DE10311622B4 - Sensorisches Membran-Osmometer und osmotisches Messverfahren zur quantitativen Bestimmung niedermolekularer Affinitätsliganden - Google Patents

Abstract

Sensorisches Membran-Osmometer, bei dem
– ein Affinitätsrezeptor (1) für einen Analyten (2) und ein mit dem Analyten (2) konkurrierender Affinitätsligand des Affinitätsrezeptors, der Konkurrenzligand (3), sich in einer sensorischen Flüssigphase (4) befinden, die durch eine semipermeable Membran (5) gegen eine zweite Flüssigphase, die Milieuphase (6), abgegrenzt ist,
– die Membran für den Analyten (2) leicht durchlässig und für den Affinitätsrezeptor (1) sowie den Konkurrenzliganden (3) nicht durchlässig ist,
– wenigstens einer der nicht permeablen Affinitätsbindungspartner (1 oder 3) nach der Auflösung der Affinitätsbindung zum anderen Partner hydraulisch an der Membran aufgrund seines osmotischen Partialdruckes wirksam ist,
– eine Messvorrichtung (7) für eine Erfassung einer an der Membran zwischen den beiden Flüssigphasen (4 und 6) auftretenden Druckdifferenz oder eines durch die Membran zwischen den beiden Flüssigphasen auftretenden Volumenflusses vorhanden ist und
– die Konzentration beider nicht permeabler Affinitätsbindungspartner (1 und 3) für die Erfassung des Dissoziations-...

Description

• Membran-Osmometer, bei denen die osmotisch bedingte Druckdifferenz oder ein osmotisch bedingter Volumenfluss über eine semipermeable Membran gemessen wird, sind in verschiedenen Ausführungsformen bekannt. Üblicherweise werden sie eingesetzt, um die molare Konzentration von nicht permeablen Stoffen an Hand ihres osmotischen Partialdrucks zu messen. Die bekannten Membran-Osmometer liefern reproduzierbare und genaue Werte, sind jedoch nicht selektiv, sondern reagieren mit vergleichbarer Empfindlichkeit mit allen Stoffen, deren Moleküle bzw. Teilchen vom Porenraum der semipermeablen Membran teilweise oder vollkommen ausgeschlossen werden und daher bei Vorliegen einer Konzentrationsdifferenz über die Membran einen Volumenfluss der Flüssigkeit durch die Membran bzw. eine Druckdifferenz generieren.
• Aus der DE 37 36 230 C1 ist ein sensorisches Membran-Osmometer bekannt, bei dem sich ein selektiver Rezeptor für einen Analyten A in einer sensorischen Flüssigphase befindet, die durch eine semipermeable Membran gegen eine zweite Flüssigphase abgegrenzt ist. Die Membran ist für den Analyten leicht durchlässig und für den selektiven Rezeptor undurchlässig, wobei der nicht permeable selektive Rezeptor nach der Änderung seines Bindungszustandes durch den Analyten hydraulisch an der Membran 2 aufgrund seines osmotischen Partialdruckes wirksam ist und eine Messvorrichtung für eine Erfassung einer an der Membran zwischen den beiden Flüssigphasen auftretenden Druckdifferenz vorhanden ist.
• Aus der US 6,475,750 B1 ist ein Glukosebiosensor bekannt, der ein Affinitätsrezeptor für einen Analyten und ein mit dem Analyten konkurrierenden Affinitätsliganden umfasst, die durch eine semipermeable Membran gegen eine zweite Flüssigphase abgegrenzt sind, wobei die Membran für den Analyten leicht durchlässig und für den Affinitätsrezeptor sowie den Konkurrenzliganden nicht durchlässig ist und die nicht permeablen Affinitätsbindungspartnern nach der Auflösung der Affinitätsbindung zum anderen Partner durch das dadurch bedingte Anschwellen des Hydrogels hydraulisch an der Membran wirksam werden, wobei eine Messvorrichtung für eine Erfassung der dadurch auftretenden Druckdifferenz vorhanden ist.
• Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein sensorisches Membran-Osmometer und ein osmotisches Messverfahren bereitzustellen, das für die Bestimmung niedermolekularer Analyte mit hoher Selektivität geeignet ist. Die Lösung der Aufgabe ist aus den Erfindungsansprüchen ersichtlich.
• Das Wesen der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Membran-Osmometers, mit dessen Hilfe das Prinzip des kompetitiven Affinitätsassays zur selektiven Erfassung der Konzentration bestimmter Analyte ausgenutzt wird. In dem erfindungsgemäßen sensitiven Membran-Osmometer trennt wie bei jedem Membran-Osmometer die semipermeable Membran zwei Flüssigphasen. Eine dieser Phasen, die sensorische Flüssigphase, enthält erfindungsgemäß einen unpermeablen Affinitätsrezeptor für den Analyten sowie einen unpermeablen Konkurrenzliganden, der ebenso wie der Analyt in der Lage ist, einen Affinitätskomplex mit dem Affinitätsrezeptor zu bilden. Die andere Flüssigphase wird im folgenden als Milieuphase bezeichnet. Für die Funktion des sensitiven Membran-Osmometers ist wesentlich, dass niedermolekulare Stoffe an porösen Membranen, wie sie für Membran-Osmometer üblicherweise eingesetzt werden, keine oder nur eine vorübergehende hydraulische Wirkung ausüben, während hochmolekulare Teilchen, die nicht durch die Membran permeieren, einen Volumenfluss oder eine Druckdifferenz erzeugen. Gelangt ein niedermolekularer permeabler Stoff in eine der beiden Flüssigphasen, diffundiert er durch die Membran und verteilt sich zwischen den beiden Flüssigphasen, ohne eine Druckdifferenz oder einen Volumenfluss zu erzeugen. Besitzt der niedermolekulare Stoff jedoch eine ausreichende Affinität zum unpermeablen Affinitätsrezeptor, kann er in Abhängigkeit von seiner Konzentration den nicht permeablen Konkurrenzliganden vom Affinitätsrezeptor verdrängen. Die Dissoziation des Konkurrenzliganden vom Affinitätsrezeptor bewirkt eine hydraulisch an der Membran wirksame Veränderung des osmotischen Partialdruckes der nichtpermeablen Komponenten des erfindungsgemäßen Membran-Osmometers. Das erfindungsgemäße Membran-Osmometer fungiert dementsprechend als selektiver Sensor für solche Analyte, die leicht durch die Membran permeieren und den Konkurrenzliganden aus dem Affinitätskomplex verdrängen können.
• Für die Funktion des erfindungsgemäßen Membran-Osmometers ist es notwendig, dass in der Messzeit der Konzentrationsausgleich des Analyten zwischen der sensorischen Flüssigphase und der Milieuphase erreicht wird. Günstig für eine schnelle Einstellung des Diffusionsgleichgewichtes des Analyten zwischen der sensorischen Phase und der Milieuphase ist es, wenn eine der beiden Phasen, vorzugsweise die sensorische Phase, hinsichtlich ihrer Ausdehnung senkrecht zur Membran auf einen Wert unter 1 mm begrenzt wird. Besonders geeignet für das erfindungsgemäße sensorische Membran-Osmometer ist die Verwendung eines Membran-Osmometers nach DE 197 14 586 , in dem die semipermeable Membran durch ein Hohlfasersegment repräsentiert ist. Dabei befindet sich die sensorische Flüssigphase in einer Messzelle, die sich durch ein sehr kleines Verhältnis zwischen ihrem Volumen und der Membranoberfläche (unter 200 μm) und einen sehr geringen Wert der maximalen Diffusionsstrecke auszeichnet.
• Als Affinitätsrezeptor wird ein Biopolymer oder ein künstlich hergestellter nicht permeabler Komplexbildner bezeichnet, der mindestens eine Bindungsstelle mit Affinität zu einer bestimmten Klasse von Teilchen, den Affinitätsliganden, aufweist und diese selektiv bindet. Als Affinitätsrezeptoren kommen Proteine, z.B. Immunglobuline, Lektine, Avidin, oder Enzyme sowie Polynucleotide, z.B. DNA oder RNA in Frage. Ausserdem kann der Affinitätsrezeptor eine polymergebundene oder immobilisierte biogene oder künstliche Affinitätsbindungsdomäne, z.B. ein Oligonucleotid, ein Oligo- oder Polypeptid, ein Oligosaccharid, Cibachrom Blue oder ein anderer komplexer organischer Stoff mit Affinitätsbindungsfähigkeit sein.
• Eine Voraussetzung für die Anwendung der Erfindung besteht darin, dass ein nicht permeabler Konkurrenzligand verfügbar ist, der mit dem Analyten hinsichtlich der Affinitätsbindung mit dem Affinitätsrezeptor konkurriert und von diesem aus dem Affinitätskomplex mit dem Affinitätsrezeptor verdrängt werden kann. Da niedermolekulare Teilchen mit der Fähigkeit zur Affinitätsbindung an einen Rezeptor durch Konjugation mit einem biogenen oder künstlichen Polymer vergrößert werden können, ohne die Affinität zu verlieren, ist diese Voraussetzung auch für solche Analyte erfüllbar, für die noch kein nichtpermeabler Konkurrenzligand verfügbar ist. Die Freisetzung eines Konkurrenzliganden von einem Affinitätsrezeptor durch einen Analyten, der selbst als Affinitätsligand des Rezeptors fungiert, bzw. der Ligandenaustausch zwischen einem Analyten und einem Konkurrenzliganden wird bekanntlich bereits in verschiedenen kompetitiven Affinitätsassays zur selektiven Bestimmung zahlreicher Analyte genutzt. Die Besonderheit des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Signalbildung. Wird der kompetitive Affinitätsassay in dem erfindungsgemäßen Membran-Osmometer mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt, verändert die durch den Analyten bewirkte Dissoziation des Affinitätskomplexes zwischen dem Affinitätsrezeptor und dem Konkurrenzliganden die hydraulische Wirkung der sensorischen Flüssigphase an der semipermeablen Membran. Die durch den Analyten beeinflusste Dissoziation oder Assoziation des Komplexes zwischen dem Affinitätsrezeptor und dem Konkurrenzliganden ist mit einer Veränderung des osmotischen Partialdruckes der nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner oder, wenn diese eine Netzwerkflüssigkeit in der sensorischen Flüssigphase bilden, mit einer Vergrößerung des hydraulischen Effekts der sensorischen Flüssigphase verbunden, die sich je nach Konstruktion des Membran-Osmometers als Druckänderung oder Volumenänderung messen lässt.
• Die Ursache dafür, dass der Affinitätsrezeptor oder der Konkurrenzligand nicht durch die Membran permeabel sind, kann das Überschreiten einer bestimmten Teilchengröße oder die Immobilisierung an einem Feststoff sein. Für die Funktion des erfindungsgemäßen sensorischen Membran-Osmometers ist es ausreichend, wenn einer der nicht permeablen Affinitätsbindungspartner nach der Auflösung des Affinitätskomplexes in der Flüssigphase diffusibel ist und damit osmotisch an der semipermeablen Membran wirksam wird.
• Für die Funktion des erfindungsgemäßen sensorischen Membran-Osmometers ist eine ausreichend hohe Konzentration der/des diffusiblen nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner/s in der sensorischen Flüssigphase und der komplementären Bindungsstellen wesentlich. Die Veränderung des osmotischen Partialdruckes der nichtpermeablen und diffusiblen Teilchen in der sensorischen Flüssigphase muss ausreichen, um eine gut messbare hydraulische Wirkung an der Membran zu erzielen. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Konzentration des Analyten an Hand des Volumenflusses durch die Membran oder an der Druckdifferenz über die semipermeable Membran gemessen. Die semipermeable Membran dient demnach zur Signalbildung. Sie kann gleichzeitig das Interface zwischen der sensorischen Flüssigphase und der potentiell den Analyten in der zu erfassenden Konzentration enthaltenden Milieuphase darstellen.
• Für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Auswahl der nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner bedeutsam. Es ist wichtig, dass der permeable Analyt den nicht permeablen Konkurrenzliganden in der Messzeit vom Affinitätsrezeptor verdrängt bzw. dass sich das Gleichgewicht des Ligandenaustausches in der Messzeit einstellt. Die Affinitätskonstante für die Bindung des Konkurrenzliganden am Affinitätsrezeptor darf nicht so hoch sein, dass die Affinitätsbindung praktisch irreversibel ist, und sie muss hoch genug sein, um zu gewährleisten, dass in Abwesenheit des Analyten ein großer Teil der nicht permeablen Affinitätsbindungspartner bei annähernd gleicher Konzentration der komplementären Bindungsstellen in der Form des Affinitätskomplexes vorliegt. Die Konkurrenzstärke des Analyten und des Konkurrenzliganden wird bekanntlich nach dem Massenwirkungsgesetz durch die jeweiligen Affinitätskonstanten oder Dissoziationskonstanten ausgedrückt, aus denen sich auch die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation abschätzen lässt.
• Erfindungsgemäß können feindisperse, partikuläre Affinitätsrezeptoren bzw. -liganden oder an einen porösen Festkörper gebundene Affinitätsbindungspartner eingesetzt werden, wenn hiermit eine ausreichende Volumenkonzentration von Affinitätsbindungsorten erreicht werden kann. Befindet sich der Affinitätsrezeptor oder der Konkurrenzligand in einer für den Messvorgang ausreichenden Konzentration in einer porösen Feststoffmatrix innerhalb der Dialysezelle, z.B. porösem Glas, ist der Affinitätskomplex mit dem jeweiligen diffusiblen nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner hydraulisch vollkommen unwirksam. In diesem Fall tragen erst die durch Ligandenaustausch freigesetzten diffusiblen nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner an der semipermeablen Membran zur Druckdifferenz oder zum Volumenfluss bei.
• Erfindungsgemäß kann die sensorische Flüssigphase mit dem Affinitätsrezeptor und dem Konkurrenzliganden eine Netzwerkflüssigkeit der durch Affinitätsbindungen vernetzten Affinitäsbindungspartner enthalten, wobei der osmotische Druck oder das Volumen dieser Netzwerkflüssigkeit von der Analytkonzentration abhängen. Da ein Teil der osmotischen Kräfte durch die vernetzenden Affinitätsbindungen zwischen dem Affinitätsrezeptor und dem Konkurrenzliganden neutralisiert wird, steigt der hydraulische Effekt an der semipermeablen Membran, wenn die sensorische Flüssigphase in einer Messzelle mit begrenztem Volumen eingeschlossen ist und die Affinitätsbindungen durch Ligandenaustausch mit dem Analyten dissoziieren. Um eine Netzwerkflüssigkeit in der Messzelle zu erhalten, kann der Ligandenaustausch in der Messzelle des Membran-Osmometers ausgenutzt werden. Ein ausreichend konzentriertes Sol, das vernetzungsfähige nichtpermeable polymere Affinitätsbindungspartner mit mehreren Affinitätsbindungsstellen pro Teilchen enthält, lässt sich bekanntlich dadurch herstellen, dass das Lösungsmittel eine für die Affinitätsbindung ungünstige Ionenzusammensetzung aufweist oder einen monovalenten niedermolekularen Affinitätsliganden enthält. Der niedermolekulare Analyt besitzt im allgemeinen nur eine Affinitätsbindungsstelle pro Teilchen. Er kann daher im allgemeinen bei ausreichender Konzentration die Vernetzung verhindern, indem er den Konkurrenzliganden aus seiner Affinitätsbindung verdrängt. Füllt man das Sol mit den vernetzungsfähigen unpermeablen Affinitätsbindungspartnern in die Messzelle mit der semipermeablen Membran und überführt diese in eine für die Affinitätsbindung geeignete analytfreie Milieuphase, entsteht in der Messzelle eine Netzwerkflüssigkeit, deren Druck an der semipermeablen Membran wirksam wird. Setzt man der Milieuphase den Analyten in unterschiedlichen Konzentrationen zu, steigt der hydraulische Effekt an der Membran. Bei einer sättigenden Analytkonzentration wird die maximale Druckdifferenz gemessen.
• Die Empfindlichkeit des sensorischen Membran-Osmometers kann dadurch gesteigert werden, dass mindestens einer der nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner ein diffusibler unpermeabler Polyelektrolyt mit hoher Ladungsdichte ist und die Ionenstärke in der Milieuphase gering ist. In diesem Fall wirken nicht nur die nichtpermeablen Polymerteilchen sondern auch die an ihm sorbierten Gegenionen hydraulisch auf die Membran. Der kolloidosmotische Partialdruck der durch den Ligandenaustausch freigesetzten Polyelektrolyt-Teilchen übersteigt bekanntlich den Wert, der sich nach dem Vant Hoffschen Gesetz aus der molaren Konzentrationsänderung der Polyelektrolyt-Teilchen ergibt.
• Für die Anwendung des erfindungsgemäßen sensorischen Membran-Osmometers in einem on-line-Sensor ist es günstig, wenn der Ligandenaustausch am Affinitätsrezeptor schnell erfolgt. Hierzu darf bekanntlich die Affinität des Konkurrenzliganden am Affinitätsrezeptor nicht sehr hoch sein (Dissoziationskonstante über 10 nM). Ist die Affinität des Affinitätsrezeptors für den Analyten ebenfalls verhältnismäßig gering, stellt sich das Bindungsgleichgewicht zwischen den Affinitätsliganden und den Affinitätsrezeptoren auch nach Reduktion der Analytkonzentration schnell ein. Wird auf diese Weise ein reversibler Ligandenaustausch gewährleistet, ist das sensorische Membran-Osmometer bei relativ hohen Analytkonzentrationen (über 0.1 mM) für kontinuierliche Messvorgänge einsetzbar.
• Ein wichtiger Anwendungsfall für den kompetitiven Affinitätsassay mit reversiblem und schnell verlaufendem Ligandenaustausch ist bekanntlich die Messung der Glucosekonzentration mit dem pflanzlichen Rezeptorprotein Concanavalin A. Diese Anwendung wird in den viskosimetrischen und optischen Affinitätssensoren für Glucose im Blut und in der interstitiellen Flüssigkeit realisiert [z.B. DE 197 14 087 ]. Für den Einsatz des erfindungsgemäßen sensorischen Membran-Osmometers zur Glucosebestimmung bestehen günstige Voraussetzungen, weil Concanavalin A in wässrigen Pufferlösungen langzeitstabil und in Konzentrationen bis zu 4 mM löslich ist [Kim J. J., Park, K. (2001) Pharmaceutical Research 18, 794–799]. Ausserdem stehen verschiedene monovalente polymere Affinitätsbindungspartner für Concanavalin A, z.B. das monovalente Insulin sowie polyvalente Affinitätsbindungspartner wie Dextran in verschieden Molekülgrößen zur Verfügung. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen sensorischen Membran-Osmometers gegenüber den bisher bekannten kompetitiven Affinitätssensoren für Glucose auf der Basis von Concanavalin A besteht in dem einfachen Signalwandlungsprinzip.
• Bei einer hohen Affinität des Affinitätsrezeptors für den Analyten und einer verhältnismäßig geringen Affinität für den eingeschlossenen polymeren Affinitätsliganden können sehr geringe Analytkonzentrationen mit dem sensorischen Membran-Osmometer erfasst werden, weil sich der Affinitätsligand in der sensorischen Flüssigphase durch die Affinitätsbindung anreichert und das Volumen der sensorischen Flüssigphase bei Verwendung von Hohlfasersegmenten als Messzelle sehr klein gehalten werden kann. Allerdings ist bei einer hohen Affinität des Analyten dessen Bindung an den Affinitätsrezeptor bekanntlich praktisch nicht reversibel. Dennoch kann das erfindungsgemäße sensorische Membran-Osmometer auch in diesem Fall für wiederholte Messungen eingesetzt werden. Um die Ablösung des Analyten vom Affinitätsrezeptor zu bewirken, kann die Affinität des Rezeptors für den Analyten durch Veränderung des pH-Wertes, der Ionenstärke oder organischer Zusätze reversibel um mehrere Größenordnungen herabgesetzt werden. Vor jeder neuen Nutzung wird hierzu der Analyt durch Uberführung der sensorische Flüssigphase in ein dissoziationsförderndes Milieu abgelöst.
• Als Messvorrichtung zur Erfassung der hydraulischen Wirkung des Ligandenaustausches sind Druckwandler mit deformierbarer Biegeplatte besonders geeignet. Wenn die sensorische Flüssigphase in dem Hohlfasersegment eingeschlossen wird und die Milieuphase unter Atmosphärendruck steht, misst der Druckwandler beispielsweise die Druckdifferenz zwischen der das Hohlfasersegment einschließenden Messzelle und der Atmosphäre und erfasst damit die Druckdifferenz über die semipermeable Membran.
• In einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen sensorischen Membran-Osmometers ist neben der Messzelle eine Referenzzelle, welche mit der Messzelle in Bezug auf die Qualität und Oberfläche der semipermeablen Membran sowie in Bezug auf die Größe und die Form übereinstimmt, vorgesehen. Erfindungsgemäß kann der Drucksensor so angeordnet werden, dass er die Druckdifferenz zwischen der Referenzzelle und der Messzelle erfasst, wobei beide Zellen an die gleiche Milieuphase grenzen. Die Referenzzelle kann die gleiche sensorische Flüssigphase enthalten wie die Messzelle und zur Messung des Referenzdruckes in einer Referenzlösung eingesetzt werden. Dies ermöglicht den Vergleich der Analytkonzentration in der Referenzlösung mit der Analytkonzentration in der Milieuphase. Die Referenzzelle kann andererseits hinsichtlich des Analyten unempfindlich gestaltet werden, indem sie mit einer Flüssigkeit gefüllt wird, welcher mindestens einer der nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner fehlt. Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass die unspezifischen osmotischen Effekte des Milieus kompensiert werden. Mit dieser Anordnung können z.B. die kolloid-osmotischen Effekte von Proteinen und Polyanionen, welche die Druckdifferenz an der semipermeablen Membran von der Ionenkonzentration des Mediums und von der Konzentration der Proteine und Polyanionen abhängig machen, ausgeglichen werden.
• Die Messzelle und die Referenzelle können als parallel angeordnete und am Ende verschlossene Hohlfasersegmente gestaltet werden, die mit den beiden Flächen der Biegeplatte des Druckwandlers kommunizieren. Hierdurch werden mögliche Druckgradienten in der Milieuphase kompensiert, die durch die Schwerkraft oder Strömungen zustandekommen. Die Parallelanordnung der beiden Hohlfasersegmente bietet ausserdem den Vorteil, dass die gesamte Membranfläche auf einer nadelähnlichen Sonde untergebracht werden kann. Letztere ist in ein sehr kleines Flüssigkeitsvolumen oder in lebendes Gewebe einführbar.
• Erfindungsgemäß kann das sensorische Membran-Osmometer mit einer Druckmessvorrichtung versehen werden, bei welcher die osmotisch bedingten Spannungsänderungen an der deformierbaren Membran des Druckwandlers kompensiert werden [vergl, z.B. DE 102 15 621 A1 und Wang, Y, Esashi, M.: The structures for electrostatic servo capacitive vacuum sensors. Sensors and Actuators A 66 (1998) 213–217]. In diesem Fall werden die zur Aufrechterhaltung einer konstanten Spannung an der Membran des Druckwandlers erforderlichen Gegenkräfte gemessen. Diese Ausführung des sensorischen Membran-Osmometers hat den Vorteil einer geringen Verzögerung bei der Einstellung des osmotischen Gleichgewichtes selbst bei sehr geringer Membranfläche, da der Druckwandler für den eigentlichen Messprozess einen sehr geringen Volumenfluss erfordert.
• Anwendungsbeispiel
• Das sensorische Membran-Osmometer besteht aus einer Messzelle (8), einer Referenzzelle (9) und einem Drucksensor, dessen Biegeplatte (10) zwischen den beiden Zellen liegt. Als Messzelle (8) und als Referenzzelle (9) dienen gleich lange Segmente einer Dialyse-Hohlfaser mit einer Membran (11) aus regenerierter Zellulose mit hoher hydraulischer Leitfähigkeit, hohem Volumen-Elastizitätsmodulus und scharfem Cut-off bei einem Stokesschen Radius von 2-3 nm, die auf einem Stahlträger aufgeklebt und an der Spitze verschlossen sind. Sie werden von hinten über Ventile (12) mit verschiedenen Flüssigkeiten gefüllt. In der Messzelle befindet sich als sensorische Flüssigphase eine Lösung von Concanavalin A (40 mg/ml) und Dextran 8 (Serva) mit einem mittleren Molekulargewicht von 8 kDa (16 mg/ml) in einem geeigneten Elektrolyten (5 mM NaHCO₃, 2 mM CaCl₂, 2 mM MnCl₂, 50 mM NaCl, pH 7.2). In der Referenzzelle befindet sich die polymerfreie Elektrolytlösung. Die dargestellte Anordnung hat den Vorteil, dass die osmotischen Wirkungen nicht permeabler Komponenten der Milieuphase kompensiert werden. Beispielsweise ergibt sich keine Änderung der Druckdifferenz, wenn die Sonde mit der Messzelle und der Referenzzelle aus einer polymerfreien Elektrolytlösung in eine Polymerlösung überführt wird. Ein weiterer Vorteil der dargestellten Anordnung besteht darin, dass die Sonde miniaturisiert und in das Unterhautfettgewebe implantiert werden kann. Wird die Sonde mit der Messzelle und der Referenzzelle in zuckerfreie Lösung gebracht, entsteht zwischen der Messzelle und der Referenzzelle eine Druckdifferenz von ca. 40 mbar, die auf die hydraulische Wirkung des Affinitätskomplexes zwischen den Concanavalin A-Molekülen und den Dextranmolekülen zurückzuführen ist. Diese Druckdifferenz vergrößert sich bei Erhöhung der Glucosekonzentration bis zur Sättigungskonzentration auf etwa 75 mbar, weil der Komplex dissoziiert und sich die Konzentration hydraulisch wirksamer Teilchen erhöht.
  (2)

1

nichtpermeabler Affinitätsrezeptor,

2

permeabler Analyt,

3

nicht permeabler Konkurrenzligand,

4

sensorische Flüssigphase,

5

semipermeable Membran,

6

Milieuphase,

7

Messvorrichtung.

8

Messzelle, als Hohlfasersegment ausgebildet

9

Referenzzelle, als Hohlfasersegment ausgebildet

10

Biegeplatte eines Drucksensors

11

Hohlfasermembran

12

Ventil

Claims (27)

1. Sensorisches Membran-Osmometer, bei dem – ein Affinitätsrezeptor (1) für einen Analyten (2) und ein mit dem Analyten (2) konkurrierender Affinitätsligand des Affinitätsrezeptors, der Konkurrenzligand (3), sich in einer sensorischen Flüssigphase (4) befinden, die durch eine semipermeable Membran (5) gegen eine zweite Flüssigphase, die Milieuphase (6), abgegrenzt ist, – die Membran für den Analyten (2) leicht durchlässig und für den Affinitätsrezeptor (1) sowie den Konkurrenzliganden (3) nicht durchlässig ist, – wenigstens einer der nicht permeablen Affinitätsbindungspartner (1 oder 3) nach der Auflösung der Affinitätsbindung zum anderen Partner hydraulisch an der Membran aufgrund seines osmotischen Partialdruckes wirksam ist, – eine Messvorrichtung (7) für eine Erfassung einer an der Membran zwischen den beiden Flüssigphasen (4 und 6) auftretenden Druckdifferenz oder eines durch die Membran zwischen den beiden Flüssigphasen auftretenden Volumenflusses vorhanden ist und – die Konzentration beider nicht permeabler Affinitätsbindungspartner (1 und 3) für die Erfassung des Dissoziations- oder Assoziationsprozesses an Hand der Druckdifferenz oder des Volumenflusses durch die semipermeable Membran ausreichend ist.
2. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die sensorische Flüssigphase (4) in einer membranbegrenzten Zelle, der Messzelle, befindet.
3. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die maximale Ausdehnung der sensorischen Flüssigphase (4) senkrecht zu Membran weniger als ein Millimeter beträgt.
4. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Affinitätsrezeptor (1) ein Protein, z.B. ein Immunglobulin, ein Lektin, Avidin oder Enzym ist.
5. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Affinitätsrezeptor (1) ein Polynucleotid ist.
6. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Affinitätsrezeptor (1) eine polymergebundene oder immobilisierte biogene oder künstliche Affinitätsbindungsdomäne, z.B. ein Oligonucleotid, ein Oligo- oder Polypeptid, ein Oligosaccharid, Cibachrom Blue oder ein anderer komplexer organischer Stoff mit Affinitätsbindungseigenschaften darstellt.
7. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem einer der nicht permeablen Affinitätsbindungspartner (1 oder 3) an unlösliche Partikeln oder einen porösen Festkörper gebunden ist.
8. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Teilchen der beiden nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner (1 und 3) jeweils nur einen Affinitätsbindungsort besitzen oder bei dem der nach der Lösung der Affinitätsbindung diffusible Affinitätsbindungspartner (1 oder 3) nur einen Affinitätsbindungsort pro Teilchen besitzt.
9. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem wenigstens einer der nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner (1 oder 3) zwei oder mehrere Affinitätsbindungsstellen pro Teilchen besitzt.
10. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 9, bei dem beide nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner (1 und 3) in der Messzelle zwei oder mehrere Affinitätsbindungsstellen pro Teilchen besitzen und in Abwesenheit des Analyten (2) in einer die Affinitätsbindung begünstigenden Milieuphase eine durch Affinitätsbindungen reversibel vernetzte viskose Netwerkflüssigkeit bilden.
11. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem mindestens einer der nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner ein diffusionsfähiger Polyelektrolyt ist.
12. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Messvorrichtung (7) ein elektronischer Druckwandler mit sensorischer Biegeplatte ist.
13. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 12, mit einer Vorrichtung zur Kompensation der osmotisch bedingten Spannungsänderung an der Biegeplatte und zur Messung der hierfür erforderlichen Gegenkräfte.
14. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 13 oder 14, bei dem die Biegeplatte an die Atmosphäre oder ein mit der Atmosphäre isobares Fluid grenzt.
15. Sensorisches Membran-Osmometer nach wenigstens einem der vorstehenden Ansprüche 12 bis 14, bei dem neben der Messzelle eine weitere membranbegrenzte Zelle, die Referenzelle, vorgesehen ist.
16. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 15, bei dem die Referenzelle die gleiche Größe, Gestalt, Membranfläche und Membranqualität wie die Messzelle besitzt.
17. Sensorisches Membran-Osmometer nach wenigstens einem der Ansprüche 15 oder 16, bei dem die Messzelle die sensorische Flüssigphase und die Referenzzelle eine andersartige Flüssigphase enthält, in der wenigstens einer der nicht permeablen Affinitätsbindungspartner (1 oder 3) nicht enthalten ist.
18. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 15 oder 16, bei dem die Messzelle und die Referenzzelle die nicht permeablen Affinitätsbindungspartner (1 und 3) in gleichen Konzentrationen enthalten.
19. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18, bei dem ein Drucksensor vorgesehen ist, der die Druckdifferenz zwischen der Referenzelle und der Messzelle erfasst.
20. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 19, bei dem die semipermeable Membran der Messzelle durch das Segment einer Mikrodialysefaser gebildet wird.
21. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 20, bei dem die Messzelle und die Referenzzelle als parallel angeordnete Mikrodialysefasersegmente ausgebildet sind.
22. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 20 oder 21, in dem die Messzelle an einem in das physiologische System implantierbaren Körper befestigt ist.
23. Osmotisches Messverfahren zur selektiven Messung der Konzentration eines Analyten mit Affinität zu einem Affinitätsrezeptor nach dem Prinzip des kompetitiven Affinitätsassays, bei dem – zwei Flüssigphasen (4 und 6) durch eine semipermeable Membran (5) getrennt werden, wobei eine dieser Flüssigphasen, die sensorische Flüssigphase (4), sowohl einen nichtpermeablen Affinitätsrezeptor (1) für den Analyten (2) als auch einen nichtpermeablen Konkurrenzliganden (3) enthält, und – der von der Konzentration des Analyten abhängige Ligandenaustausch zwischen dem Analyten (2) und dem Konkurrenzliganden (3) am Affinitätsrezeptor (1) an Hand der Veränderung der Druckdifferenz über die Membran oder des Volumenflusses durch die Membran gemessen wird.
24. Osmotisches Messverfahren nach Anspruch 23, bei dem der Affinitätsrezeptor (1), der Konkurrenzligand (3) und das Reaktionsmilieu einen reversiblen Ligandenaustausch zwischen dem Analyten (2) und dem Konkurrenzliganden (3) am Affinitätsrezeptor gewährleisten.
25. Osmotisches Messverfahren nach Anspruch 23, bei dem der eingesetzte Affinitätsrezeptor (1) durch eine praktisch irreversible Bindung des Analyten (2) und der eingesetzte Konkurrenzligand (3) durch eine reversible Bindung an den eingesetzten Affinitätsrezeptor im Messmilieu gekennzeichnet sind.
26. Osmotisches Messverfahren nach Anspruch 25, bei dem die sensorische Flüssigphase (4) nach erfolgter Messung durch Überführung in ein für die Dissoziation des Analyten (2) vom Affinitätsrezeptor (1) geeignetes analytfreies Reaktionsmilieu überführt und hierdurch die nächste Messung vorbereitet wird.
27. Osmotisches Messverfahren nach Anspruch 23, bei dem ein sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 22 eingesetzt wird.