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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Elektrochemolumineszenzsysteme. Sie betrifft insbesondere einen
Detektor und ein Verfahren für
die Dosierung von Substanzen durch Erzeugung und Erfassung einer
elektrisch erzeugten Chemolumineszenz (ECL) oder Elektrochemolumineszenz.
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Die Chemolumineszenz wird für die Dosierung
von biochemischen und biologischen Substanzen verwendet. Sie ermöglicht insbesondere
die Messung von Spuren von Mikroorganismen, Hormonen, Viren, Antikörpern, Aminen
oder Proteinen.
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Die Dosierung durch Chemolumineszenz
besteht darin, die gewünschte
Substanz mit Hilfe eines Chemolumineszenzmittels zu markieren, dessen
Erfassung und Dosierung durch Messung des ausgesendeten Lichts,
wenn es, nachdem es in einen erregten Zustand versetzt wurde, in
seinen ursprünglichen
Zustand zurückkehrt,
durchgeführt
werden.
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Der erregte Zustand, der die Entsendung
von Licht ermöglicht,
ist das Produkt einer chemischen Reaktion zwischen zwei besonderen
Substanzen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Systeme,
die eine elektrochemische Reaktion verwenden, Elektrochemolumineszenzsysteme
genannt, in denen mindestens eines der Reagentien elektrochemisch
aus einer ursprünglich
in der Lösung
vorhandenen Substanz erzeugt wird.
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Die bekannten Elektrochemolumineszenzsysteme
umfassen im Allgemeinen eine Zelle zur Erzeugung und Erfassung einer
elektrisch erzeugten Chemolumineszenz, die mindestens eine Arbeitselektrode,
Mittel zur Versorgung der Elektrode mit elektrischer Energie, eine
Photodiode zur Erfassung des erzeugten Lichts und Mittel zum Messen
des von der Photodiode gelieferten Signals umfasst.
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Diese Systeme verwenden eine oder
zwei Arbeitselektroden, wie dies später beschrieben ist. In beiden
Fällen
muss für
die Durchführung
von zuverlässigen
Messungen die Photodiode möglichst
nahe der Stelle angeordnet werden, an der die Elektrochemolumineszenzreaktion
stattfindet. Ferner ist es erforderlich, dass das gesamte Störlicht berücksichtigt wird,
um systematische Fehler so gut wie möglich zu beseitigen.
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Solche Bedingungen sind relativ schwer
einzuhalten, wenn es darum geht, Miniatursysteme von einfacher Verwendung
und zu geringen Kosten herzustellen.
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Um diesen Anforderungen gerecht zu
werden, beschreibt die Publikation von Smith et al. „Electrochemiluminescence
at microelectrodes for biosensing" (SPIE Band 2978, 1977, Seiten 64–68, XP-002056761) eine Miniatur-Elektrochemolumineszenzzelle,
deren verschiedene Bestandteile zusammengefügt sind, um eine sehr kompakte
Struktur zu bilden.
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Die vorliegende Erfindung soll einen
zusätzlichen
Schritt in Richtung der Herstellung von Elektrochemolumineszenzdetektoren
mit sehr kleinen Abmessungen, die einfach und praktisch in der Anwendung,
kostengünstig
und für
weitreichende Anwendungsgebiete geeignet sind, machen.
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Genauer betrifft die Erfindung einen
Elektrochemolumineszenzdetektor für die Dosierung einer biochemischen
oder biologischen Substanz, umfassend mindestens eine Zelle zur
Erzeugung und Erfassung einer elektrisch erzeugten Chemolumineszenz,
umfassend:
- – mindestens eine Arbeitselektrode,
die auf einem Substrat verwirklicht ist,
- – elektrische
Versorgungsmittel, die mit der Elektrode verbunden sind,
- – eine
Photodiode zur Erfassung des von der Elektrochemolumineszenz erzeugten
Lichts,
- – und
Mittel zum Messen des von der Photodiode gelieferten Signals.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
ist ein solcher Detektor hauptsächlich
dadurch gekennzeichnet, dass die Photodiode durch Integration in das
Substrat der Arbeitselektrode verwirklicht ist.
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Vorzugsweise umfasst die Zelle zwei
parallel geschaltete Arbeitselektroden, wobei die eine als Anode
und die andere als Kathode verwendet wird. Die Kathode ist aus Kohlenstoff
hergestellt, und die Anode ist aus einem Material hergestellt, das
unter Platin, Gold, Kohlenstoff und den transparenten Metalloxiden
ausgewählt
wird. Der Abstand zwischen der Kathode und der Anode ist geringer
als 10 Mikrometer.
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfasst
die Zelle eine Passivierungsschicht, in die die Elektroden integriert
sind, wobei ein Teil ihrer Oberseite mit außen in Kontakt bleibt, sowie
eine Zwischenschicht, die aus einem dielektrischen Material hergestellt
und zwischen der Elektrode und dem Substrat angeordnet ist.
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Vorzugsweise umfasst der erfindungsgemäße Detektor
zwei identische Messzellen, wie oben beschrieben, deren jeweilige
Elektroden auf demselben Substrat ausgeführt sind und deren jeweilige Photodioden
durch Integration in das Substrat ausgeführt sind. Die Elektrode von
nur einer der Zellen ist mit Versorgungsmitteln verbunden, und die
Messmittel umfassen Mittel, um den Unterschied zwischen den von
den Photodioden der beiden Zellen gelieferten Signale zu bestimmen.
Bei dieser Ausführung sind
die Passivierungsschicht und die Zwischenschicht beiden Zellen gemein.
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Das Ziel der vorliegenden Erfindung
wird auch durch ein Verfahren erreicht, nach dem sich die zu dosierende
Substanz in wässeriger
Lösung
befindet. In diesem Fall ist die Kathode aus Kohlenstoff hergestellt,
während
die Anode aus einem Material hergestellt ist, das unter Platin,
Gold, Kohlenstoff und anderen dem Fachmann bekannten Materialien,
insbesondere den transparenten Metalloxiden, ausgewählt wird,
wobei der Abstand zwischen Kathode und Anode geringer als 10 Mikrometer
ist.
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Die vorliegende Erfindung und ihre
Vorteile gehen deutlicher aus der Studie der Beschreibung verschiedener
Ausführungsarten
und der beiliegenden Zeichnungen hervor, wobei:
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1 schematisch
eine Elektrochemolumineszenzreaktion darstellt, die auf einer Zelle
mit zwei Arbeitselektroden stattfindet,
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2 eine
Elektrochemolumineszenzreaktion darstellt, die auf einer Zelle mit
nur einer Arbeitselektrode stattfindet,
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3 eine
schematische Gesamtansicht des Detektors der vorliegenden Erfindung
ist, und
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4 eine
perspektivische Ansicht eines Teils des Detektors der 3 ist.
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Wie diese Figuren zeigen, umfasst
der Elektrochemolumineszenzdetektor 10 gemäß der vorliegenden
Erfindung im Wesentlichen zwei identische Messzellen 11 und 12,
wobei gleiche Bestandteile mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet
sind.
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Jede Zelle umfasst zwei Arbeitselektroden, eine
Anode 16 und eine Kathode 17, die um einen Abstand
von weniger als 10 Mikrometer getrennt sind, elektrische Versorgungsmittel 13 für die Elektroden
nur der Zelle 11, einen photoelektrischen Detektor 14,
um das von der Elektrolumineszenz erzeugte Licht zu erfassen, und
Mittel 15 zum Messen des Ausgangssignals des Detektors 14.
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Die Zelle 11 ist die so
genannte aktive Zelle, während
die Zelle 12 die so genannte Referenzzelle ist, die für die Messung
des Hintergrundlärms
bestimmt ist, aus welchem Grund sie auch nicht mit elektrischer
Energie versorgt wird.
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Wie in 4 zu
sehen ist, sind die Anode 16 und die Kathode 17 parallel
geschaltet. Sie sind um einen Abstand von weniger als 10 Mikrometer
getrennt. Vorteilhafterweise sind diese beiden Elektroden, obwohl
dies nicht unbedingt erforderlich ist, durch eine Passivierungsschicht 18 geschützt, die
einen Teil ihrer Oberseite mit außen in Kontakt lässt. Die
Gesamtheit wird auf eine Zwischenschicht 19 gelegt, die
selbst auf einem Siliziumsubstrat 20 des Typs n ausgeführt ist.
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Es ist vorteilhaft, wenn die Elektroden 16 und 17 parallel
geschaltet sind, aber andere Anordnungen und Geometrien sind möglich, sofern
der Abstand zwischen ihnen geringer als 10 Mikrometer ist.
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Die Passivierungsschicht 18,
die Zwischenschicht 19 und das Substrat 20 sind
beiden Zellen gemein.
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Der photoelektrische Detektor 14 ist
von einer Photodiode gebildet, die von einer diffundierten Zone
des Typs n in dem Substrat 20 des Typs p unter den parallel
geschalteten Elektroden 16 und 17 gebildet ist.
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Mit anderen Worten ist die Photodiode 14 durch
Integration in das Substrat 20, auf dem die parallel geschalteten
Arbeitselektroden 16 und 17 angeordnet sind, hergestellt.
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Die Zwischenschicht 19 ist
aus einem dielektrischen Material gebildet und gewährleistet
eine galvanische Isolierung zwischen den Elektroden 16 und 17 und
der Photodiode 14. Diese Schicht dient auch dazu, einen
Schutz der Zellen gegen einen chemischen Angriff durch das umgebende
Medium zu gewährleisten.
Dies ermöglicht
eine Minimierung der Gefahren der Beeinträchtigung der Zellen.
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Eine weitere Funktion der Zwischenschicht 19 besteht
darin, die Lichtreflexion an der Schnittstelle mit dem Substrat 20 zu
verringern. Dies erfolgt durch Anpassen der Dicke und des Brechungsindex der
Schicht in Abhängigkeit
von der Wellenlänge
des ausgesendeten Lichts, die von dem als Marker verwendeten Produkt
abhängt.
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Bei einer konkreten Verwendung des
erfindungsgemäßen Detektors
ist der Marker Ruthenium(II)tris(2,2'-bipyridyl). Andere Produkte, wie beispielsweise
Luminol, können
auch verwendet werden.
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Die Zwischenschicht 19 ist
aus Siliziumnitrid Si3N4 hergestellt
und hat eine Dicke von ungefähr
0,4 Mikrometer, um die Reflexionen auf 610 nm entsprechend der maximalen
Sendewellenlänge
des Rutheniums zu minimieren, wenn dieses als Marker verwendet wird.
Diese Schicht wird vorzugsweise durch ein unter dem Namen „Plasma
enhanced chemical vapor deposition" und der Abkürzung PECVD bekanntes Aufbringungsverfahren
aufgebracht.
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Nach einer vorteilhaften Ausführungsart
sind die Elektroden 16 und 17 aus Platin, Gold,
Kohlenstoff oder transparenten Metalloxiden, die dem Fachmann bekannt
sind, hergestellt. In diesem Fall können sie verwendet werden,
um Substanzen zu messen, die in organischen Lösungen enthalten sind. Sie können auch
in Detektoren mit einer einzigen Arbeitselektrode verwendet werden,
d. h. in denen die beiden parallel geschalteten Elektroden miteinander elektrisch
verbunden sind.
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Nach einer weiteren Ausführungsart
kann die Kathode 17 aus Kohlenstoff hergestellt sein, wobei
die Anode 16 unterschiedslos aus Platin, Gold, Kohlenstoff
oder transparenten Metalloxiden gebildet sein kann. In diesem Fall
ist es möglich,
wenn die beiden Elektroden ausreichend nah sind, d. h. in einem Abstand
von weniger als 10 Mikrometer, eine Dosierung von Komponenten in
ausschließlich
wässeriger Lösung oder
auch in organischer Lösung
herzustellen.
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Die obere Passivierungsschicht 18 ermöglicht es,
die Zellen aus dem umgebenden Medium zu isolieren, um die Gefahren
einer Verschlechterung auf Grund der chemischen Angriffe dieses
Mediums zu minimieren. Diese Schicht 18 kann aus einem
Material, wie beispielsweise Siliziumnitrid Si3N4 hergestellt sein. Ihre Dicke beträgt ungefähr 0,4 Mikrometer
und kann auch durch das oben erwähnte „PECVD"-Verfahren aufgebracht
werden.
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Die Versorgungsmittel 13 der
aktiven Zelle 11 umfassen eine elektrische Energiequelle 21 und leitende
Spuren 22, die auf einem Träger, wie beispielsweise einer
Leiterplatte, ausgeführt
sind, an dessen Ende die beiden Zellen angeordnet sind. Diese leitenden
Spuren 22 schließen
die Elektroden 16 und 17 der aktiven Zelle 11 an
die Quelle 21 an. Als Beispiel liefert die Quelle eine
Dreiphasen-Wechselspannung bei der Geschwindigkeit von 100 mV/sec, die
von –1,45
V bis 1,65 V an der Kathode variiert, und eine Gleichspannung von
1,65 V an der Anode.
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Die Messmittel 15 umfassen
im Wesentlichen zwei leitende Spuren 23, die auf dem Träger der beiden Zellen
ausgeführt
sind, und schließen
die beiden Photodioden 14 an zwei Verstärker 24 an. Diese Verstärker empfangen
den Photostrom, der von den Photodetektoren erzeugt wird, und liefern
ein verstärktes
Signal an ein Messgerät 25.
Dieses bestimmt dann ein Signal, das für den Unterschied zwischen
dem von dem Photodetektor der aktiven Zelle 11 und dem
von dem Photodetektor der Referenzzelle 12 gelieferten
Signal repräsentativ
ist.
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Nach einer vorteilhaften Ausführungsart
erfolgen die elektrischen Verbindungen 22 zwischen den
Elektroden 16 und 17 der aktiven Zelle 11 und der
Versorgungsquelle 21 und die elektrischen Verbindungen 23 zwischen
den beiden Photodioden 14 und den Verstärkern 24 über Verbindungszonen 26, die
an einem Ende der Zellen ausgeführt
sind.
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Die Funktionsweise des Detektors
der vorliegenden Erfindung wird nun für den als Beispiel angenommenen
Fall beschrieben, in dem eine biochemische Verbindung, wie beispielsweise
ein Protein, dosiert werden soll. Ruthenium wird nun als Marker
verwendet. Seine Dosierung ergibt die Dosierung der biochemischen
Verbindung. In diesem Fall sind zwei Messmethoden möglich.
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Nach der ersten Methode der Erfindung
werden die beiden parallel geschalteten Arbeitselektroden als Anode
bzw. Kathode verwendet. Genauer wird in einen Behälter das
zu dosierende Protein, das mit Ruthenium (II)tris(2,2'-bipyridyl), Ru(bpy)3
2+, markiert ist,
in wässeriger
Lösung
eingeführt.
Die beiden Zellen 11 und 12 werden nun in dem
Behälter
angeordnet. In der aktiven Zelle 11 reduziert sich das Ru(bpy)3
2+ an der Kathode 17 zu
Ru(bpy)3
+ und oxydiert
in Ru(bpy)3
3+ an
der Anode 16. Nach einer Annihilationsreaktion zwischen
Ru(bpy)3
+ und Ru(bpy)3
3+ werden Photonen
freigesetzt und von der Photodiode 14 der aktiven Zelle 11 erfasst.
Diese Reaktion ist insbesondere in 1 dargestellt.
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Der durch die Freisetzung der Photonen
erzeugte Photostrom wird durch den Verstärker 24 verstärkt und
dann an das Messgerät 25 gesendet.
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Gleichzeitig wird ein Störphotostrom
auf Höhe
der beiden Photodioden 14 erzeugt. Er geht auf das Licht
zurück,
das von der Umgebung stammt, aber auch auf das Hintergrundgeräusch der
Zellen selbst. Dieser Effekt verändert
sich in Abhängigkeit von
der Temperatur, was bedeutet, dass es schwierig ist, ihn durch Berechnung
zu berücksichtigen.
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Der Störstrom, der die Messung der
aktiven Zelle 11 beeinträchtigt, wird nur mit Hilfe
der Photodiode 14 der Referenzzelle 12 bestimmt,
die nicht versorgt wird. Natürlich
ist dies insofern gültig,
als die beiden Zellen denselben Bedingungen ausgesetzt sind und
auf dieselbe Weise hergestellt wurden.
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So wird durch Bestimmung einer Differenz zwischen
den Signalen jeder der beiden Zellen in dem Messgerät 25 ein
Wert erhalten, der dem nur durch Elektrochemolumineszenz erzeugten
Strom entspricht. Die Messung ist unabhängig vom Störlicht und von den Temperaturveränderungen.
Es ist somit möglich,
Messungen bei Raumlicht sowie unter Bedingungen durchzuführen, unter
denen sich die Temperatur verändert.
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Nach der zweiten Methode der Erfindung werden
die beiden parallel geschalteten Elektroden als einzige Arbeitselektrode
verwendet. Konkret sind die Zellen nun dieselben wie die Zellen
mit zwei Elektroden, mit dem einzigen Unterschied, dass diese einfach
miteinander verbunden sind, entweder innerhalb oder außerhalb
der Zellen, beispielsweise auf Höhe
der leitenden Spuren.
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In diesem Fall unterscheidet sich
die wässerige
Lösung,
die das mit Ruthenium markierte Protein ent hält, von jener der ersten Methode
darin, dass ein Co-Reagens,
wie beispielsweise ein Amin, verwendet wird. Es wird nun eine Oxydationsreaktion
des Amins und des Rutheniums induziert, indem die Anode versorgt
wird. Die chemische Reaktion zwischen dem oxydierten Amin und dem
Ru(bpy)3
3+ erzeugt den
erregten Zustand des Rutheniums, der das von der Photodiode 14 erfasste
Licht erzeugt. Diese Reaktion ist insbesondere in 2 dargestellt.
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Die Messung des von der Photodiode 14 gelieferten
Stroms ergibt eine Messung der Anzahl von gesendeten Photonen und
folglich eine Messung der Menge des Markers, d. h. der zu dosierenden
Substanz.
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Der erfindungsgemäße Detektor, der soeben beschrieben
wurde, ermöglicht
es somit auf einfache Weise Messungen mit Zellen mit einer oder
zwei Elektroden nach der gewählten
Methode durchzuführen.
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Ein besonders wesentlicher Vorteil
dieses Detektors besteht in der Tatsache, dass er in einer selben
Zelle die Elektroden 16 und 17 und die Photodiode 14 integriert.
Dies macht diese Vorrichtung besonders zuverlässig und einfach in der Verwendung.
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Das Vorhandensein einer Nebenzelle
ermöglicht
es, leicht den Einfluss des Störlichts
und der Temperaturveränderung
zu beseitigen, wodurch es möglich
ist, die Messbedingungen zu vereinfachen und die Zuverlässigkeit
der Messungen wesentlich zu verbessern.
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Bei der ersten beschriebenen Methode
ermöglichen
es die Nähe
der Anode und der Kathode und die Verwendung einer Kathode aus Kohlenstoff, Messungen
ausschließlich
in wässeriger
Lösung durchzuführen, was
mit den derzeit bekannten Vorrichtungen nicht möglich ist.
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Schließlich ist anzumerken, dass,
wenn die Photodiode 14 in die blockierte Richtung polarisiert ist,
die Lichtmenge gemessen wird, während,
wenn sie in Durchgangsrichtung polarisiert ist, die Temperatur gemessen
wird, was für
gewisse Anwendungen interessant sein kann.
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Die vorliegende Erfindung ist nicht
auf die beschriebenen Ausführungsarten
beschränkt.
Insbesondere die für
die verschiedenen Schichten und insbesondere die Zwischenschicht 19 und
die Passivierungsschicht 18 verwendeten Materialien müssen an die
zu analysierenden Substanzen angepasst werden.
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Ebenso muss die Dicke der Zwischenschicht 19 an
die zu analysierende Substanz angepasst werden.
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Die Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung kann verwendet werden, um punktuelle Messungen in einem
Behälter
durchzuführen,
oder für
kontinuierliche Messungen, in denen sich ein Fluss von zu analysierender
Substanz in Bezug auf die Zelle verschiebt. Dies ermöglicht eine
Messung der Entwicklung der Menge an zu messender Substanz, wobei der
Einfluss von Veränderungen
der Temperatur und einer Änderung
des Störlichts
beseitigt werden.