DE102005010096B3 - Assay mit osmotisch induzierter Abtrennung und Anreicherung hochmolekularer nachzuweisender Substanzen und fluidisches Mikrosystem zu seiner Durchführung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Assay-Verfahren und ein fluidisches Mikrosystem zu seiner Durchführung, das insbesondere für miniaturisierte Affinitätstests im Microarray-Format geeignet ist. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird eine Flüssigphase mit mindestens einer nachzuweisenden hochmolekularen löslichen Substanz, z. B. einem markierten Reaktionspartner oder Reaktionsprodukt einer Affinitätsreaktion, auf Grund der hydraulischen Wirkung eines hochmolekularen Osmotikums an einer Ultrafiltermembran in eine von dieser Membran begrenzte miniaturisierte Messkammer bewegt. Dort konzentriert sich die zu bestimmende Fraktion der hochmolekularen Substanz(en), während niedermolekulare gelöste Bestandteile mit dem Lösungsmittel durch die Poren der Membran abströmen. Hierdurch wird eine hohe Nachweisempfindlichkeit erreicht.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Assay-Verfahren und ein fluidisches Mikrosystem zu seiner Durchführung, das insbesondere für miniaturisierte Affinitätstests im Microarray-Format geeignet ist.
• Erfindungsgemäß wird eine Flüssigphase mit mindestens einer nachzuweisenden hochmolekularen löslichen Substanz, z.B. einem markierten Reaktionspartner oder Reaktionsprodukt einer Affinitätsreaktion, auf Grund der hydraulischen Wirkung eines hochmolekularen Osmotikums an einer Ultrafiltermembran in eine von dieser Membran begrenzte miniaturisierte Messkammer bewegt. Dort konzentriert sich die zu bestimmende Fraktion der hochmolekularen Substanz(en), während niedermolekulare gelöste Bestandteile mit dem Lösungsmittel durch die Poren der Membran abströmen. Hierdurch wird eine hohe Nachweisempfindlichkeit erreicht. Es kann im kompetitiven Modus ein positives Signal gewonnen oder ein Assay in homogener Phase durchgeführt werden. Ein weiterer Vorteil besteht in einem geringen Zeit- und Arbeitsaufwand für die Durchführung des Assays.
• Affinitätsassays sind analytische Verfahren auf der Grundlage von nichtkovalenten Affinitätsbindungen. Zu ihnen gehören die Immuntests bzw. Immunoassays, die gegenwärtig Standardverfahren in der klinischen Chemie, Diagnostik, Umweltanalytik und in der Bioprozesskontrolle darstellen. Die Grundlage jedes Affinitätsassays ist mindestens eine spezifische bioanalytische Erkennungsreaktion, z.B. die spezifische Bindung eines Affinitätsliganden an einen Antikörper. Anstelle von Immunproteinen können auch andere Affinitätsrezeptoren, z.B. Lekti ne oder Aptamere, zur selektiven Bindung eines Analyten eingesetzt werden.
• Die inhärente Spezifität und hohe Affinität der Affinitätsbindung ermöglicht eine selektive, hochspezifische und hochempfindliche Konzentrationsmessung. Mit Hilfe von Antikörpern können beispielsweise picomolare und nanomolare Lösungen zahlreicher Analyte erfasst werden. Spezifische Antikörper können gegen fast alle Arten von chemischen Verbindungen erzeugt werden, von niedermolekularen Substanzen, sog. Haptenen, bis hin zu biologischen oder synthetischen Makromolekülen. Die Verfahren zur Herstellung und Durchführung von Affinitätsassays im makroskopischen Format (Reaktionsvolumen >20 Mikroliter) sind der Fachwelt bekannt und können in einer Vielzahl von Publikationen nachgelesen werden (z.B. James P. Gosling "Immunoassays", Practical Approach Series, Oxford University Press, Oxford, England).
• Ein Immunoassay oder Affinitätsassay besteht in der Regel aus mehreren Stufen, u.a. mindestens einem Inkubationsschritt, mindestens einem Waschschritt und einer Konzentrationsmessung.
• Es wurden in den vergangenen Jahren moderne Verfahren entwickelt, die das Handling von Immunoassays vereinfachen und sie dadurch für neue Applikationen zugänglich machen, z.B. der Schwangerschafts-Selbsttest im Papier-Teststreifenformat ("Immunochromatographie"). Eine andere Entwicklungsrichtung besteht darin, eine Vielzahl von Immuntests rasterartig auf einer kleinen Testfläche, dem „Biochip" oder „Microarray" zu vereinigen. Immuntests im Microarrayformat können z.B. aus einer einzigen Blutprobe eine Vielzahl einzelner Analyte nachweisen. Ein Problem bei der Miniaturisierung von Immunoassays oder Affinitätsassays besteht in der Verringerung der Signalintensität durch die Reduktion der Reagenzmenge.
• Da die üblichen Affinitätsrezeptoren (z.B. Antikörper und Antigene) und ihre Bindungspartner mit den üblichen Detektoren nicht direkt empfindlich detektierbar sind, werden sie mit einer Markierungssubstanz („Label" oder „Marker"), die für ein messbares und von der Analytkonzentration abhängiges Signal sorgt, chemisch gekoppelt. Für miniaturisierte Immunoassays benötigt man Markierungssubstanzen von höchster spezifischer Aktivität, z.B. Enzyme (u.a. Peroxidase, alkalische Phosphatase) oder Fluoreszenzfarbstoffe mit hoher Fluoreszenzausbeute. Mit Enzymen erzielt man einen Verstärkungseffekt dadurch, dass diese die Bildung eines Signalstoffes (z.B. eines farbiges Reaktionsproduktes) katalysieren. Fluoreszenzfarbstoffe erlauben die schnellste und direkteste Nachweisreaktion; eine hohe Empfindlichkeit erfordert bei Fluoreszenzaffinitätsassays jedoch leistungsfähige und aufwendige optischen Geräte.
• Hochmolekulare Antigene wie z.B. Proteine lassen sich besonders günstig mit einem "Sandwich"-Immunoassay nachweisen. In der häufigsten Ausführungsart ist die Oberfläche mit einem spezifischen Antikörper überzogen, so dass der Analyt nach Inkubation mit einer Probenlösung an der Oberfläche gebunden wird, während andere Probenbestandteile in einem nachfolgenden Waschschritt entfernt werden. Der eigentliche Nachweis erfolgt nach der Inkubation mit einem zweiten, markierten spezifischen Antikörper und einem weiteren Waschschritt (und gegebenenfalls einer Farbentwicklungsreaktion bei Enzymlabeln). Die Dosis-Effekt-Kurve ist positiv.
• Die quantitative Bestimmung von Substanzen mit Molekulargewichten unterhalb 1000 Dalton ist eines der wichtigsten Anwendungsgebiete von Immunoassays. Zu diesem Zweck werden fast ausschließlich sogenannte kompetitive Assays eingesetzt. Bei diesen konkurriert der (unmarkierte) Analyt mit einem Analogon um die freien Bindungsplätze eines Affinitätsrezeptors, wobei entweder der Affinitätsrezeptor oder das konkurrierende Analogon markiert sind. Das Analogon kann ein niedermolekularer oder hochmolekularer löslicher Stoff sein.
• Bei kompetitiven Affinitätsassays zum Nachweis niedermolekularer Analyte findet in der Regel eine von der Analytkonzentration abhängige Aufteilung der markierten Moleküle in eine lösliche und oberflächengebundene Fraktion statt. In vielen Fällen erfolgt die Affinitätsbindung der markierten Moleküle an eine mit immobilen Reaktionspartnern besetzte Oberfläche. Nach dem Abwaschen der löslichen Fraktion wird die Menge des gebundenen Markers an der Oberfläche erfasst. In Abwesenheit des konkurrierenden Analyten kann die maximale Menge an markierten Molekülen an die Oberfläche gebunden werden, die Menge der gebundenen markierten Moleküle an die Oberfläche wird durch die spezifische Bindung des Analyten an seinen Rezeptor reduziert.
• Da die gebundene Menge der gebundenen markierten Substanz nach einem Waschvorgang erfasst wird, ergibt sich eine inverse Dosis-Effekt-Kurve, d.h. die größten Signale werden bei den geringsten Analytkonzentrationen erzielt; bei sehr großen Analytkonzentrationen ergibt sich eine sehr geringe Abhängigkeit der Signalstärke von der Konzentration; bei sehr kleinen Analytkonzentrationen stört die Unsicherheit der Differenzmessung. Auf Grund des Prinzips der Differenzmessung muss die Konzentration des markierten Reaktionspartners an die Konzentration des Analyten angepasst werden. Da die gebundene Menge der markierten Substanz meist in einer sehr dünnen Schicht an der Oberfläche liegt, sind bei kleinen Messfeldern die Anforderungen an den Detektor sehr hoch, was sich u.a. auf die Kosten auswirkt.
• Wünschenswert wären die Aufhebung der inversen Charakteristik bei kompetitiven Assays oder eine ratiometrische Messung des Mengenanteils der durch die Reaktion mit dem Analyten gebildeten Fraktion der markierten Moleküle. Das heterogene Testsystem hat außerdem den Nachteil, dass eine unspezifische Bindung der markierten Moleküle an die Oberfläche unvermeidbar ist, wodurch ein mehr oder weniger großes Hintergrundsignal entsteht. Es wäre von großem Vorteil, wenn kompetitive Affinitätsassays vollständig in homogener Flüssigphase durchgeführt werden könnten.
• Die genannten Limitierungen kompetitiver Immunoassays beruhen vor allem darauf, dass nur der an eine Oberfläche gebundene Teil des markierten Bindungspartners (z.B. des Antikörpers oder Antigens) nachgewiesen wird. Gegenwärtig besteht ein großer Bedarf an miniaturisierten Immunoassays mit positiven Dosis-Effekt und solchen, die ohne die Bindung der markierten Moleküle an eine Oberfläche auskommen.
• DE 101 34 860 A1 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Erfassen immunogener Partikel mittels einer Filtrationsmesszelle. US 5,045,193 betrifft eine mehrteilige Vorrichtung für den Nachweis und die Analyse einer Substanz mittels Filtration und Immunfiltration. DE 197 29 492 A1 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Serienprobenahme unter Verwendung von zwei oder mehr Dialyseschläuchen, welche mehrere Gefäße verbinden. US 5,894,061 A betrifft ein Nachweisverfahren, bei dem der Analyt durch eine semipermeable Membran diffundiert. Keine dieser Druckschriften offenbart die Verwendung eines hochmolekularen Osmotikums zur Konzentration von nachweisenden hochmolekularen Substanzen wie in der vorliegenden Erfindung.
• US 5,770,086 A beschreibt die Anreicherung von Analyten auf einer Membran, wobei ein Osmotikum (Hydrogel) als Absorbens verwendet wird.
• Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist somit die Bereitstellung eines neuen, kostengünstigen und sehr empfindlichen Verfahrens und einer entsprechenden Vorrichtung für die Durchführung quantitativer, insbesondere kompetitiver, Assays, vorzugsweise Affinitätsassays, im Einzel- oder Microarray-Format. Das erfindungsgemäße Verfahren soll die Möglichkeit eines positiven Dosis-Effektes nach einer bequemen und standardisierten Trennung zwischen den durch die Reaktion mit dem Analyten entstandenen Fraktionen der markierten Moleküle bieten. Es soll ohne die Bindung der markierten Moleküle an eine Oberfläche durchführbar sein und eine Empfindlichkeitssteigerung gegenüber vergleichbaren konventionellen Verfahren ermöglichen.
• Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch einen Assay entsprechend dem Anspruch 1 und ein fluidisches Mikrosystem zu seiner Durchführung entsprechend dem Anspruch 11 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung werden in den Unteransprüchen 2–10 und 12–16 ausgeführt.
• Das Wesen der Erfindung besteht in der Nutzung makromolekularer Osmotika und einer Ultrafiltermembran zur Konzentration von nachzuweisenden hochmolekularen Substanzen und zu deren Abtrennung von potentiell störenden niedermolekularen Substanzen.
• Im Falle eines Affinitätsassays handelt es sich dabei typischerweise um eine Trennung der als Ergebnis der Reaktion mit dem Analyten vorliegenden Fraktionen der markierten Moleküle und um die Konzentration einer der Fraktionen.
• Üblicherweise wird bei Affinitätsassays eine zu analysierende Probenmatrix mit markierten und unmarkierten Reaktionspartnern gemischt. Anschließend liegt der markierte Reaktionspartner auf Grund der Affinitätsbindung mit dem Analyten oder auf Grund der Konkurrenz mit dem Analyten um die Affinitätsbindung in unterschiedlichen Bindungsformen (z.B. löslich/unlöslich oder komplexgebunden/unkomplexiert) vor, deren Mengenverhältnis von der Konzentration des Analyten abhängig ist.
• Eine Voraussetzung für einen erfindungsgemäßen Affinitätsassay besteht darin, dass die Reaktion des Analyten mit den Reaktionspartnern so geführt wird, dass anschließend nur eine der markierten Fraktionen in gelöster und gleichzeitig hochmolekularer Form vorliegt. Hierfür sind der Fachwelt mehrere Möglichkeiten bekannt.
• Ein nicht beschränkendes Beispiel ist die Bindung eines niedermolekularen Markers, der ein markiertes Analogon des Analyten darstellt, an einen Rezeptor, z.B. einen Antikörper. Nach der Reaktion ist in diesem Fall in Abhängigkeit von der Konzentration des Analyten eine Fraktion des markierten Analogons hochmolekular, die andere niedermolekular. Weiter Beispiele sind die Konkurrenz des Analyten mit einem markierten löslichen hochmolekularen Analogon um Bindungsstellen an einem immobilen Antikörper und die Konkurrenz des Analyten mit einem immobilisierten Analogon um einen markierten löslichen Antikörper. In beiden Fällen liegen nach der Reaktion in Abhängigkeit von der Konzentration des Analyten markierte Makromoleküle sowohl in gelöster als auch in nicht gelöster Form vor.
• Die Begriffe "hochmolekular" und "niedermolekular" sind im Kontext dieser Erfindung relativ zur Porengröße einer erfindungsgemäß eingesetzten Ultrafiltermembran zu verstehen. Dies bedeutet, dass eine niedermolekulare Fraktion relativ ungehindert durch die verwendete Ultrafiltermembran strömen kann (Reflexionskoeffizient < 0,5), die hochmolekulare Fraktion dagegen nicht hindurchdringt (Reflexionskoeffizient nahe dem Wert 1).
• Geeignete Ultrafiltermembranen in kapillarer oder planarer Gestalt mit Molmassen-Cut-off (bezogen auf Proteine) zwischen 5000 und 10⁶ bzw. Molekülgrößen-Cut-off (bezogen auf den Stokesschen Durchmesser) zwischen 1,5 und 50 nm werden von zahlreichen Herstellern angeboten. Typische, aber nicht beschränkende Molekulargewichts- bzw. Molekülgrößenbereiche für niedermolekulare Substanzen liegen unter 5 kDa bzw. unter 2 nm, typische Molekülgrößenbereiche von hochmolekularen Substanzen über 10 kDa bzw. über 3 nm. Da markierte Affinitätsbindungspartner in verschiedensten Molekülgrößen im Bereich von 0,3 bis 50 nm kommerziell verfügbar sind oder präpariert werden können, kann durch die Wahl der Membran die kritische Molekülgröße für die Unterscheidung der niedermolekularen und der hochmolekularen Fraktion an die zur Verfügung stehenden oder gewählten Reaktionspartner angepasst werden. Wird eine Membran mit sehr großem Molekülgrößen-Cut-off eingesetzt, hat dies den Vorteil einer hohen hydraulischen Permeabilität, erfordert aber entsprechend große Teilchen des markierten hochmolekularen Reaktionspartners oder Reaktionsproduktes und des hochmolekularen Osmotikums.
• Erfindungsgemäß wird die Flüssigphase mit der zu detektierenden hochmolekularen löslichen Fraktion auf osmotischem Wege durch die hydraulische Wirkung eines hochmolekularen Osmotikums an einer Ultrafiltermembran (5) von einem größeren Einfüllraum (2) über eine Fließstrecke (3) in einen hydraulisch mit ihm verbundenen kleineren Messraum (4) bewegt, nachdem eine konzentrierte Lösung des polymeren Osmotikums in einen Ansaugraum (1) eingefüllt wurde (vgl. 1 und 2).
• Die Begriffe "Fließstrecke" bzw. "kapillare Fließstrecke" sind im Kontext dieser Erfindung als ein Strömungsweg zwischen dem Einfüllraum und dem Messraum zu verstehen, dessen Volumen nur einen kleinen Teil des Volumens des Einfüllraumes ausmacht.
• Das hochmolekulare Osmotikum übt an einer Ultrafiltermembran, die den Ansaugraum von jedem Messraum trennt, eine hydraulische Wirkung auf die Flüssigphase mit dem markierten Reagenz aus. Die Flüssigkeit wird in den Messraum bewegt und ihre niedermolekularen Bestandteile werden mit dem Lösungsmittel durch die Poren der Ultrafiltermembran gesaugt.
• Als hochmolekulares Osmotikum kommt grundsätzlich jeder bekannte hochmolekulare Stoff in Frage, in dessen wässeriger Lösung das osmotische Potenzial ausreichend stark (in der Regel um mehr als 0,1 MPa) erniedrigt werden kann. Bekanntlich besitzen insbesondere konzentrierte Lösungen hydrophiler Polymere wie Polyethylenoxid oder Polyvinylalkohol, deren Moleküle wasserreiche Knäuel darstellen, unabhängig von ihrer Teilchenkonzentration eine starke osmotische Wirkung, da die konzentrierten Lösungen Netzwerkflüssigkeiten darstellen, deren osmotisches Potenzial durch die Konzentration der Monomere be stimmt wird. Wichtig ist, dass bei der gegebenen Konzentration die Molekülgröße des Osmotikums deutlich über dem Cut-off der Membran liegt. Dies ist bei Polyvinylalkohol oder Polyethylenoxid beispielsweise bei Ultrafiltrationsmembranen mit einem Molekülgrößen-Cut-off von 5 nm gegeben, wenn das Molekulargewicht über 20 kDa liegt. Polyethylenoxid ist z.B. gut als hochmolekulares Osmotikum für den erfindungsgemäßen Assay geeignet, weil bei diesem neutralen Polymer, das in unterschiedlichen Molmassen kommerziell erhältlich ist, relativ hohe osmotische Drucke (über 1 MPa) mit einer vertretbaren Viskosität (< 500 mPa s^–1) erreicht werden können.
• Bekanntlich zeigen Lösungen von hochmolekularen Polyelektrolyten wie Polyacrylat, Dextransulfat, Polystyrolsulfonat, Poly(diallyldimethylammoniumchlorid) und dergleichen bereits in niedriger Massekonzentration eine starke osmotische Wirkung, weil die elektrisch sorbierten Gegenionen in hoher Teilchenkonzentration vorliegen. Die hydraulische Wirkung der Polyelektrolyte an einer Ultrafiltermembran ist besonders hoch, wenn die Salzkonzentration der angesaugten Flüssigkeit im Vergleich zur Konzentration der polymergebundenen Ionen der Polyelektrolytlösung gering ist. Ein für die Erfindung breit einsetzbares polymeres Osmotikum ist hochmolekulares Natriumdextransulfat der Firma Pharmacia mit einem mittleren Molekulargewicht von 500 kDa. Es ist für Membranen mit Ultrafiltrationseigenschaften und einer Porenweite unter 20 nm nicht permeabel, bildet konzentrierte und osmotisch hochwirksame Lösungen mit verhältnismäßig geringer Viskosität und ist für Licht im sichtbaren und kurzwelligen Bereich transparent.
• Während Wasser und die niedermolekularen Bestandteile der Flüssigkeit durch die Poren der Ultrafiltermembran in den Ansaugraum übertreten, konzentrieren sich die hochmolekularen nachzuweisenden gelösten Substanzen, z.B. markierte Reaktionspartner oder Reaktionsprodukte einer Affinitätsreaktion, im Messraum, wo ihre Menge sehr empfindlich, beispielweise an Hand der Radioaktivität, optischen Eigenschaften, z.B. Fluoreszenz oder Lumineszenz, magnetischen oder elektrischen Eigenschaften oder einer katalytischen, z.B. enzymatischen, Aktivität eines Markers detektiert werden kann.
• Das Eindringen von Luft in die Messkammer nach vollständiger Entleerung der Einfüllkammer lässt sich dadurch verhindern, dass dem Reagenz das polymere Osmotikum in geringer Konzentration beigefügt wird. Auf diese Weise lässt sich auch das Verhältnis, in dem die markierten Makromoleküle konzentriert werden, festlegen.
• In der Anreicherung der markierten Moleküle in einem kleinen Volumen bei relativ hoher Schichtdicke besteht ein wesentlicher Vorteil der Erfindung, insbesondere für die Entwicklung eines miniaturisierten Testarrays. Ein weiterer wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der bequemen Trennung der markierten löslichen Makromoleküle oder hochmolekularen Komplexe von den übrigen markierten Molekülen, die im Überschuss vorliegen können. Die abzutrennende Fraktion der markierten Moleküle kann durch Bindung an eine Oberfläche oder ein partikuläres Affinitätssorbens an der Strömung in die Messkammer gehindert sein. Sie kann auch niedermolekular sein und mit dem Wasser durch die Poren der Ultrafiltermembran in den Ansaugraum strömen. Die erstgenannte Möglichkeit hat den Vorzug eines positiven Dosis-Effektes, die letztgenannte ermöglicht einen Assay in homogener Phase und hat daher den Vorteil, dass auf die Immobilisierung eines Affinitätsbindungspartners verzichtet werden kann.
• Beispielweise kann eine definierte Menge eines markierten Antikörpers mit der Probematrix, die einen niedermolekularen Analyten enthält, gemischt werden. Ein Teil des Antikörpers ist danach an den Analyten gebunden. Anschließend wird ein Af finitätssorbens, das mit dem Analyten um den Antikörper konkurriert, im Überschuss hinzugegeben. In der Flüssigphase verbleiben nur die mit dem Analyten verbundenen markierten Antikörper. Danach wird die Flüssigphase in die Messkammer bewegt. Nach Einfüllung der Lösung des polymeren Osmotikums in die Ansaugkammer wird ein großer Teil der Flüssigkeit aus dem Einfüllraum in die Messkammer gesaugt, wo sich der markierte Antikörper im Komplex mit dem Analyten konzentriert. Es kann ein weitgehend stöchiometrischer, positiver Dosiseffekt erreicht werden.
• Ein heterogener kompetitiver Affinitätsassay mit positivem Dosiseffekt kann durch das erfindungsgemäße Verfahren auch mit einem markierten partikelgebundenen Komplex nach dem Verdrängungsprinzip erreicht werden. Der Komplex besteht aus einem Affinitätsrezeptor und einem hochmolekularen markierten Analogon des Analyten,. Der nichtmarkierte Teil des Komplexes ist physikalisch oder kovalent an die Oberfläche gebunden, während der markierte Teil durch Ligandenaustausch mit dem Analyten abgelöst werden kann. In diesem Fall ist es günstig, wenn der Analyt eine hohe Affinität zum Rezeptor (z.B. einem Antikörper) besitzt, während das markierte Analogon mit mittlerer Affinität gebunden ist, so dass mit einer kurzen Reaktionszeit und mit einer nahezu stöchiometrischen Reaktion zu rechnen ist. Nach der Reaktion werden die markierten löslichen Reaktionsprodukte in der Messkammer konzentriert. Auch hier wird eine direkte Abhängigkeit des Signals von der Konzentration des Analyten erreicht.
• Die Erfindung ermöglicht auch heterogene Affinitätsassays mit niedermolekularen markierten Analoga, bei denen ein positiver Dosis-Wirkungseffekt erzielt wird. Beispielsweise wird die Konkurrenz eines niedermolekularen Analyten mit einem niedermolekularen fluoreszierenden Analogon an einem Affinitätssorbens mit immobilisierten Antikörpern genutzt. Die Flüssigphase enthält das fluoreszierende niedermolekulare Analogon in einer direkt von der Konzentration des Analyten abhängigen Konzentration. Gibt man nun den Antikörper in gelöster Form im Überschuss hinzu, wird der Marker in einen hochmolekularen Komplex überführt und kann im Messraum akkumuliert werden. Es ist auch möglich, dass eine Lösung des unmarkierten Antikörpers vor Zugabe der Probe und der übrigen Reagenzbestandteile unter Nutzung von Kapillarkräften in die Messkammer eingeführt wird. Nach dem osmotisch induzierten Ansaugen der Flüssigphase wird die lösliche Fraktion des niedermolekularen markierten Analogons an den Antikörper gebunden und in der Messkammer konzentriert.
• Wird die Erfindung für einen heterogenen Fluoreszenzimmunoassay mit hochmolekularen markierten Verbindungen genutzt, findet die Messung der Fluoreszenz nach erfolgter Immunreaktion in einem gesonderten Raum, dem Messraum, statt. Ist das Fluorophor kovalent an das Makromolekül gebunden, kann die Fluoreszenzmessung im optimalen Elektrolytmilieu für die Fluoreszenz durchgeführt werden, auch wenn dieses mit der Reaktion selbst nicht kompatibel ist. Wird z.B. ein mit Fluoreszein markierter Reaktionspartner eingesetzt, ist es sinnvoll, den pH-Wert der Lösung des polymeren Osmotikums auf etwa 9 einzustellen. Das genannte Fluorophor kann im alkalischen Milieu mit sehr hoher Fluoreszenzausbeute erfasst werden.
• Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich ein empfindlicher kompetitiver Affinitätsassay für einen niedermolekularen Analyten in homogener Phase durchführen. Hierzu werden beispielsweise zwei Reagenzien eingesetzt, zum einen ein unmarkierter Affinitätsrezeptor für den Analyten, in der Regel ein Antikörper, und zum anderen ein niedermolekularer markierter Konkurrenzligand, z.B. ein Konjugat des Analyten mit einem Fluoreszenzfarbstoff. Der Assay kann so durchgeführt werden, dass eine begrenzte und definierte Menge des Antikörpers zu nächst mit dem Analyten und anschließend mit einem im Überschuss zum Antikörper vorliegenden markierten niedermolekularen Konkurrenzliganden reagiert. Hierdurch wird ein von der Menge des Analyten abhängiger Teil der markierten niedermolekularen Substanz in den hochmolekularen Komplex überführt und lässt sich daher im Messraum konzentrieren. Falls die Konzentrationen des Analyten und des Konkurrenzliganden weit über den jeweiligen Dissoziationskonstanten liegt, entspricht die Menge des markierten nachweisbaren Komplexes der Differenz zwischen der Menge des Antikörpers und der Menge des Analyten. Die Genauigkeit dieses Assays lässt sich erhöhen, wenn auf einem Array Tests mit der Probenmatrix und dem Blindwert paarweise durchgeführt werden. Die Differenz der Signale ist in diesem Fall positiv mit der Konzentration des Analyten korreliert.
• Im dargestellten homogenen System kann eine empfindliche ratiometrische Messung durchgeführt werden. Wenn sowohl der niedermolekulare Konkurrenzligand als auch der hochmolekulare Rezeptor markiert sind und die Marker getrennt voneinander quantifiziert werden können, beispielsweise an Hand unterschiedlicher Fluoreszenz-Spektren, kann der Anteil der einfach markierten Komplexe, die mit dem Analyten markiert werden, ohne Parallelansatz ermittelt werden.
• Wird die Erfindung zur Durchführung des homogenen Assays in der dargestellten Form eingesetzt, ist es wünschenswert, den niedermolekularen markierten Konkurrenzliganden vollständig auszuwaschen. Das Auswaschen der niedermolekularen Markerfraktion aus der Messkammer kann durch Ansaugen einer zusätzlichen unmarkierten wässrigen Lösung durch die Ultrafiltermembran und/oder durch Ersatz der osmotisch wirksamen Polymerlösung im Ansaugraum durchgeführt werden. Das Ansaugen einer zusätzlichen unmarkierten wässrigen Lösung ermöglicht auch die vollständige Überführung der markierten Makromoleküle in die Mess kammer. Es wird erleichtert, wenn zwischen dem Einfüllraum und dem Messraum ein hydrophiles Filter mit einer Porenweite von ca. 2 μm oder ein Festbett aus feinen hydrophilen Partikeln liegt, welches für wässrige Lösungen von Kolloiden durchlässig ist und das Eindringen von Luft in den Messraum verhindert.
• Die Erfindung ermöglicht auch miniaturisierte enzymgekoppelte Immunoassays („enzyme linked immunoassays"; ELISA). Es wird beispielsweise ein Antikörper verwendet, der an ein Enzym, z.B. eine Peroxidase, kovalent gekoppelt ist. Der Teil des im Überschuss zugesetzten Antikörpers, der den Analyten komplexiert, kann nicht an das ebenfalls im Überschuss vorliegende, nachträglich zugegebene partikuläre Affinitätssorbens binden. Die Lösung des hochmolekularen Osmotikums, die in den Ansaugraum eingeführt wird, enthält in diesem Fall ein niedermolekulares ungefärbtes Enzymsubstrat, dass die Ultrafiltermembran durchquert. Der enzymatisch aktive Komplex, der sich durch Ultrafiltration im Messraum akkumuliert, katalysiert die Reaktion des Substrates zu einem kolloidalen fluoreszierenden oder gefärbten Stoff. Letzterer konzentriert sich in der Messkammer, so dass unter Ausnutzung der Enzymreaktion in kurzer Zeit ein hochverstärktes und positiv mit der Analytkonzentration korreliertes Signal auf kleiner Fläche erzeugt wird.
• In ähnlicher Weise kann die Erfindung genutzt werden, um einen empfindlichen Assay auf der Grundlage eines kolloidalen Silberniederschlages oder eines anderen kolloidalen Niederschlages durchzuführen. Werden z.B. Gold-Nanopartikel zur Markierung eines Immunreagenz verwendet und erfindungsgemäß im Messraum konzentriert, kommt es in Abhängigkeit von der Menge der Goldpartikeln zu einer Fällung von metallischem kolloidalen Silber, wenn die Lösung des Osmotikums ein geeignetes Reduktionsmittel und Silberionen enthält.
• Das erfindungsgemäße fluidische Mikrosystem, welches für die Durchführung der oben beschriebenen Assays, insbesondere Affinitätsassays, geeignet, aber nicht darauf beschränkt ist, umfasst mindestens einen Ansaugraum (1) und mindestens einen vom Ansaugraum durch eine Ultrafiltermembran (5) getrennten Messraum (4), wobei jeder Messraum über eine Fließstrecke (3), deren Volumen nur einen kleinen Teil des Volumens des Einfüllraumes ausmacht, mit einem Einfüllraum (2) verbunden ist und das Volumen des Einfüllraumes das Volumen der Messraumes um ein Vielfaches übersteigt.
• Eine Variante des erfindungsgemäßen fluidischen Mikrosystems ist in 1 dargestellt. Es stellt ein Array aus zahlreichen miniaturisierten Einfüllräumen (2) und Messräumen (4) in einem transparenten Feststoff dar. Beide Räume sind durch eine kapillare Fließstrecke (3) hydraulisch miteinander verbunden. Jeder Messraum wird durch eine Ultrafiltermembran von einem Ansaugraum getrennt. Jeder Messraum ist als Lumen des den Ansaugraum durchziehenden Segmentes einer Kapillarmembran mit Ultrafiltereigenschaften, z.B. einer Mikrodialysefaser, gestaltet. Dies hat den Vorteil, dass sich die markierten löslichen Makromoleküle in einem sehr kleinen Raum konzentrieren. Sie sind in diesem Raum auf Grund ihrer Fluoreszenz, Lumineszenz oder Reaktivität empfindlich nachweisbar. Wird durch ein enzymatisch markiertes Immunreagenz in der Messkammer ein Farbstoff akkumuliert, kann dieser auf Grund des relativ langen Lichtweges durch die Messkammer z.B. in einem einfachen Lichtmikroskop ein deutliches Signal erzeugen. Eine für diesen Zweck geeignete Dialysefaser aus regenerierter Zellulose mit einem Innendurchmesser von etwa 0,2 mm besitzt eine transparente, für Antikörper völlig undurchlässige Membran. Ihr geringer Querschnitt ermöglicht die mikroskopische Bildauswertung. Bei einer Länge des Messraumes von 5 mm wird eine hohe Farbtiefe oder ein starkes Fluoreszenzsignal bei starker Verdünnung möglich. Eine besonders hohe Empfindlichkeit im Fluo reszenz-Affinitätsassay wird erreicht, wenn das Anregungslicht das Hohlfaserlumen quer durchstrahlt und die Fluoreszenz über dem Querschnitt der Hohlfaser detektiert wird. Wird die Anregung mit Laserlicht durchgeführt, lässt sich bei der dargestellten Anordnung leicht in zahlreichen Messräumen der gleiche Quantenfluss erreichen, so dass eine gleichzeitige Detektion in zahlreichen Messräumen möglich ist. Soll ein Affinitätsassay in inhomogener Phase durchgeführt werden, kann zwischen dem Einfüllraum und dem Messraum ein Partikelfilter vorgesehen werden, mit dessen Hilfe das Affinitätssorbens auch bei geringer Partikelgröße an der Strömung in den Messraum gehindert wird.
• Die in 1 dargestellte Gestaltungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist nicht die einzig mögliche. Für bestimmte Anwendungen oder für die kostengünstige Herstellung des Arrays kann es günstig sein, wenn die Hohlfasersegmente parallel zur Array-Ebene angeordnet werden oder wenn anstelle von Kapillarmembranen planare Ultrafiltermembranen eingesetzt werden. Beispielsweise besteht das Array aus zwei Körpern, zwischen denen eine Ultrafiltermembran eingeklebt ist. Ansaugraum, Einfüllräume, Fließstrecken und Messräume stellen in diesem Fall Kanäle oder Vertiefungen in diesen Körpern dar.
• 2 zeigt den Array im Querschnitt durch eine Einheit aus Einfüllräumen (2) und Messräumen (4). Jeder Messraum wird durch einen engen senkrecht stehenden Kanal gestaltet. Der Ansaugraum (1) stellt einen weiten, senkrecht zum Querschnitt verlaufenden Strömungskanal in dem gegenüberliegenden Körper dar. Er wird vom Messraum durch die Ultrafiltermembran (5) getrennt.
• Für die Erfassung von Liganden an Hand ihrer Radioaktivität mit Hilfe eines Röntgenfilms ist es günstig, wenn eine sehr flache Messkammer verwendet wird, die an einer Seite durch die Ultrafiltermembran von der Ansaugkammer und an der anderen Seite über eine dünne flüssigkeitsundurchlässige Membran begrenzt wird, die dem Röntgenfilm anliegt.
• Weitere Gestaltungsvarianten der erfindungsgemäßen Assays, insbesondere Affinitätsassays, und fluidischen Mikrosysteme sind je nach Art der verwendeten Reaktionspartner und/oder Affinitätspartner sowie der Art der verwendeten Nachweismethoden möglich und für den Fachmann durch Abwandlung der beschriebenen allgemeinen Gestaltungsprinzipien unschwer zu realisieren.
• BEISPIEL
• Ein fluoreszenzmarkiertes Protein wurde im Beobachtungsfeld eines Fluoreszenzmikroskops in einem erfindungsgemäßen fluidischen Mikrosystem konzentriert und die Zunahme der Fluoreszenzintensität mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.
• Das Mikrosystem umfasste zwei Mikrokammern, die durch Mikrodialysefasern aus regenerierter Cellulose (Durchmesser 240 μm) verbunden waren. Dabei befand sich ein offenes Ende der Dialysefaser-Kapillarmembran in der ersten Kammer, die dem Einfüllraum entsprach, während die zweite Kammer, entsprechend dem Ansaugraum, von einem Hohlfasersegment (dem Messraum) durchzogen war, dessen zweites offenes Ende außerhalb der Kammer mit der Atmosphäre kommunizierte. Somit bildete die Wandung der Dialysehohlfaser die Ultrafiltermembran, während ihr Hohlraum die Fließstrecke und den Messraum bereitstellte. Nach Einfüllen von je 5 μl einer verdünnten gepufferten Polymerlösung (10 mM Natriumphosphat, pH 7, mit 0.1 % Natriumdextransulfat) in die Einfüllkammer und die Ansaugkammer füllte sich das Lumen der Kapillarmembran (100 nl) adhäsiv. In die Einfüllkammer wurde fluoreszein-markiertes Immunglobulin in hoher Verdünnung gegeben, so dass die Fluoreszenzintensität an der Nachweisgrenze lag. Anschließend wurde die verdünnte gepufferte Polymerlösung in der Ansaugkammer durch eine konzentrierte Lösung von Natriumdextransulfat (20 %) mit einem osmotischen Druck von etwa 30 bar ersetzt. Hierdurch gelang es, in etwa 30 Minuten den größten Teil der Flüssigkeit aus der Einfüllkammer in die Ansaugkammer zu saugen und das fluoreszenzmarkierte Immunglobulin im Lumen des Hohlfasersegments zu konzentrieren. Die Fluoreszenzintensität war nun deutlich im Fluoreszenzmikroskop zu erkennen. Da sich gleichzeitig Natriumdextransulfat im Hohlfasersegment konzentrierte, wurde der Fluss selbsttätig beendet, es kam nicht zum Austrocknen des Hohlfaserlumens.

Claims (16)

1. Verfahren zum Nachweis einer hochmolekularen Substanz, wobei die Lösung eines hochmolekularen Osmotikums in mindestens einen an eine Ultrafiltermembran (5) grenzenden Ansaugraum (1) eingeführt wird oder diesen durchströmt und hierdurch eine Flüssigphase, die niedermolekulare Bestandteile und die mindestens eine hochmolekulare nachzuweisende Substanz enthält, aus einem Einfüllraum (2) über eine Fließstrecke (3) zwischen dem Einfüllraum (2) und einem Messraum (4), deren Volumen nur einen kleinen Teil des Volumens des Einfüllraumes (2) ausmacht, in den durch die Ultrafiltermembran (5) vom Ansaugraum (1) getrennten Messraum (4) bewegt wird, wobei sich die hochmolekulare nachzuweisende Substanz im Messraum (4) konzentriert und dort nachgewiesen wird, während niedermolekulare Bestandteile durch die Membranporen in den Ansaugraum (1) strömen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das hochmolekulare Osmotikum aus der Gruppe aus Polyvinylalkohol, Polyethylenoxid, Polystyrolsulfonat, Poly(diallyl-dimethylammoniumchlorid), Dextransulfat, Natriumdextransulfat, Polyacrylat oder Natriumpolyacrylat, ausgewählt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der hochmolekularen Substanz im Messraum durch eine direkte optische Wechselwirkung durch den Nachweis ihrer radioaktiven, magnetischen oder elektrischen Eigenschaften oder durch eine durch einen Marker enzymatisch oder auf andere Weise katalysierte chemische Reaktion geschieht.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der nachzuweisenden hochmolekularen Substanz um markierte Reaktionspartner oder Reaktionsprodukte in Abhängigkeit von der Konzentration eines Analyten handelt, die auf Grund einer Reaktion des Analyten mit Affinitätsrezeptoren in der Flüssigphase enthalten sind.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Affinitätsrezeptoren Antikörper, Antigene, Lektine oder Aptamere umfassen.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigphase hochmolekulare unmarkierte Affinitätsrezeptoren für den Analyten und mit diesem konkurrierende niedermolekulare markierte Analoga enthält, von denen ein Teil, dessen Größe von der Konzentration des Analyten abhängt, an die Rezeptoren gebunden ist und im Messraum (4) konzentriert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Einfüllraum (2) nach der Reaktion immobile Reaktionspartner oder Analoga des Analyten enthält, in denen ein Teil der markierten Moleküle in Abhängigkeit von der Konzentration des Analyten gebunden ist, und diese markierten Komponenten an der Strömung in den Messraum (4) gehindert sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die im Messraum (4) konzentrierten Reaktionspartner oder Reaktionsprodukte Fluorophore ent halten und die Fluoreszenzausbeute durch Elektrolyte, die gemeinsam mit dem Osmotikum in den Ansaugraum (1) gegeben werden, verstärkt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die im Messraum (4) konzentrierten Reaktionspartner oder Reaktionsprodukte eine Enzymaktivität besitzen, und enzymatisch aus einem niedermolekularen Substrat, das aus dem Ansaugraum (1) in den Messraum (4) diffundiert, ein analytisch gut nachweisbares kolloidales Produkt gebildet wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die im Messraum (4) konzentrierten Reaktionspartner oder Reaktionsprodukte Gold-Nanopartikeln oder andere Katalysatoren für eine Fällungsreaktion enthalten und die Lösung des hochmolekularen Osmotikums im Ansaugraum (1) Silberionen und ein Reduktionsmittel oder andere Reaktionspartner für eine durch die Katalysatoren induzierte Fällungsreaktion enthalten.
11. Fluidisches Mikrosystem, insbesondere für die Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–10, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens einen Ansaugraum (1), in dem sich eine Lösung eines hochmolaren Osmotikums befindet, und mindestens einen vom Ansaugraum (1) durch eine Ultrafiltermembran (5) getrennten Messraum (4) enthält, wobei jeder Messraum (4) über eine Fließstrecke (3), deren Volumen nur einen kleinen Teil des Volumens des Einfüllraumes (2) ausmacht, mit einem Einfüllraum (2) verbunden ist und das Volumen des Einfüllraumes (2) das Volumen des Messraumes (4) um ein Vielfaches übersteigt.
12. Fluidisches Mikrosystem nach Anspruch 11, mit einer zwischen zwei Körpern liegenden planaren Ultrafiltermembran (5), wobei jeder Messraum (4) durch einen Kanal in der an die Ultrafiltermembran (5) grenzenden planen Oberfläche des einen Körpers gebildet wird und der Ansaugraum (1) in einer Vertiefung in der planen Oberfläche des anderen Körpers besteht.
13. Fluidisches Mikrosystem nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Messraum (4) einem Röntgenfilm anliegt.
14. Fluidisches Mikrosystem nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultrafiltermembran (5) eine Kapillarmembran ist und ein Segment dieser Kapillarmembran jeden Ansaugraum (1) durchzieht und hier einen Messraum (4) vom Ansaugraum (1) trennt.
15. Fluidisches Mikrosystem nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Einfüllraum (2) und dem Messraum (4) ein hydrophiles, für Luft im wassergesättigten Zustand schwer durchlässiges Filter für feine Partikeln vorgesehen ist.
16. Fluidisches Mikrosystem nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es mehrere Messräume (4) umfasst.