EP1627078A1 - Verfahren zur kovalenten immobilisierung von sonden-biomolekülen an organischen oberflächen - Google Patents

Verfahren zur kovalenten immobilisierung von sonden-biomolekülen an organischen oberflächen

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EP1627078A1
EP1627078A1 EP04738552A EP04738552A EP1627078A1 EP 1627078 A1 EP1627078 A1 EP 1627078A1 EP 04738552 A EP04738552 A EP 04738552A EP 04738552 A EP04738552 A EP 04738552A EP 1627078 A1 EP1627078 A1 EP 1627078A1
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EP
European Patent Office
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probe biomolecules
probe
biomolecules
organic
nucleic acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04738552A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Holger Dr. Klapproth
Jürgen Rühe
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Original Assignee
Individual
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Publication of EP1627078A1 publication Critical patent/EP1627078A1/de
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

Definitions

  • the invention relates to a method for the covalent immobilization of probe biomolecules on organic surfaces such as polymer surfaces or surfaces of inorganic substrates modified with self-assembled monolayers using photoreactive crosslinkers with which the probe biomolecules are covalently immobilized on an organic surface, or on soluble polymers or Copolymers are covalently bound, which are then covalently immobilized on an organic surface.
  • SAMs self-assembled monolayers
  • SAMs bifunctional molecules
  • Linker « has been developed, via which sample molecules are specifically coupled or conjugated to the surface of the solid support, on which the detection is then also carried out with the aid of suitable markings (for example radioactive, colored, fluorescent).
  • bioconjugation conjugation of biological molecules
  • oligo- nucleotides or antibodies for example oligo- nucleotides or antibodies
  • bio-chips conjugation of biological molecules
  • the coupling to the carrier surface can take place directly or indirectly.
  • An example of an indirect coupling is the coupling of a nucleic acid sequence to be detected by hybridization to an immobilized, complementary oligonucleotide as a probe. In this case the use of the probe still has the advantage of the natural specificity of the interaction of biological macromolecules.
  • linkers are coupled to the sample or probe molecules via a suitable further functional group, for example an amino or epoxy group.
  • Suitable bifunctional linkers for coupling a large number of sample or probe molecules, in particular also of biological origin, to a large number of support surfaces are well known to the person skilled in the art, cf. for example, “Bioconjugate Techniques” by G. T. Hermanson, Academic Press 1996.
  • a disadvantage of these reactive (and therefore sensitive) surfaces is their often limited shelf life (a few weeks), so that they have to be stored in the absence of air.
  • the immobilization of, for example, nucleic acids on non-reactive polymer or plastic / plastic surfaces (e.g. as probes for the production of sensor / bio-chips) using conventional methods is complicated and requires a great deal of effort.
  • the object of the invention is therefore to provide a simple and quick method for the covalent immobilization of probe biomolecules on organic surfaces such as polymer surfaces or inorganic substrates modified with organic substances.
  • this object is achieved by a method for the covalent immobilization of probe biomolecules on organic surfaces such as polymer surfaces, in which
  • a probe biomolecule is provided, directly or indirectly via a spacer, with one or more photoreactive group (s) (“photocrosslinker”) (this can be terminally or laterally bound or an integral part of the chain of the biomolecule), and
  • reaction product from (a) is applied to an organic surface such as a polymer surface (for example by printing) and is covalently immobilized thereon by irradiation with light of a suitable wavelength (for example UV light), or the reaction product from (a ) is bound to a soluble (eg water-soluble) polymer or copolymer, which is then immobilized on a surface consisting of organic molecules, such as a polymer surface.
  • an organic surface such as a polymer surface (for example by printing) and is covalently immobilized thereon by irradiation with light of a suitable wavelength (for example UV light), or the reaction product from (a ) is bound to a soluble (eg water-soluble) polymer or copolymer, which is then immobilized on a surface consisting of organic molecules, such as a polymer surface.
  • this object is achieved by a process for the covalent immobilization of probe biomolecules on organic surfaces such as polymer surfaces, in which a) a soluble (for example water-soluble) polymer or copolymer with reactive groups is produced and, after the polymerization, oligomers or polymers with or several photoreactive group (s) (the photoreactive group can be terminally or laterally bound or be an integral part of the chain) and probe or receptor biomolecules (to which a target biomolecule to be detected can bind) are covalently bound, or
  • reaction product from (a) or (b) is applied to an organic surface such as a polymer surface (e.g. by printing) and is covalently immobilized thereon by irradiation with light (e.g. UV light) of a suitable wavelength.
  • organic surface such as a polymer surface (e.g. by printing) and is covalently immobilized thereon by irradiation with light (e.g. UV light) of a suitable wavelength.
  • light e.g. UV light
  • the advantage of the invention lies in the possibility of printing a viscous medium, for example the reaction product of steps (a) or (b) of the alternative process defined above, on inactive surfaces (for example silanized glass substrates or substrates made of commercially available plastics) is very easy to immobilize, namely by irradiation with light of a suitable wavelength.
  • this process significantly increases the amount of analyte that can be coupled, since it is a pseudo-three-dimensional one Matrix is built.
  • Classic problems of three-dimensional matrices such as, for example, gradient effects of the medium when printing on polymer gels, are additionally solved in this way.
  • Reactive surfaces are, for example, surfaces with epoxy, aldehyde or amino functions. Reactive surfaces often have a limited shelf life (a few weeks) and must be stored in an air-tight environment. No reactive surface means that supports made of e.g. polystyrene or polymethyl methacrylate (PMMA) can be used, which are stable for years. Another advantage is that, for example, the polymer surfaces do not have to be hydrophilized by upstream process steps, such as plasma processes, since the accessibility of the surface, for example in the alternative embodiment of the method according to the invention defined above, is established by the coupled (swellable, wettable) copolymer. Apart from this, the surface properties of the substrate (eg the sensor surface) can also be controlled very precisely in a simple manner.
  • An example of an important surface property that can be easily checked using the method described here is wettability.
  • a further advantage is the simplified analysis, since in principle only that the volume of the drop applied has to be determined and the number of immobilized probes results directly therefrom. This is not a trivial undertaking in the prior art methods for binding DNA to SAMs, for example.
  • the invention further relates to an organic surface such as a polymer surface with covalently immobilized thereon, preferably with pattern formation (for example by printing) Probe biomolecules, which can be obtained by a method defined above.
  • the invention further specifies the use of an organic surface such as a polymer surface with probe biomolecules immobilized thereon with pattern formation as a sensor chip and, according to a further embodiment, also relates to a medical or diagnostic instrument that an organic surface according to the invention such as a polymer surface or a thus obtained sensor chip.
  • the photoreactive group (s) can be selected from benzophenone or derivatives thereof, anthraquinone or derivatives thereof and thymidine or derivatives thereof.
  • Suitable reactive groups are, for example, epoxy, carboxy, active ester, isocyanate, maleimide, isothiocyanate and azlactone groups.
  • the soluble polymer or copolymer with reactive groups e.g. by copolymerization of
  • the photoreactive oligomers or polymers are covalently bound in step (a) 5'-amino modified oligothymidine and the probe biomolecules formed by covalent binding of 5 'amino modified probe biomolecules.
  • the amino modification can be a primary amino group.
  • the photoreactive oligomers or polymers and the probe or receptor biomolecules in no way have to be modified in the same way, for example 5′-amino modified, in order to be able to be covalently bound to the soluble polymer or copolymer.
  • the alternative method according to the invention is only particularly simple to carry out.
  • the group used for the modification is not subject to any particular restrictions, but is selected in accordance with the practical circumstances. For example, carboxy or thio modification is also possible.
  • 5'-aryl-modified oligothymidine and 5'-aryl or 3 '-modified probe biomolecules are copolymerized with one or more acrylate (s) or methacrylet (s) in step (b).
  • 4-methacryloyloxybenzophenone and 5'-aryl- or 3'-modified probe biomolecules are copolymerized with one or more acrylate (s) or methacrylate (s) in step (b).
  • the photoreactive group (s) is ultraviolet reactive.
  • the methods are used directly or indirectly with photoreactive groups.
  • Suitable organic surfaces for the process according to the invention are e.g. Polymer surfaces such as surfaces made of cycloolefin copolymers (COCs), polystyrene, polyethylene, polypropylene or polymethyl methacrylate (PMMA, plexiglass).
  • COC cycloolefin copolymers
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • a suitable COC is, for example, that sold by Ticona under the trade name »Topas «.
  • the process according to the invention is suitable for any organic surface, depending on the photoreactive groups used.
  • Surfaces coated with organic molecules, such as inorganic substrates coated with self-assembled monolayers (SAMs), are therefore also suitable. These SAMs themselves can be completely unreactive and can therefore consist, for example, of pure alkylsilanes.
  • the probe biomolecule can, for example, be a partner of a specifically interacting system of complementary binding partners (receptor / ligand).
  • a specifically interacting system of complementary binding partners can, for example, on the interaction of a nucleic acid with a complementary nucleic acid, the interaction of a peptide nucleic acid (PNA) with a nucleic acid, the enzyme / substrate, receptor / effector, lectin / - Sugar, antibody / antigen, avidin / biotin or streptavidin / biotin interaction are based.
  • PNA peptide nucleic acid
  • nucleic acid can be a DNA or RNA, e.g. an oligonucleotide or an aptamer or also a so-called »LNA « as offered at www.proligo.com or a single polymerizable DNA as offered under the trade name »Acrydite « at www.mosaic-technologies.com.
  • PNAs Peptide nucleic acids
  • the antibody can be, for example, a polyclonal, monoclonal, chimeric or "single-chain” antibody or a functional fragment or derivative (by "functional” it is meant that the fragment / derivative bind an antigen can act without such immunogenicity) of such an antibody.
  • a suitable copolymer can be obtained, for example, by copolymerizing methacrylic acid and glycidyl methacrylate in a 1:20 (mol / mol) mixture by adding 1% AIBN (azobisisobutyronitrile) in a solution of the monomers in a suitable solvent (e.g. 10% (v / v) monomers in chloroform) are prepared.
  • AIBN azobisisobutyronitrile
  • the resulting copolymer can be separated by precipitation with diethyl ether.
  • a photoreactive side group can be inserted, for example, by adding 5'-amino-modified oligothymidine.
  • amino-modified nucleic acid such as DNA can now be bound to unreacted glycidyl residues or added simultaneously with the oligothymidine, so that a competitive reaction takes place between the oligothymidine and the nucleic acid / DNA.
  • the amino-modified nucleic acid / DNA can be coupled to the polymer, for example in an aqueous sodium phosphate solution at pH 9.
  • the copolymer substituted in this way can now be measured (to determine the DNA content) and printed on almost any organic polymer surface as a substrate.
  • the polymer is immobilized via UV radiation at 260 nm.
  • a copolymer is formed from a UV reactive group monomer, a reactive monomer and a hydrophilic (non-reactive) monomer.
  • a UV reactive group monomer For example, 4-methacryloyloxybenzophenone, glycidoxymethacrylate and methacrylic acid.
  • a 50 nm thick layer of this polymer is produced on a PMMA substrate.
  • the polymer is immobilized here exclusively via a photo-induced coupling reaction between the benzophenone groups contained in the polymer and the substrate, triggered by UV radiation at 300 nm.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kovalenten Immobili­sierung von Sonden-Biomolekülen an organischen Oberflächen unter Verwendung von photoreaktiven Vernetzern mit denen die Sonden-Biomoleküle an einer organischen Oberfläche kovalent immobilisiert werden, oder an lösliche Polymere oder Copoly­mere kovalent gebunden werden, die dann an einer organischen Oberfläche kovalent immobilisiert werden.

Description

Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Sonden- Biomolekülen an organischen Oberflächen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Sonden-Biomolekülen an organischen Oberflächen wie Polymeroberflächen oder Oberflächen von anorgischen Substraten modifiziert mit selbstorganisierten Monolagen unter Verwendung von photoreaktiven Vernetzern mit denen die Sonden-Biomoleküle an einer organischen Oberfläche kovalent immobilisiert werden, oder an lösliche Polymere oder Copolymere kovalent gebunden werden, die dann an einer organischen Oberfläche kovalent immobilisiert werden.
In den letzten Jahren haben in der Analytik Mikrotechniken immer mehr an Bedeutung gewonnen und es sind zahlreiche Festphasensysteme auf der Grundlage von selbstorganisierten Mono- layern (engl. »self-assembled monolayers«, »SAMs«) aus bi- funktioneilen Molekülen (engl. »Linker«) entwickelt worden, über die spezifisch Probenmoleküle an die Oberfläche des festen Trägers gekoppelt bzw. konjugiert werden, an der dann auch der Nachweis mit Hilfe von geeigneten Markierungen (beispielsweise radioaktiv, gefärbt, fluoreszierend) erfolgt.
Für diese Systeme hat sich in Analogie zu den elektronischen Mikro-Chips die Bezeichnung Sensor-Chips eingebürgert. Im Falle der Konjugation von biologischen Molekülen (sog. »Biokonjugation«) an solche Sensor-Chips, beispielsweise Oligo- nukleotiden oder Antikörpern, spricht man auch von Bio-Chips. Die Kopplung an die Trägeroberfläche kann direkt oder indirekt erfolgen. Ein Beispiel für eine indirekte Kopplung ist die Kopplung einer nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz durch Hybridisierung an ein immobilisiertes, komplementäres Oligo- nukleotid als Sonde. In diesem Fall hat die Verwendung der Sonde noch den Vorteil der natürlichen Spezifität der Wechselwirkung biologischer Makromoleküle.
Typischerweise werden zur Herstellung von Sensor-Chips Oberflächen aus Metall- bzw. Halbmetalloxiden, wie z.B. Aluminiumoxid, Quarzglas, Glas, in eine Lösung von bifunktionellen Molekülen (sog. »Linker«), die beispielsweise eine Halogensi- lan- (z.B. Chlorsilan-) oder Alkoxysilangruppe zur Kopplung an die Trägeroberfläche aufweisen, getaucht, so daß sich ein selbstorganisierter Monolayer (SAM) bildet. Dieser weist in diesem Fall eine Dicke von wenigen Ängström aus . Die Kopplung der Linker an die Proben- oder Sondenmoleküle erfolgt über eine geeignete weitere funktionelle Gruppe, beispielsweise eine Amino- oder Epoxygruppe. Geeignete bifunktionelle Linker für die Kopplung einer Vielzahl von Proben- oder Sonden- Molekülen, insbesondere auch biologischen Ursprungs, an eine Vielzahl von Trägeroberflächen sind dem Fachmann gut bekannt, vgl. beispielsweise »Bioconjugate Techniques« von G. T. Her- manson, Academic Press 1996.
Ein Nachteil dieser reaktiven (und dadurch empfindlichen) Oberflächen, z.B. Oberflächen mit Epoxy-, Aldehyd- oder Ami- nofunktionen, ist deren oft nur begrenzte Haltbarkeit (wenige Wochen) , so daß sie unter Luftabschluß gelagert werden müssen. Die Immobilisierung von beispielsweise Nukleinsäuren auf nicht reaktiven Polymer- bzw. Kunststoff/Plastikoberflächen (z. B. als Sonden zur Herstellung von Sensor/Bio-Chips) mit herkömmlichen Methoden ist aber kompliziert und erfordert sehr viel Aufwand.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines einfachen und schnell durchzuführenden Verfahrens zur kovalenten Immobilisierung von Sonden-Biomolekülen an organischen Ober- flächen wie Polymeroberflächen oder mit organischen Substanzen modifizierte anorganische Substrate.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Sonden-Biomolekülen an or- ganischen Oberflächen wie Polymeroberflächen, bei dem
(a) ein Sonden-Biomolekül direkt, oder indirekt über einen Abstandhalter (»Spacer«) , mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppe (n) (»Photocrosslinker«) versehen wird (dieser kann terminal oder seitlich gebunden oder integraler Bestand- teil der Kette des Biomoleküles sein) , und
(b) das Reaktionsprodukt aus (a) auf eine organische Oberfläche wie z.B. eine Polymeroberfläche aufgebracht (z.B. durch Aufdrucken) und durch Bestrahlung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge (z.B. UV-Licht) daran kovalent immobili- siert wird, oder das Reaktionsprodukt aus (a) an ein lösliches (z.B. wasserlösliches) Polymer oder Copolymer gebunden wird, welches dann an einer aus organischen Molekülen bestehenden Oberfläche wie beispielsweise einer Polymeroberfläche immobilisiert wird. Alternativ wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Sonden-Biomolekülen an organischen Oberflächen wie Polymeroberflächen, bei dem a) ein lösliches (z.B. wasserlösliches) Polymer oder Copo- lymer mit reaktiven Gruppen hergestellt und nach der Polymerisation Oligomere oder Polymere mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppe (n) (die photoreaktive Gruppe kann terminal oder seitlich gebunden oder integraler Bestandteil der Kette sein) und Sonden- bzw. Rezeptor- Biomoleküle (an die ein nachzuweisendes Ziel-Biomolekül binden kann) kovalent gebunden werden, oder
(b) die das lösliche Polymer oder Copolymer mit reaktiven Gruppen bildenden Monomeren, copolymerisationsfähige Mo- nomere mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppe (n) und copolymerisationsfähige Sonden-Biomoleküle (im Eintopfverfahren) copolymerisiert werden,
(c) das Reaktionsprodukt aus (a) oder (b) auf eine organische Oberfläche wie eine Polymeroberfläche aufgebracht (z.B. durch Aufdrucken) und durch Bestrahlung mit Licht (z.B. UV-Licht) einer geeigneten Wellenlänge daran kovalent immobilisiert wird.
Der Vorteil der Erfindung liegt in der Möglichkeit, auf unre- aktive Oberflächen (z.B. silansierte Glasträger oder Substrate aus handelsüblichen Kunststoffen) ein viskoses Medium, z.B. das Reaktionsprodukt der Schritte (a) oder (b) des oben definierten alternativen Verfahrens, zu drucken, das sehr einfach zu immobilisisieren ist, nämlich durch Bestrahlung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge. Gleichzeitig wird durch diesen Vorgang die Menge an Analyt, die gekoppelt werden kann, wesentlich erhöht, da eine pseudo-dreidimensionale Matrix aufgebaut wird. Klassische Probleme dreidimensionaler Matrizes, wie z.B. Verlaufeffekte des Mediums beim Drucken auf Polymergele, werden auf diese Weise zusätzlich gelöst. Zudem muss nicht auf reaktive (und dadurch empfindliche) Oberflächen gedruckt werden. Reaktive Oberflächen sind z.B. Oberflächen mit Epoxy-, Aldehyd- oder Aminofunktionen . Reaktive Oberflächen weisen oft nur eine begrenzte Haltbarkeit (wenige Wochen) auf und müssen unter Luftabschluß gelagert werden. Keine reaktive Oberfläche bedeutet, dass Träger aus z.B. Polystyrol oder Polymethylmethacrylat (PMMA) verwendet werden können, die jahrelang stabil sind. Ein weiter Vorteil ist, daß z.B. die Polymeroberflächen nicht durch vorgeschaltete Prozessschritte wie z.B. Plasmaprozesse hydrophilisiert werden müssen, da die Zugänglichkeit der Oberfläche zum Bei- spiel bei der oben definierten alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens durch das gekoppelte (quellbare, benetzbare) Copolymer hergestellt wird. Abgesehen davon sind außerdem die Oberflächeneigenschaften des Substrats (z.B. der Sensoroberfläche) in einfacher Weise sehr genau zu kontrollieren. Ein Beispiel für eine wichtige Oberflächeneigenschaft die mit Hilfe des hier beschriebenen Verfahrens einfach kontrolliert werden kann, ist die Benetzbarkeit. Ein weiterer Vorteil ist die vereinfachte Analytik, da im Prinzip nur daß Volumen des aufgebrachten Tropfens bestimmt werden muß und sich daraus die Anzahl der immobilisierten Sonden unmittelbar ergibt. Dies ist bei den Verfahren des Standes der Technik zur Bindung von beispielsweise DNA an SAMs kein triviales Unterfangen.
Die Erfindung betrifft ferner eine organische Oberfläche wie eine Polymeroberfläche mit kovalent, vorzugsweise unter Musterbildung (z.B. durch Aufdrucken), darauf immobilisierten Sonden-Biomolekülen, die nach einem oben definierten Verfahren erhältlich ist.
Die Erfindung gibt ferner die Verwendung einer organischen Oberfläche wie einer Polymeroberfläche mit unter Musterbildung darauf immobilisierten Sonden-Biomolekülen als Sensor- Chip an und betrifft nach einer weiteren Ausführungsform außerdem ein medizinisches oder diagnostisches Instrument, daß eine erfindungsgemäße organische Oberfläche wie eine Polymer- Oberfläche oder einen damit erhaltenen Sensor-Chip aufweist.
Vorteilhafte und/oder bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
In den erfindungsgemäßen Verfahren kann/können die photoreaktive (n) Gruppe (n) unter Benzophenon oder Derivaten davon, An- thrachinon oder Derivaten davon und Thymidin oder Derivaten davon ausgewählt werden.
Geeignete reaktive Gruppen sind zum Beispiel Epoxy-, Carboxy- , Aktivester-, Isocyanat-, Maleinimid-, Isothiocyanat- und Azlactongruppen .
Nach einer Ausführungsform des alternativen erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt (a) das lösliche Polymer oder Co- polymer mit reaktiven Gruppen z.B. durch Copolymerisation von
(Meth) acrylsäure und/oder Dimethylacrylamid und/oder Vinylpy- rrolidon und Glycidylmethacrylat hergestellt.
Nach einer weiteren Ausführungsform des alternativen erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (a) die photoreaktiven Oligomeren oder Polymeren durch kovalente Bindung von 5 ' -aminomodifiziertem Oligothymidin und die Sonden- Biomoleküle durch kovalente Bindung von 5' -aminomodifizierten Sonden-Biomolekülen gebildet. Bei der Aminomodifizierung kann es sich um eine primäre Aminogruppe handeln. Es sei aber hier darauf hingewiesen, daß die photoreaktiven Oligomeren oder Polymeren und die Sonden- bzw. Rezeptor-Biomoleküle keineswegs auf die gleiche Weise modifiziert sein müssen, z.B. 5'- aminomodifiziert, um an das lösliche Polymer oder Copolymer kovalent gebunden werden zu können. Dadurch wird das alterna- tive erfindungsgemäße Verfahren lediglich besonders einfach durchführbar. Die zur Modifizierung verwendete Gruppe unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, sondern wird nach Maßgabe der praktischen Gegebenheiten gewählt. In Frage kommt beipielsweise auch eine Carboxy- oder Thiomodifizierung.
Nach einer weiteren Ausführungsform des alternativen erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (b) 5'-aryl- modifiziertes Oligothymidin und 5'-aryl- oder 3 ' -modifizierte Sonden-Biomoleküle mit einem oder mehreren Acrylat(en) oder Methacrylet (en) copolymerisiert .
Nach einer weiteren Ausführungsform des alternativen erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (b) 4-Methacryl- oyloxybenzophenon und 5'-aryl- oder 3 ' -modifizierte Sonden- Biomoleküle mit einem oder mehreren Acrylat(en) oder Metha- crylat(en) copolymerisiert.
Beispielsweise ist/sind die photoreaktive (n) Gruppe (n) Ultraviolett-reaktiv.
Nach weiteren Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren werden die direkt oder indirekt mit photoreaktiven Grup- pen versehenen Sonden-Biomoleküle oder (in dem alternativen Verfahren) das lösliche Polymer oder Copolymer mit kovalent gebundenen photoreaktiven Oligomeren oder Polymeren und Sonden-Biomolekülen unter Musterbildung auf eine organische Oberfläche wie eine Polymeroberfläche aufgedruckt.
Für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich als organische Oberflächen z.B. Pόlymeroberflachen wie Oberflächen aus Cy- cloolefincopolymeren (COCs) , Polystyrol, Polyethylen, Poly- propylen oder Polymethylmethacrylat (PMMA, Plexiglas) . Ein geeignetes COC ist zum Beispiel das von Ticona unter dem Handelsnamen »Topas« vertriebene. Es sei an dieser Stelle ausdrücklich darauf hingewiesen, daß sich das erfindungsgemäße Verfahren in Abhängigkeit von den verwendeten photoreaktiven Gruppen für beliebige organische Oberflächen eignet. Geeignet sind somit beispielsweise auch mit organischen Molekülen beschichtete Oberflächen wie mit selbstorganisierten Monolagen (engl. »self-assembled monolayers«, SAMs) beschichtete anorganische Substrate. Diese SAMs können selber völlig unreaktiv sein und somit beispielsweise aus reinen Alkylsilanen bestehen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Sonden-Biomolekül beispielsweise ein Partner eines spezifisch wechselwirkenden Systems von komplementären Bindungspartnern (Rezeptor/Ligand) sein.
Ein spezifisch wechselwirkendes Systems von komplementären Bindungspartnern kann beispielsweise auf der Wechselwirkung einer Nukleinsäure mit einer komplementären Nukleinsäure, der Wechselwirkung einer Peptidnukleinsäure (PNA) mit einer Nukleinsäure, der Enzym/Substrat-, Rezeptor/Effektor-, Lectin/- Zucker-, Antikörper/Antigen-, Avidin/Biotin- oder Streptavi- din/Biotin-Wechselwirkung beruhen .
Natürlich kann die Nukleinsäure eine DNA oder RNA sein, z.B. ein Oligonukleotid oder ein Aptamer oder auch eine sog. »LNA« wie unter www.proligo.com angeboten oder auch eine einpolyme- risierbare DNA wie unter dem Handelsnamen »Acrydite« unter www.mosaic-technologies.com angeboten. Auch Peptidnukleinsäu- ren (PNAs) kommen in Frage
Bei dem Antikörper kann es sich beispielsweise um einen poly- klonalen, monoklonalen, Chimären oder »Single-chain«-Anti- körper oder ein funktionelles Fragment oder Derivat (mit »funktioneil« ist gemeint, daß das Fragment/Derivat ein Anti- gen binden kann, ohne daß notwendigerweise eine Immunogenität damit verbunden ist) eines derartigen Antikörpers handeln.
Im folgenden wird die Erfindung ohne Beschränkung unter Bezugnahme auf konkrete Ausführungsformen und Beispiele anhand von Nukleinsäuren als Sonden-Biomolekülen detaillierter erläutert.
Herstellung des Copolymers:
Ein geeignetes Copolymer kann beispielsweise durch Copolymer- sisation von Methacrylsäure und Glycidylmethacrylat in einem 1 : 20 (mol/mol) Gemisch durch Zugabe von 1% AIBN (Azobisiso- butyronitril) in eine Lösung der Monomeren in einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. 10% (v/v) Monomere in Chloroform) hergestellt werden. Das entstandene Copolymer kann durch Fällen mit Diethylether abgetrennt werden. Eine photoreaktive Seitengruppe kann zum Beispiel durch Zugabe von 5' -aminomodifiziertem Oligothymidin eingefügt werden. Wahlweise kann nun aminomodifizierte Nukleinsäure wie DNA an nicht abreagierte Glycidylreste gebunden werden bzw. gleichzeitig mit dem Oligothymidin zugegeben werden, so daß eine Konkurrenzreaktion zwischen dem Oligothymidin und der Nukleinsäure/DNA stattfindet. Die aminomodifizierte Nuklein- säure/DNA kann beispielsweise in einer wäßrigen Natriumphosphatlösung bei pH 9 an das Polymer gekoppelt werden.
Das so substituierte Copolymer kann nun vermessen werden (um den DNA-Gehalt zu bestimmen) und auf fast beliebige organische Polymeroberflächen als Substrat gedruckt werden. Die Immobilisierung des Polymers erfolgt über UV-Bestrahlung bei 260 nm.
Bei einem anderen Ansatz wird ein Copolymer aus einem eine UV-reaktive Gruppe aufweisenden Monomer, einem reaktiven Monomer und einem hydrophilen (nicht reaktiven) Monomer gebil- det. Z.B. 4-Methacryloyloxybenzophenon, Glycidoxymethacrylat und Methacrylsäure . Von diesem Polymer wird eine 50 nm dicke Schicht auf einem PMMA-Substrat erzeugt. Die Immobilisierung des Polymeren erfolgt hier ausschließlich über eine photoinduzierte Kupplungsreaktion zwischen den im Polymer enthalte- nen Benzophenon-Gruppen und dem Substrat, ausgelöst durch UV- Bestrahlung bei 300 nm.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Sonden- Biomolekülen an organischen Oberflächen, bei dem (a) ein Sonden-Biomolekül direkt, oder indirekt über einen Abstandhalter, mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppe (n) versehen wird, und (b) das Reaktionsprodukt aus (a) auf eine organische Oberfläche aufgebracht und durch Bestrahlung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge daran kovalent immobilisiert wird, oder das Reaktionsprodukt aus (a) an ein lösliches Polymer oder Copolymer gebunden wird, welches dann an einer organischen Oberfläche kovalent immobilisiert wird.
2. Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Sonden- Biomolekülen an organischen Oberflächen, bei dem
(a) ein lösliches Polymer oder Copolymer mit reaktiven Gruppen hergestellt und nach der Polymerisation
Oligomere oder Polymere mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppe (n) und Sonden-Biomolekülen kovalent gebunden werden, oder (b) die das lösliche Polymer oder Copolymer mit reaktiven Gruppen bildenden Monomeren, copolymerisationsfähige Monomere mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppe (n) und copolymerisationsfähige Sonden- Biomoleküle copolymerisiert werden, (c) das Reaktionsprodukt aus (a) oder (b) auf eine or¬ ganische Oberfläche aufgebracht und durch Bestrah- lung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge daran kovalent immobilisiert wird.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei als photoreaktive Gruppe (n) (eine) unter Benzophenon oder Derivaten davon, Anthrachinon oder Derivaten davon und Thymidin oder Derivaten davon ausgewählte Gruppe (n) verwendet wird/werden.
4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei in Schritt (a) das lösliche Polymer oder Copolymer mit reaktiven Gruppen durch Copolymerisation von (Meth) acrylsäure und/oder Dimethy- lacrylamid und/oder Vinylpyrrolidon und Glycidylmetha- crylat hergestellt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei in Schritt (a) die photoreaktiven Oligomeren oder Polymeren durch kovalente Bindung von 5' -aminomodifiziertem Oligothymidin und die Sonden-Biomoleküle durch kovalente Bindung von 5'-amino- modifizierten Sonden-Biomolekülen gebildet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei als Comonomere in Schritt (b) 5' -arylmodifiziertes Oligothymidin und 5'- aryl- oder 3' -modifizierte Sonden-Biomoleküle mit einem oder mehreren Acrylat(en) oder Methacrylat (en) copolymerisiert wird/werden.
7. Verfahren nach Anspruch 2, wobei als Comonomere in Schritt (b) 4-Methacryloyloxybenzophenon und 5'-aryl- oder 3' -modifizierte Sonden-Biomoleküle mit einem oder mehreren Acrylat(en) oder Methacrylat (en) copolymerisiert wird/werden.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die photoreaktive (n) Gruppe (n) Ultraviolett-reaktiv ist/sind.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in dem in Anspruch 1 definierten Schritt (b) oder dem in Anspruch 2 definierten Schritt (c) die Aufbringung durch Aufdrucken unter Musterbildung erfolgt.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Polymeroberfläche aus Cycloolefincopolymeren, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen oder Polymethylmethacrylat besteht.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei als Sonden-Biomolekül ein Partner eines spezifisch wechselwirkenden Systems von komplementären Bindungspartnern (Rezeptor/Ligand) verwendet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das spezifisch wechselwirkende System von komplementären Bindungspartnern auf der Wechselwirkung einer Nukleinsäure mit einer komplementären Nukleinsäure, der Wechselwirkung einer Pep- tidnukleinsäure mit einer Nukleinsäure, der Enzym/Substrat-, Rezeptor/Effektor-, Lectin/Zucker-, Antikör- per/Antigen-, Avidin/Biotin- oder Streptavidin/Biotin- Wechselwirkung beruht.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Nukleinsäure eine DNA oder RNA oder ein Analogon davon ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die DNA oder RNA ein Oligonukleotid ist.
15. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Antikörper ein po- lyklonaler, monoklonaler, chimärer oder »Single-chain«-
Antikörper oder ein funktionelles Fragment oder Derivat eines derartigen Antikörpers ist.
16. Organische Oberfläche mit kovalent darauf immobilisier- ten Sonden-Biomolekülen, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
17. Organische Oberfläche mit unter Musterbildung kovalent darauf immobilisierten Sonden-Biomolekülen, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
18. Verwendung einer organischen Oberfläche nach Anspruch 17 als Sensor-Chip.
19. Medizinisches oder diagnostisches Instrument, daß eine organische Oberfläche nach Anspruch 16 oder 17 aufweist.
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