DE69636173T2

DE69636173T2 - Verdrängungstest auf einer porösen membran

Info

Publication number: DE69636173T2
Application number: DE69636173T
Authority: DE
Inventors: S. Frances Potomac LIGLER; W. Anne Falls Church KUSTERBECK; Y. Sina Great Neck RABBANY
Original assignee: US Department of Navy
Current assignee: US Department of Navy
Priority date: 1996-01-11
Filing date: 1996-10-18
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2016-10-19
Also published as: DE69636173D1; US20020028475A1; WO1997025619A1; US6750031B1; EP0880699B1; EP0880699A1; EP0880699A4; ATE327507T1; US6808937B2

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Tests und insbesondere Tests vom Verdrängungstyp.
2. Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung
Im US-Patent Nr. 5.183.740, das für jegliche Zwecke durch Verweis hierin aufgenommen ist, ist ein Durchflussimmuntest und ein Verfahren zur Durchführung von Verdrängungsimmuntests beschrieben. Bei einem Verdrängungsimmuntest wird der Antikörper, anders als bei einem kompetitiven Test, einem markierten Analyten ausgesetzt, bevor er einem Analyten ausgesetzt wird. Der Analyt befindet sich ausreichend lange in Kontakt mit dem Antikörper und dem markierten, gebunden Analyten, um ein Gleichgewicht herzustellen.
Da keine Zeit zur Herstellung eines Gleichgewichts erforderlich ist, sind Verdrängungstests schneller als kompetitive Tests. Ein Verdrängungstest ergibt jedoch im Allgemeinen ein schwächeres Signal als ein kompetitiver Test. Bei einem Verdrängungstest sind die verfügbaren Bindungsstellen des Antikörpers mit einem markierten Analyten gesättigt oder nahezu gesättigt, bevor der unmarkierte Analyt zugesetzt wird. Da kein Gleichgewicht hergestellt wurde (wobei der markierte Analyt und der unmarkierte Analyt kontinuierlich Bindungen eingehen und lösen und im Gleichgewichtszustand miteinander um eine erneute Bindung an die verfügbaren Bindungsstellen am Antikörper konkurrieren), bleiben die meisten der markierten Analyten in einem Verdrängungstest an den Antikörper gebunden und sind somit nicht in der Lage, ein Signal bereitzustellen.
Aufgrund des relativ schwachen Signals, das durch die Verdrängungstests bereitgestellt wird, steigt die Bedeutung der Sicherstellung der Beständigkeit der Testbedingungen. Die im USP 5.183.740 für Verdrängungstests beschriebenen, Kügelchen enthaltenden Säulen müssen vorsichtig gelagert, vorbereitet und beladen werden, um chemische und physikalische Beständigkeit (z.B. Porosität, Vermeidung von Kanalbildung) zwischen den einzelnen Tests sicherzustellen. Durch diese Notwendigkeit der sorgfältigen Vorbereitung und des sorgfältigen Testens steigen Arbeitsaufwand, Anforderungen an die Arbeitsfertigkeit und die Kosten zur Durchführung von genauen Verdrängungstests. Außerdem schränken die Probleme in Zusammenhang mit der Verwendung von Kügelchen enthaltenden Säulen die untere Nachweisgrenze von Verdrängungstests ein.
Von US Drug Testing, Inc., (Rancho Cucamonga, Kalifornien) durchgeführte Studien führten zu besseren Ergebnissen in Verdrängungstests, wenn hohe, dünne Säulen mit antikörperbeschichteten Kügelchen und markierten Antigenen eingesetzt wurden als bei Einsatz von kürzeren, breiteren Säulen. Weiters war die Effizienz, mit der sich ein markiertes Antigen in Gegenwart eines unmarkierten Antigens vom Antikörper löste, größer, wenn die Strömungsgeschwindigkeiten verringert wurden und das Antigen mehr Zeit hatte, mit dem immobilisierten Komplex zu wechselwirken (Wemhoff et al., J. Immunol. Methods 223-230 (1992)). Beide dieser Versuchsanordnungen lassen vermuten, dass die Immobilisierung des Antikörpers und markierten Antigens auf einer porösen Membran keine geeignete Matrix für Verdrängungstests bereitstellen würde, da diese Geometrie dem Antigen unter den Strömungsbedingungen nicht ausreichend Zeit geben würde, effizient mit dem Komplex zu wechselwirken und detektierbare Mengen des markierten Antigens zu verdrängen.
Das US-Patent Nr. 5.369.007 von David A. Kidwell offenbart einen Verdrängungstest, bei dem Proben eine Membran passieren, auf der ein Antikörper immobilisiert ist. Die Bindungsstellen des immobilisierten Antikörpers sind an einen enzymatisch markierten Analyten gebunden. Ein Analyt aus der Probe verdrängt den markierten Analyten, was dazu führt, dass der markierte Analyt und der Rest der Probe nicht in eine superabsorbierende Schicht übertreten. Die superabsorbierende Schicht enthält ein Substrat für die enzymatische Markierung und jegliche erforderlichen Indikatoren. Das Kidwell-Patent lehrt jedoch, dass eine Strömungsgeschwindigkeit von etwa 0,02 ml/min und Wechselwirkungsdauern von etwa 1 bis 5 min erforderlich sind, um eine detektierbare Wechselwirkung zwischen dem Analyten und dem Antikörper sicherzustellen. In vielen Situationen sind aber sogar noch raschere Ergebnisse erwünscht. Außerdem ist die Kidwell-Mikrotestkarte nicht wiederverwendbar.
Zusammenfassung der Erfindung
Demgemäß besteht ein Ziel dieser Erfindung in der Durchführung von Bioassays, die in der Lage sind, winzige Mengen eines Analyten in unter einer Minute zu detektieren.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der raschen Durchführung von Bioassays in einem Format, das eine Wiederverwendung der Matrix erlaubt, welche den Analyten selektiv bindet.
Diese und weitere Ziele der Erfindung werden erreicht, indem eine Probe rasch an einer nichtabsorbierenden Membran vorbei strömen gelassen wird, die ein Bindungselement aufweist, das kovalent daran gebunden ist, um Anbindungsstellen für den Analyten zu bilden. Die verfügbaren Anbindungsstellen sind im Wesentlichen mit einer markierten Form des Analyten gesättigt. Nichtspezifische Bindungsstellen sind blockiert, um nichtspezifische Bindungen zu verhindern. Außerdem strömt die Probe mit einer größeren Geschwindigkeit an der Membran vorbei als erforderlich ist, um ein Gleichgewicht zwischen der Ablösung eines markierten Analyten von den Bindungsstellen und der Anbindung eines Analyten (markiert oder unmarkiert) daran zu erreichen. Die verarbeitete Probe wird dann auf die Gegenwart von markierten Antigenen analysiert, welche den unmarkierten Analyten von seiner Bindungsstelle verdrängt haben. Diese Analyse kann qualitativ oder quantitativ erfolgen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ein umfassenderes Verständnis der Erfindung ergibt sich aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und den beliegenden Zeichnungen, in denen gleiche Zahlen in unterschiedlichen Figuren die gleichen Strukturen oder Elemente bezeichnen, worin:
1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist;
2 eine schematische Darstellung einer alternativen Ausführungsform einer Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist;
3 eine schematische Darstellung einer weiteren alternativen Ausführungsform einer Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist;
4 ein Diagramm von Daten eines Membrantests gemäß der vorliegenden Erfindung ist, worin die Membran durch das Reagenzglas-Inkubationsverfahren hergestellt wurde;
5 ein Diagramm von Daten eines Membrantests gemäß der vorliegenden Erfindung ist, worin die Membran durch Sättigung des immobilisierten Antikörpers mit einem markierten Analyten in der Säule, und nicht in einem Reagenzglas, hergestellt wurde;
6 ein Diagramm von Daten eines einzelnen Membrantests gemäß der vorliegenden Erfindung ist, hergestellt durch Sättigung des Antikörpers direkt in der Säule;
7 ein Ablaufdiagramm ist, das eine Ausführungsform eines Tests gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung schematisch darstellt;
8a, 8b und 8c die Ergebnisse zeigen, die in dem gemäß dem im Ablaufdiagramm in 7 dargestellten Verfahren erhalten wurden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Membranen, die für die vorliegende Erfindung zweckdienlich sind, sind typischerweise (in Bezug auf wässrige Materialien) nichtabsorbierende Materialien. Solch eine nichtabsorbierende Membran unterstützt eine hohe Durchflussgeschwindigkeit. Außerdem kann bei Verwendung einer nichtabsorbierenden Membran die Membran nach der Verwendung leicht zur Entfernung von Proben gespült und wiederverwendet werden. Wenn eine Verdrängung stattgefunden hat, stellt die Nachladung mit einem markierten Analyten eine Option dar.
Typischerweise weisen Membranen, die in der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind, Dicken, freiliegende Oberflächen und Porositäten auf, die eine Detektion des Analyten bei einer Wechselwirkungsdauer von etwa 0,1 s bis etwa 30 s, typischerweise etwa 1 s bis etwa 15 s, zwischen einer Probe, die vermutlich den Analyten enthält, und der Membran mit einem markierten Analyten darauf erlaubt. Im Allgemeinen beträgt die Porengröße in der Membran etwa 0,2–1,0 μm, typischerweise etwa 0,45 μm. Natürlich sind auch andere Porengrößen möglich, um die gewünschte Wechselwirkungsdauer zu erreichen. Desgleichen können auch die Dicke und Oberfläche der Membran so ausgewählt werden, dass die gewünschte Wechselwirkungsdauer bereitgestellt wird.
Jede beliebige nichtabsorbierende Membran mit geeigneter Porengröße und Dichte an Stellen zur Immobilisierung von Bindungselementen für den Analyten kann eingesetzt werden. Beispielsweise kann die Membran ein Polyamid (beispielsweise Nylon^TM-Membranen, wie z.B. Immunodyne ABC^TM (eine Nylon^TM-6,6-Membran von Pall Biosupport, Port Washington, New York, USA)) oder ein Polyvinylidinfluorid, wie z.B. Immobilon^TM- oder Durapore^TM-Membranen von Millipore, Bedford, Massachusetts, USA, sein. Weitere geeignete Membranen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Cellulose, Nitrocellulose, Silicafasern, Aluminiumoxid und Polyvinylchlorid.
Bindungselemente können auf der ausgewählten Membran auf jede beliebige Weise immobilisiert werden, welche die Verfügbarkeit zumindest einer Bindungsstelle auf dem immobilisierten Bindungselement zur selektiven Bindung des markierten Analyten und Zielanalyten in einem wässrigen Medium sicherstellt. Zur Anbindung von Bindungselementen an die Membranen sind mehrere Verfahren allgemein bekannt und werden deshalb hierin nicht genauer beschrieben. Die Bindungselemente können entweder durch die gesamte Dicke der Membran oder nur auf einer oder auf beiden ihrer Oberflächen immobilisiert werden.
Das Bindungselement kann jede beliebige Substanz sein, die auf der Membran immobilisiert werden kann und den Zielanalyten und sein markiertes Analogon spezifisch bindet. Bindungselemente umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Lectine, Antikörper, Antibiotika und andere Bindungsproteine als Antikörper und Antibiotika.
Nachdem die Bindungselemente auf der Membran immobilisiert wurden, sind ihre verfügbaren Bindungsstellen zur selektiven Bindung mit dem Analyten üblicherweise im Wesentlichen mit einem markierten Analogon des Analyten (hierin als „markierter Analyt" bezeichnet) gesättigt. Eine Sättigung der verfügbaren Bindungsstellen mit dem markierten Analyten erhöht die Empfindlichkeit, indem sichergestellt wird, dass so viele Analytenmoleküle wie möglich markierte Analyten verdrängen, anstatt direkt an freie Bindungsstellen zu binden.
Die Membran ist in Bezug auf die Probenströmung so ausgerichtet, dass die Probe über die gewünschte Wechselwirkungsdauer am Komplex aus Bindungselement und markiertem Analyten auf der Membran vorbeiströmt. Die Probe strömt normal zur Ebene der Membran durch. In einer anderen Alternative kann der Membranträger eine Hohlfaser sein, die so aufgebaut ist, dass die Probe durch die hohle Mitte strömt, bevor sie die Membran passiert. In jeder Ausführungsform der Erfindung kann die Strömung der Probe durch die Membran passiv (d.h. Schwerkraft- oder Kappilarströmung) oder aktiv (vollständig oder teilweise aus der Wirkung einer Strömungspumpe, aus manuellem Druck oder aus Vakuum resultierende Strömung) erfolgen.
Jede beliebige Markierung, die in Tests für den Analyten zweckdienlich sind, können zur Markierung des Analyten eingesetzt werden. Fluorophore sind besonders zweckdienliche Markierungen. Geeignete Fluorophore umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Fluorescein, Cadaverin, Texas Red^TM (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) und Cyanine 5^TM (BDS, Pennsylvania, USA). Die eingesetzte Fluorophormarkierung ist typischerweise eine, die im sichtbaren oder nahen Infrarotbereich detektierbar ist.
Nachdem die Probe ihre Wechselwirkung mit der Membran, die immobilisiertes Bindungselement – markierten Analyten darauf immobilisiert aufweist, beendet hat, wird die bearbeitete Probe (z.B. der Ausfluss aus einer Probensäule oder der Teil der Probe, der den markierten Abschnitt eines Teststreifens passiert hat und darüber hinaus geflossen ist) analysiert, um die Konzentration des verdrängten markierten Analyten zu bestimmen. Das Detektionsmittel für diese Analyse umfasst eine Ausgabe zur Information des Benutzers, dass eine Schwellenmenge der Markierung in der Probe detektiert wurde. Wenn die Markierung fluoreszierend ist, umfasst das Detektionsmittel zudem eine Lichtquelle zum Anregen der fluoreszenzmarkierten Analyten. Das Detektionssystem kann verschiedene Verfahren zur optischen Messung nutzen, einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf, eines Spektralphotometers, Infrarotspektrometers, Fluorimeters, optischen Biosensors oder des Auges.
Die vorliegende Erfindung ist zur Detektion eines beliebigen Analyten in einem wässrigen Medium zweckdienlich, der spezifisch an das Bindungselement bindet. Die Erfindung kann beispielsweise zur Detektion der Gegenwart von Analyten in Körperflüssigkeiten (Blut, Sperma, Speichel, Urin usw.), Wasser, pharmazeutischen Präparaten, Umweltproben, Aerosolen, Nahrungsmitteln und Getränken eingesetzt werden. Wenn die Probe, die vermutlich den Analyten enthält, sich ursprünglich in einem viskosen flüssigen, festen oder gasförmigen Zustand befindet, wird die Probe vorzugsweise zuerst in Wasser gelöst, bevor sie der Membran ausgesetzt wird.
Auf einer einzigen Membran können mehrere Bindungselemente für mehrere Analyten immobilisiert werden. Membranen, die das gleiche oder ein anderes Bindungselement enthalten, können in Stapeln angeordnet werden. Wenn mehrere Bindungselemente für mehrere Analyten eingesetzt werden, können unterschiedliche Markierungen auf den markierten Analyten verwendet werden, um unterscheiden zu können, welcher Analyt vorhanden ist.
1 ist eine schematische Darstellung einer Vorrichtung 10 gemäß der vorliegenden Erfindung, worin die Membran normal zum Probenfluss steht. Eine Membran 12 mit Bindungselementen, die kovalent an diese gebunden oder auf andere Weise darauf immobilisiert sind, und verfügbaren Bindungsstellen, die mit einem markierten Analyten gesättigt sind, ist quer über der Säule 14 angebracht. Eine wässrige Probe, die von oben in die Säule 14 eintritt, strömt durch die Membran 12. Ein Analyt in der Probe wechselwirkt mit der Membran 12 und verdrängt den markierten Analyten von der Membran 12. Der markierte Analyt tritt, wenn er nicht einen weiteren markierten Analyten oder unmarkierten Analyten von der Membran verdrängt, zum Ausfluss aus der Säule 14 hinzu. Der wässrige Probenausfluss aus der Säule 14 kommt dann in die Leitung 16, die den Ausfluss zum Detektor 18 befördert, wo die Gegenwart des markierten Analyten im Ausfluss aus der Säule 14 detektiert wird.
2 zeigt eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin die Membran ebenfalls normal zum Probenfluss steht. Eine poröse Membran 102 mit Bindungselementen, die kovalent an diese gebunden oder auf andere Weise darauf immobilisiert sind, und verfügbaren Bindungsstellen, die mit einem markierten Analyten gesättigt sind, ist quer über die Säule 104 mit einer offenen Spitze angebracht. Um zu verhindern, dass die Probe zwischen der Außenseite der Membran 102 und der Innenwand der Säule 104 strömt, erstreckt sich die Membran typischerweise über die gesamte Breite der Säule 104. Die offene Spitze der Säule 104 wird in den oberen Teil eines Behälters 106 insertiert (typischerweise durch ein Septum (nicht dargestellt)), der eine Probe enthält, die vermutlich den Analyten umfasst. Ein Saugmittel 105 kann Vakuum erzeugen, um die Probe aus dem Behälter 106 durch die Membran 102 in die Säule 104 zu ziehen. Jede Markierung in der Säule kann durch ein Detektionsmittel detektiert werden, das sich außerhalb der Säule befindet. Um diese externe Detektion zu vereinfachen, ist die Säule 104 vorzugsweise für die zur Detektion eingesetzte Energie transparent oder weist ein passend platziertes Fenster auf, das dafür transparent ist.
Obwohl in 2 das Saugmittel als Kolben und die Säule 104 als Spritze dargestellt ist, in welcher der Kolben untergebracht ist, sind auch andere Vakuumanordnungen möglich. 3 zeigt beispielsweise einen Aufbau, der dem von Vacuutainers^TM ähnelt. Ein evakuiertes Rohr 204 weist eine quer angebrachte poröse Membran 205 mit Bindungselementen, die kovalent an diese gebunden oder auf andere Weise darauf immobilisiert sind, und verfügbaren Bindungsstellen, die mit einem markierten Analyten gesättigt sind, quer dazu auf. Um zu verhindern, dass die Probe zwischen der Außenseite der porösen Membran 205 und der Innenwand des evakuierten Rohrs 204 strömt, erstreckt sich die Membran typischerweise über die gesamte Breite des evakuierten Rohrs 204. Das offene Ende des evakuierten Rohrs 204 wird mit einem Verschluss 206 mit einem Flansch 208 verschlossen, der sich um den Rand des offenen Endes des Rohrs 204 erstreckt. Eine Spitze 210 erstreckt sich vom Verschluss 206 aus in entgegengesetzter Richtung zu einer Hohlnadel 212, die sich ebenfalls vom Verschluss 206 aus erstreckt. Die Nadel 212 reicht in die Nähe eines Septums 214, wenn das Rohr 204 mit nur leichtem Druck innerhalb des Flansches 208 platziert wird. Das Septum 214 erhält das Vakuum im Abschnitt 216 des Rohrs 204 aufrecht. Obwohl das Septum 214 im Wesentlichen undurchlässig für Gas oder Flüssigkeiten ist, wird es mit der Nadel 212 durchstochen, wenn das Rohr 204 ganz in den Flansch 208 eingeschoben wird. Beim Durchstechen des Septums 214 zieht das Vakuum im Abschnitt 216 Flüssigkeit aus dem Probenbehälter 218 durch die Spitze 210 in die Hohlnadel 212, durch die Membran 205 und in den Abschnitt 216. Jede beliebige Markierung im Abschnitt 216 kann wie bei anderen Ausführungsformen der Erfindung detektiert werden. Um sicherzustellen, dass die Nadel 212 die Membran 205 nicht durchsticht, sollte der Abstand zwischen der Unterseite des Septums 214 und der Unterseite der Membran 205 größer sein als die Höhe der Nadel 212. Diese Ausführungsform der Erfindung stellt sicher, dass die Strömung durch die Membran von Probe zu Probe gleichmäßig ist.
Nachdem die Erfindung beschrieben wurde, werden nun Beispiele angeführt, um spezifischen Anwendungen der Erfindung zu veranschaulichen, einschließlich der besten bekannten Art der Durchführung der Erfindung. Diese spezifischen Beispiele sind nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung zu verstehen, die in dieser Anmeldung beschrieben ist.
BEISPIELE
Beispiel 1: TNT-Detektion
Um die Membranen herzustellen, wurde ein monoklonaler 11B3-Antikörper (Maus-IgG₁) mit Spezifizität für TNT (Trinitrotoluol) auf der Membran Immunodyne^® ABC mit einer Porengröße von 0,45 μm immobilisiert. Der 11B3-Antikörper, 100 μl einer 2-nmol/ml-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), wurde an die Membran gebunden, entweder indem die Lösung in ein Reagenzglas gegeben und dann die Membran zugesetzt wurde oder indem der Antikörper in eine Säule pipettiert wurde, die schon die Membran enthielt. Egal ob in einer Säule oder einem Reagenzglas, die Membranen wurden vier Stunden lang bei Raumtemperatur mit dem Antikörper inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Antikörperlösung entfernt. Membranen, die dem Antikörper in einem Reagenzglas ausgesetzt worden waren, wurden in eine Säule gegeben. Jegliche unreagierte Bindungsstellen auf der Membran wurden durch den Zusatz von 100 μl 1 M Tris für etwa 30 Minuten blockiert. Um nichtspezifische Bindung zu reduzieren, wurden die Membranen ablaufen gelassen und dreimal mit PBS gewaschen, das 0,01 % des Detergens Triton X-100^® enthielt.
Der markierte Analyt wurde durch Anbindung des Fluorophors CY5^® (BDS, Pennsylvania, USA) an Trinitrobenzylcadaverin (CY5-TNB) hergestellt. Um die Antikörper-Bindungsstellen mit dem markierten Antigen zu sättigen, wurde eine Lösung von CY5-TNB (4 nmol in 50 μl PBS) zu jeder Säule zugesetzt, und die Säulen wurden über Nacht in einen Wippschüttler gegeben. Dann wurden die Säulen an das Fluorimeter angeschlossen und kurz gewaschen. Die Proben wurden mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min eingeleitet. Analyteninjektionen wurden dreifach vorgenommen, wobei die Konzentrationen zwischen 18,75 ng/ml und 1200 ng/ml variierten. 2 zeigt Daten, die in einem Test mit einer Membran erhalten wurden, die durch das Testrohr-Inkubationsverfahren hergestellt worden war. Ein Fluoreszenzsignalpeak wurde bei allen Analytenkonzentrationen erhalten, der proportional zu der zur Säule zugesetzten Analytenmenge war.
3 zeigt Daten aus einem Test mit einer Membran, die durch Sättigung des immobilisierten Antikörpers mit einem markierten Analyten in der Säule und nicht im Reagenzglas hergestellt wurde. Wieder wurde eine Zunahme der Signalintensität mit steigender Analytenkonzentration beobachtet. Zwischen einer Analytenkonzentration von 700 ng/ml und 1200 ng/ml trat jedoch ein Plateau auf, in dem eine vernachlässigbare Zunahme der Signalintensität zu beobachten war, trotz einer zweifachen Steigerung der Analytenkonzentration, was vermuten lässt, dass weniger markierte Analyten auf der Membran zur Verdrängung verfügbar sind als bei der Membran, die im Reagenzglas hergestellt wurde.
Die 3 und 4 zeigen beide reproduzierbare Ergebnisse mit einem minimalen Standardfehler, der durch die Fehlerbalken angegeben ist. Die Testzeiten waren sehr kurz, wobei die genaue Dauer einfach eine Funktion der Strömungsgeschwindigkeit (in diesem Fall 1 ml/min) und der Länge des Rohrs zwischen der Analyteneinbringungsstelle und der Fluorimeter-Durchflusszelle ist. Für diese Versuch wurden Signale weniger als 1 Minute nach dem Zeitpunkt der Probeneinbringung erzeugt.
Beispiel 2: Detektion von RDX
Ähnliche Versuche wurden durchgeführt, indem ein monoklonaler Antikörper mit Spezifität für den Explosivstoff Cyclonit (RDX) auf der Membran immobilisiert wurde. Das Verfahren zur Immobilisierung war identisch mit dem für den Anti-TNT-Antikörper. Anstelle von Tris wurden jedoch 100 μl 0,5 % Casein eingesetzt, um die verbleibenden Bindungsstellen auf der Membran zu blockieren. 4 zeigt Daten aus einem Test mit einer einzelnen Membran, die durch Sättigung des Antikörpers direkt in der Säule hergestellt wurde. Eine lineare Beziehung zwischen der Signalintensität und der Analytenkonzentration ist zu erkennen. Die untere Detektionsgrenze dieses Tests liegt bei 5 ng/ml, was Werten im ppb-Bereich (Teile je Milliarde) entspricht.

Claims

Testverfahren zur Detektion eines Zielanalyten, folgende Schritte umfassend: das Bereitstellen einer porösen Membran mit darauf immobilisierten Bindungselementen, wobei jedes der Bindungselemente zumindest eine Bindungsstelle aufweist, die zur spezifischen Bindung an diesen Zielanalyten fähig ist; das Aussetzen dieser Bindungsstellen gegenüber einem markierten Analogon des Zielanalyts, um Komplexe aus membranimmobilisierten Bindungselementen und markierten Analoga zu bilden; das Strömenlassen einer wässrigen Probe, die vermutlich den Zielanalyten enthält, normal zur und durch die Membran mit den Komplexen darauf hindurch, und zwar mit einer Strömungsgeschwindigkeit, die es dem Zielanalyten erlaubt, den markierten Analyten unter Ungleichgewichtsbedingungen aus den Komplexen zu verdrängen, wobei die Strömungsgeschwindigkeit zudem eine Wechselwirkungsdauer zwischen dem Analyten und der Membran von etwa 0,1 s bis etwa 30 s bereitstellt; das Detektieren des verdrängten markierten Analyten, wobei die Menge des verdrängten markierten Analyten proportional zur Konzentration des Zielanalyten in der Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Bindungselement ein Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das markierten Analogon fluoreszenzmarkiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Wechselwirkungsdauer nicht mehr als etwa 15 Sekunden beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Membran nichtabsorbierend ist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die Membran aus der aus Cellulose, Nitrocellulose, Silicafasern, Aluminiumoxid und Polyvinylchlorid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 5, das nach dem Detektionsschritt weiters die folgenden Schritte umfasst: das Abspülen der Probe von der Membran; das Strömenlassen einer zweiten wässrigen, flüssigen Probe, die vermutlich den Zielanalyten enthält, sodass die zweite flüssige Probe normal zur und durch die abgespülte Membran mit den Komplexen darauf hindurch strömt, und zwar mit einer Strömungsgeschwindigkeit, die es dem Zielanalyten in der zweiten Probe erlaubt, den markierten Analyten unter Ungleichgewichtsbedingungen aus den Komplexen zu verdrängen, um stromab von der Membran einen fließfähigen, flüssigen Ausfluss zu erhalten, der das markierte Analogon enthält, das vom Zielanalyten in der zweiten Probe verdrängt wurde, wobei die Strömungsgeschwindigkeit zudem eine Wechselwirkungsdauer zwischen dem Analyten und der Membran von etwa 0,1 s bis etwa 30 s bereitstellt; das Detektieren des verdrängten markierten Analyten, wobei die Menge des verdrängten markierten Analyten proportional zur Konzentration des Zielanalyten in der Probe ist.
Vorrichtung zum Testen einer wässrigen Probe, die vermutlich einen Zielanalyten enthält, umfassend: eine poröse Membran mit darauf immobilisierten Bindungselementen mit zumindest einer Bindungsstelle, die zur spezifischen Bindung an den Zielanalyten fähig ist, wobei im Wesentlichen alle der Bindungsstellen auf der Membran von einem markierten Analogon des Zielanalyts besetzt sind, um Komplexe aus membranimmobilisierten Bindungselementen und markierten Analoga zu bilden; ein Strömungsmittel zum Strömenlassen einer wässrigen Probe, die vermutlich den Zielanalyten enthält, normal zur und durch die Membran mit den Komplexen darauf hindurch, und zwar mit einer Strömungsgeschwindigkeit, die es dem Zielanalyten erlaubt, den markierten Analyten unter Ungleichgewichtsbedingungen aus den Komplexen zu verdrängen, um eine behandelte Probe zu erhalten, wobei die Strömungsgeschwindigkeit zudem eine Wechselwirkungsdauer zwischen dem Analyten und der Membran von etwa 0,1 s bis etwa 30 s bereitstellt; und ein Detektionsmittel zum Detektieren der Gegenwart des markierten Analogons in der verarbeiteten Probe.
Vorrichtung nach Anspruch 8, worin das markierte Analogon fluoreszenzmarkiert ist.
Vorrichtung nach Anspruch 9, worin das Detektionsmittel weiters eine Lichtquelle zum Anregen jeglichen fluoreszenzmarkierten Analogons in der verarbeiteten Probe umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 8, worin das Bindungselement ein Antikörper ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10, worin das Detektionsmittel weiters zur quantitativen Bestimmung der Menge des markierten Analogons in der verarbeiteten Probe geeignet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10, worin das Detektionsmittel weiters ein Spektralphotometer, Infrarotspektrometer, Fluorimeter oder einen optischen Biosensor umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 8, worin das Strömungsmittel eine Leitung umfasst, durch welche die Probe aufgrund von Einwirkung der Schwerkraft oder einer manuellen Kraft strömt.
Vorrichtung nach Anspruch 8, worin die Membran nichtabsorbierend ist.
Vorrichtung nach Anspruch 15, worin nach der Verwendung der Vorrichtung zum Testen einer ersten wässrigen Probe, die vermutlich den flüssigen Analyten enthält, gemäß einem Verfahren nach Anspruch 1 die Membran gespült und die Vorrichtung wiederverwendet werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 8, worin das Strömungsmittel zur Bereitstellung einer Wechselwirkungsdauer zwischen dem Analyten und der Membran von nicht mehr als etwa 15 s geeignet ist.
Vorrichtung zum Testen einer wässrigen Probe, die vermutlich den Zielanalyten enthält, umfassend: einen Behälter, wobei der Behälter ein offenes Ende zur Aufnahme einer flüssigen Probe, die vermutlich einen Analyten enthält, ein geschlossenes Ende, eine poröse Membran, die sich über die gesamte Breite des Behälters erstreckt, und ein Sammelgefäß zwischen der Membran und dem geschlossenen Ende aufweist, wobei auf der Membran Bindungselemente immobilisiert sind, wobei jedes der Bindungselemente zumindest eine Bindungsstelle aufweist, die zur spezifischen Bindung an den Zielanalyten fähig ist, wobei im Wesentlichen alle der Bindungsstellen auf der Membran von einem markierten Analogon des Zielanalyts besetzt sind, um Komplexe aus membranimmobilisierten Bindungselementen und markierten Analyten zu bilden; ein Strömungsmittel zum Strömenlassen einer flüssigen Probe durch das offene Ende, durch die Membran und in das Sammelgefäß, und zwar mit einer Strömungsgeschwindigkeit, die es dem Zielanalyten erlaubt, den markierten Analyten unter Ungleichgewichtsbedingungen aus den Komplexen zu verdrängen, wobei die Strömungsgeschwindigkeit eine Wechselwirkungsdauer zwischen dem Analyten und der Membran von etwa 0,1 s bis etwa 30 s bereitstellt; ein Detektionsmittel zum Detektieren der Gegenwart des markierten Analogons im Sammelgefäß.
Vorrichtung zum Immuntesten einer wässrigen Probe, die vermutlich einen Zielanalyten enthält, umfassend: einen Behälter, wobei der Behälter ein offenes Ende und ein geschlossenes Ende aufweist; einen Verschluss, in den das offene Ende des Behälters in einer ersten Position, in der sich das geschlossene Ende des Behälters in einem ersten Abstand von diesem Verschluss befindet, und in einer zweiten Position, in der sich das geschlos sene Ende des Behälters in einem zweiten Abstand von diesem Verschluss befindet, einpassbar ist, wobei der zweite Abstand geringer ist als der erste Abstand; eine sich vom Verschluss nach außen erstreckende Spitze zur Aufnahme der wässrigen Probe; eine Hohlnadel, die sich vom Verschluss in zur Spitze entgegengesetzter Richtung erstreckt; ein Septum, das sich über die gesamte Breite des Behälters erstreckt, wobei das Septum zwischen dem geschlossenen Ende des Behälters und einem Ende der Nadel distal zum Verschluss angeordnet ist, wenn der Behälter sich in seiner ersten Position befindet, wobei das Septum im Wesentlichen fluidundurchlässig ist; eine poröse Membran zwischen dem Septum und dem geschlossenen Ende des Behälters, wobei sich die Membran über die gesamte Breite des Behälters erstreckt, und ein Sammelgefäß zwischen der Membran und dem geschlossenen Ende, wobei auf der Membran Bindungselemente immobilisiert sind, wobei jedes der Bindungselemente zumindest eine Bindungsstelle aufweist, die zur spezifischen Bindung an den Zielanalyten fähig ist, wobei im Wesentlichen alle der Bindungsstellen auf der Membran von einem markierten Analogon des Zielanalyts besetzt sind, um Komplexe aus membranimmobilisierten Bindungselementen und markierten Analyten zu bilden; ein evakuiertes Sammelgefäß zwischen der Membran und dem geschlossenen Ende des Behälters; ein Detektionsmittel zum Detektieren der Gegenwart des markierten Analogons im Sammelgefäß; wobei die Hohlnadel so positioniert ist, dass sie das Septum, nicht aber die Membran durchsticht, wenn der Behälter sich in der zweiten Position befindet.
Vorrichtung nach Anspruch 19, die weiters ein Probenhaltemittel mit einer flüssigen Probe darin umfasst, worin das Durchstechen der Membran dazu führt, dass die flüssige Probe vom Probenhaltemittel durch das offene Ende, durch die Membran und in den Sammelbehälter strömt.