NL1028064C2 - Authenticatiewerkwijze en -systeem voor het authenticeren van veiligheidsdocumenten en veiligheidsdocument. - Google Patents

Description

i

P26938NL00/JV/NBR

Korte aanduiding: Authenticatiewerkwijze en -systeem voor het authenticeren van veiligheidsdocumenten en veiligheidsdocument.

De onderhavige uitvinding heeft in het algemeen betrekking op het authenticeren van veiligheidsdocumenten.

Volgens een eerste aspect betreft de uitvinding een werkwijze voor het authenticeren van veiligheidsdocumenten, waarbij het 5 veiligheidsdocument ten minste één van een enzym en een voor het enzym geschikt substraat omvat, welke werkwijze de stappen omvat van a) het uitvoeren van een enzymatische omzetting tussen het enzym en het substraat op het veiligheidsdocument, b) het beoordelen van een detecteerbare resulterende verandering 10 van de enzymatische omzetting.

Volgens een tweede aspect heeft de uitvinding betrekking op een authenticatiesysteem voor het authenticeren van veiligheidsdocumenten, omvattende ten minste een enzym en een voor het enzym geschikt substraat, zodat het enzym in staat is tot een 15 enzymatische omzetting waarbij een detecteerbare resulterende verandering optreedt, en het veiligheidsdocument ten minste één van het enzym en het substraat omvat.

WO 90/14441, EP 0327163, US 5 139 812, US 5 429 952, US 5 643 728 en US 5 942 444 zijn voorbeelden van authenticatiesystemen en -20 werkwijzen, waarbij veiligheidskenmerken worden toegepast, die aan de levende natuur zijn ontleend.

Recentelijk, zie WO 03/038000, is voorgesteld om specifieke DNA en RNA enkelstrengsfragmenten toe te passen in dergelijke veiligheidskenmerken, vergelijk WO 87/06383, waarbij alleen 25 complementaire delen of fragmenten hybridiseren op de biomoleculen.

Volgens WO 03/038000 wordt voorgesteld de complementaire delen te voorzien van een "vlag" in de vorm van aan één uiteinde een fluorescerende stof en aan het andere uiteinde een dover, zodat de hybridisatiebinding tussen het biomolecuul en het complementaire deel 30 daarvan gemakkelijk is aan te tonen. De gebonden complementaire delen vertonen fluorescentie, de niet-gebonden delen niet. Op deze wijze is het mogelijk nagenoeg eindeloze varianten te verzinnen en te produceren, waarbij het voor vervalsers niet eenvoudig is te achterhalen welke precieze polynucleotide volgorde van belang is.

1028064 - 2 -

Uit de bronnen van de levende natuur voor het ontwikkelen van veiligheidskenmerken is tot nu toe in de praktijk weinig gebruik gemaakt van de mogelijkheden, welke enzymen bieden. Een mogelijke oorzaak daarvoor is het gebrek aan stabiliteit van veel enzymen 5 tijdens normaal gebruik van een op enzymen gebaseerd veiligheidskenmerk beveiligd voorwerp, of bij de testomstandigheden voor het vaststellen van de echtheid van het voorwerp door middel van andere proeven, of bij het testen op andere eigenschappen.

Bijvoorbeeld wordt, in het geval van de fabricage van 10 bankbiljetten, behorende tot de klasse van veiligheidsdocumenten die gebruikelijk met verschillende echtheidskenmerken zijn beveiligd, rekening gehouden met het feit dat bankbiljetten met regelmaat per ongeluk in kleding achtergelaten worden, die vervolgens wordt gewassen; de veiligheidskenmerken moeten tegen een dergelijke 15 wasbehandeling bestand zijn. Dergelijke wasbeurten zullen de stabiliteit van veel enzymen aantasten. In zo'n geval spreekt men van denaturatie. De oorspronkelijke activiteit of functie, samenhangend met het totaal van de structuur van het betreffende biomolecuul gaat dan verloren. Deze activiteit c.q. functie, in het bijzonder de 20 katalytische activiteit van biomoleculen, hangt ten nauwste samen met de ruimtelijke structuur, die vaak fragiel is, d.w.z. dat deze structuur vrij snel en vaak irreversibel verandert als gevolg van storende invloeden. Temperatuursverhogingen en soms -verlagingen zijn veelvuldig oorzaken van denaturatie.

25 Nog een ander nadeel van het gebruik van enzymen in veiligheidskenmerken is de betrekkelijk complexe methode, die vereist is om de aanwezigheid van de enzymen aan te tonen, doch in het bijzonder de langzame reactiesnelheden.

De onderhavige uitvinding heeft ten doel een 30 authenticatiewerkwijze en -systeem te verschaffen, waarbij genoemde nadelen niet of in elk geval in mindere mate optreden.

Dit doel wordt volgens de uitvinding bereikt, doordat bij de authenticatiewerkwijze en het systeem de genetische informatie voor het enzym afkomstig is uit een extremofiel micro-organisme.

35 Extremofiele micro-organismen zijn micro-organismen die leven onder extreme omstandigheden zoals hoge temperatuur, hoge druk of sterk afwijkende zuurgraad. (De optimale zuurgraad voor de meeste niet ! extremofiele organismen ligt rond de pH=7). De toepassing van zeer i bestendige enzymen bij het authenticatiesysteem volgens de uitvinding 40 vermindert het risico dat als gevolg van normaal gebruik van het te - 102806 4

I I

- 3 - beschermen voorwerp de activiteit en functie van het betreffende enzym worden aangetast, en zodoende authenticatie niet meer goed mogelijk zou zijn. Zelfs onder omstandigheden, die buiten het normale gebruik liggen, is dit risico bij de uitvinding nog beperkt. Tevens 5 laat het gebruik van dergelijke enzymen toe dat de authenticatiewerkwijze, waarmee de echtheid van een voorwerp wordt gecontroleerd, bij verhoogde temperatuur kan worden uitgevoerd, waarbij de enzymatische omzetting veel sneller plaatsvindt. Net als bij chemische reacties geeft een temperatuursverhoging van circa 10° 10 ongeveer een verdubbeling van de reactiesnelheid.

Onder veiligheidsdocumenten worden in deze aanvrage documenten verstaan, die gebruikelijk met een veiligheidskenmerk zijn beveiligd tegen fraude. Voorbeelden omvatten waardedocumenten, zoals bankbiljetten, aktes, overeenkomsten e.d., identiteitsdocumenten 15 zoals paspoorten, identiteitskaarten, toegangsdocumenten en labels.

Vele enzymen zijn bekend, alsmede nog veel meer daarbij behorende substraten, hetzij natuurlijke hetzij gemodificeerde. Het voordeel van door enzym gekatalyseerde reacties ten opzichte van gewone chemische omzettingen is de veelal grote specificiteit die 20 enzymen bezitten ten opzichte van het om te zetten substraat, en daarnaast dat de omzettingen plaatsvinden onder betrekkelijk gematigde omstandigheden terwijl voor de analoge chemische omzettingen vaak veel extremer condities vereist zijn. Bovendien zijn de chemische omzettingen veelal weinig (stereo) specifiek, terwijl de 25 enzymatische activiteit juist is gekoppeld aan de ruimtelijke structuur en grootte van het substraat.

De meeste biomoleculen met een katalytische activiteit zijn eiwitten. Bepaalde RNA moleculen hebben ook een katalytische activiteit. Ook is bekend dat katalytische antilichamen opgewekt 30 kunnen worden voor bepaalde substraten. Deze antilichamen worden opgewekt tegen chemische structuren, die overeenkomst vertonen met de overgangstoestand van het substraat tijdens een enzymatische omzetting (de geactiveerde vorm van het substraat). Derhalve worden in de onderhavige beschrijving onder de term "enzym" (natuurlijke en 35 kunstmatige) biomoleculen verstaan die een al dan niet stereospecifieke, katalytische activiteit vertonen.

Bij de authenticatie volgens de uitvinding omvat het veiligheidsdocument ten minste een stof, gekozen uit het enzym en het substraat. Bij het uitvoeren van een authenticatie met behulp van de 40 uitvinding kan men op verschillende wijzen te werk gaan. Gebruikelijk 1028064 - 4 - wordt voor het beproeven van de echtheid de niet op het veiligheidsdocument aanwezige andere stof in aanraking gebracht met de wel op het veiligheidsdocument aanwezige stof teneinde de enzymatische omzetting te initiëren. Desgewenst kunnen andere bij de 5 enzymatische omzetting te betrekken materialen reeds zijn voorzien op het veiligheidsdocument, of ten tijde van het beproeven worden toegevoegd, of een combinatie van beide. Voorbeelden van dergelijke materialen worden hierna nog besproken. Het veiligheidsdocument omvat tenminste één van de stoffen gekozen uit enzym en substraat. Het 10 veiligheidsdocument kan ook zowel het enzym als het substraat omvatten, mits in een zodanige situatie dat de enzymatische omzetting niet spontaan kan opstarten. Een geschikt voorbeeld is een veiligheidsdocument, waarbij het enzym en het substraat in gescheiden gebieden zijn voorzien. Een ander voorbeeld omvat een fysieke 15 scheiding van het enzym en het substraat. Wanneer voor de enzymatische omzetting aanvullende stoffen zoals co-enzymen en/of co-factoren nodig zijn, kunnen deze al dan niet op het documentsubstraat aanwezig zijn, of later bij authenticatie zelf worden toegevoegd.

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze en het 20 systeem volgens de uitvinding is de genetische informatie voor het enzym afkomstig uit een hyperthermofiel of thermofiel micro-organisme. Dergelijke enzymen zijn zeer goed tegen verhoogde temperaturen bestand, zoals bijvoorbeeld blijkt uit het voorkomen van bacteriën bij heetwaterbronnen. Het voordeel van het toepassen van 25 enzymen uit (hyper)thermofiele organismen in vitro is dat de katalytische activiteit bij verhoogde temperatuur lang behouden blijft, de omzettingssnelheid bij verhoogde temperatuur hoog is in vergelijking met kamertemperatuur en dat er niet snel denaturatie optreedt bij de normale gebruikstemperatuur.

30 Bekend is dat enzymen uit (hyper)thermofielen gebruikt worden bij het vermenigvuldigen van (fragmenten van) DNA moleculen. Het hiervoor noodzakelijke DNA-polymerease is, wat betreft de genetische informatie, afkomstig uit een micro-organisme dat bij heetwaterbronnen voorkomt. Bij het smelten van dubbelstrengs DNA, bij 35 verhoogde temperatuur, behoudt dit enzym zijn katalytische activiteit waardoor de cyclus van vermenigvuldiging telkens weer kan starten zonder opnieuw enzym te hoeven toevoegen.

Om grote hoeveelheden enzym uit specifieke organismen op een gemakkelijke manier te verkrijgen, wordt vaak de voor het enzym 40 coderende informatie ingebracht in een gemakkelijk te manipuleren en 1 0 2 8 0 6 4.

- 5 - te kweken micro-organisme. Door genetische manipulatie wordt er tevens voor gezorgd dat dit organisme relatief veel enzym produceert (een zgn. "overproducer"). Het enzym wordt geïsoleerd en, afhankelijk van het gewenste gebruik, meer of minder gezuiverd.

5 De enzymatische omzettingssnelheid is een functie van veel variabelen, zoals temperatuur, enzymconcentratie, substraatconcentratie, co-enzymconcentratie, de aan of afwezigheid van cofactoren, activatoren, remmers e.d.. Een cofactor is een niet-eiwitverbinding, die bij de katalytische reactie betrokken is, doch 10 uiteindelijk onveranderd uit het betreffende katalytische proces opnieuw tevoorschijn komt. Een co-enzym is eveneens een niet-eiwitverbinding, die bij de katalytische reactie betrokken is, welke via andere enzymatische reacties kan worden geregenereerd. Het onderscheid tussen co-enzym en cofactor is niet altijd scherp.

15 Remmers zijn er in vele soorten, van typen die zeer specifiek alleen de katalytische werking van bepaalde enzymen aantasten, tot typen die in het algemeen de integriteit van eiwitten of de structuren daarvan aantasten. Daarnaast kan men remmers nog indelen naar het type binding, nl. de reversibel en de irreversibel bindende. 20 Generaliserend kan men zeggen dat zeer sterke binding van een remmer aan een enzym of een covalente modificatie van een aminozuur dat op enigerlei wijze cruciaal is voor de katalyse en/of structuur van de katalytische plaats, leidt tot onomkeerbare remming.

Een recente klasse van remmers, toepasbaar bij de uitvinding, 25 zijn nucleïnezuur liganden. Dergelijke nucleïnezuur liganden zijn in staat te complexeren met de meest uiteenlopende verbindingen waaronder eiwitten. Zie bijv. US-A- 6083696, waarin liganden zijn beschreven waarmee een remming van elastase door een remmerpeptide 30.000 maal sterker werd wanneer dat remmerpeptide aan een specifiek 30 nucleïnezuur ligand werd gebonden. De beïnvloeding van de enzymwerking bleek zeer specifiek te zijn aangezien andere serine proteasen nauwelijks beïnvloed werden door deze remmercombinatie. Combinatie van een remmer met een de remming verzwakkend nucleotide is eveneens denkbaar.

35 Andere bij de uitvinding bruikbare remmers zijn die, welke minder specifiek de katalytische werking van enzymen tenietdoen omdat ze zeer algemeen de integriteit van een eiwit (-structuur) aantasten en/of aan de zij keten van een bepaald aminozuur kunnen binden. Vooral als de daardoor gemodificeerde aminozuurrest een essentiële rol 40 speelt in de structuurintegriteit van het biomolecuul en/of in het 1028064 ι - 6 - katalytische proces is het effect van modificatie ingrijpend. Bekend zijn de effecten van zware metalen (o.a. binden van zwavelgroepen) en van de remmers van de zenuwwerking zoals de specifieke binders van -OH groepen van serine.

5 Er zijn enzymen die niet volgens de Michaelis-Menten kinetiek werken (zie hierna); deze enzymen vertonen een veel complexer kinetisch gedrag en worden allosteer genoemd. Men vindt dit soort enzymen vaak in biochemische routes op regulerende posities. Dit type enzym kan bij een constante substraatconcentratie sneller of 10 langzamer gaan werken onder invloed van de zogenaamde allostere effectoren. In het kader van deze beschrijving worden deze en andere effectoren simpelweg remmers of activatoren genoemd al naar gelang hun invloed op de enzymomzettingssnelheid bij een bepaalde substraatconcentratie.

15 Met voordeel is het enzym gestabiliseerd, zodat het enzym nog beter is beschermd tegen de gebruiksomstandigheden van het authenticatiesysteem dan het van zichzelf al is. Voorbeelden daarvan omvatten hechting aan een vaste drager, of opsluiting daarin. Stabilisatie door een niet aan de reactie deelnemend biomolecuul 20 zoals een eiwit en/of polynucleotide is een verdere mogelijkheid.

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is het enzym in een startreagens aanwezig, welk startreagens een enzym stabiliserende stof omvat. Het startreagens is hier gedefinieerd als de laatste toevoeging, die plaatsvindt om de enzymatische omzetting 25 te initiëren. Bij voorkeur is deze stof gekozen uit de groep welke een co-enzym, een cofactor of een substraat - dit laatste bij meersubstraatsreacties - omvat. Het startreagens of het veiligheidsdocument kan met voordeel tevens een enzymactivator en/of een enzymremmer omvatten, zodat de enzymatische reactie gestuurd kan 30 worden.

De enzymatische omzetting kan zowel tot de klasse van een-substraatreacties behoren, als tot de klasse van de meersubstraatsreacties .

Door het gebruik van een extremofiel enzym is de kans dat bij 35 de authenticatie een echt artikel (d.w.z. niet vervalst) ten onrechte wordt aangemerkt als zijnde vals, gering. Dit verhoogt de betrouwbaarheid van de werkwijze voor het authenticeren van veiligheidsdocumenten. Met voordeel is het veiligheidsdocument voorzien van het enzym. Met het oog op de snelheid van de 40 authenticatiewerkwijze wordt de enzymatische omzetting met voordeel ___ _ 1028064 - 7 - bij verhoogde temperatuur uitgevoerd, met voordeel in een gebied tussen 50 en 95°C. In vergelijking met het laten verlopen van de enzymatische reactie bij kamertemperatuur is de snelheid in dit temperatuursgebied in het algemeen vele malen hoger (4-100 a 200 5 maal) , waardoor de tijdsduur van de totale bepaling zeer aanmerkelijk kan worden bekort.

Met voordeel is de enzymatische omzetting gekoppeld aan een chemische en/of enzymatische volgreactie. Hoewel dit de authenticatie op zich complexer maakt, verhoogt deze volgreactie het 10 beveiligingsniveau van het veiligheidsdocument.

Met voordeel worden de reactieomstandigheden voor het uitvoeren van de enzymatische omzetting, zoals pH, ionsterkte enz. constant gehouden over het te testen oppervlak van het veiligheidsdocument.

15 Wanneer een hoger beveiligingsniveau vereist is, kan men, afhankelijk van de aard van de reagentia op de te beschermen voorwerpen, ook de reactieomstandigheden tijdens het uitvoeren van de werkwijze laten variëren. Bijvoorbeeld wanneer het enzym in discrete gebieden aanwezig is, die op zekere afstand van elkaar liggen, is het 20 mogelijk de eerste enzymatische reactie te laten plaatsvinden bij kamertemperatuur, en dan telkens bij de overgang naar een volgend gebied de temperatuur te verhogen, of vice versa. De reactieconstanten of -snelheden, die aldus kunnen worden gemeten, geven een unieke "vingerafdruk" van het betreffende document.

25 Men kan enzymatische reacties van hetzelfde enzym met meerdere substraten uitvoeren, bij voorkeur in discrete gebieden, zodat nog meer specifieke informatie over de echtheid kan worden verkregen.

Stap b) van de werkwijze volgens de uitvinding kan het visueel beoordelen van de resulterende verandering omvatten, bijvoorbeeld een 30 kleurverandering. De resulterende verandering kan ook met machines worden afgelezen, waarbij desgewenst de mate en/of snelheid van verandering een verdere indicatie van de echtheid kan zijn. De beoordelingsstap kan ook het onderzoeken van een olfactorische verandering omvatten, evenals die van een tastbare verandering.

35 Bij een voorkeursuitvoeringsvorm wordt de enzymatische omzettingssnelheid bepaald, zoals hierna nog uitgebreid zal worden toegelicht.

Volgens een derde aspect betreft de uitvinding een veiligheidsdocument, zoals een akte, bankbiljet, identiteitsbewijs, 40 toegangsbewijs en paspoort, welk veiligheidsdocument is voorzien van 1028064 - 8 - een op een enzymatische omzetting tussen een enzym en een substraat gebaseerd veiligheidskenmerk. Volgens de uitvinding omvat het veiligheidskenmerk een enzym waarvan de genetische informatie afkomstig is uit een extremofiel micro-organisme.

5 De hierboven besproken voorkeursuitvoeringsvormen zijn ook van toepassing op het veiligheidsdocument volgens de uitvinding.

Bij een voorkeursuitvoeringsvorm is het enzym uniform verdeeld over het oppervlak van het veiligheidsdocument. Deze uitvoeringsvorm zal in het algemeen worden toegepast, wanneer een snelle en 10 betrekkelijk eenvoudige authenticatie gewenst is. Dit is bijvoorbeeld het geval, wanneer men alleen de aan- of afwezigheid van een enzymreactie gebruikt voor de echtheidsbepaling.

Bij een alternatieve uitvoeringsvorm is het enzym in discrete gebieden van het oppervlak van het veiligheidsdocument aanwezig. Dit 15 laat toe om de concentratie van het enzym of andere benodigde reagentia over de verschillende gebieden te variëren, zodat daaraan gerelateerde specifieke kenmerken van de enzymatische omzetting kunnen worden bepaald, zoals bijvoorbeeld concentraties, veranderingsgraad, omzettingssnelheid, reactieconstanten etc., die 20 van gebied tot gebied kunnen variëren. Een dergelijke verificatie of authenticatie is complex, zodat deze in het algemeen alleen bij zeer waardevolle en unieke documenten zal worden toegepast. Om het veiligheidsniveau verder te vergroten kan een tweede enzym als een maskerende achtergrond aanwezig zijn in het veiligheidsdocument.

25 Bijvoorbeeld is de concentratie van dit tweede enzym veel groter dan van het eerste enzym, terwijl het eerste enzym wel het enzym is, dat bij de echtheidsbepaling de gewenste omzetting bewerkstelligt. Eventueel kan men ook een niet katalytisch eiwit toevoegen zoals albumine.

30 Bij nog een andere uitvoeringsvorm omvat het veiligheidsdocument volgens de uitvinding ten minste twee verschillende enzymen, die zijn voorzien in elkaar overlappende gebieden.

Bij het authenticatiesysteem, veiligheidsdocument en werkwijze 35 volgens de uitvinding kan men gebruik maken van een aantal zeer karakteristieke kinetische eigenschappen van enzymsystemen onder allerlei variabele omstandigheden. Deze eigenschappen zijn niet falsificeerbaar behalve dan door een volkomen identiek kenmerk wat gezien het aantal mogelijke varianten nagenoeg onmogelijk na te maken 40 is via "reverse engineering".

1028064 - 9 -

Bij het gebruik van enzymen voor analytische doeleinden wordt veelal de substraatconcentratie/-hoeveelheid in een monster bepaald. Hierbij worden in het algemeen twee verschillende benaderingen onderscheiden, te weten de eindpuntsbepaling en de kinetische 5 benadering.

Men spreekt van een eindpuntsbepaling wanneer alle te bepalen substraat geheel wordt omgezet zodat het verschil tussen de begintoestand en de eindtoestand bij de test een ondubbelzinnige kwantitatieve maat vormt voor de te bepalen 10 concentratie(s)/hoeveelheden. Om een volledige omzetting te bewerkstelligen kan men in sommige gevallen hulpstappen toepassen, zoals het laten verlopen van vervolgreacties waardoor altijd een mogelijk ongunstige evenwichtsinstelling van de eerste reactie wordt tegengegaan en/of meetbare signaalveranderingen optreden. Door het 15 gebruik van een grote overmaat van een tweede substraat (bijv. water is nodig als tweede substraat) dwingt men het evenwicht een kant op waarbij het eerste substraat nagenoeg geheel wordt omgezet zodat het verschil tussen begin- en eindtoestand een kwantitatieve maat vormt voor de te bepalen concentratie(s). De hoeveelheden te gebruiken 20 enzym bepalen grotendeels de snelheid van het instellen van de eindtoestand gegeven de rest van de reactiecondities. De precieze hoeveelheden gebruikt enzym zijn niet kritisch bij een eindpuntsbepaling zolang de te bepalen substraatconcentratie maar vele malen groter is dan de enzymconcentratie; of anders gezegd: de 25 hoeveelheid substraat die gebonden is aan het enzym moet verwaarloosbaar klein zijn t.o.v. de niet enzymgebonden hoeveelheid.

De temperatuur bij de eindpuntsbepaling is niet van groot belang voorzover de reactie met zekerheid volledig compleet is in het voor de bepaling beschikbare tijdsinterval.

30 Wil men echter sneller werken bij het bepalen van een onbekende concentratie dan wordt bij voorkeur een kinetische bepaling uitgevoerd. Dit laat toe om al in een paar seconden aan de hand van een omzetsnelheid een nauwkeurige bepaling van een onbekende substraatconcentratie uit te voeren, op voorwaarde dat de ijkgegevens 35 van de snelheden van ten minste één bekende concentratie van hetzelfde substraat onder identieke meetomstandigheden bekend zijn.

De enzymsnelheid van een één-substraatreactie in de stabiele toestand (steady state) wordt weergeven in de Michaelis-Menten vergelijking. Indien een tweede substraat in zeer grote overmaat 40 aanwezig is ten opzichte van een eerste substraat dan beschouwt men 1028064 - 10 - de reactie toch als een één-substraatreactie (pseudo één-substraatreactie); bijvoorbeeld water is de tweede reactant, aanwezig in grote overmaat, bij de door alkalische fosfatase gekatalyseerde omzetting van p-nitrofenylfosfaat.

5 Bij de afleiding van de snelheidsvergelijking voor een één- substraatreactie, weergegeven in onderstaande reactievergelijking 1, gaat men ervan uit dat de substraatconcentratie ([S]) vele malen groter zal zijn dan die van het enzym ([E]0) en dat de hoeveelheid substraat aanvankelijk vele malen groter is dan die van het product 10 ([P])- Deze aannames gelden meestal ook bij in vitro enzymatische testen. Tevens wordt verondersteld dat er zich bij de eerste reactie (zie hieronder) een evenwicht instelt terwijl er zich, initieel, bij de tweede reactie nog geen evenwicht heeft ingesteld ([P] erg laag). Men neemt tevens aan dat: d[ES)/dt =0; de "steady state" aanname 15 genaamd.

Reactievergelijking 1: E+SoESoE+P

De reactiesnelheid aan het begin van de reactie wordt dan 20 gegeven door kCat [E] o [S] V = _ .Km + [S] 25 Waarin: v is de initieel gemeten snelheid; E]0 is de totale enzymconcentratie; [E] is de vrije enzymconcentratie, bij zeer lage substraatconcentratie is [E] * [E]0; '30 [S] is de vrije substraatconcentratie (maar omdat [E0] « [So], is onder gebruikelijke testcondities [S] » [S]o ) kcat een katalytische constante karakteristiek voor het enzym onder de gegeven testcondities; KM een schijnbare dissociatieconstante die kan dienen als een 35 overall dissociatieconstante voor alle enzymgebonden vormen onder de gegeven testcondities (algemeen: KM = [E] [S]/ Σ (ES], waarin de noemer de som is van alle gebonden enzymvormen);

Het product, kcat [E]o noemt men Vmax .

Onder de conditie dat [S] » KM, is de snelheid (v) van de 1 η > β n & a - 11 - gemeten reactie nagenoeg gelijk aan die van Vmax , dus rechtevenredig met de gebruikte enzymhoeveelheid en niet evenredig met die van de substraatconcentratie; het enzym is verzadigd met substraat en verhogen van de substraatconcentratie leidt niet of nauwelijks tot 5 een hogere snelheid.

Wanneer [S] « KM, dan is de reactiesnelheid zowel rechtevenredig met de enzym- als met de substraatconcentratie; vanwege de rechtevenredigheid met [S] is dit is de omstandigheid waaronder men bijvoorkeur een kinetische substraatbepaling zal 10 uitvoeren.

De snelheidsvergelijkingen voor meersubstraatsreacties zijn ingewikkelder dan de hierboven gegeven vergelijkingen; daarbij zijn de snelheidsvergelijkingen nog afhankelijk van het mechanisme van het betrokken enzym. Omgekeerd kan men uit een complete 15 snelheidsvergelijking opmaken met welk enzymmechanisme men te maken heeft; onder enzymmechanisme wordt hier verstaan het verloop van de binding van de substraten en co-enzymen evenals het loslaten van de omzettingsproducten tijdens de gehele katalytische cyclus.

De KM van een bepaald enzym voor een bepaald substraat is een 20 karakteristiek gegeven bij een enzymatisch gekatalyseerde reactie onder daarbij gegeven omstandigheden. De KM voor hetzelfde substraat kan geheel anders zijn voor enzymen welke dezelfde reactie katalyseren maar die uit een verschillend orgaan of organisme afkomstig zijn (iso-enzymen). Hoewel KM niet een rechtstreekse 25 dissociatieconstante is, is KM representatief voor de affiniteit van het enzym voor het betreffende substraat onder de gegeven omstandigheden; ingrepen in het enzym kunnen leiden tot verandering van de KM, zeker als deze ingreep de substraatbindingsplaats beïnvloedt, bijvoorbeeld door een verandering van lading in een 30 aminozuurzijketen en/of door een conformatieverandering in het eiwit en/of door sterische hindering/verandering (dit laatste als gevolg van verandering van de grootte van aminozuurzijketens).

Het is mogelijk de KM voor een bepaald substraat te bepalen door bij verschillende substraatconcentraties en een bekende (meestal 35 constante) enzymconcentratie (-hoeveelheid) de bijbehorende initiële snelheden te meten; de andere concentraties, zoals van een mogelijk tweede substraat en van co-enzymen en cofactoren, worden daarbij meestal hoog ingesteld.

Om de Km te meten kan men ook volstaan met het doen van slechts 40 een meting met een bekende aanvangsconcentratie van het substraat en . 10^80^4 - 12 - het vervolgen van deze reactie in de tijd. In beide gevallen kan men de KM van het betreffende substraat-enzymsysteem berekenen en/of via allerlei grafische methoden bepalen.

De KM zoals men deze bepaalt uit bijvoorbeeld een Lineweaver-5 Burk plot voor een bepaald substraat, wordt schijnbaar anders in de aanwezigheid van bepaalde remmers; dit is een gevolg van het feit dat deze schijnbare KM dan tevens gegevens bevat met betrekking tot de remming welke karakteristiek zijn voor de gebruikte remmer in de gegeven omstandigheden.

10 Via dezelfde methoden als boven vermeld, kan men tevens de Vmax van een enzymatisch systeem verkrijgen. Deze grootheid is evenredig met zowel de katalytische constante (kcat) als met de gebruikte enzymhoeveelheid. De Vmax verandert schijnbaar in de aanwezigheid van bepaalde remmers; uit deze verandering is bij gegeven 15 remmerconcentratie de remmingconstante (Ki) van dit soort remmers te meten. Er zijn ook remmers die schijnbaar zowel de KM term als de Vmax term doen veranderen zodanig dat de verhouding constant blijft. Tenslotte zijn er nog remmers die een gemengd remmingspatroon geven. In alle gevallen van remming is men echter in staat de Km, Vraax en Ki 20 te bepalen.

In het algemeen kiest men bij een substraatconcentratie bepaling voor de betreffende omzetting een enzym dat een grote omzetsnelheid heeft, gepaard gaande met een goede stabiliteit en specificiteit. De omzettingssnelheid bij een gegeven [S] en [E] is 25 een functie van de katalytische omzettingsconstante kcat en de bindingsconstante KM. Ruwweg geldt dat een hoge KM gecombineerd met een hoge kcat gunstig is voor een snelle omzetting. (Zie bijv. "Structure and mechanism in protein Science", 3e ed. 1999, Alan Fersht, W.H. Freeman and Company, New York, p362).

30 In de eerder genoemde enzymsnelheidsvergelijking volgens

Michaelis-Menten ziet men niet expliciet de invloeden van allerlei factoren die men gewoonlijk tijdens de test constant houdt. De pH en de temperatuur hebben bijvoorbeeld elk een uitgesproken invloed op een enzymatische reactiesnelheid.

35 De invloed van temperatuurverandering is in het algemeen gelijk aan die welke zou optreden indien de reactie ongekatalyseerd zou kunnen verlopen. Wanneer de temperatuur echter te hoog wordt, zal de gekatalyseerde reactie abrupt stoppen omdat dan denaturatie van de biokatalysator optreedt. Het gebruik van enzymen uit 40 extremofiele, in het bijzonder hyperthermofiele micro-organismen, 1 0 2 8 0 6 4.

- 13 - vermindert het risico van denaturatie door een verhoogde temperatuur.

Bij blootstelling aan extreme pH-waarden zullen veel biomoleculen denatureren, en in het gebied waar nog geen denaturatie optreedt kan de pH van grote invloed zijn op de katalytische snelheid 5 van een enzymgekatalyseerde reactie. Bij in vivo testen van enzymen wordt de pH meestal constant gehouden door pH-buffers. De chemische aard van de buffer zelf kan ook van invloed zijn op de snelheid van de omzettingen evenals de concentratie ervan. Dit laatste valt meestal toe te schrijven aan ionsterkte-effecten op de binding van 10 het enzym en het substraat. Veranderen van de zoutionconcentraties beïnvloedt ook de ionogene interacties in het enzym waardoor tevens de ruimtelijke structuur kan veranderen en gekoppeld daaraan de katalytische activiteit. Als de concentratie zout erg hoog wordt, dan gaan uitzoutingseffecten optreden die het gevolg zijn van 15 competitieve (de)hydratatie; een eiwit kan dan neerslaan zonder dat dit evenwel irreversibel tot verlies van activiteit hoeft te leiden.

Verder wordt opgemerkt dat een enzym helpt om een snellere evenwichtsinstelling mogelijk te maken. Een enzym is niet in staat de ligging van een evenwicht te veranderen. De ligging van het evenwicht 20 wordt, bij gegeven temperatuur en druk, slechts bepaald door de thermodynamische gegevens van de bij de omzetting betrokken verbindingen. Wel kan het voorkomen dat, ondanks dat de reactie gekatalyseerd wordt door een enzym, het evenwicht zich niet instelt.

Voor het bepalen volgens de uitvinding van de aanwezigheid van 25 een bepaalde verbinding in het veiligheidsdocument is het voldoende dat een specifieke verandering optreedt. Deze verandering kan direct zintuiglijk waarneembaar zijn en/of meetbaar. Deze zintuiglijke waarneembare veranderingen kunnen visueel zijn en/of olfactorisch en/of tastbaar. Soms heeft men voor een zintuiglijke waarneming nog 30 een simpel hulpmiddel nodig zoals een vergrootglas of een zogenaamd black light.

Bij de uitvinding komen in beginsel alle mogelijke wijzen van het meten van enzymenactiviteiten/enzymatische omzettingen in aanmerking.

35 Voor meetbare/kwantificeerbare veranderingen gebruikt men veelal spectrale technieken. Deze veranderingen kunnen zich voordoen als een verandering in absorptie, reflectie, fluorescentie, fosforescentie en dit alles in het uv en/of zichtbare en/of nabije IR - gebied. Verreweg de meeste enzymactiviteiten worden 40 (spectro)fotometrisch of fluorimetrisch gemeten. Andere meer 1028064 - 14 - specifiek toepasbare voorbeelden omvatten onder meer bioluminescentie, waarmee men bijvoorbeeld in staat is om zeer lage microbiële contaminaties snel te detecteren. De chemische energie uit de energierijke verbinding ATP wordt overgedragen aan een 5 fluorescente groep tijdens de zogenaamde luciferase reactie. De hoeveelheid uitgezonden licht is een maat voor de hoeveelheid aanwezig ATP en daardoor ook voor de aanwezigheid van bijvoorbeeld ATP producerende organismen. Enzymactiviteit kan ook resulteren in de verandering van optische activiteit bijv. een verandering van 10 polarisatiehoek; een voorbeeld is dat van de inwerking van sucrase op sucrose waarbij de rechtdraaiing van een sucrose-oplossing verandert in een linksdraaiing na het splitsen van de glycosidische binding (de specifieke linksdraaiing van D-fructose is groter dan die van het rechtdraaiende D-glucose). Soms meet men een enzymactiviteit door de 15 tijdens de reactie vrijkomende substraatgroepen te titreren.

Bij de stabiliteit van enzymen (i.c. de katalytische activiteit) spelen een groot aantal omstandigheden een rol, waaronder de thermische stabiliteit. Dit laatste is bij enzymen die genetisch gecodeerd zijn door (hyper)thermofiele micro-organismen groot.

20 Afhankelijk van het soort veiligheidsdocument, en de normale gebruiksomstandigheden daarvan, kan het ook van belang zijn of er bijv. enzyminactivering kan optreden tengevolge van oxidatie met zuurstof uit de lucht, of door gevoeligheid voor bepaalde stoffen, zoals (sporen van) zware metalen. De mogelijkheden voor directe 25 opname van een dergelijk gevoelig enzym in een te waarmerken voorwerp kan daardoor beperkt worden. Anderzijds kan men ook juist gebruik maken van dergelijke gevoeligheden van een enzym. Bijvoorbeeld kan het veiligheidsdocument lokaal van een remmer zijn voorzien in een bepaald patroon (bijv. in de vorm van een zichtbare en/of meetbare 30 (bar)code of geometrische figuur terwijl de andere reactanten homogeen verdeeld zijn. Bij testen op echtheid, door het toevoegen van testreagens (bevattende ten minste een enzym), zal het duidelijk worden dat de reactie ter plekke van de remmer niet/nauwelijks verloopt terwijl de reactie vlak ernaast veel sneller verloopt. Een 35 dergelijk systeem kan men mutatis mutandis ook toepassen met een activator(-verdeling) i.p.v. een remmer.

Om in vitro enzymen te stabiliseren zijn er een aantal j! mogelijkheden voorhanden. Commercieel verkrijgbare enzymen worden op ii verschillende wijzen gestabiliseerd. Soms levert men ze in droge 40 toestand (als lyophilisaat) soms in een hoge concentratie 1028064 -15- i ammoniumsulfaat, soms in een glyceroloplossing al dan niet met een buffer, soms in een hoge concentratie keukenzout, soms in alleen een buffer, soms voegt men EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) toe en soms worden ze geleverd met een van de substraten of met BSA (bovine 5 serum albumine).

Men kan enzymen immobiliseren op of in (vaste) dragers. Het binden aan een vaste drager kan stabiliteitsbevorderend zijn; de kinetische parameters kunnen veranderen.

Een specifieke manier van het binden van eiwitten is uit US 10 6287765 bekend waarbij aan polyfunctionele polynucleotide ten minste een eiwit (enzym) gebonden wordt; door meerdere eiwitten (enzymen) in een specifieke/functionele samenstelling tezamen te brengen via deze polyfunctionele nucleotide polymeren is men o.a. in staat meerdere enzymatische reacties gekoppeld te laten verlopen. Dit laatste 15 enigszins vergelijkbaar met multi-enzymcomplexen, hoewel in deze laatsten de gehele ruimtelijke/structurele organisatie optimaal is ingesteld op het efficiënt doen verlopen van meerdere opeenvolgende reacties; bekende voorbeelden van deze laatsten zijn de a-ketozuur-dehydrogenase complexen en het vetzuursynthetiserende complex.

20 Uit bovenstaande is duidelijk dat er veel verschillende mogelijkheden bestaan voor het stabiliseren van alle soorten enzymen; elk soort enzym heeft een individuele benadering nodig. Een optimale wijze van bewaren/stabiliseren is van groot belang om de reproduceerbaarheid van een kwantitatieve test van het kenmerk zo 25 goed mogelijk te waarborgen.

De meeste enzymsubstraten zijn onder biologische condities redelijk tot zeer stabiel.

De stabiliteit van cofactoren en co-enzymen varieert van uiterst stabiel tot zeer instabiel. Cofactoren in de vorm van 30 metaalionen (bijv. Mg2+) zijn bijvoorbeeld uiterst stabiel maar co-enzymen met een hoge energie-inhoud, zoals NADH of ATP, zijn bij kamertemperatuur niet stabiel (onder atmosferische condities).

Voor toepassing van de uitvinding bij een veiligheidsdocument kan het nodig zijn dat de voor de enzymatische omzetting benodigde 35 reactanten, enzymen en andere benodigdheden beschermd moeten worden tegen invloeden die tijdens normaal gebruik op het document zouden kunnen inwerken, bijvoorbeeld wateroplosbare chemicaliën in aan vochtige omstandigheden onderhevige documenten. Voorbeelden van toepasbare beschermingen omvatten het opsluiten van chemicaliën in 40 microcapsules waarbij deze chemicaliën pas vrijkomen bij het 1028064 - 16 - toevoegen van het startreagens hetzij door oplossen van de capsules hetzij door mechanische invloed. Ook is het mogelijk om een van nature wateroplosbaar reagens via een spacer aan een vaste matrix, bijvoorbeeld die van het kenmerk, te binden. Tenslotte is het 5 mogelijk om aan onoplosbare microdeeltjes via spacers wateroplosbare stoffen te immobiliseren. Als de substraten in een kenmerk daarentegen een sterk apolair karakter hebben dan is het gevaar van uitspoelen veel minder/ niet aanwezig en behoeven dergelijke voorzieningen niet persé getroffen te worden.

10 Een enzymtest wordt in het algemeen zo uitgevoerd dat er een begintoestand wordt gemeten waarin zich nog geen enzymatische omzetting heeft voorgedaan, vervolgens wordt dan een laatste toevoeging gedaan waardoor de reactie start en verloopt. Deze laatste toevoeging zal dus altijd ten minste een of meerdere reagentia moeten 15 bevatten die essentieel zijn voor het laten starten van de reactie; dat kan een enzym zijn en/of een ontbrekend substraat en/of een ontbrekend co-enzym (en mogelijk een ontbrekende cofactor). Het kan ook dat de laatste toevoeging meerdere factoren tegelijk bevat zoals een enzym en een van de substraten en/of een co-enzym. Evenzo is het 20 mogelijk dat in de laatste toevoeging het enzym ontbreekt omdat dit, in een voorbeeld van het kenmerk, in/op het substraat van het te testen kenmerk aanwezig is. Bij voorkeur moet ervoor gewaakt worden dat, voorafgaand aan de test, noch in de laatste toevoeging noch in het te testen monster (het substraat waarop/ waarin een deel van het 25 kenmerk aanwezig is) reeds een spontane omzetting heeft kunnen optreden. Het is ook denkbaar om als laatste toevoeging iets toe te voegen waardoor een volgreactie start waardoor een eerste ongunstige evenwichtsinstelling geheel wordt verschoven naar een "aflopende" reactie.

30 Een minimale uitvoering van het authenticatiesysteem volgens de uitvinding omvat alle benodigdheden voor ten minste een kwalitatief en/of kwantitatief reproduceerbare enzymatische omzetting. Daarnaast kan men nog variëren in de omstandigheden die ten minste een enzymatische omzetting kunnen beïnvloeden.

35 Het is mogelijk dat er vele stoffen aanwezig zijn die geheel inert zijn met betrekking tot ten minste een enzymatische omzetting en die deze omzetting dus niet beïnvloeden, maar die wel een eigen karakteristiek hebben zoals kleur, luminescente eigenschappen, geleidingsvermogen, optische activiteit en magnetische eigenschappen.

40 Tevens kan men allerlei stoffen opnemen die enkel dienen om het voor 1028064 I ___ ____ - 17 - een vervalser moeilijk te maken na te gaan welke stoffen werkelijk van belang zijn in het kenmerk. Zo kan men bijv. een mengsel aan stereo-isomeren toepassen waarbij slechts een van deze isomeren van belang is, en eventueel daarnaast voor de echtheidstest niet , 5 benodigde maar wel maskerende verbindingen. Ook zou men in het geval van een gewenste remming door een polynucleotide sequentie een aantal niet ter zake doende (inerte) nucleotide sequenties kunnen opnemen.

Bij een andere variant bevat het veiligheidsdocument ten minste lokaal verschillende substraatconcentraties waarbij, na toevoegen van 10 het startreagens, omzettingen met een gelijke initiële snelheid plaatsvinden omdat onder de condities de reactie aanvankelijk wel onder Vmax-condities verloopt. Het eindresultaat van de omzettingen is echter verschillend. Bij een andere variant laat men, bij lokaal verschillende substraatconcentraties, een enzymatische reactie 15 verlopen en men meet hierbij de verschillende omzetsnelheden. Uit deze metingen zijn de voor het systeem relevante kinetische parameters te berekenen.

Volgens nog een andere variant zijn discrete gebieden zo ingericht dat in een gebied een ongeremde reactie verloopt terwijl 20 in/op ten minste een ander deel van het kenmerk dezelfde enzymatische omzetting plaatsvindt onder geremde condities. Bij andere varianten kan men werken met activatoren, of met combinaties van activatoren en remmers. De onderhavige uitvinding wordt hierna verder toegelicht aan de hand van de bijgevoegde tekening, waarin: 25 Fig. 1 is een uitvoeringsvorm van een veiligheidsdocument met een lokaal veiligheidskenmerk;

Fig. 2 is een veiligheidskenmerk met meerdere deeloppervlakken;

Fig. 3-6 tonen veiligheidskenmerken met enkele variaties per 30 deeloppervlak;

Fig. 7-11 vertonen veiligheidskenmerken in de vorm van een streepcode met enkele variaties, per streepje

Fig. 12 is een kenmerk dat is opgebouwd uit verschillende tekens.

35 In figuur 1 is een veiligheidsdocument 1 weergegeven, in dit geval een bankbiljet. Het veiligheidsdocument is voorzien van op zich bekende veiligheidskenmerken, zoals een veiligheidsdraad 2 en een watermerk 3. Een uitvoeringsvorm van een veiligheidskenmerk 4 volgens de uitvinding is lokaal aangebracht, en beslaat in het hier gegeven 40 voorbeeld slechts een beperkt deel van het document 1. Het kenmerk 4 1028064 - 18 - kan geheel uniform en continu zijn uitgevoerd, maar het is ook mogelijk om binnen het kenmerk discontinuïteiten aan te brengen. De volgende figuren geven een aantal illustratieve voorbeelden daarvan. In deze figuren en voorbeelden vinden vanwege de overzichtelijkheid 5 en eenvoud slechts een of twee enzymatische omzettingen plaats. Het aantal voorbeelden is echter door de vakman eenvoudig uit te breiden door bijvoorbeeld verschillende enzymsystemen binnen het kenmerk op te nemen en/of door enzymen met dezelfde specificiteit te nemen waarvan echter de herkomst verschillend is, waardoor de KM en de Vmax 10 onder de gegeven omstandigheden kunnen verschillen.

De voorbeelden zijn bedoeld om de uitvinding, nl. ten minste een bepaalde enzymreactie met ten minste een vooraf bepaalde omzetting met een detecteerbare verandering te laten optreden, in het bijzonder na het toevoegen van een startreagens onder bekende 15 condities wat betreft de eindsamenstelling en alle relevante factoren die een enzymatische reactie kunnen beïnvloeden, te illustreren, waarbij het enzym tegen de normale gebruiksomstandigheden goed bestand is.

In de gegeven voorbeelden omvat het startreagens ten minste het 20 enzym. De voorbeelden zijn echter gemakkelijk uit te breiden met varianten waarbij het veiligheidsdocument is voorzien van ten minste het enzym, en waarbij het startreagens het enzym niet bevat.

In figuur 2 is een algemene uitvoeringvorm van het veiligheidskenmerk 4 gegeven. Elk van de gegeven deelgebieden Oa t/m 25 09 kan een identieke kenmerksamenstelling hebben; als alle deelgebieden een identieke samenstelling hebben dan is het kenmerk uniform uitgevoerd. De deelgebieden kunnen onderling echter ook verschillen qua samenstelling; in dat geval is er sprake van een of meerder discontinuïteiten in het kenmerk.

30 Elke mogelijke combinatie van ll7 12, 13 en bi, b2, b3 is mogelijk binnen de randvoorwaarden: 13 + 12 + 13 = 1 en bi + b2 +b3 = b, voor de hier gegeven rechthoekige indeling van het kenmerk, waarbij 1 staat voor lengte en b voor breedte. Het spreekt vanzelf dat het kenmerk in meer delen verdeeld kan worden dan in de hier gegeven 35 negen gebieden (algemeen bij een dergelijke onderverdeling: 1 is te verdelen in 13 t/m lx met de lengte 0 ^ ln < 1 en Σ ln =1; b is te verdelen in b3 t/m by met de breedte 0 < bn < b en Σ bn =b; het aantal deelgebieden < x*y bij een soortgelijke verdeling).

In een bijzondere uitvoering (figuur 3) ligt de nadruk op 1028064 - 19 - mogelijke variaties in de samenstelling op de verschillende deeloppervlakken. Variatie kan gelegen zijn in een of meerdere factoren die een invloed hebben op de snelheid van een enzymatische omzetting, te weten: de substraatconcentratie en/of het soort 5 substraat en/of een remmerconcentratie en/of een soort remmer en/of een cofactorconcentratie en/of een coënzymconcentratie en/of een activatorconcentratie en/of de pH en/of de ionensterkte en/of de ionensamenstelling, of specifieke combinaties van al deze factoren; de concentratie van het enzym is hier buiten beschouwing gelaten en 10 wordt in deze voorbeelden gemakshalve constant verondersteld.

Hierbij wordt opgemerkt dat totale concentraties van factoren soms identiek kunnen zijn maar dat effectieve concentraties ervan toch afwijkend kunnen zijn. Zo kan men een bepaalde vaste concentratie van een cofactor gebruiken, bijv. in de vorm van een 15 metaalion, maar daarbij tegelijkertijd variaties aanbrengen in de aanwezigheid/concentraties van een metaalcomplexvormer die een complex kan vormen met het betreffende metaalion (bijv. EDTA). Voor een enzymatische reactiesnelheid is veelal de vrije metaalionconcentratie bepalend ; deze snelheid zal dan mede 20 afhankelijk zijn van de EDTA concentratie bij een gegeven totaalconcentratie van het metaal. Een deel van deze vrije metaalionen kan gecomplexeerd zijn met een van de reactanten en/of met het enzym; deze ionen zijn dus niet in werkelijkheid vrij te noemen maar ze zijn wel effectief in de enzym gekatalyseerde reactie 25 in tegenstelling tot de EDTA-gecomplexeerde ionen. Een bekend voorbeeld van enzymatische reacties' die afhankelijk zijn van een metaal zijn die waarbij ten minste een fosfaatgroep betrokken is.

Deze reacties zijn vaak Mg2+-ion afhankelijk (complexering door Mg2+ van een of meerdere fosfaatgroepen van verbindingen die bij de 30 reactie betrokken zijn). Hoewel totale concentraties van bijv. het Mg2+-ion identiek kunnen zijn, verkrijgt men verschillende omzetsnelheden in de aanwezigheid van een vaste Mgz+-concentratie in de aanwezigheid van variërende EDTA-concentraties.

Een bijzondere uitvoeringsvorm is gegeven in fig. 4 waarbij de 35 substraatconcentraties voor ten minste een soort enzymatische omzetting bij ten minste een van de deelgebieden afwijkt van die van de andere gebieden, bij gelijkblijvende overige condities/concentraties. Hierdoor treedt er bij het testen ten minste een afwijkend enzymatische omzetsnelheid en/of eindtoestand op in ten 40 minste een van de verschillende deelgebieden.

1028064 - 20 -

Een andere bijzondere uitvoeringsvorm is gegeven in fig. 5 waarbij in ten minste een van de deelgebieden een afwijkend substraat voor een bepaalde enzymatische omzetting wordt gebruikt, waardoor dit gebied een ander signaal vertoont na testen. Men kan in ten minste 5 deelgebied 02 en 08 (deze deelgebieden zijn willekeurig gekozen) substraat Sp gebruiken terwijl ten minste een van de andere deeloppervlakken (bijv. Oj en 06) een ander substraat Sq bevat. Het zichtbare en/of meetbare signaal in de gebieden 02 en 08 zal kunnen afwijken van dat in de gebieden Ch en 06 met Sq op grond van een 10 andere omzetsnelheid en/of andere spectrale eigenschappen van de substraten en/of respectievelijke producten.

Het is bijvoorbeeld mogelijk om één omzetting met een meet-en/of visueel waarneembare kleurverandering gepaard te doen gaan terwijl de andere omzetting gepaard gaat met een meet- en/of 15 waarneembare fluorescente verandering.

Bij een andere bijzondere uitvoeringsvorm volgens fig. 6 gebruikt men in ten minste één deelgebied een gekoppelde reactie onder toepassing van een bepaald substraat en op een ander deelgebied wordt hetzelfde substraat gebruikt zonder gekoppelde reactie waardoor 20 er lokaal een ander signaal ontstaat. Zo kan men bijv. in deelgebied 05 (willekeurig voorbeeld) de zichtbare en/of meetbare omzetting krijgen van Sa----> Pa en op oppervlak 08 (willekeurig voorbeeld) de

zichtbare en/of meetbare omzetting van Sa----> Pa gevolgd door Pa + C

---> Pb + D of Pa---> Pb waarbij een zichtbare en/of meetbare 25 verandering in de tweede reactie ontstaat; de optredende signalen kunnen verschillend zijn qua kleur en/of intensiteit en/of emissie. Ook hier kunnen de omzettingen zowel visueel waarneembaar zijn en/of meetbaar via een fotometer en/of via een fluorimeter. In het gegeven voorbeeld is slechts een volgreactie aangegeven, er kan echter ook 30 gebruik gemaakt worden van meerdere volgreacties binnen een deelgebied of van onderling verschillende volgreacties in verschillende deelgebieden.

Soms kan men via volgreacties een van de reactanten (substraten en/of coënzymen) regenereren waardoor van dit reactant een 35 betrekkelijk lage beginconcentratie volstaat. Door het wegnemen van producten uit de eerste reactie(s) zal bovendien de mate van substraatomzetting van deze eerste reactie(s) gunstig worden beïnvloed. Voor volgreacties kunnen additionele enzymen nodig zijn.

Een bijzondere uitvoeringsvorm is weergegeven in fig. 7, waar 40 het kenmerk gekarakteriseerd wordt door een discontinue verdeling van | 1028064 - 21 - de in het kenmerk aanwezige en voor de enzymatische omzetting benodigde factoren/reactanten in de vorm van een (on)zichtbare en/of meetbare streepcode. In elk van de strepen waarin de uiteindelijke reactie kan plaatsvinden kan men de factoren-/reactantensamenstelling 5 identiek doen zijn maar men kan ze evenzeer laten verschillen. Als de samenstelling binnen de actieve delen van het kenmerk identiek zijn dan zal men bijvoorbeeld na het optreden van de reactie een streepcode zien met strepen met een zelfde waarneembare en/of meetbare intensiteit; het kan ook zijn dat juist alle aanvankelijk 10 waarneembare/meetbare strepen gelijkelijk verdwijnen daar waar de reactie plaatsvindt. Een en ander wordt geheel bepaald door de samenstelling van het kenmerk. Evenzo kan de uiteindelijke intensiteit van de strepen verschillen afhankelijk van de oorspronkelijke samenstelling of de uiteindelijke toevoeging(en).

15 Een bijzondere uitvoeringsvorm is gegeven in fig. 8 waarin de substraatconcentratie van ten minste een van de strepen afwijkend is van die in de overige (bij verder identieke samenstelling en omstandigheden). Dit resulteert in ten minste een afwijkende signaalverandering in deze streep vergeleken met die in de overige 20 strepen; deze afwijking kan gelegen zijn in de snelheid waarin een signaalverandering zich voltrekt en/of in de uiteindelijke mate van de signaalverandering.

Een bijzondere uitvoeringsvorm is gegeven in fig. 9 door in de strepen onderling verschillen aan te brengen in de samenstelling 25 welke de enzymsnelheid lokaal wijzigen zoals de aan-/afwezigheid van een remmer en/of een cofactor en/of een coënzym en/of een activator.

Van al deze factoren kan men, bij aanwezigheid, tevens de concentraties variëren per streep. Daarbij is het, los van deze variaties, ook nog mogelijk om lokaal de ionsterkte en de 30 ionensamenstelling te variëren.

In een bijzondere uitvoeringsvorm (fig. 10) voert men de enzymatische reacties in de verschillende deelgebieden uit onder verschillende reactieomstandigheden, specifieker verschillende pH-waarden, waardoor de omzetsnelheid in de deelgebieden verschilt, mede 35 afhankelijk van de gebruikte enzymen en substraten.

In een bijzondere uitvoeringsvorm (fig. 11) is het soort i substraat per streep verschillend, waardoor er een veelheid aan veranderingen in het totale kenmerk kunnen optreden. De substraten zouden alle door één soort enzym omzetbaar kunnen zijn maar met 40 verschillende snelheden en/of verschillende signaalveranderingen, of 1028064 - 22 - de substraten kunnen nagenoeg identiek zijn (bijv. wat betreft bruto formule), maar moeten door verschillende enzymen worden omgezet.

In figuur 12 is een uitvoeringsvorm gegeven waarbij het kenmerk is opgebouwd uit specifieke vormen, zoals tekens en/of 5 cijfers en/of figuren. Alle vormen of delen binnen het kenmerk kunnen, wat enzymatische omzettingen betreft, identieke eigenschappen hebben, maar evengoed kan er ten minste een vorm of deel afwijkend zijn van de anderen en in het uiterste geval zijn alle vormen onderling verschillend wat betreft de snelheid en/of soort van 10 enzymatische omzetting.

Het toevoegen van een startreagens kan via daarvoor bekende doseersystemen worden uitgevoerd. Ook kan men een startreagens in een pen opslaan waardoor het zetten van een streep kan volstaan voor een kwalitatieve test.

15 1028064

Claims (52)

1. Werkwijze voor het authenticeren van veiligheidsdocumenten, waarbij het veiligheidsdocument ten minste één van een enzym en een voor het enzym geschikt substraat omvat, welke werkwijze de stappen omvat van a) het uitvoeren van een enzymatische omzetting tussen het 5 enzym en een substraat, en b) het beoordelen van een detecteerbare verandering resulterend van de enzymatische omzetting, met het kenmerk dat de genetische informatie voor het enzym afkomstig is uit een extremofiel micro-organisme.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk dat de genetische informatie voor het enzym afkomstig is uit een hyperthermofiel of thermofiel micro-organisme.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk dat het 15 veiligheidsdocument is voorzien van het enzym.

4. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk dat het enzym is gestabiliseerd.

5. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk dat het enzym in een startreagens aanwezig is, dat een het enzym stabiliserende stof omvat.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk dat de het 25 enzym stabiliserende stof is gekozen uit een co-enzym of een co- factor. 7. 9. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk dat de het enzym stabiliserende stof een substraat voor meersubstraatsreactie 30 omvat.

8. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-6, met het kenmerk dat de enzymatische omzetting behoort tot de klasse van de pseudo één-substraatreacties. 35

9. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies 1-7, met het kenmerk dat de enzymatische omzetting behoort tot de klasse van 1028064 ^_ . - 24 - de meer-substraatsreacties.

10. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk dat het veiligheidskenmerk een enzymactivator en/of een 5 enzymremmer omvat.

11. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk dat een product van de enzymatische omzetting wordt toegepast als reagens in een chemische en/of enzymatische volgreactie. 10

12. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk dat het enzym uniform verdeeld is over tenminste een deel van het oppervlak van het veiligheidskenmerk.

13. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk dat het enzym in discrete gebieden van het oppervlak van het veiligheidsdocument aanwezig is.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk dat de 20 enzymconcentratie gelijk is.

15. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk dat de enzymconcentratie in de discrete gebieden niet gelijk is.

16. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk dat het veiligheidsdocument een tweede enzym als maskerende achtergrond omvat.

17. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het 30 kenmerk dat ten minste twee verschillende enzymen zijn voorzien in elkaar overlappende gebieden van het oppervlak van het veiligheidsdocument.

18. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het 35 kenmerk dat de reactieomstandigheden voor het uitvoeren van de enzymatische omzetting constant worden gehouden over het oppervlak van het veiligheidskenmerk. 1 1028064 Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, in het - 25 - bijzonder volgens conclusie 10, met het kenmerk dat de reactieomstandigheden voor het uitvoeren van de enzymatische reactie verschillend worden ingesteld over het oppervlak van het veiligheidsdocument. 5

20. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk dat de enzymatische omzetting bij verhoogde temperatuur plaatsvindt.

21. Werkwijze volgens conclusie 20, met het kenmerk dat de enzymatische omzetting plaatsvindt in een temperatuursgebied tussen 50 en 95°C.

22. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het 15 kenmerk dat stap a) het uitvoeren van enzymatische reacties van hetzelfde enzym met meerdere substraten omvat.

23. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk dat stap b) het visueel beoordelen van de resulterende 20 verandering omvat.

24. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk dat stap b) het meten van de resulterende verandering omvat.

25. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies 1-22, met het kenmerk dat stap b) het beoordelen van een olfactorische verandering omvat.

26. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies 1-22, met 30 het kenmerk dat stap b) het beoordelen van een tastbare verandering omvat. 1 2 1028064 Werkwijze volgens conclusie 24, met het kenmerk dat tijdens stap b) de enzymatische omzettingssnelheid wordt bepaald. 35 2 Werkwijze volgens conclusie 27, met het kenmerk dat vanuit tenminste één enzymatische omzettingssnelheid de Km voor tenminste een bij de reactie betrokken reactant wordt bepaald in tenminste een gebruikt enzymmeetsysteem. - 26 -

29. Werkwijze volgens conclusie 27, met het kenmerk dat vanuit ten minste een enzymatische omzettingssnelheid de Vmax voor ten minste een bij de reactie betrokken reactant wordt bepaald in ten minste een 5 gebruikt enzymmeetsysteem.

30. Werkwijze volgens conclusie 27, met het kenmerk dat vanuit ten minste een enzymatische omzettingssnelheid een remmerconstante voor ten minste een specifieke remmer wordt bepaald in ten minste een 10 gebruikt enzymmeetsysteem.

31. Werkwijze volgens conclusie 27, met het kenmerk dat vanuit ten minste een enzymatische omzettingssnelheid een activeringsconstante voor een specifieke activator wordt bepaald in ten minste een 15 gebruikt enzymmeetsysteem.

32. Werkwijze volgens een van de conclusies 27-31, met het kenmerk dat een kinetische parameter wordt bepaald in afhankelijkheid van pH en/of temperatuur bij overige gelijkblijvende condities. 20

33. Authenticatiesysteem voor het authenticeren van veiligheidsdocumenten, omvattende ten minste een enzym en een voor het enzym geschikt substraat, zodat het enzym in staat is tot een enzymatische omzetting waarbij een detecteerbare resulterende 25 verandering optreedt, en het veiligheidsdocument ten minste één van het enzym en een substraat omvat, met het kenmerk dat de genetische informatie voor het enzym afkomstig is uit een extremofiel micro-organisme.

34. Authenticatiesysteem volgens conclusie 33, met het kenmerk dat de genetische informatie voor het enzym afkomstig is uit een hyperthermofiel of thermofiel micro-organisme.

35. Authenticatiesysteem volgens conclusie 33 of 34, met het 35 kenmerk dat het enzym is gestabiliseerd.

36. Authenticatiesysteem volgens een van de voorgaande conclusies 33-35, met het kenmerk dat het enzym in een startreagens aanwezig is, dat een het enzym stabiliserende stof omvat. 10 28 06 4 - 27 -

37. Authenticatiesysteem volgens conclusie 36, met het kenmerk dat de het enzym stabiliserende stof is gekozen uit de groep omvattende een co-enzym en een co-factor. 5

38. Authenticatiesysteem volgens conclusie 36, met het kenmerk dat de het enzym stabiliserende stof is gekozen uit één substraat bij een meersubstraatsreactie.

39. Authenticatiesysteem volgens een van de voorgaande conclusies 33-37, met het kenmerk dat het enzym en het substraat in staat zijn tot een enzymatische omzetting behorende tot de klasse van de (pseudo) één-substraatreacties.

40. Authenticatiesysteem volgens een van de voorgaande conclusies 33-38, met het kenmerk dat het enzym en het substraat in staat zijn tot een enzymatische omzetting behorende tot de klasse van de meer-substraatsreacties.

41. Authenticatiesysteem volgens een van de voorgaande conclusies 33-40, met het kenmerk dat het veiligheidskenmerk een enzymactivator en/of enzymremmer omvat.

42. Veiligheidsdocument, zoals een akte, bankbiljet, 25 waardedocument, identiteitsbewijs, toegangsbewijs en paspoort, voorzien van een op een enzymatische omzetting tussen een enzym en een substraat gebaseerd veiligheidskenmerk, met het kenmerk dat het veiligheidskenmerk een enzym omvat, waarvan de genetische informatie afkomstig is uit een extremofiel micro-organisme. 30

43. Veiligheidsdocument volgens conclusie 42, met het kenmerk dat de genetische informatie voor hèt enzym afkomstig is uit een hyperthermofiel of thermofiel micro-organisme.

44. Veiligheidsdocument volgens conclusie 42 of 43, met het kenmerk dat het enzym is gestabiliseerd.

45. Veiligheidsdocument volgens een van de voorgaande conclusies 42-44, met het kenmerk dat het document voorts een het enzym 1028064 ................................... ........" " ........llll__ _ - 28 - stabiliserende stof omvat.

46. Veiligheidsdocument volgens conclusie 45, met het kenmerk dat de het enzym stabiliserende stof is gekozen uit de groep omvattende 5 een co-enzym en een cofactor.

47. Veiligheidsdocument volgens conclusie 45, met het kenmerk dat de het enzym stabiliserende stof één substraat voor een meersubstraatsreactie omvat. 10

48. Veiligheidsdocument volgens een van de voorgaande conclusies 42-46, met het kenmerk dat de enzymatische omzetting behoort tot de klasse van één-substraatreacties.

49. Veiligheidsdocument volgens een van de voorgaande conclusies 42-47, met het kenmerk dat de enzymatische omzetting behoort tot de klasse van de meer-substraatsreacties.

50. Veiligheidsdocument volgens een van de voorgaande conclusies 20 42-49, met het kenmerk dat het veiligheidskenmerk een enzymactivator en/of een enzymremmer omvat.

51. Veiligheidsdocument volgens een van de voorgaande conclusies 42-50, met het kenmerk dat het enzym uniform verdeeld is over 25 tenminste een deel van het oppervlak van het veiligheidskenmerk.

52. Veiligheidsdocument volgens een van de voorgaande conclusies 42-50, met het kenmerk dat het enzym in discrete gebieden van het oppervlak van het veiligheidsdocument aanwezig is. 30

53. Veiligheidsdocument volgens conclusies 52, met het kenmerk dat de enzymconcentratie in de discrete gebieden gelijk is.

54. Veiligheidsdocument volgens conclusie 52, met het kenmerk dat 35 de enzymconcentratie in de discrete gebieden niet gelijk is.

55. Veiligheidsdocument volgens een van de voorgaande conclusies 42-54, met het kenmerk dat het veiligheidsdocument een tweede enzym als maskerende achtergrond omvat. 1 0 2 8 0 6 4 - 29 -

56. Veiligheidsdocument volgens een van de voorgaande conclusies 42-55, met het kenmerk dat ten minste twee verschillende enzymen zijn voorzien in elkaar overlappende gebieden van het oppervlak van het 5 veiligheidsdocument. 1028064