WO2004083828A1 - Sensorisches membran-osmometer und osmotisches messverfahren zur quantitativen bestimmung niedermolekularer affinitätsliganden - Google Patents

Sensorisches membran-osmometer und osmotisches messverfahren zur quantitativen bestimmung niedermolekularer affinitätsliganden Download PDF

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WO2004083828A1
WO2004083828A1 PCT/EP2004/002470 EP2004002470W WO2004083828A1 WO 2004083828 A1 WO2004083828 A1 WO 2004083828A1 EP 2004002470 W EP2004002470 W EP 2004002470W WO 2004083828 A1 WO2004083828 A1 WO 2004083828A1
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membrane
sensory
affinity
permeable
analyte
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PCT/EP2004/002470
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Uwe Beyer
Rudolf Ehwald
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Disetronic Licensing Ag
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N7/00—Analysing materials by measuring the pressure or volume of a gas or vapour
    • G01N7/10—Analysing materials by measuring the pressure or volume of a gas or vapour by allowing diffusion of components through a porous wall and measuring a pressure or volume difference
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N13/00—Investigating surface or boundary effects, e.g. wetting power; Investigating diffusion effects; Analysing materials by determining surface, boundary, or diffusion effects
    • G01N13/04—Investigating osmotic effects

Definitions

  • Membrane osmometers in which. The osmotically induced pressure difference or an osmotically induced nolumen flow is measured over a semipermeable membrane, are known in various embodiments. They are usually used to measure the molar concentration of impermeable substances based on their osmotic partial pressure.
  • the known membrane osmometers provide reproducible and precise values, but are not selective, but react with comparable sensitivity with all substances whose molecules or particles are partially or completely excluded from the pore space of the semipermeable membrane and therefore unite when there is a concentration difference across the membrane Generate the volume flow of the liquid through the membrane or a pressure difference.
  • the object of the invention is to provide a sensory membrane osmometer and an osmotic measuring method which is suitable for the determination of low molecular weight analytes with high selectivity.
  • the essence of the invention consists in the provision of a membrane osmometer, by means of which the principle of the competitive affinity assay is used for the selective determination of the concentration of certain analytes.
  • the semipermeable membrane separates two liquid phases.
  • the sensory liquid phase contains an impermeable affinity receptor for the analyte and an impermeable competitive ligand which, like the analyte, is capable of one To form affinity complex with the affinity receptor.
  • the other liquid phase is referred to below as the milieu phase.
  • low-molecular substances on porous membranes as are usually used for membrane osmometers, have no or only a temporary hydraulic effect, while high-molecular particles that do not permeate through the membrane have a nolumen flow or generate a pressure difference. If a low-molecular permeable substance gets into one of the two liquid phases, it diffuses through the membrane and is distributed between the two liquid phases without producing a pressure difference or a volume flow. However, if the low molecular weight substance has sufficient affinity for the impermeable affinity receptor, it can, depending on its concentration, displace the non-permeable competitive ligand from the affinity receptor.
  • the dissociation of the competitive ligand from the affinity receptor causes a ner change of the osmotic partial pressure of the permeable components of the membrane osmometer according to the invention which is hydraulically effective on the membrane.
  • the membrane osmometer according to the invention accordingly functions as a selective sensor for those analytes which can easily permeate through the membrane and displace the competition ligand from the affinity complex.
  • the concentration equalization of the analyte between the sensory liquid phase and the milieu phase be achieved during the measurement time. It is favorable for a rapid adjustment of the diffusion equilibrium of the analyte between the sensory phase and the milieu phase if one of the two phases, preferably the sensory phase, is limited to a value below 1 mm with respect to its extent perpendicular to the membrane.
  • Particularly suitable for the sensory membrane osmometer according to the invention is the use of a membrane osmometer according to DE 197 14 586, in which the semipermeable membrane is represented by a hollow fiber segment.
  • the sensory liquid phase is located in a measuring cell, which is characterized by a very small ratio between its volume and the membrane surface (below 200 ⁇ m) and a very low value of the maximum diffusion distance.
  • An affinity receptor is a biopolyraer or an artificially produced impermeable complexing agent which has at least one binding site with affinity for a certain class of particles, the affinity ligands, and selectively binds them. Proteins, for example immunoglobulins, lectins, avidin, or enzymes and polynucleotides, for example DNA or SNA, are suitable as affinity receptors.
  • the affinity receptor can be a polymer-bound or immobilized biogenic or artificial affinity binding domain, for example an oligonucleotide, an oligo- or polypeptide, an oligosaccharide, Cibachrom Blue or another complex organic substance with affinity binding ability.
  • a prerequisite for the application of the invention is that a non-permeable competitor ligand is available which competes with the analyte in terms of affinity binding with the affinity receptor and can be displaced from the latter by the affinity complex with the affinity receptor. Since low molecular weight particles with the ability to bind affinity to a receptor can be enlarged by conjugation with a biogenic or artificial polymer without losing affinity, this requirement can also be met for those analytes for which no highly permeable competitive ligand is yet available.
  • the release of a competitor ligand from an affinity receptor by an analyte, which itself acts as the affinity ligand of the receptor, or the ligand exchange between an analyte and a competitor ligand is known to be used in various competitive affinity assays for the selective determination of numerous analytes.
  • the special feature of the method according to the invention is the signal formation. If the competitive affinity assay is carried out in the membrane osmometer according to the invention with the aid of the method according to the invention, the dissociation of the affinity complex between the affinity receptor and the competitor ligand caused by the analyte changes the hydraulic effect of the sensory liquid phase on the semipermeable membrane.
  • the dissociation or association of the complex between the affinity receptor and the competitor ligand, which is influenced by the analyte, is associated with a change in the osmotic partial pressure of the strongly permeable affinity binding agents or, if these form a network liquid in the sensory liquid phase, with one Enlargement of the hydraulic effect of the sensory liquid phase, which can be measured as a pressure change or volume change depending on the design of the membrane osmometer.
  • the reason that the affinity receptor or the competitor ligand are not permeable through the membrane can be the exceeding of a certain particle size or the immobilization on a solid.
  • a sufficiently high concentration of the diffusible, highly permeable affinity binding partner (s) in the sensory liquid phase and the complementary binding sites is essential for the function of the sensory membrane osmometer according to the invention.
  • the change in the osmotic partial pressure of the permeable and diffusible particles in the sensory liquid phase must be sufficient to achieve a well-measurable hydraulic effect on the membrane.
  • the concentration of the analyte is measured on the basis of the volume flow through the membrane or on the pressure difference across the semipermeable membrane.
  • the semipermeable membrane is used for signal generation. It can simultaneously represent the interface between the sensory liquid phase and the milieu phase potentially containing the analyte in the concentration to be detected.
  • the selection of the permeable affinity binding partners is important for the method according to the invention. It is important that the permeable analyte displaces the non-permeable competitor ligand from the affinity receptor during the measuring time or that the equilibrium of the ligand exchange is established during the measuring time.
  • the affinity constant for the binding of the competitor ligand to the affinity receptor must not be so high that the affinity binding is practically irreversible, and it must be high enough to ensure that, in the absence of the analyte, a large part of the non-permeable affinity binding partners at approximately the same concentration of complementary binding sites in the form of the affinity complex.
  • the Competitive strength of the analyte and the competitive ligand is known to be expressed in accordance with the law of mass action by the respective affinity constants or dissociation constants, from which the rate constant of the dissociation can also be estimated.
  • finely dispersed, particulate affinity receptors or ligands or affinity binding partners bound to a porous solid body can be used if a sufficient volume concentration of affinity binding sites can be achieved with this. If the affinity receptor or the competitor ligand is in a concentration sufficient for the measurement process in a porous solid matrix within the dialysis cell, e.g. porous glass, the affinity complex with the respective diffusible, non-permeable affinity binding partner is hydraulically completely ineffective. In this case, the diffusible, non-permeable affinity binding partners released by ligand exchange only contribute to the pressure difference or to the volume flow on the sipmiperrneabble membrane.
  • the sensory liquid phase with the affinity receptor and the competitor ligand can contain a network liquid of the affinity binding partners cross-linked by affinity bonds, the osmotic pressure or the volume of this network liquid depending on the analyte concentration. Since some of the osmotic forces are neutralized by the crosslinking affinity bonds between the affinity receptor and the competitor ligand, the hydraulic effect on the semipermeable membrane increases when the sensory liquid phase is enclosed in a measuring cell with limited volume and the affinity bonds dissociate with the analyte by ligand exchange. In order to obtain a network liquid in the measuring cell, the ligand exchange in the measuring cell of the membrane osmometer can be used.
  • a sufficiently concentrated sol which contains crosslinkable, non-permeable polymeric affinity binding partners with several affinity binding sites per particle, can be produced, as is known, in that the solvent has an ionic composition which is unfavorable for the affinity binding or contains a monovalent low-molecular affinity ligand.
  • the low molecular weight analyte generally has only one affinity binding site per Particles. If the concentration is sufficient, it can therefore generally prevent crosslinking by displacing the competitor ligand from its affinity binding.
  • the sol is filled with the cross-linkable, impermeable affinity binding partners in the measuring cell with the semipermeable membrane and this is transferred into an analyte-free milieu phase suitable for affinity binding, a network fluid is created in the measuring cell, the pressure of which acts on the semipermeable membrane. If the analyte is added to the milieu phase in different concentrations, the hydraulic effect on the membrane increases. With a saturating analyte concentration, the maximum pressure difference is measured.
  • the sensitivity of the sensory membrane osmometer can be increased in that at least one of the non-permeable affinity binding partners is a diffusible impermeable polyelectrolyte with a high charge density and the ionic strength in the milieu phase is low.
  • the non-permeable polymer particles not only the non-permeable polymer particles but also the counterions sorbed on them act hydraulically on the membrane.
  • the colloid osmotic partial pressure of the polyelectrolyte particles released by the ligand exchange exceeds the value which, according to Vant Hoff's law, results from the molar concentration change of the polyelectrolyte particles.
  • the ligand exchange takes place quickly at the affinity receptor.
  • the affinity of the competitive ligand on the affinity receptor must not be very high (dissociation constant above 10 nM). If the affinity of the affinity receptor for the analyte is also relatively low, the binding equilibrium between the affinity ligands and the affinity receptors is established quickly even after the analyte concentration has been reduced. If a reversible ligand exchange is ensured in this way, the sensory membrane osmometer can be used for continuous measurement processes at relatively high analyte concentrations (over 0.1 mM).
  • the affinity receptor for the analyte With a high affinity of the affinity receptor for the analyte and a relatively low affinity for the enclosed polymeric affinity ligand, very low analyte concentrations can be detected with the sensory membrane osmometer because the affinity ligand accumulates in the sensory liquid phase through the affinity binding and the volume of the sensory liquid phase can be kept very small when using hollow fiber segments as a measuring cell.
  • the analyte has a high affinity, it is known that its binding to the affinity receptor is practically irreversible. Nevertheless, the sensory membrane osmometer according to the invention can also be used in this case for repeated measurements.
  • the affinity of the receptor for the analyte can be reversibly reduced by several orders of magnitude by changing the pH, the ionic strength or organic additives.
  • the analyte is replaced by transferring the sensory liquid phase into a dissociation-promoting environment.
  • Pressure transducers with a deformable bending plate are particularly suitable as a measuring device for recording the hydraulic effect of the ligand exchange. If the sensory liquid phase is enclosed in the hollow fiber segment and the milieu phase is under atmospheric pressure, the pressure transducer measures, for example, the pressure difference between the measuring cell enclosing the hollow fiber segment and the atmosphere and thus detects the pressure difference across the semipermeable membrane.
  • a reference cell is provided in addition to the measuring cell, which corresponds to the measuring cell in terms of the quality and surface of the semipermeable membrane and in terms of size and shape.
  • the pressure sensor can be arranged such that it detects the pressure difference between the reference cell and the measuring cell, both cells bordering on the same milieu phase.
  • the reference cell can contain the same sensory liquid phase as the measuring cell and can be used to measure the reference pressure in a reference solution. This enables the analyte concentration in the reference solution to be compared with the analyte concentration in the milieu phase.
  • the reference cell can be made insensitive to the analyte by filling it with a liquid which at least one of the non-permeable affinity binding partners is missing.
  • This embodiment has the advantage that the non-specific osmotic effects of the environment are compensated for. With this arrangement e.g. the colloid-osmotic effects of proteins and polyanions, which make the pressure difference on the semipermeable membrane dependent on the ion concentration of the medium and on the concentration of the proteins and polyanions, are balanced.
  • the measuring cell and the reference cell can be designed as hollow fiber segments arranged in parallel and closed at the end, which communicate with the two surfaces of the bending plate of the pressure transducer. This compensates for possible pressure gradients in the milieu phase, which are caused by gravity or currents.
  • the parallel arrangement of the two hollow fiber segments also offers the advantage that the entire membrane surface on a needle-like Probe can be accommodated. The latter can be introduced into a very small volume of liquid or into living tissue.
  • the sensory membrane osmometer can be provided with a pressure measuring device in which the osmotically induced voltage changes on the deformable membrane of the pressure transducer are compensated [cf. e.g. Ser. 102 15 621.2 and Wang, Y, Esashi, M .: The structures for electrostatic servo capacitive vacuum sensors. Sensors and Actuators A 66 (1998) 213-217]. In this case, the counterforces required to maintain a constant tension on the membrane of the pressure transducer are measured.
  • This version of the sensory membrane osmometer has the advantage of a slight delay in setting the osmotic equilibrium even with a very small membrane area, since the pressure transducer requires a very low volume flow for the actual measuring process.
  • the sensory membrane osmometer consists of a measuring cell (8), a reference cell (9) and a pressure sensor, the bending plate (10) of which lies between the two cells.
  • the measuring cell (8) and the reference cell (9) are segments of the same length of a dialysis hollow fiber with a membrane (11) made of regenerated cellulose with high hydraulic conductivity, high volume elasticity modulus and sharp cut-off with a Stokes radius of 2-3 nm, which are glued on a steel support and closed at the tip. They are filled with various liquids from the rear via valves (12).
  • a solution of concanavalin A (40 mg / ml) and dextran 8 (Serva) with an average molecular weight of 8 kDa (16 mg / ml) in a suitable electrolyte (5 mM NaHCO 3 , 2 mM) is located in the measuring cell as the sensory liquid phase , CaCl 2 , 2 mM MnCl 2 , 50 mM NaCl, pH 7.2).
  • the polymer-free electrolyte solution is located in the reference cell.
  • the arrangement shown has the advantage that the osmotic effects of non-permeable components of the milieu phase are compensated for.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Membran-Osmometer, das für die quantitative Bestimmung von Analyten, die niedermolekulare Affinitätsliganden eines hochmolekularen Affinitätsrezeptors darstellen, geeignet ist, und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung derartiger Analyte. Das erfindungsgemässe Verfahren stellt eine vorteilhafte Form des kompetitiven Affinitätsassays dar. Es zeichnet sich dadurch aus, dass die semipermeable Membran des erfindungsgemässen Membranosmometers als Signalgenerator und als Interface zur Milieuphase genutzt wird. In dem erfindungsgemässen sensorischen Membran-Osmometer befindet sich die semipermeable Membran (5) zwischen einer sensorischen Flüssigphase (4) und einer Milieuphase (6). Erfindungsgemäss befinden sich ein nichtpermeabler Affinitätsrezeptor (1) und ein nicht permeabler Konkurrenzligand (3) in der sensorischen Flüssigphase (4), und die Membran (5) ist für den Analyten (2) permeabel. Erfindungsgemäss wird der osmotische Partialdruck der nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner (1) und (3) oder der hydraulische Effekt der Affinitätsbindungen zwischen den nichtpermeablen Affinitätsbindungspartnern (1) und (3) in einer Netzwerkflüssigkeit als Mass der Analytkonzentration erfasst. Hierzu dient eine Messvorrichtung (7) für die Messung der Druckdifferenz über die semipermeable Membran (5) oder des Volumenflusses durch die semipermeable Membran (5).

Description

Sensorisches Membran-Osmometer und osmotisches Messverfahren zur quantitativen Bestimmung niedermolekularer Affinitätsliganden
Membran-Osmometer, bei denen . die osmotisch bedingte Druckdifferenz oder ein osmotisch bedingter Nolumenfluss über eine semipermeable Membran gemessen wird, sind in verschiedenen Ausfuhrungsformen bekannt. Üblicherweise werden sie eingesetzt, um die molare Konzentration von nicht permeablen Stoffen an Hand ihres osmotischen Partialdrucks zu messen. Die bekannten Membran-Osmometer liefern reproduzierbare und genaue Werte, sind jedoch nicht selektiv, sondern reagieren mit vergleichbarer Empfindlichkeit mit allen Stoffen, deren Moleküle bzw. Teilchen vom Porenraum der semipermeablen Membran teilweise oder vollkommen ausgeschlossen werden und daher bei Norliegen einer Konzentrationsdifferenz über die Membran einen Nolumenfluss der Flüssigkeit durch die Membran bzw. eine Druckdifferenz generieren.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein sensorisches Membran-Osmometer und ein osmotisches Messverfahren bereitzustellen, das für die Bestimmung niedermolekularer Analyte mit hoher Selektivität geeignet ist. Die Lösung der Aufgabe ist aus den Erfmdungsansprüchen ersichtlich.
Das Wesen der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Membran-Osmometers, mit dessen Hilfe das Prinzip des kompetitiven Affimtatsassays zur selektiven Erfassung der Konzentration bestimmter Analyte ausgenutzt wird. In dem erfindungsgemäßen sensitiven Membran-Osmometer trennt wie bei jedem Membran-Osmometer die semipermeable Membran zwei Flüssigphasen. Eine dieser Phasen, die sensorische Flüssigphase, enthält erfindungsgemäß einen impermeablen Affimtatsrezeptor für den Analyten sowie einen impermeablen Konkurrenzliganden, der ebenso wie der Analyt in der Lage ist, einen Affmitätskomplex mit dem Affinitätsrezeptor zu bilden. Die andere Flüssigphase wird im folgenden als Milieuphase bezeichnet. Für die Funktion des sensitiven Membran- Osmometers ist wesentlich, dass niedermolekulare Stoffe an porösen Membranen, wie sie für Membran-Osmometer üblicherweise eingesetzt werden, keine oder nur eine vorübergehende hydraulische Wirkung ausüben, während hochmolekulare Teilchen, die nicht durch die Membran permeieren, einen Nolumenfluss oder eine Druckdifferenz erzeugen. Gelangt ein niedermolekularer permeabler Stoff in eine der beiden Flüssigphasen, diffundiert er durch die Membran und verteilt sich zwischen den beiden Flüssigphasen, ohne eine Druckdifferenz oder einen Nolumenfluss zu erzeugen. Besitzt der niedermolekulare Stoff jedoch eine ausreichende Affinität zum impermeablen Affinitätsrezeptor, kann er in Abhängigkeit von seiner Konzentration den nicht permeablen Kohkurrenzliganden vom Affinitätsrezeptor verdrängen. Die Dissoziation des Konkurrenzliganden vom Affinitätsrezeptor bewirkt eine hydraulisch an der Membran wirksame Neränderung des osmotischen Partialdruckes der mchtpermeablen Komponenten des erfindungsgemäßen Membran-Osmometers. Das erfindungsgemäße Membran- Osmometer fungiert dementsprechend als selektiver Sensor für solche Analyte, die leicht durch die Membran permeieren und den Konkurrenzliganden aus dem Affmitätskomplex verdrängen können.
Für die Funktion des erfindungsgemäßen Membran-Osmometers ist es notwendig, dass in der Messzeit der Konzentrationsausgleich des Analyten zwischen der sensorischen Flüssigphase und der Milieuphase erreicht wird. Günstig für eine schnelle Einstellung des Diffusionsgleichgewichtes des Analyten zwischen der sensorischen Phase und der Milieuphase ist es, wenn eine der beiden Phasen, vorzugsweise die sensorische Phase, hinsichtlich ihrer Ausdehnung senkrecht zur Membran auf einen Wert unter 1 mm begrenzt wird. Besonders geeignet für das erfindungsgemäße sensorische Membran-Osmometer ist die Verwendung eines Membran-Osmometers nach DE 197 14 586, in dem die semipermeable Membran durch ein Hohlfasersegment repräsentiert ist. Dabei befindet sich die sensorische Flüssigphase in einer Messzelle, die sich durch ein sehr kleines Verhältnis zwischen ihrem Volumen und der Membranoberfläche (unter 200 μm) und einen sehr geringen Wert der maximalen Diffusionsstrecke auszeichnet. Als Affinitätsrezeptor wird ein Biopolyrαer oder ein künstlich hergestellter nicht permeabler Komplexbildner bezeichnet, der mindestens eine Bindungsstelle mit Affinität zu einer bestimmten Klasse von Teilchen, den Affinitätsliganden, aufweist und diese selektiv bindet. Als Affinitätsrezeptoren kommen Proteine, z.B. Immuriglobuline, Lektine, Avidin, oder Enzyme sowie Polynucleotide, z.B. DNA oder SNA in Frage. Ausserde kann der Affimtatsrezeptor eine polymergebundene oder immobilisierte biogene oder künstliche Affinitätsbindungsdomäne, z.B. ein Oligonucleotid, ein Oligo- oder Polypeptid, ein Oligosaccharid, Cibachrom Blue oder ein anderer komplexer organischer Stoff mit Affmitätsbindungsfähigkeit sein.
Eine Voraussetzung für die Anwendung der Erfindung besteht darin, dass ein nicht permeabler Konkurrenzligand verfügbar ist, der mit dem Analyten hinsichtlich der Affmitätsbindung mit dem Affinitätsrezeptor konkurriert und von diesem aus dem Affinitätskomplex mit dem Affirύtätsrezeptor verdrängt werden kann. Da niedermolekulare Teilchen mit der Fähigkeit zur Affinitätsbindung an einen Rezeptor durch Konjugation mit einem biogenen oder künstlichen Polymer vergrößert werden können, ohne die Affinität zu verlieren, ist diese Voraussetzung auch für solche Analyte erfüllbar, für die noch kein mchtpermeabler Konkurrenzligand verfügbar ist. Die Freisetzung eines Konkurrenzliganden von einem Affimtatsrezeptor durch einen Analyten, der selbst als Affinitätsligand des Rezeptors fungiert, bzw. der Ligandenaustausch zwischen einem Analyten und einem Konkurrenzliganden wird bekanntlich bereits in verschiedenen kompetitiven Affimtatsassays zur selektiven Bestimmung zahlreicher Analyte genutzt. Die Besonderheit des erfindungsgerαäßen Verfahrens besteht in der Signalbildung. Wird der kompetitive Affmitätsassay in dem erfindungsgemäßen Membran- Osmometer mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt, verändert die durch den Analyten bewirkte Dissoziation des Affinitätskomplexes zwischen dem Affinitätsrezeptor und dem Konkurrenzliganden die hydraulische Wirkung der sensorischen Flüssigphase an der semipermeablen Membran. Die durch den Analyten beeinflusste Dissoziation oder Assoziation des Komplexes zwischen dem Affimtatsrezeptor und dem Konkurrenzliganden ist mit einer Veränderung des osmotischen Partialdruckes der mchtpermeablen Affinitätsbindungs artner oder, wenn diese eine Netzwerkfiüssigkeit in der sensorischen Flüssigphase bilden, mit einer Vergrößerung des hydraulischen Effekts der sensorischen Flüssigphase verbunden, die sich je nach Konstruktion des Membran-Osmometers als Druckänderung oder Volumenänderung messen lässt.
Die Ursache dafür, dass der Affinitätsrezeptor oder der Konkurrenzligand nicht durch die Membran permeabel sind, kann das Überschreiten einer bestimmten Teilchengröße oder die Immobilisierung an einem Feststoff sein. Für die Funktion des erfindungsgemäßen sensorischen Membran-Osmometers ist es ausreichend, wenn einer der nicht permeablen Affinitätsbindungspartner nach der Auflösung des Affinitätskomplexes in der Flüssigphase diffusibel ist und damit osmotisch an der semipermeablen Membran wirksam wird.
Für die Funktion des erfindungsgemäßen sensorischen Membran-Osmometers ist eine ausreichend hohe Konzentration der/des diffusiblen mchtpermeablen Affimtätsbindungspartner/s in der sensorischen Flüssigphase und der komplementären Bindungsstellen wesentlich. Die Veränderung des osmotischen Partialdruckes der mchtpermeablen und diffusiblen Teilchen in der sensorischen Flüssigphase muss ausreichen, um eine gut messbare hydraulische Wirkung an der Membran zu erzielen. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Konzentration des Analyten an Hand des Volumenflusses durch die Membran oder an der Druckdifferenz über die semipermeable Membran gemessen. Die semipermeable Membran dient demnach zur Signalbildung. Sie kann gleichzeitig das Interface zwischen der sensorischen Flüssigphase und der potentiell den Analyten in der zu erfassenden Konzentration enthaltenden Milieuphase darstellen.
Für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Auswahl der mchtpermeablen Affinitätsbindungspartner bedeutsam. Es ist wichtig, dass der permeable Analyt den nicht permeablen Konkurrenzliganden in der Messzeit vom Affinitätsrezeptor verdrängt bzw. dass sich das Gleichgewicht des Ligandenaustausches in der Messzeit einstellt. Die Affinitätskonstante für die Bindung des Konkurrenzliganden am Affinitätsrezeptor darf nicht so hoch sein, dass die Affinitätsbindung praktisch irreversibel ist, und sie muss hoch genug sein, um zu gewährleisten, dass in Abwesenheit des Analyten ein großer Teil der nicht permeablen Affinitätsbindungspartner bei annähernd gleicher Konzentration der komplementären Bindungsstellen in der Form des Affinitätskomplexes vorliegt. Die Konkurrenzstärke des Analyten und des Konkurrenzliganden wird bekanntlich nach dem Massenwirkungsgesetz durch die jeweiligen Affinitätskonstanten oder Dissoziationskonstanten ausgedrückt, aus denen sich auch die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation abschätzen lässt.
Erfmdungsgemäß können feindisperse, partikuläre Affinitätsrezeptoren bzw. -liganden oder an einen porösen Festkörper gebundene Affinitätsbindungspartner eingesetzt werden, wenn hiermit eine ausreichende Volumenkonzentration von Affinitätsbindungsorten erreicht werden kann. Befindet sich der Affinitätsrezeptor oder der Konkurrenzligand in einer für den Messvorgang ausreichenden Konzentration in einer porösen Feststoffinatrix innerhalb der Dialysezelle, z.B. porösem Glas, ist der Affinitätskomplex mit dem jeweiligen diffusiblen nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner hydraulisch vollkommen unwirksam. In diesem Fall tragen erst die durch Ligandenaustausch freigesetzten diffusiblen nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner an der sβmiperrneablβn Membran zur Druckdifferenz oder zum Volumenfluss bei.
Erfmdungsgemäß kann die sensorische Flüssigphase mit dem Affinitätsrezeptor und dem Konkurrenzliganden eine Netzwerkflüssigkeit der durch Affinitätsbindungen vernetzten Affinitäsbindungspartner enthalten, wobei der osmotische Druck oder das Volumen dieser Netzwerkflüssigkeit von der Analytkonzentration abhängen. Da ein Teil der osmotischen Kräfte durch die vernetzenden Affinitätsbindungen zwischen dem Affinitätsrezeptor und dem Konkurrenzliganden neutralisiert wird, steigt der hydraulische Effekt an der semipermeablen Membran, wenn die sensorische Flüssigphase in einer Messzelle mit begrenztem Volumen eingeschlossen ist und die Affinitätsbindungen durch Ligandenaustausch mit dem Analyten dissoziieren. Um eine Netzwerkflüssigkeit in der Messzelle zu erhalten, kann der Ligandenaustausch in der Messzelle des Membran- Osmometers ausgenutzt werden. Ein für ausreichend konzentriertes Sol, das vemetzungsfähige nichtpermeable polymere Affinitätsbindungspartner mit mehreren Affinitätsbindungsstellen pro Teilchen enthält, lässt sich bekanntlich dadurch herstellen, dass das Lösungsmittel eine für die Affinitätsbindung ungünstige Ionenzusammensetzung aufweist oder einen monovalenten niedermolekularen Affinitätsliganden enthält. Der niedermolekulare Analyt besitzt im allgemeinen nur eine Affinitätsbindungsstelle pro Teilchen. Er kann daher im allgemeinen bei ausreichender Konzentration die Vernetzung verhindern, indem er den Konkurrenzliganden aus seiner Affinitätsbindung verdrängt. Füllt man das Sol mit den vernetzungsfähigen unpermeäblen Affinitätsbindungsp artnern in die Messzelle mit der semipermeablen Membran und überführt diese in eine für die Affinitätsbindung geeignete analytfreie Milieuphase, entsteht in der Messzelle eine Netzwerkflüssigkeit, deren Druck an der semipermeablen Membran wirksam wird. Setzt man der Milieuphase den Analyten in unterschiedlichen Konzentrationen zu, steigt der hydraulische Effekt an der Membran. Bei einer sättigenden Analytkonzentration wird die maximale Druckdifferenz gemessen.
Die Empfindlichkeit des sensorischen Membran-Osmometers kann dadurch gesteigert werden, dass mindestens einer der nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner ein diffusibler impermeabler Polyelektrolyt mit hoher Ladungsdichte ist und die Ionenstärke in der Milieuphase gering ist. In diesem Fall wirken nicht nur die nichtpermeablen Polymerteilchen sondern auch die an ihm sorbierten Gegenionen hydraulisch auf die Membran. Der kolloidosmotische Partialdruck der durch den Ligandenaustausch freigesetzten Polyelektrolyt-Teilchen übersteigt bekanntlich den Wert, der sich nach dem Vant Hoffschen Gesetz aus der molaren Konzentrationsänderung der Polyelektrolyt- Teilchen ergibt.
Für die Anwendung des erfindungsgemäßen sensorischen Membran-Osmometers in einem on-line-Sensor ist es günstig, wenn der Ligandenaustausch am Affinitätsrezeptor schnell erfolgt. Hierzu darf bekanntlich die Affinität des Konkurrenzliganden am Affinitätsrezeptor nicht sehr hoch sein (Dissoziationskonstante über 10 nM). Ist die Affinität des Affinitätsrezeptors für den Analyten ebenfalls verhältnismäßig gering, stellt sich das Bindungsgleichgewicht zwischen den Affinitätsliganden und den Affinitätsrezeptoren auch nach Reduktion der Analytkonzentration schnell ein. Wird auf diese Weise ein reversibler Ligandenaustausch gewährleistet, ist das sensorische Membran-Osmometer bei relativ hohen Analytkonzentrationen (über 0.1 mM) für kontinuierliche Messvorgänge einsetzbar. Ein wichtiger Anwendungsfall für den kompetitiven Affinitätsassay mit reversiblem und schnell verlaufendem Ligandenaustausch ist bekanntlich die Messung der Glucosekonzentration mit dem pflanzlichen Rezeptorprotein Concanavalin A. Diese Anwendung wird in den viskosimetrischen und optischen Affinitätssensoren für Glucose im Blut und in der mterstitiellen Flüssigkeit realisiert [z.B. DE 197 14 087]. Für den Einsatz des erfindungsgemäßen sensorischen Membran-Osmometers zur Glucosebestimmung bestehen günstige Voraussetzungen, weil Concanavalin A in wässrigen Pufferlösungen langzeitstabil und in Konzentrationen bis zu 4 mM löslich ist [Kim J. J., Park, K. (2001) Pharmaceutical Research 18, 794-799]. Außerdem stehen verschiedene monovalente polymere Affinitätsbindungspartner für Concanavalin A, z.B. das monovalente Insulin sowie polyvalente Affinitätsbindungspartner wie Dextran in verschieden Molekülgrößen zur Verfügung. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen sensorischen Membran-Osmometers gegenüber den bisher bekannten kompetitiven Affinitätssensoren für Glucose auf der Basis von Concanavalin A besteht in dem einfachen Signalwandlungsprinzip .
Bei einer hohen Affinität des Affinitätsrezeptors für den Analyten und einer verhältnismäßig geringen Affinität für den eingeschlossenen polymeren Affinitätsliganden können sehr geringe Analytkonzentrationen mit dem sensorischen Membran-Osmometer erfasst werden, weil sich der Affinitätsligand in der sensorischen Flüssigphase durch die Affinitätsbindung anreichert und das Volumen der sensorischen Flüssigphase bei Verwendung von Hohlfasersegmenten als Messzelle sehr klein gehalten werden kann. Allerdings ist bei einer hohen Affinität des Analyten dessen Bindung an den Affinitätsrezeptor bekanntlich praktisch nicht reversibel. Dennoch kann das erfindungsgemäße sensorische Membran-Osmometer auch in diesem Fall für wiederholte Messungen eingesetzt werden. Um die Ablösung des Analyten vom Affinitätsrezeptor zu bewirken, kann die Affinität des Rezeptors für den Analyten durch Veränderung des pH- Wertes, der Ionenstärke oder organischer Zusätze reversibel um mehrere Größenordnungen herabgesetzt werden. Vor jeder neuen Nutzung wird hierzu der Analyt durch Überführung der sensorische Flüssigphase in ein dissoziationsförderndes Milieu abgelöst. Als Messvorrichtung zur Erfassung der hydraulischen Wirkung des Ligandenaustauscb.es sind Druckwandler mit deformierbarer Biegeplatte besonders geeignet. Wenn die sensorische Flüssigphase in dem Hohlfasersegment eingeschlossen wird und die Milieuphase unter Atmosphärendruck steht, misst der Druckwandler beispielsweise die Druckdifferenz zwischen der das Hohlfasersegment einschließenden Messzelle und der Atmosphäre und erfasst damit die Druckdifferenz über die semipermeable Membran.
In einer vorteilhaften Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen sensorischen Membran- Osmometers ist neben der Messzelle eine Referenzzelle, welche mit der Messzelle in Bezug auf die Qualität und Oberfläche der semipermeablen Membran sowie in Bezug auf die Größe und die Form übereinstimmt, vorgesehen. Erfindungsgemäß kann der Drucksensor so angeordnet werden, dass er die Druckdifferenz zwischen der Referenzzelle und der Messzelle erfasst, wobei beide Zellen an die gleiche Milieuphase grenzen. Die Referenzzelle kann die gleiche sensorische Flüssigphase enthalten wie die Messzelle und zur Messung des Referenzdruckes in einer Referenzlösung eingesetzt werden. Dies ermöglicht den Vergleich der Analytkonzentration in der Referenzlösung mit der Analytkonzentration in der Milieuphase. Die Referenzzelle kann andererseits Irinsichtlich des Analyten unempfindlich gestaltet werden, indem sie mit einer Flüssigkeit gefüllt wird, welcher mindestens einer der nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner fehlt. Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass die unspezifischen osmotischen Effekte des Milieus kompensiert werden. Mit dieser Anordnung können z.B. die kolloid-osmotischen Effekte von Proteinen und Polyanionen, welche die Druckdifferenz an der semipermeablen Membran von der Ionenkonzentration des Mediums und von der Konzentration der Proteine und Polyanionen abhängig machen, ausgeglichen werden.
Die Messzelle und die Referenzelle können als parallel angeordnete und am Ende verschlossene Hohlfasersegmente gestaltet werden, die mit den beiden Flächen der Biegeplatte des Druckwandlers kommunizieren. Hierdurch werden mögliche Druckgradienten in der Milieuphase kompensiert, die durch die Schwerkraft oder Strömungen zustande kommen. Die Parallelanordnung der beiden Hohlfasersegmente bietet außerdem den Vorteil, dass die gesamte Membranfläche auf einer nadelähnlichen Sonde untergebracht werden kann. Letztere ist in ein sehr kleines Flüssigkeitsvolumen oder in lebendes Gewebe einführbar.
Erfindungsgemäß kann das sensorische Membran-Osmometer mit einer Druckmessvorrichtung versehen werden, bei welcher die osmotisch bedingten Spannungsänderungen an der deformierbaren Membran des Druckwandlers kompensiert werden [vgl. z.B. Anmelde-Nr. 102 15 621.2 und Wang, Y, Esashi, M.: The structures for electrostatic servo capacitive vacuum sensors. Sensors and Actuators A 66 (1998) 213- 217]. In diesem Fall werden die zur Aufrechterhaltung einer konstanten Spannung an der Membran des Druckwandlers erforderlichen Gegenkräfte gemessen. Diese Ausführung des sensorischen Membran-Osmometers hat den Vorteil einer geringen Verzögerung bei der Einstellung des osmotischen Gleichgewichtes selbst bei sehr geringer Membranfläche, da der Druckwandler für den eigentlichen Messprozess einen sehr geringen Volumenfluss erfordert.
Anwendungsbeispiel
Das sensorische Membran-Osmometer besteht aus einer Messzelle (8), einer Referenzzelle (9) und einem Drucksensor, dessen Biegeplatte (10) zwischen den beiden Zellen liegt. Als Messzelle (8) und als Referenzzelle (9) dienen gleich lange Segmente einer Dialyse- Hohlfaser mit einer Membran (11) aus regenerierter Zellulose mit hoher hydraulischer Leitfähigkeit, hohem Volumen-Elastizitätsmodulus und scharfem Cut-off bei einem Stokesschen Radius von 2-3 nm, die auf einem Stahlträger aufgeklebt und an der Spitze verschlossen sind. Sie werden von hinten über Ventile (12) mit verschiedenen Flüssigkeiten gefüllt. In der Messzelle befindet sich als sensorische Flüssigphase eine Lösung von Concanavalin A (40 mg/ml) und Dextran 8 (Serva) mit einem mittleren Molekulargewicht von 8 kDa (16 mg/ml) in einem geeigneten Elektrolyten (5 mM NaHCO3, 2 mM, CaCl2, 2 mM MnCl2, 50 mM NaCl, pH 7.2). In der Referenzzelle befindet sich die polymerfreie Elektrolytlösung. Die dargestellte Anordnung hat den Vorteil, dass die osmotischen Wirkungen nicht permeabler Komponenten der Milieuphase kompensiert werden. Beispielsweise ergibt sich keine Änderung der Druckdifferenz, wenn die Sonde mit der Messzelle und der Referenzzelle aus einer polymerfreien Elektrolytlösung in eine Polymerlösung überführt wird. Ein weiterer Vorteil der dargestellten Anordnung besteht darin, dass die Sonde miniaturisiert und in das Unterhautfettgewebe implantiert werden kann. Wird die Sonde mit der Messzelle und der Referenzzelle in zuckerfreie Lösung gebracht, entsteht zwischen der Messzelle und der Referenzzelle eine Druckdifferenz von ca. 40 mbar, die auf die hydraulische Wirkung des Affinitätskomplexes zwischen den Concanavalin A-Molekülen und den Dextranmolekülen zurückzuführen ist. Diese Druckdifferenz vergrößert sich bei Erhöhung der Glucosekonzentration bis zur Sättigungskonzentration auf etwa 75 mbar, weil der Komplex dissoziiert und sich die Konzentration hydraulisch wirksamer Teilchen erhöht. (Figur 2)
Bezugszeichenliste
1 mchtpermeabler Affinitätsrezeptor,
2 permeabler Analyt,
3 nicht permeabler Konkurrenzligand,
4 sensorische Flüssigphase,
5 semipermeable Membran,
6 Milieuphase,
7 Messvorrichtung.
8 Messzelle, als Hohlfasersegment ausgebildet
9 Referenzzelle, als Hohlfasersegment ausgebildet
10 Biegeplatte eines Drucksensors
11 Hohlfasermembran
12 Ventil

Claims

Ansprüche
1. Sensorisches Membran-Osmometer, dadurch gekennzeichnet, dass
- . ein Affinitätsrezeptor (1) für einen Analyten (2) und ein mit dem Analyten (2) konkurrierender Affmitätsligand des Affinitätsrezeptors, der Konkurrenzligand (3), sich in einer sensorischen Flüssigphase (4) befinden, die durch eine semipermeable Membran (5) gegen eine zweite Flüssigphase, die Milieuphase (6), abgegrenzt ist,
- die Membran für den Analyten (2) leicht durchlässig und für den Affinitätsrezeptor (1) sowie den Konkurrenzliganden (3) nicht durchlässig ist,
- wenigstens einer der nicht permeablen Affimtätsbindungspartner (1 oder 3) nach der Auflösung der Affinitätsbindung zum anderen Partner hydraulisch an der Membran aufgrund seines osmotischen Partialdruckes wirksam ist, eine Messvorrichtung (7) für eine Erfassung einer an der Membran zwischen den beiden Flüssigphasen (4 und 6) auftretenden Druckdifferenz oder eines durch die Membran zwischen den beiden Flüssigphasen auftretenden Volumenflusses vorhanden ist und die Konzentration beider nicht permeabler Affinitätsbindungspartner (1 und 3) für die Erfassung des Dissoziations- oder Assoziationsprozesses an Hand der Druckdifferenz oder des Volumenflusses durch die semipermeable Membran ausreichend ist.
2. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die sensorische Flüssigphase (4) in einer membranbegrenzten Zelle, der Messzelle, befindet.
3. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die maximale Ausdehnung der sensorischen Flüssigphase (4) senkrecht zu Membran weniger als ein Millimeter beträgt.
4. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Affinitätsrezeptor (1) ein Protein, z.B. ein Immunglobulin, ein Lektin, Avidin oder Enzym ist.
5. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Affinitätsrezeptor (1) ein Polynucleotid ist.
6. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Affinitätsrezeptor (1) eine polymergebundene oder immobilisierte biogene oder künstliche Affinitätsbindungsdomäne, z.B. ein Oligonucleotid, ein Oligo- oder Polypeptid, ein Oligosaccharid, Cibachrom Blue oder ein anderer komplexer organischer Stoff mit Affinitätsbindungseigenschaften darstellt.
7. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem einer der nicht permeablen Affinitätsbindungspartner (1 oder 3) an unlösliche Partikeln oder einen porösen Festkörper gebunden ist.
8. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Teilchen der beiden nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner (1 und 3) jeweils nur einen Affinitätsbindungsort besitzen oder bei dem der nach der Lösung der Affinitätsbindung diffusible Affinitätsbindungspartner (1 oder 3) nur einen Affinitätsbindungsort pro Teilchen besitzt.
9. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem wenigstens einer der nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner (1 oder 3) zwei oder mehrere Affinitätsbindungsstellen pro Teilchen besitzt.
10. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 9, bei dem beide nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner (1 und 3) in der Messzelle zwei oder mehrere Affinitätsbindungsstellen pro Teilchen besitzen und in Abwesenheit des Analyten (2) in einer die Affinitätsbindung begünstigenden Milieuphase eine durch Affinitätsbindungen reversibel vernetzte viskose Netzwerkflüssigkeit bilden.
11. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem mindestens einer der nichtpermeablen Affinitätsbindungspartner ein diffusionsfähiger Polyelektrolyt ist.
12. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Messvorrichtung (7) ein elektronischer Druckwandler mit sensorischer Biegeplatte ist.
13. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 12, mit einer Vorrichtung zur Kompensation der osmotisch bedingten Spannungsänderung an der Biegeplatte und zur Messung der hierfür erforderlichen Gegenkräfte.
14. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 13 oder 14, bei dem die Biegeplatte an die Atmosphäre oder ein mit der Atmosphäre isobares Fluid grenzt.
15. Sensorisches Membran-Osmometer nach wenigstens einem der vorstehenden Ansprüche 12 bis 14, bei dem neben der Messzelle eine weitere membranbegrenzte Zelle, die Referenzelle, vorgesehen ist.
16. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 15, bei dem die Referenzelle die gleiche Größe, Gestalt, Membranfläche und Membranqualität wie die Messzelle besitzt.
17. Sensorisches Membran-Osmometer nach wenigstens einem der Ansprüche 15 oder 16, bei dem die Messzelle die sensorische Flüssigphase und die Referenzzelle eine andersartige Flüssigphase enthält, in der wenigstens einer der nicht permeablen Affinitätsbindungspartner (1 oder 3) nicht enthalten ist.
18. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 15 oder 16, bei dem die Messzelle und die Referenzzelle die nicht permeablen Affinitätsbindungspartner (1 und 3) in gleichern Konzentrationen enthalten.
19. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis
18, bei dem ein Drucksensor vorgesehen ist, der die Druckdifferenz zwischen der Referenzelle und der Messzelle erfasst.
20. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis
19, bei dem die semipermeable Membran der Messzelle durch das Segment einer Mikrodialysefaser gebildet wird..
21. Sensorisches Membran-Osmometer nach Anspruch 20, bei dem die Messzelle und die Referenzzelle als parallel angeordnete Mikrodialysefasersegmente ausgebildet sind.
22. Sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 20 oder 21, in dem die Messzelle an einem in das physiologische System implantierbaren Körper befestigt ist.
23. Osmotisches Messverfahren zur selektiven Messung der Konzentration eines Analyten mit Affinität zu einem Affinitätsrezeptor nach dem Prinzip des kompetitiven Affimtatsassays, bei dem
- zwei Flüssigphasen (4 und 6) durch eine semipermeable Membran (5) getrennt werden, wobei eine dieser Flüssigphasen, die sensorische Flüssigphase (4), sowohl einen nichtpermeablen Affinitätsrezeptor (1) für den Analyten (2) als auch einen nichtpermeablen Konkurrenzliganden (3) enthält, und
- der von der Konzentration des Analyten abhängige Ligandenaustausch zwischen dem Analyten (2) und dem Konkurrenzliganden (3) am Affinitätsrezeptor (1) an Hand der Veränderung der Druckdifferenz über die Membran oder des Volumenflusses durch die Membran gemessen wird.
24. Osmotisches Messverfahren nach Ansprach 23, bei dem der Affinitätsrezeptor (1), der Konkurrenzligand (3) und das Reaktionsmilieu einen reversiblen Ligandenaustausch zwischen dem Analyten (2) und dem Konkurrenzliganden (3) am Affinitätsrezeptor gewährleisten.
25. Osmotisches Messverfahren nach Anspruch 23, bei dem der eingesetzte Affinitätsrezeptor (1) durch eine praktisch irreversible Bindung des Analyten (2) und der eingesetzte Konkurrenzligand (3) durch eine reversible Bindung an den eingesetzten Affinitätsrezeptor im Messmilieu gekennzeichnet sind.
26. Osmotisches Messverfahren nach Anspruch 25, bei dem die sensorische Flüssigphase (4) nach erfolgter Messung durch Überführung in ein für die Dissoziation des Analyten (2) vom Affinitätsrezeptor (1) geeignetes analytfreies Reaktionsmilieu überführt und hierdurch die nächste Messung vorbereitet wird.
27. Osmotisches Messverfahren nach Ansprach 23, bei dem ein sensorisches Membran-Osmometer nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 22 eingesetzt wird.
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121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase