfläche. Je nachdem, an welchem der gebundenen Partner die Markierung(en) sitzt/sitzen, bilden die über Haftbindung gebundenen Partner allein, und/oder mit Bindepartnern aus der Flüssigkeit, und/oder mit Bindepart­ nern von der anderen Oberfläche somit ein Muster. Da durch die Kenntnis der Inhaltsstoffe der Flüssigkeit alleine nicht festgestellt werden kann, wo welche Bindungen stattfinden könnten und selbst bei dem Wissen, was als Bindepartner auf der Oberfläche immobilisiert ist, nicht festgestellt werden kann, welches Mus­ ter sich ergeben wird, wird damit ein nachahmungssicheres Identifikationsmittel bereitgestellt.

Da die auf einem Flächenabschnitt immobilisierten Bindepartner biologische Mo­ leküle sind, die der Umwelt ausgesetzt sind und dadurch verändert werden kön­ nen, ist es in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, dass der Flä­ chenabschnitt, der die Bindepartner trägt, mit einer Schutzbeschichtung abge­ deckt ist, so lange, bis die Authentifizierung stattfindet. Der Schutz kann durch Aufkleben einer Folie, die die Bindepartner nicht bindet und auch nicht verändert, durch eine Überzugsschicht, die gegenüber den Bindepartnern inert ist, oder ähnliche Mittel bewirkt werden.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt schematisch den Aufbau einer experimentellen Durchführung.

Fig. 2 zeigt ein Fluoreszenz-Scanbild von einer Oberfläche, an der verschiede­ ne Antikörper bzw. Straptavidin (links oben Streptavidin, rechts oben Anti- Digoxygenin, links unten Anti-Antitrypsin, rechts unten Anti-Biotin) immobilisiert wurden und die mit einer Oberfläche, auf der der Detektorkomplex mit Biotin immobilisiert wurde, in Kontakt gebracht wurde.

Fig. 3 zeigt ein Fluoreszenz-Scanbild von einer Oberfläche, an der verschiede­ ne Antikörper bzw. Straptavidin (links oben Streptavidin, rechts oben Anti- Digoxygenin, links unten Anti-Antitrypsin, rechts unten Anti-Biotin) immobilisiert wurden und die mit einer Oberfläche, auf der der Detektorkomplex mit Digoxyge­ nin immobilisiert wurde, in Kontakt gebracht wurde.

Fig. 4 zeigt ein Diagramm, in dem die Ergebnisse zusammengefasst sind, die mit einem Unzip-Oligo mit und ohne Hapten auf Oberflächen, die mit vier ver­ schiedenen Proteinen beschichtet waren, erhalten wurden (Anti-Biotin- Antikörper, Anti-Digoxygenin-Antikörper, Anti-Antitrypsin-Antikörper und Strepta­ vidin).

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert. Die Abkürzung µM steht für die Einheit µmol/l.

Beispiele

Für alle Versuche wurde ultrareines Wasser für das Waschen und die Herstel­ lung der Puffer verwendet. Ölfreies N₂-Gas wurde zum Trocknen verwendet. Alle Chemikalien hatten Analysequalität.

Es wurden Versuche durchgeführt, bei denen auf einem Glasträger fluoreszenz­ markierte Bindepartner immobilisiert waren und auf einem Stempel die komple­ mentären Bindungspartner bzw. nicht spezifisch bindefähige Bindepartner immo­ bilisiert waren.

Dieses Beispiel dient dazu, zu zeigen, dass bei einer bevorzugten Ausführungs­ form des erfindungsgemäßen Verfahrens dann, wenn zwei Oberflächen in Kon­ takt gebracht werden, an denen jeweils spezifisch bindefähige Bindepartner im­ mobilisiert sind, ein Bindepartner nur dann übertragen wird, wenn er auf seinen spezifischen Bindepartner trifft, dass jedoch ein Übertrag nicht stattfindet, wenn auf der anderen Oberfläche ein nicht spezifisch bindefähiger Partner ist. Außer­ dem wird gezeigt, dass bei der Ausübung von Kraft auf eine Kette aus drei ver­ schiedenen Bindungen - Haftbindung, spezifische Bindung, Detektorbindung -, die als Detektorbindung verwendete reißverschlussartige Bindung zwischen zwei DNA-Ketten aufgeht und nicht die Bindung zwischen den zwei ausgewählten spezifischen Bindepartnern oder die Immobilisierung an den Oberflächen, etwa die kovalente Bindung, die jeweils eine stärkere Bindungskraft haben.

a) Vorbereitung der Glasträger

Es wurden Glasträger mit Aldehydgruppen an der Oberfläche (Typ CSS, Gen­ pak, Brighton, GB) verwendet. Diese Träger wurden mit 20 mg/ml HCl-NH₂-PEG- COOH (Shearwater, Huntsville, USA) in PBS pH 7,4 beschichtet. 150 µl Lösung wurden pro Träger verwendet; die Träger wurden über Nacht in feuchter Atmo­ sphäre bei Raumtemperatur inkubiert, wobei sie mit einem Deckglas mit 24 × 60 mm² bedeckt waren. Anschließend wurden die Träger mit Wasser gespült und mit N₂ getrocknet.

Die gebildeten Schiff'schen Basen wurden dann mit 1 Gew.-% NaBH₄ in Wasser 30 Minuten bei Raumtemperatur reduziert. Anschließend wurde wiederum mit Wasser gespült und mit N₂ getrocknet.

In einer weiteren Stufe wurde an dem mit PEG beschichteten Träger Oligonucle­ otide gebunden, die die Verbindung zwischen Bindepartner und Glasträger her­ stellen sollten. Hierzu wurde ein als Oligo 61 bezeichneter erster Detekorbin­ dungs-Oligo mit einer Aminogruppe am 5'-Ende verwendet. Eine 25 µmolare Verdünnung von Oligo 61 in PBS plus 7,5 mg/ml EDC wurde eingesetzt. 0,6 µl dieser Lösung wurden aufgetupft und in feuchter Atmosphäre 2 Stunden bei 40°C inkubiert. Anschließend wurde mit Wasser gespült und mit N₂ getrocknet.

Die Sequenzen der verwendeten Oligos sind im folgenden angegeben:
Oligo 61 (erster Detektorkomplex-Oligo):
5'NH₂-AAA AAA AAA ATC TCC GGC TTT ACG GCG TAT-3'
Oligo 78 (Unzip, ohne Hapten):
5'-Cy3-ATA CGC CGT AAA GCC GGA GAC AGA TAA GAC GCT ACA TGA AAA AAA AAA AA-3'
Oligo 79 (Unzip, mit Biotin):
5'-Cy3-ATA CGC CGT AAA GCC GGA GAC AGA TAA GAC GCT ACA TGA AAA AAA AAA AA-biotin-3'
Oligo 82 (Unzip, mit Digoxygenin):
5'-Cy3-ATA CGC CGT AAA GCC GGA GAC AGA TAA GAC GCT ACA TGA AAA AAA AAA AA-digoxygenin-3'.

b) Vorbereitung und Herstellung der PDMS-Stempel

Ein Stempel mit Mikrostruktur wurde hergestellt, der aus 1 mm dickem PDMS (Polydimethylsiloxan) bestand, das ein Raster mit Quadraten von 100 × 100 µm², die durch Vertiefungen mit 25 µm Breite und 1 µm Tiefe getrennt wurden, auf­ wies.

Zur Herstellung des PDMS-Stempels wurde eine Mischung von Vernetzungsrea­ genz und Siliconelastomer (Sylgard 184, Dow Corning) (1 : 10) nach intensivem Entgasen zwischen einen strukturierten Siliciumwafer und eine ebene PMMA- (Polymethylmethacrylat)-Platte gegossen. Diese Anordnung wurde zur Polymeri­ sierung 24 Stunden lang senkrecht bei Raumtemperatur aufbewahrt. Das poly­ merisierte PDMS wurde zu Stempeln in eine Größe von 1 cm² geschnitten.

Das strukturierte PDMS wurde in einem Plasma-Cleaner 60 Sekunden lang in Gegenwart von Eis funktionalisiert. Der Druck wurde dabei auf etwa 2 mbar re­ duziert.

Die mit Plasma behandelten PDMS-Stempel wurden dann silanisiert. Dazu wur­ den 2% Aldehyd-Ethoxysilan, 88% Ethanol und 10% Wasser vermischt und es wurden 50 µl/cm² dieser Mischung mit dem PDMS in feuchter Atmosphäre 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Stempel wurden dann zweimal mit Ethanol, dreimal mit Wasser gewaschen und mit N₂ getrocknet.

Die so vorbehandelten silanisierten Stempel wurden dann mit PEG beschichtet. 20 mg/ml HCl-NH₂-PEG-COOH (Shearwater, Huntsville, USA) in PBS pH 7,4 wurden verwendet. Dazu wurden jeweils 150 bis 200 µl Lösung pro PDMS- Stempel (1 cm²) in feuchter Atmosphäre bei Raumtemperatur über Nacht inku­ biert. Es wurde mit Wasser gespült und mit N₂ getrocknet.

Die gebildeten Schiff'schen Basen wurden dann mit 1 Gew.-% NaBH₄ in Wasser 30 Minuten bei Raumtemperatur reduziert. Danach wurde mit Wasser gespült und mit N₂ getrocknet.

Die funktionellen Gruppen wurden dann mit EDC/NHS aktiviert. Dazu wurden 10 mg/ml EDC und 10 mg/ml NHS in PBS pH 7,4 hergestellt. Die Stempel wurden mit jeweils 30 µl 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert unter einem Deckglas mit 12 mm Durchmesser. Danach wurde wieder mit Wasser gespült und mit N₂ getrocknet.

An die so aktivierten Stempel wurden dann die spezifisch bindefähigen Binde­ partner gebunden. Als Bindepartner wurden Antibiotin-Antikörper, Antidigoxyge­ nin-Antikörper, Anti-Antitrypsin-Antikörper und Streptavidin verwendet. Es wur­ den jeweils Lösungen von 5 mg/ml polyklonalem Antibiotin-Antikörper, 5 mg/ml polyklonalem Antidigoxygenin-Antikörper, 50 µg/ml monoklonalem Anti- Antitrypsin-Antikörper bzw. 100 µg/ml Streptavidin in PBS mit 40% Glycerin her­ gestellt. Jeweils 4 µl wurden auf einen PDMS-Stempel aufgetupft und 1 Stunde bei Raumtemperatur in feuchter Atmosphäre inkubiert. Dann wurde zuerst mit PBS mit 0,05% Tween 20 und 1% BSA 1 Minute lang und dann mit PBS mit 0,05% Tween 20 2 bis 3 Minuten lang gewaschen.

Die noch freien funktionellen Gruppen auf dem PDMS wurden dann mit 2% BSA mindestens 2 Stunden lang bei Raumtemperatur blockiert. In dieser Blockie­ rungslösung konnten die Stempel auch aufbewahrt werden. Vor der Inkubation mit dem Detektorkomplex auf dem Glasträger wurde das PDMS mit PBS 2 bis 3 Minuten lang gewaschen, mit Wasser gespült und mit N₂ getrocknet.

Um den Transfer der über die Detektorbindung gebundenen Bindepartner auf die Bindepartner, die an das PDMS gebunden waren, durchzuführen, wurde das PDMS auf den Glasträger in 1 × SSC 30 Minuten bei Raumtemperatur aufge­ drückt. Danach wurden die zwei Oberflächen vorsichtig getrennt, mit Wasser gespült und mit N₂ getrocknet.

Die bei diesem Transfer übertragenen Fluorophore wurden mit einem Fluores­ zenz-Mikroarray-Scanner GenePix 4000 B (Axon Instruments Inc., USA) gemes­ sen. Beide Oberflächen wurden mit dem 532-nm-Laser gemessen (PDMS: PMT 600 V, 100% Energie, Fokus 100; Glasträger: PMT 550 V, 33% Energie, Fokus 0). Die Hintergrundfluoreszenz des PDMS (vor dem Stempeln außerhalb der Spots) ist etwa 200 und die Hintergrundfluoreszenz des Glasträgers (außerhalb der gebundenen Oligos) ist etwa 100. Die Intensitäten der Spots wurden mit der Software gemessen, die mit dem Instrument zusammen geliefert wird, indem ein Mittelwert in einem kreisförmigen Bereich berechnet wurde. Durch diese Mes­ sung wird die gitterartige Struktur in den Flecken vernachlässigt.

Als Kontrolle wurde ein Unzip-Oligo aus der Lösung auf die blockierten Antikör­ perflecken gebunden. Jeweils eine Art von Oligo (mit Biotin, Digoxygenin oder ohne Hapten) wurde in PBS mit 10% Glycerin und 0,05% Tween 20 für einige Versuche (siehe Tabelle 7) verdünnt. Die endgültige Konzentration des Oligos war 2 µM oder 8 µM. 10 µl dieser Lösung wurden auf den vier Antikörperspots 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert unter einem Deckglas mit 12 mm Durch­ messer. In dem Fall, in dem der Oligo in PBS ohne Tween 20 gelöst wurde, wur­ de der Glasträger nur mit Wasser gespült und getrocknet. Ansonsten wurde der Glasträger 2 bis 3 Minuten lang mit PBS mit 0,05% Tween 20 gewaschen, mit Wasser gespült und mit N₂ getrocknet.

Ergebnisse

Ein PDMS-Stück mit vier Spots von verschiedenen Bindepartnern (Antikörpern bzw. Streptavidin) wurde auf einen Glasträger aufgedrückt, auf dem Unzip-Oligo mit Biotin an den ersten Detektorbindungs-Oligo hybridisiert war. Danach wurde ein PDMS-Abschnitt mit dem Fluoreszenz-Scanner auf übertragene Oligos ges­ cannt. Der Versuch wurde mehrere Male wiederholt und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die jeweiligen Glasträger wurden vor und nach dem Stempeln gescannt und die Ergebnisse in Tabelle 2 zusammengefasst. Fig. 2 zeigt ein Beispiel für einen Fluoreszenz-Scan eines PDMS-Abschnitts nach dem Stempeln des Unzip-Oligos mit Biotin. Links oben war Streptavidin angebunden, rechts oben Anti-Digoxygenin, links unten Anti-Antitrypsin, rechts unten Anti- Biotin. Die hellen Flecken sind die mit Unzip-Oligo markierten Antibiotin- Antikörper und Streptavidin. Die dunkleren Bereiche eines unspezifischen Trans­ fers von Anti-Digoxygenin und Anti-Antitrypsin-Antikörpern sind auch zu sehen.

Tabelle 1

Fluoreszenzintensität auf dem PDMS nach Stempeln mit Unzip-Oligo mit Biotin

Tabelle 2

Fluoreszenzintensität auf dem Glasträger vor und nach dem Stempeln mit Unzip- Oligo mit Biotin

Ein PDMS-Stück mit vier Spots von verschiedenen Bindepartnern (Antikörpern bzw. Streptavidin) wurde auf einen Glasträger aufgedrückt, auf dem Unzip-Oligo mit Digoxygenin an den ersten Detektorbindungs-Oligo hybridisiert war. Danach wurde ein PDMS-Abschnitt mit dem Fluoreszenz-Scanner auf übertragene Oligos gescannt. Der Versuch wurde mehrere Male wiederholt und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Die jeweiligen Glasträger wurden vor und nach dem Stempeln gescannt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Ein Beispiel für einen Fluoreszenz-Scan eines PDMS, das mit einem Unzip-Oligo mit Digoxygenin gestempelt wurde, ist in Fig. 3 gezeigt. Links oben war Strepta­ vidin angebunden, rechts oben Anti-Digoxygenin, links unten Anti-Antitrypsin, rechts unten Anti-Biotin Der einzige helle Bereich ist derjenige, wo Anti- Digoxygenin-Antikörper immobilisiert war, alle anderen Spots sind sehr schwach.

Tabelle 3

Fluoreszenzintensität auf dem PDMS nach dem Aufstempeln von Unzip-Oligo mit Digoxygenin

Tabelle 4

Fluoreszenzintensität auf dem Glasträger vor und nach dem Aufstempeln mit Unzip-Oligo mit Digoxygenin

Ein PDMS-Stück mit vier Spots von verschiedenen Bindepartnern (Antikörpern bzw. Streptavidin) wurde auf einen Glasträger aufgedrückt, auf dem Unzip-Oligo ohne Hapten an den ersten Detektorbindungs-Oligo hybridisiert war. Danach wurde ein PDMS-Abschnitt mit dem Fluoreszenz-Scanner auf übertragene Oligos gescannt. Das Ergebnis ist in Tabelle 5 zusammengefasst. Der jeweilige Glas­ träger wurde vor und nach dem Aufstempeln gescannt und das Ergebnis ist in Tabelle 6 zusammengefasst.

Tabelle 5

Fluoreszenzintensität auf dem PDMS nach dem Aufstempeln von Unzip-Oligo ohne Hapten

Tabelle 6

Fluoreszenzintensität auf dem Glasträger vor und nach dem Aufstempeln von Unzip-Oligo ohne Hapten

Als Kontrolle wurden die Oligos mit und ohne Hapten auch aus der Lösung auf Proteinspots gebunden. Die entstehenden Fluoreszenzintensitäten sind in Tabel­ le 7 zusammengefasst.

Tabelle 7

Fluoreszenzintensität auf den Spots nach Bindung der Oligos aus der Lösung (Oligo 78 = Unzip-Oligo ohne Hapten, Oligo 79 = Unzip-Oligo mit Biotin, Oligo 82 = Unzip-Oligo mit Digoxygenin, PBST = PBS mit 0,05% Tween 20)

Die Ergebnisse, die beim Stempeln erhalten wurden, die in Fig. 4 zusammenge­ fasst sind, zeigen einen höchst spezifischen Transfer des Unzip-Oligos auf den entsprechenden Proteinspot (Fluoreszenzintensitäten zwischen 20 000 und 30 000), während der unspezifische Transfer auf die anderen Proteinspots ziem­ lich niedrig ist (etwa 1600) und unabhängig von dem verwendeten Oligo ist. Das Verhältnis von spezifischem zu unspezifischem Transfer ist größer als 10 : 1.

Fig. 4 zeigt eine Zusammenfassung der beim Stempeln des Unzip-Oligos mit und ohne Hapten auf vier verschiedene Proteinspots erhaltenen Ergebnisse. Die Bin­ dung des Oligos aus der Lösung liefert weniger intensive Spots im Fall einer spezifischen Bindung (etwa 5800), aber auch eine geringere unspezifische Bin­ dung (etwa 300). Dies führt zu einem ähnlichen Verhältnis von spezifischer zu unspezifischer Bindung. Die höheren Intensitäten der Spots, die durch das Auf­ stempeln erreicht werden, beruhen auf einer höheren lokalen Konzentration. Weder die Gegenwart von Tween 20 im Bindepuffer noch unterschiedliche Waschstufen beeinflussen die Antigen-Bindung sonderlich.

Claims (24)

1. Verfahren zum Nachweis der Authentizität eines Gegenstandes, wobei der Gegenstand auf einer Oberfläche zumindest einen Flächenab­ schnitt aufweist, auf dem Partner eines spezifisch bindenden Paares in einer vorgegebenen Anordnung gebunden sind, die Oberfläche mit einer zweiten Oberfläche, die korrespondierende Flächenabschnitte aufweist, auf denen zumindest in ausgewählten Bereichen komplementäre Bindungspartner vor­ liegen, so in Kontakt gebracht wird, dass die Partner miteinander reagieren können, wobei mindestens ein Teil der Partner eine nachweisbare Markie­ rung trägt, die Flächen dann getrennt werden und auf mindestens einer der beiden Flächen die entstandene Anordnung der Markierungen nachgewie­ sen wird, wobei sich die nach dem Trennen auf mindestens einer der beiden Oberflächen entstandene Anordnung der gebundenen Partner und/oder Markierungen von der ursprünglichen Anordnung der gebundenen Partner und/oder der Markierungen auf der Oberfläche des Gegenstands unter­ scheidet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die komplementären Partner entweder kovalent oder nicht-kovalent an aus­ gewählten Flächenabschnitten der zweiten Oberfläche gebunden sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass an den Oberflächen der korrespondierenden Flächenabschnitte in vorbe­ stimmten Bereichen jeweils komplementäre Partner eines spezifisch binden­ den Paares gebunden sind, von denen jeweils mindestens einer eine Markie­ rung trägt, wobei jeweils einer der Partner über eine Haftbindung an die Oberfläche gebunden ist und der andere über eine Detektorbindung gebun­ den ist, wobei die Bindungskraft der Detektorbindung unter einer von außen angelegten Zugkraft kleiner als die Bindungskraft der spezifischen Bindung der beiden Partner und kleiner als die Bindungskraft der Haftbindung ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, dass mindestens eine der beiden Oberflächen aus einem elasti­ schen Material besteht bzw. mit einem elastischen Material beschichtet ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, dass mindestens eine der beiden Oberflächen mit Polydimethylsi­ loxan oder einem Derivat davon beschichtet ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, dass eine der beiden Oberflächen, die auf dem zu identifizierenden Gegenstand angeordnet ist, als Beschichtung aus einem elastischen Materi­ al auf einem Trägermaterial, das Papier, eine Kunststofffolie oder die Ober­ fläche des Gegenstandes sein kann, ausgebildet ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, dass einer der Partner des spezifisch bindenden Paares entweder direkt kovalent, über ein Brückenmolekül und/oder über ein zweites spezi­ fisch bindendes Paar an einer der beiden Oberflächen mit einer Haftbindung immobilisiert ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die Detektorbindung über ein spezifisch bindendes Detektor­ paar erfolgt, wobei die Bindung eine hohe Affinität, aber geringe Bindungs­ kraft aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, dass die Detektorbin­ dung durch zwei komplementäre Nucleinsäurestränge erfolgt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die komplemen­ tären Nucleinstränge DNA-, RNA-, LNA und/oder PNA-Stränge sind.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die beiden Partner des spezifisch bindenden Paares Antigen- Antikörper, Hapten-Antikörper, DNA-DNA, RNA-RNA, DNA-RNA, Aptamer- Peptid, Aptamer-Protein, Rezeptor-Ligand, Lectin-Zucker, Zinkfingerprotein- DNA, Enzym-Substrat, Biotin-Avidin/Streptavidin bzw. die jeweiligen Derivate oder Analoga davon sind.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die Partner des spezifisch bindenden Paares Biotin und Streptavidin bzw. Antibiotin-Antikörper sind.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die Bindung der jeweiligen Partner des spezifisch bindenden Paares an jeder Oberfläche teilweise über Haftbindung und teilweise über Detektorbindung erfolgt.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, dass auf einer Oberfläche verschiedene Partner von spezifisch bindenden Paaren immobilisiert sind.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, dass auf einander entsprechenden Flächenabschnitten der beiden Oberflächen jeweils nur ein vorbestimmter Anteil der Partner eines spezifisch bindenden Paares einem entsprechenden Partner des spezifisch bindenden Paares gegenüberliegt.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, dass als Markierung eine Gruppe verwendet wird, die optisch und/oder elektrisch nachweisbar ist.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, dass als Markierung eine radioaktive, fluoreszierende, lumineszie­ rende, chromophore Markierung oder ein Farbstoff oder eine leitfähige Gruppe verwendet wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17 dadurch gekennzeichnet, dass als Markierung eine fluoreszierende Gruppe verwendet wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, dass als Markierung Fluoresceinisothiocyanat, Fluorescein, Rhodamin, Tetramethylrhodamin-5- (und-6)-isothiocyanat, Texas Red oder ein Cyaninfarbstoff verwendet wird.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, dass mehrere Markierungen verwendet werden, die an verschie­ dene Partner von spezifisch bindenden Paaren gebunden sind.

21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Ober­ fläche eine Beschichtung trägt, die in Bereiche aufgeteilt ist, wobei in vorbe­ stimmten Bereichen komplementäre Bindungspartner vorliegen, die bei Kon­ takt mit der ersten Oberfläche zu den jeweiligen Partner wandern können, wobei der Kontakt der bindefähigen Partner durch Diffusion der komplemen­ tären Partner erfolgt.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschich­ tung der zweiten Oberfläche eine Diffusion der komplementären Bindepart­ ner zulässt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschich­ tung der zweiten Oberfläche ein Gel ist.

24. Vorrichtung zum Nachweis der Authentizität eines Gegenstandes in einem Verfahren gemäß Anspruch 1, umfassend eine Oberfläche, an der zumindest in einem Flächenabschnitt Partner eines spezifisch bindenden Paares, die eine Markierung tragen, gebunden sind, wobei zumindest ein Teil der Part­ ner über eine Detektorbindung gebunden ist, wobei die Detektorbindung so ausgebildet ist, dass ihre Bindungskraft schwächer als die Kraft der Bindung zwischen den spezifisch bindenden Partnern ist, wobei erst durch In-Kontakt- Bringen mit einer zweiten Oberfläche, die komplementäre Partner des spezi­ fisch bindenden Paares aufweist, und Trennen der beiden Oberflächen das die Authentizität bestätigende Muster entsteht.