DE102013105491A1

DE102013105491A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Primärsignalaufnahme für ein Affinitäts-Assay

Info

Publication number: DE102013105491A1
Application number: DE102013105491.9A
Authority: DE
Inventors: Angela Eubisch; Michael Hanko
Original assignee: Endress and Hauser Conducta Gesellschaft fuer Mess und Regeltechnik mbH and Co KG
Current assignee: Endress and Hauser Conducta GmbH and Co KG
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2014-12-04

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Primärsignalaufnahme für Affinitäts-Assay, wobei die optische Messgröße unter Einwirkung eines Substrats enzymatisch unter Durchflussbedingungen gebildet wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Primärsignalaufnahme für ein Affinitäts- Assay unter Durchfluss-Bedingungen.
Hintergrund und Aufgabe der Erfindung
Bei vielen bioanalytischen Anwendungen wird der Analytgehalt einer Probe durch optische Messungen bestimmt, bei denen die Absorption und/oder die Emission von elektromagnetischer Strahlung als Messgröße dient.
Bei Absorptionsmessungen wird die Schwächung der Strahlung beim Durchdringen einer Lösung eines absorbierenden Stoffes (Chromogen) genutzt. Bei der Messgröße der Lumineszenz wird die als Strahlung emittierte Energie beim Übergang, ausgehend von einem angeregten Zustand, in den Grundzustand, bestimmt. Häufige Anwendung findet dabei die Fluoreszenz und Chemilumineszenz. Bei ersteren erfolgt die Anregung durch geeignete Strahlungsquellen, welche optimalerweise Strahlung im Wellenlängenbereich der maximalen Absorption des jeweilig angewandten Fluorophors emittieren. Bei der Chemilumineszenz wird durch eine vorgelagerte chemische Reaktion der angeregte Zustand erreicht. Eine Chemilumineszenzdetektion kann gegenüber der Detektion von Fluoreszenz mit geringerem apparativem Aufwand erfolgen. Die entstehende Strahlung wird ohne die für die Fluoreszenz notwendige Anregung vor einem strahlungsfreien Hintergrund ohne weitere Filter mit einer einfachen Photodiode aufgenommen. Schwankungen durch eine Erwärmung und Drift der Anregungsquelle sowie Interferenzen durch Lichtstreuung werden ausgeschlossen.
Bei affinitätsbasierten Bioassays wird die Detektion des Bindungsereignises zwischen Analyt und Analytrezeptor häufig durch Nutzung eines Markers, welcher direkt oder indirekt mit dem Analyten und/oder dem Rezeptor verbunden ist, realisiert, sodass eine messtechnisch leicht zugängliche Größe zusätzlich eingebracht wird. Neben Fluoreszenzmarkern werden häufig Enzymmarkierungen oder radioaktive Label für optische Messmethoden verwendet. Bei Enzymmarkierungen bietet sich der Vorteil, dass mit ein und demselben Enzym je nach Wahl des Substrates Chemilumeszenz-, Fluoreszenz- und Absorptionsmessung stattfinden können. Häufig in der Bioanalytik als Marker eingesetzte Enzyme sind die Alkalische Phosphatase, die β-Galactosidase und die Meerrettichperoxidase (engl. horse radish peroxidase, HRP). Bei HRP wird beispielsweise das Chromophor 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) zu dem intensiv grün gefärbten Radikalkation ABTS^·+ oxidiert. 3-Aminophthalsäurehydrazid (Luminol) führt durch HRP-Katalyse zur Emission blauer Strahlung. Amplex Red (10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (ADHP)) wird zu dem Fluorophor Resorufin durch HRP umgesetzt, welches nach Anregung bei 520 nm bis 550 nm bei 585 nm bis 595 nm emittiert.
In vielen Anwendungen erfolgt die optische Messung unter der Bedingung eines geschlossenen Systems. So wird beim dem häufig in Mikrotiterplatten durchgeführten, affinitätsbasierten Verfahren des ELISAs nach einem optimierten Protokoll die gleiche Menge beispielsweise eines Chromophores in die Wells pipettiert, in welchen die Oberfläche in Abhängigkeit von der Analytkonzentration mit Enzymmolekülen modifiziert ist. Nach definierter Inkubationszeit wird die Absorption des dabei entstandenen Produktes mittels eines Plattenreaders gemessen.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben, mit dem bzw. mit der ein Analytgehalt mittels eines Affinitäts-Assays unter Durchflussbedingungen mit hoher Genauigkeit bestimmt werden kann.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung werden die Messungen im Durchfluss durchgeführt, d.h. das Substrat wird kontinuierlich zur Enzymoberfläche hin- und das gebildete Produkt wegtransportiert. Zur Auswertung können mehrere Parameter des Verlaufs des Primärsignals der optischen Messung beim Durchleiten der Substratlösung herangezogen werden. Das festphasengebundene Assay ist vorteilhafterweise so aufgebaut, dass (unter Nichtbeachtung sterischer Einflüsse sowie der Stofftransportlimitierung bei trägerimmobilisierten Enzymen) die Enzymmenge mit der Menge der Zielstruktur (z.B. Rezeptor, Analyt) auf der Oberfläche direkt proportional ist und darüber auf die Analytkonzentration in der Probenlösung geschlossen werden kann. Zur Bestimmung der Enzymmenge muss durch die verwendeten Substratkonzentrationen die Reaktionsgeschwindigkeit der enzymatischen Umsetzung immer nahe dem Maximum liegen. Vorteilhafterweise ist (beispielsweise bei zu Grunde legen einer Michaelis-Menten-Enzymkinetik nach der entsprechenden Geschwindigkeitsgleichung für die Produktbildung) die Reaktionsgeschwindigkeit direkt proportional zur Enzymmenge. Zusammenfassend gilt der Zusammenhang: Reaktionsgeschwindigkeit v = v_max ~ Emzymmenge ~ Analytgehalt in der Probe Es zeigte sich, dass die zur Auswertung nutzbaren Parameter des Primärsignalkurvenverlaufs beim Durchfluss des Substrates eine Abhängigkeit von der festphasengebundenen Enzymmenge (und somit von der Analytkonzentration in der Probenlösung) aufweisen und somit als ein Maß für die maximale Reaktionsgeschwindigkeit herangezogen werden können.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispiele erläutert. Es zeigen:
1 eine graphische Darstellung des allgemeinen Verlaufs des Primärsignals für eine Chemilumineszenzmessung mit dem Substrat Luminol;
2 eine graphische Darstellung eines Primärsignalverlaufs bei Absorptionsmessungen mit dem Substrat ABTS;
3 eine schematische Darstellung eines Absorptionsdurchflusssensors;
4 eine schematische Darstellung zur räumlichen Trennung/Entkopplung zwischen einem Detektionsbereich und einem Messbereich eines Sensors.
1 zeigt für Chemilumineszenzmessungen mit dem Substrat Luminol exemplarisch den allgemeinen Verlauf des Primärsignals, den Strom I der Photodiode, welche sich im Ausführungsbeispiel direkt über der mit Enzymmolekülen modifizierten Messoberfläche befindet.
Aus dem Verlauf des Signals können die folgenden Parameter zur Auswertung herangezogen werden:

• der Anstieg des Photodiodenstromes m_Anf durch die bei der enzymatischen Umsetzung von Luminol durch HRP entstehende Strahlung nach Einleiten der Substratlösung
• der maximale Photodiodenstrom I_max
• die in der Photodiode erzeugte elektrische Ladung bis zu einer festgelegten Zeit nach dem Einleiten Q_(xmin)
• der Abfall des Signals m_Konv nach Erreichen von I_max beim weiteren Durchleiten der Substratlösung durch Enzym-Inaktivierung und Einfluss des weiteren Substrates H₂O₂
• der bei Anhalten des Flusses sofort eintretende Abfall m_Diff des Signals durch Substratverarmung (Hier herrschen keine definierten Durchflussbedingungen mehr.)

In 2 ist der Primärsignalverlauf (Strom der Photodiode) bei Absorptionsmessungen mit dem Substrat ABTS dargestellt. Dazu wird ein Absorptionsdurchflusssensor verwendet, welcher die Produktbildung bei konstantem Volumenstrom der Substratlösung aufnimmt. Der Aufbau eines solchen Sensors ist in 3 aufgezeigt. Der Detektionsbereich des Sensors kann so angeordnet sein, dass dieser mit der Oberfläche des Bioaffinitätsassays (Messbereich) übereinstimmt. Vorteilhafterweise besteht jedoch auch die Möglichkeit, Messbereich und Detektionsbereich räumlich zu beabstanden. Neben einem dann einfacheren Aufbau von sowohl der optischen Komponenten des Sensors als auch des Messbereiches innerhalb des Durchflusssystems für Affinitätsmesssungen kann somit der modulare Absorptionssensor das Signal von mehreren Messbereichen (zeitlich versetzt) aufnehmen.
Aus dem Verlauf des Signals können die folgenden Parameter zur Auswertung herangezogen werden:

• der maximale Photodiodenstrom ∆I_max als Differenz aus den Strom I_Blank beim Durchleiten einer nicht umgesetzten ABTS-Substratlösung und dem minimalen Strom I_Mess-min beim Durchleiten des durch die Enzym-Katalyse im Messbereich entstandenen grünen Radikalkation ABTS·+-Produktvolumenstroms in Abhängigkeit von der Konzentration an ABTS·+.
• der über einem konstanten Zeitraum um ∆I_max, d.h. ab bestimmter Zeit bis Erreichen ∆I_max und oder ab ∆I_max bis bestimmte Zeit nach ∆I_max bestimmte Mittelwert I_Mess-gem
• die Fläche A_0-max, begrenzt durch die Messsignalkurve bis ∆I_max und der zur Zeitachse parallelen Gerade, den Wert des Blank-Stromes entsprechend
• die Fläche A_{max±x min}, begrenzt durch die Messsignalkurve über einem konstanten Zeitraum um ∆I_max, d.h. ab bestimmter Zeit bis ∆I_max und oder ab ∆I_max bis bestimmte Zeit nach ∆I_max und der zur Zeitachse parallelen Gerade, den Wert des Blank-Stromes entsprechend
• der Quotient aus ∆I_max und I_Blank
• die Steigung des Abfalls des Photodiodenstroms m_Anf-Abs beim Durchleiten einer durch die enzymatisch Umsetzung entstandenen absorbierenden Lösung, welche die detektierte Strahlung zunehmend abschwächt

In 3 ist schematisch ein Absorptionsdurchflusssensor 4 als Beispiel für einen erfindungsgemäß verwendbaren optischen Sensor dargestellt. Der Absorptionsdurchflusssensor 4 umfasst eine Photodiode 1, einem transparenten Schlauch mit einem ABTS·+ Produktvolumenstrom, einer LED 3 und einem Absorptionsdurchflusssensor 4 dargestellt.
Eine Vorrichtung zur Analyse einer Probenflüssigkeit mit einem solchen Absorptionsdurchflusssensor kann dazu ausgestaltet sein, entsprechende Messungen eines Analytgehalts in eine Probe automatisiert durch eine zentrale Steuerungs-/Auswerteeinheit durchzuführen. Aus einem Prozessbehälter wird Probenflüssigkeit eines Prozesses, der der Erzeugung eines Produktes dient, durch einen geeigneten Prozessanschluss entnommen und über Flüssigkeitsleitungen zu einer den Absorptionsdurchflusssensor umfassenden Messeinrichtung, transportiert. Die Messbereitschaft wurde zuvor durch geeignete, komplett automatisiert ablaufende Verfahrensschritte, welche auch das sukzessive Durchleiten von Assayreagenzien aus Vorratsbehältern beinhaltet, sichergestellt. Das durch die Messeinrichtung bei der Messung der Probe erzeugte Messsignal wird von der zentralen Steuerungs-/Auswerteeinheit erfasst. Die Messeinrichtung zur Bestimmung des Produktes basiert bevorzugt auf einem festphasengebundenen Affinitäts-Immunosensor mit den in DE 20 1010 064 391 A1 , DE 10 2010 064 392 A1 , WO 2012055606 A1 und WO 2012055607 A1 beschriebenen Eigenschaften. Auf die Offenbarung dieser Dokumente wird hier vollumfänglich Bezug genommen. Alle Flüssigkeiten gelangen nach Durchleitung durch die Messeinrichtung in ein Abfallgefäß.
Innerhalb des optischen Sensors kann ein Messbereich von einem Detektionsbereich räumlich getrennt bzw. entkoppelt vorgesehen sein. Die räumliche Trennung/Entkopplung zwischen dem Detektionsbereich innerhalb eines optischen Sensors (Chemilumineszenz-, Absorptions- oder Fluoreszenzmessung) und dem Messbereich (beinhaltend die analytsensitive Oberfläche) ist in 4 schematisch dargestellt aufgezeigt. Dem optischen Sensor zur Primärsignalaufnahme ist ein oder sind mehrere Messbereiche, in fluidischen Kontakt zum Sensor stehend, vorgelagert, innerhalb derer die im Sensor gemessene Messgröße des enzymatisch gebildeten Produktes gemessen wird.
Bezugszeichenliste

1: Photodiode
2: ABTS·+ Produktvolumenstroms in transparenten Schlauch
3: LED
4: Absorptionsdurchflusssensor
5: optischer Sensor zur Primärsignalaufnahme
6: Messbereich 1
7: Messbereich 2
8: Messbereich „n“

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

DE 201010064391 A1 [0018]
DE 102010064392 A1 [0018]
WO 2012055606 A1 [0018]
WO 2012055607 A1 [0018]

Claims

Verfahren zur Primärsignalaufnahme für Affinitäts-Assay, wobei die optische Messgröße unter Einwirkung eines Substrats enzymatisch unter Durchflussbedingungen gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Substratlösungen in einer Konzentration, welche zur Substratsättigung führt, bei konstantem Volumenstrom durchgeleitet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die optische Messgröße Absorption, Chemilumineszenz oder Fluoreszenz ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei als Parameter des Primärsignals, welcher zur weiteren Bestimmung des Analytgehalts herangezogen wird, bei Absorptionsmessung das Maximum der Absorptionsänderung bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei als Parameter des Primärsignals, welcher zur weiteren Bestimmung des Analytgehalts herangezogen wird, bei Chemilumineszenzmessungen das Maximum der Chemilumineszenz bestimmt wird.
Vorrichtung zur Primärsignalauswertung für Affinitäts-Assays, beim welchen die optische Messgröße enzymatisch unter Durchflussbedingungen gebildet wird, wobei der Detektionsbereich vom Messbereich räumlich getrennt angeordnet, jedoch fluidisch mit dem Messbereich verbunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei einem optischen Sensor, den Detektionsbereich beinhaltend, ein oder mehrere Messbereiche, in fluidischem Kontakt zum Sensor stehend, vorgelagert sind, innerhalb derer die im optischen Sensor gemessene Messgröße des enzymatisch gebildeten Produktes gebildet wird.