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Viskosimetrische
Affinitätsassays
und viskosimetrische Affinitätssensoren
zur Bestimmung von niedermolekularen Analyten beruhen auf der Konkurrenz
der Moleküle
eines Analyten mit strukturähnlichen
polymergebundenen Analoga um die Affinitätsbindungsorte an einem polyvalenten
Rezeptormolekül,
z. B. einem Antikörper
oder einem Lektin, das die Polymere mit den gebundenen Analoga reversibel vernetzt,
wodurch eine viskose Flüssigkeit
entsteht. Die Viskosität
dieser Flüssigkeit
beruht auf kurzlebigen Affinitätsbindungen,
durch welche die hydratisierten Polymere vernetzt werden. Die viskose
Flüssigkeit
wird als sensitive Flüssigkeit
oder sensitives Sol bezeichnet, weil ihre Viskosität in definierter
Weise von der Konzentration niedermolekularer Analytmoleküle abhängt. Von
besonderem Interesse ist eine gut untersuchte sensitive Flüssigkeit,
die hochmolekulares Dextran und das Lektin Concanavalin A (ConA)
in geeigneten Konzentrationen enthält und deren Viskosität von der
Konzentration niedermolekularer Glykoliganden, z. B. der Glucose,
abhängt (siehe
beispielsweise
DE 42
03 466 A1 ; Ballerstädt R,
Ehwald R. Suitability of aqueous dispersions of dextran and Concanavalin
A for glucose sensing in different variants of the affinity sensor.
Biosensors & Bioelectronics
9, 557–567
(1994); Ehwald R, Ballerstädt
R, Dautzenberg H. Viscosimetric Affinity Assay, Anal. Biochemistry
234, 1–8
(1996)). Befindet sich diese Lösung
in einem Mikrodialyse-Hohlfasersegment oder einer anderen Dialysekammer
und kann ihre Viskosität
gemessen werden, nachdem die Konzentration des Glycoliganden in
der sensitiven Flüssigkeit
sich derjenigen in der Matrix angeglichen hat, entsteht ein Sensor
für niedermolekulare
Glykoliganden des Concanavalin A (
DE 42 03 466 A1 ). Viskosimetrische Sensoren
auf dieser Grundlage sind in mehreren Ausführungsformen bekannt (Ballerstädt R, Ehwald
R. Suitability of aqueous dispersions of dextran and Concanavalin
A for glucose sensing in different variants of the affinity sensor.
Biosensors & Bioelectronics
9, 557–567
(1994);
DE 197 14
087 C2 ;
DE
40 34 565 A1 ;
WO
2004/037079 A1 ) und können zur
Messung der Glucosekonzentration im Blut oder in der interstitiellen
Flüssigkeit
des Unterhautgewebes eingesetzt werden, da in diesen physiologischen Flüssigkeiten
andere Glykoliganden des ConA als Glucose normalerweise nicht in
störender
Konzentration vorkommen.
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Ein
auf der Grundlage der Druckschrift
DE 197 14 087 C2 entwickelter viskosimetrischer
Durchfluss-Sensor wurde bereits zur Messung der Blutzuckerkonzentration
in klinischen Studien eingesetzt (Beyer U, Reihl B, Ehwald R. Recording
of subcutaneous glucose dynamics by a viscometric affinity sensor.
Diabetologia 44, 416–423
(2001); Diem P, Kalt L, Haueter U, Krinelke L, Fajfr R, Reihl B,
Beyer U. Clinical performance of a continuous viscometric affinity
sensor for glucose. Diabetes Technology and Therapeutics 6, 790–799 (2004)).
Mit Hilfe dieses Systems wurde die Eignung des viskosimetrischen Sensorprinzips
für die
kontinuierliche Messung der Glucosekonzentration in der interstitiellen
Flüssigkeit nachgewiesen.
Da die Empfindlichkeit des Sensors im Verlauf einiger Tage unverändert blieb,
reichte eine einzige Eichung für
die Aufzeichnung des Blutglucose-Konzentrationsverlaufes
aus. Das Prinzip des Durchfluss-Sensors besteht in der Erfassung
der Viskosität
der sensitiven Flüssigkeit
in einer Messkapillare, durch welche sie nach der Passage durch
ein Dialyse-Hohlfasersegment fließt. Das Durchfluss-System erfordert
eine Mikrodialyse-Sonde mit zwei parallelen kapillaren Fließbahnen
und die Integration dieser Sonde in ein komplexes, relativ aufwendiges
mikrofluidisches System mit einer Mikropumpe, einem größeren Vorrat
der sensitiven Flüssigkeit,
zwei Messkapillaren und zwei Drucksensoren. Die Anwendung des Durchfluss-Systems
ist mit dem Risiko verbunden, dass größere Mengen der sensitiven
Flüssigkeit
in das Hautgewebe ausströmen
könnten,
falls die Mikrodialyse-Sonde undicht wird.
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Außer dem
genannten Durchfluss-Prinzip sind weitere Möglichkeiten zur Gestaltung
des viskosimetrischen Sensors bekannt. Die bereits genannte Druckschrift
DE 40 34 565 A1 beschreibt
ein Messprinzip für
den viskosimetrischen Sensor, bei dem die sensitive Flüssigkeit
auf einer in sich geschlossenen Fließbahn bewegt wird, wobei ein
Teil dieser Fließbahn
durch eine Dialysemembran nach außen abgeschlossen ist. Ein
Vorteil der Verwendung einer in sich geschlossenen Fließbahn besteht
darin, dass durch das Volumen dieser Fließbahn das Volumen der sensitiven
Flüssigkeit
festgelegt wird und daher von osmotischen Vorgängen unabhängig gestaltet werden kann.
Allerdings ist bisher noch kein implantierbarer Sensor für die medizinische
Forschung oder medizinische Anwendungen auf der Grundlage dieses
Prinzips hergestellt worden. Die Rückführung der von der Pumpe oder
dem Aktor bewegten sensitiven Flüssigkeit
zur Pumpe und die Integration einer miniaturisierten Messvorrichtung
für den
strömungsabhängigen Druck
oder die Strömungsgeschwindigkeit in
die geschlossen Fließbahn
erfordern die Neuentwicklung mikrotechnischer Bauteile.
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In
der ebenfalls bereits genannten Druckschrift
WO 2004/037079 A1 wird
ein viskosimetrischer Sensor für
Glucose beschrieben, bei dem die sensitive Flüssigkeit ebenfalls auf einer
in sich geschlossenen Bahn bewegt wird. Bei der hier beschriebenen
Ausführungsform
des viskosimetrischen Sensors wird die Flüssigkeit in einer zylindrischen
Dialysezelle mit Hilfe eines rotierenden magnetischen Zylinders
durch ein rotierendes Magnetfeld bewegt, wobei die Viskosität an Hand
des Abklingen der trägheitsbedingten
Rotation erfasst wird.
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In
der Druckschrift
DE
100 27 684 A1 wird ein auf der Grundlage der Siliziumtechnologie
konzipierter viskosimetrischer Sensor für niedermolekulare Anlayte,
insbesondere für
Glucose, beschrieben. Bei diesem Sensor befindet sich in der mit
der sensitiven Flüssigkeit
gefüllten
Mikrodialysekammer ein mikroskopisch kleiner deformierbarer elastischer Körper, der
in Verbindung mit einer feststehenden, in die Kammerwand integrierten
elektrostatischen oder elektromagnetischen Kraftquelle das Scherfließen der
sensitiven Flüssigkeit
bewirkt. Zur Messung der Viskosität dient die Hochfrequenz-Abstandsmessung zwischen
dem deformierbaren Körper
und der Kammerwand, mit deren Hilfe die viskositätsabhängige Bewegungsgeschwindigkeit
des Körpers
in der sensitiven Flüssigkeit
erfasst werden kann. Um einen medizinisch anwendbaren viskosimetrischen
Sensor auf dieser Grundlage zu fertigen, müssen noch einige technische
Probleme gelöst
werden, insbesondere die äußere Abgrenzung
der die sensitiven Flüssigkeit enthaltenden
Kavität
auf dem Siliciumchip durch eine Mikrodialyse-Membran.
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Vor
diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die
Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise zu lösen bzw.
abzumildern.
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Die
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein
Verfahren nach Anspruch 1 und einen viskosimetrischen Affinitätssensor
nach Anspruch 2 gelöst.
Die Unteransprüche
beziehen sich auf vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung.
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Gemäß einem
Aspekt der Erfindung wird ein viskosimetrischer Affinitätssensor
bereitgestellt, der eine mit einer sensitiven Flüssigkeit zumindest teilweise
gefüllte
zweiseitig abgeschlossene Fließbahn oder
Fließstrecke,
die einen Aufnahmeraum, eine strömungsbegrenzende
Verengung und einen Vorraum umfasst, aufweist, wobei die Verengung
zwischen dem Aufnahmeraum und dem Vorraum angeordnet ist, und der
Vorraum durch eine elastische Trennwand von einem Außenraum
abgegrenzt ist. Weiterhin umfasst der Affinitätssensor eine Dialysemembran,
welche zumindest einen Teilbereich der Fließbahn nach außen abschließt, einen
Aktor zur Ausübung
einer Kraft auf die elastische Trennwand, und eine Messvorrichtung
zum Registrieren des von der Viskosität der sensitiven Flüssigkeit
abhängigen Zeitverlaufes
der Druckdifferenz zwischen dem Außenraum und dem Vorraum. Die
Verengung, durch welche die sensitive Flüssigkeit strömen kann,
ist dabei so ausgebildet, dass jede Position des Lumens der Fließbahn in
der Verengung durch einen Diffusionsweg von weniger als 1 mm von
der Dialysemembran entfernt ist.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Messung der
Konzentration niedermolekularer Analyte bereitgestellt, wobei auf
eine elastische Trennwand, die zwischen einem Außenraum und einer eine sensitive
Flüssigkeit
enthaltenden, an zwei Enden abgeschlossenen Fließbahn liegt, eine Kraft ausgeübt wird,
wodurch in der flüssigkeitsgefüllten Fließbahn eine
Strömung
zwischen der elastischen Trennwand und einem Aufnahmeraum ausgelöst wird,
die durch eine Verengung der durch eine Dialysemembran mindestens
teilweise begrenzten Fließbahn
führt und
der Zeitverlauf der Druckdifferenz über die elastische Trennwand
gemessen wird.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
und der erfindungsgemäße Affinitätssensor
beruhen auf dem Prinzip zur Messung der Konzentration niedermolekularer
Analyte mit Hilfe einer sensitiven Flüssigkeit, deren Viskosität von der
Analytkonzentration abhängt.
Dabei wird die Strömung
der sensitiven Flüssigkeit
durch das Segment beispielsweise einer Mikrodialyse-Hohlfaser oder eine
andere Mikrodialysekammer zur Messung der Viskosität ausgenutzt.
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Im
Gegensatz zum Durchflussverfahren nach Druckschrift
DE 197 14 087 C2 findet
die Viskositätsmessung
innerhalb der Dialysekammer statt. Bei dem mikromechanischen Verfahren
nach Druckschrift
DE
100 27 684 A1 wird die Dialysekammer, anders als bei der
hier dargestellten erfinderischen Lösung, nicht als Ganzes durchströmt; sondern
innerhalb der Dialysekammer geschert. Die durch die vorliegende
Erfindung bereitgestellte technische Lösung für die Viskositätsmessung
unterscheidet sich von dem in den Druckschriften
DE 40 34 565 A1 und
WO 2004/037079 A1 dargestellten
Verfahren dadurch, dass die Fließbahn nicht durch eine in sich
geschlossene kapillare, sondern durch eine an ihren Enden abgeschlossene
Strömungs-
oder Fließbahn gebildet
wird. Die sensitive Flüssigkeit,
die die beispielsweise kapillare Fließbahn bzw. einen Hohlleiter erfüllt, fließt zwischen
dem Teil der kapillaren Fließbahn,
die durch eine deformierbare Trennwand nach außen abgegrenzt ist und einem
anderen Teil (Aufnahmeraum) der kapillaren Fließbahn, der eine begrenzte Menge
der sensitiven Flüssigkeit
aufnehmen oder abgeben kann. Sie fließt dabei durch eine zwischen
diesen Teilen liegende strömungsbegrenzende
Verengung der Fließbahn,
deren Volumen durch eine Mikrodialyse-Membran im Diffusionsaustausch mit
dem äußeren Medium
steht. Die Strömung
der Flüssigkeit
wird durch Übertragung
einer Kraft auf eine an die Flüssigkeit
in der kapillaren Fließbahn grenzende
elastische Trennwand ausgelöst.
Der Aufnahmeraum ist nach außen
abgeschlossen und kann ein begrenztes Volumen aufnehmen oder abgeben, das
für die
Messung der Viskosität
an Hand des Zeitverlaufes der Druckdifferenz an der elastischen Trennwand
ausreicht. Die Fähigkeit
des Aufnahmeraums zur Volumenaufnahme oder Volumenabgabe kann darauf
beruhen, dass seine Wände
für Wasser ausreichend
permeabel sind, dass in ihm ein kleines elastisches gasgefülltes Volumen
eingeschlossen ist oder dass seine Wände eine ausreichende elastische
Dehnbarkeit besitzen. Bei dem erfindungsgemäßen viskosimetrischen Affinitätssensor
wird nur eine kapillare Fließbahn
benötigt;
daher kann der Durchmesser der implantierbaren Mikrodialyse-Sonde
sehr klein gestaltet werden kann. Mit der Erfindung werden die technischen
Möglichkeiten
zur Herstellung schmerzarm und verletzungsarm implantierbarer wenig
invasiver Affinitätssensoren
für Glucose und
andere Analyte erweitert.
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Die
Viskosität
der sensitiven Flüssigkeit
wird auf Grund des Flusses der sensitiven Flüssigkeit durch die Verengung
bestimmt, wobei der Fluss durch einen Druckgradienten über der
Verengung erzeugt wird. Dieser Druckgradient wird durch Betätigen des
Aktors hervorgerufen. Durch den Aktor kann beispielsweise der Druck
im Vorraum erhöht
werden. Dadurch wird sowohl ein Druckgradienten zwischen Vorraum
und Aufnahmeraum, d. h. über die
Verengung, als auch zu einer Druckdifferenz zwischen Vorraum und
Außenraum,
d. h. über
die Trennwand, aufgebaut. Im Ergebnis fließt die sensitive Flüssigkeit vom
Vorraum in den Aufnahmeraum. Dies führt zu einer messbaren Druckrelaxation über der
Trennwand. Umgekehrt ist es möglich,
durch den Aktor einen Druck auf die sensitive Flüssigkeit im Aufnahmeraum auszuüben und
so einen Fluss in den Vorraum zu induzieren und den Druckanstieg über der
Trennwand als Messsignal zu verwenden. Der Aktor muss hierzu nicht
direkt auf den Aufnahmeraum oder den Vorraum wirken. Beispielsweise
kann der Aktor den Druck in einem Fluid im Außenraum beeinflussen, wobei
der Druck auf den Vorraum über
die elastische Membran übertragen
wird.
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Ein
Vorteil des erfindungsgemäßen Affinitätssensors
ist, dass die Verengung der Dialysemembran sehr nahe ist. Dadurch
kann sich die Viskosität in
der Verengung sehr schnell an veränderte Konzentrationen des
Analyten anpassen.
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Unter
einer sensitiven Flüssigkeit
wird, wie einleitend beschrieben, eine Flüssigkeit verstanden, deren
Viskosität
von der Konzentration des Analyten abhängt.
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Der
erfindungsgemäße viskosimetrische
Affinitätssensor
gestattet insbesondere, folgende, für die medizinische und klinische
Forschung wichtige Kriterien zu erfüllen:
- 1.
Die zur Messung eingesetzte sensitive Flüssigkeit soll während des
Messzeitraumes in der Mikrodialysekammer verbleiben. Dies ermöglicht, den
Einfluss des Dialysates des Blutplasmas und der interstitiellen
Flüssigkeit
auf die Langzeitstabilität
der sensitiven Flüssigkeit
zu untersuchen.
- 2. Die sensorische Oberfläche
soll möglichst schmerzfrei
und verletzungsarm in das Unterhautfettgewebe eingeführt werden
können.
- 3. Der Sensor soll aus industriell gefertigten und allgemein
verfügbaren
Bauteilen hergestellt werden können
und miniaturisierbar sein.
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Im
Folgenden soll die Erfindung anhand eines in der anhängenden
Figur gezeigten Ausführungsbeispiels
näher erläutert werden
Die Erfindung ist jedoch nicht auf die konkret beschriebene Ausführungsform
beschränkt,
sondern kann in geeigneter Weise abgeändert werden. Die in den Figuren
gezeigten Ausführungsformen
sind nicht maßstabsgetreu
gezeichnet, sondern dienen lediglich dem besseren Verständnis.
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1 zeigt
eine Ausführungsform
mit einer Fließbahn.
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2 zeigt
eine Ausführungsform
mit zwei Fließbahnen.
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Zunächst soll
die Herstellung einer einfachen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Affinitätssensors
erläutert
werden.
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Durch
eine axiale Durchgangsbohrung in einem beispielsweise 1 cm langen
Messingblock mit einer seitlichen Gewindebohrung, die senkrecht
zur Durchgangsbohrung verläuft
und zumindest bis zu dieser reicht, und einer passenden Schraube
wird ein elastischer Silikonschlauch, dessen äußerer Durchmesser im entspannten
Zustand größer als
der Durchmesser der Durchgangsbohrung ist, im längsgespannten Zustand hindurchgezogen.
Nach dem Wegfall der Längsspannung
legt sich der Silikonschlauch an die Durchgangsbohrung dicht an.
Die herausragenden Enden werden abgeschnitten und der Messingblock
wird mit einer seiner Seiten, auf welcher die Bohrung ist, auf das
Gehäuse
eines handelsüblichen
Drucksensors mit einem Messbereich von beispielsweise 500 mbar (5·104 Pa) und einer elastischen Volumenkapazität von beispielsweise
ca. 100 nl geklebt. Der Drucksensor ist für die Messung der Druckdifferenz
zwischen einem Gasraum und einer Flüssigkeit ausgelegt. Beispielsweise
führt die Deformation
einer elastischen Halbleiter-Biegeplatte in
diesem Sensor zu einer Widerstandsänderung, die das primäre Mess-Signal
darstellt.
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In
die mit dem Silikonschlauch ausgekleidete und mit einer Flüssigkeit
gefüllte
Durchgangsbohrung kann durch eine Silikon-Dichtung eine dünne Dialyse-Nadel
eingeführt
werden. Um bei diesem Prozess den Druck in dem flüssigkeitsgefüllten Raum kontrollieren
zu können,
wird die Schraube in die seitliche Gewindebohrung so weit eingeführt, dass
sie die Silikongummi-Auskleidung deformiert und eine Druckmanipulation
möglich
wird.
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Zur
Herstellung der Dialyse-Nadel aus beispielsweise Edelstahl wird
in ein beispielsweise 1,5 cm langes Segment einer handelsüblichen
Dialyse-Hohlfaser aus beispielsweise regenerierter Zellulose mit
einem Innendurchmesser von beispielsweise 200 μm ein beispielsweise 5 mm langes
Segment eines Nylonfadens mit einem Durchmesser von beispielsweise
150 μm eingeführt und
in deren Mitte an der Wand der Dialysehohlfaser durch lokale Klebung befestigt.
Eine beispielsweise 20 mm lange, an einem Ende schräg angeschliffene
Kanüle
mit einem Außendurchmesser
von beispielsweise 0,4 mm und einem Innendurchmesser von beispielsweise
0,3 mm wird in der Mitte so geschliffen, dass beispielsweise drei
8 mm lange schlitzförmige
Fenster entstehen. Außerdem
wird mit einem Schleifgerät
beispielsweise 2 mm hinter dem schrägen angeschliffenen Ende der
Kanüle
eine kurze seitliche Öffnung
(beispielsweise 1 mm) hergestellt. Das so hergestellte Metallgerüst der Dialysesonde
wird sorgfältig
entfettet.
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Der
Außendurchmesser
einer Hohlfaser mit einer Wand aus gasdurchlässigem porösem hydrophoben Polypropylen
wird durch kontrollierte Dehnung genau an den Innendurchmesser der
Edelstahl-Kanüle
angepasst. Die Polypropylenhohlfaser hat eine Porenweite von beispielsweise
0,2 μm und ist
nur für
Gas, nicht jedoch für
Flüssigkeit
durchlässig.
Ein beispielsweise 5 mm langes Segment dieser Faser wird von der
schrägen Öffnung her
in die Kanüle
hereingeschoben und an den Rändern
mit der Stahlkanüle
mit selbst härtendem
Klebstoff verklebt. Die schräge Öffnung an
der Spitze der Kanüle
wird ebenfalls mit Hilfe des Klebstoffs verschlossen. Die Kanülenspitze
wird nach der Aushärtung
des Klebstoffes wieder scharf angeschliffen. Von der anderen Seite
wird die Mikrodialyse-Hohlfaser aus regenerierter Zellulose in die
Kanüle
eingeführt.
Danach befindet sich der Hohlfaserabschnitt mit dem Nylonfaden im
Bereich der Fensterschlitze. Die Mikrodialyse-Hohlfaser wird an
den Fenster-Enden und an der Öffnung
dicht eingeklebt. Das überstehende
Ende des Hohlfasersegmentes wird an der Kanülenbasis abgeschnitten. Die
Hohlräume
des Drucksensors und die mit Silikongummi ausgekleidete Durchgangsbohrung
des Messingblockes werden gasfrei mit der sensitiven Flüssigkeit
gefüllt.
Dazu wird mit Hilfe eines dünnen
Silikonschlauches die Mikrodialysesonde mit einer die sensitive
Flüssigkeit
enthaltenden 50 μl-Spritze
verbunden. Die sensitive Flüssigkeit
wird langsam in die einseitig verschlossene Mikrodialyse-Sonde eingeführt, wobei
das Gas durch die poröse
Membran der Polypropylenfaser vor der seitlichen Öffnung nahe
dem verschlossenen Ende der Kanüle entweichen
kann. Die seitliche Öffnung
wird anschließend
verklebt. Die Kanüle
enthält
danach an der Spitze einen kleinen Gasraum (beispielsweise 200–500 nl),
weil die komprimierte Luft hinter der seitlichen Öffnung keinen
Ausweg besitzt. Die Basis der so gefüllten Kanüle wird mit dem die sensitive
Flüssigkeit enthaltenden
Raum in dem Messingblock am Drucksensor unter Vermeidung weiteren
Gaseinschlusses verbunden. Hierzu wird die Kanüle mit dem flüssigkeitsbedeckten
offenen Ende durch eine flüssigkeitsgefüllte Silikongummidichtung
allmählich
in diesen mit sensitiver Flüssigkeit
gefüllten
Raum hinein geschoben, wobei der Druckanstieg am Drucksensor gemessen
und durch die seitlich am Messingblock angebrauchte Schraube kontrolliert
wird.
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Im
Folgenden wird, ausgehend von der oben hinsichtlich der Herstellung
beschriebenen Ausführungsform,
der erfindungsgemäße Affinitätssensor an
Hand von schematischen Figuren erläutert.
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Der
Sensor umfasst einen Außenraum 1,
der durch eine elastische Trennwand 2 von einer mit Flüssigkeit
gefüllten
Fließbahn 3 getrennt
wird, wobei die Fließbahn 3 an
zwei von einander entfernten Enden verschlossen ist. Weiterhin weist
der Sensor einen Aktor 4, mit dessen Hilfe eine Kraft auf
die elastische Trennwand 2 ausgeübt werden kann, auf. Eine Messvorrichtung 5 zur
Erfassung der Druckdifferenz zwischen dem Außenraum 1 und der
Flüssigkeit
auf der Fließbahn 3,
mit der die Trennwand in Kontakt steht, ist vorgesehen. Die Fließbahn 3 weist
eine strömungsbegrenzende
Verengung 6 auf, wobei jede Position des Lumens der Fließbahn in
dieser Verengung weniger als 1 mm von einer Mikrodialyse-Membran 9 entfernt
ist. Außerdem
weist der Sensor einen abgeschlossenen Aufnahmeraum 7 auf.
Die seitliche Öffnung
der Kanüle 15,
welche mit der an der Innenwand der Kanüle 15 anliegenden
gasdurchlässigen porösen hydrophoben
Polypropylenhohlfaser 17 bedeckt und von außen mit
einem Klebstoff nach dem Befüllen
der Kanüle 15 mit
der sensitiven Flüssigkeit verschlossen
wird, ist mit 10 bezeichnet.
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Der
Aufnahmeraum 7 steht nur durch die strömungsbegrenzende Verengung 6,
welche seitlich durch die Mikrodialyse-Membran 9 abgeschlossen ist,
mit der elastischen Trennwand 2 in Verbindung und ermöglicht den
Fluss eines begrenzten Volumens der sensitiven Flüssigkeit
durch die strömungsbegrenzende
Verengung 6. Der Außenraum 1 ist
bei der dargestellten Ausführungsform
mit der Atmosphäre
verbunden. Die elastische Trennwand 2 ist bei der dargestellten
Ausführungsform
die Halbleiter-Biegeplatte des Drucksensors in der Kombination mit
deren elastischen Verankerung. Die flüssigkeitsgefüllte Fließbahn 3 umfasst
bei der dargestellten Ausführungsform
die flüssigkeitsgefüllten Räume im Drucksensor,
in der mit Silkongummischlauch 13 ausgefüllten Durchgangsbohrung 16,
in der strömungsbegrenzenden
Verengung 6 und im Aufnahmeraum 7 bis zu dem gasgefüllten Raum 11 vor
dem terminalen Verschluss der Kanüle 15. Der bei der dargestellten
Ausführungsform
manuell zu bedienende Aktor 4 ist die Stellschraube an
der seitlichen Gewindebohrung in dem durchbohrten Messingblock 14.
Die Messvorrichtung 5 ist ein handelsüblicher Drucksensor zur Aufzeichnung
der Druckdifferenz auf der Grundlage des elektrischen Widerstandes
einer Halbleiterbiegeplatte. Die strömungsbegrenzende Verengung 6 wird
bei dieser Ausführungsform durch
Integration eines zylindrischen Körpers 12 in das Hohlfaser-Segment
realisiert. Die Fähigkeit
des Aufnahmeraums 7 zur Aufnahme oder Abgabe eines begrenzten
Volumens wird in dem dargestellten Ausführungsbeispiel durch den Einschluss
eines begrenzten Gasvolumens 11 realisiert, das sich beim Einströmen in den
Aufnahmeraum 7 komprimieren und beim Ausströmen entspannen
kann.
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Die
Viskosität
der sensitiven Flüssigkeit
wird mit diesem Sensor dadurch erfasst, dass durch Verdrehen der
Stellschraube 4 Flüssigkeit
aus dem Vorraum 8 teilweise verdrängt und dadurch eine Kraft
auf die elastische Trennwand 2 ausgeübt wird, deren Deformation
der Druckdifferenz zwischen dem Außenraum 1 und dem
Vorraum 8 proportional ist. Die Messvorrichtung 5 misst
diese Druckdifferenz. Da die strömungsbegrenzende
Verengung 6 einen sofortigen Druckausgleich mit dem Aufnahmeraum 7 verhindert
und die elastische Volumenkapazität des Aufnahmeraums 7 größer als
die elastische Volumenkapazität
der elastischen Trennwand 2 ist, kommt es zu einer gut
messbaren Druckrelaxation, deren Halbwertszeit der Viskosität der sensitiven
Flüssigkeit proportional
ist. Der Zeitverlauf der Druckrelaxation wird durch den Drucksensor 5 sehr
genau erfasst.
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Jede
der genannten Komponenten kann in verschiedenen Ausführungsformen
realisiert werden, wie im Folgenden erläutert wird. Beispielsweise
können
zusätzlich
zu der Biegeplatte und den anderen Bestandteilen des Drucksensors
weitere Komponenten zur Elastitizität der Trennwand beitragen.
Es ist möglich,
dass der Außenraum
ein Fluid enthält,
dessen Druck verändert
werden kann. Ein solcher Außenraum
könnte
die Funktion des Aktors übernehmen,
zum Beispiel, wenn er gasgefüllt
ist und an eine Gaspumpe angeschlossen wird. Es sind Ausführungsformen
des Aktors möglich,
bei denen die Kraft ohne Vermittlung durch ein Fluid direkt durch
ein elektrisches oder magnetisches Feld auf die elastische Trennwand übertragen
wird. Der Sensor kann auch so gestaltet werden, dass der Aktor eine
Kraft auf die flüssige
Matrix in der Umgebung der Messsonde ausübt und diese Kraft hydraulisch über die strömungsbegrenzende
Verengung auf die elastische Trennwand übertragen wird. Ebenso ist
es möglich,
dass der Aktor auf die Flüssigkeit
im Aufnahmeraum wirkt und dadurch einen Fluss durch die strömungsbegrenzende
Verengung induziert, der dann zu einer messbaren Druckdifferenz
an der elastischen Trennwand führt.
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Es
gibt verschiedene physikalische Möglichkeiten zur Erfassung der
Druckdifferenz über
die elastische Trennwand, z. B. die Messung einer Kapazität anstelle
der Messung eines Widerstandes.
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Die
strömungsbegrenzende
Verengung kann in verschiedener Weise gestaltet werden, beispielsweise
durch einen Abschnitt, in dem das Lumen des zylinderförmigen Hohlfasersegmentes
sehr eng ist, oder durch die Deformation eines zylindrischen Hohlfasersegmentes.
Falls, wie in dem dargestellten Ausführungsbeispiel, die strömungsbegrenzende
Verengung der Fließbahn
durch den Einschluss eines oder mehrerer fester Körpers erfolgt,
können/kann
diese/r Körper
umströmbar
sein. Die Verengung kann auch in der Form einer kurzen durchströmbaren Blende realisiert
werden. Wesentlich ist, dass der Analyt, z. B. Glucose, durch die
Hohlfasermembran in einer für die
Mikrodialyse typischen Zeit (< 10
min) das Diffusionsgleichgewicht mit der sensitiven Flüssigkeit
in der strömungsbegrenzenden
Verengung erreichen kann, ohne dass es einer zusätzlichen Strömung bedarf.
Hierzu muss die Entfernung der Dialysemembran von jeder Position
in der flüssigkeitsgefüllten Fließbahn in
der Verengung kleiner als 1 mm sein. Dies lässt sich dadurch erreichen,
dass beispielsweise die strömungsbegrenzende
Verengung zumindest teilweise, beispielsweise auf einer Seite, von
der Mikrodialyse-Membran begrenzt ist. Die strömungsbegrenzende Verengung
kann sich daher in Strömungsrichtung
auch über
einen gewissen Bereich erstrecken, da eine Seitenwand der Verengung
durch die Mikrodialyse-Membran
gebildet wird. Ebenso kann bei Verwendung einer Blende aus einem
nicht permeablen Material als strömungsbegrenzende Verengung,
die Blende in Strömungsrichtung
relativ kurz ausgebildet werden, wobei die Mikrodialyse-Membran
dann die Fließbahn
unmittelbar vor oder hinter Blende zumindest teilweise abgrenzt.
Vorzugsweise wird die strömungsbegrenzende
Verengung, wie in dem angeführten
Ausführungsbeispiel
auf beiden Seiten durch einen Abschnitt der Fließbahn begrenzt, der ebenfalls
für den
Analyten durch Diffusion von außen
erreichbar ist bzw. von einer Mikrodialyse-Membran abgegrenzt ist.
Durch die räumlich
eng benachbarte Anordnung von Verengung, welche die Strömungsgeschwindigkeit
der sensitiven Flüssigkeit begrenzt
und dadurch die Viskositätsmessung
ermöglicht,
und dem Bereich, in dem der Analytaustausch erfolgt, kann problemlos
gewährleistet
werden, dass die beim Messvorgang durch die Verengung strömende sensitive
Flüssigkeit
hinsichtlich der Analytkonzentration mit der Matrix im Gleichgewicht steht.
Dadurch wird die Ansprechzeit des Sensors wesentlich erhöht. Außerdem kann
die Sonde, welche die Verengung und die Dialysemembran umfasst,
sehr klein gehalten werden. Dies ermöglicht die Herstellung von
kleinen und leicht implantierbaren Sonden. Außerdem vermeidet die räumlich eng
benachbarte Anordnung von Verengung und Dialysemembran weitgehend
ein Totvolumen, das sich bei räumlich
größerer Entfernung
zwischen Dialysemembran und Verengung ausbildet. Die in einem solchen
Totvolumen enthaltene sensitive Flüssigkeit steht nämlich hinsichtlich
der Analytkonzentration mit der Matrix nicht im Gleichgewicht und
muss daher durch einströmende
Flüssigkeit
aus dem Dialyseraum ersetzt werden.
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Es
bestehen mehrere prinzipiell anwendbare Möglichkeiten zur Gestaltung
des Aufnahmeraumes. Letzterer muss ein begrenztes Volumen der sensitiven
Flüssigkeit
aus dem übrigen
Teil der flüssigkeitsgefüllten Fließbahn aufnehmen
oder an sie abgeben können.
Dies kann, wie im dargestellten Fall, durch den Einschluss eines
begrenzten Gasvolumens realisiert werden. Eine andere Möglichkeit
besteht darin, dass der Aufnahmeraum auf Grund der elastischen Dehnbarkeit
seiner Wand eine begrenzte, für
die Deformation der elastischen Trennwand ausreichende Volumenkapazität besitzt.
In diesem Fall kann der Aufnahmeraum vollständig mit Flüssigkeit gefüllt sein.
Es ist auch eine Ausführungsform
der Erfindung möglich,
bei der ein Aufnahmeraum als kapillare Dialyse- oder Ultrafiltrationsmembran
realisiert wird und die für
den Messvorgang erforderliche Volumenverschiebung durch eine hohe
Permeabilität
dieser Membran für
Wasser gewährleistet
wird.
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Der
erfindungsgemäße Affinitätssensor
kann in den bisher beschriebenen Varianten zur Untersuchung des
Einflusses der Matrix auf die Stabilität der sensitiven Flüssigkeit
eingesetzt werden. Er stellt auch eine günstige Ausführungsform des viskosimetrischen
Affinitätssensors
für die
Kontrolle der Konzentration der Glucose in der interstitiellen Flüssigkeit
dar. Für
diese Anwendung ist es vorteilhaft, wenn die Viskosität der sensitiven
Flüssigkeit,
die mit der interstitiellen Flüssigkeit
austauscht, mit der Viskosität
der gleichen sensitiven Flüssigkeit,
die eine definierte Konzentration an Glucose enthält, verglichen wird
[Beyer U, Ehwald R: Compensation of temperature and Concanavalin
A cocentration effects for glucose determination by the viscometric
affinity assay]. Um diesen Vergleich durchzuführen, wird gemäß einer
Ausführungsform,
die schematisch in 2 gezeigt ist, der Außenraum
als zweite Fließbahn 30 mit einer
strömungsbegrenzenden
Verengung 36 und einem Aufnahmeraum 37 gestaltet,
wobei die so realisierte zweite Fließbahn 33 die sensitive
Flüssigkeit mit
einer definierten Konzentration an Glucose enthält und nicht von einer Mikrodialyse-Membran,
sondern von undurchlässigen
Wänden 32 begrenzt
wird. Die strömungsbegrenzende
Verengung 33 der zweiten Fließbahn 33 liegt zwischen
der elastischen Trennwand 2 und dem Aufnahmeraum 37,
dessen elastische Volumenkapazität
größer ist
als die elastische Volumenkapazität der Trennwand.
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Die
erste Fließbahn 23 in
diesem Ausführungsbeispiel
umfasst einen Vorraum (28), der über eine strömungsbegrenzende
Verengung 36 mit einem Aufnahmeraum 27 verbunden
ist. Der Aufnahmeraum 27 enthält an seinem toten Ende ein
Gasvolumen 21, welches die Aufnahme von Flüssigkeit
in den Aufnahmeraum 27 unter Komprimierung des Gasvolumens
ermöglicht.
Der Aufnahmeraum 37 der zweiten Fließbahn verfügt ebenfalls über ein
entsprechendes Gasvolumen 31.
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Im
Gegensatz zur zweiten Fließbahn 33,
ist die erste Fließbahn 23 abschnittsweise
von einer Dialysemembran begrenzt. Die strömungsbegrenzenden Verengungen 26 und 36 in
beiden Fließbahnen sind
hier durch kurze Blenden realisiert.
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Für den Messvorgang
wird bei dieser Ausführungsform
beispielsweise auf hydraulischem Wege die gleiche Kraft auf die
beiden an die elastische Trennwand 2 grenzenden Flüssigkeitsräume, die
jeweils mit einer der Fließbahnen
in fluidischer Verbindung stehen, ausgeübt. Dies ist in 2 durch den
Aktor 24 angedeutet. Der anschließend mittels der Messvorrichtung 5 messbare
Zeitverlauf der Druckdifferenz über
der Trennwand 2 resultiert aus der Relation der Viskositäten der
sensitiven Flüssigkeit
in den beiden Verengungen, wobei die Viskosität in der zweiten Fließbahn als
Referenz dient. Der Affinitätssensor
kann so gestaltet werden, dass die beiden kapillaren Fließbahnen
nebeneinander auf der gleichen Sonde liegen, so dass der Temperatureffekt auf
die Viskosität
im Mess-Signal kompensiert wird.
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Es
ist ebenfalls möglich,
dass die Fließbahn ein
nicht mit der sensitiven Flüssigkeit
vermischbares Fluid, beispielsweise ein Öl, enthält, das die Fließbahn zwischen
der elastischen Trennwand und der strömungsbegrenzenden Verengung,
ohne diese zu erreichen, füllt.
Dieses Fluid dient damit zur Druckvermittlung zwischen elastischer
Trennwand und der sensitiven Flüssigkeit.
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Der
Raum, welcher die elastische Trennwand aufweist, kann auch durch
vergleichsweise lange Zuleitungen, die mit der sensitiven Flüssigkeit oder
dem Fluid gefüllt
ist, mit dem Vorraum verbunden werden. Dadurch kann die die strömungsbegrenzende
Verengung sowie den Aufnahmeraum umfassende Sonde als kleine und
leicht implantierbare separate Sonde ausgeführt werden. Der Vorraum kann
ebenfalls in der Sonde untergebracht sein, und mit der elastischen
Trennwand über
das in der Zuleitung enthaltene Fluid kommuniziert.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann in allgemeinen Worten auch wie folgt zusammengefasst werden:
- – Bereitstellen
einer an zwei Enden abgeschlossenen Fließbahn, die eine in Diffusionsaustausch hinsichtlich
eines Analyten mit einer äußeren Matrix
stehende strömungsbegrenzende
Verengung, welche zwischen einem ersten Raum und einem zweiten Raum
der Fließbahn
angeordnet ist, aufweist, wobei die Fließbahn mit einer sensitiven Flüssigkeit,
deren Viskosität
von der Konzentration des Analyten abhängt, zumindest teilweise gefüllt ist
und auf der Seite des ersten Raums durch eine elastische Trennwand
von einem Außenraum
getrennt ist;
- – Hervorrufen
einer Druckdifferenz in der Fließbahn zwischen dem Vorraum
und dem Aufnahmeraum;
- – Ermitteln
der zeitlichen Verlaufs der Druckdifferenz über der elastischen Trennwand,
- – Ermitteln
der Konzentration des Analyten aus dem ermittelten zeitlichen Verlauf.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen viskosimetrischen Affinitätssensor
mit einer Mikrodialyse-Sonde mit sehr kleinem Durchmesser und sehr kleinem
Volumen des implantierbaren Teils, in die nur eine kapillare Fließbahn integriert
ist. Der erfindungsgemäße Affinitätssensor
kann aus industriell gefertigten marktüblichen Teilen hergestellt
werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
zur Messung der Viskosität
der in einer Dialysesonde fließenden
sensorischen Flüssigkeit
wird die kapillare Fließbahn
an einem Ende von einer elastischen Trennwand von einem Außenraum
getrennt und besitzt am anderen Ende einen abgeschlossenen Aufnahmeraum.
In der kapillaren Fließbahn
befindet sich eine strömungsbegrenzende
Verengung, die für
den Analyten von außen
auf dem Wege der Diffusion durch eine Mikrodialyse-Membran zugänglich ist.
Beim Messvorgang wird durch einen in den Sensor integrierten Aktor
auf die elastische Trennwand eine Kraft ausgeübt. Hierbei wird die sensitive
Flüssigkeit
durch die strömungsbegrenzende
Verengung der kapillaren Fließbahn
bewegt, und der von der Konzentration des Analyten abhängige Zeitverlauf
der Druckdifferenz über
die elastische Trennwand wird durch eine in den Sensor integrierte
Messvorrichtung registriert. Das Messprinzip eignet sich für die Erfassung
einer Messgröße, die
auf einen Referenzwert definierter Analytkonzentration bezogen ist.