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Die Erfindung betrifft ein biomolekulares Detektionsverfahren zum Detektieren eines Analyten mit einem Rezeptormolekül und/oder einem Detektormolekül. Die Erfindung betrifft des Weiteren einen Biosensor mit einer Elektrode. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein mikrofluidisches System mit mindestens einem Biosensor.
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Stand der Technik
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Aus der deutschen Übersetzung
DE 695 18 995 T2 der europäischen Patentschrift
EP 0 671 625 B1 ist ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Konzentration eines Biomoleküls in einer Testprobe bekannt, wobei das Biomolekül mit einem Enzym markiert ist, das eine hydrolytische Aktivität aufweist oder in einem Komplex enthalten ist, der durch zwei oder mehr Biomoleküle gebildet ist, und zumindest eines von diesen mit dem erwähnten Enzym markiert ist, und das Biomolekül oder der Komplex in Kontakt mit einem Substrat gebracht wird, das einen Phosphatrest trägt, insbesondere ein Phenyl-Phosphat-Derivat, das durch das Enzym, insbesondere eine Phosphatase, unter Bedingungen hydrolysiert werden kann, die zur Verursachung der Hydrolyse adaptiert sind und das Hydrolyseprodukt elektrochemisch oxidiert wird, um den Oxidationsstrom zu messen. Aus der deutschen Gebrauchsmusterschrift DE 20 2016 003 910 U1 ist ein elektrochemischer Biosensor zum Nachweis von Substanzen in Gasen, Aerosolen, Ausatemluft und Flüssigkeiten mit mindestens einem immobilisierten biologisch aktiven System aus signalerzeugenden Biomolekülen und einer für voltammetrische oder amperometrische Messungen geeigneten Elektrodenanordnung bekannt, wobei die signalerzeugenden Biomoleküle Enzymcluster auf einer Arbeitselektrodenstruktur sind. Aus der deutschen Offenlegungsschrift
DE 10 2014 223 539 A1 ist ein Biosensor zur Bestimmung von Laktat bekannt, der einen integrierten Detektor als Mittel zur Erfassung einer Chemolumineszenz, insbesondere einen Photodetektor, umfasst.
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Offenbarung der Erfindung
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Das biomolekulare Detektionsverfahren mit einem Analyten sowie mit einem Rezeptormolekül und/oder einem Detektormolekül ist dadurch gekennzeichnet, dass als Markierungsmolekül ein molekularer Photosensibilisator verwendet wird, der durch Lichtapplizierung in einen angeregten Zustand versetzt wird, um über eine messbare Energieabgabe eine Präsenz des Analyten nachzuweisen. Der Photosensibilisator versetzt den damit in Kontakt kommenden molekularen Sauerstoff (Triplett-Sauerstoff, 3O2) durch Abgabe der durch die Lichtapplizierung aufgenommenen Energie in den angeregten Zustand (Singulett-Sauerstoff, 1O2). Der Begriff Singulett-Sauerstoff wird im Folgenden noch erläutert. Das Detektionsverfahren kann auf einem sogenannten „Sandwich“-Immunoassay-Format beruhen. Prinzipiell ist die beanspruchte Markierung mittels Photosensibilisator auch bei anderen Formaten einsetzbar, zum Beispiel bei kompetitiven oder indirekten Immunoassay-Formaten, bei denen ebenfalls ein markiertes Biomolekül verwendet wird. Bei dem beanspruchten Detektionsverfahren müssen immer ein Analyt und ein Rezeptor- oder Detektormolekül vorhanden sein. Ob der Analyt oder das Rezeptormolekül/Detektormolekül markiert wird beziehungsweise ist, hängt vom verwendeten Immunoassay-Format ab. Bei der Einstrahlung von Licht entsprechender Wellenlänge wird der Photosensibilisator angeregt. Das Detektormolekül ist zum Beispiel ein Detektor-Antikörper. Das Rezeptormolekül ist zum Beispiel ein Fänger-Antikörper. Bei dem Rezeptormolekül kann es sich aber auch um ein Protein oder um eine Nukleinsäure handeln. Als Rezeptormoleküle können auch synthetische Moleküle verwendet werden, zum Beispiel Aptamere oder MIPs, wobei die Großbuchstaben MIP für den englischen Begriff Molecular Imprinted Polymers stehen. Durch Lichtapplizierung kann der Photosensibilisator relativ einfach aktiviert werden. Als Photosensibilisator oder Photosensitizer wird ein Stoff bezeichnet, der durch Absorption von Licht geeigneter Wellenlänge, das von außen zum Beispiel mittels einer Photolampe zugeführt wird, temporär Energie aufzunehmen vermag. Der Photosensibilisator kann seine aus dem Licht der Lichtapplizierung aufgenommene Energie nachweisbar abgeben. Die Energie kann von dem Photosensibilisator zum Beispiel über den damit in Kontakt kommenden Sauerstoff und einen Mediator abgeben werden. Die Energieabgabe kann gemessen werden, um die Präsenz des Analyten nachzuweisen. Wesentlich ist dabei auch ein Waschschritt, um ungebundene Photosensibilisatoren wegzuwaschen und falsch positive Signale zu vermeiden. Ein Rest der Lichtenergie geht zum Beispiel als Wärme verloren. Der molekulare Photosensibilisator oder Photosensitizer ersetzt in einem biomolekularen Detektionssystem ein als Markierungsmolekül verwendbares Enzym, das chemisch reagiert. Der Verzicht auf das Enzym ist vorteilhaft, weil Enzyme relativ teuer und aufwändig zu lagern sind. Der molekulare Photosensibilisator ersetzt besonders vorteilhaft sowohl das enzymatische Markierungsmolekül als auch das Substrat des Enzyms, Wasserstoffperoxid, das kritisch zu handhaben ist, weil es instabil ist.
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Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel des biomolekularen Detektionsverfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass der Photosensibilisator Lichtenergie aufnimmt, um diese an in der direkten Umgebung vorliegenden Triplett-Sauerstoff weiterzugeben, woraufhin dieser in Singulett-Sauerstoff überführt wird. Der Photosensibilisator nimmt zum Beispiel die Energie eines Lichtquants auf, um diese sofort an den in der direkten Umgebung vorliegenden Triplett-Sauerstoff weiterzugeben. Als Triplett-Sauerstoff wird der molekulare Sauerstoff in seinem energetischen Grundzustand bezeichnet. Dieser Triplett-Sauerstoff ist weniger reaktiv. Der Triplett-Sauerstoff wird durch die Lichtenergie in Singulett-Sauerstoff überführt. Als Singulett-Sauerstoff wird molekularer Sauerstoff in seinem energetisch angeregten Zustand bezeichnet. Singulett-Sauerstoff ist sehr reaktiv und wirkt als Oxidationsmittel, indem er die Oxidation eines Substrat-Moleküls begünstigt. Das Substrat-Molekül kann ein klassischer Mediator sein. Mediatoren sind künstliche Elektronenakzeptoren und können entweder anorganische, zum Beispiel Ferrocyanid-Verbindungen oder Metalloxide, oder organische Substanzen sein, zum Beispiel Chinone oder heteroaromatische nichtgesättigte Substanzen, wie Tetracyanochinodimethan oder Tetrathiafulvalen. Das Substrat-Molekül kann aber prinzipiell auch jedes andere Molekül sein, das in der Lage ist, eine Redox-Reaktion einzugehen, wie ein Redox-Polymer.
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Ein weiteres bevorzugtes Ausführungsbeispiel des biomolekularen Detektionsverfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Substrat-Molekül durch Anlegen einer elektrischen Spannung an eine Elektrode wieder in seine reduzierte Form gebracht wird. Dabei werden von der Elektrode Elektronen abgegeben. Dann kann das Detektionsverfahren ohne großen Aufwand erneut gestartet werden.
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Ein weiteres bevorzugtes Ausführungsbeispiel des biomolekularen Detektionsverfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass ein beim Anlegen der elektrischen Spannung an die Elektrode als Folge des gebundenen Analyten auftretender Reduktionsstrom gemessen wird. Dadurch kann die Anwesenheit des Analyten wirksam qualitativ und vorteilhaft auch quantitativ detektiert werden. Der auftretende Reduktionsstrom wird zum Beispiel mit einem Potentiostaten gemessen.
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Ein weiteres bevorzugtes Ausführungsbeispiel des biomolekularen Detektionsverfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtapplizierung unterbrochen wird. Dadurch kann der molekulare Photosensibilisator deaktiviert werden. So kann die vorab beschriebene biomolekulare Detektion in einem biomolekularen Detektionssystem durch die Lichtapplizierung bedarfsabhängig ein- und ausgeschaltet werden.
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Ein weiteres bevorzugtes Ausführungsbeispiel des biomolekularen Detektionsverfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass der molekulare Photosensibilisator aus der Gruppe organischer Farbstoffe, aromatischer Kohlenwasserstoffe, Porphyrine, Phthalocyanine und verwandter Tetrapyrole, sowie Übergangsmetallkomplexe, ausgewählt ist. Wenn Licht mit einer geeigneten Wellenlänge appliziert wird, wird der molekulare Photosensibilisator in einen angeregten Zustand versetzt.
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Ein weiteres bevorzugtes Ausführungsbeispiel des biomolekularen Detektionsverfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Detektormolekül und das Rezeptormolekül Antikörper sind. Das Rezeptormolekül wird dann auch als Fänger-Antikörper bezeichnet. Analog wird das Detektormolekül dann als Detektor-Antikörper bezeichnet.
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Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Computerprogrammprodukt mit einem Computerprogramm, das Softwaremittel zum Durchführen eines vorab beschriebenen biomolekularen Detektionsverfahrens aufweist, wenn das Computerprogramm auf einem Computer ausgeführt wird. Der Computer ist zum Beispiel ein Messgerät, insbesondere ein Potentiostat, oder mit einem derartigen Messgerät verbunden. Der Computer beziehungsweise das Messgerät ist beziehungsweise sind vorzugsweise Bestandteile des biomolekularen Detektionssystems.
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Die oben angegebene Aufgabe ist auch durch einen Biosensor mit einer Elektrode gelöst, der eingerichtet ist zum Detektieren eines Analyten mit einem Rezeptormolekül und/oder einem Detektormolekül, gekennzeichnet durch einen Photosensibilisator. Das biomolekulare Detektionsverfahren läuft in dem Biosensor sozusagen automatisch ab. Bei dem beanspruchten Biosensor handelt es sich vorzugsweise um einen elektrochemischen Biosensor mit Antikörpern als Rezeptormolekül für den zu messenden Analyten. Ein derartiger Biosensor wird auch als Immunosensor bezeichnet. Durch die Verwendung des molekularen Photosensibilisators kann ein kostengünstiger Biosensor-Aufbau realisiert werden. Außerdem kann der molekulare Photosensibilisator gezielt aktiviert und deaktiviert werden. Dadurch kann der Biosensor beziehungsweise ein biosensorisches Gerät zielgerichtet geregelt werden.
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Die Erfindung betrifft des Weiteren ein mikrofluidisches System mit mindestens einem vorab beschriebenen Biosensor. Mikrofluidische Systeme an sich sind bekannt, zum Beispiel aus der deutschen Offenlegungsschrift
DE 10 2009 028 496 A1 . Durch das Prozessieren in dem mikrofluidischen System kann das vorab beschriebene biomolekulare Detektionsverfahren auf einfache Art und Weise für Praxisanwendungen automatisiert werden.
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Die Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung von mehreren Photosensibilisatoren/Biosensoren in einem vorab beschriebenen Detektionsverfahren, insbesondere in einem vorab beschriebenen mikrofluidischen System. Die Erfindung ist sowohl anwendbar für einen eigenständigen (elektrochemischen) Biosensor. Die Erfindung ist aber auch anwendbar für einen Biosensor, insbesondere für mindestens einen Biosensor oder mehrere Biosensoren, der beziehungsweise die in ein mikrofluidisches System integriert ist/sind. Durch die Verwendung mehrerer Photosensibilisatoren/Biosensoren mit Absorbanz bei unterschiedlichen Wellenlängen wird bei gleichzeitiger Anregung prinzipiell die parallele Messung mehrerer Analyte ermöglicht. Alternativ kann man sich das Aktivieren und Deaktivieren desselben Photosensibilisators zu Nutze machen, um verschiedene Sensoren/Analyte sukzessiv zu messen.
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Weitere Vorteile, Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung, in der unter Bezugnahme auf die Zeichnung verschiedene Ausführungsbeispiele im Einzelnen beschrieben sind.
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Figurenliste
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Es zeigen:
- 1 eine schematische Darstellung zur Veranschaulichung eines biomolekularen Detektionsverfahrens mit einem Enzym als Markierungsmolekül und
- 2 eine ähnliche Darstellung wie in 1 mit einem molekularen Photosensibilisator als Markierungsmolekül.
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Beschreibung der Ausführungsbeispiele
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In 1 ist ein Detektionsverfahren zum Detektieren eines Analyten 3 schematisch dargestellt. Der in 1 dargestellte Biosensor umfasst ein Rezeptormolekül 2. Bei dem Rezeptormolekül 2 handelt es sich zum Beispiel um einen Fänger-Antikörper.
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Das Rezeptormolekül 2 bindet den zu messenden Analyten 3 selektiv. Das Rezeptormolekül 2 kann mittels verschiedener Immobilisierungsmethoden entweder direkt auf die Oberfläche einer Elektrode 1 oder auf eine Festphase aufgebracht werden. Die Festphase kann dann auf die Elektrodenoberfläche transferiert werden. Zur Darstellung der Festphase können zum Beispiel Nanopartikel verwendet werden.
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Nur wenn das Rezeptormolekül 2 den Analyten 3 bindet, kann auch ein Detektormolekül 4, zum Beispiel ein Detektor-Antikörper, an den Analyten 3 binden. Das Detektormolekül 4 ist mit einem Enzym 5 versehen, das ein Markierungsmolekül darstellt.
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Das Enzym oder Markierungsmolekül 5 katalysiert in 1 die Umsetzung von Wasserstoffperoxid zu Wasser, wie in 1 durch einen Pfeil 6 angedeutet ist. Während dieser Reaktion wird das Enzym 5 oxidiert, wie in 1 durch einen Pfeil 7 angedeutet ist.
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Im Weiteren wird das Enzym 5 durch einen sogenannten Mediator regeneriert, wie in 1 durch einen Pfeil 8 angedeutet ist, und liegt dadurch wieder in reduzierter und aktiver Form vor. Der Mediator selbst wird gleichzeitig oxidiert, wie in 1 durch einen Pfeil 9 angedeutet ist.
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Mediatoren sind künstliche Elektronenakzeptoren und können entweder anorganische oder organische Substanzen sein. Der Mediator wird, wie in 1 durch einen Pfeil 10 angedeutet ist, durch Anlegen einer geeigneten Spannung wieder in seine reduzierte Form überführt. Dabei fließen, wie in 1 durch einen Pfeil 11 angedeutet ist, Elektronen in das System. Dieser Reduktionsstrom 11 kann als Folge des gebundenen Analyten 3 gemessen werden.
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Das in 1 schematisch dargestellte Sensorprinzip ist für biosensorische Geräte aufgrund der kritischen Stabilität und/oder Aktivität des verwendeten Wasserstoffperoxids und des enzymatischen Markierungsmoleküls 5 eher ungeeignet.
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Daher wird gemäß einem wesentlichen Aspekt der Erfindung ein molekularer Photosensibilisator 26 in 2 als Markierungsmolekül 25 verwendet. Die Anordnung der Biomoleküle, also des Rezeptormoleküls 2, des Analyten 3 und des Detektormoleküls 4, auf der Elektrode 1 bleibt in 2 die gleiche wie in 1.
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Durch ein Blitzsymbol 28 ist in 2 angedeutet, dass der als Markierungsmolekül 25 verwendete Photosensibilisator 26 durch die Applizierung von Licht einer geeigneten Wellenlänge in einen angeregten Zustand versetzt werden kann. Durch das Licht beziehungsweise die Lichtenergie kann der in 2 vereinfacht dargestellte Biosensor aktiviert und deaktiviert werden.
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Wenn der Biosensor in 2 aktiviert ist, dann entsteht wie in 2 durch einen Pfeil 30 angedeutet ist, in Anwesenheit von molekularem Sauerstoff (3O2) eine hoch reaktive Sauerstoffspezies (1O2), die auch als Singulett-Sauerstoff bezeichnet wird.
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In Anwesenheit eines geeigneten Substrats überträgt der Singulett-Sauerstoff seine Energie auf das Substrat, wie in 2 durch einen Pfeil 31 angedeutet ist. Singulett-Sauerstoff hat eine kurze Lebensdauer. Deshalb muss sichergestellt werden, dass der Energietransfer effizient erfolgt, insbesondere bei einem größeren Schichtaufbau des Biosensors. Das Substrat kann ein klassischer Mediator sein oder jedes andere Molekül, das in der Lage ist, eine Redox-Reaktion einzugehen, wie zum Beispiel ein Redox-Polymer.
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Wenn der Singulett-Sauerstoff seine Energie auf das reduzierte Substrat, insbesondere den reduzierten Mediator, überträgt, wird dieses beziehungsweise dieser oxidiert, wie in 2 durch einen Pfeil 31 angedeutet ist.
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Im Folgenden wird das Substrat beziehungsweise der Mediator durch Anlegen einer geeigneten elektrischen Spannung wieder zurück in seine reduzierte Form gebracht, wie in 2 durch einen Pfeil 32 angedeutet ist. Dabei fließen Elektronen in das System, wie in 2 durch einen Pfeil 35 angedeutet ist. Der Reduktionsstrom 35 wird als Folge des gebundenen Analyten 3 mit einem geeigneten Messgerät, wie einem Potentiostaten, gemessen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 69518995 T2 [0002]
- EP 0671625 B1 [0002]
- DE 102014223539 A1 [0002]
- DE 102009028496 A1 [0012]
