WO2006040142A2 - Verfahren zum nachweisen und/oder zum bestimmen der konzentration mindestens eines liganden - Google Patents

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WO2006040142A2
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Mirko Lehmann
Ingo Freund
Holger Klapproth
Sonja Mohry
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Micronas Gmbh
Micronas Holding Gmbh
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting and / or determining the concentration of at least one ligand, which is suspected to be contained in a solution to be analyzed, wherein at least one receptor is immobilized on at least one test site on a semiconductor chip the ligand becomes specifically bound when the receptor contacts the ligand, the solution being applied to bind the ligand to the receptor on the test site, the solution being removed from the test site and a .
  • Help liquid is applied to the test site, which contains a chemiluminophore is excited in response to the binding of the ligand to the receptor for emitting a luminescence, and wherein at least one of the luminescence sensitive, integrated in the semiconductor chip radiation receiver a radiation measurement signal is detected ,
  • the invention relates to a method for detecting and / or determining the concentration of at least one ligand which is suspected to be contained in a solution to be analyzed, wherein at least one receptor is immobilized on a semiconductor chip at at least one test site, which binds specifically to the ligand when the receptor contacts the ligand, the ligand-binding solution being applied to the receptor on the test site, wherein at least one luminophore immobilizes to the receptor at the test site, depending on the formation of the ligand in which the test site is irradiated with an excitation radiation which contains at least one wavelength at which the luminophore is excited to emit luminescence radiation, and wherein a radiation measurement is effected with the aid of at least one radiation receiver sensitive to the luminescence radiation and integrated in the semiconductor chip Signal will be.
  • the invention relates to a method for detecting and / or determining the concentration of at least one ligand suspected of being contained in a solution to be analyzed, on a support
  • receptors are immobilized on the surface of a semiconductor chip at test sites, on each of which an optical radiation receiver and a surface occupation sensor are integrated into the semiconductor chip .
  • the solution is applied to the test sites so that it comes in contact with the receptors.
  • the receptors have epitopes that undergo specific binding upon contacting the ligand with them.
  • the semiconductor chip is washed. Then, a help liquid is applied to the test site containing a chemiluminescent which is excited to deliver luminescent radiation depending on the binding of the ligand to the receptor.
  • the surface area of the surface of the semiconductor chip is measured with the receptors using the area occupation sensors at the test sites.
  • concentration of the ligand at the individual test sites is determined according to the law of mass action on the basis of the measurement signals from the radiation receivers and the area occupation sensors as well as a binding consonant.
  • the method has been proven in practice, above all, because it allows a direct measurement of the concentration of ligands over a large concentration range.
  • a disadvantage of the method is that the measurement results are relatively inaccurate in solutions containing the ligands only in low concentration.
  • DE 102 51 757 A1 also discloses a method for determining the concentration of a ligand contained in a solution, in which the binding of the ligand to the receptor is detected by means of a luminophore, which is indirectly bound to a receptor-ligand complex via a N ⁇ ch Stamm ⁇ nti body.
  • a luminophore which is indirectly bound to a receptor-ligand complex via a N ⁇ ch Stamm ⁇ nti body.
  • the semiconductor chip is washed. Thereafter, the luminophores, which are further bound to the receptors via the detection antibodies, are irradiated with excitation radiation.
  • the spectrum of the excitation radiation has an excitation wavelength at which the luminophore is excited to emit the luminescent radiation which detects with the aid of the radiation receiver. Also in this method, the measurement accuracy is still capable of improvement.
  • an auxiliary liquid is understood as meaning a liquid in which the measurement of the luminescence radiation and / or a color change occurring as a function of the binding of the ligand to the receptor takes place.
  • a substitute fluid is understood to be a fluid which, when in contact with the at least one radiation receiver, has approximately the same electrical influence on the measurement signal of the radiation receiver as the auxiliary fluid. No luminescence radiation or color change occurs in the replacement liquid.
  • a specific bond is understood to mean a covalent bond and / or a chemical bond.
  • the liquid is in contact with the radiation receivers during the measurement of the radiation measurement signal Help fluid the dark current or darkening of the Strahlungsempfän ⁇ gers influenced, which can be caused inaccuracies in particular at small radiation measuring signal levels inaccuracies when the dark current or the dark voltage is not taken into account.
  • these measurement inaccuracies are avoided by detecting a dark measurement signal during the contact with the auxiliary liquid and / or a corresponding replacement liquid with the receptor-ligand complex (s) coated with the ligand bound to the receptor the radiation measuring signal is compensated with this.
  • the at least one ligand and the at least one receptor may be biocomponents or biomolecules and, for example, nucleic acids or derivatives thereof (DNA, RNA, PNA, LNA, oligonucleotides, plasmids, chromosomes), peptides, proteins (enzyme, protein, oligopeptides, cellular receptor proteins and their Complexes, peptide hormones, antibodies and fragments thereof), carbohydrates and their derivatives, in particular glycosylated proteins and glycosides, fats, fatty acids and / or lipids.
  • nucleic acids or derivatives thereof DNA, RNA, PNA, LNA, oligonucleotides, plasmids, chromosomes
  • peptides proteins (enzyme, protein, oligopeptides, cellular receptor proteins and their Complexes, peptide hormones, antibodies and fragments thereof), carbohydrates and their derivatives, in particular glycosylated proteins and glycosides, fats, fatty acids and
  • the receptor and / or ligand may be biological cells (microorganisms and / or cells of higher organisms) and / or their sub-components, such as cell organelles.
  • the receptor and / or the ligand can also be chemical substances.
  • the replacement fluid can be found experimentally by a comparison test by detecting the dark measurement signal for different fluids and comparing it with the radiation measurement signal measured in the auxiliary fluid when no ligand is bound to the receptor (s).
  • the liquid in which the dark measurement signal has the largest coincidence with the corresponding auxiliary fluid measurement signal is used as a replacement liquid.
  • the liquids selected for the comparison test must meet the following conditions: a) the specific bonds in the liquid are sufficiently stable, b) the enzymes and / or luminophores are not damaged by the liquid, c) in the liquid, no chemiluminescence radiation visible to the radiation receiver is produced in contact with the receptor-ligand complexes.
  • the at least one ligand is labeled directly and / or via at least one detection antibody bound to the ligand with at least one enzyme (binding assay), wherein the chemiluminophore is selected such that it reacts directly or indirectly in the presence of the enzyme the mediation of a chemical substance contained in the auxiliary liquid is stimulated to emit the luminescence radiation.
  • the enzyme is bound directly to the ligand.
  • the enzyme is linked to the ligand via a bridge of at least two specific bonds. For example, a first specific binding between the ligand and a biotin-labeled
  • the specific linkages may include, for example, streptavidin-biotin linkages, digoxigenin-antidigoxigenin linkages, and / or sense and antisense DNA links.
  • the at least one enzyme is a peroxidase enzyme, preferably horseradish peroxidase, and if the chemiluminophore luminol and the chemical substance are hydrogen peroxide.
  • a peroxidase enzyme preferably horseradish peroxidase
  • the chemiluminophore luminol and the chemical substance are hydrogen peroxide.
  • other enzymes and chemiluminophores may also be used, for example luciferase and luciferin and / or alkaline phosphatase and CDP-Star or 2-chloro-5-B-methoxyspiro [l / 2-dioxetane-3,2 '. - (5'-ChIoO tricyclo [3.3.1.1 3 '7] decane ⁇ -4-yl) -l-phenyl phosphate disodium salt.
  • auxiliary liquid hydrogen peroxide and luminol and the replacement liquid preferably contains a phosphate-buffered saline solution (PBS).
  • PBS phosphate-buffered saline solution
  • ECL ® phosphate-buffered saline solution
  • the corresponding solutions are available at low cost and enable a high accuracy of measurement and verification.
  • the method according to the invention is also suitable for competitive assay systems. At least one competitor labeled with the enzyme is introduced into the solution to be analyzed, after which the solution is applied to the test site.
  • the above-mentioned problem is solved in that the radiation measurement signal is detected while the solution and / or a hilum liquid not containing the luminophore is in contact with the radiation receiver, that during the generation of the luminescence is prevented, a dark measurement signal is measured for the radiation receiver, that upon detection of the dark measurement signal of the radiation receiver is in contact with the solution, the auxiliary liquid and / or a replacement liquid, and that the radiation measurement signal is compensated with the dark measurement signal.
  • the above-mentioned object is also achieved with the features of claim 17.
  • the solution and / or replacement liquid is chosen to be approximately the same has electrical influence on the measurement signal of the radiation receiver (have), as the Schwaflüs ⁇ stechnik.
  • the generation of the luminescence radiation is suppressed by the excitation radiation being switched off and / or the auxiliary liquid being replaced by a substitute liquid which does not contain the luminophore
  • the measurement of the radiation measurement signal in the auxiliary fluid allows a higher quantum efficiency of the luminophore. largely avoided.
  • the method according to the invention can be used in the on-line polymerase chain reaction (PCR). With the help of PCR, it is possible to amplify a targeted portion between two known sequences from a small amount of DNA.
  • the luminophore is contained in the analyte solution or admixed with it. During the measurement of the luminescence radiation, the solution with the free luminophores contained therein is in contact with the radiation receiver.
  • this contact can also take place indirectly via a thin waveguide layer, which is arranged on the radiation receiver and preferably monolithically integrated with this. Even when the dark measurement signal is detected, the radiation receiver can be in indirect contact with the solution, the auxiliary liquid and / or the replacement liquid via the waveguide layer.
  • the at least one ligand is labeled directly with a luminophore (binding assay) directly and / or via at least one detection antibody linked to the ligand, wherein the luminophore is detected during detection of the radiation measurement signal for generating the luminescence radiation with a luminescence is irradiated to the wavelength of the luminescent radiation different excitation radiation for the radiation of catcher is insensitive.
  • the luminophore used is preferably an upwardly converting luminophore in which the wavelength of the luminescence radiation is smaller than the excitation wavelength.
  • Such upward-converting lumi- nophores are known per se, for example from EP 0 723 146 A1.
  • the method is also suitable for competitive assay systems. At least one competitor labeled with the luminophore is introduced into the solution to be analyzed and then the solution is applied to the test site.
  • the abovementioned object is also achieved by a method for detecting and / or determining the concentration of at least one ligand which is suspected of being contained in a solution to be analyzed, a) on at least one test site on at least one semiconductor chip immobilizing a receptor which specifically binds with the ligand when the receptor contacts the ligand, b) applying the ligand-binding solution to the receptor on the test site, c) using a reagent in the test site Contact is made and converted depending on the binding of the ligand to the receptor by a chemical Reak ⁇ tion in an indicator which differs in color from the reagent d) wherein the test site is irradiated with optical radiation, e) wherein at least one sensitive to the chemical reaction color change, in the Halbleiferchip integrated
  • a help liquid is understood to mean a liquid which differs from the solution and does not contain the reagent.
  • a replacement liquid is defined in claim 9 as a liquid which differs from the solution and the auxiliary liquid and which, when in contact with the at least one radiation receiver, has approximately the same electrical influence on the measuring signal of the radiation receiver as the liquid during the detection of the radiation measuring signal is in contact with the radiation receiver.
  • both the radiation measurement signal and the dark measurement signal are measured while the radiation receiver is in contact with a liquid.
  • the specific binding is detected by means of a color change reaction.
  • the indicator may contain, for example, methyl red and / or bromothymol blue, the color of which may change from orange to turquoise, depending on the pH value, from orange to yellow.
  • the ligand may contain a urobilinogen, bilirubin, ketone, ascorbic acid, glucose, protein, blood, pH, nitrite and / or leucocytes.
  • glucose oxidase and peroxidase can be immobilized at the test site. The detection of the ⁇ lucose can take place via a coupled enzyme reaction.
  • the ⁇ lucose is oxidized by the ⁇ -glucose oxidase to form ⁇ -gluconic acid to form hydrogen peroxide.
  • De peroxidase oxidizes a redox indicator with the formed hydrogen peroxide, which turns from green to yellow.
  • the semiconductor chip has a plurality of radiation receivers, a radiation measurement signal and a dark measurement signal preferably being determined for each of these radiation receivers, and the radiation measurement signal associated therewith compensated for each radiation receiver with its associated dark measurement signal.
  • receptors can be immobilized either on all radiation receivers or only on a part of the radiation receiver. With the help of at least one radiation receiver, on which no receptor is immobilized, can Blindmesssign ⁇ l be erf ⁇ sst be. The blank measurement signal can be subtracted from the measurement signal of at least one radiation receiver having at least one receptor in order to compensate for background radiation and / or a background color change which is not produced as a function of the binding of a ligand to a receptor.
  • At least one receptor is immobilized on at least two test sites, a radiation measurement signal and a dark measurement signal being respectively detected for the radiation receivers associated with these test sites, and the individual radiation measurement signals being compensated with the respectively associated dark measurement signal.
  • the measurement results if one carries out for the semiconductor chip only a single dark signal measurement for all Strahlungs ⁇ receiver, have relatively large scattering. These scatterings can be reduced by performing an individual dark signal measurement for each individual radiation receiver and then compensating the radiation measurement signals with the respective dark signals assigned to them, for example by subtracting the dark measurement signal from the radiation measurement signal. The method then allows even greater measurement accuracy.
  • the dark measurement signals can be detected simultaneously for several test stations. Of course, the dark measurement signals for individual Tesfstellen or groups of a plurality of test sites but also nachein ⁇ other be measured.
  • the same receptors are immobilized on at least two test sites on the semiconductor chip, to which the solution to be analyzed is applied, if at least one radiation messsignai detected and compensated with a Dunkeimesssignal for these test sites in each case, and if compensated from the thus determined Measurement signals an average signal is formed.
  • the average signal only with respect to a part of the on the H ⁇ lbleiterchip test skins to form.
  • the radiation receiver is a photodiode, which is connected to charge its junction capacitance in the reverse direction with an electrical voltage source, after which the connection to the voltage source is interrupted, and wherein during the interruption as a radiation measurement signal and / or as a dark measurement signal the electrical voltage is tapped at the photodiode.
  • the biasing of the photodiode in the reverse direction results in a low junction capacitance on the photodiode during the measurement of the radiation or dark measurement signal. This allows a large bandwidth and high sensitivity during the measurement.
  • the dark measurement signal is approximated by a section of a straight line, wherein the slope of the device is determined, and wherein the Sfrahlungsmesssignal is compensated on the basis of the slope.
  • the at least one radiation measurement signal can then be compensated in a simple manner, for example with the aid of an evaluation device integrated in the semiconductor chip.
  • a wash solution is used as replacement liquid, the at least one test site being rinsed off after application of the solution to be analyzed with the wash solution, after which the dark measurement signal is detected, and in which case the wash solution is replaced by the auxiliary liquid and the radiation measurement signal is detected.
  • the dark measurement signal is therefore measured immediately after washing the test site, while the washing solution is still located on the test site.
  • the washing solution thereby fulfills a double function and, apart from washing the semiconductor chip, also serves as a replacement liquid for measuring the dark measuring signal, since the application of an additional replacement liquid is saved, the total time required for the measurement is shortened, which is particularly advantageous for unstable ligands.
  • a reverse procedure is conceivable in which first the dark measurement signal is detected, for example in the replacement solution and then the radiation measurement signal in the auxiliary solution,
  • FIG. 1 shows a semiconductor chip on which a receptor is immobilized
  • FIG. 2 shows a representation similar to FIG. 1, but with a ligand bound to the receptor
  • FIG. 3 shows a representation similar to FIG. 2, but with a detection antibody bound to the ligand
  • FIG. 4 shows a schematic representation of a sandwich ELISA assay (enzyme-linked immunosorbent assay) in which a chemiluminescence radiation is generated
  • FIG. 6 shows a bar graph of the gradients of the dark measurement signals of the individual radiation receivers of a semiconductor chip
  • FIG. 10 shows a semiconductor chip on which a plurality of test sites with receptor are arranged, wherein a solution to be examined is applied to the semiconductor chip, the ligands and labeled with a luminophore
  • receptors 5 are immobilized at test sites 3 which are arranged on the surface of a semiconductor chip 4 (FIG. 1).
  • the semiconductor chip 4 has a plurality of test sites 3; which are arranged in a matrix-like manner preferably in a plurality of rows and columns and are spaced from one another.
  • the receptors 5 are tuned to the ligands 2 in such a way that they form a specific bond with them when they come into contact with them.
  • the immobilization of the receptors 5 can be achieved by the application of an adhesive layer on the semiconductor chip 4, at which the receptors 5 anchor themselves.
  • the adhesive layer can be, for example, a silane layer and / or a polymer layer (cf., EP 1 176423 A1).
  • the receptors 5 can be printed on the test stations and / or applied to the semiconductor chip 4 in dissolved form with a micropipette, which is positioned relative to the semiconductor chip 4 by means of an XY positioning device.
  • the solution to be analyzed is applied to the test skins 3 in order to allow the ligand 2 contained in the solution 1 to bind specifically to the receptors 5 (FIG. 2).
  • the application of the solution 1 can take place with the aid of a pipette not shown in detail in the drawing.
  • the semiconductor chip 4 adjoins a flow measuring chamber, which has an inflow opening, through which the solution 1 is pumped into the flow measuring chamber by means of a micropump.
  • Fig. 3 it can be seen that the solution 1 is then removed, for example by means of a rinsing liquid from the test sites 3, so that then only those Lig ⁇ nden 2 are arranged at the test sites 3, which are specifically bound to a receptor 5.
  • the rinsing liquid can be stored in a reservoir (not shown in detail in the drawing) which can be connected to the test sites 3 by means of a supply device which has a micropump on it.
  • the ligands 2 remaining at the test sites 3 are brought into contact with biotinylated detection antibodies 7 which bind to the ligands 2 but not to free receptors 5.
  • biotinylated detection antibodies 7 which bind to the ligands 2 but not to free receptors 5.
  • receptor-ligand-detection antibody complexes are formed.
  • the detection antibodies 7 are stored together with a carrier liquid in a further reservoir, which can be connected to the test sites 3 via the supply device.
  • any remaining free ligands 2 are removed from the test sites, so that then only free receptors, receptor-ligand complexes and / or receptor-ligand detection antibody complexes are present at the test sites 3.
  • the test sites are rinsed with a rinsing liquid, which is conducted to the test sites 3 from a supply container with the aid of the supply device.
  • test sites 3 are brought into contact with a tracer solution which contains streptavidin, to which the enzyme horseradish is added.
  • Peroxidase 9 is bound.
  • the streptavidin has the property of binding specifically to the biotinylated detection antibodies 7.
  • horseradish peroxidase 9 indirectly binds to the detection antibodies 7 through the mediation of streptavidin.
  • the tracer solution is conveyed from a reservoir to the test sites 3 with the aid of the delivery device.
  • a replacement liquid 10 namely a phosphate buffered saline solution (PBS - phosphate buffered saline
  • the replacement liquid 10 is in a reservoir stored on the supply means with the test sites 3 is connectable.
  • horseradish peroxidase 9 is now only present at the sites where a ligand 2 is bound to a receptor 5 immobilized on the semiconductor chip 4.
  • the receptor-ligand complexes are therefore labeled with horseradish peroxidase 9.
  • an electronic radiation receiver ⁇ for example a photodiode, is integrated in the semiconductor chip 4 at each of the test sites 3. It can clearly be seen that the receptors 5 are each immobilized directly on the radiation receivers ⁇ .
  • the radiation receivers ⁇ are sensitive to a luminescence radiation, which is generated in a later Verfedhrensuze, which will be described in more detail below, depending on the binding of the ligand 2 to the receptor 5.
  • FIG. 5 it can be seen that the radiation receivers ⁇ are charged to a predetermined electrical voltage value at the beginning of the dark measurement, and that the amount of the measuring voltage respectively applied to the radiation receivers 6 continuously decreases during the dark measurement.
  • a slope value for the dark measurement signal 1 1 is determined and buffered.
  • the corresponding slope values in the form of a bar chart for a semiconductor chip with 32 test sites 3, which are arranged in matrix form in four rows and eight columns, are shown graphically in FIG.
  • a second dark measurement signal 12 is additionally shown, which was recorded at dry radiation receiver ⁇ . It can clearly be seen that the second dark measurement signal 12 has a greater gradient than the first one l ⁇
  • the measuring signal or the dark current of the radiation receiver ⁇ is therefore influenced by the presence of the substitute liquid 10.
  • the replacement liquid 10 is removed from the test sites 3 and an auxiliary liquid 13 is applied to the test sites 3 containing hydrogen peroxide and luminol.
  • assistance liquid 13 is available for example under the name // ECL ® solution "in the trade.
  • the ligand is not included, or in a non-relevant for the measurement of concentration.
  • the help liquid 13 is by means of the supply means from a reservoir promoted to the test sites 3.
  • a luminescence radiation 14 is generated depending on the binding of the ligand 2 to the receptor 5, a luminescence radiation 14 is generated. This has a wavelength of about 428 nm.
  • the luminescence radiation 14 is detected in each case with the aid of the radiation receiver ⁇ located at the test site 3, while it is covered with the auxiliary liquid 13.
  • the corresponding radiation measurement signal is denoted by 15 in FIG. It can clearly be seen that the radiation measurement signal 15 drops considerably more than the dark measurement signal 11 due to an electrical current induced in the radiation receiver ⁇ by the luminescence radiation.
  • the radiation measuring signals 15 of the individual radiation receivers ⁇ each have an approximately linear course during or after the detection of the radiation. With the aid of the slope value for the dark measurement signal 11 assigned to the corresponding radiation receiver ⁇ , a value for the slope of the radiation measurement signal 15 relative to the dark measurement signal 11 is determined.
  • FIG. 8 graphically shows the respective relative gradient values in the form of a bar chart for the individual radiation receivers ⁇ . For comparison, the absolute slope values of the radiation measurement signals 15 are shown in FIG.
  • the matrix of the semiconductor chip 4 has a plurality of groups of test sites 3; on each of which the same receptors are immobilized. Thus, columns 1 to 3 form
  • Test sites 3 which are assigned to different groups, each differ in their receptors. From the measured values of test sites 3, which belong to the same group, the arithmetic mean is formed in each case. As a result, metrological tolerances / which may be due to differences in the radiation receivers ⁇ and / or the occupancy of the radiation receivers ⁇ with the receptors 5 are smoothed.
  • FIG. 8 it can be clearly seen that in the first matrix line arranged at the rear in the drawing, a relatively high measuring signal was respectively measured at three measuring points assigned to the same group, and that these measuring signals largely correspond. At the corresponding measuring points of the second line, the measuring signal is considerably lower. An even smaller measuring signal was determined at the first three measuring points of the third line. At the remaining measuring points the measuring signal is approximately zero.
  • a solution 1 to be analyzed is applied to a test site 3 arranged on the semiconductor chip 4, which solution contains the ligands 2 and competitors 1.
  • a test site 3 arranged on the semiconductor chip 4, which solution contains the ligands 2 and competitors 1.
  • radiation receiver ⁇ is integrated into the semiconductor chip 4.
  • Both the ligands 2 and the competitors 1 ⁇ bind specifically, if you come into contact with a receptor 5, specifically to this.
  • Fig. 9 it can be seen that the competitors l ⁇ are labeled with a luminophore 17.
  • the luminophore 17 emits a Luminesze ⁇ zstr ⁇ hlung 14 when it is irradiated with a Anreungsstr ⁇ hlung.
  • the wavelength of the excitation radiation differs from the wavelength of the luminescence radiation 14.
  • the radiation receiver ⁇ are insensitive to the excitation radiation.
  • the test site 3 is irradiated with the excitation radiation in order to excite luminophore 17, which are bound indirectly via the competitors 16 to the receptors 5, for emitting the luminescence radiation 14.
  • a radiation measurement signal 15 is detected at the auxiliary liquid 13 in contact with the radiation receiver mit with the aid of the radiation receiver ⁇ .
  • the excitation radiation is then switched off in order to detect a dark measurement signal 1 1 with the aid of the radiation receiver ⁇ with auxiliary fluid 13 in contact with the radiation receiver ⁇ .
  • the radiation measurement signal 15 is compensated by the dark measurement signal 1 1 is subtracted from the radiation measurement signal 15.
  • the aid of the compensated measuring signal thus obtained, the slope of the radiation measuring signal 15 relative to the dark measuring signal 11 is determined.
  • the compensation can take place with the aid of a corresponding compensation device, which has inputs for the radiation measurement signal 15 and the dark measurement signal 11 and also for the compensated radiation measurement signal.
  • FIG. 10 it can be seen that the receptors 5 immobilized at the individual measuring points 3 undergo a specific binding with different ligands.
  • the ligands are each labeled with a luminophore 17, which is only on the
  • Ligands, but not to free receptors 5 binds.
  • the ligands are applied to the test sites 3 in the solution 1 to be analyzed. After the solution 1 for a period of time sufficient to bind a representative amount of the ligands 2 contained in the solution 1 to the receptors 5, with the test site 3 in Contact 1, the solution 1 is removed from the test site 3 and replaced by a Wegenbergkeit 13 which contains no suitable ligands to the receptors 2. Thereafter, the test site 3 is irradiated with the excitation radiation in order to excite those luminophores 17, which are bound to the receptors 5 via the ligands 2, for the emission of the luminescence radiation 14.
  • the radiation measuring signals 15 are detected at auxiliary liquid 13 in contact with the radiation receivers ⁇ . Thereafter, the excitation radiation is switched off to measure the dark measurement signals 1 1, while the radiation receiver ⁇ lo continue to be in contact with the auxiliary liquid 1 3.
  • a receptor 5 is thus immobilized on a semiconductor chip 4 at a test site 3, said receptor being immobilized with
  • ligand 2 can form a specific binding.
  • the solution is applied to the test site 3.
  • a luminescence radiation 14 or a color change is generated.
  • a radiation measurement signal is generated
  • the 20 15 detects while the auxiliary liquid 13 is in contact with the radiation receiver ⁇ . While the generation of the luminescence radiation 14 is prevented and the radiation receiver ⁇ is in contact with the auxiliary liquid 1 3 and / or a replacement liquid, a dark measurement signal 1 1 for the radiation receiver ⁇ is measured.
  • the radiation measurement signal 15 is provided with the dark measurement signal 11

Abstract

Bei einem Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration eines in einer zu analysierenden Lösung (1) enthaltenen Liganden (2) wird auf einem Halbleiterchip (4) an einer Teststelle (3) ein Rezeptor (5) immobilisiert, der mit dem Liganden (2) eine spezifische Bindung eingehen kann. Zum Binden des Liganden (2) an den Rezeptor (5) wird die Lösung (1) auf die Teststelle (3) aufgebracht. In Abhängigkeit von der Bindung des Liganden (2) an den Rezeptor (5) wird eine Lumineszenzstrahlung (14) oder eine Farbveränderung erzeugt. Mit Hilfe eines in den Halbleiterchip (4) integrierten Strahlungsempfängers (6) wird ein Strahlungsmesssignal erfasst, während die Lösung (1) und/oder eine den Luminophor (17) nicht enthaltende Hilfsflüssigkeit mit dem Strahlungsempfänger (6) in Kontakt steht. Während das Erzeugen der Lumineszenzstrahlung verhindert wird und der Strahlungsempfänger (6) mit der Hilfsflüssigkeit und/oder einer Ersatzflüssigkeit in Kontakt steht, wird ein Dunkelmesssignal für den Strahlungsempfänger (6) gemessen. Das Strahlungsmesssignal wird mit dem Dunkelmesssignal kompensiert.

Description

Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration mindes¬ tens eines Liganden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration mindestens eines Liganden, von dem vermutet wird, dass er in einer zu analysierenden Lösung enthalten ist wobei auf einem Halbleiterchip an mindes¬ tens einer Teststelle wenigstens ein Rezeptor immobilisiert wird, der mit dem Liganden eine spezifische Bindung eingeht wenn der Rezeptor den Liganden kontaktiert wobei die Lösung zum Binden des Liganden an den Rezeptor auf die Teststelle aufgebracht wird, wobei die Lösung von der Teststelle entfernt und eine .Hilfeflüssigkeit auf die Teststelle aufgebracht wird, die einen Chemiluminophor enthält der in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden an den Rezeptor zur Abgabe einer Lumineszenzstrahlung angeregt wird, und wobei mit Hilfe mindes¬ tens eines für die Lumineszenzstrahlung empfindlichen, in den Halbleiterchip integrierten Strahlungsempfängers ein Strahlungsmesssignal erfasstwird.
Außerdem bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration mindestens eines Liganden, von dem vermutet wird, dass er in einer zu analysierenden Lösung enthalten ist, wobei auf einem Halbleiterchip an mindestens einer Teststelle wenigstens ein Rezeptor immobilisiert wird, der mit dem Liganden eine spezifische Bindung eingeht, wenn der Rezeptor den Liganden kontaktiert, wobei die Lösung zum Binden des Liganden an den Rezeptor auf die Teststelle aufgebracht wird, wobei mindestens ein Luminophor in Abhängigkeit von der Bildung des Liganden an den Rezeptor an der Teststelle immobilisiert wird, wobei die Teststelle mit einer Anregungssfrahlung bestrahlt wird, die mindestens eine Wellenlänge enthält, bei welcher der Luminophor zur Abgabe einer Lumineszenzstrahlung angeregt wird, und wobei mit Hilfe mindestens eines für die Lumineszenzstrahlung empfindlichen, in den Halbleiterchip integrierten Strah¬ lungsempfängers ein Strahlungsmesssignal erfttsst wird.
Ferner bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration mindestens eines Liganden, von dem vermutet wird, dass er in einer zu analysierenden Lösung enthalten ist, wobei auf einem Träger an
BESTÄtlQüNGSfDOBE mindestens einer Teststelle wenigstens ein Rezeptor immobilisiert wird, der mit dem Ligαnden eine spezifische Bindung eingeht, wenn der Rezeptor den Ligαnden kontαktlert wobei die Lösung zum Binden des Ligαnden an den Rezeptor auf die Teststelle aufgebracht wird, wobei mit der Teststelle ein Reagenz in Kontakt ge- bracht und in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden an den Rezeptor durch eine chemische Reaktion in einen Indikator umgewandelt wird, der sich farblich von dem Reagenz unterscheidet, und wobei die Teststelle mit einer optischen Strahlung bestrahlt wird.
Bei einem aus DE 102 51 757 Al bekannten Verfahren zum Bestimmen der Konzentration eines in einer Lösung enthaltenen Liganden werden auf der Oberflä¬ che eines Halbleiterchips an Teststellen, an denen jeweils ein optischer Strahlungs¬ empfänger und ein Flächenbelegungssensor in den Halbleiterchip integriert sind, Rezeptoren immobilisiert. Zur Bestimmung der Konzentration der Liganden wird die Lösung auf die Teststellen aufgebracht, so dass sie mit den Rezeptoren in Kontakt gerät. Die Rezeptoren haben Epitope, die beim Kontaktieren des Liganden mit diesen eine spezifische Bindung eingehen. Zum Entfernen der nicht an einen Rezeptor gebundenen Bestandteile der Lösung wird der Halbleiterchip gewaschen. Dann wird eine Hilfeflüssigkeit auf die Teststelle aufgebracht wird, die einen Chemi- luminophor enthält, der in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden an den Rezeptor zur Abgabe einer Lumineszenzstrahlung angeregt wird. Außerdem wird mit Hilfe der Flächenbelegungssensoren an den Teststellen jeweils die Flächenbe¬ legung der Oberfläche des Halbleiferchips mit den Rezeptoren gemessen. Anhand der Messsignale der Strahlungsempfänger und der Flächenbelegungssensoren sowie einer Bindungskonsfanten wird die Konzentration des Liganden an den einzelnen Teststellen nach dem Massenwirkungsgesetz bestimmt. Das Verfahren hat sich in der Praxis vor allem deshalb bewährt, weil es über einen großen Konzentrationsbereich eine direkte Messung der Konzentration der Liganden ermöglicht. Ein Nachteil des Verfahrens besteht jedoch noch darin, dass die Messergebnisse bei Lösungen, welche die Liganden nur in geringer Konzentration enthalten, relativ ungenau sind.
Aus DE 102 51 757 Al ist ferner ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration eines in einer Lösung enthaltenen Liganden bekannt, bei dem die Bindung des Liganden an den Rezeptor mit Hilfe eines Luminophors nachgewiesen wird, der über einen Nαchweisαnti Körper indirekt an einen Rezeptor-Liganden-Komplex gebunden wird. Zum Entfernen nicht an einen Rezeptor gebundener freier Lumi- nophoren wird der Halbleiferchip gewaschen. Danach werden die weiterhin über die Nachweisantikörper an die Rezeptoren gebundenen Luminophore mit einer Anregungsstrahlung bestrahlt. Das Spektrum der Anregungsstrahlung weist eine Anregungswellenlänge auf bei welcher der Luminophor zur Abgabe der Lumines¬ zenzstrahlung angeregt wird, die mit Hilfe der Strahlungsempfänger detektiert. Auch bei diesem Verfahren ist die Messgenauigkeit noch verbesserungsfähig.
Es besteht deshalb die Aufgabe, ein Verfahren der eingangs genannten Art und eine Vorrichtung zu schaffen, die vor allem bei geringen Ligandenkonzentrationen eine hohe Mess- bzw. Nachweisgenauigkeit ermöglichen.
Diese Aufgabe wird bezüglich des eingangs genannten Verfahrens, bei dem in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden an den Rezeptor eine Chemilumines- zenz-Strahlung erzeugt wird, dadurch gelöst, dass das Strahlungsmesssignal erfasst wird, während die Hilfeflüssigkeit mit dem Strahlungsempfänger in Kontakt steht, dass der Strahlungsempfänger mit einer sich von der Hilfeflüssigkeit unterscheiden¬ den Ersatzflüssigkeit in Kontakt gebracht wird, in der keine Lumineszenzstrahlung auftritt, dass während der Strahlungsempfänger mit einer Ersatzflüssigkeit in Kontakt steht, ein Dunkelmesssignal für den Strahlungsempfänger gemessen wird, und das Strahlungsmesssignal mit dem Dunkelmesssignal kompensiert wird. Bezüglich der Vorrichtung wird die Aufgabe mit den Merkmalen des Anspruchs 16 gelöst.
Dabei wird unter einer Hilfeflüssigkeit eine Flüssigkeit verstanden, in der die Messung der Lumineszenzstrahlung und/oder einer in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden an den Rezeptor auftretenden Farbveränderung erfolgt. Unter einer Ersatzflüssigkeit wird eine Flüssigkeit verstanden, die - wenn sie mit dem mindestens einen Strahlungsempfänger in Kontakt steht - etwa den gleichen elektrischen Einfluss auf das Messsignal des Strahlungsempfängers hat, wie die Hilfeflüssigkeit. In der Ersatzflüssigkeit tritt keine Lumineszenzstrahlung bzw. Farbveränderung auf Unter einer spezifischen Bindung wird eine kovaiente Bindung und/oder eine chemische Bindung verstanden.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, äass die während der Messung des Strahlungsmesssignals mit den Strahlungsempfängern in Kontakt stehende Hilfeflüssigkeit den Dunkelstrom bzw. die Dunkelspαnnung des Strahlungsempfän¬ gers beeinflusst, wodurch insbesondere bei kleinen Strahlungsmesssignalpegeln Messungenauigkeiten hervorgerufen werden können, wenn der Dunkelstrom bzw. die Dunkelspannung nicht berücksichtigt wird. Bei der erfindungsgemäßen Lösung werden diese Messungenauigkeiten dadurch vermieden, dass während der mit den durch die Bindung des Liganden an den Rezeptor gebildeten Rezeptor- Liganden-Komplex(en) beschichtete Halbleiterchip mit der Hilfeflüssigkeit und/oder einer entsprechenden Ersatzflüssigkeit in Kontakt steht ein Dunkelmesssignal erfasst und das Strahlungsmesssignal mit diesem kompensiert wird. In vorteilhafter Weise ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren dadurch auch bei geringen Ligan- denkonzentrationen eine hohe Mess- bzw. Nachweisgenauigkeit. Der mindestens eine Ligand und der wenigstens eine Rezeptor können Biokomponenten oder Biomoleküle sein und beispielsweise Nukleinsäuren oder Derivate davon (DNA, RNA, PNA, LNA, Oligonukleotide, Plasmide, Chromosomen), Peptide, Proteine (Enzym, Protein, Oligopeptide, zelluläre Rezeptorproteine und deren Komplexe, Peptidhor- mone, Antikörper und deren Fragmente), Kohlenhydrate und deren Derivate, insbesondere glykosylierte Proteine und Θlycoside, Fette, Fettsäuren und/oder Lipide umfassen. Ferner können der Rezeptor und/oder der Ligand biologische Zellen (Mikroorganismen und/oder Zellen höherer Organismen) und/oder deren Unterbestandteile, wie z.B. Zellorganellen sein. Der Rezeptor und/oder der Ligand können aber auch chemische Stoffe sein.
Die Ersatzflüssigkeit kann experimentell durch einen Vergleichstest gefunden werden, indem für verschiedene Flüssigkeiten das Dunkelmesssignal erfasst und mit dem Strahlungsmesssignal verglichen wird, das in der Hilfeflüssigkeit gemessen wird, wenn an den (die) Rezeptor(en) kein Ligand gebunden ist. Die Flüssigkeit, bei der das Dunkelmesssignal die größte Übereinstimmung mit dem entsprechenden Strahlungsmesssignal der Hilfeflüssigkeit aufweist, wird als Ersatzflüssigkeit verwendet. Die für den Vergleichstest ausgewählten Flüssigkeiten müssen folgende Bedingun- gen erfüllen: a) Die spezifischen Bindungen in der Flüssigkeit sind hinreichend stabil, b) die Enzyme und/oder Luminophore werden durch die Flüssigkeit nicht geschädigt, c) in der Flüssigkeit wird bei einem Kontakt mit den Rezeptor-Liganden- Komplexen keine für den Strahlungsempfänger sichtbare Chemilumines- zenzstrahlung erzeugt.
5 Bei einer bevorzugten Ausführungsförm der Erfindung wird der wenigstens eine Ligand direkt und/oder über mindestens einen mit dem Ligand verbundenen Nachweisantikörper mit mindestens einem Enzym markiert (Bindungsassay), wobei der Chemiluminophor derart gewählt ist, dass er bei Anwesenheit des Enzyms direkt oder indirekt durch die Vermittlung einer in der Hilfeflüssigkeit enthaltenen l o chemischen Substanz zur Abgabe der Lumineszenzstrahlung angeregt wird. Bei der direkten Markierung ist das Enzym unmittelbar an den Liganden gebunden. Bei der indirekten Markierung ist das Enzym über eine Brücke von mindestens zwei spezifischen Bindungen an den Liganden gebunden. Dabei kann beispielsweise eine erste spezifische Bindung zwischen dem Liganden und einem biotinmarkier-
15 ten Nachweisantikörper und eine zweite spezifische Bindung zwischen dem Biotin und einem Streptavidin-Molektül vorgesehen sein, das mit dem Enzym verbunden ist. Die spezifischen Bindungen können beispielsweise Streptavidin-Biotin-Bindungen, Digoxigenin-Antidigoxigenin-Bindungen und/oder Sense- und Antisense-DNA- Bindungen umfassen.
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Vorteilhaft ist wenn das mindestens eine Enzym ein Peroxidase-Enzym, vorzugswei¬ se Meerrettich-Peroxidase ist, und wenn der Chemiluminophor Luminol und die chemische Substanz Wasserstoffperoxid sind. Versuche haben gezeigt dass mit • dieser Kombination eine besonders hohe Detektionsempfinglichkeit erreicht wird. 25 Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können aber auch andere Emzyme und Chemiluminophore verwendet werden, z.B. Luziferase und Luziferin und/oder alkalische Phosphatase und CDP-Star bzw. 2-Chlor-5-B-Methoxyspiro[l/2-Dioxetan- 3,2'-(5'-ChIoO Tricyclo[3.3.1.1 ,3'7]Decan}-4-yl)-l-Phenylphosphat Dinatriumsalz.
30 Vorteilhaft ist wenn die Hilfeflüssigkeit Wasserstoffperoxid und Luminol und die Ersatzflüssigkeit vorzugsweise eine phosphafgepufferte Salzlösung (PBS) enthält. Eine solche Hilfeflüssigkeit ist im Handel unter der Bezeichnung ECL® erhältlich. Die entsprechenden Lösungen sind kostengünstig verfügbar und ermöglichen eine hohe Mess- bzw. Nachweisgenauigkeit. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch für kompetitive Assaysysteme geeignet. Dabei wird in die zu analysierende Lösung mindestens ein mit dem Enzym markier¬ ter Kompetitor eingebracht und danach wird die Lösung auf die Teststelle aufge¬ bracht.
Die vorstehend genannte Aufgabe wird bei dem eingangs genannten Verfahren, bei dem der Luminophor mit Hilfe der Anregungsstrahlung zur Abgabe von Lumineszenzstrahlung angeregt wird, dadurch gelöst dass das Strahlungsmesssig¬ nal erfasst wird, während die Lösung und/oder eine den Luminophor nicht enthal- tende Hillsflüssigkeit mit dem Strahlungsempfänger in Kontakt steht, dass während das Erzeugen der Lumineszenzstrahlung verhindert wird, ein Dunkelmesssignal für den Strahlungsempfänger gemessen wird, dass bei der Erfassung des Dunkel¬ messsignals der Strahlungsempfänger mit der Lösung, der Hilfeflüssigkeit und/oder einer Ersatzflüssigkeit in Kontakt steht, und dass das Strahlungsmesssignal mit dem Dunkelmesssignal kompensiert wird. Bezüglich der Vorrichtung wird die vorstehend genannte Aufgabe auch mit den Merkmalen des Anspruchs 17 gelöst.
Bei dem Verfahren wird für den Fall, dass bei der Erfassung des Dunkelmesssignals der Strahlungsempfänger mit der Lösung und/oder einer sich von der Lösung und der Hilfeflüssigkeit unterscheidenden Ersatzflüssigkeit in Kontakt steht, die Lösung und/oder Ersatzflüssigkeit derart gewählt, dass sie etwa den gleichen elektrischen Einfluss auf das Messsignal des Strahlungsempfängers hat (haben), wie die Hilfeflüs¬ sigkeit.
Auch bei dieser Lösung werden also sowohl das Strahlungsmesssignal als auch das Dunkelmesssignal bei „nassem" Strahlungsempfänger gemessen. Während der Dunkelmessung wird die Erzeugung der Lumineszenzstrahlung unterdrückt, indem die Anregungsstrahlung abgeschaltet und/oder die Hilfeflüssigkeit durch eine Ersatzflüssigkeit ersetzt wird, die den Luminophor nicht enthält. Gegenüber einem Verfahren, bei dem die Lumineszenzstrahlung bei trockenem Halbleiterchip gemessen wird, ermöglicht die Messung des Strahlungsmesssignals in der Hilfeflüs¬ sigkeit eine höhere Quantenausbeute des Luminophors. Außerdem werden Artefakte, wie z.B. optische Reflexionen an der Oberfläche des Halbleiterchips, welche die Messgenauigkeit reduzieren, weitestgehend vermieden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei der on-line-Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) angewendet werden. Mit Hilfe der PCR ist es möglich, aus einer geringen DNA-Menge einen gezielten Abschnitt zwischen zwei bekannten Sequenzen zu vervielfältigen. Hierzu sind zwei Oligonukleotidprimer nötig, die gegenläufig an die komplementären Stränge einer bekannten DNA- Sequenz binden. Des weiteren müssen neben der zu amplifizierenden Sequenz die Nukleotide dATP, dCTP, dθTP und dTTP zugegeben werden sowie eine Taq- Polymerase, die in der Lage ist den DNA-Strang von den Primern aus zu verlängern. Bei der on-line-PCR ist der Luminophor in der analysierenden Lösung enthalten bzw. wird dieser beigemischt. Während der Messung der Lumineszenzstrahlung steht die Lösung mit den darin enthaltenen freien Luminophoren mit dem Strahlungs¬ empfänger in Kontakt. Dabei kann dieser Kontakt auch indirekt über eine dünne Wellenleiterschicht erfolgen, die auf dem Strahlungsempfänger angeordnet und vorzugsweise monolithisch mit diesem integriert ist. Auch bei der Erfassung des Dunkelmesssignals kann der Strahlungsempfänger über die Wellenleiterschicht mit der Lösung, der Hilfeflüssigkeit und/oder der Ersatzflüssigkeit indirekt in Kontakt stehen.
Selbstverständlich ist es auch möglich, nach dem Inkontaktbringen der Lösung mit der Teststelle eventuelle an der Teststelle noch vorhandene freie Luminophoren von dieser zu entfernen und eine Hilfeflüssigkeit auf die Teststelle aufzubringen, die den Luminophor nicht enthält. Danach wird die Lumineszenzstrahlung gemessen, während die Hilföflüssigkeit weiterhin mit dem Strahlungsempfänger in Kontakt steht. Die Luminophoren können zusammen mit der zu analysierenden Lösung auf die Teststelle aufgebracht werden. Es ist aber auch denkbar, die Lösung ohne die Luminophoren auf die Teststelle aufzubringen, anschließend die Lösung von der Testelle beispielsweise durch Abwaschen zu entfernen und danach die Lumi¬ nophoren mit der Teststelle in Kontakt zu bringen.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird der wenigstens eine Ligand direkt und/oder über mindestens einen mit dem Ligand verbundenen Nachweisantikör¬ per mit einem Luminophor markiert (Bindungsassay), wobei der Luminophor während der Erfassung des Strahlungsmesssignals zum Erzeugen der Lumines¬ zenzstrahlung mit einer sich von der Wellenlänge der Lumineszenzstrahlung unterscheidenden Anregungsstrahlung bestrahlt wird, für die der Strahlungsemp- fänger unempfindlich ist. Als Luminophor wird bevorzugt ein aufwärtskonvertieren¬ der Luminophor verwendet, bei dem die Wellenlänge der Lumineszenzstrahlung kleiner ist als die Anregungswellenlänge. Derartige aufwärtskonvertierende Lumi- nophore sind an sich bekannt, beispielsweise aus EP 0 723 146 Al .
Das Verfahren ist auch für kompetitive Assaysysteme geeignet, Dabei wird in die zu analysierende Lösung mindestens ein mit dem Luminophor markierter Kompetitor eingebracht und danach wird die Lösung auf die Teststelle aufgebracht,
Die vorstehend genannte Aufgabe wird auch durch ein Verfahren zum Nachwei¬ sen und/oder zum Bestimmen der Konzentration mindestens eines Liganden gelöst von dem vermutet wird, dass er in einer zu analysierenden Lösung enthalten ist, a) wobei auf einem Halbleiterchip an mindestens einer Teststelle wenigstens ein Rezeptor immobilisiert wird, der mit dem Liganden eine spezifische Bindung eingeht, wenn der Rezeptor den Liganden kontaktiert, b) wobei die Lösung zum Binden des Liganden an den Rezeptor auf die Teststel¬ le aufgebracht wird, c) wobei mit der Teststelle ein Reagenz in Kontakt gebracht und in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden an den Rezeptor durch eine chemische Reak¬ tion in einen Indikator umgewandelt wird, der sich farblich von dem Reagenz unterscheidet d) wobei die Teststelle mit einer optischen Strahlung bestrahlt wird, e) wobei mit Hilfe mindestens eines für die bei der chemischen Reaktion auftre- tende Farbveränderung empfindlichen, in den Halbleiferchip integrierten
Strahlungsempfängers ein Strahlungsmesssignal erfasst wird, f) während die Lösung und/oder eine das Reagenz enthaltende Hilfeflüssigkeit mit dem Strahlungsempfänger in Kontakt steht, g) wobei während das Erzeugen der optischen Strahlung verhindert und/oder der Indikator von der Teststelle ferngehalten wird, ein Dunkelmesssignal für den Strahlungsempfänger gemessen wird, h) wobei bei der Erfassung des Dunkelmesssignals der Strahlungsempfänger mit der Lösung oder der Hilfeflüssigkeit und/oder einer Ersatzflüssigkeit in Kontakt steht, 0 und wobei das Strahlungsmesssignal mit dem Dunkelmesssignal kompen¬ siert wird.
Bezüglich der Vorrichtung wird die vorstehend genannte Aulgabe auch mit den Merkmalen des Anspruchs 18 gelöst.
Dabei wird unter einer Hilfeflüssigkeit eine sich von der Lösung unterscheidende Flüssigkeit verstanden, die das Reagenz nicht enthält. Unter einer Ersatzflüssigkeit wird in Anspruch 9 eine sich von der Lösung und der Hilfsflüssigkeif unterscheidende Flüssigkeit verstanden, die - wenn sie mit dem mindestens einen Strahlungsemp- fanger in Kontakt steht - etwa den gleichen elektrischen Einfluss auf das Messsignal des Strahlungsempfängers hat wie die Flüssigkeit die während der Erfassung des Strahlungsmesssignals mit dem Strahlungsempfänger in Kontakt steht.
Auch bei dieser Lösung werden also sowohl das Strahlungsmesssignal als auch das Dunkelmesssignal gemessen, während der Strahlungsempfänger mit einer Flüssigkeit in Kontakt steht. Die spezifische Bindung wird mit Hilfe einer Farbum¬ schlagreaktion detektiert. Der Indikator kann beispielsweise Methylrot und/oder Bromthymolblau enthalten, deren Farbe sich je nach pH-Wert von orange über gelb nach türkis verändern kann. Der Ligand kann ein Urobilinogen, Bilirubin, Keton, Ascorbinsäure, Θlucose, Protein, Blut, pH, Nitrit und/oder Leukozyten enthalten. Zum Nachweis von Θlucose können an der Teststelle die Enzyme Θlucoseoxidase und Peroxidase immobilisiert sein. Der Nachweis der θlucose kann über eine gekoppel¬ te Enzymreaktion erfolgen. Dabei wird die θlucose von der θlucoseoxidase unter Bildung von Wasserstoffperoxid zu θluconsäure oxidierf. De Peroxidase oxidiert mit dem gebildeten Wasserstoffperoxid einen Redoxindikator, der hierbei von grün nach gelb umschlägt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsförm der Erfindung weist der Halbleiferchip mehrere Strahlungsempfänger auf, wobei vorzugsweise für jeden dieser Strah- lungsempfanger jeweils ein Strahlungsmesssignal und ein Dunkelmesssignal errdsst und für jeden Strahlungsempfänger jeweils das das ihm zugeordnete Strahlungsmesssignal mit dem ihm zugeordneten Dunkelmesssignal kompensiert wird. Dabei können entweder auf allen Strahlungsempfängern oder nur auf einem Teil der Strahlungsempfänger Rezeptoren immobilisiert werden. Mit Hilfe mindes- tens eines Strahlungsempfängers, auf dem kein Rezeptor immobilisiert ist, kann ein Blindmesssignαl erfαsst werden. Das Blindmesssigna] kann von dem Messsignal mindestens eines, wenigstens einen Rezeptor aufweisenden Strahlungsempfängers subtrahiert werden, um Hintergrundstrahlung und/oder eine Hintergrundfarbverän¬ derung, die nicht in Abhängigkeit von der Bindung eines Liganden an einen Rezeptor erzeugt wird, zu kompensieren.
Bei einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird auf mindestens zwei Teststellen jeweils wenigstens ein Rezeptor immobilisiert, wobei für die diesen Teststellen zugeordneten Strahlungsempfänger jeweils ein Strahlungsmesssignal und ein Dunkelmesssignal erfasst werden, und wobei die einzelnen Strahlungs¬ messsignale mit dem ihnen jeweils zugeordneten Dunkelmesssignal kompensiert werden. Bei Versuchen hat sich gezeigt, dass die Messergebnisse, wenn man für den Halbleiterchip nur eine einzige Dunkelsignalmessung für sämtliche Strahlungs¬ empfänger durchführt, relativ starke Streuungen aufweisen. Diese Streuungen können dadurch reduziert werden, dass für jeden einzelnen Strahlungsempfänger jeweils eine individuelle Dunkelsignalmessung durchgeführt und die Strahlungs¬ messsignale dann mit den ihnen jeweils zugeordneten Dunkelsignalen kompen¬ siert werden, beispielsweise indem das Dunkelmesssignal von dem Strahlungs¬ messsignal subtrahiert wird. Das Verfahren ermöglicht dann eine noch größere Messgenauigkeit. Die Dunkelmesssignale können gleichzeitig für mehrere Teststel¬ len erfasst werden. Selbstverständlich können die Dunkelmesssignale für einzelne Tesfstellen oder für Gruppen von jeweils mehreren Teststellen aber auch nachein¬ ander gemessen werden.
Vorteilhaft ist, wenn an mindestens zwei Teststellen gleiche Rezeptoren auf dem Halbleiterchip immobilisiert werden, auf welche die zu analysierende Lösung aufgebracht wird, wenn für diese Teststellen jeweils mindestens ein Strahlungs- messsignai erfasst und mit einem Dunkeimesssignal kompensiert wird, und wenn aus den so ermittelten kompensierten Messsignalen ein Mittelwertsignal gebildet wird. Dadurch können zusätzlich auch noch Streuungen, die durch Unterschiede der Strahlungsempfänger und/oder durch Unterschiede bei der Messwerterfäs- sung bedingt sind, ausgeglichen werden. Das Verfahren ermöglicht dadurch eine noch größere Mess- bzw. Nachweisgenauigkeit. In die Mittelwertbildung können sämtliche auf dem Halbleiterchip befindliche Teststellen miteinbezogen werden. Es ist aber auch denkbar, das Mittelwertsignal nur bezüglich eines Teils der auf dem Hαlbleiterchip befindlichen Testsfellen zu bilden. Dabei ist es sogar möglich/ auf dem Halbleiterchip mehrere Gruppen von Teststellen vorzusehen/ bei denen an Teststellen, die derselben Gruppe angehören, jeweils die gleichen Rezeptoren und an Teststellea die verschiedenen Gruppen angehören unterschiedliche Rezeptoren angeordnet sind. Dadurch ist es möglich, mit nur einem Halbleiterchip mehrere Liganden in der Lösung nachzuweisen und/oder deren Konzentration zu bestim¬ men.
Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist der Strahlungsempfänger eine Photodiode, die zum Aufladen ihrer Sperrschichtkapazität in Sperrrichtung mit einer elektrischen Spannungsquelle verbunden wird, wobei danach die Verbin¬ dung zu der Spannungsquelle unterbrochen wird, und wobei während der Unterbrechung als Strahlungsmesssignal und/oder als Dunkelmesssignal die elektrische Spannung an der Photodiode abgegriffen wird. Durch die Vorspannung der Photodiode in Sperrrichtung ergibt sich wird während der Messung des Strahlungs- bzw. Dunkelmesssignals eine geringe Sperrschichtkapazität an der Photodiode. Dadurch wird während der Messung eine große Bandbreite und eine hohe Messempfindlichkeit ermöglicht.
Bei einer zweckmäßigen Ausgestaltung des Verfahrens wird das Dunkelmesssignal durch einen Abschnitt einer Geraden angenähert wobei die Steigung der Gera¬ den bestimmt wird, und wobei das Sfrahlungsmesssignal anhand der Steigung kompensiert wird. Das mindestens eine Strahlungsmesssignal kann dann auf einfache Weise, beispielsweise mit Hilfe einer in den Halbleiterchip integrierten Auswerteeinrichtung, kompensiert werden.
Zweckmäßigerweise wird als Ersatzflüssigkeit eine Waschlösung verwendet, wobei die mindestens eine Teststelle nach dem Aufbringen der zu analysierenden Lösung mit der Waschlösung abgespült wird, wobei danach das Dunkelmesssignal erfasst wird, und wobei dann die Waschlösung durch die Hilfsflüssigkeit ersetzt und das Strahlungsmesssignal erfasst wird. Das Dunkelmesssignal wird also gleich nach dem Waschen der Teststelle gemessen, während die Waschlösung noch auf der Teststelle angeordnet ist. Die Waschlösung erfüllt dabei eine Doppelfünktion und dient außer zum Waschen des Halbleiterchips auch als Ersatzflüssigkeit zur Mes- sung des Dunkelmesssignals, Da das Aufbringen einer zusätzlichen Ersatzflüssigkeit eingespart wird, verkürzt sich die für die Messung insgesamt benötigte Zeit was besonders bei instabilen Liganden vorteilhaft ist. Selbstverständlich ist aber auch eine umgekehrte Vorgehensweise denkbar, bei der zuerst das Dunkelmesssignal beispielsweise in der Ersatzlösung und danach das Strahlungsmesssignal in der Hilfelösung erfasst wird,
Nachfolgend sind Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 einen Halbleiterchip, auf dem ein Rezeptor immobilisiert ist
Fig.2 eine Darstellung ähnlich Fig. 1, wobei jedoch an den Rezeptor ein Ligand gebunden ist
Fig. 3 eine Darstellung ähnlich Fig. 2, wobei jedoch an den Ligand ein Nach¬ weisantikörper gebunden ist,
Fig.4 eine schematische Darstellung eines Sandwich ELISA Assays (Enzyme- Linked Jmmunosorbent Assay), bei dem eine Chemilumineszenzstrah- lung erzeugt wird,
Fig. 5 eine graphische Darstellung verschiedener Messsignale, wobei auf der Abszisse die Zeit t und auf der Ordinate die Signalamplitude V aufgetra¬ gen ist,
Fig. ό ein Balkendiagramm der Steigungen der Dunkelmesssignale der einzelnen Strahlungsempfänger eines Halbleiterchips,
Fig. 7 ein Balkendiagramm der Steigungen der Strahlungsmesssignale der einzelnen Strahlungsempfänger eines Halbleiterchips,
Fig. 8 ein Balkendiagramm der Steigungen der Sfrahlungsmesssignale relativ zu den Dunkelmesssignalen für die einzelnen Strahlungsempfänger ei¬ nes Halbleiterchips, Fig. 9 eine schemαtische Darstellung eines indirekten EUSA Assayssystems, und
Fig. 10 einen Halbleiterchip, auf dem mehrere Teststellen mit Rezeptor ange¬ ordnet sind, wobei auf den Halbleiterchip eine zu untersuchende Lösung aufgebracht Ist, die Liganden und mit einem Luminophor markierte
Kompetiforen enthält.
Bei einem Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration von in einer zu analysierenden Lösung 1 enthalten Liganden 2 werden an Teststel- len 3, die der Oberfläche eines Halbleiterchips 4 angeordnet sind, Rezeptoren 5 immobilisiert (Fig. 1). Der Halbleiterchip 4 weist mehrere Teststellen 3 auf; die matrixförmig vorzugsweise in mehreren Reihen und Spalten angeordnet und voneinander beabstandet sind.
Die Rezeptoren 5 sind derart auf die Liganden 2 abgestimmt, dass sie mit diesen eine spezifische Bindung eingehen, wenn Sie mit ihnen in Kontakt geraten. Die Immobilisierung der Rezeptoren 5 kann durch das Aufbringen einer Haftschicht auf den Halbleiterchip 4 erreicht werden, an der sich die Rezeptoren 5 selbständig verankern. Die Haftschicht kann beispielsweise eine Silanschicht und/oder eine Polymerschicht (vgl. EP 1 176423 AI) sein. Die Rezeptoren 5 können auf die Teststel¬ len aufgedruckt und/oder mit einer Mikropipette, die mittels einer XY- Positioniervorrichtung relativ zu dem Halbleiterchip 4 positioniert wierd, in gelöster Form auf den Halbleiterchip 4 aufgetragen werden.
Nachdem die Rezeptoren 5 auf dem Halbleiterchip 4 immobilisiert wurden, wird die zu analysierende Lösung auf die Testsfellen 3 aufgebracht um den in der Lösung 1 enthaltenen Liganden 2 die Möglichkeit zu geben, spezifisch an die Rezeptoren 5 zu binden (Fig. 2). Das Aufbringen der Lösung 1 kann mit Hilfe einer in der Zeich¬ nung nicht näher dargestellten Pipette erfolgen. Es ist aber auch denkbar, dass der Halbleiterchip 4 an eine Durchflussmesskammer angrenzt, die eine Zuflussöffhung hat, durch welche die Lösung 1 mittels einer Mikropumpe in die Durchflussmess¬ kammer gepumpt wird.
In Fig. 3 ist erkennbar, dass die Lösung 1 anschließend beispielsweise mit Hilfe einer Spülflüssigkeit von den Teststellen 3 entfernt wird, so dass dann nur noch diejenigen Ligαnden 2 an den Teststellen 3 angeordnet sind, die spezifisch an einen Rezeptor 5 gebunden sind. Die Spülflüssigkeit kann in einem in der Zeichnung nicht näher dargestellten Reservoir bevorratet sein, das über eine eine Mikropumpe aufwei¬ sende Zufuhreinrichtung mit den Teststellen 3 verbindbar ist.
In einem weiteren, in Fig. 3 gezeigten Verfdhrensschritt werden die an den Teststel¬ len 3 verbliebenen Liganden 2 mit biotylinierten Nachweisantikörpern 7 in Kontakt gebracht, die an die Liganden 2, nicht jedoch an freie Rezeptoren 5 binden. Dabei bilden sich an den Stellen, an denen zuvor ein Ligand 2 an einen Rezeptoren 5 gebunden hat, Rezeptor-Liganden-Nachweisantikörper-Komplexe aus. Die Nach¬ weisantikörper 7 sind zusammen mit einer Trägerflüssigkeit in einem weiteren Reservoir bevorratet, das über die Zufuhreinrichtung mit den Teststellen 3 verbind¬ bar ist. Selbstverständlich ist es aber auch möglich, die die Nachweisantikörper 7 enthaltende Trägerflüssigkeit mit Hilfe einer Pipette auf die Teststellen 3 aufzubrin- gen.
Nun werden eventuelle noch vorhandene freie Liganden 2 von den Teststellen entfernt, so dass dann nur noch freie Rezeptoren, Rezeptor-Liganden-Komplexe und/oder Rezeptor-Liganden-Nachweisanfikörper-Komplexe an den Teststellen 3 vorhanden sind. Zum Entfernen der freien Liganden 2 werden die Teststellen mit einer Spülflüssigkeit gespült, die mit Hilfe der Zufuhreinrichtung aus einem Vorrats¬ behälter zu den Teststellen 3 geleitet wird.
In einem weiteren Verfdhrensschritt werden die Teststellen 3 mit einer Tracer-Lösung in Kontakt gebracht, die Streptavidin enthält, an welches das Enzym Meerrettich-
Peroxidase 9 gebunden ist. Das Streptavidin hat die Eigenschaft, spezifisch an die biotinylierten Nachweisantikörper 7 zu binden. Wie in Hg. 4 erkennbar ist, bindet durch die Vermittlung des Streptavidins indirekt auch die Meerrettich-Peroxidase 9 an die Nachweisantikörper 7. Die Tracer-Lösung wird mit Hilfe der Zuführeinrichtung aus einem Reservoir zu den Teststellen 3 gefördert.
Nun wird die Oberfläche des Halbleiterchips 4 mit einer Ersatzflüssigkeit 10 gespült, nämlich einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS - phosphat buffered saline
Solution), um die Tracer-Lösung und eventuell darin noch enthaltene freie Meerret- tich-Peroxidase 9 von den Teststellen 3 zu entfernen. Die Ersatzflüssigkeit 10 ist in einem Reservoir bevorratet das über die Zufuhreinrichtung mit den Teststellen 3 verbindbar ist.
Die Meerrettich-Peroxidase 9 ist jetzt nur noch an den Stellen vorhanden, an denen ein Ligand 2 an einen an dem Halbleiterchip 4 immobilisierten Rezeptor 5 gebun¬ den ist. Die Rezeptor-Liganden-Komplexe sind also mit der Meerrettich-Peroxidase 9 markiert.
In Hg. 1 bis 4 ist erkennbar, dass an den Teststellen 3 in den Halbleiterchip 4 jeweils ein elektronischer Strahlungsempfänger ό integriert ist, beispielsweise eine Photodi¬ ode. Deutlich ist erkennbar, dass die Rezeptoren 5 jeweils direkt auf den Strah¬ lungsempfängern ό immobilisiert sind. Die Strahlungsempfänger ό sind für eine Lumineszenzstrahlung empfindlich, die in einem späteren Verfdhrensschritt, der nachfolgend noch näher beschrieben wird, in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden 2 an den Rezeptor 5 erzeugt wird.
Mit Hilfe der Strahlungsempfänger ό wird für die einzelnen Teststellen 3 jeweils ein Dunkelmesssignal 1 1 erfasst, während die Strahlungsempfänger ό mit der Ersatz¬ flüssigkeit 10 in Kontakt stehen. Die Ersatzflüssigkeit ist derart auf die Rezeptoren 5, die Liganden 2 und die Nachweisantikörper' 7 abgestimmt, dass bei der Dunkel¬ messung keine Lumineszenz auftritt.
In Fig. 5 ist erkennbar, dass die Strahlungsempfänger ό zu Beginn der Dunkelmes¬ sung auf einen vorgegebenen elektrischen Spannungswert aufgeladen sind, und dass der Betrag der an den Strahlungsempfängern 6 jeweils anliegenden Mess¬ spannung während der Dunkelmessung kontinuierlich abnimmt. Während oder nach der Dunkelmessung wird ein Steigungswert für das Dunkelmesssignal 1 1 bestimmt und zwischengespeichert. In Fig. ό sind die entsprechenden Steigungs¬ werte in Form eines Balkendiagramms für einen Halbleiterchip mit 32 Teststellen 3, die matrixformig in vier Reihen und acht Spalten angeordnet sind, graphisch dargestellt.
In Fig. 5 ist zusätzlich noch ein zweites Dunkelmesssignal 12 eingezeichnet, das bei trockenem Strahlungsempfänger ό aufgezeichnet wurde. Deutlich ist erkennbar, dass das zweite Dunkelmesssignal 12 eine größere Steigung aufweist als das erste lό
Dunkelmesssignαl 1 1. Die Messspαnnung bzw. der Dunkelstrom der Strahlungs¬ empfänger ό wird also durch die Anwesenheit der Ersatzflüssigkeit 10 beeinflusst.
Nachdem die Dunkelmesssignale 1 1 für die einzelnen Strahlungsempfänger ό jeweils gemessen wurden, wird die Ersatzflüssigkeit 10 von den Teststellen 3 entfernt und es wird eine Hilfeflüssigkeit 13 auf die Teststellen 3 aufgebracht, die Wasserstoff¬ peroxid und Luminol enthält. Eine solche Hilfeflüssigkeit 13 ist beispielsweise unter der Bezeichnung //ECL®-Lösung" im Handel erhältlich. In der Hilfeflüssigkeit 13 ist der Ligand nicht oder in einer für die Messung nicht relevanten Konzentration enthalten. Die Hilfeflüssigkeit 13 wird mit Hilfe der Zufuhreinrichtung aus einem Reservoir zu den Teststellen 3 gefördert.
Wenn die Meerrettich-Peroxidase 9 mit dem Wasserstoffperoxid in Kontakt gerät, werden freie Sauerstoffradikale von dem Wasserstoffperoxid abgespalten, wodurch das Luminol gemäß der nachstehenden Reaktionsgleichung unter Abgabe von Lumineszenzstrahlung chemisch zersetzt wird:
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Es wird also in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden 2 an den Rezeptor 5 eine Lumineszenzstrahlung 14 erzeugt. Diese hat eine Wellenlänge von etwa 428 nm. Für die einzelnen Testsfellen 3 wird die Lumineszenzstrahlung 14 jeweils mit Hilfe des an der Teststelle 3 befindlichen Strahlungsempfängers ό detektiert, während dieser mit der Hilfeflüssigkeit 13 bedeckt ist. Das entsprechende Strah¬ lungsmesssignal ist in Fig. 5 mit 15 bezeichnet. Deutlich ist erkennbar, dass das Strahlungsmesssignal 15 aufgrund eines durch die Lumineszenzstrahlung in dem Strahlungsempfänger ό induzierten elektrischen Stroms wesentlich stärker abfällt als das Dunkelmesssignal 11.
Die Strahlungsmesssignale 15 der einzelnen Strahlungsempfänger ό weisen jeweils einen etwa linearen Verlauf auf Während oder nach der Erfassung des Strah- lungsmesssignαls 15 wird mit Hilfe des dem entsprechenden Strahlungsempfänger ό zugeordneten Steigungswerts für das Dunkelmesssignal 11 ein Wert für die Steigung des Strahlungsmesssignals 15 relativ zu dem Dunkelmesssignal 11 ermittelt. In Fig. 8 sind die entsprechenden relativen Steigungswerte jeweils in Form eines Balkendiagramms für die einzelnen Strahlungsempfänger ό graphisch dargestellt. Zum Vergleich sind die absoluten Steigungswerte der Strahlungsmess¬ signale 15 in Fig. 7 wiedergeben.
Die Matrix des Halbleiterchips 4 weist mehrere Gruppen von Teststellen 3 auf; an denen jeweils gleiche Rezeptoren immobilisiert sind. So bilden die Spalten 1 bis 3
(von links nach rechts) und die Spalten 4 bis ό jeder Zeile der Matrix jeweils ein
Gruppe von Teststellen 3. Teststellen 3, die unterschiedlichen Gruppen zugeordnet sind, unterscheiden sich jeweils hinsichtlich ihrer Rezeptoren. Aus den Messwerten von Teststellen 3, die derselben Gruppe angehören, wird jeweils der arithmetische Mittelwert gebildet. Dadurch werden Messweiltoleranzen/ die durch Unterschiede in den Strahlungsempfängern ό und/oder der Belegung der Strahlungsempfänger ό mit den Rezeptoren 5 bedingt sein können, geglättet.
In Fig. 8 ist deutlich erkennbar, dass in der ersten, in der Zeichnung hinten ange- ordneten Matrix-Zeile, an drei Messpunkten, die derselben Gruppe zugeordnet sind, jeweils ein relativ hohes Messsignal gemessen wurde, und dass diese Messsignale weitgehend übereinstimmen. An den entsprechenden Messpunkten der zweiten Zeile ist das Messsignal wesentlich geringer. Ein noch kleineres Mess¬ signal wurde an den ersten drei Messpunkten der dritten Zeile ermittelt. An den übrigen Messpunkten ist das Messsignal etwa null.
Bei dem in Fig. 9 gezeigten Ausführungsbeispiel wird auf eine auf dem Halbleiter¬ chip 4 angeordnete Teststelle 3 eine zu analysierende Lösung 1 aufgebracht, welche die Liganden 2 und Kompetitoren lό enthält. An der Teststelle 3 ist ein in der Zeichnung nicht näher dargestellter Strahlungsempfänger ό in den Halbleiterchip 4 integriert.
Sowohl die Liganden 2 als auch die Kompetitoren 1 ό binden jeweils, wenn Sie mit einem Rezeptor 5 in Kontakt geraten, spezifisch an diesen. In Fig. 9 ist erkennbar, dass die Kompetitoren lό mit einem Luminophor 17 markiert sind. Der Luminophor 17 emittiert eine Lumineszeπzstrαhlung 14, wenn er mit einer Anregungsstrαhlung bestrahlt wird. Die Wellenlänge der Anregungsstrahlung unterscheidet sich von der Wellenlänge der Lumineszenzstrahlung 14. Die Strahlungsempfänger ό sind für die Anregungsstrahlung unempfindlich.
Nachdem die zu analysierende Lösung 1 für eine Zeitdauer, die ausreicht um eine repräsentative Menge der in der Lösung 1 enthaltenen Liganden 2 und/oder Kompetitoren 16 an die Rezeptoren 5 zu binden, mit der Teststelle 3 in Kontakt gebracht wurde, wird die Lösung 1 von der Teststelle 3 entfernt und durch eine Hilfeflüssigkeit 13 ersetzt, die weder Liganden 2 noch Kompetitoren 16 enthält. Danach wird die Teststelle 3 mit der Anregungsstrahlung bestrahlt, um Luminopho- re 17, die indirekt über die Kompetitoren 16 an die Rezeptoren 5 gebunden sind, zur Abgabe der Lumineszenzstrahlung 14 anzuregen. Während die Teststelle 3 mit der Anregungsstrahlung bestrahlt wird, wird bei mit dem Strahlungsempfänger ό in Kontakt befindlicher Hilfeflüssigkeit 13 mit Hilfe des Strahlungsempfängers ό ein Strahlungsmesssignal 15 erfdsst. Danach wird die Anregungsstrahlung abgeschal¬ tet, um mit Hilfe des Strahlungsempfängers ό bei weiterhin mit dem Strahlungsemp¬ fänger ό in Kontakt befindlicher Hilfeflüssigkeit 13 ein Dunkelmesssignal 1 1 zu detektieren.
Mit dem Dunkelmesssignal 1 1 wird das Strahlungsmesssignal 15 kompensiert, indem das Dunkelmesssignal 1 1 von dem Strahlungsmesssignal 15 subtrahiert wird. Mit Hilfe des so erhaltenen kompensierten Messsignals wird die Steigung des Strahlungsmesssignals 15 relativ zu dem Dunkelmesssignal 11 bestimmt. Die Kompensation kann mit Hilfe einer entsprechenden Kompensationseinrichtung erfolgen, die Eingänge für das Strahlungsmesssignal 15 und das Dunkelmesssignal 1 1 sowie einen Ausgang für das kompensierte Strahlungsmesssignal aufweist.
In Fig. 10 ist erkennbar, dass die an den einzelnen Messpunkten 3 immobilisierten Rezeptoren 5 mit unterschiedlichen Liganden eine spezifische Bindung eingehen.
Dabei sind die Liganden jeweils mit einem Luminophor 17 markiert, der nur an die
Liganden, nicht jedoch an freie Rezeptoren 5 bindet. Die Liganden werden in der zu analysierenden Lösung 1 auf die Teststellen 3 aufgebracht. Nachdem die Lösung 1 für eine Zeitdauer, die ausreicht, um eine repräsentative Menge der in der Lösung 1 enthaltenen Liganden 2 an die Rezeptoren 5 zu binden, mit der Teststelle 3 in Kontakt gebracht wurde, wird die Lösung 1 von der Teststelle 3 entfernt und durch eine Hilfeflüssigkeit 13 ersetzt die keine zu den Rezeptoren passenden Liganden 2 enthält. Danach wird die Teststelle 3 mit der Anregungsstrahlung bestrahlt um diejenigen Luminophore 17, die über die Liganden 2 an die Rezeptoren 5 gebun- 5 den sind, zur Abgabe der Lumineszenzstrahlung 14 anzuregen. Während die Teststellen 3 mit der Anregungsstrahlung bestrahlt werden, werden die Strahlungs¬ messsignale 15 bei mit den Strahlungsempfängern ό in Kontakt befindlicher Hilfeflüssigkeit 13 erfässt. Danach wird die Anregungsstrahlung abgeschaltet, um die Dunkelmesssignale 1 1 zu messen, während die Strahlungsempfänger ό weiterhin l o mit der Hilfeflüssigkeit 1 3 in Kontakt stehen.
Bei dem Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration eines in einer zu analysierenden Lösung enthaltenen Liganden 2 wird also auf einem Halbleiterchip 4 an einer Teststelle 3 ein Rezeptor 5 immobilisiert, der mit
15 dem Liganden 2 eine spezifische Bindung eingehen kann. Zum Binden des Liganden 2 an den Rezeptor 5 wird die Lösung auf die Teststelle 3 aufgebracht. In Abhängigkeit von der Bindung des Liganden 2 an den Rezeptor 5 wird eine Lumineszenzstrahlung 14 oder eine Farbveränderung erzeugt. Mit Hilfe eines in den Halbleiterchip 4 integrierten Strahlungsempfängers ό wird ein Strahlungsmesssignal
20 15 erfässt, während die Hilfeflüssigkeit 13 mit dem Strahlungsempfänger ό in Kontakt steht. Während das Erzeugen der Lumineszenzstrahlung 14 verhindert wird und der Strahlungsempfänger ό mit der Hilfeflüssigkeit 1 3 und/oder einer Ersatzflüssigkeit in Kontakt steht, wird ein Dunkelmesssignal 1 1 für den Strahlungsempfänger ό gemessen. Das Strahlungsmesssignal 15 wird mit dem Dunkelmesssignal 11
25 kompensiert.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration mindestens eines Liganden (2), von dem vermutet wird, dass er in einer zu analysierenden Lösung (1) enthalten ist a) wobei auf einem Halbleiterchip H) an mindestens einer Teststeile (3) wenigstens ein Rezeptor (5) immobilisiert wird, der mit dem Liganden (2) eine spezifische Bindung eingeht wenn der Rezeptor (5) den Liganden (2) kontaktiert b) wobei die Lösung (1) zum Binden des Liganden (2) an den Rezeptor (5) auf die Teststelle (3) aufgebracht wird, c) wobei die Lösung (1) von der Teststelle (3) entfernt und eine Hilfeflüssigkeif (1 3) auf die Teststelle (3) aufgebracht wird, die einen Chemiluminophor enthält, der in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden (2) an den Rezeptor (5) zur Abgabe einer Lumineszenzstrahlung (14) angeregt wird, d) und wobei mit Hilfe mindestens eines für die Lumineszenzstrahlung (14) empfindlichen, in den Halbleiterchip (4) integrierten Strahlungsempfän¬ gers (ό) ein Strahlungsmesssignal (15) erfasst wird, dadurch gekennzeichnet, e) dass das Strahlungsmesssignal (15) erfasst wird, während die Hilfsflüssig- keit (13) mit dem Strahlungsempfänger (ό) in Kontakt steht, f) dass der Strahlungsempfänger (ό) mit einer Ersatzflüssigkeit (10) in Kontakt gebracht wird, in der keine Lumineszenzstrahlung (14) auftritt, g) dass während der Strahlungsempfänger (ό) mit einer Ersatzflüssigkeit (10) in Kontakt steht, ein Dunkelmesssignal (1 1) für den Strahlungsempfänger
(ό) gemessen wird, h) und dass das Strahlungsmesssignal (15) mit dem Dunkelmesssignal (1 1) kompensiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Ligand (2) direkt und/oder über mindestens einen mit dem Ligand (2) verbundenen Nachweisantikörper (7) mit mindestens einem Enzym markiert wird, dass der Chemiluminophor derart gewählt ist, dass er bei Anwesenheit des Enzyms direkt oder indirekt durch die Vermittlung einer in der Hilfsflüssig- keit (13) enthaltenen chemischen Substanz zur Abgabe der Lumines¬ zenzstrahlung (14) angeregt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Enzym ein Peroxidase-Enzym, vorzugsweise Meerrettich-
Peroxidase (9) ist und dass der Chemiluminophor Luminol und die chemi¬ sche Substanz Wasserstoffperoxid sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet dass die Hilfsflüssigkeit (13) Wasserstoffperoxid und Luminol und die Ersatzflüs¬ sigkeit (10) vorzugsweise eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) enthält.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet dass in die zu analysierende Lösung (1) mindestens ein mit dem Enzym markierter Kompetitor (1 ό) eingebracht wird, und dass die Lösung (1 ) danach auf die Teststelle (3) aufgebracht wird.
ό. Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration mindestens eines Liganden (2), von dem vermutet wird, dass er in einer zu analysierenden Lösung (1) enthalten ist, a) wobei auf einem Halbleiterchip (4) an mindestens einer Teststelle (3) wenigstens ein Rezeptor (5) immobilisiert wird, der mit dem Liganden (2) eine spezifische Bindung eingeht, wenn der Rezeptor (5) den Ligahden
(2) kontaktiert, b) wobei die Lösung (1) zum Binden des Liganden (2) an den Rezeptor (5) auf die Teststelle (3) aufgebracht wird, c) wobei mindestens ein Luminophor (17) in Abhängigkeit von der Bildung des Liganden (2) an den Rezeptor (5) an der Teststelle (3) immobilisiert wird, d) wobei die Teststelle mit einer Anregungsstrahlung bestrahlt wird, die mindestens eine Weilenlänge enthält, bei welcher der Luminophor (17) zur Abgabe einer Lumineszenzstrahlung (14) angeregt wird, e) und wobei mit Hilfe mindestens eines für die Lumineszenzstrahlung (14) empfindlichen, in den Halbleiterchip (4) integrierten Strahlungsempfan- gers (ό) ein Strahlungsmesssignal (15) erfasst wird, dadurch gekennzeichnet f) dass das Strahlungsmesssignal (15) erfasst wird, während die Lösung (1) und/oder eine den Luminophor (17) nicht enthaltende Hilfsflüssigkeϊf (13) mit dem Strahlungsempfänger (ό) in Kontakt steht
5 g) dass während das Erzeugen der Lumineszenzstrahlung (14) verhindert wird, ein Dunkelmesssignal (11) für den Strahlungsempfänger (ό) gemes¬ sen wird, h) dass bei der Erfassung des Dunkelmesssignals (1 1) der Strahlungsemp¬ fänger (ό) mit der Lösung (1), der Hilfsflüssigkeit (13) und/oder einer Ersatz- i o flüssigkeit (10) in Kontakt steht,
I) und dass das Strahlungsmesssignal (15) mit dem Dunkelmesssignal (11) kompensiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch ό, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand (2) 15 direkt oder über mindestens einen Nachweisantikörper mit dem Lumi¬ nophor (17) markiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch ό, dadurch gekennzeichnet, dass in die zu analysierende Lösung (1) mindestens ein mit dem Luminophor (17) markier- 0 ter Kompetitor (1 ό) eingebracht wird, und dass die Lösung (1) danach auf die
Teststelle (3) aufgebracht wird.
9. Verfahren zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentration mindestens eines Liganden (2), von dem vermutet wird, dass er in einer zu 5 analysierenden Lösung (1) enthalten ist, a) wobei auf einem Halbleiterchip (4) an mindestens einer Teststelle (3) wenigstens ein Rezeptor (5) immobilisiert wird, der mit dem Liganden (2) eine spezifische Bindung eingeht, wenn der Rezeptor (5) den Üganden
(2) kontaktiert, 0 b) wobei die Lösung (1) zum Binden des Liganden (2) an den Rezeptor (5) auf die Teststelle (3) aufgebracht wird, c) wobei mit der Teststelle (3) ein Reagenz in Kontakt gebracht und in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden (2) an den Rezeptor (5) durch eine chemische Reaktion in einen Indikator umgewandelt wird, 5 der sich farblich von dem Reagenz unterscheidet, d) wobei die Teststelle mit einer optischen Strahlung bestrahlt wird, e) wobei mit Hilfe mindestens eines für die bei der chemischen Reaktion auftretende Farbveränderung empfindlichen/ in den Halbleiterchip (4) in¬ tegrierten Strahlungsempfängers (ό) ein Strahlungsmesssignal (15) erfasst wird/ f) während die Lösung (1) und/oder eine das Reagenz enthaltende
Hilfeflüssigkeit (13) mit dem Strahlungsempfänger (ό) in Kontakt steht g) wobei während das Erzeugen der optischen Strahlung (14) verhindert und/oder der Indikator von der Teststelle (3) ferngehalten wird, ein Dun¬ kelmesssignal (1 1) für den Strahlungsempfänger (ό) gemessen wird, h) wobei bei der Erfassung des Dunkelmesssignals (1 1) der Strahlungsemp¬ fänger (ό) mit der Lösung (1) oder der Hilfsflüssigkeit (13) und/oder einer Ersatzflüssigkeit (10) in Kontakt steht, i) und wobei das Strahlungsmesssignal (15) mit dem Dunkelmesssignal (11) kompensiert wird.
10. Verfahren einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Halbleiterchip (4) mehrere Strahlungsempfänger (ό) aufweist, und dass vor¬ zugsweise für jeden dieser Strahlungsempfänger (ό) jeweils ein Strahlungs¬ messsignal und ein Dunkelmesssignal erfasst und für jeden Strahlungsemp- fänger (ό) jeweils das das ihm zugeordnete Strahlungsmesssignal mit dem ihm zugeordneten Dunkelmesssignal kompensiert wird.
1 1. Verfahren einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass auf mindestens zwei Teststellen (3) jeweils wenigstens ein Rezeptor (5) immobili- siert wird, dass für die diesen Teststellen (3) zugeordneten Strahlungsemp¬ fänger (ό) Jeweils ein Strahlungsmesssignal (15) und ein Dunkelmesssignal (1 1) erfasst werden, und dass die einzelnen Strahlungsmesssignale (15) mit dem ihnen jeweils zugeordneten Dunkelmesssignal (1 1) kompensiert wer¬ den.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass an mindestens zwei Teststellen (3) gleiche Rezeptoren (5) auf dem Halb¬ leiterchip (4) immobilisiert werden, auf weiche die zu analysierende Lösung (1) aufgebracht wird, dass für diese Teststellen (3) jeweils mindestens ein Strahlungsmesssignal (15) erfasst und mit einem Dunkelmesssignal (1 1) kompensiert wird, und dass aus den so ermittelten kompensierten Messsig¬ nalen ein Mittelwertsigna] gebildet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, 5 dass der Strahlungsempfänger (ό) eine Photodiode ist, die zum Aufladen ih¬ rer Sperrschichtkapazität in Sperrrichtung mit einer elektrischen Spannungs¬ quelle verbunden wird, dass danach die Verbindung zu der Spannungs¬ quelle unterbrochen wird, und dass während der Unterbrechung als Strah¬ lungsmesssignal (15) und/oder als Dunkelmesssignal (1 1) die elektrische l o Spannung an der Photodiode abgegriffen wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Dunkelmesssignal (1 1) durch einen Abschnitt einer Geraden an¬ genähert wird, dass die Steigung der Geraden bestimmt wird, und dass das i 5 Strahlungsmesssignal (15) anhand der Steigung kompensiert wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Ersatzflüssigkeit (10) eine Waschlösung ist, dass die mindestens eine Teststelle (3) nach dem Aufbringen der zu analysierenden Lösung (1) mit der
20 Waschlösung abgespült wird, dass danach das Dunkelmesssignal (11) er- fasst wird, und dass dann die Waschlösung durch die Hilfeflüssigkeit (13) er¬ setzt und das Strahlungsmesssignal (15) erfάsst wird.
1 ό. Messvorrichtung zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentra- 25 tion mindestens eines Liganden (2), von dem vermutet wird, dass er in einer zu analysierenden Lösung (1) enthalten ist, mit einem Halbleiterchip (4), auf dem an mindestens einer Teststelle (3) wenigstens ein Rezeptor (5) immobili¬ siert ist, der mit dem Liganden (2) eine spezifische Bindung eingeht, wenn der Rezeptor (5) den Liganden (2) kontaktiert, mit einem ersten Reservoir, in dem 30 eine Hilfeflüssigkeit (13) angeordnet ist, die einen Chemiluminophor enthält, der bei einem Kontakt mit der Teststelle (3) in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden (2) an den Rezeptor (5) zur Abgabe einer Lumineszenzstrah¬ lung (14) anregbar ist, mit mindestens einem für die Lumineszenzstrahlung (14) empfindlichen, in den Halbleiterchip (4) integrierten Strahlungsempfan- 35 ger (ό), mit einem zweiten Reservoir, in dem eine den Chemiluminophor nicht enthaltende Ersatzflüssigkeit (10) angeordnet ist mit einer die Reservoirs mit der Teststelle (3) verbindenden Zufuhreinrichtung, mittels der die Hilfeflüs¬ sigkeit (13) und die Ersatzflüssigkeit (10) getrennt voneinander der Teststelle (3) zuführbar sind, mit einer mit der Zuführeinrichtung und dem Strahlungsemp- 5 fanger (ό) verbundenen Steuer- und Auswerteeinrichtung, die derart mit der
ZufiJhreinrichtung in Steuerverbindung steht, dass die Hilfeflüssigkeit (13) und die Ersatzflüssigkeit (10) nacheinander der Teststelle (3) zugeführt werden, wobei die Steuereinrichtung derart ausgestaltet ist, dass sie das Erfassen eines Strahlungsmesssignals (15) auslöst, während die l o Teststelle (3) mit der Hilfeflüssigkeit (13) in Kontakt steht, und sie das Erfassen eines Dunkelmesssignals (15) auslöst, während die Teststelle (3) mit der Ersatzflüssigkeit (13) in Kontakt steht, und dass die Steuer- und Auswerteeinrichtung zum Kompensieren des Strahlungsmesssignals (15) in Abhängigkeit vom Dunkelmesssignal (15) eine 15 Kompensationseinrichtung aufweist.
17. Messvorrichtung zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentra¬ tion mindestens eines Liganden (2), von dem vermutet wird, dass er in einer zu analysierenden Lösung (1) enthalten ist, mit einem Halbleiterchip (4), auf
20 dem an mindestens einer Teststelle (3) wenigstens ein Rezeptor (5) immobili¬ siert ist, der mit dem Liganden (2) eine spezifische Bindung eingeht, wenn der Rezeptor (5) den Liganden (2) kontaktiert, mit einem Reservoir, in dem ein Luminophor (17) angeordnet ist, der bei einem Kontakt mit der Teststelle (3) in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden (2) an den Rezeptor (5) durch
25 Bestrahlung mit einer Anregungsstrahlung zur Abgabe einer Lumines¬ zenzstrahlung (14) anregbar ist, mit mindestens einer Strahlungsquelle zur Aussendung der Anregungsstrahlung, mit wenigstens einem für die Lumines¬ zenzstrahlung (14) empfindlichen, in den Halbleiterchip (4) integrierten Strah¬ lungsempfänger (ό), mit einer das Reservoir mit der Teststelle (3) verbinden-
30 den Zuführeinrichtung, mittels welcher der Luminophor (17) der Teststelle (3) zuführbar ist, mit einer Steuer- und Auswerteeinrichtung, die derart mit der Zu¬ führeinrichtung, dem Strahlungsempfänger (ό) und der Strahlungsquelle in Steuerverbindung steht, dass ein Strahlungsmesssignal (15) erfdsst wird, wäh¬ rend die Strahlungsquelle eingeschaltet ist und die Lösung (1) mit dem Strah-
35 lungsempftinger (ό) in Kontakt steht, und während des Erfassens eines Dun- kelmesssignαls (1 1) die Strαhlungsquelle ausgeschaltet ist, und dass die Steuer- und Auswerteeinrichtung zum Kompensieren des Strahlungsmess¬ signals (15) in Abhängigkeit vom Dunkelmesssignal (15) eine Kompensati¬ onseinrichtung aufweist.
18. Messvorrichtung zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen der Konzentra¬ tion mindestens eines Liganden (2), von dem vermutet wird, dass er in einer zu analysierenden Lösung (1) enthalten ist, mit einem Halbleiterchip (4), auf dem an mindestens einer Teststelle (3) wenigstens ein Rezeptor (5) immobili- siert ist, der mit dem Liganden (2) eine spezifische Bindung eingeht, wenn der
Rezeptor (5) den Liganden (2) kontaktiert, mit einem Reservoir, das ein Rea¬ genz enthält, das bei einem Kontakt mit der Teststelle (3) in Abhängigkeit von der Bindung des Liganden (2) an den Rezeptor (5) durch eine chemische Reaktion in einen Indikator umwandelbar ist, der sich farblich von dem Rea- genz unterscheidet, mit wenigstens einer Strahlungsquelle zur Aussendung von optischer Strahlung auf die Teststelle (3), mit mindestens einem für die bei der chemischen Reaktion auftretende Farbveränderung empfindlichen, in den Halbleiterchip (4) integrierten Strahlungsempfänger (ό), mit einer das Reservoir mit der Teststelle (3) verbindenden Zuführeinrichtung, mittels wel- eher das Reagenz der Teststelle (3) zufuhrbar ist, mit einer Steuer- und Aus¬ werteeinrichtung, die derart mit der Zufuhreinrichtung, dem Strahlungsemp¬ fänger (ό) und der Strahlungsquelle in Steuerverbindung steht, dass ein Strah¬ lungsmesssignal (15) erfasst wird, während die Strahlungsquelle eingeschal¬ tet ist und die Lösung (1) mit dem Strahlungsempfänger (ό) in Konfakt steht, dass während des Erfassens eines Strahlungsmesssignals (15) die Strah¬ lungsquelle eingeschaltet und während des Erfassens eines Dunkelmesssig¬ nals (1 1) die Strahlungsquelle ausgeschaltet ist, und dass die Steuer- und Auswerteeinrichtung zum Kompensieren des Strahlungsmesssignals (15) in Abhängigkeit vom Dunkelmesssignal (15) eine Kompensationseinrichtung aufweist
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