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Viskosimetrische
Affinitätsassays und viskosimetrische Affinitätssensoren
zur Bestimmung von niedermolekularen Analyten beruhen auf der Konkurrenz
der Moleküle eines Analyten mit strukturähnlichen
polymergebundenen Analoga um die Affinitätsbindungsorte
an einem polyvalenten Rezeptormolekül, z. B. einem Antikörper
oder einem Lektin, das die Polymere mit den gebundenen Analoga reversibel vernetzt,
wodurch eine viskose Flüssigkeit entsteht. Die Viskosität
dieser Flüssigkeit beruht auf kurzlebigen Affinitätsbindungen,
durch welche die hydratisierten Polymere vernetzt werden. Die viskose
Flüssigkeit wird als sensitive Flüssigkeit oder
sensitives Sol bezeichnet, weil ihre Viskosität in definierter
Weise von der Konzentration niedermolekularer Analytmoleküle
abhängt. Von besonderem Interesse ist eine gut untersuchte
sensitive Flüssigkeit, die hochmolekulares Dextran und
das Lektin Concanavalin A (ConA) in geeigneten Konzentrationen enthält
und deren Viskosität von der Konzentration niedermolekularer
Glykoliganden, z. B. der Glucose, abhängt (siehe beispielsweise
DE 42 03 466 A1 ;
Ballerstädt R,
Ehwald R. Suitability of aqueous dispersions of dextran and Concanavalin
A for glucose sensing in different variants of the affinity sensor.
Biosensors & Bioelectronics
9, 557–567 (1994);
Ehwald R, Ballerstädt
R, Dautzenberg H. Viscosimetric Affinity Assay, Anal. Biochemistry
234, 1–8 (1996)). Befindet sich diese Lösung
in einem Mikrodialyse-Hohlfasersegment oder einer anderen Dialysekammer
und kann ihre Viskosität gemessen werden, nachdem die Konzentration
des Glycoliganden in der sensitiven Flüssigkeit sich derjenigen
in der Matrix angeglichen hat, entsteht ein Sensor für
niedermolekulare Glykoliganden des Concanavalin A (
DE 42 03 466 A1 ). Viskosimetrische
Sensoren auf dieser Grundlage sind in mehreren Ausführungsformen
bekannt (
Ballerstädt R, Ehwald R. Suitability of
aqueous dispersions of dextran and Concanavalin A for glucose sensing
in different variants of the affinity sensor. Biosensors & Bioelectronics
9, 557–567 (1994);
DE 197 14 087 C2 ;
DE 40 34 565 A1 ;
WO 2004/037079 A1 )
und können zur Messung der Glucosekonzentration im Blut
oder in der interstitiellen Flüssigkeit des Unterhautgewebes
eingesetzt werden, da in diesen physiologischen Flüssigkeiten
andere Glykoliganden des ConA als Glucose normalerweise nicht in
störender Konzentration vorkommen.
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Ein
auf der Grundlage der Druckschrift
DE 197 14 087 C2 entwickelter viskosimetrischer
Durchfluss-Sensor wurde bereits zur Messung der Blutzuckerkonzentration
in klinischen Studien eingesetzt (
Beyer U, Reihl B, Ehwald
R. Recording of subcutaneous glucose dynamics by a viscometric affinity sensor.
Diabetologia 44, 416–423 (2001);
Diem
P, Kalt L, Haueter U, Krinelke L, Fajfr R, Reihl B, Beyer U. Clinical
performance of a continuous viscometric affinity sensor for glucose.
Diabetes Technology and Therapeutics 6, 790–799 (2004)).
Mit Hilfe dieses Systems wurde die Eignung des viskosimetrischen Sensorprinzips
für die kontinuierliche Messung der Glucosekonzentration
in der interstitiellen Flüssigkeit nachgewiesen. Da die
Empfindlichkeit des Sensors im Verlauf einiger Tage unverändert
blieb, reichte eine einzige Eichung für die Aufzeichnung
des Blutglucose-Konzentrationsverlaufes aus. Das Prinzip des Durchfluss-Sensors
besteht in der Erfassung der Viskosität der sensitiven
Flüssigkeit in einer Messkapillare, durch welche sie nach
der Passage durch ein Dialyse-Hohlfasersegment fließt.
Das Durchfluss-System erfordert eine Mikrodialyse-Sonde mit zwei
parallelen kapillaren Fließbahnen und die Integration dieser
Sonde in ein komplexes, relativ aufwendiges mikrofluidisches System
mit einer Mikropumpe, einem größeren Vorrat der
sensitiven Flüssigkeit, zwei Messkapillaren und zwei Drucksensoren.
Die Anwendung des Durchfluss-Systems ist mit dem Risiko verbunden,
dass größere Mengen der sensitiven Flüssigkeit
in das Hautgewebe ausströmen könnten, falls die
Mikrodialyse-Sonde undicht wird.
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Außer
dem genannten Durchfluss-Prinzip sind weitere Möglichkeiten
zur Gestaltung des viskosimetrischen Sensors bekannt. Die bereits
genannte Druckschrift
DE
40 34 565 A1 beschreibt ein Messprinzip für den
viskosimetrischen Sensor, bei dem die sensitive Flüssigkeit
auf einer in sich geschlossenen Fließbahn bewegt wird,
wobei ein Teil dieser Fließbahn durch eine Dialysemembran
nach außen abgeschlossen ist. Ein Vorteil der Verwendung
einer in sich geschlossenen Fließbahn besteht darin, dass durch
das Volumen dieser Fließbahn das Volumen der sensitiven
Flüssigkeit festgelegt wird und daher von osmotischen Vorgängen
unabhängig gestaltet werden kann. Allerdings ist bisher
noch kein implantierbarer Sensor für die medizinische Forschung
oder medizinische Anwendungen auf der Grundlage dieses Prinzips
hergestellt worden. Die Rückführung der von der
Pumpe oder dem Aktor bewegten sensitiven Flüssigkeit zur
Pumpe und die Integration einer miniaturisierten Messvorrichtung
für den strömungsabhängigen Druck oder
die Strömungsgeschwindigkeit in die geschlossen Fließbahn
erfordern die Neuentwicklung mikrotechnischer Bauteile.
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In
der ebenfalls bereits genannten Druckschrift
WO 2004/037079 A1 wird
ein viskosimetrischer Sensor für Glucose beschrieben, bei
dem die sensitive Flüssigkeit ebenfalls auf einer in sich
geschlossenen Bahn bewegt wird. Bei der hier beschriebenen Ausführungsform
des viskosimetrischen Sensors wird die Flüssigkeit in einer
zylindrischen Dialysezelle mit Hilfe eines rotierenden magnetischen Zylinders
durch ein rotierendes Magnetfeld bewegt, wobei die Viskosität
an Hand des Abklingen der trägheitsbedingten Rotation erfasst
wird.
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In
der Druckschrift
DE
100 27 684 A1 wird ein auf der Grundlage der Siliziumtechnologie
konzipierter viskosimetrischer Sensor für niedermolekulare
Anlayte, insbesondere für Glucose, beschrieben. Bei diesem
Sensor befindet sich in der mit der sensitiven Flüssigkeit
gefüllten Mikrodialysekammer ein mikroskopisch kleiner
deformierbarer elastischer Körper, der in Verbindung mit
einer feststehenden, in die Kammerwand integrierten elektrostatischen
oder elektromagnetischen Kraftquelle das Scherfließen der
sensitiven Flüssigkeit bewirkt. Zur Messung der Viskosität
dient die Hochfrequenz-Abstandsmessung zwischen dem deformierbaren
Körper und der Kammerwand, mit deren Hilfe die viskositätsabhängige Bewegungsgeschwindigkeit
des Körpers in der sensitiven Flüssigkeit erfasst
werden kann. Um einen medizinisch anwendbaren viskosimetrischen
Sensor auf dieser Grundlage zu fertigen, müssen noch einige technische
Probleme gelöst werden, insbesondere die äußere
Abgrenzung der die sensitiven Flüssigkeit enthaltenden
Kavität auf dem Siliciumchip durch eine Mikrodialyse-Membran.
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Vor
diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die
Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise zu lösen
bzw. abzumildern.
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Die
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren
nach Anspruch 1 und einen viskosimetrischen Affinitätssensor
nach Anspruch 2 gelöst. Die Unteransprüche beziehen
sich auf vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung.
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Gemäß einem
Aspekt der Erfindung wird ein viskosimetrischer Affinitätssensor
bereitgestellt, der eine mit einer sensitiven Flüssigkeit
zumindest teilweise gefüllte zweiseitig abgeschlossene
Fließbahn oder Fließstrecke, die einen Aufnahmeraum,
eine strömungsbegrenzende Verengung und einen Vorraum umfasst,
aufweist, wobei die Verengung zwischen dem Aufnahmeraum und dem
Vorraum angeordnet ist, und der Vorraum durch eine elastische Trennwand
von einem Außenraum abgegrenzt ist. Weiterhin umfasst der
Affinitätssensor eine Dialysemembran, welche zumindest
einen Teilbereich der Fließbahn nach außen abschließt,
einen Aktor zur Ausübung einer Kraft auf die elastische
Trennwand, und eine Messvorrichtung zum Registrieren des von der
Viskosität der sensitiven Flüssigkeit abhängigen Zeitverlaufes
der Druckdifferenz zwischen dem Außenraum und dem Vorraum.
Die Verengung, durch welche die sensitive Flüssigkeit strömen
kann, ist dabei so ausgebildet, dass jede Position des Lumens der
Fließbahn in der Verengung durch einen Diffusionsweg von
weniger als 1 mm von der Dialysemembran entfernt ist.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Messung der
Konzentration niedermolekularer Analyte bereitgestellt, wobei auf
eine elastische Trennwand, die zwischen einem Außenraum
und einer eine sensitive Flüssigkeit enthaltenden, an zwei
Enden abgeschlossenen Fließbahn liegt, eine Kraft ausgeübt
wird, wodurch in der flüssigkeitsgefüllten Fließbahn
eine Strömung zwischen der elastischen Trennwand und einem
Aufnahmeraum ausgelöst wird, die durch eine Verengung der
durch eine Dialysemembran mindestens teilweise begrenzten Fließbahn
führt und der Zeitverlauf der Druckdifferenz über
die elastische Trennwand gemessen wird.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren und der erfindungsgemäße
Affinitätssensor beruhen auf dem Prinzip zur Messung der
Konzentration niedermolekularer Analyte mit Hilfe einer sensitiven
Flüssigkeit, deren Viskosität von der Analytkonzentration
abhängt. Dabei wird die Strömung der sensitiven
Flüssigkeit durch das Segment beispielsweise einer Mikrodialyse-Hohlfaser
oder eine andere Mikrodialysekammer zur Messung der Viskosität
ausgenutzt
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Im
Gegensatz zum Durchflussverfahren nach Druckschrift
DE 197 14 087 C2 findet
die Viskositätsmessung innerhalb der Dialysekammer statt. Bei
dem mikromechanischen Verfahren nach Druckschrift
DE 100 27 684 A1 wird die
Dialysekammer, anders als bei der hier dargestellten erfinderischen Lösung,
nicht als Ganzes durchströmt; sondern innerhalb der Dialysekammer
geschert. Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte technische
Lösung für die Viskositätsmessung unterscheidet
sich von dem in den Druckschriften
DE 40 34 565 A1 und
WO 2004/037079 A1 dargestellten
Verfahren dadurch, dass die Fließbahn nicht durch eine
in sich geschlossene kapillare, sondern durch eine an ihren Enden
abgeschlossene Strömungs- oder Fließbahn gebildet
wird. Die sensitive Flüssigkeit, die die beispielsweise
kapillare Fließbahn bzw. einen Hohlleiter erfüllt,
fließt zwischen dem Teil der kapillaren Fließbahn,
die durch eine deformierbare Trennwand nach außen abgegrenzt
ist und einem anderen Teil (Aufnahmeraum) der kapillaren Fließbahn,
der eine begrenzte Menge der sensitiven Flüssigkeit aufnehmen oder
abgeben kann. Sie fließt dabei durch eine zwischen diesen
Teilen liegende strömungsbegrenzende Verengung der Fließbahn,
deren Volumen durch eine Mikrodialyse-Membran im Diffusionsaustausch mit
dem äußeren Medium steht. Die Strömung
der Flüssigkeit wird durch Übertragung einer Kraft
auf eine an die Flüssigkeit in der kapillaren Fließbahn grenzende
elastische Trennwand ausgelöst. Der Aufnahmeraum ist nach
außen abgeschlossen und kann ein begrenztes Volumen aufnehmen
oder abgeben, das für die Messung der Viskosität
an Hand des Zeitverlaufes der Druckdifferenz an der elastischen Trennwand
ausreicht. Die Fähigkeit des Aufnahmeraums zur Volumenaufnahme
oder Volumenabgabe kann darauf beruhen, dass seine Wände
für Wasser ausreichend permeabel sind, dass in ihm ein
kleines elastisches gasgefülltes Volumen eingeschlossen
ist oder dass seine Wände eine ausreichende elastische
Dehnbarkeit besitzen. Bei dem erfindungsgemäßen
viskosimetrischen Affinitätssensor wird nur eine kapillare
Fließbahn benötigt; daher kann der Durchmesser
der implantierbaren Mikrodialyse-Sonde sehr klein gestaltet werden
kann. Mit der Erfindung werden die technischen Möglichkeiten
zur Herstellung schmerzarm und verletzungsarm implantierbarer wenig
invasiver Affinitätssensoren für Glucose und andere
Analyte erweitert.
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Die
Viskosität der sensitiven Flüssigkeit wird auf
Grund des Flusses der sensitiven Flüssigkeit durch die
Verengung bestimmt, wobei der Fluss durch einen Druckgradienten über
der Verengung erzeugt wird. Dieser Druckgradient wird durch Betätigen
des Aktors hervorgerufen. Durch den Aktor kann beispielsweise der
Druck im Vorraum erhöht werden. Dadurch wird sowohl ein
Druckgradienten zwischen Vorraum und Aufnahmeraum, d. h. über die
Verengung, als auch zu einer Druckdifferenz zwischen Vorraum und
Außenraum, d. h. über die Trennwand, aufgebaut.
Im Ergebnis fließt die sensitive Flüssigkeit vom
Vorraum in den Aufnahmeraum. Dies führt zu einer messbaren
Druckrelaxation über der Trennwand. Umgekehrt ist es möglich,
durch den Aktor einen Druck auf die sensitive Flüssigkeit
im Aufnahmeraum auszuüben und so einen Fluss in den Vorraum
zu induzieren und den Druckanstieg über der Trennwand als
Messsignal zu verwenden. Der Aktor muss hierzu nicht direkt auf
den Aufnahmeraum oder den Vorraum wirken. Beispielsweise kann der
Aktor den Druck in einem Fluid im Außenraum beeinflussen, wobei
der Druck auf den Vorraum über die elastische Membran übertragen
wird.
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Ein
Vorteil des erfindungsgemäßen Affinitätssensors
ist, dass die Verengung der Dialysemembran sehr nahe ist. Dadurch
kann sich die Viskosität in der Verengung sehr schnell
an veränderte Konzentrationen des Analyten anpassen.
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Unter
einer sensitiven Flüssigkeit wird, wie einleitend beschrieben,
eine Flüssigkeit verstanden, deren Viskosität
von der Konzentration des Analyten abhängt.
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Der
erfindungsgemäße viskosimetrische Affinitätssensor
gestattet insbesondere, folgende, für die medizinische
und klinische Forschung wichtige Kriterien zu erfüllen:
- 1. Die zur Messung eingesetzte sensitive Flüssigkeit
soll während des Messzeitraumes in der Mikrodialysekammer
verbleiben. Dies ermöglicht, den Einfluss des Dialysates
des Blutplasmas und der interstitiellen Flüssigkeit auf
die Langzeitstabilität der sensitiven Flüssigkeit
zu untersuchen.
- 2. Die sensorische Oberfläche soll möglichst schmerzfrei
und verletzungsarm in das Unterhautfettgewebe eingeführt
werden können.
- 3. Der Sensor soll aus industriell gefertigten und allgemein
verfügbaren Bauteilen hergestellt werden können
und miniaturisierbar sein.
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Im
Folgenden soll die Erfindung anhand eines in der anhängenden
Figur gezeigten Ausführungsbeispiels näher erläutert
werden Die Erfindung ist jedoch nicht auf die konkret beschriebene
Ausführungsform beschränkt, sondern kann in geeigneter Weise
abgeändert werden. Die in den Figuren gezeigten Ausführungsformen
sind nicht maßstabsgetreu gezeichnet, sondern dienen lediglich
dem besseren Verständnis.
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1 zeigt
eine Ausführungsform mit einer Fließbahn.
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2 zeigt
eine Ausführungsform mit zwei Fließbahnen.
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Zunächst
soll die Herstellung einer einfachen Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Affinitätssensors erläutert
werden.
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Durch
eine axiale Durchgangsbohrung in einem beispielsweise 1 cm langen
Messingblock mit einer seitlichen Gewindebohrung, die senkrecht
zur Durchgangsbohrung verläuft und zumindest bis zu dieser
reicht, und einer passenden Schraube wird ein elastischer Silikonschlauch,
dessen äußerer Durchmesser im entspannten Zustand
größer als der Durchmesser der Durchgangsbohrung
ist, im längsgespannten Zustand hindurchgezogen. Nach dem Wegfall
der Längsspannung legt sich der Silikonschlauch an die
Durchgangsbohrung dicht an. Die herausragenden Enden werden abgeschnitten
und der Messingblock wird mit einer seiner Seiten, auf welcher die
Bohrung ist, auf das Gehäuse eines handelsüblichen
Drucksensors mit einem Messbereich von beispielsweise 500 mbar (5·104 Pa) und einer elastischen Volumenkapazität
von beispielsweise ca. 100 nl geklebt. Der Drucksensor ist für
die Messung der Druckdifferenz zwischen einem Gasraum und einer
Flüssigkeit ausgelegt. Beispielsweise führt die Deformation
einer elastischen Halbleiter-Biegeplatte in diesem Sensor zu einer
Widerstandsänderung, die das primäre Mess-Signal
darstellt.
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In
die mit dem Silikonschlauch ausgekleidete und mit einer Flüssigkeit
gefüllte Durchgangsbohrung kann durch eine Silikon-Dichtung
eine dünne Dialyse-Nadel eingeführt werden. Um
bei diesem Prozess den Druck in dem flüssigkeitsgefüllten
Raum kontrollieren zu können, wird die Schraube in die
seitliche Gewindebohrung so weit eingeführt, dass sie die
Silikongummi-Auskleidung deformiert und eine Druckmanipulation möglich
wird.
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Zur
Herstellung der Dialyse-Nadel aus beispielsweise Edelstahl wird
in ein beispielsweise 1,5 cm langes Segment einer handelsüblichen
Dialyse-Hohlfaser aus beispielsweise regenerierter Zellulose mit
einem Innendurchmesser von beispielsweise 200 μm ein beispielsweise
5 mm langes Segment eines Nylonfadens mit einem Durchmesser von
beispielsweise 150 μm eingeführt und in deren
Mitte an der Wand der Dialysehohlfaser durch lokale Klebung befestigt.
Eine beispielsweise 20 mm lange, an einem Ende schräg angeschliffene
Kanüle mit einem Außendurchmesser von beispielsweise
0,4 mm und einem Innendurchmesser von beispielsweise 0,3 mm wird
in der Mitte so geschliffen, das beispielsweise drei 8 mm lange
schlitzförmige Fenster entstehen. Außerdem wird
mit einem Schleifgerät beispielsweise 2 mm hinter dem schrägen
angeschliffenen Ende der Kanüle eine kurze seitliche Öffnung
(beispielsweise 1 mm) hergestellt. Das so hergestellte Metallgerüst
der Dialysesonde wird sorgfältig entfettet.
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Der
Außendurchmesser einer Hohlfaser mit einer Wand aus gasdurchlässigem
porösem hydrophoben Polypropylen wird durch kontrollierte
Dehnung genau an den Innendurchmesser der Edelstahl-Kanüle
angepasst. Die Polypropylenhohlfaser hat eine Porenweite von beispielsweise
0,2 μm und ist nur für Gas, nicht jedoch für
Flüssigkeit durchlässig. Ein beispielsweise 5
mm langes Segment dieser Faser wird von der schrägen Öffnung
her in die Kanüle hereingeschoben und an den Rändern
mit der Stahlkanüle mit selbst härtendem Klebstoff
verklebt. Die schräge Öffnung an der Spitze der
Kanüle wird ebenfalls mit Hilfe des Klebstoffs verschlossen.
Die Kanülenspitze wird nach der Aushärtung des
Klebstoffes wieder scharf angeschliffen. Von der anderen Seite wird
die Mikrodialyse-Hohlfaser aus regenerierter Zellulose in die Kanüle
eingeführt. Danach befindet sich der Hohlfaserabschnitt
mit dem Nylonfaden im Bereich der Fensterschlitze. Die Mikrodialyse-Hohlfaser
wird an den Fenster-Enden und an der Öffnung dicht eingeklebt.
Das überstehende Ende des Hohlfasersegmentes wird an der
Kanülenbasis abgeschnitten. Die Hohlräume des
Drucksensors und die mit Silikongummi ausgekleidete Durchgangsbohrung
des Messingblockes werden gasfrei mit der sensitiven Flüssigkeit
gefüllt. Dazu wird mit Hilfe eines dünnen Silikonschlauches
die Mikrodialysesonde mit einer die sensitive Flüssigkeit
enthaltenden 50 μl-Spritze verbunden. Die sensitive Flüssigkeit
wird langsam in die einseitig verschlossene Mikrodialyse-Sonde eingeführt,
wobei das Gas durch die poröse Membran der Polypropylenfaser
vor der seitlichen Öffnung nahe dem verschlossenen Ende
der Kanüle entweichen kann. Die seitliche Öffnung
wird anschließend verklebt. Die Kanüle enthält
danach an der Spitze einen kleinen Gasraum (beispielsweise 200–500 nl),
weil die komprimierte Luft hinter der seitlichen Öffnung
keinen Ausweg besitzt. Die Basis der so gefüllten Kanüle
wird mit dem die sensitive Flüssigkeit enthaltenden Raum
in dem Messingblock am Drucksensor unter Vermeidung weiteren Gaseinschlusses verbunden.
Hierzu wird die Kanüle mit dem flüssigkeitsbedeckten
offenen Ende durch eine flüssigkeitsgefüllte Silikongummidichtung
allmählich in diesen mit sensitiver Flüssigkeit
gefüllten Raum hinein geschoben, wobei der Druckanstieg
am Drucksensor gemessen und durch die seitlich am Messingblock angebrauchte
Schraube kontrolliert wird.
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Im
Folgenden wird, ausgehend von der oben hinsichtlich der Herstellung
beschriebenen Ausführungsform, der erfindungsgemäße
Affinitätssensor an Hand von schematischen Figuren erläutert.
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Der
Sensor umfasst einen Außenraum 1, der durch eine
elastische Trennwand 2 von einer mit Flüssigkeit
gefüllten Fließbahn 3 getrennt wird,
wobei die Fließbahn 3 an zwei von einander entfernten
Enden verschlossen ist. Weiterhin weist der Sensor einen Aktor 4,
mit dessen Hilfe eine Kraft auf die elastische Trennwand 2 ausgeübt
werden kann, auf. Eine Messvorrichtung 5 zur Erfassung
der Druckdifferenz zwischen dem Außenraum 1 und
der Flüssigkeit auf der Fließbahn 3,
mit der die Trennwand in Kontakt steht, ist vorgesehen. Die Fließbahn 3 weist
eine strömungsbegrenzende Verengung 6 auf, wobei
jede Position des Lumens der Fließbahn in dieser Verengung
weniger als 1 mm von einer Mikrodialyse-Membran 9 entfernt
ist. Außerdem weist der Sensor einen abgeschlossenen Aufnahmeraum 7 auf.
Die seitliche Öffnung der Kanüle 15,
welche mit der an der Innenwand der Kanüle 15 anliegenden
gasdurchlässigen porösen hydrophoben Polypropylenhohlfaser 17 bedeckt
und von außen mit einem Klebstoff nach dem Befüllen
der Kanüle 15 mit der sensitiven Flüssigkeit verschlossen
wird, ist mit 10 bezeichnet.
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Der
Aufnahmeraum 7 steht nur durch die strömungsbegrenzende
Verengung 6, welche seitlich durch die Mikrodialyse-Membran 9 abgeschlossen ist,
mit der elastischen Trennwand 2 in Verbindung und ermöglicht
den Fluss eines begrenzten Volumens der sensitiven Flüssigkeit
durch die strömungsbegrenzende Verengung 6. Der
Außenraum 1 ist bei der dargestellten Ausführungsform
mit der Atmosphäre verbunden. Die elastische Trennwand 2 ist
bei der dargestellten Ausführungsform die Halbleiter-Biegeplatte
des Drucksensors in der Kombination mit deren elastischen Verankerung.
Die flüssigkeitsgefüllte Fließbahn 3 umfasst
bei der dargestellten Ausführungsform die flüssigkeitsgefüllten
Räume im Drucksensor, in der mit Silkongummischlauch 13 ausgefüllten
Durchgangsbohrung 16, in der strömungsbegrenzenden
Verengung 6 und im Aufnahmeraum 7 bis zu dem gasgefüllten
Raum 11 vor dem terminalen Verschluss der Kanüle 15.
Der bei der dargestellten Ausführungsform manuell zu bedienende
Aktor 4 ist die Stellschraube an der seitlichen Gewindebohrung
in dem durchbohrten Messingblock 14. Die Messvorrichtung 5 ist
ein handelsüblicher Drucksensor zur Aufzeichnung der Druckdifferenz auf
der Grundlage des elektrischen Widerstandes einer Halbleiterbiegeplatte.
Die strömungsbegrenzende Verengung 6 wird bei
dieser Ausführungsform durch Integration eines zylindrischen
Körpers 12 in das Hohlfaser-Segment realisiert.
Die Fähigkeit des Aufnahmeraums 7 zur Aufnahme
oder Abgabe eines begrenzten Volumens wird in dem dargestellten
Ausführungsbeispiel durch den Einschluss eines begrenzten
Gasvolumens 11 realisiert, das sich beim Einströmen
in den Aufnahmeraum 7 komprimieren und beim Ausströmen
entspannen kann.
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Die
Viskosität der sensitiven Flüssigkeit wird mit
diesem Sensor dadurch erfasst, dass durch Verdrehen der Stellschraube 4 Flüssigkeit
aus dem Vorraum 8 teilweise verdrängt und dadurch
eine Kraft auf die elastische Trennwand 2 ausgeübt
wird, deren Deformation der Druckdifferenz zwischen dem Außenraum 1 und
dem Vorraum 8 proportional ist. Die Messvorrichtung 5 misst
diese Druckdifferenz. Da die strömungsbegrenzende Verengung 6 einen
sofortigen Druckausgleich mit dem Aufnahmeraum 7 verhindert
und die elastische Volumenkapazität des Aufnahmeraums 7 größer
als die elastische Volumenkapazität der elastischen Trennwand 2 ist,
kommt es zu einer gut messbaren Druckrelaxation, deren Halbwertszeit
der Viskosität der sensitiven Flüssigkeit proportional
ist. Der Zeitverlauf der Druckrelaxation wird durch den Drucksensor 5 sehr
genau erfasst.
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Jede
der genannten Komponenten kann in verschiedenen Ausführungsformen
realisiert werden, wie im Folgenden erläutert wird. Beispielsweise
können zusätzlich zu der Biegeplatte und den anderen Bestandteilen
des Drucksensors weitere Komponenten zur Elastitizität
der Trennwand beitragen. Es ist möglich, dass der Außenraum
ein Fluid enthält, dessen Druck verändert werden
kann. Ein solcher Außenraum könnte die Funktion
des Aktors übernehmen, zum Beispiel, wenn er gasgefüllt
ist und an eine Gaspumpe angeschlossen wird. Es sind Ausführungsformen
des Aktors möglich, bei denen die Kraft ohne Vermittlung
durch ein Fluid direkt durch ein elektrisches oder magnetisches
Feld auf die elastische Trennwand übertragen wird. Der
Sensor kann auch so gestaltet werden, dass der Aktor eine Kraft auf
die flüssige Matrix in der Umgebung der Messsonde ausübt
und diese Kraft hydraulisch über die strömungsbegrenzende
Verengung auf die elastische Trennwand übertragen wird.
Ebenso ist es möglich, dass der Aktor auf die Flüssigkeit
im Aufnahmeraum wirkt und dadurch einen Fluss durch die strömungsbegrenzende
Verengung induziert, der dann zu einer messbaren Druckdifferenz
an der elastischen Trennwand führt.
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Es
gibt verschiedene physikalische Möglichkeiten zur Erfassung
der Druckdifferenz über die elastische Trennwand, z. B.
die Messung einer Kapazität anstelle der Messung eines
Widerstandes.
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Die
strömungsbegrenzende Verengung kann in verschiedener Weise
gestaltet werden, beispielsweise durch einen Abschnitt, in dem das
Lumen des zylinderförmigen Hohlfasersegmentes sehr eng
ist oder durch die Deformation eines zylindrischen Hohlfasersegmentes.
Falls, wie in dem dargestellten Ausführungsbeispiel, die
strömungsbegrenzende Verengung der Fließbahn durch
den Einschluss eines oder mehrerer fester Körpers erfolgt,
können/kann diese/r Körper umströmbar
sein. Die Verengung kann auch in der Form einer kurzen durchströmbaren
Blende realisiert werden. Wesentlich ist, dass der Analyt, z. B.
Glucose, durch die Hohlfasermembran in einer für die Mikrodialyse
typischen Zeit (< 10
min) das Diffusionsgleichgewicht mit der sensitiven Flüssigkeit
in der strömungsbegrenzenden Verengung erreichen kann,
ohne dass es einer zusätzlichen Strömung bedarf.
Hierzu muss die Entfernung der Dialysemembran von jeder Position
in der flüssigkeitsgefüllten Fließbahn
in der Verengung kleiner als 1 mm sein. Dies lässt sich
dadurch erreichen, dass beispielsweise die strömungsbegrenzende
Verengung zumindest teilweise, beispielsweise auf einer Seite, von
der Mikrodialyse-Membran begrenzt ist. Die strömungsbegrenzende
Verengung kann sich daher in Strömungsrichtung auch über
einen gewissen Bereich erstrecken, da eine Seitenwand der Verengung
durch die Mikrodialyse-Membran gebildet wird. Ebenso kann bei Verwendung
einer Blende aus einem nicht- permeablen Material als strömungsbegrenzende
Verengung, die Blende in Strömungsrichtung relativ kurz
ausgebildet werden, wobei die Mikrodialyse-Membran dann die Fließbahn
unmittelbar vor oder hinter Blende zumindest teilweise abgrenzt.
Vorzugsweise wird die strömungsbegrenzende Verengung, wie
in dem angeführten Ausführungsbeispiel auf beiden
Seiten durch einen Abschnitt der Fließbahn begrenzt, der
ebenfalls für den Analyten durch Diffusion von außen
erreichbar ist bzw. von einer Mikrodialyse-Membran abgegrenzt ist.
Durch die räumlich eng benachbarte Anordnung von Verengung,
welche die Strömungsgeschwindigkeit der sensitiven Flüssigkeit begrenzt
und dadurch die Viskositätsmessung ermöglicht,
und dem Bereich, in dem der Analytaustausch erfolgt, kann problemlos
gewährleistet werden, dass die beim Messvorgang durch die
Verengung strömende sensitive Flüssigkeit hinsichtlich
der Analytkonzentration mit der Matrix im Gleichgewicht steht. Dadurch
wird die Ansprechzeit des Sensors wesentlich erhöht. Außerdem
kann die Sonde, welche die Verengung und die Dialysemembran umfasst,
sehr klein gehalten werden. Dies ermöglicht die Herstellung
von kleinen und leicht implantierbaren Sonden. Außerdem
vermeidet die räumlich eng benachbarte Anordnung von Verengung
und Dialysemembran weitgehend ein Totvolumen, das sich bei räumlich
größerer Entfernung zwischen Dialysemembran und
Verengung ausbildet. Die in einem solchen Totvolumen enthaltene
sensitive Flüssigkeit steht nämlich hinsichtlich
der Analytkonzentration mit der Matrix nicht im Gleichgewicht und
muss daher durch einströmende Flüssigkeit aus
dem Dialyseraum ersetzt werden.
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Es
bestehen mehrere prinzipiell anwendbare Möglichkeiten zur
Gestaltung des Aufnahmeraumes. Letzterer muss ein begrenztes Volumen
der sensitiven Flüssigkeit aus dem übrigen Teil
der flüssigkeitsgefüllten Fließbahn aufnehmen
oder an sie abgeben können. Dies kann, wie im dargestellten
Fall, durch den Einschluss eines begrenzten Gasvolumens realisiert
werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass der
Aufnahmeraum auf Grund der elastischen Dehnbarkeit seiner Wand eine
begrenzte, für die Deformation der elastischen Trennwand
ausreichende Volumenkapazität besitzt. In diesem Fall kann
der Aufnahmeraum vollständig mit Flüssigkeit gefüllt sein.
Es ist auch eine Ausführungsform der Erfindung möglich,
bei der ein Aufnahmeraum als kapillare Dialyse- oder Ultrafiltrationsmembran
realisiert wird und die für den Messvorgang erforderliche
Volumenverschiebung durch eine hohe Permeabilität dieser Membran
für Wasser gewährleistet wird
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Der
erfindungsgemäße Affinitätssensor kann in
den bisher beschriebenen Varianten zur Untersuchung des Einflusses
der Matrix auf die Stabilität der sensitiven Flüssigkeit
eingesetzt werden. Er stellt auch eine günstige Ausführungsform
des viskosimetrischen Affinitätssensors für die
Kontrolle der Konzentration der Glucose in der interstitiellen Flüssigkeit
dar. Für diese Anwendung ist es vorteilhaft, wenn die Viskosität
der sensitiven Flüssigkeit, die mit der interstitiellen
Flüssigkeit austauscht, mit der Viskosität der
gleichen sensitiven Flüssigkeit, die eine definierte Konzentration
an Glucose enthält, verglichen wird [Beyer U, Ehwald
R: Compensation of temperature and Concanavalin A concentration
effects for gucose determination by the viscometric affinity assay]. Um
diesen Vergleich durchzuführen, wird gemäß einer
Ausführungsform, die schematisch in 2 gezeigt
ist, der Außenraum als zweite Fließbahn 30 mit einer
strömungsbegrenzenden Verengung 36 und einem Aufnahmeraum 37 gestaltet,
wobei die so realisierte zweite Fließbahn 33 die
sensitive Flüssigkeit mit einer definierten Konzentration
an Glucose enthält und nicht von einer Mikrodialyse-Membran,
sondern von undurchlässigen Wänden 32 begrenzt
wird. Die strömungsbegrenzende Verengung 33 der
zweiten Fließbahn 33 liegt zwischen der elastischen Trennwand 2 und
dem Aufnahmeraum 37, dessen elastische Volumenkapazität
größer ist als die elastische Volumenkapazität
der Trennwand.
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Die
erste Fließbahn 23 in diesem Ausführungsbeispiel
umfasst einen Vorraum (28), der über eine strömungsbegrenzende
Verengung 36 mit einem Aufnahmeraum 27 verbunden
ist. Der Aufnahmeraum 27 enthält an seinem toten
Ende ein Gasvolumen 21, welches die Aufnahme von Flüssigkeit
in den Aufnahmeraum 27 unter Komprimierung des Gasvolumens
ermöglicht. Der Aufnahmeraum 37 der zweiten Fließbahn
verfügt ebenfalls über ein entsprechendes Gasvolumen 31.
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Im
Gegensatz zur zweiten Fließbahn 33, ist die erste
Fließbahn 23 abschnittsweise von einer Dialysemembran
begrenzt. Die strömungsbegrenzenden Verengungen 26 und 36 in
beiden Fließbahnen sind hier durch kurze Blenden realisiert.
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Für
den Messvorgang wird bei dieser Ausführungsform beispielsweise
auf hydraulischem Wege die gleiche Kraft auf die beiden an die elastische
Trennwand 2 grenzenden Flüssigkeitsräume, die
jeweils mit einer der Fließbahnen in fluidischer Verbindung
stehen, ausgeübt. Dies ist in 2 durch den
Aktor 24 angedeutet. Der anschließend mittels der
Messvorrichtung 5 messbare Zeitverlauf der Druckdifferenz über
der Trennwand 2 resultiert aus der Relation der Viskositäten
der sensitiven Flüssigkeit in den beiden Verengungen, wobei
die Viskosität in der zweiten Fließbahn als Referenz
dient. Der Affinitätssensor kann so gestaltet werden, dass
die beiden kapillaren Fließbahnen nebeneinander auf der gleichen
Sonde liegen, so dass der Temperatureffekt auf die Viskosität
im Mess-Signal kompensiert wird.
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Es
ist ebenfalls möglich, dass die Fließbahn ein
nicht mit der sensitiven Flüssigkeit vermischbares Fluid,
beispielsweise ein Öl, enthält, das die Fließbahn
zwischen der elastischen Trennwand und der strömungsbegrenzenden
Verengung, ohne diese zu erreichen, füllt. Dieses Fluid
dient damit zur Druckvermittlung zwischen elastischer Trennwand
und der sensitiven Flüssigkeit.
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Der
Raum, welcher die elastische Trennwand aufweist, kann auch durch
vergleichsweise lange Zuleitungen, die mit der sensitiven Flüssigkeit oder
dem Fluid gefüllt ist, mit dem Vorraum verbunden werden.
Dadurch kann die die strömungsbegrenzende Verengung sowie
den Aufnahmeraum umfassende Sonde als kleine und leicht implantierbare
separate Sonde ausgeführt werden. Der Vorraum kann ebenfalls
in der Sonde untergebracht sein, und mit der elastischen Trennwand über
das in der Zuleitung enthaltene Fluid kommuniziert.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren kann in allgemeinen
Worten auch wie folgt zusammengefasst werden:
- – Bereitstellen
einer an zwei Enden abgeschlossenen Fließbahn, die eine
in Diffusionsaustausch hinsichtlich eines Analyten mit einer äußeren
Matrix stehende strömungsbegrenzende Verengung, welche
zwischen einem ersten Raum und einem zweiten Raum der Fließbahn
angeordnet ist, aufweist, wobei die Fließbahn mit einer
sensitiven Flüssigkeit, deren Viskosität von der
Konzentration des Analyten abhängt, zumindest teilweise
gefüllt ist und auf der Seite des ersten Raums durch eine
elastische Trennwand von einem Außenraum getrennt ist;
- – Hervorrufen einer Druckdifferenz in der Fließbahn
zwischen dem Vorraum und dem Aufnahmeraum;
- – Ermitteln der zeitlichen Verlaufs der Druckdifferenz über
der elastischen Trennwand,
- – Ermitteln der Konzentration des Analyten aus dem
ermittelten zeitlichen Verlauf.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen viskosimetrischen Affinitätssensor
mit einer Mikrodialyse-Sonde mit sehr kleinem Durchmesser und sehr kleinem
Volumen des implantierbaren Teils, in die nur eine kapillare Fließbahn
integriert ist. Der erfindungsgemäße Affinitätssensor
kann aus industriell gefertigten marktüblichen Teilen hergestellt
werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur
Messung der Viskosität der in einer Dialysesonde fließenden
sensorischen Flüssigkeit wird die kapillare Fließbahn
an einem Ende von einer elastischen Trennwand von einem Außenraum
getrennt und besitzt am anderen Ende einen abgeschlossenen Aufnahmeraum.
In der kapillaren Fließbahn befindet sich eine strömungsbegrenzende
Verengung, die für den Analyten von außen auf
dem Wege der Diffusion durch eine Mikrodialyse-Membran zugänglich
ist. Beim Messvorgang wird durch einen in den Sensor integrierten
Aktor auf die elastische Trennwand eine Kraft ausgeübt.
Hierbei wird die sensitive Flüssigkeit durch die strömungsbegrenzende
Verengung der kapillaren Fließbahn bewegt, und der von
der Konzentration des Analyten abhängige Zeitverlauf der
Druckdifferenz über die elastische Trennwand wird durch
eine in den Sensor integrierte Messvorrichtung registriert. Das Messprinzip
eignet sich für die Erfassung einer Messgröße,
die auf einen Referenzwert definierter Analytkonzentration bezogen
ist.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 4203466
A1 [0001, 0001]
- - DE 19714087 C2 [0001, 0002, 0011]
- - DE 4034565 A1 [0001, 0003, 0011]
- - WO 2004/037079 A1 [0001, 0004, 0011]
- - DE 10027684 A1 [0005, 0011]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Ballerstädt
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for glucose. Diabetes Technology and Therapeutics 6, 790–799 (2004) [0002]
- - Beyer U, Ehwald R: Compensation of temperature and Concanavalin
A concentration effects for gucose determination by the viscometric
affinity assay [0032]