WO2008102001A1 - Verfahren zur messung der viskosität und viskosimetrischer affinitätssensor - Google Patents

Verfahren zur messung der viskosität und viskosimetrischer affinitätssensor Download PDF

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WO2008102001A1
WO2008102001A1 PCT/EP2008/052155 EP2008052155W WO2008102001A1 WO 2008102001 A1 WO2008102001 A1 WO 2008102001A1 EP 2008052155 W EP2008052155 W EP 2008052155W WO 2008102001 A1 WO2008102001 A1 WO 2008102001A1
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constriction
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Rudolf Ehwald
Margit Heiske
Max Ehwald
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Humboldt-Universität Zu Berlin
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N11/00—Investigating flow properties of materials, e.g. viscosity, plasticity; Analysing materials by determining flow properties
    • G01N11/02—Investigating flow properties of materials, e.g. viscosity, plasticity; Analysing materials by determining flow properties by measuring flow of the material
    • G01N11/04—Investigating flow properties of materials, e.g. viscosity, plasticity; Analysing materials by determining flow properties by measuring flow of the material through a restricted passage, e.g. tube, aperture
    • G01N11/08—Investigating flow properties of materials, e.g. viscosity, plasticity; Analysing materials by determining flow properties by measuring flow of the material through a restricted passage, e.g. tube, aperture by measuring pressure required to produce a known flow
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    • A61B5/6847—Arrangements of detecting, measuring or recording means, e.g. sensors, in relation to patient specially adapted to be brought in contact with an internal body part, i.e. invasive mounted on an invasive device
    • A61B5/6848—Needles

Definitions

  • Viscosimetric affinity assays and viscometric affinity sensors for the determination of low molecular weight analytes are based on the competition of the molecules of an analyte with structurally similar polymer-bound analogs for the affinity binding sites on a polyvalent receptor molecule, e.g. An antibody or a lectin that reversibly cross-links the polymers with the bound analogs to form a viscous liquid.
  • the viscosity of this fluid is due to short-lived affinity bonds through which the hydrated polymers are crosslinked.
  • the viscous liquid is referred to as a sensitive liquid or sensitive SoI, because their viscosity depends in a defined manner on the concentration of low molecular weight analyte molecules.
  • aqueous dispersions of dextran and concanavalin A for glucose sensing in different variants of the affinity sensor Biosensors & Bioelectronics 9, 557-567 (1994); 197 14 087 C2, DE 40 34 565 A1, WO 2004/037079 A1) and can be used for measuring the glucose concentration in the blood or in the interstitial fluid of the subcutaneous tissue, since in these physiological fluids other glycol ligands of the ConA as glucose normally do not interfere Concentration occur.
  • a viscometric flow sensor developed on the basis of the publication DE 197 14 087 C2 has already been used for measuring the blood sugar concentration in clinical studies (Beyer U, Reihl B, Ehwald R.
  • the principle of the flow sensor is the detection of the viscosity of the sensitive liquid in a measuring capillary through which it flows after passage through a dialysis hollow fiber segment.
  • the flow-through system requires a microdialysis probe with two parallel capillary flow paths and the integration of this probe into a complex, relatively complex microfluidic system with a micropump, a larger supply of sensitive fluid, two measuring capillaries and two pressure sensors.
  • the use of the flow-through system involves the risk that larger amounts of the sensitive fluid may leak into the skin tissue if the microdialysis probe becomes leaky.
  • WO 2004/037079 A1 describes a viscometric sensor for glucose in which the sensitive liquid is also moved on a self-contained path.
  • the liquid in a cylindrical dialysis cell is moved by means of a rotating magnetic cylinder through a rotating magnetic field, wherein the viscosity is detected on the basis of the decay of the inertial rotation.
  • Document DE 100 27 684 A1 describes a viscometric sensor for low-molecular analysis, in particular glucose, designed on the basis of silicon technology.
  • this sensor is located in the filled with the sensitive liquid microdialysis a microscopically small deformable elastic body, which causes in conjunction with a fixed, integrated in the chamber wall electrostatic or electromagnetic power source, the shear flow of the sensitive liquid.
  • To measure the viscosity is the high-frequency distance measurement between the deformable body and the chamber wall, by means of which the viscosity-dependent speed of movement of the body can be detected in the sensitive liquid.
  • some technical problems still have to be solved, in particular the outer delimitation of the cavity containing the sensitive liquid on the silicon chip by a microdialysis membrane.
  • a viscometric affinity sensor comprising a bidirectionally sealed flow path or flow path at least partially filled with a sensitive fluid, comprising a containment space, a flow restricting throat and an antechamber, the restriction disposed between the containment space and the vestibule is, and the vestibule is delimited by an elastic partition from an exterior space.
  • the affinity sensor comprises a dialysis membrane, which closes at least a portion of the flow path to the outside, an actuator (for example an actuator, actuator or actuator) for exerting a force on the elastic partition wall, and a measuring device for registering the dependent on the viscosity of the sensitive liquid Time course of the pressure difference between the outer space and the vestibule.
  • the constriction through which the sensitive fluid can flow is designed so that each position of the lumen of the H manbahn in the constriction is removed by a diffusion path of less than 1 mm from the dialysis membrane.
  • a method of measuring the concentration of low molecular weight analytes wherein a force is applied to an elastic partition wall located between an outer space and a two-ended flow containing a sensitive liquid, whereby in the liquid-filled Flow path is triggered a flow between the elastic partition wall and a receiving space, which leads by a narrowing of the at least partially defined by a dialysis membrane flow path and the time course of the pressure difference across the elastic partition wall is measured.
  • the method according to the invention and the affinity sensor according to the invention are based on the principle for measuring the concentration of low-molecular-weight analytes with the aid of a sensitive liquid whose viscosity depends on the analyte concentration.
  • the flow of the sensitive liquid through the segment for example, a microdialysis hollow fiber or another microdialysis chamber is used to measure the viscosity
  • the viscosity measurement takes place within the dialysis chamber.
  • the dialysis chamber unlike the inventive solution represented here, does not flow through as a whole; but sheared within the dialysis chamber.
  • the technical solution for the viscosity measurement provided by the present invention differs from the method shown in the documents DE 40 34 565 Al and WO 2004/037079 Al in that the flow path is not by a self-contained capillary, but by one at their ends completed flow or flow path is formed.
  • the sensitive liquid which satisfies the example capillary flow path or a waveguide flows between the part of the capillary flow path, which is defined by a deformable partition to the outside and another part (receiving space) of the capillary flow path, which is a limited amount of the sensitive liquid can take or leave. It flows through a lying between these parts flow-limiting narrowing of the flow path, whose volume is through a microdialysis membrane in diffusion exchange with the outer medium.
  • the flow of the liquid is triggered by transferring a force to an elastic partition wall adjacent to the liquid in the capillary flow path.
  • the receiving space is closed to the outside and can absorb or deliver a limited volume, which is sufficient for the measurement of the viscosity on the basis of the time course of the pressure difference at the elastic partition wall.
  • the ability of the volume-receiving or volume-releasing receiving space may be based on its walls being sufficiently permeable to water, enclosed in it a small elastic gas-filled volume, or its walls having sufficient elastic extensibility.
  • only one capillary flow path is required; therefore, the diameter of the implantable microdialysis probe can be made very small.
  • the invention extends the technical possibilities for producing painless and low-injury implantable, low-invasiveness affinity sensors for glucose and other analytes.
  • the viscosity of the sensitive fluid is determined by the flow of sensitive fluid through the restriction, the flow being generated by a pressure gradient across the restriction.
  • This pressure gradient is achieved by actuating the actuator caused.
  • the actuator for example, the pressure in the anteroom can be increased.
  • the sensitive liquid flows from the vestibule into the receiving space. This leads to a measurable pressure relaxation over the dividing wall.
  • the actuator does not have to act directly on the recording room or the vestibule.
  • the actuator can influence the pressure in a fluid in the outer space, wherein the pressure is transmitted to the vestibule via the elastic membrane.
  • An advantage of the affinity sensor according to the invention is that the constriction of the dialysis membrane is very close. As a result, the viscosity in the constriction can adapt very quickly to changed concentrations of the analyte.
  • the viscometric affinity sensor according to the invention makes it possible to fulfill the following criteria, which are important for medical and clinical research:
  • the sensitive liquid used for the measurement should remain in the microdialysis chamber during the measurement period. This makes it possible to examine the influence of the dialysate of the blood plasma and of the interstitial fluid on the long-term stability of the sensitive fluid.
  • the sensory surface should be able to be introduced into the subcutaneous fat tissue as painlessly and as little as possible.
  • the sensor should be made of industrially manufactured and commonly available components and be miniaturized.
  • FIG. 1 shows an embodiment with a flow path.
  • FIG. 2 shows an embodiment with two flow paths.
  • a matching screw is an elastic silicone tube whose outer diameter is greater than the diameter of the through hole in the relaxed state , pulled in the longitudinally stretched state. After elimination of the longitudinal stress, the silicone hose lays tight against the through hole.
  • the protruding ends are cut off and the brass block with one of its sides, on which the bore is on the housing of a commercial pressure sensor with a measuring range of for example 500 mbar (5 * 10 4 Pa) and an elastic volume capacity of for example about 100 nl glued.
  • the pressure sensor is designed for measuring the pressure difference between a gas space and a liquid. For example, the deformation of a resilient semiconductor flexural plate in this sensor results in a resistance change that is the primary measurement signal.
  • a thin dialysis needle can be inserted into the through-hole lined with the silicone tube and filled with a fluid through a silicone seal.
  • the screw is inserted into the side tapped hole so that it deforms the silicone rubber lining and pressure manipulation is possible.
  • the dialysis needle of, for example, stainless steel, for example, a 1.5 mm long segment of a commercially available dialysis hollow fiber of regenerated cellulose with an inner diameter of for example 200 microns, for example, a 5 mm long segment of a nylon thread with a diameter of for example 150 microns introduced and attached in the middle of the wall of the Dialysehohlmaschine by local bonding.
  • a short lateral opening (for example 1 mm) is produced with a grinding device, for example 2 mm behind the obliquely ground end of the cannula.
  • the metal framework of the dialysis probe thus prepared is carefully degreased.
  • the outer diameter of a hollow fiber with a wall of gas-permeable porous hydrophobic polypropylene is adapted by controlled stretching exactly to the inner diameter of the stainless steel cannula.
  • the polypropylene hollow fiber has a pore size of, for example, 0.2 microns and is permeable only to gas, but not for liquid.
  • a 5 mm long segment of this fiber is inserted from the oblique opening into the cannula and glued to the edges with the steel cannula with self-curing adhesive.
  • the oblique opening at the tip of the cannula is also closed with the aid of the adhesive.
  • the cannula tip is sharpened again after the adhesive has hardened.
  • the microdialysis hollow fiber of regenerated cellulose is introduced into the cannula. Thereafter, the hollow fiber section is located with the nylon thread in the window slots. The microdialysis hollow fiber is glued tightly to the window ends and the opening. The protruding end of the hollow fiber segment is cut off at the cannula base. The cavities of the pressure sensor and the silicone rubber-lined through hole of the brass block are filled gas-free with the sensitive liquid.
  • the microdialysis probe is connected to a 50 ⁇ l syringe containing the sensitive fluid using a thin silicone tube.
  • the sensitive liquid is slowly introduced into the single-ended microdialysis probe, the gas passing through the porous membrane of the polypropylene fiber in front of the lateral opening near the closed end of the cannula can escape.
  • the lateral opening is then glued.
  • the cannula then contains at the top of a small gas space (for example, 200-500 nl), because the compressed air behind the side opening has no way out.
  • the base of the cannula filled in this way is connected to the space containing the sensitive fluid in the brass block on the pressure sensor while avoiding further gas entrapment.
  • the cannula is pushed with the liquid-filled open end by a liquid-filled silicone rubber seal gradually into this space filled with sensitive liquid, wherein the pressure increase is measured at the pressure sensor and controlled by the side mounted on the brass block screw.
  • the sensor comprises an outer space 1, which is separated by a resilient partition wall 2 from a liquid-filled flow path 3, wherein the flow path 3 is closed at two mutually remote ends. Furthermore, the sensor has an actuator 4, by means of which a force can be exerted on the elastic partition 2. A measuring device 5 for detecting the pressure difference between the outer space 1 and the liquid on the flow path 3, with which the partition wall is in contact, is provided.
  • the flow path 3 has a flow-limiting constriction 6, wherein each position of the lumen of the flow path in this constriction is less than 1 mm away from a microdialysis membrane 9.
  • the sensor has a closed receiving space 7.
  • the lateral opening of the cannula 15, which is covered with the gas-permeable porous hydrophobic polypropylene hollow fiber 17 bearing against the inner wall of the cannula 15 and sealed from outside with an adhesive after filling the cannula 15 with the sensitive liquid, is designated by 10.
  • the receiving space 7 communicates only with the elastic dividing wall 2 through the flow restricting constriction 6, which is closed laterally by the microdialysis membrane 9, and allows the flow of a limited volume of the sensitive liquid through the flow restricting constriction 6.
  • the outer space 1 is at of the illustrated embodiment connected to the atmosphere.
  • the elastic partition wall 2 in the illustrated embodiment is the semiconductor flexure plate of the pressure sensor in combination with its elastic anchorage.
  • the liquid-filled flow path 3 comprises in the illustrated embodiment, the liquid-filled spaces in the pressure sensor, in the filled with Silkongummischlauch 13 through hole 16, in the flow restricting constriction 6 and in the receiving space 7 to the gas-filled space 11 in front of the terminal closure of the cannula 15.
  • the manually operated actuator 4 is the adjusting screw on the lateral threaded bore in the pierced brass block 14.
  • the measuring device 5 is a commercially available pressure sensor for recording the pressure difference on the basis of the electrical resistance of a semiconductor flexure plate.
  • the Strömungsbesky constriction 6 is realized in this embodiment by integration of a cylindrical body 12 in the hollow fiber segment.
  • the ability of the receiving space 7 for receiving or dispensing a limited volume is realized in the illustrated embodiment by the inclusion of a limited volume of gas 11, which can compress as it flows into the receiving space 7 and relax when flowing out.
  • the viscosity of the sensitive liquid is detected with this sensor characterized in that by displacing the adjusting screw 4 liquid from the vestibule 8 partially displaced and thereby a force is exerted on the elastic partition wall 2, the deformation of the pressure difference between the outer space 1 and the vestibule 8 proportional is.
  • the measuring device 5 measures this pressure difference. Since the Strömungsbeskynde constriction 6 prevents immediate pressure equalization with the receiving space 7 and the elastic volume capacity of the receiving space 7 is greater than the elastic volume capacity of the elastic partition 2, there is a well-measurable pressure relaxation, the half-life of the viscosity of the sensitive liquid is proportional. The time course of the pressure relaxation is detected very accurately by the pressure sensor 5.
  • the outer space contains a fluid whose pressure can be changed.
  • Such an outdoor space could take over the function of the actuator, for example, when it is gas filled and connected to a gas pump.
  • the actuator in which the force is transmitted without mediation by a fluid directly by an electric or magnetic field on the elastic partition wall.
  • the sensor can also be designed so that the actuator exerts a force on the liquid matrix in the vicinity of the probe and this force is transmitted hydraulically via the flow-limiting constriction on the elastic partition. It is also possible that the actuator acts on the liquid in the receiving space and thereby induces a flow through the flow-limiting constriction, which then leads to a measurable pressure difference at the elastic partition wall.
  • the flow restricting constriction can be designed in various ways, for example by a section in which the lumen of the cylindrical hollow fiber segment is very narrow, or by the deformation of a cylindrical hollow fiber segment. If, as in the illustrated exemplary embodiment, the flow-limiting narrowing of the casting path takes place by the inclusion of one or more solid bodies, these bodies can be able to flow around them.
  • the constriction can also be realized in the form of a short flow-through aperture. It is essential that the analyte, for example glucose, can reach the diffusion equilibrium with the sensitive fluid in the flow-limiting constriction through the hollow-fiber membrane in a time typical for microdialysis ( ⁇ 10 min), without the need for additional flow.
  • the removal of the dialysis membrane from any position in the liquid-filled flow path in the constriction must be less than 1 mm.
  • the flow restricting constriction can therefore also extend over a certain range in the flow direction, since a side wall of the constriction is formed by the microdialysis membrane.
  • the aperture are formed relatively short in the flow direction, the microdialysis membrane then at least partially delimits the flow path immediately before or behind the aperture.
  • the flow restricting restriction is bounded on both sides by a portion of the flow path which is also accessible to the analyte by external diffusion or demarcated by a microdialysis membrane.
  • the spatially closely spaced arrangement of constriction and dialysis membrane largely avoids a dead volume, which forms at spatially greater distance between dialysis membrane and constriction.
  • the sensitive liquid contained in such a dead volume is in fact not in equilibrium with the analyte concentration with the matrix and must therefore be replaced by inflowing liquid from the dialysis room.
  • the receiving space There are several principally applicable options for designing the receiving space.
  • the latter must be able to take up or deliver a limited volume of the sensitive liquid from the remaining part of the liquid-filled flow path. This can, as in the case shown, be realized by the inclusion of a limited volume of gas.
  • the receiving space due to the elastic extensibility of its wall has a limited, sufficient for the deformation of the elastic partition volume capacity. In this case, the receiving space may be completely filled with liquid.
  • An embodiment of the invention is also possible in which a receiving space is realized as a capillary dialysis or ultrafiltration membrane and the volume displacement required for the measuring operation is achieved by a high permeability of this membrane is ensured for water
  • the affinity sensor according to the invention can be used in the variants described so far for investigating the influence of the matrix on the stability of the sensitive liquid. It also constitutes a favorable embodiment of the viscometric affinity sensor for controlling the concentration of glucose in the interstitial fluid.
  • the viscosity of the sensitive fluid exchanging with the interstitial fluid is the same as the viscosity of the same sensitive fluid , which contains a defined concentration of glucose, is compared [Beyer U, Ehwald R: Compensation of temperature and Concanavalin A concentration effects for glucose determination by the viscometric affinity assay].
  • the outer space is designed as a second flow path 30 with a flow-restricting constriction 36 and a receiving space 37, the second flow path 33 thus realized applying the sensitive fluid with a defined concentration Contains glucose and is not limited by a microdialysis membrane, but by impermeable walls 32.
  • the flow restricting throat 33 of the second flow path 33 is located between the elastic partition wall 2 and the receiving space 37 whose elastic volume capacity is larger than the elastic volume capacity of the partition wall.
  • the first flow path 23 in this exemplary embodiment comprises an antechamber (28), which is connected to a receiving space 27 via a flow-limiting constriction 36.
  • the receiving space 27 contains at its dead end a gas volume 21, which allows the absorption of liquid into the receiving space 27 while compressing the gas volume.
  • the receiving space 37 of the second flow path likewise has a corresponding gas volume 31.
  • the first flow path 23 is partially bounded by a dialysis membrane.
  • the flow restricting constrictions 26 and 36 in both flow paths are realized here by short diaphragms.
  • the same force is exerted hydraulically on the two fluid spaces bordering the elastic partition wall 2, which in each case are in fluid communication with one of the flow paths.
  • the actuator 24 is indicated in Figure 2 by the actuator 24.
  • the subsequently measurable by means of the measuring device 5 time course of the pressure difference across the partition wall 2 results from the relation of the viscosities of the sensitive liquid in the two constrictions, the viscosity in the second flow path serves as a reference.
  • the affinity sensor can be designed so that the two capillary flow paths lie side by side on the same probe, so that the temperature effect is compensated for the viscosity in the measurement signal.
  • the flow path contains a fluid which is not miscible with the sensitive fluid, for example an oil, which fills the flow path between the elastic partition wall and the flow restricting restriction without reaching it.
  • This fluid thus serves to convey pressure between the elastic partition wall and the sensitive fluid.
  • the space which has the elastic partition may also be connected to the vestibule by means of comparatively long supply lines which are filled with the sensitive liquid or the fluid.
  • the probe which encloses the flow restricting constriction as well as the receiving space can be designed as a small and easily implantable separate probe.
  • the vestibule can also be accommodated in the probe, and communicates with the elastic partition wall via the fluid contained in the supply line.
  • Providing a two-ended slurry pathway having a flow-limiting restriction disposed in a diffusion exchange with an outer matrix analyte disposed between a first space and a second space of the flow path, the flow path having a sensitive liquid having a viscosity of the concentration of the analyte depends is at least partially filled and is separated on the side of the first space by an elastic partition from an outside space;
  • the present invention relates to a viscometric affinity sensor with a microdialysis probe with very small diameter and very small volume of the implantable part, in which only a capillary flow path is integrated.
  • the affinity sensor according to the invention can be produced from industrially manufactured marketable parts.
  • the capillary flow path is separated from an outer space by an elastic partition at one end and has a closed receiving space at the other end.
  • a flow-limiting constriction which is accessible to the analyte from the outside by way of diffusion through a microdialysis membrane.
  • a force is exerted on the elastic partition by an actuator integrated in the sensor.
  • the sensitive liquid is moved through the flow-limiting constriction of the capillary flow path, and the time dependent on the concentration of the analyte time course of the pressure difference across the elastic partition is registered by a built-in sensor measuring device.
  • the measuring principle is suitable for the acquisition of a measurand related to a reference value of defined analyte concentration.

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Abstract

Ein viskosimetrischer Affinitatssensor weist eine mit einer sensitiven Flüssigkeit zumindest teilweise gefüllte zweiseitig abgeschlossene Flieβbahn (3), die einen Aufnahmeraum (7), eine stromungsbegrenzende Verengung (6) und einen Vorraum (8) umfasst, auf, wobei die Verengung (6) zwischen dem Aufnahmeraum (7) und dem Vorraum (8) angeordnet ist, und der Vorraum (8) durch eine elastische Trennwand (2) von einem AuBenraum (1) abgegrenzt ist. Eine Dialysemembran (9) schlieβt zumindest einen Teilbereich der Flieβbahn (3), in dem die Verengung liegt, nach auβen ab. Mittels eines Aktors (4) kann eine Kraft auf die elastische Trennwand (2) ausgeübt werden, wobei eine Messvorrichtung (5) zum Registrieren des von der Viskositat der sensitiven Flüssigkeit abhangigen Zeitverlaufes der Druckdifferenz zwischen dem AuBenraum (1) und dem Vorraum (8) dient. Die Verengung (6), durch welche die sensitive Flüssigkeit stromen kann, ist so ausgebildet, dass jede Position des Lumens der Flieβbahn in der Verengung (6) durch einen Diffusionsweg von weniger als 1 mm von der Dialysemembran (9) entfernt ist.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Messung der Viskosität und viskosimetrischer Affinitätssensor
Viskosimetrische Affinitätsassays und viskosimetrische Affinitätssensoren zur Bestimmung von niedermolekularen Analyten beruhen auf der Konkurrenz der Moleküle eines Analyten mit strukturähnlichen polymergebundenen Analoga um die Affinitätsbindungsorte an einem polyvalenten Rezeptormolekül, z. B. einem Antikörper oder einem Lektin, das die Polymere mit den gebundenen Analoga reversibel vernetzt, wodurch eine viskose Flüssigkeit entsteht. Die Viskosität dieser Flüssigkeit beruht auf kurzlebigen Affinitätsbindungen, durch welche die hydratisierten Polymere vernetzt werden. Die viskose Flüssigkeit wird als sensitive Flüssigkeit oder sensitives SoI bezeichnet, weil ihre Viskosität in definierter Weise von der Konzentration niedermolekularer Analytmoleküle abhängt. Von besonderem Interesse ist eine gut untersuchte sensitive Flüssigkeit, die hochmolekulares Dextran und das Lektin Concanavalin A (ConA) in geeigneten Konzentrationen enthält und deren Viskosität von der Konzentration niedermolekularer Glykoliganden, z.B. der Glucose, abhängt (siehe beispielsweise DE 4203 466 Al; Ballerstädt R, Ehwald R. Suitability of aqueous dispersions of dextran and Concanavalin A for glucose sensing in different variants of the affinity sensor. Biosensors & Bioelectronics 9, 557-567 (1994); Ehwald R, Ballerstädt R, Dautzenberg H. Viscosimetric Affinity Assay, Anal. Biochemistry 234, 1-8 (1996)). Befindet sich diese Lösung in einem Mikrodialyse-Hohlfasersegment oder einer anderen Dialysekammer und kann ihre Viskosität gemessen werden, nachdem die Konzentration des Glycoliganden in der sensitiven Flüssigkeit sich derjenigen in der Matrix angeglichen hat, entsteht ein Sensor für niedermolekulare Glykoliganden des Concanavalin A (DE 42 03 466 Al). Viskosimetrische Sensoren auf dieser Grundlage sind in mehreren Ausführungsformen bekannt (Ballerstädt R, Ehwald R. Suitability of aqueous dispersions of dextran and Concanavalin A for glucose sensing in different variants of the affinity sensor. Biosensors & Bioelectronics 9, 557-567 (1994); DE 197 14 087 C2; DE 40 34 565 Al; WO 2004/037079 Al) und können zur Messung der Glucosekonzentration im Blut oder in der interstitiellen Flüssigkeit des Unterhautgewebes eingesetzt werden, da in diesen physiologischen Flüssigkeiten andere Glykoliganden des ConA als Glucose normalerweise nicht in störender Konzentration vorkommen. Ein auf der Grundlage der Druckschrift DE 197 14 087 C2 entwickelter viskosimetrischer Durchfluss-Sensor wurde bereits zur Messung der Blutzuckerkonzentration in klinischen Studien eingesetzt (Beyer U, Reihl B, Ehwald R. Recording of subcutaneous glucose dynamics by a viscometric affmity sensor. Diabetologia 44, 416-423 (2001); Diem P, Kalt L, Haueter U, Krinelke L, Fajfr R, Reihl B, Beyer U. Clinical Performance of a continuous viscometric affinity sensor for glucose. Diabetes Technology and Therapeutics 6, 790-799 (2004)). Mit Hilfe dieses Systems wurde die Eignung des viskosimetrischen Sensorprinzips für die kontinuierliche Messung der Glucosekonzentration in der interstitiellen Flüssigkeit nachgewiesen. Da die Empfindlichkeit des Sensors im Verlauf einiger Tage unverändert blieb, reichte eine einzige Eichung für die Aufzeichnung des Blutglucose- Konzentrations verlauf es aus. Das Prinzip des Durchfluss-Sensors besteht in der Erfassung der Viskosität der sensitiven Flüssigkeit in einer Messkapillare, durch welche sie nach der Passage durch ein Dialyse-Hohlfasersegment fließt. Das Durchfluss-System erfordert eine Mikrodialyse-Sonde mit zwei parallelen kapillaren Fließbahnen und die Integration dieser Sonde in ein komplexes, relativ aufwendiges mikrofluidisches System mit einer Mikropumpe, einem größeren Vorrat der sensitiven Flüssigkeit, zwei Messkapillaren und zwei Drucksensoren. Die Anwendung des Durchfluss-Systems ist mit dem Risiko verbunden, dass größere Mengen der sensitiven Flüssigkeit in das Hautgewebe ausströmen könnten, falls die Mikrodialyse-Sonde undicht wird.
Außer dem genannten Durchfluss-Prinzip sind weitere Möglichkeiten zur Gestaltung des viskosimetrischen Sensors bekannt. Die bereits genannte Druckschrift DE 40 34 565 Al beschreibt ein Messprinzip für den viskosimetrischen Sensor, bei dem die sensitive Flüssigkeit auf einer in sich geschlossenen Fließbahn bewegt wird, wobei ein Teil dieser Fließbahn durch eine Dialysemembran nach außen abgeschlossen ist. Ein Vorteil der Verwendung einer in sich geschlossenen Fließbahn besteht darin, dass durch das Volumen dieser Fließbahn das Volumen der sensitiven Flüssigkeit festgelegt wird und daher von osmotischen Vorgängen unabhängig gestaltet werden kann. Allerdings ist bisher noch kein implantierbarer Sensor für die medizinische Forschung oder medizinische Anwendungen auf der Grundlage dieses Prinzips hergestellt worden. Die Rückführung der von der Pumpe oder dem Aktor bewegten sensitiven Flüssigkeit zur Pumpe und die Integration einer miniaturisierten Messvorrichtung für den strömungsabhängigen Druck oder die Strömungsgeschwindigkeit in die geschlossen Fließbahn erfordern die Neuentwicklung mikrotechnischer Bauteile.
Li der ebenfalls bereits genannten Druckschrift WO 2004/037079 Al wird ein viskosimetrischer Sensor für Glucose beschrieben, bei dem die sensitive Flüssigkeit ebenfalls auf einer in sich geschlossenen Bahn bewegt wird. Bei der hier beschriebenen Ausfuhrungsform des viskosimetrischen Sensors wird die Flüssigkeit in einer zylindrischen Dialysezelle mit Hilfe eines rotierenden magnetischen Zylinders durch ein rotierendes Magnetfeld bewegt, wobei die Viskosität an Hand des Abklingens der trägheitsbedingten Rotation erfasst wird.
In der Druckschrift DE 100 27 684 Al wird ein auf der Grundlage der Siliziumtechnologie konzipierter viskosimetrischer Sensor für niedermolekulare Anlayte, insbesondere für Glucose, beschrieben. Bei diesem Sensor befindet sich in der mit der sensitiven Flüssigkeit gefüllten Mikrodialysekammer ein mikroskopisch kleiner deformierbarer elastischer Körper, der in Verbindung mit einer feststehenden, in die Kammerwand integrierten elektrostatischen oder elektromagnetischen Kraftquelle das Scherfließen der sensitiven Flüssigkeit bewirkt. Zur Messung der Viskosität dient die Hochfrequenz- Abstandsmessung zwischen dem deformierbaren Körper und der Kammerwand, mit deren Hilfe die viskositätsabhängige Bewegungsgeschwindigkeit des Körpers in der sensitiven Flüssigkeit erfasst werden kann. Um einen medizinisch anwendbaren viskosimetrischen Sensor auf dieser Grundlage zu fertigen, müssen noch einige technische Probleme gelöst werden, insbesondere die äußere Abgrenzung der die sensitiven Flüssigkeit enthaltenden Kavität auf dem Siliciumchip durch eine Mikrodialyse-Membran.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise zu lösen bzw. abzumildern.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach Anspruch 1 und einen viskosimetrischen Affinitätssensor nach Anspruch 2 gelöst. Die Unteransprüche beziehen sich auf vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung. Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein viskosimetrischer Affinitätssensor bereitgestellt, der eine mit einer sensitiven Flüssigkeit zumindest teilweise gefüllte zweiseitig abgeschlossene Fließbahn oder Fließstrecke, die einen Aufnahmeraum, eine Strömungsbegrenzende Verengung und einen Vorraum umfasst, aufweist, wobei die Verengung zwischen dem Aufnahmeraum und dem Vorraum angeordnet ist, und der Vorraum durch eine elastische Trennwand von einem Außenraum abgegrenzt ist. Weiterhin umfasst der Affinitätssensor eine Dialysemembran, welche zumindest einen Teilbereich der Fließbahn nach außen abschließt, einen Aktor (beispielsweise ein Betätiger, Aktuator oder Stellglied) zur Ausübung einer Kraft auf die elastische Trennwand, und eine Messvorrichtung zum Registrieren des von der Viskosität der sensitiven Flüssigkeit abhängigen Zeitverlaufes der Druckdifferenz zwischen dem Außenraum und dem Vorraum. Die Verengung, durch welche die sensitive Flüssigkeit strömen kann, ist dabei so ausgebildet, dass jede Position des Lumens der Hießbahn in der Verengung durch einen Diffusionsweg von weniger als 1 mm von der Dialysemembran entfernt ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Messung der Konzentration niedermolekularer Analyte bereitgestellt, wobei auf eine elastische Trennwand, die zwischen einem Außenraum und einer eine sensitive Flüssigkeit enthaltenden, an zwei Enden abgeschlossenen Fließbahn liegt, eine Kraft ausgeübt wird, wodurch in der flüssigkeitsgefüllten Fließbahn eine Strömung zwischen der elastischen Trennwand und einem Aufnahmeraum ausgelöst wird, die durch eine Verengung der durch eine Dialysemembran mindestens teilweise begrenzten Fließbahn führt und der Zeitverlauf der Druckdifferenz über die elastische Trennwand gemessen wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren und der erfindungsgemäße Affinitätssensor beruhen auf dem Prinzip zur Messung der Konzentration niedermolekularer Analyte mit Hilfe einer sensitiven Flüssigkeit, deren Viskosität von der Analytkonzentration abhängt. Dabei wird die Strömung der sensitiven Flüssigkeit durch das Segment beispielsweise einer Mikrodialyse- Hohlfaser oder eine andere Mikrodialysekammer zur Messung der Viskosität ausgenutzt Im Gegensatz zum Durchflussverfahren nach Druckschrift DE 197 14 087 C2 findet die Viskositätsmessung innerhalb der Dialysekammer statt. Bei dem mikromechanischen Verfahren nach Druckschrift DE 100 27 684 Al wird die Dialysekammer, anders als bei der hier dargestellten erfinderischen Lösung, nicht als Ganzes durchströmt; sondern innerhalb der Dialysekammer geschert. Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte technische Lösung für die Viskositätsmessung unterscheidet sich von dem in den Druckschriften DE 40 34 565 Al und WO 2004/037079 Al dargestellten Verfahren dadurch, dass die Fließbahn nicht durch eine in sich geschlossene kapillare, sondern durch eine an ihren Enden abgeschlossene Strömungs- oder Fließbahn gebildet wird. Die sensitive Flüssigkeit, die die beispielsweise kapillare Fließbahn bzw. einen Hohlleiter erfüllt, fließt zwischen dem Teil der kapillaren Fließbahn, die durch eine deformierbare Trennwand nach außen abgegrenzt ist und einem anderen Teil (Aufnahmeraum) der kapillaren Fließbahn, der eine begrenzte Menge der sensitiven Flüssigkeit aufnehmen oder abgeben kann. Sie fließt dabei durch eine zwischen diesen Teilen liegende Strömungsbegrenzende Verengung der Fließbahn, deren Volumen durch eine Mikrodialyse-Membran im Diffusionsaustausch mit dem äußeren Medium steht. Die Strömung der Flüssigkeit wird durch Übertragung einer Kraft auf eine an die Flüssigkeit in der kapillaren Fließbahn grenzende elastische Trennwand ausgelöst. Der Aufnahmeraum ist nach außen abgeschlossen und kann ein begrenztes Volumen aufnehmen oder abgeben, das für die Messung der Viskosität an Hand des Zeitverlaufes der Druckdifferenz an der elastischen Trennwand ausreicht. Die Fähigkeit des Aufnahmeraums zur Volumenaufnahme oder Volumenabgabe kann darauf beruhen, dass seine Wände für Wasser ausreichend permeabel sind, dass in ihm ein kleines elastisches gasgefülltes Volumen eingeschlossen ist oder dass seine Wände eine ausreichende elastische Dehnbarkeit besitzen. Bei dem erfindungsgemäßen viskosimetrischen Affinitätssensor wird nur eine kapillare Fließbahn benötigt; daher kann der Durchmesser der implantierbaren Mikrodialyse-Sonde sehr klein gestaltet werden kann. Mit der Erfindung werden die technischen Möglichkeiten zur Herstellung schmerzarm und verletzungsarm implantierbarer wenig invasiver Affinitätssensoren für Glucose und andere Analyte erweitert.
Die Viskosität der sensitiven Flüssigkeit wird auf Grund des Flusses der sensitiven Flüssigkeit durch die Verengung bestimmt, wobei der Fluss durch einen Druckgradienten über der Verengung erzeugt wird. Dieser Druckgradient wird durch Betätigen des Aktors hervorgerufen. Durch den Aktor kann beispielsweise der Druck im Vorraum erhöht werden. Dadurch wird sowohl ein Druckgradienten zwischen Vorraum und Aufnahmeraum, d.h. über die Verengung, als auch zu einer Druckdifferenz zwischen Vorraum und Außenraum, d.h. über die Trennwand, aufgebaut. Im Ergebnis fließt die sensitive Flüssigkeit vom Vorraum in den Aufnahmeraum. Dies führt zu einer messbaren Druckrelaxation über der Trennwand. Umgekehrt ist es möglich, durch den Aktor einen Druck auf die sensitive Flüssigkeit im Aufnahmeraum auszuüben und so einen Fluss in den Vorraum zu induzieren und den Druckanstieg über der Trennwand als Messsignal zu verwenden. Der Aktor muss hierzu nicht direkt auf den Aufnahmeraum oder den Vorraum wirken. Beispielsweise kann der Aktor den Druck in einem Fluid im Außenraum beeinflussen, wobei der Druck auf den Vorraum über die elastische Membran übertragen wird.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Affinitätssensors ist, dass die Verengung der Dialysemembran sehr nahe ist. Dadurch kann sich die Viskosität in der Verengung sehr schnell an veränderte Konzentrationen des Analyten anpassen.
Unter einer sensitiven Flüssigkeit wird, wie einleitend beschrieben, eine Flüssigkeit verstanden, deren Viskosität von der Konzentration des Analyten abhängt.
Der erfindungsgemäße viskosimetrische Affinitätssensor gestattet insbesondere, folgende, für die medizinische und klinische Forschung wichtige Kriterien zu erfüllen:
1. Die zur Messung eingesetzte sensitive Flüssigkeit soll während des Messzeitraumes in der Mikrodialysekammer verbleiben. Dies ermöglicht, den Einfiuss des Dialysates des Blutplasmas und der interstitiellen Flüssigkeit auf die Langzeitstabilität der sensitiven Flüssigkeit zu untersuchen.
2. Die sensorische Oberfläche soll möglichst schmerzfrei und verletzungsarm in das Unterhautfettgewebe eingeführt werden können.
3. Der Sensor soll aus industriell gefertigten und allgemein verfügbaren Bauteilen hergestellt werden können und miniaturisierbar sein.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand eines in der anhängenden Figur gezeigten Ausführungsbeispiels näher erläutert werden Die Erfindung ist jedoch nicht auf die konkret beschriebene Ausführungsform beschränkt, sondern kann in geeigneter Weise abgeändert werden. Die in den Figuren gezeigten Ausführungsformen sind nicht maßstabsgetreu gezeichnet, sondern dienen lediglich dem besseren Verständnis.
Figur 1 zeigt eine Ausführungsform mit einer Fließbahn.
Figur 2 zeigt eine Ausfuhrungsform mit zwei Fließbahnen.
Zunächst soll die Herstellung einer einfachen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Affinitätssensors erläutert werden.
Durch eine axiale Durchgangsbohrung in einem beispielsweise 1 cm langen Messingblock mit einer seitlichen Gewindebohrung, die senkrecht zur Durchgangsbohrung verläuft und zumindest bis zu dieser reicht, und einer passenden Schraube wird ein elastischer Silikonschlauch, dessen äußerer Durchmesser im entspannten Zustand größer als der Durchmesser der Durchgangsbohrung ist, im längsgespannten Zustand hindurchgezogen. Nach dem Wegfall der Längsspannung legt sich der Silikonschlauch an die Durchgangsbohrung dicht an. Die herausragenden Enden werden abgeschnitten und der Messingblock wird mit einer seiner Seiten, auf welcher die Bohrung ist, auf das Gehäuse eines handelsüblichen Drucksensors mit einem Messbereich von beispielsweise 500 mbar (5*104 Pa) und einer elastischen Volumenkapazität von beispielsweise ca. 100 nl geklebt. Der Drucksensor ist für die Messung der Druckdifferenz zwischen einem Gasraum und einer Flüssigkeit ausgelegt. Beispielsweise führt die Deformation einer elastischen Halbleiter- Biegeplatte in diesem Sensor zu einer Widerstandsänderung, die das primäre Mess-Signal darstellt.
In die mit dem Silikonschlauch ausgekleidete und mit einer Flüssigkeit gefüllte Durchgangsbohrung kann durch eine Silikon-Dichtung eine dünne Dialyse-Nadel eingeführt werden. Um bei diesem Prozess den Druck in dem flüssigkeitsgefüllten Raum kontrollieren zu können, wird die Schraube in die seitliche Gewindebohrung so weit eingeführt, dass sie die Silikongummi-Auskleidung deformiert und eine Druckmanipulation möglich wird. Zur Herstellung der Dialyse-Nadel aus beispielsweise Edelstahl wird in ein beispielsweise 1,5 cm langes Segment einer handelsüblichen Dialyse-Hohlfaser aus beispielsweise regenerierter Zellulose mit einem Innendurchmesser von beispielsweise 200 μm ein beispielsweise 5 mm langes Segment eines Nylonfadens mit einem Durchmesser von beispielsweise 150 μm eingeführt und in deren Mitte an der Wand der Dialysehohlfaser durch lokale Klebung befestigt. Eine beispielsweise 20 mm lange, an einem Ende schräg angeschliffene Kanüle mit einem Außendurchmesser von beispielsweise 0,4 mm und einem Innendurchmesser von beispielsweise 0,3 mm wird in der Mitte so geschliffen, dass beispielsweise drei 8 mm lange schlitzförmige Fenster entstehen. Außerdem wird mit einem Schleifgerät beispielsweise 2 mm hinter dem schrägen angeschliffenen Ende der Kanüle eine kurze seitliche Öffnung (beispielsweise 1 mm) hergestellt. Das so hergestellte Metallgerüst der Dialysesonde wird sorgfältig entfettet.
Der Außendurchmesser einer Hohlfaser mit einer Wand aus gasdurchlässigem porösem hydrophoben Polypropylen wird durch kontrollierte Dehnung genau an den Innendurchmesser der Edelstahl-Kanüle angepasst. Die Polypropylenhohlfaser hat eine Porenweite von beispielsweise 0,2 μm und ist nur für Gas, nicht jedoch für Flüssigkeit durchlässig. Ein beispielsweise 5 mm langes Segment dieser Faser wird von der schrägen Öffnung her in die Kanüle hereingeschoben und an den Rändern mit der Stahlkanüle mit selbst härtendem Klebstoff verklebt. Die schräge Öffnung an der Spitze der Kanüle wird ebenfalls mit Hilfe des Klebstoffs verschlossen. Die Kanülenspitze wird nach der Aushärtung des Klebstoffes wieder scharf angeschliffen. Von der anderen Seite wird die Mikrodialyse-Hohlfaser aus regenerierter Zellulose in die Kanüle eingeführt. Danach befindet sich der Hohlfaserabschnitt mit dem Nylonfaden im Bereich der Fensterschlitze. Die Mikrodialyse-Hohlfaser wird an den Fenster-Enden und an der Öffnung dicht eingeklebt. Das überstehende Ende des Hohlfasersegmentes wird an der Kanülenbasis abgeschnitten. Die Hohlräume des Drucksensors und die mit Silikongummi ausgekleidete Durchgangsbohrung des Messingblockes werden gasfrei mit der sensitiven Flüssigkeit gefüllt. Dazu wird mit Hilfe eines dünnen Silikonschlauches die Mikrodialysesonde mit einer die sensitive Flüssigkeit enthaltenden 50 μl-Spritze verbunden. Die sensitive Flüssigkeit wird langsam in die einseitig verschlossene Mikrodialyse-Sonde eingeführt, wobei das Gas durch die poröse Membran der Polypropylenfaser vor der seitlichen Öffnung nahe dem verschlossenen Ende der Kanüle entweichen kann. Die seitliche Öffnung wird anschließend verklebt. Die Kanüle enthält danach an der Spitze einen kleinen Gasraum (beispielsweise 200-500 nl), weil die komprimierte Luft hinter der seitlichen Öffnung keinen Ausweg besitzt. Die Basis der so gefüllten Kanüle wird mit dem die sensitive Flüssigkeit enthaltenden Raum in dem Messingblock am Drucksensor unter Vermeidung weiteren Gaseinschlusses verbunden. Hierzu wird die Kanüle mit dem flüssigkeitsbedeckten offenen Ende durch eine flüssigkeitsgefüllte Silikongummidichtung allmählich in diesen mit sensitiver Flüssigkeit gefüllten Raum hinein geschoben, wobei der Druckanstieg am Drucksensor gemessen und durch die seitlich am Messingblock angebrauchte Schraube kontrolliert wird.
Im Folgenden wird, ausgehend von der oben hinsichtlich der Herstellung beschriebenen Ausführungsform, der erfindungsgemäße Affinitätssensor an Hand von schematischen Figuren erläutert.
Der Sensor umfasst einen Außenraum 1, der durch eine elastische Trennwand 2 von einer mit Flüssigkeit gefüllten Fließbahn 3 getrennt wird, wobei die Fließbahn 3 an zwei von einander entfernten Enden verschlossen ist. Weiterhin weist der Sensor einen Aktor 4, mit dessen Hilfe eine Kraft auf die elastische Trennwand 2 ausgeübt werden kann, auf. Eine Messvorrichtung 5 zur Erfassung der Druckdifferenz zwischen dem Außenraum 1 und der Flüssigkeit auf der Fließbahn 3, mit der die Trennwand in Kontakt steht, ist vorgesehen. Die Fließbahn 3 weist eine Strömungsbegrenzende Verengung 6 auf, wobei jede Position des Lumens der Fließbahn in dieser Verengung weniger als 1 mm von einer Mikrodialyse-Membran 9 entfernt ist. Außerdem weist der Sensor einen abgeschlossenen Aufnahmeraum 7 auf. Die seitliche Öffnung der Kanüle 15, welche mit der an der Innenwand der Kanüle 15 anliegenden gasdurchlässigen porösen hydrophoben Polypropylenhohlfaser 17 bedeckt und von außen mit einem Klebstoff nach dem Befüllen der Kanüle 15 mit der sensitiven Flüssigkeit verschlossen wird, ist mit 10 bezeichnet.
Der Aufnahmeraum 7 steht nur durch die Strömungsbegrenzende Verengung 6, welche seitlich durch die Mikrodialyse-Membran 9 abgeschlossen ist, mit der elastischen Trennwand 2 in Verbindung und ermöglicht den Fluss eines begrenzten Volumens der sensitiven Flüssigkeit durch die Strömungsbegrenzende Verengung 6. Der Außenraum 1 ist bei der dargestellten Ausführungsform mit der Atmosphäre verbunden. Die elastische Trennwand 2 ist bei der dargestellten Ausführungsform die Halbleiter-Biegeplatte des Drucksensors in der Kombination mit deren elastischen Verankerung. Die flüssigkeitsgefüllte Fließbahn 3 umfasst bei der dargestellten Ausführungsform die flüssigkeitsgefüllten Räume im Drucksensor, in der mit Silkongummischlauch 13 ausgefüllten Durchgangsbohrung 16, in der Strömungsbegrenzenden Verengung 6 und im Aufnahmeraum 7 bis zu dem gasgefüllten Raum 11 vor dem terminalen Verschluss der Kanüle 15. Der bei der dargestellten Ausführungsform manuell zu bedienende Aktor 4 ist die Stellschraube an der seitlichen Gewindebohrung in dem durchbohrten Messingblock 14. Die Messvorrichtung 5 ist ein handelsüblicher Drucksensor zur Aufzeichnung der Druckdifferenz auf der Grundlage des elektrischen Widerstandes einer Halbleiterbiegeplatte. Die Strömungsbegrenzende Verengung 6 wird bei dieser Ausführungsform durch Integration eines zylindrischen Körpers 12 in das Hohlfaser-Segment realisiert. Die Fähigkeit des Aufnahmeraums 7 zur Aufnahme oder Abgabe eines begrenzten Volumens wird in dem dargestellten Ausführungsbeispiel durch den Einschluss eines begrenzten Gasvolumens 11 realisiert, das sich beim Einströmen in den Aufnahmeraum 7 komprimieren und beim Ausströmen entspannen kann.
Die Viskosität der sensitiven Flüssigkeit wird mit diesem Sensor dadurch erfasst, dass durch Verdrehen der Stellschraube 4 Flüssigkeit aus dem Vorraum 8 teilweise verdrängt und dadurch eine Kraft auf die elastische Trennwand 2 ausgeübt wird, deren Deformation der Druckdifferenz zwischen dem Außenraum 1 und dem Vorraum 8 proportional ist. Die Messvorrichtung 5 misst diese Druckdifferenz. Da die Strömungsbegrenzende Verengung 6 einen sofortigen Druckausgleich mit dem Aufnahmeraum 7 verhindert und die elastische Volumenkapazität des Aufnahmeraums 7 größer als die elastische Volumenkapazität der elastischen Trennwand 2 ist, kommt es zu einer gut messbaren Druckrelaxation, deren Halbwertszeit der Viskosität der sensitiven Flüssigkeit proportional ist. Der Zeitverlauf der Druckrelaxation wird durch den Drucksensor 5 sehr genau erfasst.
Jede der genannten Komponenten kann in verschiedenen Ausführungsformen realisiert werden, wie im Folgenden erläutert wird. Beispielsweise können zusätzlich zu der Biegeplatte und den anderen Bestandteilen des Drucksensors weitere Komponenten zur Elastitizität der Trennwand beitragen. Es ist möglich, dass der Außenraum ein Fluid enthält, dessen Druck verändert werden kann. Ein solcher Außenraum könnte die Funktion des Aktors übernehmen, zum Beispiel, wenn er gasgefüllt ist und an eine Gaspumpe angeschlossen wird. Es sind Ausführungsformen des Aktors möglich, bei denen die Kraft ohne Vermittlung durch ein Fluid direkt durch ein elektrisches oder magnetisches Feld auf die elastische Trennwand übertragen wird. Der Sensor kann auch so gestaltet werden, dass der Aktor eine Kraft auf die flüssige Matrix in der Umgebung der Messsonde ausübt und diese Kraft hydraulisch über die Strömungsbegrenzende Verengung auf die elastische Trennwand übertragen wird. Ebenso ist es möglich, dass der Aktor auf die Flüssigkeit im Aufnahmeraum wirkt und dadurch einen Fluss durch die Strömungsbegrenzende Verengung induziert, der dann zu einer messbaren Druckdifferenz an der elastischen Trennwand führt.
Es gibt verschiedene physikalische Möglichkeiten zur Erfassung der Druckdifferenz über die elastische Trennwand, z.B. die Messung einer Kapazität anstelle der Messung eines Widerstandes.
Die Strömungsbegrenzende Verengung kann in verschiedener Weise gestaltet werden, beispielsweise durch einen Abschnitt, in dem das Lumen des zylinderförmigen Hohlfasersegmentes sehr eng ist, oder durch die Deformation eines zylindrischen Hohlfasersegmentes. Falls, wie in dem dargestellten Ausführungsbeispiel, die Strömungsbegrenzende Verengung der Hießbahn durch den Einschluss eines oder mehrerer fester Körpers erfolgt, können/kann diese/r Körper umströmbar sein. Die Verengung kann auch in der Form einer kurzen durchströmbaren Blende realisiert werden. Wesentlich ist, dass der Analyt, z.B. Glucose, durch die Hohlfasermembran in einer für die Mikrodialyse typischen Zeit (< 10 min) das Diffusionsgleichgewicht mit der sensitiven Flüssigkeit in der Strömungsbegrenzenden Verengung erreichen kann, ohne dass es einer zusätzlichen Strömung bedarf. Hierzu muss die Entfernung der Dialysemembran von jeder Position in der flüssigkeitsgefüllten Fließbahn in der Verengung kleiner als 1 mm sein. Dies lässt sich dadurch erreichen, dass beispielsweise die Strömungsbegrenzende Verengung zumindest teilweise, beispielsweise auf einer Seite, von der Mikrodialyse-Membran begrenzt ist. Die Strömungsbegrenzende Verengung kann sich daher in Strömungsrichtung auch über einen gewissen Bereich erstrecken, da eine Seitenwand der Verengung durch die Mikrodialyse- Membran gebildet wird. Ebenso kann bei Verwendung einer Blende aus einem nicht- permeablen Material als strömungsbegrenzende Verengung, die Blende in Strömungsrichtung relativ kurz ausgebildet werden, wobei die Mikrodialyse-Membran dann die Fließbahn unmittelbar vor oder hinter Blende zumindest teilweise abgrenzt. Vorzugsweise wird die strömungsbegrenzende Verengung, wie in dem angeführten Ausführungsbeispiel auf beiden Seiten durch einen Abschnitt der Fließbahn begrenzt, der ebenfalls für den Analyten durch Diffusion von außen erreichbar ist bzw. von einer Mikrodialyse-Membran abgegrenzt ist. Durch die räumlich eng benachbarte Anordnung von Verengung, welche die Strömungsgeschwindigkeit der sensitiven Flüssigkeit begrenzt und dadurch die Viskositätsmessung ermöglicht, und dem Bereich, in dem der Analytaustausch erfolgt, kann problemlos gewährleistet werden, dass die beim Messvorgang durch die Verengung strömende sensitive Flüssigkeit hinsichtlich der Analytkonzentration mit der Matrix im Gleichgewicht steht. Dadurch wird die Ansprechzeit des Sensors wesentlich erhöht. Außerdem kann die Sonde, welche die Verengung und die Dialysemembran umfasst, sehr klein gehalten werden. Dies ermöglicht die Herstellung von kleinen und leicht implantierbaren Sonden. Außerdem vermeidet die räumlich eng benachbarte Anordnung von Verengung und Dialysemembran weitgehend ein Totvolumen, das sich bei räumlich größerer Entfernung zwischen Dialysemembran und Verengung ausbildet. Die in einem solchen Totvolumen enthaltene sensitive Flüssigkeit steht nämlich hinsichtlich der Analytkonzentration mit der Matrix nicht im Gleichgewicht und muss daher durch einströmende Flüssigkeit aus dem Dialyseraum ersetzt werden.
Es bestehen mehrere prinzipiell anwendbare Möglichkeiten zur Gestaltung des Aufnahmeraumes. Letzterer muss ein begrenztes Volumen der sensitiven Flüssigkeit aus dem übrigen Teil der flüssigkeitsgefüllten Fließbahn aufnehmen oder an sie abgeben können. Dies kann, wie im dargestellten Fall, durch den Einschluss eines begrenzten Gasvolumens realisiert werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass der Aufnahmeraum auf Grund der elastischen Dehnbarkeit seiner Wand eine begrenzte, für die Deformation der elastischen Trennwand ausreichende Volumenkapazität besitzt. In diesem Fall kann der Aufnahmeraum vollständig mit Flüssigkeit gefüllt sein. Es ist auch eine Ausführungsform der Erfindung möglich, bei der ein Aufnahmeraum als kapillare Dialyse- oder Ultrafiltrationsmembran realisiert wird und die für den Messvorgang erforderliche Volumenverschiebung durch eine hohe Permeabilität dieser Membran für Wasser gewährleistet wird
Der erfindungsgemäße Affinitätssensor kann in den bisher beschriebenen Varianten zur Untersuchung des Einflusses der Matrix auf die Stabilität der sensitiven Flüssigkeit eingesetzt werden. Er stellt auch eine günstige Ausführungsform des viskosimetrischen Affϊnitätssensors für die Kontrolle der Konzentration der Glucose in der interstitiellen Flüssigkeit dar. Für diese Anwendung ist es vorteilhaft, wenn die Viskosität der sensitiven Flüssigkeit, die mit der interstitiellen Flüssigkeit austauscht, mit der Viskosität der gleichen sensitiven Flüssigkeit, die eine definierte Konzentration an Glucose enthält, verglichen wird [Beyer U, Ehwald R: Compensation of temperature and Concanavalin A concentration effects for glucose determination by the viscometric affinity assay]. Um diesen Vergleich durchzuführen, wird gemäß einer Ausführungsform, die schematisch in Figur 2 gezeigt ist, der Außenraum als zweite Fließbahn 30 mit einer Strömungsbegrenzenden Verengung 36 und einem Aufnahmeraum 37 gestaltet, wobei die so realisierte zweite Fließbahn 33 die sensitive Flüssigkeit mit einer definierten Konzentration an Glucose enthält und nicht von einer Mikrodialyse-Membran, sondern von undurchlässigen Wänden 32 begrenzt wird. Die Strömungsbegrenzende Verengung 33 der zweiten Fließbahn 33 liegt zwischen der elastischen Trennwand 2 und dem Aufnahmeraum 37, dessen elastische Volumenkapazität größer ist als die elastische Volumenkapazität der Trennwand.
Die erste Fließbahn 23 in diesem Ausführungsbeispiel umfasst einen Vorraum (28), der über eine Strömungsbegrenzende Verengung 36 mit einem Aufnahmeraum 27 verbunden ist. Der Aufnahmeraum 27 enthält an seinem toten Ende ein Gasvolumen 21, welches die Aufnahme von Flüssigkeit in den Aufnahmeraum 27 unter Komprimierung des Gasvolumens ermöglicht. Der Aufnahmeraum 37 der zweiten Fließbahn verfügt ebenfalls über ein entsprechendes Gasvolumen 31.
Im Gegensatz zur zweiten Fließbahn 33, ist die erste Fließbahn 23 abschnittsweise von einer Dialysemembran begrenzt. Die Strömungsbegrenzenden Verengungen 26 und 36 in beiden Fließbahnen sind hier durch kurze Blenden realisiert. Für den Messvorgang wird bei dieser Ausführungsform beispielsweise auf hydraulischem Wege die gleiche Kraft auf die beiden an die elastische Trennwand 2 grenzenden Flüssigkeitsräume, die jeweils mit einer der Fließbahnen in fluidischer Verbindung stehen, ausgeübt. Dies ist in Figur 2 durch den Aktor 24 angedeutet. Der anschließend mittels der Messvorrichtung 5 messbare Zeitverlauf der Druckdifferenz über der Trennwand 2 resultiert aus der Relation der Viskositäten der sensitiven Flüssigkeit in den beiden Verengungen, wobei die Viskosität in der zweiten Fließbahn als Referenz dient. Der Affinitätssensor kann so gestaltet werden, dass die beiden kapillaren Fließbahnen nebeneinander auf der gleichen Sonde liegen, so dass der Temperatureffekt auf die Viskosität im Mess-Signal kompensiert wird.
Es ist ebenfalls möglich, dass die Fließbahn ein nicht mit der sensitiven Flüssigkeit vermischbares Fluid, beispielsweise ein Öl, enthält, das die Fließbahn zwischen der elastischen Trennwand und der Strömungsbegrenzenden Verengung, ohne diese zu erreichen, füllt. Dieses Fluid dient damit zur Druckvermittlung zwischen elastischer Trennwand und der sensitiven Flüssigkeit.
Der Raum, welcher die elastische Trennwand aufweist, kann auch durch vergleichsweise lange Zuleitungen, die mit der sensitiven Flüssigkeit oder dem Fluid gefüllt ist, mit dem Vorraum verbunden werden. Dadurch kann die die Strömungsbegrenzende Verengung sowie den Aufnahmeraum umfassende Sonde als kleine und leicht implantierbare separate Sonde ausgeführt werden. Der Vorraum kann ebenfalls in der Sonde untergebracht sein, und mit der elastischen Trennwand über das in der Zuleitung enthaltene Fluid kommuniziert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in allgemeinen Worten auch wie folgt zusammengefasst werden:
Bereitstellen einer an zwei Enden abgeschlossenen Hießbahn, die eine in Diffusionsaustausch hinsichtlich eines Analyten mit einer äußeren Matrix stehende Strömungsbegrenzende Verengung, welche zwischen einem ersten Raum und einem zweiten Raum der Fließbahn angeordnet ist, aufweist, wobei die Fließbahn mit einer sensitiven Flüssigkeit, deren Viskosität von der Konzentration des Analyten abhängt, zumindest teilweise gefüllt ist und auf der Seite des ersten Raums durch eine elastische Trennwand von einem Außenraum getrennt ist;
Hervorrufen einer Druckdifferenz in der Fließbahn zwischen dem Vorraum und dem
Aufnahmeraum;
Ermitteln des zeitlichen Verlaufs der Druckdifferenz über der elastischen Trennwand,
Ermitteln der Konzentration des Analyten aus dem ermittelten zeitlichen Verlauf.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen viskosimetrischen Affinitätssensor mit einer Mikrodialyse-Sonde mit sehr kleinem Durchmesser und sehr kleinem Volumen des implantierbaren Teils, in die nur eine kapillare Fließbahn integriert ist. Der erfindungsgemäße Affinitätssensor kann aus industriell gefertigten marktüblichen Teilen hergestellt werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Messung der Viskosität der in einer Dialysesonde fließenden sensorischen Flüssigkeit wird die kapillare Fließbahn an einem Ende von einer elastischen Trennwand von einem Außenraum getrennt und besitzt am anderen Ende einen abgeschlossenen Aufnahmeraum. In der kapillaren Fließbahn befindet sich eine Strömungsbegrenzende Verengung, die für den Analyten von außen auf dem Wege der Diffusion durch eine Mikrodialyse-Membran zugänglich ist. Beim Messvorgang wird durch einen in den Sensor integrierten Aktor auf die elastische Trennwand eine Kraft ausgeübt. Hierbei wird die sensitive Flüssigkeit durch die Strömungsbegrenzende Verengung der kapillaren Fließbahn bewegt, und der von der Konzentration des Analyten abhängige Zeitverlauf der Druckdifferenz über die elastische Trennwand wird durch eine in den Sensor integrierte Messvorrichtung registriert. Das Messprinzip eignet sich für die Erfassung einer Messgröße, die auf einen Referenzwert definierter Analytkonzentration bezogen ist.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Messung der Konzentration niedermolekularer Analyte auf Basis der Affinitätsviskosimetrie, wobei auf eine elastische Trennwand (2), die zwischen einem Außenraum (1) und einer eine sensitive Flüssigkeit enthaltenden, an zwei Enden abgeschlossenen Fließbahn (3) liegt, eine Kraft ausgeübt wird, wodurch in der flüssigkeitsgefüllten Fließbahn (3) eine Strömung zwischen der elastischen Trennwand (2) und einem Aufnahmeraum (7) ausgelöst wird, die durch eine Verengung (6) der durch eine Dialysemembran (9) mindestens teilweise begrenzten Fließbahn (3) führt und der Zeitverlauf der Druckdifferenz über die elastische Trennwand (2) gemessen wird.
2. Viskosimetrischer Affinitätssensor, aufweisend: eine mit einer sensitiven Flüssigkeit zumindest teilweise gefüllte zweiseitig abgeschlossene Fließbahn (3), die einen Aufnahmeraum (7), eine Strömungsbegrenzende
Verengung (6) und einen Vorraum (8) umfasst, wobei die Verengung (6) zwischen dem
Aufnahmeraum (7) und dem Vorraum (8) angeordnet ist, und der Vorraum (8) durch eine elastische Trennwand (2) von einem Außenraum (1) abgegrenzt ist, eine Dialysemembran (9), welche zumindest einen Teilbereich der Fließbahn (3) nach außen abschließt, zumindest einen Aktor (4) zur Ausübung einer Kraft auf die elastische Trennwand (2), und eine Messvorrichtung (5) zum Registrieren des von der Viskosität der sensitiven
Flüssigkeit abhängigen Zeitverlaufes der Druckdifferenz zwischen dem Außenraum (1) und dem Vorraum (8), wobei die Verengung (6), durch welche die sensitive Flüssigkeit strömen kann, so ausgebildet ist, dass jede Position des Lumens der Fließbahn in der Verengung (6) durch einen Diffusionsweg von weniger als 1 mm von der Dialysemembran (9) entfernt ist.
3. Viskosimetrischer Affinitätssensor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufnahmeraum (7) so ausgebildet ist, dass er ein begrenztes Flüssigkeitsvolumen aufnehmen oder abgeben kann.
4. Viskosimetrische Affinitätssensor nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Affinitätssensor ein implantierbares Teil aufweist, welches zumindest den Abschnitt der Fließbahn umfasst, in dem die Strömungsbegrenzende Verengung (6) angeordnet ist.
5. Viskosimetrischer Affinitätssensor nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Strömungsbegrenzende Verengung (6) durch ein Mikrodialyse- Hohlfaser-Segment oder ein Mikrodialyse-Hohlfasersegment mit integrierte/n Festkörper(n)gebildet wird.
6. Viskosimetrischer Affinitätssensor nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufnahmeraum (7) durch eine Kapillare mit undurchlässiger Wand, die ein begrenztes Gasvolumen enthält, gebildet wird.
7. Viskosimetrischer Affinitätssensor nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Aktor (4) so ausgebildet ist, dass er zur Ausübung der Kraft auf die Trennwand (2) eine Druckänderung im Außenraum (1), im Aufnahmeraum (7) oder/und in der Fließbahn (3) zwischen der Verengung (6) und der elastischen Trennwand (2) hervorrufen kann.
8. Viskosimetrischer Affinitätssensor nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Außenraum (1) zumindest teilweise gasgefüllt ist und an eine Gaspumpe anschließbar ist.
9. Viskosimetrischer Affinitätssensor nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Aktor (4) zur Übertragung einer elektrischen oder magnetischen Kraft direkt auf die elastische Trennwand (2) ausgebildet ist.
10. Viskosimetrischer Affinitätssensor nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Außenraum (1) über eine von undurchlässigen Wänden begrenzte weitere Fließbahn (33), die eine Strömungsbegrenzende Verengung (36) umfasst, mit einem weiteren Aufnahmeraum (37) verbunden ist, wobei die weitere Fließbahn (33) ebenfalls sensitive Flüssigkeit enthält.
11. Viskosimetrischer Affinitätssensor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Aktor (24) oder zwei Aktoren so ausgebildet ist bzw. sind, dass auf beide Räume zwischen der elastischen Trennwand (2) und der jeweiligen Strömungsbegrenzenden Verengung (26, 36) der beiden Fließbahnen (23, 33) oder auf beide Aufnahmeräume (27, 37) die gleiche Kraft oder zwei definierte Kräfte ausgeübt werden können.
12. Viskosimetrischer Affinitätssensor nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass beide Fließbahnen (23, 33) auf einer implantierbaren Sonde liegen.
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