WO2015124690A1 - Zusammensetzung mit fret-paar in definierter geometrie - Google Patents

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WO2015124690A1
WO2015124690A1 PCT/EP2015/053529 EP2015053529W WO2015124690A1 WO 2015124690 A1 WO2015124690 A1 WO 2015124690A1 EP 2015053529 W EP2015053529 W EP 2015053529W WO 2015124690 A1 WO2015124690 A1 WO 2015124690A1
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WO
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analyte
fret
acceptor
donor
linking
Prior art date
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PCT/EP2015/053529
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Anne ENZENBERG
Christine Boeffel
André LASCHEWSKY
Erik Wischerhoff
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Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the detection of an analyte.
  • recognition units usually antibodies
  • immobilized on a solid support serve as "catchers" for the antigen (the analyte) to be detected, and the presence of the analyte by a labeled secondary antibody is made visible to the naked eye Labeling reagent z.
  • gold nanoparticles or colored latex particles used. The principle is widely used commercially, e.g. In mass-produced items such as home-use pregnancy tests. However, it assumes that two different recognition groups are available per analyte.
  • Detection unit is bound, displaced by analyte molecules. Disadvantage here is that a clear proof of the binding events in small
  • Binding events is; on the other hand, the method is so far only for small
  • Analyte molecules such. As glucose applicable.
  • complementary Polynukleotidstrlinde be marked at positions that after base pairing (ie the recognition process) so close a distance that an efficient energy transfer can take place, see eg Didenko, V.V.
  • Donor-acceptor pairs are used, between which a radiation-free energy transfer can take place.
  • donor and acceptor may be different fluorophores.
  • the donor may be a fluorophore while the acceptor is a fluorescence quencher.
  • Assign donor and acceptor to the complementary Polynucleotide strands on a sufficiently small distance, so there is a radiation-free energy transfer from the donor to the acceptor.
  • the donor no longer shows fluorescence, while the acceptor either emits the transferred energy radiation-free and thus as
  • Wavelength fluoresces If the complementary Polynukleotidstrssene and thus donor and acceptor spatially separated from each other, is a
  • the method has the advantage of high sensitivity when one of the complementary polynucleotide strands carries one fluorescence quencher and the other is fluorescently labeled. If the strand with the fluorescence quencher is then displaced from a sample by a more strongly binding unlabelled DNA / RNA sequence, this manifests itself in the transition from a dark to a fluorescent state. Such transitions are visually very easy to detect.
  • an analyte preferably in the field of biology, medicine or biochemistry
  • composition for the detection of an analyte comprising
  • At least one linking moiety formed by an at least bifunctional molecule i.e., a molecule having at least two functional groups
  • Linking unit connects the FRET donor and the FRET acceptor
  • Linking unit is connected.
  • an at least bifunctional molecule i.e., a molecule having at least two functional groups
  • This created by the at least bifunctional molecule hereinafter also referred to as linking molecule
  • Linking unit brings donor and acceptor of the FRET pair into a defined spatial proximity, so that a radiation-free energy transfer can take place.
  • a functional group of the linking molecule may be sufficient to allow attachment of the FRET pair (e.g., in the case of a cyclic acid anhydride group or a
  • Epoxide there is at least one second functional group for a further reaction, for example, to allow a connection to a substrate (for example, a polymer).
  • a substrate for example, a polymer
  • the composition either lacks fluorescence (i.e., acceptor is a quencher) or luminesces in the wavelength characteristic of the acceptor. Since either the donor or the acceptor is linked to the linking moiety via an analyte-specific recognition moiety and an analyte-competitive binder interacting with this analyte-specific recognition moiety, the presence of the analyte and its interaction with the analyte-specific recognition moiety may provide donor release or acceptor of the linking unit effect. This leads to a spatial separation of the FRET donor-acceptor pair, whereby the
  • Luminescence radiation of the donor is reactivated in the presence of the analyte.
  • the composition according to the invention preferably also comprises a substrate, wherein the linking unit formed by the at least bifunctional molecule is connected to this substrate.
  • the linking unit formed from the at least bifunctional molecule combines donor, acceptor and substrate with each other. If either the donor or alternatively the acceptor is separated from the linking unit in the presence of the analyte, the remaining component of the FRET pair remains immobilized on the substrate.
  • the substrate may be, for example, a polymer or a solid surface.
  • the polymer may for example be immobilized on a solid surface (eg in the form of a coating).
  • FRET Förster resonance energy transfer
  • the donor of the FRET pair is a luminophore (e.g., an organic or inorganic fluorophore or an organic or inorganic phosphorescent component) that, when excited, transfers energy to the acceptor without radiation, provided donor and acceptor are sufficiently close. The distance in which a radiation-free luminophore (e.g., an organic or inorganic fluorophore or an organic or inorganic phosphorescent component) that, when excited, transfers energy to the acceptor without radiation, provided donor and acceptor are sufficiently close. The distance in which a radiation-free
  • Resonance energy transfer between donor and acceptor is still possible, can be up to a few nanometers.
  • a suitable distance of a given FRET donor-acceptor pair in which radiation-free resonance energy transfer is still possible is either basically known to the person skilled in the art (for example based on known Förster radii or Förster distances) or can be determined by the person skilled in the art via routine experiments.
  • the acceptor may also be a luminophore or else a luminescence quencher (for example a fluorescence quencher), ie a component which does not emit the energy transferred to it in the form of luminescence.
  • a luminescence quencher for example a fluorescence quencher
  • the donor may be an organic or inorganic luminophore.
  • luminophore may be fluorescent (i.e., a fluorophore)
  • FRET donor capable of exhibiting fluorescence
  • fluorescent dyes such as Xanthene dyes (for example, povhodamine, fluorescein), naphthalimides, coumarins, cyanine dyes, oxazines, pyrenes, porphyrins, acridines, conjugated oligomers, or polymers (ie, oligomers or conjugated polymers)
  • Double bonds e.g. Oligothiophene are called.
  • Fluorescent dyes can be obtained commercially or by conventional synthesis methods known to those skilled in the art.
  • Fluorescent nanoparticles for example fluorescent semiconducting nanoparticles or fluorescent quantum dots, can also be used as donors in the FRET pair.
  • nanoparticles containing CdSE, CdS or indium phosphide may be mentioned as fluorescent nanoparticles.
  • the average diameter of such fluorescent nanoparticles can vary over a wide range and is, for example, 1 nm-15 nm or even 1.5 nm-10 nm.
  • Such fluorescent nanoparticles are available commercially or by conventional production methods known to the person skilled in the art.
  • a suitable FRET donor which can show phosphorescence, is also basically known to the person skilled in the art.
  • tris [2- (4-methylphenyl) pyridyl] iridium, tris [9,9-dihexyl-2-pyridinyl-2 ') fluorenyl] iridium and phosphorescent nanoparticles such as e.g. ZnS nanoparticles are called.
  • the mean diameter of phosphorescent nanoparticles can vary over a wide range and is for example 1 nm-15 nm or even 1.5 nm-10 nm.
  • the acceptor of the FRET pair may be a luminophore or a luminescent extinguisher.
  • Suitable luminophores which can function as acceptors in a FRET pair are generally known to the person skilled in the art.
  • donor and acceptor are different.
  • donor and acceptor are so selected that the wavelengths of the luminescence emitted by the donor and acceptor (eg fluorescence radiation or phosphorescence) as much as possible differ and the wavelength difference thus preferably by the viewer with the naked eye is perceptible.
  • the acceptor is a luminescence extinguisher (eg, fluorescence quencher or phosphorescence quencher), ie, a component that does not emit luminescent radiation.
  • Suitable fluorescence quenchers are, for example, metal nanoparticles such as gold nanoparticles, silver nanoparticles, organic compounds containing viologen structures, or organic compounds containing nitroaromatics.
  • the mean diameter of nanoparticles that act as luminescence quenchers can vary over a wide range, for example, 1 - 10 nm.
  • the composition of the invention contains at least one linking moiety formed by an at least bifunctional molecule (i.e., a molecule having at least two functional groups).
  • an at least bifunctional molecule i.e., a molecule having at least two functional groups.
  • Linking unit is connected via an analyte-specific recognition unit and an analyte-competitive binder interacting with this analyte-specific recognition unit. It is preferably in the
  • a functional group may be sufficient (for example a
  • Paares can also be done via two functional groups. Furthermore, a functional group of the linking molecule may be sufficient to control the
  • the attachment to the substrate may also be via two or more functional groups (for example, two OH groups in the linking molecule, via a polycondensation cause incorporation of the linking molecule into a polymer chain).
  • the linking molecule contains 2-4 or 2-3 functional groups.
  • the person skilled in the art knows (for example from known Förster radii or distances for certain FRET pairs) or the skilled person can use routine experiments to determine up to which distance between donor and acceptor a resonance energy transfer is still possible.
  • the skilled person can select at least bifunctional molecules of suitable size, which ensure that donor and acceptor after their attachment to the
  • Linking unit are not too far apart.
  • it may be a molecule in which the respective distance between the functional groups is smaller than the Förster radius or Förster distance or even smaller than half the Förster radius of the used FRET donor acceptor pair.
  • the linking molecule is a molecule (preferably an organic molecule) of relatively low molecular weight, for example a molecular weight of less than 300 g / mol or less than 250 g / mol or even less than 200 g / mol.
  • Suitable functional groups of the linking molecule can be readily selected by one skilled in the art. It may be, for example, a functional group containing one or more heteroatoms (e.g., O, N, or S), or a carbon-carbon double bond or triple bond. Exemplary functional groups are carboxylic acids or their salts, acid anhydrides (preferably cyclic
  • Acid anhydride groups hydroxy (alcohols or phenols), thiol, amino or ether groups (preferably cyclic ether groups such as epoxide),
  • linking at least bifunctional molecules from which the linking moiety is obtained in the composition, functional amino acids (such as serine lysine, asparagine, glutamine or cysteine), functional epoxides (such as glycidyl methacrylate), functional anhydrides, e.g. Maleic anhydride, itaconic anhydride or allylsuccinic anhydride, and acrylic compounds such as e.g. B. 2-acrylamido-2-hydroxyacetic acid.
  • functional amino acids such as serine lysine, asparagine, glutamine or cysteine
  • functional epoxides such as glycidyl methacrylate
  • functional anhydrides e.g. Maleic anhydride, itaconic anhydride or allylsuccinic anhydride
  • acrylic compounds such as e.g. B. 2-acrylamido-2-hydroxyacetic acid.
  • the donor or the acceptor is linked to the linking moiety via an analyte-specific recognition moiety and an analyte-competitive binder, the presence of the analyte and its interaction with the analyte-specific recognition moiety can cause the donor or acceptor to detach from the linking moiety.
  • analyte to be detected is determined, one of ordinary skill in the art may choose a suitable analyte-specific one
  • Select detection unit Exemplary, smaller groups such as biotin, sugar, amino acids, but also larger units such as peptides, proteins, polysaccharides, antibodies, F a b fragments of antibodies, enzymes,
  • Enzyme fragments are used as recognition units, especially for the detection of
  • analyte-competitive binders in conjunction with analyte-specific recognition units and analytes is known in principle to the person skilled in the art from displacement assays or competitive assays.
  • the skilled person on the basis of his general knowledge, can select not only a suitable analyte-specific recognition unit but also a suitable analyte-competitive binding agent.
  • exemplary competitive binders include, but are not limited to, smaller groups such as biotin, sugars, amino acids, nucleic acids, as well as peptides, proteins, nucleotides,
  • Oligosaccharides or polysaccharides are called.
  • the FRET donor and the analyte-specific recognition unit are covalently bound to the linking unit, the analyte-competitive binder is labeled with the FRET acceptor and, through its interaction with the analyte-specific recognition unit, connects the FRET acceptor to the linking moiety.
  • Labeling of the analyte-competitive binder with the FRET actor can be accomplished by linking these two components together via a covalent linkage.
  • these two components may also be non-covalently linked together (for example, one or more analyte-competitive binders present on the surface of a nanoparticle functioning as a FRET acceptor).
  • the FRET donor and the analyte-competitive binder are covalently bound to the linking moiety, the analyte-specific
  • Recognition unit with the FRET actor can be done by connecting these two components together via a covalent connection.
  • these two components may also be non-covalently linked together (for example one or more analyte-specific
  • Recognition units present on the surface of a nanoparticle acting as a FRET acceptor).
  • the FRET acceptor and the analyte-specific recognition moiety are covalently bound to the linking moiety, the analyte-competitive binder is labeled with the FRET donor and through its
  • Binders with the FRET donor can be made by connecting these two components together via a covalent bond.
  • these two components may also be non-covalently bonded together
  • analyte-competitive binders present on the surface of a FRET donor nanoparticle.
  • the FRET acceptor and the analyte-competitive binder are covalently bound to the linking moiety, the analyte-specific recognition moiety is labeled with the FRET donor, and by their
  • Recognition unit with the FRET donor can be made by connecting these two components together via a covalent connection.
  • these two components may also be non-covalently linked together (for example one or more analyte-specific
  • Recognition units present on the surface of a nanoparticle acting as a FRET donor).
  • composition according to the invention can in principle be used for the detection of a large number of different analytes.
  • Preferred analytes are, for example, bio-oligomers, biopolymers or biological particles.
  • Exemplary bio-oligomers are oligopeptides, oligosaccharides and oligonucleotides.
  • Exemplary biopolymers are polypeptides, proteins, polysaccharides, polynucleotides and nucleic acids.
  • Exemplary biological particles are viruses and bacteria.
  • the linking unit formed by the at least bifunctional molecule is preferably also connected to a substrate and thereby immobilizes the FRET donor-acceptor pair.
  • the substrate is covalently linked to the linking moiety by a reaction with one of the functional groups of the at least bifunctional molecule.
  • the substrate may be, for example, an organic or inorganic polymer. It can also be a solid surface. If the substrate is a polymer, it may be preferable to immobilize this polymer again on a solid surface.
  • This direct or indirect (eg via the polymer applied to the solid surface) immobilization offers the advantage that the acceptor displaced by the analyte (or alternatively the donor displaced by the analyte) can be completely removed from the system by rinsing. Thus, loss of intensity can be avoided by the then freely displaceable displaced acceptor accidentally gets back into the immediate vicinity of the donor.
  • the linking unit is as
  • the donor and the acceptor can be connected to the at least bifunctional molecule and this molecule already carrying the FRET donor-acceptor pair is subsequently polymerized together with other monomers.
  • this molecule already carrying the FRET donor-acceptor pair is subsequently polymerized together with other monomers.
  • Recognition unit (alternatively: the analyte-competitive binder) to covalently bind to the linking molecule, then polymerize this molecule with other monomers and then add to the analyte-competitive binder (covalent or non-covalent) FRET acceptor. Due to the high detection sensitivity of the composition according to the invention, the proportion of monomers having a FRET donor-acceptor pair or initially only the FRET donor or FRET acceptor, can be kept quite low, for example less than 5 mol% or even less as 2 mole%, based on the total amount of monomers.
  • the at least bifunctional molecule is to be polymerized into a polymer chain
  • at least one of the functional groups is a polymerizable group, for example, a carbon-carbon double bond.
  • the linking molecule still has another functional group and the polymerization is realized with the participation of this further functional group (for example a polycondensation which requires the presence of two OH groups in the linking molecule).
  • the linking unit carrying the FRET donor-acceptor pair may be present as a repeating unit in a variety of different polymers.
  • vinyl polymers such as e.g. Polyvinylpyrrolidones or
  • Polyvinylcaprolactams polyacrylamides, polyvinyl alcohols, polyolefms such as
  • Polyethylene or polypropylene or poly (meth) acrylates may be mentioned.
  • the polymer may also be a hydrogel. This can optionally be cross-linked.
  • the hydrogel may optionally also be a responsive hydrogel, for example a thermoresponsive hydrogel.
  • linking unit carrying the FRET donor-acceptor pair may be grafted onto a polymer chain.
  • possible polymers reference may be made to the above statements.
  • the polymer in which the linking unit is present as a repeating unit, or on which the linking unit is grafted, can on a
  • the linking unit can be connected to a variety of different
  • Bonded solid surfaces can be both organic (eg a polymer) and inorganic solid surfaces. If reactive groups are present on a solid surface (for example, a functionalized surface with reactive groups such as -NH 2 , -SH, -OH, -COOH or epoxy), these may have a functional group of at least Reacting bifunctional molecule and thus realize a covalent connection of the linking unit with the substrate.
  • a solid surface for example, a functionalized surface with reactive groups such as -NH 2 , -SH, -OH, -COOH or epoxy
  • the linking unit is as
  • Solid surface e.g., in the form of a polymer coating.
  • Molecule obtained moiety 001 which combines a polymer 002, a FRET donor 003 and FRET acceptor 004.
  • the FRET donor 003 may be a fluorophore.
  • the connection of the FRET acceptor 004 with the linking unit 001 is mediated via a competitive binder 005 and an analyte-specific recognition unit 006.
  • Analyte-specific recognition unit 006 is covalently bound to linking unit 001 and interacts with analyte-competitive binder 005, which in turn is linked to FRET acceptor 004.
  • the FRET acceptor 004 may be, for example, a gold nanoparticle, on the
  • the competitive binder 005 is present and mediated by its interaction with the detection unit 006, the connection of the FRET -Aceptor 004 with the linking unit 001.
  • the linking unit 001 formed from the at least bifunctional molecule donor 003 and acceptor 004 are kept at a defined distance, which is sufficiently low for a
  • the composition does not fluoresce in this state.
  • the fluorescence quencher FRET acceptor 004 is used together with the analyte-competitive binder 005 present on its surface is separated from the linking unit 001.
  • the FRET pair is disconnected
  • the left half shows a linking unit 001 obtained from an at least bifunctional molecule which connects a polymer 002, a FRET donor 003 and FRET acceptor 004.
  • the compound of the acceptor 004 which acts as a fluorescence quencher, with the
  • Linking unit 001 mediated via an analyte-specific recognition unit 006 and an analyte-competitive binder 005.
  • the analyte-competitive binder 005 is covalently bound to the linking unit 001, while analyte-specific recognition unit 006 is bound to the acceptor 004.
  • this displaces the analyte-competitive binder 005 from the analyte-specific recognition unit 006, as a result of which the acceptor 004 is separated from the linking unit 001.
  • This is shown in the right half of Figure lb.
  • the FRET pair is disconnected, energy transfer from donor 003 to acceptor 004 is no longer possible, and the fluorescence of donor 003 is activated.
  • the present invention relates to a method of making the above-described composition
  • a method of making the above-described composition comprising attaching a FRET donor and a FRET acceptor to an at least bifunctional molecule, wherein either the attachment of the FRET acceptor or the attachment of the FRET donor to the at least bifunctional molecule via an analyte-specific recognition unit and an analyte-competitive binder.
  • the method further comprises the attachment of the at least bifunctional molecule to a substrate.
  • the FRET donor and analyte-specific recognition moiety react (either simultaneously or sequentially) with the at least bifunctional molecule, followed by the addition of the analyte-competitive binding agent (covalent or non-covalent) with the FRET acceptor is marked. Since the analyte-competitive binder with the analyte-specific
  • Components ie analyte-competitive binders and analyte-specific
  • the at least bifunctional molecule is linked to a substrate via another functional group, for example in a polymerization reaction and by grafting onto a polymer.
  • the timing of this attachment to the substrate can be varied.
  • the at least bifunctional molecule can first be bound to the substrate, followed by attachment of the FRET donor and the FRET acceptor to the linking molecule.
  • the FRET donor and the analyte-specific recognition unit can be bound to the at least bifunctional molecule, followed by attachment of the linking molecule to the substrate (eg, by polymerization or grafting) and then addition of the analyte-competitive binder, the (covalent or non-covalent) with the FRET
  • the FRET donor and the analyte-competitive binder react with the at least bifunctional molecule, followed by the addition of the analyte-specific
  • Components ie analyte-competitive binders and analyte-specific
  • the at least bifunctional molecule is linked to a substrate via another functional group, for example in a polymerization reaction and by grafting onto a polymer.
  • the timing of this attachment to the substrate can be varied.
  • the at least bifunctional molecule can first be bound to the substrate, followed by attachment of the FRET donor and the FRET acceptor to the linking molecule.
  • the FRET donor and the analyte-competitive binder can be bound to the at least bifunctional molecule, followed by attachment of the linking molecule to the substrate (eg, by polymerization or grafting) and then addition of the labeled with the FRET acceptor Analyte-specific detection unit.
  • the FRET acceptor and the analyte-specific recognition moiety react with the at least bifunctional molecule, followed by the addition of the analyte-competitive binding agent (covalent or non-covalent) with the FRET -Donor is marked. Since the analyte-competitive binder interacts with the analyte-specific recognition unit, the FRET donor is via these two components, ie analyte-competitive binder and analyte-specific recognition unit, with the
  • the at least bifunctional molecule is linked to a substrate via another functional group, for example in a polymerization reaction and by grafting onto a polymer.
  • Time for this attachment to the substrate can be varied.
  • the at least bifunctional molecule can first be bound to the substrate, followed by attachment of the FRET acceptor and the FRET donor to the linking molecule.
  • the FRET acceptor and the analyte-specific recognition unit are bound to the at least bifunctional molecule, followed by the attachment of the linking molecule to the substrate (eg by polymerization or
  • the FRET acceptor and the analyte-competitive binder may react (either simultaneously or sequentially) with the at least bifunctional molecule, followed by the addition of the analyte-specific recognition moiety labeled with the FRET donor.
  • the FRET donor is connected to the linking molecule via these two components, ie analyte-competitive binder and analyte-specific recognition unit.
  • the at least bifunctional molecule is connected via a further functional group with a substrate, for example in one
  • the timing of this attachment to the substrate can be varied.
  • the at least bifunctional molecule can first be bound to the substrate and then followed by attachment of the FRET acceptor and the FRET donor to the linking molecule.
  • the FRET acceptor and the analyte-competitive binder can be bound to the at least bifunctional molecule, followed by attachment of the linking molecule to the substrate (eg, by polymerization or grafting) and then addition of the labeled with the FRET donor analyte-specific
  • the present invention relates to a device for detecting an analyte, the device being that described above
  • composition contains.
  • the device according to the invention may also comprise further device elements which are customary for this type of device, for example a signal converter and / or an electrical amplifier.
  • the composition according to the invention exhibits a marked change in the luminescence behavior upon attachment of the analyte to the detection unit, which can also be clearly visible to the naked eye, it is possible within the scope of the present invention for the device to have neither a
  • Signal converter still has an electrical amplifier.
  • the present invention relates to the use of the above-described composition for the detection of an analyte.
  • composition according to the invention can in principle be used for the detection of a large number of different analytes.
  • Preferred analytes are, for example, bio-oligomers, biopolymers or biological particles.
  • Exemplary bio-oligomers are oligopeptides, oligosaccharides and oligonucleotides.
  • Exemplary biopolymers are polypeptides, proteins, polysaccharides, polynucleotides and nucleic acids.
  • Exemplary biological particles are viruses and bacteria.
  • composition labeling of the analyte is not required.
  • the use therefore preferably takes place for the detection of an unlabelled analyte.
  • maleic anhydride acts as a bifunctional molecule which in the composition forms the linking moiety for acceptor, donor and substrate.
  • the FRET donor is rhodamine B (a fluorescent dye).
  • Gold nanoparticles act as a fluorescence-quenching FRET acceptor.
  • the rhodamine dye is covalently bound to the maleic anhydride.
  • Amantadine hydrochloride is used as test analyte.
  • the acceptor i.e., a gold nanoparticle
  • the acceptor is analyte-specific
  • Linking unit connected.
  • analyte-specific recognition unit cyclodextrin
  • adamantane acts as an analyte-competitive binder.
  • the analyte-competitive binder is covalently bound to the maleic anhydride.
  • the cyclodextrin is immobilized on the surface of the gold nanoparticles, yielding an analyte-specific recognition unit (cyclodextrin) labeled with the FRET acceptor (ie, gold nanoparticle).
  • the gold nanoparticle ie the acceptor
  • the acceptor ie, the gold nanoparticle
  • the acceptor is detached from the linking moiety because it becomes stronger between the analyte-specific recognition moiety and the analyte Interaction occurs as between the analyte-specific recognition group and the analyte-competitive binder.
  • the fluorophore pvhodamine B was chosen as the FRET donor.
  • the synthesis of rhodamine B-piperazine precursor 1 for attachment to maleic anhydride has been described in the literature [Nguyen, T .; Francis, M. B. Organic Letters 2003, 5, 3245.].
  • Rhodamine B-piperazine 1 is reacted with maleic anhydride to give rhodamine B- (3-carboxyacryloyl) -piperazine 2.
  • Rhodamine B-piperazine 1 (2 g, 3.66 mmol, 1 eq.) And maleic anhydride (0.36 g, 3.66 mmol, 1 eq.) are dissolved in 40 mL DMF / CH 2 Cl 2 2: 1 and 48 h at
  • Aminomethyladamantane attached to the second carboxylic acid function of the maleic acid spacer.
  • Rhodamine B (3-carboxyacryloyl) piperazine 2 (0.45 g, 0.70 mmol, 1 eq.) And 1 - [bis (dimethylamino) methylene] -1H-1,2,3-triazolo [4,5- b] Pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate (HATU) (0.4 g, 1.05 mmol, 1.5 eq.) is dissolved in 10 mL of dry CH 2 Cl 2 under argon.
  • HATU Pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate
  • DIEA Diisopropylethylamine
  • 1-adamantylmethylamine (0.13 g, 86 ⁇ , 0.77 mmol, 1.1 eq .)
  • reaction mixture is shaken out against 3 ⁇ 0.1 mol / L HCl.
  • organic phase is dried over Na 2 S0 4 and the solvent removed.
  • the residue is dissolved in a little methanol and precipitated with a large excess of diethyl ether.
  • the solid is filtered off with suction and dried in vacuo.
  • the linking molecule is incorporated into a polymer backbone via the polymerizable double bond of maleic acid.
  • Another possibility for immobilization may be, for example, attachment to a functionalized surface (NH 2 , SH, COOH, epoxy).
  • Maleic acid monomers can be mixed with various
  • Monomers are copolymerized for immobilization (including N-vinylpyrrolidone, N-vinylcaprolactam, N-isopropylacrylamide).
  • the polymers thus prepared can also be converted to hydrogels with the aid of cross-linking agents.
  • the double bond of maleic acid can be reacted with different surface-bound nucleophiles (NH 2 -, SH-).
  • N-vinylpyrrolidone, rhodamine B-piperazine-maleamic acid-methyladamantane 3 (0.1-1 mol%) and azo-bis (isobutyronitrile) AIBN (1 mol%) are dissolved in methanol (25% by weight solids content) and stirred for 15 min Purged argon. It is heated to 60 ° C oil bath temperature and polymerized for 24 h. The mixture is then dialysed against water for 7 days (M w 12000-14000 g / mol) and the resulting polymer is freeze-dried.
  • Au NP gold nanoparticles
  • ⁇ -CD ⁇ -cyclodextrins
  • the FRET acceptor i.e., the gold nanoparticle is linked to the linking moiety formed from the maleic anhydride.
  • the prepared polymers described in C serve as a matrix for the
  • the FRET acceptor i.e., the gold nanoparticle
  • the linking moiety Since the FRET donor (rhodamine fluorophore) and FRET acceptor (gold nanoparticles) are kept within a defined small distance by the linking unit formed from the maleic anhydride, a radiation-free resonance energy transfer and thus a
  • FIG. 3 shows the course of the fluorescence intensity upon the addition of Au nanoparticles which have been functionalized with PVP. Since PVP in Compared to cyclodextrin no significant interaction with the as
  • the ß-CD-Au NPs show a significantly higher quenching efficiency compared to PVP Au NPs.
  • this sensor can be used for a variety of binding partners and not limited to a few binding pairs. This offers a great
  • Sensitivity of detection is essential.
  • the efficiency of the fluorescence quenching in the example given here is almost 50% higher for the fluorescence quencher labeled with the detection unit than for the reference fluorescence quencher without detection unit. Since analyte and recognition unit are variably exchangeable, a fluorescence quenching assay can be synthesized which is not fixed to the sequence of defined biological sequences. By adding the analyte to the non-fluorescent state, the
  • Fluorescence quencher are displaced and the fluorescence amplified again.
  • Figure 4 shows the fluorescence enhancement as a function of time after addition of the analyte amantadine hydrochloride. Because this analyte is a stronger
  • the FRET donor 003 and the competitive binder 005 are covalently bonded to the linking unit 001 formed from the at least bifunctional molecule.
  • the linking unit 001 is also bonded to a polymer 002. Since no FRET acceptor is present, the FRET donor 003 fluoresces and thus the composition (vessel A). This is followed by the addition of gold nanoparticles, on the surface of which cyclodextrin is immobilized.
  • Gold nanoparticles act as fluorescence-quenching FRET acceptors 004 and the cyclodextrin acts as an analyte-specific recognition unit 006 (i.e., an analyte-specific recognition unit 006 labeled with a FRET acceptor 004).
  • the FRET acceptor 004 is bound to the linking unit 001. Due to the connection to the linking unit 001 are FRET donor 003 and FRET acceptor 004 at a defined distance, which is low enough for the radiation-free
  • Composition no longer fluoresces (vessel B). Becomes an analyte 007

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung für die Detektion eines Analyten, umfassend -zumindest ein FRET-Donor-Akzeptor-Paar, -zumindest eine Verknüpfungseinheit, die durch ein zumindest bifunktionelles Molekül gebildetwird, wobei die durch das zumindest bifunktionelle Molekül gebildete Verknüpfungseinheit den Donorundden Akzeptor miteinander verbindet, und entweder der Donor oder der Akzeptor über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheitund einen Analyt-kompetitiven Bindermit der Verknüpfungseinheit verbunden ist.

Description

Zusammensetzung mit FRET-Paar in definierter Geometrie
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung für die Detektion eines Analyten.
Hochempfindliche Systeme, die über eine spezifische Erkennungsreaktion biologischer Bindungspartner (z. B. ein Antikörper-Antigen-Paar) die Anwesenheit eines Analyten bis hin zu sehr geringen Konzentrationen optisch anzeigen können, sind von hoher Bedeutung in der Sensorik. Besonders in der biomedizinischen Forschung, Biologie, Medizin und Biochemie ist eine mit dem bloßen Auge oder allenfalls mit einfachen Hilfsmitteln erkennbare Analytdetektion erwünscht, um z.B. Krankheiten schneller und kostengünstiger diagnostizieren zu können. Ein spezielles Problem liegt darin, dass die zu detektierenden Mengen häufig sehr gering und die Analytkonzentrationen sehr niedrig sind. Daher benötigen derartige Nachweise eine hohe Empfindlichkeit. Eine zum Beispiel in immunchromatographischen Schnelltests weit verbreitete
Möglichkeit, die Gegenwart eines Analyten visuell anzuzeigen, ist die Nutzung eines sogenannten Sandwich-Immunassays. Hier dienen an einem festen Träger immobilisierte Erkennungseinheiten, meist Antikörper, als„Fänger" für das nachzuweisende Antigen (den Analyten); mit dem bloßen Auge sichtbar gemacht wird die Anwesenheit des Analyten durch einen markierten Sekundärantikörper. Als Markierungsreagenz werden z. B. Goldnanopartikel oder farbige Latexpartikel verwendet. Das Prinzip findet kommerziell in großem Umfang Anwendung, z. B. in Massenartikeln wie Schwangerschaftstests für die Heimanwendung. Es setzt jedoch voraus, dass pro Analyt zwei unterschiedliche Erkennungsgruppen zur Verfügung stehen.
Alternativ dazu gibt es auch sogenannte Verdrängungsassays. Hier wird ein markierter Analyt-kompetitiver Binder, der an eine immobilisierte
Erkennungseinheit gebunden ist, von Analytmolekülen verdrängt. Nachteil ist hierbei, dass ein eindeutiger Nachweis der Bindungsereignisse bei kleinen
Analytkonzentrationen schwierig ist, da dann nicht alle markierten kompetitiven Binder verdrängt werden.
Eine weitere Möglichkeit, Detektion mit dem bloßen Auge zu ermöglichen, bieten photonische Kristalle [Asher, S.A. Clinical Chemistry 2004, 50, 2353]. Darauf basierende Nachweise sind aber zum einen nicht sehr empfindlich, da die
Verschiebung der Absorptionswellenlänge proportional zur Zahl der
Bindungsereignisse ist; zum anderen ist die Methode bisher nur für kleine
Analytmoleküle wie z. B. Glukose anwendbar.
Bei einer weiteren Strategie zur visuellen Anzeige einer Analytbindung, die sich nach dem Stand der Technik nur für Polynukleotide (DNA / RNA) einsetzen lässt, werden komplementäre Polynukleotidstränge an Positionen markiert, die nach Basenpaarung (also dem Erkennungsvorgang) einen so geringen Abstand aufweisen, dass ein effizienter Energietransfer stattfinden kann, siehe z.B. Didenko, V.V.
Biotechniques 2001, 5, 1106. Es werden dabei Donor- Akzeptor-Paare verwendet, zwischen denen ein strahlungsfreier Energietransfer stattfinden kann. Beispielsweise kann es sich bei Donor und Akzeptor um unterschiedliche Fluorophore handeln. Alternativ kann der Donor beispielsweise ein Fluorophor sein, während der Akzeptor ein Fluoreszenzlöscher ist. Weisen Donor und Akzeptor auf den komplementären Polynukleotidsträngen einen ausreichend geringen Abstand auf, so kommt es zu einem strahlungs freien Energietransfer vom Donor zum Akzeptor. Als Folge dieses Energietransfers zeigt der Donor keine Fluoreszenz mehr, während der Akzeptor entweder die transferierte Energie strahlungsfrei emittiert und somit als
Fluoreszenzlöscher fungiert oder seinerseits in der für ihn charakteristischen
Wellellänge fluoresziert. Werden die komplementären Polynukleotidstränge und damit auch Donor und Akzeptor räumlich voneinander separiert, ist ein
strahlungsfreier Energietransfer vom Donor zum Akzeptor nicht mehr möglich, was dazu führt, dass der Donor wieder fluoresziert.
In der heutigen Praxis wird diese Markierung häufig mit Fluoreszenzfarbstoffen vorgenommen. Andere Methoden wie z.B. das Markieren mit Nanopartikeln oder Quanten-Punkten werden ebenfalls bereits häufig angewendet. Besonders in der Biochemie ist die Bindung von markierter DNA/R A durch Basenpaarung eine wichtige Nachweismethode [Didenko, V.V. Biotechniques 2001, 5, 1106.]. Die
Methode besitzt vor allem dann den Vorteil hoher Empfindlichkeit, wenn einer der komplementären Polynukleotidstränge einen Fluoreszenzlöscher trägt und der andere fluoreszenzmarkiert ist. Wird dann der Strang mit dem Fluoreszenzlöscher durch eine stärker bindende unmarkierte DNA/RNA- Sequenz aus einer Probe verdrängt, äußert sich dies in dem Übergang von einem dunklen in einen fluoreszierenden Zustand. Derartige Übergänge sind optisch sehr gut zu erfassen.
Die Nutzung dieses Messprinzips unter Verwendung von Akzeptor-Donor-Paaren, zwischen denen ein strahlungsfreier Resonanzenergietransfer stattfinden kann, ist bisher auf DNA/RNA beschränkt, da die für den Energietransfer erforderliche geometrische Nähe der Marker nur bei Polynukleotiden gewährleistet ist [Bao, G.; Rhee, W., J.; Tsourkas, A. Ann Rev. Biomed. Engineering 2009, 11, 25-47.].
Wichtige Analyten wie z. B. Proteine oder Polysaccharide sind mit diesem
Meßprinzip bisher nicht zu erfassen. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung, die die Anwesenheit eines Analyten (bevorzugt im Bereich der Biologie, Medizin oder Biochemie) bis hin zu sehr geringen Konzentrationen optisch anzeigen kann, wobei die Analytdetektion mit dem bloßen Auge oder allenfalls mit einfachen Hilfsmitteln erfolgen kann, ohne das der Analyt selber markiert werden muß.
Gelöst wird diese Aufgabe durch eine Zusammensetzung für die Detektion eines Analyten, umfassend
- zumindest ein FRET-Donor- Akzeptor-Paar,
zumindest eine Verknüpfungseinheit, die durch ein zumindest bifunktionelles Molekül (d.h. einem Molekül mit mindestens zwei funktionellen Gruppen) gebildet wird,
wobei die durch das zumindest bifunktionelle Molekül gebildete
Verknüpfungseinheit den FRET-Donor und den FRET-Akzeptor miteinander verbindet, und
entweder der FRET-Donor oder der FRET-Akzeptor über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und einen Analyt-kompetitiven Binder mit der
Verknüpfungseinheit verbunden ist.
In der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird ein zumindest bifunktionelles Molekül (d.h. ein Molekül, das zumindest zwei funktionelle Gruppen aufweist) als Verknüpfungseinheit verwendet. Diese durch das zumindest bifunktionelle Molekül (nachfolgend auch als verknüpfendes Molekül bezeichnet) geschaffene
Verknüpfungseinheit bringt Donor und Akzeptor des FRET-Paares in eine definierte räumliche Nähe, so dass ein strahlungsfreier Energietransfer stattfinden kann. Wie nachfolgend noch eingehender beschrieben wird, kann eine funktionelle Gruppe des Verknüpfungsmoleküls ausreichend sein, um die Anbindung des FRET-Paares zu ermöglichen (z.B. im Fall einer cyclischen Säureanhydridgruppe oder einer
Epoxidgruppe). In diesem Fall steht zumindest noch eine zweite funktionelle Gruppe für eine weitere Reaktion zur Verfügung, beispielsweise um eine Anbindung an ein Substrat (beispielsweise ein Polymer) zu ermöglichen. Alternativ kann die
Anbindung des FRET-Paares an das verknüpfende Molekül über zwei funktionelle Gruppen erfolgen. In dieser Anordnung kommt es zu einem strahlungsfreien
Energietransfer zwischen Donor und Akzeptor des FRET-Paares und der Donor zeigt daher keine Lumineszenz (z.B. in Form von Fluoreszenz oder Phosphoreszenz). In Abhängigkeit von der Art des Akzeptors zeigt die Zusammensetzung dann entweder keine Lumineszenz (d.h. Akzeptor ist ein Löscher) oder es luminesziert in der für den Akzeptor charakteristischen Wellenlänge. Da entweder der Donor oder der Akzeptor mit der Verknüpfungseinheit über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und einen mit dieser Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wechselwirkenden Analyt- kompetitiven Binder verbunden ist, kann die Anwesenheit des Analyten und dessen Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit eine Ablösung des Donors oder Akzeptors von der Verknüpfungseinheit bewirken. Dies führt zu einer räumlichen Separierung des FRET-Donor- Akzeptor-Paares, wodurch die
Lumineszenzstrahlung des Donors in Anwesenheit des Analyten wieder aktiviert wird.
Um die räumliche Separierung von Donor und Akzeptor in Anwesenheit des Analyten weiter zu verbessern, umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung bevorzugt noch ein Substrat, wobei die durch das zumindest bifunktionelle Molekül gebildete Verknüpfungseinheit mit diesem Substrat verbunden ist. In dieser bevorzugten Ausführungsform verbindet also die aus dem zumindest bifunktionellen Molekül gebildete Verknüpfungseinheit Donor, Akzeptor und Substrat miteinander. Wird entweder der Donor oder alternativ der Akzeptor in Anwesenheit des Analyten von der Verknüpfungseinheit abgetrennt, bleibt die verbleibende Komponente des FRET-Paares am Substrat immobilisiert. Wie nachfolgend noch ausführlicher beschrieben wird, kann es sich bei dem Substrat beispielsweise um ein Polymer oder eine Festkörperoberfläche handeln. Das Polymer kann beispielsweise auf einer Festkörperoberfläche immobilisiert sein (z.B. in Form einer Beschichtung). Durch eine solche dauerhafte direkte oder indirekte (z.B. über ein Polymer erfolgende) Immobilisierung der Verknüpfungseinheit auf einer Festkörperoberfläche wird die räumliche Separierung von Donor und Akzeptor in Anwesenheit des Analyten noch weiter verbessert.
Wie dem Fachmann bekannt ist, steht„FRET" für„Förster- Resonanzenergietransfer". Bei dem Donor des FRET-Paares handelt es sich um einen Luminophor (z.B. einen organischen oder anorganischen Fluorophor oder eine organische bzw. anorganische phosphoreszierende Komponente), der im angeregten Zustand Energie strahlungsfrei auf den Akzeptor transferiert, sofern sich Donor und Akzeptor ausreichend nahe sind. Der Abstand, in dem ein strahlungsfreier
Resonanzenergietransfer zwischen Donor und Akzeptor noch möglich ist, kann maximal einige Nanometer betragen. Ein geeigneter Abstand eines gegebenen FRET-Donor- Akzeptor-Paares, in dem ein strahlungsfreier Resonanzenergietransfer noch möglich ist, ist dem Fachmann entweder grundsätzlich bekannt (z.B. anhand bekannter Förster-Radien bzw. Förster- Abstände) oder kann vom Fachmann über Routineversuche bestimmt werden.
Der Akzeptor kann ebenfalls ein Luminophor oder auch ein Lumineszenzlöscher (z.B. ein Fluoreszenzlöscher), also eine Komponente, die die auf sie transferierte Energie nicht in Form von Lumineszenz emittiert, sein.
Geeignete FRET-Donor- Akzeptor-Paare sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Der Donor kann ein organischer oder anorganischer Luminophor sein. Der
Luminophor kann beispielsweise fluoreszierend (d.h. ein Fluorophor),
phosphoreszierend, chemo lumineszierend oder biolumineszierend sein.
Ein geeigneter FRET-Donor, der Fluoreszenz zeigen kann, ist dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Beispielhaft können Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B. Xanthenfarbstoffe (beispielsweise Pvhodamine, Fluoreszein), Naphthalimide, Cumarine, Cyanin-Farbstoffe, Oxazine, Pyrene, Porphyrine, Acridine, konjugierte Oligomere oder Polymere (d.h. Oligomere bzw. Polymere mit konjugierten
Doppelbindungen wie z.B. Oligothiophene) genannt werden. Solche
Fluoreszenzfarbstoffe sind kommerziell oder über herkömmliche, dem Fachmann bekannte Syntheseverfahren erhältlich. Auch fluoreszierende Nanopartikel, beispielsweise fluoreszierende halbleitende Nanopartikel bzw. fluoreszierende Quantenpunkte, können als Donor im FRET-Paar verwendet werden. Beispielhaft können als fluoreszierende Nanopartikel solche Nanopartikel genannt werden, die CdSE, CdS oder Indiumphosphid enthalten. Der mittlere Durchmesser solcher fluoreszierender Nanopartikel kann über einen breiten Bereich variieren und beträgt beispielsweise 1 nm - 15 nm oder auch 1,5 nm - 10 nm. Solche fluoreszierenden Nanopartikel sind kommerziell oder über herkömmliche, dem Fachmann bekannte Herstellungsverfahren erhältlich.
Ein geeigneter FRET-Donor, der Phosphoreszenz zeigen kann, ist dem Fachmann ebenfalls grundsätzlich bekannt. Beispielhaft können Tris[2-(4-Methyl- Phenyl)pyridyl] Iridium, Tris[9,9-Dihexyl-2-pyridinyl-2')fluorenyl] Iridium und phosphoreszierende Nanopartikel wie z.B. ZnS-Nanopartikel genannt werden. Der mittlere Durchmesser phosphoreszierender Nanopartikel kann über einen breiten Bereich variieren und beträgt beispielsweise 1 nm - 15 nm oder auch 1,5 nm - 10 nm.
Wie bereits oben erwähnt, kann es sich bei dem Akzeptor des FRET-Paares um einen Luminophor oder einen Lumineszenzlöscher handeln.
Geeignete Luminophore, die als Akzeptor in einem FRET-Paar fungieren können, sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. In diesem Zusammenhang kann auf die oben genannten bevorzugten Donor-Luminophore verwiesen werden, wobei Donor und Akzeptor unterschiedlich sind. Bevorzugt werden Donor und Akzeptor so ausgewählt, dass sich die Wellenlängen der vom Donor und Akzeptor emittierten Lumineszenzstrahlung (z.B. Fluoreszenzstrahlung oder Phosphoreszenzstrahlung) möglichst stark unterscheiden und der Wellenlängenunterschied somit bevorzugt vom Betrachter mit bloßem Auge wahrnehmbar ist. Alternativ ist es aber auch möglich, dass der Akzeptor ein Lumineszenzlöscher (z.B. Fluoreszenzlöscher oder Phosphoreszenzlöscher) ist, d.h. eine Komponente, die keine Lumineszenzstrahlung emittiert. Solche Löscher sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Geeignete Fluoreszenzlöscher sind beispielsweise Metall-Nanopartikel wie z.B. Gold- Nanopartikel, Silber-Nanopartikel, organische Verbindungen, die Viologen- Strukturen enthalten, oder organische Verbindungen, die Nitroaromaten enthalten. Der mittlere Durchmesser von Nanopartikeln, die als Lumineszenzlöscher fungieren, kann über einen breiten Bereich variieren und beträgt beispielsweise 1 - 10 nm.
Wie oben ausgeführt, enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung zumindest eine Verknüpfungseinheit, die durch ein zumindest bifunktionelles Molekül (d.h. einem Molekül mit mindestens zwei funktionellen Gruppen) gebildet wird. Über die aus dem zumindest bifunktionellen Molekül erhaltene Verknüpfungseinheit sind der FRET-Donor, der FRET -Akzeptor und, sofern vorhanden, das Substrat miteinander verbunden, wobei entweder der Donor oder der Akzeptor mit der
Verknüpfungseinheit über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und einen mit dieser Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wechselwirkenden Analyt- kompetitiven Binder verbunden ist. Bevorzugt handelt es sich bei dem
verknüpfenden Molekül um ein organisches Molekül. Für die Anbindung des FRET- Paares kann eine funktionelle Gruppe ausreichend sein (beispielsweise eine
Epoxidgruppe oder eine cyclische Anhydridgruppe). Die Anbindung des FRET-
Paares kann aber auch über zwei funktionelle Gruppen erfolgen. Weiterhin kann eine funktionelle Gruppe des verknüpfenden Moleküls ausreichend sein, um die
Anbindung an das Substrat zu bewirken. Alternativ kann die Anbindung an das Substrat auch über zwei oder mehr funktionelle Gruppen erfolgen (beispielsweise zwei OH-Gruppen in dem verknüpfenden Molekül, die über eine Polykondensation einen Einbau des verknüpfenden Moleküls in eine Polymerkette bewirken).
Bevorzugt enthält das verknüpfende Molekül 2-4 oder 2-3 funktionelle Gruppen.
Wie bereits oben erwähnt, weiß der Fachmann (z.B. anhand bekannter Förster- Radien bzw. -Abstände für bestimmte FRET-Paare) oder kann der Fachmann über Routineversuche bestimmen, bis zu welchem Abstand zwischen Donor und Akzeptor noch ein Resonanzenergietransfer möglich ist. Auf der Basis dieser Kenntnis kann der Fachmann zumindest bifunktionelle Moleküle geeigneter Größe auswählen, die sicher stellen, dass Donor und Akzeptor nach ihrer Anbindung an die
Verknüpfungseinheit nicht zu weit voneinander entfernt sind. Beispielsweise kann es sich um ein Molekül handeln, bei dem der jeweilige Abstand zwischen den funktionellen Gruppen kleiner ist als der Förster-Radius bzw. Förster- Abstand oder sogar kleiner als der halbe Förster-Radius des verwendeten FRET-Donor- Akzeptor- Paares. Bevorzugt handelt es sich bei dem verknüpfenden Molekül um ein Molekül (bevorzugt ein organisches Molekül) mit relativ geringer Molmasse, beispielsweise einer Molmasse von weniger als 300 g/mol oder weniger als 250 g/mol oder sogar weniger als 200 g/mol. Indem FRET-Donor und FRET -Akzeptor an die durch das zumindest bifunktionelle Molekül gebildete Verknüpfungseinheit gebunden sind, befinden sich diese in einer definierten räumlichen Anordnung bzw. geometrischen Konfiguration zueinander.
Geeignete funktionelle Gruppen des verknüpfenden Moleküls, bevorzugt des verknüpfenden organischen Moleküls, kann der Fachmann ohne weiteres auswählen. Es kann sich beispielsweise um eine funktionelle Gruppe, die ein oder mehrere Heteroatome (z.B. O, N oder S) enthält, oder auch um eine Kohlenstoff- Kohlenstoff- Doppelbindung oder-Dreifachbindung handeln. Beispielhafte funktionelle Gruppen sind Carbonsäuren oder deren Salze, Säureanhydride (bevorzugt cyclische
Säureanhydridgruppen), Hydroxy- (Alkohole oder Phenole), Thiol-, Amino- oder Ethergruppen (bevorzugt cyclische Ethergruppen wie z.B. Epoxid),
Thiocarbonsäuren oder deren Salze, Sulfonsäuren oder deren Salze, Sulfoxide, Nitrile, Aldehyde, Thioaldehyde, Thioether (bevorzugt cyclische Thioethergruppen), Carbonsäurehalogenide, Thiocarbonsäurehalogenide, Sulfonsäurehalogenide, Ketone, Carbonsäureester, Thiocarbonsäureester, Imine oder Kohlenstoff- Kohlenstoff-Doppelbindungen oder -Dreifachbindungen. Mindestens zwei dieser beispielhaften funktionellen Gruppen sind in dem verknüpfenden Molekül vorhanden.
Beispielhaft können als verknüpfende, zumindest bifunktionelle Moleküle, aus denen die Verknüpfungseinheit in der Zusammensetzung erhalten wird, unter anderem funktionelle Aminosäuren (wie z.B. Serin Lysin, Asparagin, Glutamin oder Cystein), funktionelle Epoxide (wie z.B. Glycidylmethacrylat), funktionelle Anhydride wie z.B. Maleinsäureanhydrid, Itaconsäureanhydrid oder Allylbernsteinsäureanhydrid, und Acrylverbindungen wie z. B. 2-Acrylamido-2-hydroxyessigsäure genannt werden.
Da entweder der Donor oder der Akzeptor mit der Verknüpfungseinheit über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und einen Analyt-kompetitiven Binder verbunden ist, kann die Anwesenheit des Analyten und dessen Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit eine Ablösung dieses Donors oder Akzeptors von der Verknüpfungseinheit bewirken.
Sobald der zu detektierende Analyt festgelegt ist, kann der Fachmann aufgrund seines allgemeinen Fachwissens eine geeignete Analyt-spezifische
Erkennungseinheit auswählen. Beispielhaft können unter anderem kleinere Gruppen wie Biotin, Zucker, Aminosäuren, aber auch größere Einheiten wie Peptide, Proteine, Polysaccharide, Antikörper, Fab-Fragmente von Antikörpern, Enzyme,
Enzymfragmente, Coenzyme, prosthetische Gruppen und Aptamere genannt werden. Letztgenannte sind als Erkennungseinheiten vor allem für die Detektion von
Krankheitserregern wie Bakterien oder Viren von großem Interesse. Die Verwendung von Analyt-kompetitiven Bindern im Zusammenspiel mit Analyt- spezifischen Erkennungseinheiten und Analyten ist dem Fachmann grundsätzlich aus Verdrängungsassays bzw. kompetitiven Assays bekannt. Sobald also der zu detektierende Analyt festgelegt ist, kann der Fachmann aufgrund seines allgemeinen Fachwissens nicht nur eine geeignete Analyt-spezifische Erkennungseinheit, sondern auch einen geeigneten Analyt-kompetitiven Binder auswählen. Als beispielhafte kompetitive Binder können unter anderem kleinere Gruppen wie Biotin, Zucker, Aminosäuren, Nukleinsäuren, aber auch Peptide, Proteine, Nukleotide,
Oligosaccharide oder Polysaccharide genannt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet also der Begriff„Analyt- spezifische Erkennungseinheit", in Übereinstimmung mit dem allgemeinen
Verständnis des Fachmanns, eine Einheit oder Gruppe, die aufgrund ihrer chemischen Struktur eine ausreichend starke Wechselwirkung mit dem Analyten zeigt und diesen dadurch an sich binden kann. Weiterhin bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Begriff„Analyt-kompetitiver Binder", in
Übereinstimmung mit dem allgemeinen Verständnis des Fachmanns, eine Einheit oder Gruppe, die aufgrund ihrer chemischen Struktur eine ausreichend starke Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit zeigt, um aufgrund dieser Wechselwirkung an diese gebunden sein zu können, jedoch in Anwesenheit des Analyten von dieser Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wieder abgetrennt wird. Sowohl der Analyt wie auch der Analyt-kompetitive Binder können also mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wechselwirken und dadurch an diese gebunden sein, wobei jedoch der Analyt im Vergleich zum Analyt-kompetitiven Binder eine stärkere Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit zeigt und daher den Analyt-kompetitiven Binder verdrängen kann.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dass der FRET-Donor und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit kovalent an die Verknüpfungseinheit gebunden sind, der Analyt-kompetitive Binder mit dem FRET- Akzeptor markiert ist und durch seine Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit den FRET -Akzeptor mit der Verknüpfungseinheit verbindet. Die Markierung des Analyt- kompetitiven Binders mit dem FRET-Akteptor kann erfolgen, indem diese beiden Komponenten über eine kovalente Verbindung miteinander verbunden sind.
Alternativ können diese beiden Komponenten auch nicht-kovalent miteinander verbunden sein (beispielsweise ein oder mehrere Analyt-kompetitive Binder, die auf der Oberfläche eines als FRET-Akzeptors fungierenden Nanopartikels vorliegen).
Alternativ ist es möglich, dass der FRET-Donor und der Analyt-kompetitive Binder kovalent an die Verknüpfungseinheit gebunden sind, die Analyt-spezifische
Erkennungseinheit mit dem FRET -Akzeptor markiert ist und durch ihre
Wechselwirkung mit dem Analyt-kompetitiven Binder den FRET -Akzeptor mit der Verknüpfungseinheit verbindet. Die Markierung der Analyt-spezifischen
Erkennungseinheit mit dem FRET-Akteptor kann erfolgen, indem diese beiden Komponenten über eine kovalente Verbindung miteinander verbunden sind.
Alternativ können diese beiden Komponenten auch nicht-kovalent miteinander verbunden sein (beispielsweise ein oder mehrere Analyt-spezifische
Erkennungseinheiten, die auf der Oberfläche eines als FRET-Akzeptors fungierenden Nanopartikels vorliegen).
Alternativ ist es möglich, dass der FRET -Akzeptor und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit kovalent an die Verknüpfungseinheit gebunden sind, der Analyt- kompetitive Binder mit dem FRET-Donor markiert ist und durch seine
Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit den FRET-Donor mit der Verknüpfungseinheit verbindet. Die Markierung des Analyt-kompetitiven
Binders mit dem FRET-Donor kann erfolgen, indem diese beiden Komponenten über eine kovalente Verbindung miteinander verbunden sind. Alternativ können diese beiden Komponenten auch nicht-kovalent miteinander verbunden sein
(beispielsweise ein oder mehrere Analyt-kompetitive Binder, die auf der Oberfläche eines als FRET-Donor fungierenden Nanopartikels vorliegen). Alternativ ist es möglich, dass der FRET -Akzeptor und der Analyt-kompetitive Binder kovalent an die Verknüpfungseinheit gebunden sind, die Analyt-spezifische Erkennungseinheit mit dem FRET-Donor markiert ist und durch ihre
Wechselwirkung mit dem Analyt-kompetitiven Binder den FRET-Donor mit der Verknüpfungseinheit verbindet. Die Markierung der Analyt-spezifischen
Erkennungseinheit mit dem FRET-Donor kann erfolgen, indem diese beiden Komponenten über eine kovalente Verbindung miteinander verbunden sind.
Alternativ können diese beiden Komponenten auch nicht-kovalent miteinander verbunden sein (beispielsweise ein oder mehrere Analyt-spezifische
Erkennungseinheiten, die auf der Oberfläche eines als FRET-Donors fungierenden Nanopartikels vorliegen).
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann prinzipiell für die Detektion einer Vielzahl unterschiedlicher Analyten eingesetzt werden. Bevorzugte Analyten sind beispielsweise Biooligomere, Biopolymere oder biologische Partikel. Beispielhafte Biooligomere sind Oligopeptide, Oligosaccharide und Oligonucleotide. Beispielhafte Biopolymere sind Polypeptide, Proteine, Polysaccharide, Polynucleotide und Nucleinsäuren. Beispielhafte biologische Partikel sind Viren und Bakterien.
Wie oben bereits ausgeführt, ist die durch das zumindest bifunktionelle Molekül gebildete Verknüpfungseinheit bevorzugt auch mit einem Substrat verbunden und immobilisiert dadurch das FRET-Donor- Akzeptor-Paar. Bevorzugt ist das Substrat durch eine Reaktion mit einer der funktionellen Gruppen des zumindest bifunktionellen Moleküls kovalent mit der Verknüpfungseinheit verbunden.
Bei dem Substrat kann es sich beispielsweise um ein organisches oder anorganisches Polymer handeln. Es kann sich auch um eine Festkörperoberfläche handeln. Wenn das Substrat ein Polymer ist, kann es bevorzugt sein, dieses Polymer wiederum auf einer Festkörperoberfläche zu immobilisieren. Diese direkte oder indirekte (z.B. über das auf der Festkörperoberfläche aufgebrachte Polymer) Immobilisierung bietet den Vorteil, daß der durch den Analyten verdrängte Akzeptor (oder alternativ der durch den Analyten verdrängte Donor) durch Spülen vollständig aus dem System entfernt werden kann. So können Intensitätsverluste dadurch, dass der dann frei bewegliche verdrängte Akzeptor zufällig wieder in unmittelbare Nähe des Donors gerät, vermieden werden. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Verknüpfungseinheit als
Wiederholeinheit in einem Polymer vor. In diesem Fall wird eine funktionelle Gruppe des zumindest bifunktionellen Moleküls für eine Polymerisation mit weiteren Monomeren genutzt und das zumindest bifunktionelle Molekül wird in die
Polymerkette eingebaut. Dabei können beispielsweise zunächst der Donor und der Akzeptor mit dem zumindest bifunktionellen Molekül verbunden werden und dieses bereits das FRET-Donor- Akzeptor-Paar tragende Molekül wird anschließend zusammen mit weiteren Monomeren polymerisiert. Alternativ ist es beispielsweise auch möglich, zunächst nur den FRET-Donor und die Analyt-spezifische
Erkennungseinheit (alternativ: den Analyt-kompetitiven Binder) kovalent an das verknüpfende Molekül zu binden, dieses Molekül dann mit weiteren Monomeren zu polymerisieren und anschließend den mit dem Analyt-kompetitiven Binder (kovalent oder nicht-kovalent) verbundenen FRET -Akzeptor zuzugeben. Aufgrund der hohen Nachweisempfindlichkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann der Anteil der Monomere, die ein FRET-Donor- Akzeptor-Paar bzw. zunächst nur den FRET- Donor oder FRET- Akzeptor aufweisen, recht gering gehalten werden, beispielsweise weniger als 5 Mol% oder sogar weniger als 2 Mol%, bezogen auf die Gesamtmenge der Monomere.
Wenn das zumindest bifunktionelle Molekül in eine Polymerkette einpolymerisiert werden soll, handelt es sich zumindest bei einer der funktionellen Gruppen um eine polymerisierbare Gruppe, beispielsweise um eine Kohlenstoff-Kohlenstoff- Doppelbindung. Prinzipiell ist auch möglich, dass das verknüpfende Molekül noch eine weitere funktionelle Gruppe aufweist und die Polymerisation unter Mitwirkung dieser weiteren funktionellen Gruppe realisiert wird (z.B. eine Polykondensation, die die Anwesenheit von zwei OH-Gruppen in dem verknüpfenden Molekül erfordert).
Die das FRET-Donor- Akzeptor-Paar tragende Verknüpfungseinheit kann als Wiederholeinheit in einer Vielzahl unterschiedlicher Polymere vorliegen.
Beispielhaft können Vinyl-Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidone oder
Polyvinylcaprolactame, Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, Polyolefme wie
Polyethylen oder Polypropylen oder auch Poly(meth)acrylate genannt werden. Bei dem Polymer kann es sich auch um ein Hydrogel handeln. Dieses kann optional quervernetzt sein. Bei dem Hydrogel kann es sich optional auch um ein responsives Hydrogel, beispielsweise ein thermoresponsives Hydrogel handeln.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, dass die das FRET- Donor- Akzeptor-Paar tragende Verknüpfungseinheit auf eine Polymerkette aufgepfropft ist. Hinsichtlich möglicher Polymere kann auf die obigen Ausführungen verwiesen werden.
Das Polymer, in dem die Verknüpfungseinheit als Wiederholeinheit vorliegt, oder auf das die Verknüpfungseinheit aufgepfropft ist, kann auf einer
Festkörperoberfläche immobilisiert sein. Die Verknüpfungseinheit kann an eine Vielzahl unterschiedlicher
Festkörperoberflächen gebunden sein. Es kann sich dabei sowohl um organische (z.B. ein Polymer) wie auch anorganische Festkörperoberflächen handeln. Wenn auf einer Festkörperoberfläche reaktive Gruppen vorliegen (beispielsweise eine funktionalisierte Oberfläche mit reaktiven Gruppen wie -NH2, -SH, -OH, -COOH oder Epoxy), können diese mit einer funktionellen Gruppe des zumindest bifunktionellen Moleküls reagieren und somit eine kovalente Verbindung der Verknüpfungseinheit mit dem Substrat realisieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Verknüpfungseinheit als
Wiederholeinheit in einem Polymer vor, das seinerseits auf einer
Festkörperoberfläche vorliegt (z.B. in Form einer Polymerbeschichtung).
In den Figuren la und lb ist das Funktionsprinzip der vorliegenden Erfindung anhand von zwei bevorzugten Ausführungsformen schematisch dargestellt. Die linke Hälfte der Figur la zeigt eine aus einem zumindest bifunktionellen
Molekül erhaltene Verknüpfungseinheit 001, die ein Polymer 002, einen FRET- Donor 003 und FRET-Akzeptor 004 miteinander verbindet. Bei dem FRET-Donor 003 kann es sich beispielsweise um einen Fluorophor handeln. Die Verbindung des FRET -Akzeptors 004 mit der Verknüpfungseinheit 001 wird über einen kompetitiven Binder 005 und eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006 vermittelt. Die
Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006 ist kovalent an die Verknüpfungseinheit 001 gebunden und wechselwirkt mit dem Analyt-kompetitiven Binder 005, der wiederum mit dem FRET-Akzeptor 004 verbunden ist. Bei dem FRET-Akzeptor 004 kann es sich beispielsweise um ein Gold-Nanopartikel handeln, auf dessen
Oberfläche der kompetitive Binder 005 vorliegt und durch seine Wechselwirkung mit der Erkennungseinheit 006 die Verbindung des FRET -Akzeptors 004 mit der Verknüpfungseinheit 001 vermittelt. Durch die aus dem zumindest bifunktionellen Molekül gebildeten Verknüpfungseinheit 001 werden Donor 003 und Akzeptor 004 in einem definierten Abstand gehalten, der ausreichend gering für einen
strahlungsfreien Resonanzenergietransfer vom Donor 003 zum Akzeptor 004 ist. Daher zeigt die Zusammensetzung in diesem Zustand keine Fluoreszenz.
Nach Zuführung des Analyten 007 wechselwirkt dieser mit der Analyt-spezifischen Erkennungsgruppe 006 und verdrängt den Analyt-kompetitiven Binder 005. Daher wird der als Fluoreszenzlöscher fungierende FRET-Akzeptor 004 zusammen mit dem auf seiner Oberfläche vorliegenden Analyt-kompetitiven Binder 005 von der Verknüpfungseinheit 001 abgetrennt. Das FRET-Paar wird getrennt, ein
Energietransfer vom Donor 003 zum Akzeptor 004 ist nicht mehr möglich und die Fluoreszenz des Donors 003 wird aktiviert. Dies ist in der rechten Hälfte der Figur la gezeigt.
Auch in der Figur lb zeigt die linke Hälfte eine aus einem zumindest bifunktionellen Molekül erhaltene Verknüpfungseinheit 001, die ein Polymer 002, einen FRET- Donor 003 und FRET -Akzeptor 004 miteinander verbindet. Wiederum wird die Verbindung des Akzeptors 004, der als Fluoreszenzlöscher fungiert, mit der
Verknüpfungseinheit 001 über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006 und einen Analyt-kompetitiven Binder 005 vermittelt. Im Unterschied zu Figur la ist allerdings der Analyt-kompetitive Binder 005 kovalent an die Verknüpfungseinheit 001 gebunden, während Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006 an den Akzeptor 004 gebunden ist. Nach Zuführung des Analyten 007 verdrängt dieser den Analyt- kompetitiven Binder 005 von der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit 006, wodurch der Akzeptor 004 von der Verknüpfungseinheit 001 abgetrennt wird. Dies ist in der rechten Hälfte der Figur lb gezeigt. Das FRET-Paar wird getrennt, ein Energietransfer vom Donor 003 zum Akzeptor 004 ist nicht mehr möglich und die Fluoreszenz des Donors 003 wird aktiviert.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Zusammensetzung, umfassend die Anbindung eines FRET-Donors und eines FRET -Akzeptors an ein zumindest bifunktionelles Molekül, wobei entweder die Anbindung des FRET-Akzeptors oder die Anbindung des FRET-Donors an das zumindest bifunktionelle Molekül über eine Analyt- spezifische Erkennungseinheit und einen Analyt-kompetitiven Binder erfolgt.
Bevorzugt umfasst das Verfahren außerdem die Anbindung des zumindest bifunktionellen Moleküls an ein Substrat. In einer bevorzugten Ausführungsform reagieren (entweder gleichzeitig oder nacheinander) der FRET-Donor und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit mit dem zumindest bifunktionellen Molekül, gefolgt von der Zugabe des Analyt- kompetitiven Binders, der (kovalent oder nicht-kovalent) mit dem FRET -Akzeptor markiert ist. Da der Analyt-kompetitive Binder mit der Analyt-spezifischen
Erkennungseinheit wechselwirkt, ist der FRET -Akzeptor über diese beiden
Komponenten, also Analyt-kompetitiven Binder und Analyt-spezifische
Erkennungseinheit, mit dem verknüpfenden Molekül verbunden. Das zumindest bifunktionelle Molekül wird über eine weitere funktionelle Gruppe mit einem Substrat verbunden, beispielsweise in einer Polymerisationsreaktion und durch Aufpfropfen auf ein Polymer. Der Zeitpunkt für diese Anbindung an das Substrat kann variiert werden. Beispielsweise kann das zumindest bifunktionelle Molekül zunächst an das Substrat gebunden werden und anschließend folgt die Anbindung des FRET-Donors und des FRET -Akzeptors an das verknüpfende Molekül.
Alternativ können beispielsweise zunächst der FRET-Donor und die Analyt- spezifische Erkennungseinheit an das zumindest bifunktionelle Molekül gebunden werden, gefolgt von der Anbindung des verknüpfenden Moleküls an das Substrat (z.B. durch Polymerisation oder Aufpfropfen) und anschließend der Zugabe des Analyt-kompetitiven Binders, der (kovalent oder nicht-kovalent) mit dem FRET-
Akzeptor markiert ist. Die Teilschritte der kovalenten Anbindung eines Fluorophors, das als FRET-Donor fungiert, und einer Analyt-spezifischen Erkennungseinheit an ein bifunktionelles Molekül (in diesem Beispiel Maleinsäureanhydrid, das als funktionelle Gruppen eine cyclische Säureanhydridgruppe und eine C=C- Doppelbindung aufweist) sind schematisch in Figur 2 dargestellt.
Alternativ kann es bevorzugt sein, dass der FRET-Donor und der Analyt-kompetitive Binder (entweder gleichzeitig oder nacheinander) mit dem zumindest bifunktionellen Molekül reagieren, gefolgt von der Zugabe der Analyt-spezifischen
Erkennungseinheit, die (kovalent oder nicht-kovalent) mit dem FRET -Akzeptor markiert ist. Da der Analyt-kompetitive Binder mit der Analyt-spezifischen
Erkennungseinheit wechselwirkt, ist der FRET -Akzeptor über diese beiden
Komponenten, also Analyt-kompetitiven Binder und Analyt-spezifische
Erkennungseinheit, mit dem verknüpfenden Molekül verbunden. Das zumindest bifunktionelle Molekül wird über eine weitere funktionelle Gruppe mit einem Substrat verbunden, beispielsweise in einer Polymerisationsreaktion und durch Aufpfropfen auf ein Polymer. Der Zeitpunkt für diese Anbindung an das Substrat kann variiert werden. Beispielsweise kann das zumindest bifunktionelle Molekül zunächst an das Substrat gebunden werden und anschließend folgt die Anbindung des FRET-Donors und des FRET -Akzeptors an das verknüpfende Molekül.
Alternativ können beispielsweise zunächst der FRET-Donor und der Analyt- kompetitive Binder an das zumindest bifunktionelle Molekül gebunden werden, gefolgt von der Anbindung des verknüpfenden Moleküls an das Substrat (z.B. durch Polymerisation oder Aufpfropfen) und anschließend der Zugabe der mit dem FRET- Akzeptor markierten Analyt-spezifischen Erkennungseinheit.
Alternativ kann es bevorzugt sein, dass der FRET -Akzeptor und die Analyt- spezifische Erkennungseinheit (gleichzeitig oder nacheinander) mit dem zumindest bifunktionellen Molekül reagieren, gefolgt von der Zugabe des Analyt-kompetitiven Binders, der (kovalent oder nicht-kovalent) mit dem FRET-Donor markiert ist. Da der Analyt-kompetitive Binder mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wechselwirkt, ist der FRET-Donor über diese beiden Komponenten, also Analyt- kompetitiven Binder und Analyt-spezifische Erkennungseinheit, mit dem
verknüpfenden Molekül verbunden. Das zumindest bifunktionelle Molekül wird über eine weitere funktionelle Gruppe mit einem Substrat verbunden, beispielsweise in einer Polymerisationsreaktion und durch Aufpfropfen auf ein Polymer. Der
Zeitpunkt für diese Anbindung an das Substrat kann variiert werden. Beispielsweise kann das zumindest bifunktionelle Molekül zunächst an das Substrat gebunden werden und anschließend folgt die Anbindung des FRET -Akzeptors und des FRET- Donors an das verknüpfende Molekül. Alternativ können beispielsweise zunächst der FRET -Akzeptor und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit an das zumindest bifunktionelle Molekül gebunden werden, gefolgt von der Anbindung des verknüpfenden Moleküls an das Substrat (z.B. durch Polymerisation oder
Aufpfropfen) und anschließend der Zugabe des mit dem FRET-Donor markierten Analyt-kompetitiven Binders.
Alternativ kann es bevorzugt sein, dass der FRET -Akzeptor und der Analyt- kompetitive Binder (entweder gleichzeitig oder nacheinander) mit dem zumindest bifunktionellen Molekül reagieren, gefolgt von der Zugabe der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit, die mit dem FRET-Donor markiert ist. Da der Analyt- kompetitive Binder mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wechselwirkt, ist der FRET-Donor über diese beiden Komponenten, also Analyt-kompetitiven Binder und Analyt-spezifische Erkennungseinheit, mit dem verknüpfenden Molekül verbunden. Das zumindest bifunktionelle Molekül wird über eine weitere funktionelle Gruppe mit einem Substrat verbunden, beispielsweise in einer
Polymerisationsreaktion und durch Aufpfropfen auf ein Polymer. Der Zeitpunkt für diese Anbindung an das Substrat kann variiert werden. Beispielsweise kann das zumindest bifunktionelle Molekül zunächst an das Substrat gebunden werden und anschließend folgt die Anbindung des FRET- Akzeptors und des FRET-Donors an das verknüpfende Molekül. Alternativ können beispielsweise zunächst der FRET- Akzeptor und der Analyt-kompetitive Binder an das zumindest bifunktionelle Molekül gebunden werden, gefolgt von der Anbindung des verknüpfenden Moleküls an das Substrat (z.B. durch Polymerisation oder Aufpfropfen) und anschließend der Zugabe der mit dem FRET-Donor markierten Analyt-spezifischen
Erkennungseinheit.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur Detektion eines Analyten, wobei die Vorrichtung die oben beschriebene
Zusammensetzung enthält. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann noch weitere Vorrichtungselemente aufweisen, die für diese Art von Vorrichtungen üblich sind, beispielsweise einen Signalumwandler und/oder einen elektrischen Verstärker. Da jedoch die erfindungsgemäße Zusammensetzung bei Anbindung des Analyten an die Erkennungseinheit eine deutliche Änderung des Lumineszenzverhaltens zeigt, die auch mit dem bloßen Auge gut erkennbar sein kann, ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich, dass die Vorrichtung weder einen
Signalumwandler noch einen elektrischen Verstärker aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der oben beschriebenen Zusammensetzung für den Nachweis eines Analyten.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann prinzipiell für die Detektion einer Vielzahl unterschiedlicher Analyten eingesetzt werden. Bevorzugte Analyten sind beispielsweise Biooligomere, Biopolymere oder biologische Partikel. Beispielhafte Biooligomere sind Oligopeptide, Oligosaccharide und Oligonucleotide. Beispielhafte Biopolymere sind Polypeptide, Proteine, Polysaccharide, Polynucleotide und Nucleinsäuren. Beispielhafte biologische Partikel sind Viren und Bakterien.
Für ein Detektionsverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen
Zusammensetzung ist eine Markierung des Analyten nicht erforderlich. Bevorzugt erfolgt die Verwendung daher für den Nachweis eines nicht markierten Analyten. Anhand der nachfolgenden Beispiele wird die vorliegende Erfindung eingehender erläutert. Beispiele
In dem nachfolgend beschriebenen Beispiel fungiert Maleinsäureanhydrid als bifunktionelles Molekül, das in der Zusammensetzung die Verknüpfungseinheit für Akzeptor, Donor und Substrat ausbildet. Die Bifunktionalität des
Maleinsäureanhydrids resultiert aus der cyclischen Säureanhydridgruppe sowie der Kohlenstoff-Doppelbindung. Als FRET-Donor wird Rhodamin B (ein Fluoreszenzfarbstoff) verwendet. Gold- Nanopartikel fungieren als Fluoreszenz- löschender FRET -Akzeptor.
Der Rhodamin-Farbstoff wird kovalent an das Maleinsäureanhydrid gebunden. Als Test-Analyt wird Amantadin-Hydrochlorid verwendet.
Der Akzeptor (d.h. ein Gold-Nanopartikel) ist über eine Analyt-spezifische
Erkennungseinheit und einen Analyt-kompetitiven Binder mit der
Verknüpfungseinheit verbunden. Als Analyt-spezifische Erkennungseinheit wird Cyclodextrin verwendet, während Adamantan als Analyt-kompetitiver Binder fungiert. Der Analyt-kompetitive Binder wird kovalent an das Maleinsäureanhydrid gebunden. Das Cyclodextrin ist auf der Oberfläche der Gold-Nanopartikel immobilisiert, wodurch eine mit dem FRET -Akzeptor (d.h. Gold-Nanopartikel) markierte Analyt-spezifische Erkennungseinheit (Cyclodextrin) erhalten wird. Durch die Wechselwirkung zwischen der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit und dem Analyt-kompetitiven Binder ist der Gold-Nanopartikel (d.h. der Akzeptor) mit der aus dem Maleinsäureanhydrid gebildeten Verknüpfungseinheit verbunden. In Anwesenheit des Analyten (d.h. Amantadin) wird der Akzeptor (d.h. der Gold- Nanopartikel) von der Verknüpfungseinheit abgelöst, da es zwischen der Analyt- spezifischen Erkennungsgruppe und dem Analyten zu einer stärkeren Wechselwirkung kommt als zwischen der Analyt-spezifischen Erkennungsgruppe und dem Analyt-kompetitiven Binder.
A Anbindung des optischen Sensors an den Abstandshalter
In diesem Ausführungsbeispiel wurde das Fluorophor Pvhodamin B als FRET-Donor gewählt. Die Synthese der Rhodamin B-Piperazin- Vorstufe 1 zur Anbindung an Maleinsäureanhydrid ist in der Literatur beschrieben [Nguyen, T.; Francis, M. B. Organic Letters 2003, 5, 3245.]. Im ersten Syntheseschritt erfolgt die kovalente Anbindung des Fluorophors an Maleinsäureanhydrid (d.h. das bifunktionelle Molekül). Rhodamin B-Piperazin 1 wird mit Maleinsäureanhydrid zu Rhodamin B- (3-carboxyacryloyl)piperazin 2 umgesetzt.
Figure imgf000025_0001
Synthesevorschrift Rhodamin B-(3-carboxyacryloyl)piperazin 2
Rhodamin B-piperazin 1 (2 g, 3,66 mmol, 1 eq.) und Maleinsäureanhydrid (0,36 g, 3,66 mmol, 1 eq.) werden in 40 mL DMF/CH2C12 2: 1 gelöst und 48 h bei
Raumtempertaur gerührt. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand mit K2C03aq (1 mol/L) aufgenommen. Die wässrige Phase wird 3 x mit Ethylacetat ausgeschüttelt, mit NaCl gesättigt und anschließend mit Isopropanol/CH2Cl22: 1 ausgeschüttelt, bis die wässrige Phase nur noch leicht pink verbleibt. Die organische Phase wird über Na2S04 getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wird mit CHC13 aufgenommen und filtriert, um unlösliche Salze zu entfernen. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Feststoff im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 1,50 g, 2,33 mmol (64 %); lila Feststoff. B Anbindung des kompetitiven Binders an das bifunktionelle Molekül
Adamantan diente als Analyt-kompetitiver Binder. Dabei wird
Aminomethyladamantan an die zweite Carbonsäure-Funktion des Maleinsäure- Abstandshalters angebunden.
Figure imgf000026_0001
Synthese von Rhodamin B-piperazin-maleinsäurediamid-methyladamantan 3
Rhodamin B-(3-carboxyacryloyl)piperazin 2 (0,45 g, 0,70 mmol, 1 eq.) und 1 -[Bis(dimethylamino)methylen]- 1H- 1 ,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium3- oxidhexafluorophosphat (HATU) (0,4 g, 1,05 mmol, 1,5 eq.) werden in 10 mL trockenem CH2CI2 unter Argon gelöst. Diisopropylethylamin (DIEA) (0,14 g, 0,18 mL, 1,05 mmol, 1,5 eq.) und 1-Adamantyl-methylamin (0,13 g, 86 μί, 0,77 mmol, 1,1 eq.) werden zugefügt und 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die
Reaktionsmischung wird gegen 3 x 0,1 mol/L HCl ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Na2S04 getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wird in wenig Methanol gelöst und mit einem großen Überschuss Diethylether ausgefällt. Der Feststoff wird abgesaugt und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 0,43 g; 0,54 mmol (78 %); lila Feststoff.
C Immobilisierung des Systems
Die in B hergestellte Einheit aus bifunktionellem Molekül, FRET-Donor und kompetitivem Binder soll über die weitere funktionelle Gruppe des Moleküls (d.h. die C=C-Doppelbindung) immobilisiert werden. So wird im späteren
Analyseverfahren eine einfache Entfernung nicht bindender Analyten und
Erkennungseinheiten mit Fluoreszenzlöschern möglich. Die Entfernung der Fluoreszenzlöscher gewährleistet eine höhere Signalintensität Im hier aufgeführten Beispiel wird das verknüpfende Molekül über die polymerisierbare Doppelbindung der Maleinsäure in ein Polymerrückgrat eingebunden. Eine andere Möglichkeit zur Immobilisierung kann z.B. Anbindung an eine funktionalisierte Oberfläche (NH2-, SH-, COOH-, Epoxy) sein. Maleinsäure-Monomere können mit verschiedenen
Monomeren zur Immobilisierung copolymerisiert werden (u. a. N-Vinylpyrrolidon, N-Vinylcaprolactam, N-Isopropylacrylamid). Die so hergestellten Polymere können auch zu Hydrogelen mit Hilfe von Quervernetzern umgesetzt werden. Des Weiteren kann zur Immobilisierung die Doppelbindung der Maleinsäure mit verschiedenen oberflächengebundenen Nukleophilen umgesetzt werden (NH2-, SH-).
Beispiel einer typischen Copolymerisation mit N-Vinylpyrrolidon:
Figure imgf000027_0001
N-Vinylpyrrolidon, Rhodamin B-piperazin-maleinsäurediamid-methyladamantan 3 (0,1 - 1 mol%) und Azo-bis-(isobutyronitril) AIBN (1 mol%) werden in Methanol (25 gew% Feststoffgehalt) gelöst und 15 min mit Argon gespült. Es wird auf 60 °C Ölbadtemperatur erhitzt und 24 h polymerisiert. Anschließend wird 7 Tage gegen Wasser dialysiert (Mw 12000-14000 g/mol) und das entstandene Polymer gefriergetrocknet.
D Anbindung des FRET -Akzeptors an das bifunktionelle Molekül über eine Analyt- spezifische Erkennungseinheit und den Analyt-kompetitiven Binder
In dem hier beschriebenen Beispiel werden Gold-Nanopartikel (Au-NP) als Fluoreszenz-Löscher mit ß-Cyclodextrinen (ß-CD) als Analyt-spezifische Erkennungseinheiten für Adamantan synthetisiert [Lui, J.; Ong, W.; Roman, E.; Lynn, M. J.; Kaifer, A. E. Langmuir, 2000, 16, 3000-3002.].
Bei Zugabe des mit den Gold-Nanopartikeln markierten Cyclodextrins zu dem in Schritt C hergestellten Polymer kommt es zu einer Wechselwirkung zwischen dem Adamantan (d.h. dem kompetitiven Binder) und dem Cyclodextrin (d.h. der Analyt- spezifischen Erkennungseinheit). Über diese Wechselwirkung wird der FRET- Akzeptor (d.h. das Gold-Nanopartikel) mit der aus dem Maleinsäureanhydrid gebildeten Verknüpfungseinheit verbunden.
Fluoreszenz-Löschungs Messungen
Nachfolgend wird ein Beispiel für Fluoreszenz-Löschung durch Analytbindung mit anschließender kompetitiver Verdrängung des Analyten ausgeführt.
Die in C beschriebenen hergestellten Polymere dienen als Matrix für die
Fluoreszenz-Löschungs-Experimente. ß-CD (Cyclodextrin)-funktionalisierte Au-NP (Nanopartikel) werden als Bindungspartner für die Adamantan-Erkennungseinheiten im Copolymer zu einer wässrigen Lösung des Polymers gegeben. Über die
Wechselwirkung zwischen Cyclodextrin (d.h. der Analyt-spezifischen
Erkennungseinheit) und Adamantan (d.h. dem kompetitiven Binder) wird der als Fluoreszenzlöscher fungierende FRET -Akzeptor (d.h. das Gold-Nanopartikel) an die Verknüpfungseinheit gebunden. Da nun FRET-Donor (Rhodamin-Fluorophor) und FRET -Akzeptor (Gold-Nanopartikel) durch die aus dem Maleinsäureanhydrid gebildeten Verknüpfungseinheit in einem definierten geringen Abstand gehalten werden, ist ein strahlungsfreier Resonanzenergietransfer und somit eine
Fluoreszenzlöschung möglich.
Der Verlauf der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der zugegebenen Menge der mit Cyclodextrin funktionalisierten Gold-Nanopartikel wird in Figur 3 gezeigt. Als Referenz zeigt Figur 3 auch den Verlauf der Fluoreszenzintensität bei der Zugabe von Au-Nanopartikeln, die mit PVP funktionalisiert wurden. Da PVP im Vergleich zu Cyclodextrin keine signifikante Wechselwirkung mit der als
kompetitivem Binder fungierenden Adamantan-Gruppe zeigt, können FRET-Donor und FRET -Akzeptor nicht in einen definierten geringen Abstand gebracht werden, wie er für einen strahlungsfreien Resonanzenergietransfer notwendig wäre. Die ß- CD-Au-NP zeigen eine deutlich höhere Löschungseffizienz im Vergleich zu PVP- Au-NP.
Da bei dem hier beschriebenen System Erkennungseinheit und Analyt variabel austauschbar sind, ist dieser Sensor für eine Vielzahl an Bindungspartnern einsetzbar und nicht nur auf wenige Bindungspaare beschränkt. Dies bietet einen großen
Vorteil, besonders für Erkennungsreaktionen von biologisch relevanten Strukturen, wie Peptiden oder Proteinen durch Bakterien oder Viren, da hier eine hohe
Sensitivität der Erkennung essentiell ist. Die Effizienz der Fluoreszenz-Löschung in dem hier angeführten Beispiel liegt für die mit der Erkennungseinheit markierten Fluoreszenz-Löscher um fast 50 % höher, als für die Referenz Fluoreszenz-Löscher ohne Erkennungseinheit. Da Analyt und Erkennungseinheit dabei variabel austauschbar sind, kann so ein Fluoreszenz-Löschungs-Assay synthetisiert werden, welches nicht auf die Abfolge definierter biologischer Sequenzen festgelegt ist. Durch Zugabe des Analyten zu dem nicht fluoreszierenden Zustand kann der
Fluoreszenz-Löscher verdrängt werden und die Fluoreszenz wieder verstärkt werden. Figur 4 zeigt die Fluoreszenzverstärkung in Abhängigkeit von der Zeit nach Zugabe des Analyten Amantadin-Hydrochlorid. Da dieser Analyt eine stärkere
Wechselwirkung mit der auf den Gold-Nanopartikeln vorliegenden Analyt- spezifischen Erkennungseinheit (d.h. dem Cyclodextrin) zeigt als der Analyt- kompetitive Binder, kommt es zu einer Ablösung der Gold-Nanopartikel (also des FRET -Akzeptors) von der Verknüpfungseinheit. Dadurch wird die Fluoreszenz des Fluorophors (also des FRET-Donors) wieder aktiviert und es kommt zu einer signifikanten, mit dem bloßen Auge wahrnehmbaren Fluoreszenzverstärkung. Die hier im aufgeführten Beispiel-Experiment erzielte Verstärkung der Fluoreszenz nach Fluoreszenz-Löschung beträgt für die Erkennungsgruppen-markierten Au-NP etwa 30 %. Auch hier zeigt das Referenz-Experiment mit PVP- Au-NP ohne
Erkennungsgruppen, dass keine nennenswerte Fluoreszenzverstärkung auftritt. Diese Fluoreszenz- Verstärkung ist sehr leicht durch Anregung des Substrats mit einer UV- Handlampe mit bloßem Auge sichtbar.
Dieser Vorgang ist in Figur 5 nochmals schematisch dargestellt. Zunächst sind nur der FRET-Donor 003 und der kompetitive Binder 005 kovalent an die aus dem zumindest bifunktionellen Molekül gebildeten Verknüpfungseinheit 001 gebunden. Die Verknüpfungseinheit 001 ist außerdem an ein Polymer 002 gebunden. Da noch kein FRET -Akzeptor anwesend ist, fluoresziert der FRET-Donor 003 und damit die Zusammensetzung (Gefäß A). Anschließend erfolgt die Zugabe von Gold- Nanopartikeln, auf deren Oberfläche Cyclodextrin immobilisiert ist. Die
Goldnanopartikel fungieren als Fluoreszenz- löschende FRET-Akzeptoren 004 und das Cyclodextrin fungiert als Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006 (d.h. eine mit einem FRET -Akzeptor 004 markierte Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006). Über den Analyt-kompetitiven Binder 005 und die Analyt-spezifische
Erkennungseinheit 006, die miteinander wechselwirken, wird der FRET-Akzeptor 004 an die Verknüpfungseinheit 001 gebunden. Durch die Anbindung an die Verknüpfungseinheit 001 befinden sich FRET-Donor 003 und FRET-Akzeptor 004 in einem definierten Abstand, der gering genug ist für den strahlungsfreien
Resonanzenergietransfer. Es kommt zur Fluoreszenzlöschung. Die
Zusammensetzung fluoresziert nicht mehr (Gefäß B). Wird ein Analyt 007
(Amantadin-Hydrochlorid) zugegeben, so bindet dieser an die Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006 und bewirkt dadurch die Abtrennung des FRET-Akzeptors 004 von der Verknüpfungseinheit 001. Durch die Trennung des FRET-Paares wird die Fluoreszenz des FRET-Donors 003 wieder aktiviert, die Zusammensetzung fluoresziert wieder (Gefäß C).

Claims

Ansprüche
Eine Zusammensetzung für die Detektion eines Analyten, umfassend
zumindest ein FRET-Donor- Akzeptor-Paar,
zumindest eine Verknüpfungseinheit, die durch ein zumindest bifunktionelles Molekül gebildet wird,
wobei die durch das zumindest bifunktionelle Molekül gebildete
Verknüpfungseinheit den Donor und den Akzeptor miteinander verbindet, und
entweder der Donor oder der Akzeptor über eine Analyt-spezifische
Erkennungseinheit und einen Analyt-kompetitiven Binder mit der
Verknüpfungseinheit verbunden ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1 , weiterhin umfassend ein Substrat, wobei die durch das zumindest bifunktionelle Molekül gebildete
Verknüpfungseinheit auch mit dem Substrat verbunden ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das die
Verknüpfungseinheit bildende zumindest bifunktionelle Molekül eine Molmasse von weniger als 300 g/mol aufweist.
Die Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Donor des FRET-Paares und, sofern vorhanden, das Substrat kovalent mit der Verknüpfungseinheit verbunden sind und der Akzeptor über die Analyt- spezifische Erkennungseinheit und den Analyt-kompetitiven Binder mit der Verknüpfungseinheit verbunden ist; oder der Akzeptor des FRET-Paares und, sofern vorhanden, das Substrat kovalent mit der Verknüpfungseinheit verbunden sind und der Donor über die Analyt-spezifische Erkennungseinheit mit der Verknüpfungseinheit verbunden ist.
Die Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Analyt-spezifische Erkennungseinheit kovalent mit der Verknüpfungseinheit verbunden ist und der Analyt-kompetitive Binder entweder mit dem FRET- Donor oder dem FRET-Akzeptor markiert ist und durch seine
Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit den FRET- Donor oder den FRET-Akzeptor mit der Verknüpfungseinheit verbindet; oder der Analyt-kompetitive Binder kovalent mit der Verknüpfungseinheit verbunden ist und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit entweder mit dem FRET-Donor oder dem FRET-Akzeptor markiert ist und durch ihre Wechselwirkung mit dem Analyt-kompetitiven Binder den FRET-Donor oder den FRET-Akzeptor mit der Verknüpfungseinheit verbindet.
Die Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Donor des FRET-Paares ein organischer oder anorganischer Luminophor ist.
Die Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Akzeptor des FRET-Paares ein organischer oder anorganischer Luminophor ist.
Die Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Akzeptor des FRET-Paares ein Lumineszenzlöscher ist.
Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei das Substrat ein organisches oder anorganisches Polymer oder eine Festkörperoberfläche ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Verknüpfungseinheit als eine Wiederholeinheit in einem Polymer vorliegt; oder die
Verknüpfungseinheit auf ein Polymer aufgepfropft ist.
Ein Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-10, umfassend die Anbindung eines FRET-Donors und eines FRET -Akzeptors an ein zumindest bifunktionelles Molekül, wobei entweder die Anbindung des FRET -Akzeptors oder die Anbindung des FRET-Donors an das zumindest bifunktionelle Molekül über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und einen Analyt-kompetitiven Binder erfolgt.
Das Verfahren nach Anspruch 11 , weiterhin umfassend die Anbindung des zumindest bifunktionellen Moleküls an ein Substrat.
Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei entweder der FRET-Donor oder der FRET-Akzeptor über die Analyt-spezifische Erkennungseinheit und den Analyt-kompetitiven Binder mit dem zumindest bifunktionellen Molekül verbunden wird, indem zunächst die Analyt-spezifische Erkennungseinheit kovalent mit dem zumindest bifunktionellen Molekül verbunden wird und anschließend der mit dem FRET-Donor oder -Akzeptor markierte Analyt- kompetitive Binder zugegeben wird, oder alternativ indem zunächst der Analyt-kompetitive Binder kovalent mit dem zumindest bifunktionellen Molekül verbunden wird und anschließend die mit dem FRET-Donor oder - Akzeptor markierte Analyt-spezifische Erkennungseinheit zugegeben wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 11-13, wobei das zumindest bifunktionelle Molekül als Monomer in einer Polymerisation verwendet wird oder auf ein Polymer aufgepfropft wird
Eine Vorrichtung für die Detektion eines Analyten, umfassend die
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-10.
16. Die Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-10 zur Detektion eines Analyten.
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