WO2005085857A1 - 固定化生体分子及び生体分子と相互作用し得る物質の検出法 - Google Patents

固定化生体分子及び生体分子と相互作用し得る物質の検出法 Download PDF

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WO2005085857A1
WO2005085857A1 PCT/JP2005/001882 JP2005001882W WO2005085857A1 WO 2005085857 A1 WO2005085857 A1 WO 2005085857A1 JP 2005001882 W JP2005001882 W JP 2005001882W WO 2005085857 A1 WO2005085857 A1 WO 2005085857A1
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WO
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biomolecule
carrier
immobilized
substrate
protein
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Application number
PCT/JP2005/001882
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English (en)
French (fr)
Inventor
Megumi Akiyama
Naoki Kimura
Original Assignee
Nisshinbo Industries, Inc.
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

Definitions

  • the present invention relates to the detection of a substance that can interact with a biomolecule using an immobilized biomolecule, and more particularly, to a method for detecting a substance that can interact with the biomolecule using an immobilized biomolecule. And a biomolecule and a biomolecule-immobilized substrate used in the method.
  • Non-patent Document 1 a protein immobilization method
  • the method (2) can overcome the drawback that the protein is peeled off from the substrate surface due to the formation of a covalent bond, but requires a harmful reagent such as a reducing agent when performing the fixing reaction. In addition, skilled operations are required to obtain reproducible data.
  • the bond between gold and thiol is physical adsorption.
  • the stability of the thiol group itself is poor, which makes it difficult to obtain reproducible quantitative data. ing.
  • Non-Patent Document 1 a technique is known in which a nucleotide polymer or the like is bound to a nucleic acid, and the nucleic acid is bonded to a substrate for immobilization by ultraviolet irradiation or the like (Patent Document 1).
  • Patent Document l Zhu, H. and Snyder, M. (2003) Protein chip technology. Curr. Opin.
  • Patent Document 1 JP 2001-281246 A
  • the present invention relates to a method for simply and efficiently immobilizing a biomolecule on a substrate, a method for detecting a substance capable of interacting with a biomolecule with high sensitivity, and a method for this method. It is an object to provide a biomolecule to be used and a biomolecule-immobilized base material.
  • a biomolecule in which a polymer containing a compound having an unsaturated bond or a compound having a photoreactive group is bonded to the biomolecule is strongly immobilized.
  • the present inventors have found that the present invention can improve the detection sensitivity of a substance capable of interacting with a biomolecule by using a biomolecule immobilized on a substrate in this way, and thus completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • An immobilized biomolecule used in a method for detecting a substance capable of interacting with the biomolecule using the immobilized biomolecule (excluding nucleic acids), wherein the biomolecule is immobilized.
  • a biomolecule to which a compound having a group capable of binding to a biomolecule-immobilizing substrate or a carrier on the substrate is bound.
  • the compound having a group capable of binding to the biomolecule-immobilizing substrate or the carrier on the substrate is selected from a nitrene precursor, a carbene precursor, or a compound having a ketone group.
  • the biomolecule according to (1) which is a compound having a group.
  • a biomolecule-immobilized substrate comprising a biomolecule-immobilizing substrate and the biomolecule according to any one of (1) to (6) immobilized on the substrate.
  • a method for producing a biomolecule-immobilized substrate which comprises contacting the biomolecule with the biomolecule according to any one of (1) and (6) and irradiating the contact portion with electromagnetic waves. .
  • the present invention provides a biomolecule that can be stably immobilized on a substrate or a carrier on the substrate.
  • a compound having a group capable of binding to a substrate or a carrier on a substrate to any biomolecule, it is possible to increase the amount of any biomolecule that can be immobilized on the substrate or a carrier on the substrate. Therefore, the detection sensitivity can be improved.
  • the biomolecule of the present invention is a biomolecule to which a compound having a group capable of binding to a substrate for immobilizing a biomolecule or a carrier on the substrate is bound.
  • Biomolecules include proteins, sugars, antigens, antibodies, peptides, enzymes and the like.
  • a protein will be described as an example of a biomolecule.
  • other substances are used.
  • the present invention can be carried out by employing the methods and conditions usually used for fixing.
  • the protein of the present invention can be used for ordinary immobilization (solid-phase immobilization) except that a compound having a group capable of binding to a substrate for immobilizing biomolecules or a carrier on the substrate is bonded. ) Interaction with proteins that are not particularly different from immobilized proteins used in methods for detecting substances that can interact with immobilized proteins using proteins (for example, Imnoassay etc.)
  • the protein is not particularly limited as long as it is a protein capable of binding to a substance capable of binding, and examples thereof include a natural or synthetic protein.
  • the size of the protein is not particularly limited as long as it can bind to a substance that can interact with the protein.
  • the portion to which the compound having a group capable of binding on the substrate for immobilizing biomolecules or the carrier on the substrate binds is the amino or carboxy terminal of the protein, the side chain amino group, or the side chain.
  • moieties such as a carboxyalkyl group, a side chain thiol group, and a side chain alcohol group.
  • a known method can be used as a method for binding a compound having a group capable of binding to a substrate for immobilizing a biomolecule or a carrier on the substrate to a protein.
  • Such methods include, for example, a method of binding the compound to the protein using a commercially available cross-linking reagent, and a method using a functional group of the protein and an atom, functional group, or structure reactive with the functional group. And reacting the compound with the compound to bind the compound to the protein.
  • Examples of a method for binding a compound having a group capable of binding to a substrate for biomolecule immobilization or a carrier on the substrate to a protein using a cross-linking reagent include the following methods and the like.
  • the target peptide is synthesized using a commercially available peptide synthesizer.
  • a nucleotide force having a nucleobase such as adenine, cytosine, thymine, or peracil is also selected.
  • an amino group is introduced using a commercially available amino group introduction reagent.
  • the peptide and the nucleotide into which the amino group has been introduced are bound by a conventional method using a commercially available cross-linking reagent (eg, DSS (Disuccinimidyl suberate)).
  • Examples of a method of binding a compound having a group capable of binding to a substrate for immobilizing a biomolecule or a carrier on the substrate to a saccharide include the following methods. After protecting the hydroxyl group at the 6-position of glucose with a trityl group, the remaining hydroxyl groups are acetylated, an azide group is introduced at the 6-position, and then converted to an amino group. Then, a large excess of DSS is added to the aminated glucose and purified.
  • a polydoxyadenylic acid, a polydoxycytidylic acid, or a polydoxylated amino acid having a 5′-terminal or 3′-terminal amino group synthesized as described above is introduced.
  • Nucleotides such as thymidylic acid and polydoxydidylic acid or composite polymers thereof are reacted with the succinimidyl group of the aminated glucose.
  • Deacetylation is performed using sodium methoxide to synthesize polymer-introduced glucose.
  • atoms, functional groups, or structures having reactivity with the functional groups of the protein include the following.
  • the atom, functional group or structure that reacts with the amino group is included in the imide ester group, isohalocyanate group, succinimide ester, sulfonyl succinimide ester, etc., halogenated sulfol group, halogenated alkyl, etc.
  • Halogen an isocyanate group, a halogenated alkyl group, a platinum complex, a carbodiimide group, an aldehyde group, an azide group, a cyano group contained in oxyimino-phenyl-acetonitrile, etc., contained in nitrogen pyridine, a dimethylthiopyrimidine, etc. Methylthio group, diester group contained in dicarbonate, etc .;
  • the atoms, functional groups or structures that react with the carboxyl group include diazo groups contained in diazoalkanes and the like, halogens contained in alkyl halides and the like, sulfol groups contained in trifluoromethanesulfonate and the like, carbodiimide groups and hydrazines.
  • Etc . hydrazino groups contained in phenacyl esters, etc., hydroxyl groups contained in 4-sulfo 2,3,5,6-tetrafluorophenol, alkyltrifluoromethanesulfonate, etc .; atoms reacting with thiol groups
  • the functional group or structure include iodine contained in iodoacetamide, etc., imide group contained in maleimide, etc., halogen contained in alkylnolide, etc., aziridino group contained in aziridine, etc., epoxy group, symmetrical Disulfide groups contained in disulfide, etc. Burs in brosulfuric acid, bromine in bromopyruvic acid, etc .;
  • Examples of the atom, functional group or structure that reacts with the alcohol group include 2-oxonitrile, acid chloride, and isocyanate group.
  • Examples of a method for binding the compound to a protein by reacting a functional group of the protein with an atom, functional group, or structure having reactivity with the functional group include the following methods. After activating the carboxyl group in the protein using cesium carbonate, sodium, carbodiimide, chloride salt, or the like, the group capable of binding to the biomolecule-immobilizing substrate or the carrier on the substrate is removed. Halogen or amino groups in compounds Reaction according to the method.
  • the protein of the present invention includes a compound having a group capable of binding to a substrate for immobilizing a biomolecule or a carrier on the substrate, that is, a polymer or a photoreaction containing a compound having an unsaturated bond.
  • the amino acid to which the compound having a functional group is bound is immobilized on a substrate or a carrier on the substrate by previously irradiating an electromagnetic wave to be described later, and further, a Spot synthesis method (Heine N, Germeroth L, Schneider-Mergener J, Wenschuh H: A modular approach to the spot synthesis of 1,2,5-trisubstituted hybridizations on cellulose membranes.Tetrahedron Lett 2001, 42: 227-230.), Photolithography technology (Fodor SPA, Read JL) , Pirrung LC, Stryer L, Lu AT, Solas D: Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis.Science 1991, 251: 767-773.) And Fmoc method (Hasegawa K, Sha YL, Bang JK, Kawakami T, Akaji K, Aimoto S:
  • a group capable of binding on a substrate or a carrier on a substrate refers to a substrate or a group. There is no particular limitation as long as it is reactive with the carrier on the material and forms a strong bond such as a covalent bond.
  • the group capable of binding to the carrier on the substrate or the substrate is one or more as long as the protein is sufficiently contained in the compound to be immobilized on the protein immobilizing substrate. There may be more than one.
  • Examples of such a compound having a group capable of binding to a substrate for biomolecule immobilization or a carrier on the substrate include a polymer containing a compound having an unsaturated bond, a compound having a photoreactive group, and the like. And the like.
  • the polymer containing a compound having an unsaturated bond refers to a polymer containing a compound in which at least one of the monomers constituting the polymer has an unsaturated bond.
  • the compound having an unsaturated bond only needs to be sufficiently contained so that the protein is immobilized on the protein immobilization substrate. Further, all of the monomers constituting the polymer may be compounds having an unsaturated bond.
  • "including a compound having an unsaturated bond” means that the compound consists of or contains a residue of a compound having an unsaturated bond.
  • the average degree of polymerization is preferably from 2 to 1,000,000, more preferably from 5 to 100000, and particularly preferably from 7 to 1000! /.
  • the average degree of polymerization is 1 or less, a sufficient amount of protein may not be immobilized on the carrier, and when the degree of polymerization is 1000001 or more, the target molecule may become a protein due to steric hindrance. Lack of access to quality may interfere with measurement.
  • polymer examples include nucleotides having a base of acrylic acid or methacrylic acid, such as lanzanine, adenine derivative, cytosine, cytosine derivative, guanine, guanine derivative, thymine, thymine derivative, peracyl, peracyl derivative.
  • Examples include a polymer containing a monomer selected from the group consisting of methylolpropanetetraaphthalate, dipentaerythritol pentaatalylate, and the like.
  • the types of the above monomers in the polymer may be the same or different. Good.
  • Preferred monomers are nucleotides, and particularly preferred monomers are nucleotides having adenine as a base, nucleotides having cytosine as a base, nucleotides having thymine as a base, and nucleotides having peracyl as a base.
  • the photoreactive group means a group that generates a group having high reactivity with a substrate or a carrier on a substrate when irradiated with light.
  • the compound having a photoreactive group may be a single molecule or a polymer containing a compound having a photoreactive group.
  • the polymer containing a compound having a photoreactive group refers to a polymer containing a compound having a photoreactive group in at least one of the monomers constituting the polymer.
  • the compound having a photoreactive group only needs to be sufficiently contained so that the protein is immobilized on the protein immobilizing substrate. Further, all of the monomers constituting the polymer may be compounds having a photoreactive group.
  • the photoreactive group include a nitrene precursor, a carbene precursor, and a ketone group.
  • the precursor means a group capable of generating active species such as nitrene and carbene.
  • the compound having a photoreactive group contains one or more optional photoreactive groups among various photoreactive groups.
  • Compounds having a photoreactive group include Specific examples include aryl ketones, azides and diazo conjugates.
  • the compound having a group capable of binding to the biomolecule-immobilizing substrate or the carrier on the substrate may be immobilized such that the immobilized biomolecule can be sufficiently sterically approached to the target molecule.
  • a spacer compound may be introduced in order to appropriately maintain the distance between the biomolecules and the substrate surface.
  • the spacer compound has a non-photoreactive atom, a functional group, or a structure capable of binding to a compound having a group capable of binding to a biomolecule and a carrier on a photobiomolecule-immobilizing substrate or substrate.
  • Compounds can be used.
  • Examples of the compound having a non-photoreactive atom, a functional group or a structure include an alkyl group, a cycloalkyl group, a halogen, a hydroxy group, an ether group (including a thioether and a mouth ether group), an aldehyde group, and a carbonyl group.
  • the compound having a group capable of binding to the substrate for immobilizing a biomolecule or the carrier on the substrate includes the above-described compound having a photoreactive group and the compound having an unsaturated bond. It may contain a polymer.
  • the biomolecule of the present invention may further contain a compound having a group capable of binding on a substrate for immobilizing a biomolecule or a carrier on the substrate, and further include a derivative of deoxyguanosine and a derivative of vinylated deoxyguanosine.
  • a derivative of deoxyguanosine and a derivative of vinylated deoxyguanosine Psoralen, and psoralen derivatives (4'5'-dihydropsoralen, 4,5'8-trimethylpsoralen, angelicin, etc.) It can also be fixed on a solid support three-dimensionally.
  • the substrate used for the protein immobilization substrate of the present invention has reactivity with a compound having a group capable of binding to the protein immobilization substrate or the carrier on the substrate, and these compounds are chemically bonded.
  • a compound having a group capable of binding to the protein immobilization substrate or the carrier on the substrate there is no particular limitation as long as it can immobilize the protein to which the compound is bound and can withstand conditions such as a method for detecting a substance that can interact with the immobilized protein using a normal immobilized protein. Not done. Specifically, it is insoluble in a solvent used for immobilizing a protein and detecting a substance capable of interacting with an immobilized protein and at a room temperature or in a temperature range around the room temperature (for example, 0 to 100 ° C.).
  • the term “substrate is insoluble in a solvent” means that a carrier having a group having a binding property to a protein such as a carbodiimide group is supported on the substrate as described below, and the protein is immobilized in the next step.
  • a carrier having a group having a binding property to a protein such as a carbodiimide group
  • the protein is immobilized in the next step.
  • it means that it is substantially insoluble in various solvents such as an aqueous solvent and an organic solvent used in each process when used as a protein chip or the like.
  • Specific examples of the material of such a base material include plastic, inorganic polymer, metal, and ceramic.
  • plastic examples include synthetic resins (thermoplastic resins, thermosetting resins, copolymers, etc.) and natural resins.
  • thermoplastic resin examples include polycarboimide, ionomer (styrene and olefin), polynorbornene, polyacetal, polyarylate, polyetheretherketone, polyethylene oxide, polyoxymethylene, and polyethylene terephthalate.
  • thermosetting plastic examples include epoxy, polyxylene, polyguanamine, polydiaryl phthalate, polybutyl ester, polyphenol, unsaturated polyester, polyfuran, polyimide, polyurethane, polymaleic acid, melamine, Urea, alkyd, benzoguanamine, polycyanate, polyisocyanate and the like can be mentioned.
  • a copolymer may be used as the plastic. More specifically, as the copolymer, isobutylene maleic anhydride copolymer, acrylonitrile atalylate styrene copolymer, acrylonitrile EPDM styrene copolymer Copolymer, acrylonitrile styrene copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, butadiene styrene methyl methacrylate copolymer, ethylene chloride butyl copolymer, ethylene vinyl acetate copolymer, ethylene ethyl acrylate copolymer, acrylonitrile butadiene styrene Copolymers, polyester ether ketone copolymers, fluoroethylene polypropylene copolymers, tetrafluoroethylene perfluoroalkylbutyl ether copolymers, tetra
  • the natural fats include cellulose, rosin, koval, dammar, Canadian balsam, ellemi, sandalack, guttabel force, urushi, shrub, amberjack, carp fiber, leaf vein fiber, fruit Fiber, animal hair fiber, cocoon fiber, feather fiber, chitin, chitosan, asbestos, asbestos, and derivatives thereof.
  • a dye, a color former, a plasticizer, a pigment, a polymerization inhibitor, a surface modifier, a stabilizer, an adhesion-imparting agent, a thermosetting agent, a dispersant, an ultraviolet ray deterioration inhibitor, and the like are added to the synthetic resin.
  • Synthetic resins added as needed can be used.
  • the synthetic resin may be a single synthetic resin in which different types of the synthetic resins may be laminated in order to maintain a shape.
  • a polymer alloy in which two or more kinds of the synthetic resins are mixed may be used.
  • the inorganic polymer include glass, quartz, carbon, silica gel, and dalaphite.
  • metal preferably, I, II, III, IV, V, VI,
  • Particularly preferred as the metal selected from the groups I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII and transition elements of the second and seventh cycles of the periodic table are aluminum, titanium, Platinum, tungsten, molybdenum, gold, copper, nickel and the like can be mentioned.
  • alloys include nickel silver (component: Cu, Ni, Zn), brass (component: Cu, Zn), bronze (component: Cu, Be), and monel (component: Cu, Ni). , Fe, Mn), nickel-cobalt alloy (composition: Ni, Co), nickel-chromium alloy (composition: Ni, Cr), cobalt alloy (composition: Co, Ni, Cr), stainless steel (composition: Ni, Cr, Fe), silver tungsten (component: Ag, W), b titanium (component: Ti, V, A1;), ab titanium (component: Ti, V, Al), NT alloy (component: Ti, Ni), aluminum alloy (Component: Al, Cu, Mg, Si, Mn, Zn), Duralumin (Component: Al, Cu, Si, Fe, Mn, Mg, Zn), Magnesium alloy (Component: Mg, Al, Zn), K24 (Component : Au), K18 (composition: Au, Ag, Cu), beryllium
  • sendust components: Fe, Si, Al
  • super sendust components:
  • the metal may be deposited or plated (processed) with another metal. Further, the metal may be a single metal, which may be a stack of different types of the metal in order to maintain its shape.
  • the base material may be composed of only metal, or may be laminated on a nonmetallic material by adhesion, vapor deposition, plating, or the like. Good.
  • the ceramic include apatite, alumina, silica, silicon carbide, silicon nitride, and boron carbide.
  • the shape of the base material is not particularly limited, but may be a foil (foil) shape, a flat plate (plate) shape, or a flake.
  • ⁇ eno, filter, beads and the like. Further, it may be shaped like a microtiter plate. Furthermore, in order to facilitate the storage of the obtained results, a material (adhesive, etc.) that can be used for sealing the back surface of a flat plate or the like can be used as a seal by applying or coating. . There is no particular limitation on their size.
  • the protein In immobilizing the protein on the substrate, the protein may be immobilized directly on the substrate, or the carrier may be supported on the substrate, and the protein may be immobilized on the substrate via the carrier. You may.
  • the carrier those having a binding property to the above-described substrate for protein immobilization or a compound having a group capable of binding to the carrier on the substrate can be used.
  • the term “support” refers to various solvents such as a water-soluble solvent and an organic solvent used when immobilizing a protein on a carrier or when using a protein immobilization substrate as a protein chip or the like. This means that the carrier is not substantially detached from the substrate.
  • the carrier used in the present invention may be supported simply by using physical adhesiveness, as long as it is supported on the base material, or chemically via a covalent bond or the like. May be carried.
  • the carrier may be supported on the entire surface of the substrate or on a part thereof as required.
  • Examples of the carrier include low organic molecules, plastics, inorganic polymers, metals, and ceramics.
  • organic low-molecular compound examples include polylysine, 3-aminotriethoxyaminosilane, and 3-aminotriethoxyaminosilane.
  • Silane coupling agents having a primary amino group such as aminotrimethoxyaminosilane, imide group-containing conjugates such as maleimide and succinimide ester, carbodiimide group-containing conjugates, isocyanate group-containing compounds, and isothiocyanate group-containing compounds
  • the compound include a nitrogen-conjugated compound, a nitrogen-containing compound, an aldehyde-containing compound, an amino-containing compound, a carboxyl-containing compound, and a halogen-containing compound.
  • plastic examples include synthetic resins (thermoplastic resins, thermosetting resins, copolymers, etc.) and natural resins as described above as base materials.
  • the inorganic polymer include glass, quartz, carbon, silica gel, and dalaphite.
  • the metal preferably, as the base material, the group I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII and transition element force of the second period to the seventh period of the periodic table as described above are selected. Metal or an alloy containing the same metal can be used.
  • metal selected from the groups I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII and transition elements of the second and seventh cycles of the periodic table are aluminum, titanium, Platinum, tungsten, molybdenum, gold, copper, nickel and the like can be mentioned.
  • the ceramic include apatite, alumina, silica, silicon carbide, silicon nitride, and boron carbide.
  • Such a carrier has high adhesiveness to the above-mentioned substrate, and is carried on the substrate using this adhesiveness.
  • a typical form when the carrier is carried on a substrate utilizing physical adhesiveness is a film.
  • a known method such as spraying, dipping, brushing, stamping, vapor deposition, coating using a film coater, or the like can be used.
  • an amino-substituted organoalkoxysilane such as 3-aminopropyltriethoxysilane is added to an appropriate solvent.
  • the glass substrate is immersed in the solution obtained by dissolving at a temperature of about 70-80 ° C for about 2-3 hours, taken out, washed with water, and further heated at about 100-120 ° C. Heat and dry for about 4-5 hours. After drying, soak in a suitable solvent It may be washed by stirring for about 12 hours at a temperature of about 30-170 ° C.
  • the amino group of the 3-aminopropyltriethoxysilane is reacted with a functional group other than the protein binding group of the nitrogen pyridine group using a suitable solvent, and the surface of the glass substrate is treated with a nitrogen propyl group. You can also guide.
  • the plastic substrates of the above-mentioned substrates there are also those having a functional group as described above already on the surface of the substrate.
  • the functional group is introduced into the surface of the substrate. Without this, it can be used as it is for the production of the carrier. Further, even with such a plastic substrate, it is possible to introduce a further functional group and use it for the production of the above-mentioned carrier.
  • a known photopolymerization initiator can be mixed with the material of the carrier or the base material.
  • the photopolymerization initiator By mixing the photopolymerization initiator, the reactivity at the time of immobilizing proteins by irradiation of electromagnetic waves such as ultraviolet rays can be improved.
  • a protein solution is spotted on a predetermined position of the carrier.
  • the protein include the proteins described in 1> above without any particular limitation.
  • the solvent for dissolving the protein is also not particularly limited, and may be distilled water or a buffer usually used for preparing a protein solution, for example, a Tris buffer or a PBS buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 1.5 mM KHPO3). , 8.1 mM Na HPO), aqueous solution containing phosphoric acid, aqueous solution containing salt
  • a solvent containing a union selected from compounds containing a carboxyl group, a sulfo group, and a phosphor group, and a cation whose alkali metal ion, alkaline earth metal ion, and ionic force are also selected.
  • a solvent containing the aion and a cation the protein can be more efficiently immobilized on the carrier using electromagnetic waves.
  • a solvent containing the aion and a cation specifically, for example, a carboxylate Aqueous solution containing sodium salt (sodium taenoate, ammonium citrate, sodium acetate, etc.), aqueous solution containing sulfonate (sodium dodecyl sulfate, ammonium dodecyl sulfate, etc.), aqueous solution containing phosphonate (sodium phosphate, etc.) , Ammonium phosphate and the like).
  • concentration of the protein solution is not particularly limited, it is usually 1 mmol / 1 to 1 foiol / 1, preferably 100 ⁇ mol / ⁇ 1 to 100 ftnol / ⁇ 1.
  • Examples of the method of spotting the protein solution on the carrier include a method of dropping the protein solution on the carrier with a pipette, a method using a commercially available spotter, and the like.
  • the shape and amount of the spot are not particularly limited as long as the position where the protein solution is spotted can be grasped, but the shape is preferably a dot or a circle.
  • the preferred spot volume is lOnl-10ml.
  • the protein solution is spotted on the carrier at one or more locations. One, two or more protein solutions may be spotted.
  • the labeled protein may be immobilized as a positive control indicating that the protein is immobilized on the carrier.
  • the protein solution After the protein solution is spotted on the carrier, it is irradiated with electromagnetic waves, preferably ultraviolet rays. Further, the protein solution can be dried after spotting and before irradiation with ultraviolet rays.
  • the protein solution may be dried naturally or by heating and drying. The heating temperature is usually 30-100 ° C, preferably 35-45 ° C.
  • the carrier When immobilizing a protein using a compound having an unsaturated bond, the carrier, at least the site of the carrier on which the protein is immobilized, is irradiated with ultraviolet light having a wavelength of 240 to 380 nm. Preferred examples are given. Specifically, ultraviolet light having a broad waveform including a wavelength of 254 nm or 335 nm may be used. Irradiation dose is usually 20- 2400 mJ / cm 2 as the accumulated irradiation amount is preferably 50- 900mJ / cm 2.
  • the wavelength of the ultraviolet light and the amount of irradiation used for irradiating the carrier, at least the site where the protein of the carrier is immobilized, and the amount of photocrosslinking used are determined. It can be determined appropriately depending on the agent and the compound having Z or a photoreactive group.
  • the protein immobilization substrate of the present invention has many opportunities to be brought into contact with a protein other than the above-mentioned immobilized protein when performing an analysis or the like using the protein immobilization substrate.
  • the protein is added to the substrate or the carrier on the substrate in the form of dots as described above. After immobilization, it is preferable that an unreacted protein-immobilized portion is blocked by bringing an excess amount of serum albumin (BSA), casein or the like into contact with the substrate or the carrier on the substrate.
  • BSA serum albumin
  • the substance detected by the detection method using the protein immobilization substrate of the present invention may interact with the immobilization protein immobilized on the protein immobilization substrate.
  • the term "interaction” refers to an action between molecules caused by a covalent bond, a hydrophobic bond, a hydrogen bond, a van der Waals bond, a bond due to static electricity, or the like between an immobilized protein and a substance, and is particularly limited. Not done.
  • the protein-immobilized substrate of the present invention obtained in this manner is one in which the protein is very firmly supported on a carrier, and interacts with the immobilized protein using the immobilized protein. If analysis is performed using a method that cannot be desorbed even by a washing method (such as a washing method using a surfactant) that is widely used in a detection method for substances that can be used (for example, Imnoassay, etc.) Analysis with excellent reproducibility and quantification becomes possible.
  • a washing method such as a washing method using a surfactant
  • a detection method for substances that can be used for example, Imnoassay, etc.
  • the protein immobilization substrate of the present invention can be applied to a protein chip (protein microarray) or the like with excellent performance.
  • a peptide (7 residues) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was synthesized using a peptide synthesizer. Further, a peptide (7 residues) obtained by phosphorylating the tyrosine shown in SEQ ID NO: 2 was also synthesized.
  • peptide synthesis refer to Basics and Experiments of Peptide Synthesis (Maruzen Co., Ltd.).
  • an oligonucleotide having an amino group introduced at the 5 ′ end of the oligonucleotide (10 residues) shown in SEQ ID NO: 3 was synthesized according to a conventional method.
  • the peptide solution was spotted at a predetermined position on the carrier.
  • the amount of each spot was 0.5 ⁇ l, and the size of the spot diameter was lmm.
  • Uvstratalinker 2400 manufactured by Stratagene, center wavelength: 254 nm
  • ultraviolet rays were irradiated at 600 mJ / cm 2 from a distance of 16 cm.
  • the irradiation time was 240 seconds. Thereafter, the carrier was shaken in water for 30 minutes, washed and dried.
  • a glass substrate treated with a polymer compound having a carbodiimide group was used as a carrier.
  • a solution (1 ⁇ g / 100 ⁇ l antibody, 1 ⁇ PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA) containing a rhodamine-labeled anti-phosphoridin amino acid antibody was placed on the sample-fixed portion of the carrier, and Incubated for hours.
  • a rhodamine-labeled anti-phosphoridin amino acid antibody is prepared by using rhodamine NHS (Molecular Probes) in 0.1 M NaHCO (pH 9) to convert rhodamine to an anti-phosphorylated amino acid antibody (Co).
  • the protein solution was spotted at a predetermined position on a carrier on which gold was deposited on a glass plate.
  • the spot amounts were 0.5 ⁇ l each, and the spot diameter was lmm in diameter.
  • ultraviolet light having a center wavelength of 335 nm was irradiated using a CRM-FA Spectro Iradiator (manufactured by JASCO). At this time, the irradiation intensity was 1.5 mW / cm 2 and the irradiation time was 120 seconds. Thereafter, the carrier was shaken in water for 30 minutes, washed, and dried. On the other hand, irradiate UV rays as a control! / ⁇ ! ⁇ A carrier was also prepared.
  • the signal was clear and specifically detected only in the spot containing Protein G on the carrier irradiated with ultraviolet light, indicating that the protein was securely immobilized. In the control (irradiation with ultraviolet rays, spots containing spots and spots containing BSA), fluorescence was not detected.
  • peptide solution (lpmol / ⁇ 1) prepared in Example 1
  • 0.1 ml of psoralen (200 g / ml) solution (200 g / ml) was mixed well, and the psoralen-containing peptide solution (peptidol) was added.
  • Pide 0.5 ⁇ 1 / / ⁇ 1) was prepared.
  • the peptide solution was spotted at a predetermined position on the glass carrier treated with the polymer compound having a carpoimide group. The amount of each spot was 0.5 ⁇ l, and the size of the spot diameter was lmm in diameter.
  • a solution containing a peptide (aqueous solution of disodium taenoate) was similarly spotted on the carrier, and the operation of immobilization was performed as described above.
  • a solution (1 ⁇ g / 100 ⁇ l antibody, 1 ⁇ PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA) containing a rhodamine-labeled anti-phosphoridion amino acid antibody was placed on the sample-fixed portion of the carrier, and Incubated for hours.
  • a rhodamine-labeled anti-phosphoridin amino acid antibody is prepared by using rhodamine NHS (Molecular Probes) in 0.1 M NaHCO (pH 9) to convert rhodamine to an anti-phosphorylated amino acid antibody (Co).
  • a peptide (8 residues) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a peptide (8 residues) obtained by phosphorylating serine shown in SEQ ID NO: 6 were synthesized.
  • the N-terminals of these peptides were acetylated on a solid support (2-chlorotrityl chloride resin) according to a conventional method.
  • These peptides still having the side chain protecting groups [BOC (t-butoxycarbonyl) group and t-Bu (t-butyl) group] were added to an acetic acid: trofluoroethanol: dichloromethane solution (1: 2: 7 vol. / vol) to separate the force on the solid support.
  • peptides were prepared by adding 1,3-diisopropylcarbodiimide, 1-hydroxybenzotriazole, ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine and 4-dimethylaminopyridine in the DMF to the C-terminal of the peptide according to a conventional method. Oligonucleotides having an amino group introduced at the 5 ′ end of the polythymine derivative shown in 4 were introduced.
  • the protecting group of the peptide was deprotected using a trifluoroacetic acid: water: diethanedithiol: thioanol: phenol solution (10 ml: 0.5 ml: 0.25 ml: 0.5 ml: 0.75 g), and a NAP5 column (Amersham) Bioscience) (purified and concentrated to 50 mM
  • the peptide solution (lpmol / ⁇ 1) was prepared by dissolving in a phosphoric acid aqueous solution (pH 8.5).
  • the peptide solution was spotted at a predetermined position on a glass carrier treated with a polymer compound having a carpoimide group.
  • the spot amounts were 0.51 and the spot diameter was lmm in diameter.
  • ultraviolet light having a center wavelength of 335 nm was irradiated using a CRM-FA Spectro Iradiator (manufactured by JASCO).
  • the irradiation intensity was 1.5 mW / cm 2
  • the irradiation time was 120 seconds.
  • the irradiation time was 60 seconds.
  • the carrier was shaken in water for 30 minutes, washed and dried.
  • a carrier that was not irradiated with ultraviolet light was also prepared as a control.
  • Rhodamine-labeled anti-phosphoridamide amino acid antibody 1 ⁇ g / 100 ⁇ l antibody, 1 ⁇ PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA) ) And incubated for 5 hours.
  • Rhodamine-labeled anti-phosphoridin amino acid antibody is prepared by using rhodamine NHS (manufactured by Molecular Probes) in 0.1 M NaHCO (pH 9).
  • the peptide solution (lpmol / ⁇ 1) prepared in Example 4 was spotted at a predetermined position on a glass substrate (manufactured by Telechem International) treated with aminosilane. The spot amounts were 0.5 ⁇ l each, and the spot diameter was lmm in diameter.
  • ultraviolet light having a center wavelength of 335 nm was irradiated using a CRM-FA Spectro Iradiator (manufactured by JASCO). At this time, the irradiation intensity was 1.5 mW / cm 2 and the irradiation time was 120 seconds. Thereafter, the carrier was shaken in water for 30 minutes, washed, and dried. On the other hand, irradiate UV rays as a control!
  • a carrier was also prepared.
  • Rhodamine-labeled anti-phosphoridin amino acid antibody is prepared by using rhodamine NHS (manufactured by Molecular Probes) in 0.1 M NaHCO (pH 9).
  • 4-Benzylbenzoic acid power 4-Benzylbenzoic acid chloride was synthesized by a conventional method. 4-Benzylbenzoic acid chloride (30 g) was dissolved in chloroform (500 ml), 6-aminohexanoic acid solution (17 g / 400 ml IN NaOH) was added dropwise at 0 ° C, and the mixture was stirred at room temperature for 60 minutes. did. 12N HCl (40 ml) was added to the reaction mixture, and the organic solvent layer was extracted. The organic solvent layer was concentrated under reduced pressure and dried.
  • a peptide (8 residues) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 was synthesized using a peptide synthesizer. Further, a peptide (8 residues) obtained by phosphorylating serine represented by SEQ ID NO: 6 was also synthesized. Next, 1 M sodium bicarbonate buffer (pH 9.0) (0.5 ml) was added to the peptide (10 ol) and dissolved therein, and N-succinimidyl 6- (4-benzoylbenzamide) dissolved in DMF was dissolved. Hexanoate (lOOnmol) was added and stirred at room temperature for 18 hours.
  • the peptide solution (lpmol / ⁇ 1) was prepared by dissolving in an aqueous acid solution (pH 8.5).
  • the peptide solution was spotted at a predetermined position on a commercially available polypropylene carrier (polypropylene plate: manufactured by Takiron).
  • the spot amounts were 0.5 ⁇ l each, and the spot diameter was lmm in diameter.
  • ultraviolet light having a center wavelength of 335 nm was irradiated using a CRM-FA Spectro Iradiator (manufactured by JASCO). At this time, the irradiation intensity was 1.5 mW / cm 2 , and the irradiation time was 120 seconds. Thereafter, the carrier was shaken in water for 30 minutes, washed, and dried. As a control, a carrier not irradiated with ultraviolet rays was also prepared.
  • Rhodamine-labeled anti-phosphoridamide amino acid antibody 1 ⁇ g / 100 ⁇ l antibody, 1 ⁇ PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA was added to the peptide-fixed portion of the peptide-fixed carrier. ) And incubated for 5 hours.
  • Rhodamine-labeled anti-phosphoridin amino acid antibody is prepared by using rhodamine NHS (manufactured by Molecular Probes) in 0.1 M NaHCO (pH 9).
  • N-succinimidyl 6 prepared in Example 6 was prepared by adding 1 M sodium bicarbonate buffer (pH 9.0) (1 ml) to 500 g of Protein G (Funakoshi) and BSA (Sigma-Aldrich). -(4-Benzoylbenzamide) hexane solution (100 nmol) in DMF was added and stirred at room temperature for 18 hours. Next, the protein was purified and concentrated using a NAP5 column (manufactured by Amersham Neuroscience), and dissolved in a 50 mM phosphoric acid aqueous solution (pH 8.5) to prepare a protein solution (30 g / ml).
  • the obtained protein was spotted at a predetermined position on a commercially available polycarbonate carrier (general polycarbonate plate: manufactured by Takiron). The spot amounts were 0.51 and the spot diameter was lmm in diameter.
  • a CRM-FA Spectro Iradiator OASCO ultraviolet rays having a center wavelength of 335 ⁇ were irradiated. At this time, the irradiation intensity was 1.5 mW / cm 2 , and the irradiation time was 120 seconds. Thereafter, the carrier was shaken in water for 30 minutes, washed, and dried. As a control, a carrier not irradiated with ultraviolet rays was also prepared.
  • TritonX-100 TritonX-100 was placed and incubated for 5 hours. Next, the protein-immobilized support was washed with 1 ⁇ PBS-0.2% TritonX-100 solution, and the fluorescence was measured using ScanArray 4000 (manufactured by GSI).
  • Oligonucleotide (10 bases) having an amino group introduced at the 5 'end of a polymer composed of aminoethyl- ⁇ D-galactopyranoside (manufactured by Mitani Sangyo Co., Ltd.) and deoxythymidylic acid and deoxycytidylic acid shown in SEQ ID NO: 7
  • 2-fold molar DSS (manufactured by Pierce) was prepared and incubated at 42 ° C for 5 hours. Then, it was purified using reverse-phase HPLC (Waters, ⁇ Bondaspphere, C8 300A, 3.9 ⁇ 150), concentrated, dissolved in a 45 mM aqueous diammonium citrate solution, and dissolved in a sugar solution (1 pmol / ⁇ 1). was prepared.
  • the sugar solution and the buffer solution were spotted at predetermined positions on a flat-bottomed 96-well polystyrene microtiter plate (manufactured by TechJam Co., Ltd.). spot The amounts were 0.5 ⁇ l each and the size of the spot diameter was lmm in diameter.
  • Uvstratalinker 2400 manufactured by Stratagene, center wavelength: 254 nm
  • ultraviolet rays were irradiated from a distance of 16 cm to 80 mJ / cm 2 .
  • the irradiation time was 30 seconds.
  • the carrier was shaken in water for 30 minutes, washed, and dried.
  • a carrier that was not irradiated with ultraviolet light was also prepared as a control.
  • FITC-labeled lectin from Sophora japonica
  • a solution containing the FITC-labeled lectin was placed on the sugar-immobilized portion of the carrier, and incubated at room temperature for 12 hours.
  • the sugar-immobilized carrier was washed with sterilized water, and the fluorescence was measured using FLA 5000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.).
  • the signal was clearly, vigorously, and specifically detected only in the spot containing galactose on the carrier irradiated with ultraviolet light, indicating that the sugar was securely immobilized. Further, the control (spot not irradiated with ultraviolet rays) was capable of detecting only the fluorescence intensity of the same intensity as the knock ground noise (buffer solution).
  • a peptide (6 residues) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 was synthesized using a peptide synthesizer.
  • the synthetic peptide and the oligonucleotide (10 bases) having the amino group introduced at the 5 ′ end of the oligonucleotide (SEQ ID NO: 7) were dissolved in equimolar amounts in 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH 8.0) and dissolved in DMF. Twice molar DSS (Pierce) was added and incubated at 37 ° C for 2 hours.
  • the peptide solution was purified using reverse-phase HPLC (Waters, ⁇ Bondaspphere, C8 300A, 3.9 ⁇ 150), concentrated, dissolved in a 45 mM diammonium citrate aqueous solution, and dissolved in a peptide solution (5 pmol / ⁇ 1). Was prepared.
  • the peptide solution was spotted on a 3D-Link TM Activated Slide (manufactured by Surmodics) having a polyacrylamide on the slide surface.
  • the spot diameter was 0.3 mm.
  • Uvstratalinker 2400 (Stratagene And a center wavelength of 254 nm), and was irradiated with ultraviolet rays at a distance of 16 cm and 60 mj / cm 2 .
  • the irradiation time was 24 seconds.
  • the carrier was shaken in water for 30 minutes, washed, and dried.
  • a solution containing no peptide aqueous solution of disodium taenoate
  • T src kinase manufactured by Upstate [2 U / 50 ⁇ l enzyme, 25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl, 7 mM
  • sample-immobilized carrier was washed with 1X PBS-0.2% Tween 20 solution and labeled with FITC.
  • a buffer containing anti-phosphotyrosine (Sigma-Aldrich) (1 ⁇ g / 100 ⁇ l antibody, IX PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA) is placed on the peptide-immobilized part of the peptide-immobilized carrier and incubated for 2 hours did.
  • the peptide-immobilized carrier was washed with 1 ⁇ PBS-0.2% Tween 20 solution, and the fluorescence was measured using FLA5000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.).
  • tyrosine p6 T src kinase-free buffer [25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl, 7 mM MnCl, 0.5 mM EGTA, 100 ⁇ M ATP] was placed, and incubated for 5 hours.
  • a peptide-immobilized carrier which was incubated for 2 hours using the FITC-labeled anti-phosphotyrosine was also prepared.
  • the peptide solution (5 pmol / ⁇ 1) prepared in Example 9 was spotted on a FAST Slide (Schleicher & Schuell) having trocellulose on the slide surface. .
  • the spot diameter was 0.4 mm in diameter.
  • Uvstratalinker Ultraviolet rays were irradiated from a distance of 16 cm to 120 mj / cm 2 using 2400 (Stratagene, center wavelength: 254 nm). The irradiation time was 48 seconds. Thereafter, the carrier was shaken in a 3% BSA solution for 30 minutes, washed, and dried.
  • a solution containing no peptide aqueous solution of disodium taenoate
  • T src kinase manufactured by Upstate [2 U / 50 ⁇ l enzyme, 25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl 2, 7 mM
  • the above peptide-immobilized carrier was washed with 1 ⁇ PBS-0.2% Tween 20 solution, and a buffer containing FITC-labeled anti-phosphotyrosine (manufactured by Sigma-Aldrich) (1 ⁇ g / 100 ⁇ 1 antibody, IX PBS, 0.2% Tween 20) was used. , 1% BSA) was placed on the sample-immobilized portion of the peptide-immobilized carrier, and incubated for 2 hours. Next, the peptide-immobilized carrier was washed with 1 ⁇ PBS-0.2% Tween 20 solution, and the fluorescence was measured using FLA5000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.).
  • tyrosine p6 (a buffer not containing T src kinase [25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl, 7 mM MnCl, 0.5 mM EGTA, 100 ⁇ M ATP] was placed, and incubated for 5 hours.
  • a peptide-immobilized carrier which was incubated for 2 hours using the FITC-labeled anti-phosphotyrosine was also prepared.
  • a slide having an acrylamide gel on the slide surface was prepared by the method of Nallur et al. [Nallur G, Luo, rang L, oolev S, Dave V, Lambert J, Kukanskis K, Kingsmore 3 ⁇ 4, Lasken R, Prepared according to Schweitzer B. (2001 Signal amplification by rolling circle amplification on DNA microarrays.
  • T src kinase manufactured by Upstate
  • T src kinase manufactured by Upstate
  • the peptide-immobilized carrier was washed with a 1 ⁇ PBS-0.2% Tween 20 solution, and a buffer containing FITC-labeled anti-phosphotyrosine (manufactured by Sigma-Aldrich) (1 ⁇ g / 100 ⁇ 1 antibody, IX PBS, 0.2% Tween 20) was used. , 1% BSA) was placed on the sample-immobilized portion of the peptide-immobilized carrier, and incubated for 2 hours. Next, the peptide-immobilized carrier was washed with 1 ⁇ PBS-0.2% Tween 20 solution, and the fluorescence was measured using FLA5000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.).
  • tyrosine p6 (T src kinase-free buffer [25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl, 7 mM MnCl, 0.5 mM EGTA, 100 ⁇ M ATP]) is placed, and incubated for 5 hours.
  • a peptide-immobilized carrier which was incubated for 2 hours using the FITC-labeled anti-phosphotyrosine was also prepared.
  • Tyrosine p60 e The signal was clearly and specifically detected only in the spot containing the peptide on the carrier incubated with the buffer containing src kinase, so the peptide was reliably immobilized and specific. It was shown that various enzyme reactions could be detected. In the control (tyrosine p6 (containing no T src kinase! /, Peptide spot on the carrier incubated with the buffer and spot containing no peptide), fluorescence was not detected.
  • Example 12 [0121] ⁇ Immobilization of peptide on polylysine carrier, evaluation of peptide-immobilized carrier by enzymatic reaction>
  • a peptide (6 residues) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 was synthesized using a peptide synthesizer.
  • the synthetic peptide and the oligonucleotide (20 bases) shown in SEQ ID NO: 9 in which an amino group was introduced at the 5 ′ end were dissolved in equimolar amounts in 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH 8.0) and dissolved in DMF. Twice molar DSS (Pierce) was added and incubated at 37 ° C for 2 hours.
  • the peptide was purified using reverse phase HPLC (Waters, ⁇ Bondaspphere, C8 300A, 3.9 ⁇ 150), concentrated, dissolved in a 45 mM aqueous solution of diammonium-dumene, and dissolved in a peptide solution (10 pmol / ⁇ 1). Was prepared.
  • the peptide solution was spotted on a slide having polylysine on the slide surface using SP-BIO (Hitachi). The spot diameter was 0.3 mm in diameter. Then, using Uvstratalinker 2400 (manufactured by Stratagene, center wavelength: 254 nm), ultraviolet rays were irradiated at 240 mj / cm 2 from a distance of 16 cm. The irradiation time was 96 seconds. Thereafter, the carrier was shaken in a 1% BSA solution for 30 minutes, washed and dried. On the other hand, as a control, a solution containing no peptide (aqueous solution of disodium taenoate) was similarly spotted on the carrier, and the immobilization operation was performed as described above.
  • T src kinase manufactured by Upstate
  • T src kinase manufactured by Upstate
  • a buffer (1 ⁇ g / 100 ⁇ l antibody, IX PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA) containing anti-phosphotyrosine (manufactured by Sigma-Aldrich) is placed on the sample-fixed portion of the peptide-immobilized carrier, and incubated for 2 hours. did.
  • the peptide-immobilized carrier was washed with 1 ⁇ PBS-0.2% Tween 20 solution, and the fluorescence was measured using FLA5000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.).
  • tyrosine p6 T src kinase-free buffer [25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl, 7 mM MnCl, 0.5 mM EGTA, 100 ⁇ M ATP] was placed, and incubated for 5 hours.
  • the peptide solid was incubated for 2 hours using the FITC-labeled anti-phosphotyrosine.
  • An immobilized carrier was also prepared.
  • a peptide (Ala-Ala: 2 residues) to which the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 10 was bound was prepared, and was treated with a polymer compound having a carbodiimide group on a glass substrate.
  • a polymer compound having a carbodiimide group on a glass substrate.
  • the sample-fixed portion of the glass substrate was treated with a 2% acetic anhydride / DMF solution to acetylate the N-terminal of the synthesized peptide, and further, 3% triisobutylsilane and 2% water were added.
  • the sample-immobilized portion of the glass substrate was treated at room temperature for 2 hours using a dichloromethane / trifluoroacetic acid (1: 1) solution containing the mixture to carry out a deprotection reaction of the peptide side chain.
  • a peptide to which the polynucleotide was bound was used as the glass substrate. After fixing on a plate, a sample in which the elongation reaction was not performed was also prepared.
  • Cy3-labeled anti-angiotensin I antibody was placed on the sample-fixed part of the above carrier, and left for 2 hours. Incubated. Cy3-labeled anti-angiotensin I antibody can be obtained by using Cy3-NHS (GE Healthcare) in 0.1 M NaHCO (pH 9) to convert Cy3 to anti-angiotensin I antibody (purchased from Cosmo Bio).
  • the protein-immobilized substrate of the present invention is a protein effective for use as a protein chip or the like having excellent reproducibility and quantification. It can be a fixed base material.

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Abstract

　基材上にタンパク質を簡便に効率よく、かつ、簡易に固定化する方法、該タンパク質と相互作用し得る物質の検出を高感度で行う方法、ならびにこれらの方法に用いるタンパク質及びタンパク質固定化基材を提供することを課題とする。 　本発明の固定化タンパク質を用いた該タンパク質と相互作用し得る物質の検出法においては、生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合物が結合したタンパク質であって、基材上に固定化されたタンパク質を固定化タンパク質として用いる。                                                                            

Description

明 細 書
固定化生体分子及び生体分子と相互作用し得る物質の検出法 技術分野
[0001] 本発明は、固定化生体分子を用いた該生体分子と相互作用し得る物質の検出に 関し、詳しくは、固定化生体分子を用いた該生体分子と相互作用し得る物質の検出 法、並びに同方法に用いる生体分子及び生体分子固定ィ匕基材に関する。
背景技術
[0002] 従来、ハイブリダィゼーシヨンによる核酸の分析や、ィムノアッセィ等にぉ 、ては、核 酸やタンパク質を膜や平板などの担体に固定ィ匕する技術が利用されており、これら の技術の中でタンパク質の固定ィ匕法として以下のものが知られている（非特許文献 1
) o
[0003] (1) -トロセルロースメンブレンあるいはポリ L—リジン上にタンパク質を物理的に吸 着させる方法。
(2)ガラス等の基板表面にアルデヒド基ある!/、はエポキシ基を導入した基板を作製し 、これら官能基とタンパク質のアミノ基を反応させ、固定する方法。
(3)金基板上に二官能チオールアルキレンを用いてタンパク質を固定する方法。
[0004] しかしながら、（1)の方法では固定反応に物理吸着を利用しているため、タンパク 質が基材から剥がれやすぐまた、非特異的な吸着により高いバックグラウンドノイズ が観測される欠点がある。
[0005] また、（2)の方法では、共有結合を形成するためタンパク質が基材表面から剥がれ る欠点を克服できるが、固定反応を行う場合に有害な還元剤等の試薬を必要とし、ま た、再現性のあるデータを得るためには熟練の操作を必要とする。
[0006] さらに、（3)の方法では、金—チオール間の結合が物理吸着であることゃチオール 基自体の安定性が乏し 、ことが再現性のある定量的なデータを得ることを困難にして いる。
[0007] また、核酸の固定ィ匕法として核酸にヌクレオチドポリマー等を結合させ、紫外線照 射等により固定ィ匕用基材に結合させる技術が知られて 、る (特許文献 1)。 非特許文献 l :Zhu, H. and Snyder, M. (2003) Protein chip technology. Curr. Opin.
Chem. Biol. 7, 55-63.
特許文献 1：特開 2001—281246号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、基材上に生体分子を簡便に効率よぐかつ、簡易に固定化する方法、 及び生体分子と相互作用し得る物質の検出を高感度で行う方法、及びこの方法に用 いる生体分子及び生体分子固定化基材を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0009] 上記課題を解決するため、検討を行った結果、生体分子に、不飽和結合を有する 化合物を含むポリマー又は光反応性基を有する化合物が結合した生体分子が、強 固に固定ィ匕できること、さらにこのようにして生体分子を基材に固定ィ匕したものを用い ると、該生体分子と相互作用し得る物質の検出感度を向上できることを見出し、本発 明の完成に至った。
[0010] すなわち本発明は、以下の通りである。
(1) 固定化生体分子 (ただし、核酸を除く）を用いた該生体分子と相互作用し得る 物質の検出法に用いられる固定化される生体分子であって、該生体分子が固定化さ れる生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合物が結 合した生体分子。
(2) 前記生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合 物が不飽和結合を有する化合物を含むポリマーである（1)に記載の生体分子。
(3) 前記ポリマーの平均重合度が 2以上で 1000000以下である（2)に記載の生体 分子。
(4) 前記ポリマーを構成するモノマーがヌクレオチドである（2)又は（3)に記載の生 体分子。
(5) 前記生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合 物がナイトレン前駆体、カルベン前駆体又はケトン基を有する化合物から選ばれる、 少なくとも一つの光反応性基を有する化合物である（1)に記載の生体分子。 (6) 前記生体分子が、タンパク質、糖、抗原、抗体、ペプチド及び酵素力も選ばれ る（1)一 (5)の 、ずれかに記載の生体分子。
(7) 生体分子固定化用基材と、この基材上に固定化された（1)一（6)のいずれか に記載の生体分子とを有する生体分子固定化基材。
(8) 生体分子固定化用基材と（1)一 (6)の ヽずれかに記載の生体分子を接触させ 、接触部に電磁波を照射することを含む生体分子固定化基材の製造法。
(9) 固定化生体分子を用いた該固定化生体分子と相互作用し得る物質の検出法 において、（7)記載の生体分子固定ィ匕基材を用いることを特徴とする固定ィ匕生体分 子と相互作用し得る物質の検出法。
発明の効果
[0011] 本発明により、安定に基材又は基材上の担体上に固定ィ匕できる生体分子が提供さ れる。任意の生体分子に基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物 を付加することにより、基材又は基材上の担体上に固定できる任意の生体分子の量 を増やすことができるため、検出感度を向上できる。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
< 1 >生体分子
本発明の生体分子は、生体分子固定ィヒ用基材又は基材上の担体上に結合し得る 基を有する化合物が結合した生体分子である。生体分子としては、タンパク質、糖、 抗原、抗体、ペプチド及び酵素等が挙げられる。
[0013] 以下、生体分子としてタンパク質を例として説明するが、生体分子固定化用基材又 は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物を結合させること以外は、他の物 質でも通常固定ィ匕に用いられている方法や条件を採用して本発明を実施することが できる。
[0014] 本発明のタンパク質は、生体分子固定ィ匕用基材又は基材上の担体上に結合し得 る基を有する化合物が結合していること以外は、通常の固定化（固相化)タンパク質 を用いた固定ィ匕タンパク質と相互作用し得る物質の検出法 (例えば、ィムノアッセィ 等)等に用いられる固定ィ匕タンパク質と特に変わることは無ぐタンパク質と相互作用 し得る物質との結合が可能なタンパク質であれば特に制限されず、例えば、天然又 は合成のタンパク質が挙げられる。また、タンパク質の大きさは、タンパク質と相互作 用し得る物質との結合が可能な大きさであれば特に制限されない。
[0015] タンパク質において、生体分子固定ィ匕用基材又は基材上の担体上に結合し得る基 を有する化合物が結合する部分は、タンパク質のァミノ末端又はカルボキシ末端、側 鎖ァミノ基、側鎖カルボキシキル基、側鎖チオール基、側鎖アルコール基等の部分 である。
[0016] タンパク質に生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有す る化合物を結合させる方法としては、公知の方法を用いることができる。このような方 法としては、例えば、市販のクロスリンク試薬を用いてタンパク質に該化合物を結合さ せる方法やタンパク質が有する官能基と該官能基と反応性を有する原子、官能基又 は構造とを反応させることによりタンパク質に該化合物を結合させる方法を挙げること ができる。
[0017] クロスリンク試薬を用いてタンパク質に生体分子固定ィ匕用基材又は基材上の担体 上に結合し得る基を有する化合物を結合させる方法としては、例えば、以下の方法 等が挙げられる。市販されているペプチド合成機を用いて、 目的とするペプチドを合 成する。ポリマーを構成する化合物として、市販されている核酸合成機を用いて、ァ デニン、シトシン、チミン、ゥラシル等の核酸塩基を有するヌクレオチド力も選ばれる 1 種又は 2種以上が少なくとも 2塩基以上重合したヌクレオチドを合成し、市販のアミノ 基導入試薬を用いてアミノ基を導入する。前記ペプチドとァミノ基が導入されたヌクレ ォチドを、市販のクロスリンク試薬（例えば、 DSS (Disuccinimidyl suberate)等）を用い て、常法に従って結合させる。
[0018] また、糖に生体分子固定ィ匕用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する 化合物を結合させる方法としては、例えば、以下の方法等が挙げられる。グルコース の 6位の水酸基をトリチル基で保護した後、残りの水酸基をァセチルイ匕し、 6位にアジ ド基を導入した後、ァミノ基に変換する。次いで、アミノ化グルコースに DSSを大過剰 量加え、精製する。次いで、例えば、上記のように合成した 5'末端あるいは 3'末端ァ ミノ基が導入されたポリデォキシアデ-ル酸、ポリデォキシシチジル酸、ポリデォキシ チミジル酸、ポリデォキシゥリジル酸等のヌクレオチド又はこれらの複合ポリマーを、 上記アミノ化グルコースのスクシ-ミジル基に反応させる。ナトリウムメトキシドを用いて 脱ァセチル化を行 ヽ、ポリマーが導入されたグルコースを合成する。
[0019] タンパク質が有する官能基と反応性を有する原子、官能基又は構造として、具体的 には、以下のものを挙げることができる。ァミノ基と反応する原子、官能基又は構造と しては、イソチオシァネート基、スクシンイミドエステル、スルホニルスクシンイミドエス テル等に含まれるイミドエステル基、ハロゲン化スルホ-ル基、ハロゲンィ匕アルキル等 に含まれるハロゲン、イソシァネート基、窒素ィぺリット等に含まれるハロゲンィ匕アルキ ル基、プラチナ錯体、カルポジイミド基、アルデヒド基、アジド基、ォキシィミノ-フエ- ルァセトニトリル等に含まれるシァノ基、ジメチルチオピリミジン等に含まれるメチルチ ォ基、ジカルボナート等に含まれるジエステル基等；
カルボキシル基と反応する原子、官能基又は構造としては、ジァゾアルカン等に含 まれるジァゾ基、ハロゲン化アルキル等に含まれるハロゲン、トリフルォロメタンスルホ ネート等に含まれるスルホ-ル基、カルポジイミド基、ヒドラジン等に含まれるヒドラジノ 基、フエナシルエステル等に含まれるフエナシル基、 4ースルホー 2, 3, 5, 6—テトラフ ルオロフェノール等に含まれる水酸基、アルキルトリフルォロメタンスルホネート等； チオール基と反応する原子、官能基又は構造としては、ョードアセトアミド等に含ま れるヨウ素、マレインイミド等に含まれるイミド基、アルキルノヽライド等に含まれるハロゲ ン、アジリジン等に含まれるアジリジノ基、エポキシ基、シンメトリックジサルファイド等 に含まれるジスルフイド基、ビュルスルホン等に含まれるビュル基、ブロモピルビン酸 等に含まれる臭素等；
アルコール基と反応する原子、官能基又は構造としては、 2—ォキソ二トリル、酸クロ ライド、イソシァネート基等を挙げることができる。
[0020] タンパク質が有する官能基と該官能基と反応性を有する原子、官能基又は構造と を反応させることによりタンパク質に該化合物を結合させる方法として、例えば、以下 の方法等が挙げられる。炭酸セシウム、ナトリウム、カルポジイミド、塩ィ匕チォ-ル等を 用いて、タンパク質中のカルボキシル基を活性ィ匕した後に、生体分子固定化用基材 又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物中のハロゲン又はアミノ基を常 法に従って反応させる。
[0021] さらに、本発明のタンパク質としては、生体分子固定化用基材又は基材上の担体 上に結合し得る基を有する化合物、すなわち、不飽和結合を有する化合物を含むポ リマーあるいは光反応性基を有する化合物を結合させたアミノ酸を、基材又は基材 上の担体上に予め後に記載する電磁波を照射すること等により固定して、さらに、 Sp ot synthesis法 (Heine N, Germeroth L, Schneider- Mergener J, Wenschuh H: A modular approach to the spot synthesis of 1,2,5— trisubstituted hybridizations on cellulose membranes. Tetrahedron Lett 2001, 42:227—230.)、フォトリソグラフィー技 術 (Fodor SPA, Read JL, Pirrung LC, Stryer L, Lu AT, Solas D: Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 1991, 251:767- 773.)や Fmoc法 (Hasegawa K, Sha YL, Bang JK, Kawakami T, Akaji K, Aimoto S:
Preparation of phosphopeptide thioesters by Fmoc- and Fmoc(2-F)- solid phase synthesis. Lett Pept Sci 2002, 8:277-284.)等を用いて、基材又は基材上の担体上 に固定したアミノ酸に新たに複数の任意のアミノ酸を結合 (伸長）させることもできる。
[0022] 生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物にお ける、基材又は基材上の担体上に結合し得る基とは、基材又は基材上の担体と反応 性を有し、共有結合等の強固な結合を形成するものであれば特に制限されない。基 材又は基材上の担体上に結合し得る基は、化合物中に、タンパク質がタンパク質固 定ィ匕用基材に固定ィ匕されるのに十分に含まれていればよぐ一つ又は複数であって よい。このような生体分子固定ィ匕用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有す る化合物としては、例えば、不飽和結合を有する化合物を含むポリマー、光反応性 基を有する化合物等を挙げることができる。
[0023] 不飽和結合を有する化合物を含むポリマーとは、ポリマーを構成するモノマーの少 なくとも一つが不飽和結合を有する化合物を含むポリマーを意味する。不飽和結合 を有する化合物は、タンパク質がタンパク質固定ィ匕用基材に固定化されるのに十分 に含まれていればよい。また、ポリマーを構成するモノマーの全てが不飽和結合を有 する化合物であってもよい。なお、「不飽和結合を有する化合物を含む」とは、不飽和 結合を含む化合物の残基からなる又は該残基を含むことを意味する。 [0024] ポリマーの長さとしては、その平均重合度が 2— 1000000であることが好ましぐ 5 一 100000であることがより好ましく、 7— 1000であることが特に好まし!/、。
[0025] この平均重合度が 1以下であると、十分な量のタンパク質を担体上に固定できない ことがあり、また、重合度が 1000001以上であると、立体障害のため標的分子がタン ノ ク質に接近できず、測定を妨げることがある。
[0026] ポリマーとしては、具体的には、了ザニン、アデニン誘導体、シトシン、シトシン誘導 体、グァニン、グァニン誘導体、チミン、チミン誘導体、ゥラシル、ゥラシル誘導体を塩 基として有するヌクレオチド、アクリル酸又はメタクリル酸のエステル系モノマー、スチ レン系モノマー、ポリオレフイン系モノマー、ビニル系モノマー、二トリノレ系モノマー、 エチレングリコールジアタリレート、エチレングリコーノレジメタクリレート、テトラエチレン グリコールジアタリレート、トリメチロールプロパントリアタリレート、テトラメチロールプロ パンテトラアタリレート、ジペンタエリスリトールペンタアタリレート等力も選ばれるモノマ 一が含まれるポリマーが挙げられ、ポリマー中の上記モノマーの種類は同一又は異 なってもよい。好ましいモノマーはヌクレオチドであり、特に好ましいモノマーはアデ- ンを塩基として有するヌクレオチド、シトシンを塩基として有するヌクレオチド、チミンを 塩基として有するヌクレオチド、ゥラシルを塩基として有するヌクレオチドである。
[0027] 光反応性基を有する化合物において光反応性基とは、光を照射することにより、基 材又は基材上の担体と高い反応性を有する基を生じる基を意味する。
[0028] 光反応性基を有する化合物としては、一分子又は光反応性基を有する化合物を含 むポリマーであってもよい。光反応性基を有する化合物を含むポリマーとは、ポリマー を構成するモノマーの少なくとも一つが光反応性基を有する化合物を含むポリマーを 意味する。光反応性基を有する化合物は、タンパク質がタンパク質固定ィ匕用基材に 固定ィ匕されるのに十分に含まれていればよい。また、ポリマーを構成するモノマーの 全てが光反応性基を有する化合物であってもよ ヽ。
[0029] 光反応性基としては、具体的には、ナイトレン前駆体、カルベン前駆体又はケトン 基等が挙げられる。ここで前駆体とは、ナイトレン、カルベン等の活性種を発生し得る 基を意味する。光反応性基を有する化合物は、各種光反応性基のうちの任意の 1又 は 2以上の光反応性基を含むものである。光反応性基を有する化合物としては、具 体的には、ァリルケトン、アジド又はジァゾィ匕合物等を挙げることができる。
[0030] 生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物には 、固定ィ匕した生体分子が標的分子と立体的に十分に接近できるように固定ィ匕する生 体分子と基材表面の距離を適切に保っために、スぺーサー化合物を導入してもよい 。このスぺーサー化合物としては、生体分子及び光生体分子固定化用基材又は基 材上の担体上に結合し得る基を有する化合物と結合し得る非光反応性原子、官能 基又は構造を有する化合物を用いることができる。非光反応性原子、官能基又は構 造を有する化合物としては、例えば、アルキル基、シクロアルキル基、ハロゲン、ヒドロ キシル基、エーテル基（ノ、口エーテル基を含む）、アルデヒド基、カルボ-ル基、エス テル基、アミド基、イミド基、カルボキシル基、スルホ-ル基、ホスホ-ル基、ニトロ基、 アミノ基、チオール基等力 選ばれる任意の原子、官能基又は構造を 2以上含む化 合物であれば特に制限されな！、。
[0031] なお、生体分子固定化用基材又は基材上の担体上に結合し得る基を有する化合 物としては、上記した光反応性基を有する化合物と不飽和結合を有する化合物を含 むポリマーを含むものであってもよ 、。
[0032] 本発明の生体分子には、生体分子固定ィ匕用基材又は基材上の担体上に結合し得 る基を有する化合物とともに、さらにビュルィ匕デォキシグアノシン、ビニル化デォキシ グアノシン誘導体、ソラレン、ソラレン誘導体 (4'5'-ジヒドロソラレン、 4,5'8-トリメチルソ ラレン、アンゲリシン等)等の光架橋剤を導入してもよぐこのような光架橋剤を用いて 生体分子を三次元的に固相担体上に固定することもできる。
[0033] く 2 >タンパク質固定ィ匕用基材
本発明のタンパク質固定ィ匕用基材に用いる基材は、タンパク質固定ィ匕用基材又は 基材上の担体上に結合し得る基を有する化合物と反応性を有し、化学結合によって これらの化合物が結合したタンパク質を固定ィ匕することができ、通常の固定ィ匕タンパ ク質を用いた固定ィ匕タンパク質と相互作用し得る物質の検出法等の条件に耐えうる ものであれば特に制限されない。具体的には、タンパク質の固定及び固定ィ匕タンパ ク質と相互作用し得る物質の検出法等に用いる溶剤に不溶であり、かつ常温若しく はその付近の温度範囲内（例えば 0— 100°C)で固体又はゲル状であるものが挙げ られる。尚、基材が溶剤に不溶性であるとは、基材に後述のようにしてカルポジイミド 基等のタンパク質に結合性を有する基を有する担体が担持され、次 ヽでタンパク質 が固定ィ匕され、その後、例えば、プロテインチップ等として使用される際の各過程で 用いられる水性溶剤、有機溶剤等の各種溶剤に実質的に不溶性であることをいう。
[0034] このような基材の材質として、具体的には、プラスチック、無機高分子、金属、セラミ ック等が挙げられる。
[0035] 上記プラスチックとして具体的には合成樹脂 (熱可塑性榭脂、熱硬化性榭脂、共重 合体等)及び天然榭脂を挙げることができる。
[0036] より具体的に、熱可塑性榭脂としては、ポリカルポジイミド、アイオノマー (スチレン系 、ォレフィン系）、ポリノルボルネン、ポリアセタール、ポリアリレート、ポリエーテルエー テルケトン、ポリエチレンオキサイド、ポリオキシメチレン、ポリエチレンテレフタレート、 ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリパラメチルスチレン、ポリアリルアミ ン、ポリフエ-レンエーテル、ポリフエ-レンサルファイド、ポリブタジエン、ポリブチレ ンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリエーテルスルホン、ポリフエ 二レンスルフイド、ポリオキシベンゾィル、ポリオキシエチレン、酢酸セルロース、ポリジ メチルシロキサン、ポリイソブチレン、セルローストリアセテート、ポリ p フエ二レンテ レフタラミド、ポリイソプレン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルペンテン、塩素プラスチッ ク（ポリ塩ィ匕ビュル、ポリ塩ィ匕エチレン、塩素化ポリプロピレン、ポリ塩ィ匕ビ -リデン）、 フッ素プラスチック（テトラフルォロエチレン、ポリクロ口トリフルォロエチレン、ポリフッ 化ビ-リデン）、ニトロセルロース、ポリアミド（ナイロン 6、ナイロン 66)、ポリアミドイミド、 ポリイミド (熱可塑性ポリイミド、ポリエーテルイミド）、ポリエチレンプラスチック (塩素化 、高密度、低密度）、ポリビュルプラスチック（ポリ塩ィ匕ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリパ ラビニルフエノール、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニノレブチラ一 ル、ポリビュルホルマール）、液晶ポリマー (ポリエステル系液晶高分子）、アタリレート プラスチック（ァミノポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタタリレート、ェチ ルポリメタクリレート、ブチルポリメタクリレート）、熱可塑性エラストマ一（スチレン系、ォ レフイン系、ウレタン系、ポリエステル系、ポリアミド系、 1, 2—ポリブタジエン系、塩化ビ -ル系、フッ素系、ポリアイオノマー系、塩素化ポリエチレン系、シリコーン系）等を挙 げることができる。
[0037] より具体的に、熱硬化性プラスチックとしては、エポキシ、ポリキシレン、ポリグァナミ ン、ポリジァリルフタレート、ポリビュルエステル、ポリフエノール、不飽和ポリエステル 、ポリフラン、ポリイミド、ポリウレタン、ポリマレイン酸、メラミン、ユリア、アルキド、ベン ゾグアナミン、ポリシアナート、ポリイソシアナ一ト等を挙げることができる。
[0038] また、プラスチックとしては、共重合体を用いることもでき、より具体的に、共重合体 としては、イソブチレン無水マレイン酸共重合体、アクリロニトリルアタリレートスチレン 共重合体、アクリロニトリル EPDMスチレン共重合体、アクリロニトリルスチレン共重合、 アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、ブタジエンスチレンメチルメタタリレート 共重合体、エチレン塩化ビュル共重合体、エチレン酢酸ビニル共重合体、エチレン ェチルアタリレート共重合体、アクリロニトリル ブタジエンスチレン共重合体、ポリエ 一テルエーテルケトン共重合体、フッ化工チレンポリプロピレン共重合体、テトラフル ォロエチレンパーフロロアルキルビュルエーテル共重合体、テトラフルォロエチレン エチレン共重合体等を挙げることができる。
[0039] さらに、より具体的に、天然榭脂としては、セルロース、ロジン、コーバル、ダンマル 、カナダバルサム、ェレミ、サンダラック、グッタベル力、ウルシ、シュラック、コハク、じ ん皮繊維、葉脈繊維、果実繊維、獣毛繊維、繭繊維、羽毛繊維、キチン、キトサン、 石綿、アスベスト及びこれらの誘導体等を挙げることができる。
[0040] また、上記合成樹脂に、染料、発色剤、可塑剤、顔料、重合禁止剤、表面改質剤、 安定剤、密着性付与剤、熱硬化剤、分散剤、紫外線劣化防止剤等を必要に応じて 添加した合成樹脂を用いることができる。さらに、前記合成樹脂としては、形状を保持 するために異なる種類の前記合成樹脂を積層させていてもよぐ単一合成樹脂であ つてもよい。また、前記合成樹脂を 2種類以上混合したポリマーァロイであってもよい
[0041] また、無機高分子として具体的には、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及びダラ ファイト等が挙げられる。
[0042] また、金属として好ましくは、周期律表第 2周期一第 7周期の I、 II、 III、 IV、 V、 VI、
VII、 VIII族および遷移元素力 選ばれる金属、又は同金属を含む合金が挙げられる [0043] 上記周期律表第 2周期一第 7周期の I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII族および遷移元 素から選ばれる金属として特に好ましいものとしては、アルミニウム、チタン、白金、タ ングステン、モリブデン、金、銅、ニッケル等が挙げられる。
[0044] また、上記合金として具体的には、洋白（成分: Cu, Ni, Zn)、真鍮 (成分: Cu, Zn)、 ブロンズ（成分： Cu, Be)、モネル（成分： Cu, Ni, Fe, Mn)、ニッケルコバルト合金（成 分： Ni, Co)、ニッケルクロム合金（成分： Ni, Cr)、コバルト合金（成分： Co, Ni, Cr)、ス テンレス（成分： Ni, Cr, Fe)、銀タングステン（成分: Ag, W)、 bチタン（成分： Ti, V, A1 ；)、 abチタン (成分: Ti, V, Al)、 NT合金 (成分: Ti, Ni)、アルミニウム合金 (成分: Al, Cu, Mg, Si, Mn, Zn)、ジュラルミン（成分： Al, Cu, Si, Fe, Mn, Mg, Zn)、マグネシウム 合金 (成分: Mg, Al, Zn)、 K24 (成分: Au)、 K18 (成分: Au, Ag, Cu)、ベリリウム銅 (成 分： Cu, Be)、铸鉄 (成分： Fe, Mn, S, C)、炭素鋼 (成分： Fe, C, Si, Mn, P, S)、青銅 铸物 (成分: Cu, Sn, Zn, Pb)、りん青銅铸物 (成分: Cu, Zn, P)、黄銅铸物 (成分: Cu, Zn, Pb)、マンガン黄銅（成分： Cu, Zn, Mn, Fe,Al)、シルジン青銅铸物（成分： Cu, Si, Zn)、アルミニウム青銅铸物（成分： Cu, Al,Fe, Ni, Mn)、エリンバー（成分： Ni, Cr, Mn)、エリンバーェクストラ（成分： Ni, Cr, Co, Mn)、インバー（成分： Ni, Fe)、スーパ 一インバー（成分： Fe, Ni, Co)、ステンレスインバー（成分： Fe, Co, Cr)、 Malottes (成 分： Sn, Bi, Pb)、リポウイッツ（Lipowitz) (成分： Sn, Bi, Pb, Cd)、ウッズ (Wood's) (成 分： Sn, Bi, Pb, Cd)、マンガ-ン（成分： Cu, Mn, Ni, Fe)、イザベリン（成分： Cu, Mn, Al)、コンスタンタン（成分： Cu, Ni)、アルクレス（成分： Fe, Cr, Al)、カンタル（成分： Cr, Fe, Al, Co)、アルメル（成分： Ni, Al)、磁性材料（Fe, Ni, Co等強磁性遷移元素 を含む材料）、パーマロイ（成分： Fe, Ni)、アルパーム（成分： Fe, Al)、フェライト（Fe
2
0を主成分とする複合酸化物）、センダスト (成分: Fe, Si, Al)、スーパーセンダスト（
3
成分： Fe, Si, Al, Ni,)、アルニコ（成分： Fe, Al, Ni, Co)、水素吸蔵金属（ランタン-ッ ケル合金 (成分: La, Ni)等）、 Co- Cr系合金、 SnO系酸化物、 Nb- Ti合金、制振合金（
2
振動を低減もしくは吸収、振動の伝播を遮断する合金材料、 A卜 Zn超塑性合金、サイ レントァロイ、二チノール等）、電極用材料、半導体材料 (シリコン、ゲルマニウム、カリ ゥムヒ素等)等が挙げられる。 [0045] また、前記金属は、他の金属で蒸着又はメツキ処理 (加工)されて 、てもよ 、。さら に、前記金属は、形状を保持するために異なる種類の前記金属を積層させていても よぐ単一金属であってもよい。
[0046] 本発明における基材として上記金属を用いる場合、基材が金属のみカゝら構成され ていてもよいし、非金属材料上に金属が接着、蒸着又はメツキ等により積層されてい てもよい。
[0047] また、セラミックとして具体的には、アパタイト、アルミナ、シリカ、炭化ケィ素、窒化ケ ィ素及び炭化ホウ素等が挙げられる。
[0048] 上記基材の形状は、特に問われないが、箔 (フォイル)状、平板 (プレート)状、薄片
(ゥエーノ、）状、フィルター状、ビーズ状等が挙げられる。また、マイクロタイタープレー トのような形状であってもよい。さらに、得られる結果の保存を容易にするため、平板 等の裏面をシール等に使用できる材料 (接着剤等)を塗布、コート等をすることによつ て、シールとしても使用することもできる。また、それらの大きさについては、特に制限 は無い。
[0049] 上記基材にタンパク質を固定ィ匕するに当たって、基材にタンパク質を直接固定ィ匕し てもよく、担体を基材に担持させて、担体を介してタンパク質を基材に固定ィ匕してもよ い。担体としては、前述のタンパク質固定ィ匕用基材又は基材上の担体上に結合し得 る基を有する化合物に結合性を有するものが使用できる。ここで、「担持」とは、担体 にタンパク質を固定ィ匕する際やタンパク質固定ィ匕基材をプロテインチップ等として使 用する際等に用いられる水溶性溶剤、有機溶剤等の各種溶剤中で、基材から上記 担体が実質的に脱離しないことを意味する。
[0050] 本発明に用いられる上記担体は、上記基材上に担持される限り、単に物理的な接 着性を利用して担持されていてもよぐまた、化学的に共有結合等を介して担持され ていてもよい。また、上記担体は、必要に応じ、基材上の全面において担持されても 、また、その一部において担持されてもよい。
[0051] 担体としては、有機低分子、プラスチック、無機高分子、金属、セラミック等が挙げら れる。
[0052] 上記有機低分子として具体的には、ポリリジン、 3—アミノトリエトキシアミノシラン、 3- アミノトリメトキシアミノシラン等の一級アミノ基を有するシランカップリング剤、マレイン イミド、スクシンイミドエステル等のイミド基含有ィ匕合物、カルポジイミド基含有ィ匕合物 、イソシァネート基含有化合物、イソチオシァネート基含有ィ匕合物、窒素ィぺリット基 含有化合物、アルデヒド基含有化合物、アミノ基含有化合物、カルボキシル基含有 化合物、ハロゲン含有ィ匕合物等が挙げられる。
[0053] また、プラスチックとして具体的には、基材材料として上記したような合成樹脂 (熱可 塑性榭脂、熱硬化性榭脂、共重合体等)及び天然榭脂を用いることができる。
[0054] また、無機高分子として具体的には、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及びダラ ファイト等が挙げられる。
[0055] また、金属として好ましくは、基材材料として上記したような周期律表第 2周期一第 7 周期の I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII族および遷移元素力 選ばれる金属、又は同金 属を含む合金を用いることができる。
[0056] 上記周期律表第 2周期一第 7周期の I、 II、 III、 IV、 V、 VI、 VII、 VIII族および遷移元 素から選ばれる金属として特に好ましいものとしては、アルミニウム、チタン、白金、タ ングステン、モリブデン、金、銅、ニッケル等が挙げられる。
[0057] また、セラミックとして具体的には、アパタイト、アルミナ、シリカ、炭化ケィ素、窒化ケ ィ素及び炭化ホウ素等が挙げられる。
[0058] このような担体は、上記基材に対して高い接着性を有するものであり、この接着性を 利用して基材に担持されるものである。尚、前記担体が基材上に物理的な接着性を 利用して担持される際の代表的な形態は皮膜である。
[0059] 前記基材上に前記担体を皮膜で担持させる方法としては、スプレー、浸漬、ブラッ シング、スタンプ、蒸着、フィルムコータを用いたコーティング等の公知の方法を用い ることがでさる。
[0060] 例えば、ガラス基材の表面全体にカルポジイミド基 (榭脂）を導入する方法にっ ヽて は、まず、 3—ァミノプロピルトリエトキシシラン等のアミノ置換オルガノアルコキシシラン を適当な溶媒に溶解して得られた溶液に 70— 80°C程度の温度条件下でガラス基材 を概ね 2— 3時間程度浸漬した後、これを取り出して水洗し、さらに、 100— 120°C程 度で約 4一 5時間加熱乾燥する。乾燥後、適当な溶媒中に浸し、カルポジイミド榭脂 をカロえ 30— 170°C程度の温度条件下で 12時間程度攪拌し、洗浄すればよい。また 、上記 3—ァミノプロピルトリエトキシシランのァミノ基と窒素ィぺリット基のタンパク質結 合基以外の官能基を適当な溶媒を用いて反応させ、ガラス基材の表面に窒素ィペリ ット基を導人することもできる。
[0061] また、ガラス基材にァミノ基以外の官能基を導入する場合や、基材がガラス以外の 材料カゝらなる場合においても、上記基材の説明で挙げた各種材料表面に種々の官 能基を導入することは、従来より一般的に行われていることであり、その方法も公知で あるので、このような公知の方法を用いて基材表面への官能基の導入を行うことがで きる。
[0062] さらに、上記で挙げた基材のプラスチック基材の中には、基材表面に既に上記のよ うな官能基を有するものも有り、この場合には基材表面に官能基を導入することなし に、これをそのまま担体の製造に用いることも可能である。また、このようなプラスチッ ク基材であってもさらに官能基を導入して上記担体の製造に用いることも可能である
[0063] また、上記担体又は基材、ある!/、は担体及び基材の材料に公知の光重合開始剤 を混合することもできる。光重合開始剤を混合することによって、紫外線等の電磁波 の照射によるタンパク質の固定ィ匕の際の反応性が向上し得る。
[0064] < 3 >タンパク質固定化基材
上記担体の所定の位置に、タンパク質の溶液をスポットする。タンパク質としては、 上記く 1 >で挙げたタンパク質が特に制限無く挙げられる。
[0065] タンパク質を溶解する溶媒も特に制限されず、蒸留水、又は通常タンパク質溶液の 調製に用いられる緩衝液、例えば Tris緩衝液、 PBS緩衝液（137 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 1.5 mM KH PO , 8.1 mM Na HPO )、リン酸を含む水溶液、食塩を含む水溶液
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等の他、カルボキシル基、スルホ-ル基、ホスホ-ル基を含む化合物から選ばれるァ ユオンと、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、ォ -ゥムイオン力も選ばれる カチオンとを含む溶媒を用いることができる。同ァ-オンとカチオンとを含む溶媒を用 いることにより、電磁波を用いてより効率よくタンパク質を担体に固定ィ匕することができ る。同ァ-オンとカチオンとを含む溶媒として、具体的には、例えば、カルボン酸塩を 含む水溶液 (タエン酸ナトリウム、クェン酸アンモ-ゥム、酢酸ナトリウム等）、スルホン 酸塩を含む水溶液 (ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸アンモ -ゥム等）、ホスホン 酸塩を含む水溶液等（リン酸ナトリウム、リン酸アンモ-ゥム等)等を挙げることができ る。また、タンパク質溶液の濃度も特に制限されないが、通常 1 mmol/ 1一 1 foiol/ 1、好ましくは 100 μ mol/ μ 1一 100 ftnol/ μ 1の濃度である。
[0066] タンパク質溶液を担体上にスポットする方法としては、ピペットでタンパク質溶液を 担体上に滴下する方法、又は市販のスポッタを用いる方法等が挙げられる。スポット の形状及びスポット量としては、タンパク質溶液をスポットした位置を把握することが できる程度であれば、特に制限されないが、形状としては点状又は円状が好ましい。 また、好ましいスポット量は lOnl— 10mlである。タンパク質溶液は、担体上に 1箇所又 は複数箇所にスポットされる。スポットされるタンパク質溶液は、 1種類でも 2種類又は それ以上であってもよい。尚、担体にタンパク質が固定されたことを示す陽性コント口 ールとして、標識したタンパク質を固定ィ匕してお 、てもよ 、。
[0067] タンパク質溶液を担体上にスポットした後に、電磁波、好ましくは紫外線を照射する 。また、前記タンパク質溶液をスポット後紫外線照射前に乾燥させることができる。前 記タンパク質溶液の乾燥方法としては、自然に乾燥させてもよぐ加熱して乾燥させ てもよい。加熱する場合の温度は、通常 30— 100°C、好ましくは 35— 45°Cである。
[0068] 不飽和結合を有する化合物を用いてタンパク質を固定ィ匕する場合、担体、少なくと も担体のタンパク質を固定した部位に照射する紫外線としては、波長 240— 380nmの 成分を含む紫外線等を好ましく挙げることができる。具体的には、波長 254nm又は 335應を含むブロードな波形を有する紫外線であっても良い。照射量は、累積照射 量として通常 20— 2400mJ/cm2、好ましくは 50— 900mJ/cm2である。
[0069] 光架橋剤及び Z又は光反応性基を有する化合物を用いてタンパク質を固定化す る場合、担体、少なくとも担体のタンパク質を固定した部位に照射する紫外線の波長 、照射量等は用いる光架橋剤及び Z又は光反応性基を有する化合物に応じて、適 宜決定することができる。
[0070] 本発明のタンパク質固定ィ匕用基材は、これを用いて分析等を行う際に、上記固定 化タンパク質以外のタンパク質等を接触させる機会が多いが、基材又は基材上の担 体に担持された未反応タンパク質固定部分に上記固定化タンパク質以外のタンパク 質等が非特異的に結合することを防ぐため、上記のようにして点状にタンパク質を基 材又は基材上の担体に固定ィ匕した後に、過剰量のゥシ血清アルブミン (BSA)、カゼ イン等を基材又は基材上の担体に接触させ、未反応タンパク質固定部分をブロック しておくことが好ましい。
[0071] 本発明のタンパク質固定ィ匕基材を用いた検出法により検出される物質は、前記タン ノ^質固定ィ匕用基材上に固定化された固定ィ匕タンパク質と相互作用し得る物質であ れば特に制限されない。なお、「相互作用」とは、固定ィ匕タンパク質とある物質間にお いて、共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合及び静電気による 結合等により生じる分子間における作用であり、特に限定されない。
[0072] このようにして得られる本発明のタンパク質固定ィ匕基材は、前記タンパク質が担体 に非常に強固に担持されたものであり、固定ィ匕タンパク質を用いた固定ィ匕タンパク質 と相互作用し得る物質の検出法 (例えば、ィムノアッセィ等)等で広く使用されている 洗浄方法 (界面活性剤を用いた洗浄方法等）によっても脱離することがなぐこれを 用いて分析等を行った場合、再現性及び定量性に優れた分析が可能となる。また、 本発明のタンパク質固定ィ匕基材は、タンパク質が、大きさや種類に制限されずに固 定され得るので、同一基材上で種々のタンパク質を同時に取り扱うことができる。
[0073] これらのことから、本発明のタンパク質固定ィ匕基材は、プロテインチップ (プロテイン マイクロアレイ)等に優れた性能を持って適用可能であるといえる。
実施例 1
[0074] <クェン酸二アンモ-ゥム水溶液を溶媒としたペプチド溶液の担体への固定化、ぺ プチド固定化担体の抗体反応による評価 >
常法に従い、ペプチド合成機を用いて、配列番号 1に示すアミノ酸配列を有するぺ プチド（7残基)を合成した。さらに、配列番号 2で示すチロシンをリン酸ィ匕したぺプチ ド（7残基)も合成した。なお、ペプチド合成の詳細については、ペプチド合成の基礎 と実験 (丸善株式会社)を参照した。次いで、配列番号 3に示すオリゴヌクレオチド（1 0残基)の 5'末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドを定法に従 ヽ合成した。
[0075] 上記合成ペプチド及び上記オリゴヌクレオチドを等モルずつリン酸バッファー（p H7.5)に溶解し、 10倍モルの DSS (ピアス社製)をカ卩えて、 37°Cにて 2時間インキュべ ートした。次いで、 NAP5カラム (アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて精製'濃 縮し、 45mMクェン酸二アンモ-ゥム水溶液に溶解してペプチド溶液（1 pmol/ zz l)を 調製した。
[0076] 担体上の所定の位置に、前記ペプチド溶液をスポットした。スポット量は、それぞれ 0.5 μ 1であり、スポット径の大きさは直径 lmmであった。次いで、 Uvstratalinker 2400( ストラタジーン社製， 中心波長 254nm)を用い、紫外線を 16cmの距離から、 600mJ/cm2 照射した。照射時間は 240秒であった。その後、前記担体を水中で 30分間振とうし、 洗浄した後に乾燥させた。
[0077] 一方、コントロールとしてペプチドを含まな 、溶液 (タエン酸ニナトリウム水溶液)も 同様に担体にスポットし、前述のような固定ィ匕の操作を行った。
[0078] 担体として、カルポジイミド基を有する高分子化合物で処理したガラス基材を用い た。
[0079] 上記担体の試料固定部分に、ローダミン標識抗リン酸ィ匕アミノ酸抗体を含む溶液 (1 μ g/100 μ 1抗体， 1 X PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA)を載せ、 5時間インキュベートし た。ローダミン標識抗リン酸ィ匕アミノ酸抗体は、ローダミン NHS (モレキュラープローブ ス社製)を用いて 0. 1M NaHCO (pH 9)中でローダミンを抗リン酸化アミノ酸抗体（コ
3
スモノくィォ社製）に導入したものを用いた。次いで、上記担体を滅菌水で洗浄し、 ScanArray 4000 (GSI社製）を用いて蛍光を測定した。
[0080] リン酸ィ匕ペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出され たことから、ペプチドが確実に固定ィ匕されていることが示された。また、コントロール（ ペプチドを含まな 、スポット及びリン酸化されて 、な 、ペプチドを含むスポット）では、 蛍光を検出しな力つた。
実施例 2
[0081] <タンパク質の担体への固定化、タンパク質固定化担体の抗体反応による評価 >
Protein G (フナコシ社製）及び BSA (シグマアルドリッチ社製）各 500 gをリン酸バッ ファー（pH7.5)及び DMF (Ν,Ν-dimethylformamide) (1:1 vol/vol)混合溶液 (2ml)に溶 解し、等モルの配列番号 4に示すポリチミン誘導体の 5'末端にアミノ基を導入したオリ ゴヌクレオチド (ダレンリサーチ社製, 12塩基)及び 10倍モルの DSS (ピアス社製)をカロ えて、 4°Cにて 10時間インキュベートした。次いで、 NAP5カラム（アマシャムバイオサイ エンス社製)を用いて精製し、タンパク質溶液 (50 g/ml)を調製した。ガラス板に金 蒸着させた担体の所定の位置に、前記タンパク質溶液をスポットした。スポット量は、 それぞれ 0.5 μ 1であり、スポット径の大きさは直径 lmmであった。次いで、 CRM- FA Spectro Iradiator (JASCO社製)を用い、中心波長 335 nmの紫外線を照射した。このと きの照射強度は、 1.5mW/cm2であり、照射時間は 120秒であった。その後、前記担体 を水中で 30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとして紫外線 を照射して！/ヽな！ヽ担体も作製した。
[0082] 上記タンパク質固定ィ匕担体のタンパク質固定部分に、 Cy3標識抗 Protein G IgG (ァ マシャム バイオサイエンス社製）を含む溶液（1 μ g/200 μ 1 IgG, 1 X PBS, 0.2% TritonX- 100)を載せ、 5時間インキュベートした。次いで、上記タンパク質固定化担 体を 1 X PBS-0.2% TritonX-100溶液で洗浄し、 ScanArray 4000 (GSI社製）を用いて 蛍光を測定した。
[0083] 紫外線を照射した担体上の Protein Gを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、 特異的に検出されたことから、タンパク質が確実に固定ィ匕されていることが示された。 また、コントロール (紫外線を照射して 、な 、スポット及び BSAを含むスポット）では、 蛍光を検出しな力つた。
実施例 3
[0084] <光架橋剤を用いたペプチドの担体への固定化、ペプチド固定化担体の抗体反応 による評価 >
実施例 1で作製したペプチド溶液（lpmol/ μ 1) 100 μ 1にソラレン (モレキュラープロ 一ブネ土製)溶液 (200 g/ml)を 0.1mlカ卩えよく混合し、ソラレン含有ペプチド溶液 (ぺプ チド 0.5ρπιο1/ /ζ 1)を調製した。次いで、カルポジイミド基を有する高分子化合物で処 理したガラス担体上の所定の位置に、前記ペプチド溶液をスポットした。スポット量は それぞれ 0.5 μ 1であり、スポット径の大きさは直径 lmmであった。次いで、 HPW125 Philips Lamp (Philips Lighting社製）（中心波長 365 nm)を 2.9 X 1016quanta/secのエネ ルギ一で 60分間照射し、さらに、 Uvstratalinker 2400(ストラタジーン社製、中心波長 254 nm)を用い、紫外線を 16cmの距離から、 300mJ/cm2照射した。照射時間は 120秒 であった。その後、前記担体を水中で 30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。
[0085] 一方、コントロールとしてペプチドを含まな 、溶液 (タエン酸ニナトリウム水溶液)も 同様に担体にスポットし、前述のような固定ィ匕の操作を行った。
[0086] 上記担体の試料固定部分に、ローダミン標識抗リン酸ィ匕アミノ酸抗体を含む溶液 (1 μ g/100 μ 1抗体， 1 X PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA)を載せ、 5時間インキュベートし た。ローダミン標識抗リン酸ィ匕アミノ酸抗体は、ローダミン NHS (モレキュラープローブ ス社製)を用いて 0. 1M NaHCO (pH 9)中でローダミンを抗リン酸化アミノ酸抗体（コ
3
スモノくィォ社製）に導入したものを用いた。次いで、上記担体を滅菌水で洗浄し、
ScanArray 4000 (GSI社製）を用いて蛍光を測定した。
[0087] リン酸ィ匕ペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出され たことから、ペプチドが確実に固定ィ匕されていることが示された。また、コントロール（ ペプチドを含まな 、スポット及びリン酸化されて 、な 、ペプチドを含むスポット）では、 蛍光を検出しな力つた。
実施例 4
[0088] <ペプチドの担体への固定化、ペプチド固定化担体の抗体反応による評価 >
ペプチド合成機を用いて、配列番号 5に示すアミノ酸配列を有するペプチド (8残基 )及び配列番号 6で示すセリンをリン酸ィ匕したペプチド (8残基)を合成した。これらべ プチドの N末端を常法に従い、固相担体上 (2-クロロトリチルクロライド レジン)でァセ チル化した。側鎖の保護基 [BOC (t-ブトキシカルボニル)基及び t-Bu (t-プチル)基] を有したままのこれらペプチドを酢酸：トロフルォロエタノール：ジクロロメタン溶液 (1:2:7 vol/vol)を用いて固相担体上力 切り離した。これらペプチドを DMF中で 1,3- ジイソプロピルカルボジイミド， 1-ヒドロキシベンゾトリァゾール， Ν,Ν-ジイソプロピルェ チルァミン及び 4-ジメチルァミノピリジンを用いて、常法に従い、ペプチドの C末端に 、配列番号 4に示すポリチミン誘導体の 5'末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチ ドを導入した。次いで、ペプチドの保護基をトリフルォロ酢酸:水:ジエタンジチオール: チオア-ノール:フエノール溶液 (10 ml:0.5 ml:0.25 ml: 0.5 ml: 0.75 g)を用いて脱保 護し、 NAP5カラム (アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて精製'濃縮し、 50mM リン酸水溶液 (pH 8.5)に溶解してペプチド溶液（lpmol/ μ 1)を調製した。
[0089] カルポジイミド基を有する高分子化合物で処理したガラス担体上の所定の位置に、 前記ペプチド溶液をスポットした。スポット量は、それぞれ 0.5 1であり、スポット径の 大きさは直径 lmmであった。次いで、 CRM-FA Spectro Iradiator (JASCO社製)を用 い、中心波長 335 nmの紫外線を照射した。このときの照射強度は、 1.5mW/cm2であり 、照射時間は 120秒であった。照射時間は 60秒であった。その後、前記担体を水中で 30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとして紫外線を照射し ていない担体も作製した。
[0090] 上記ペプチド固定ィ匕担体のペプチド固定部分に、ローダミン標識抗リン酸ィ匕ァミノ 酸抗体を含む溶液 (1 μ g/100 μ 1抗体， 1 X PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA)を載せ、 5 時間インキュベートした。ローダミン標識抗リン酸ィ匕アミノ酸抗体は、ローダミン NHS( モレキュラープローブス社製)を用いて 0. 1M NaHCO (pH 9)中でローダミンを抗リン
3
酸ィ匕アミノ酸抗体 (コスモバイオ社製）に導入したものを用いた。次いで、上記べプチ ド固定ィ匕担体を滅菌水で洗浄し、 ScanArray 4000 (GSI社製)を用いて蛍光を測定し た。
[0091] 紫外線を照射した担体上のリン酸ィ匕ペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭 、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確実に固定ィ匕されていることが示さ れた。また、コントロール (紫外線を照射していないスポット及びリン酸ィ匕されていない ペプチドを含むスポット)では、蛍光を検出しな力つた。
実施例 5
[0092] <ペプチドの担体への固定化、ペプチド固定化担体の抗体反応による評価 >
実施例 4で作製したペプチド溶液（lpmol/ μ 1)を、アミノシランで処理したガラス担 体（Telechem International社製）上の所定の位置にスポットした。スポット量は、それ ぞれ 0.5 μ 1であり、スポット径の大きさは直径 lmmであった。次いで、 CRM- FA Spectro Iradiator (JASCO社製)を用い、中心波長 335 nmの紫外線を照射した。このと きの照射強度は、 1.5mW/cm2であり、照射時間は 120秒であった。その後、前記担体 を水中で 30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとして紫外線 を照射して！/ヽな！ヽ担体も作製した。 [0093] 上記ペプチド固定ィ匕担体のペプチド固定部分に、ローダミン標識抗リン酸ィ匕ァミノ 酸抗体を含む溶液 (1 μ g/100 μ 1抗体， 1 X PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA)を載せ、 5 時間インキュベートした。ローダミン標識抗リン酸ィ匕アミノ酸抗体は、ローダミン NHS( モレキュラープローブス社製)を用いて 0. 1M NaHCO (pH 9)中でローダミンを抗リン
3
酸ィ匕アミノ酸抗体 (コスモバイオ社製）に導入したものを用いた。次いで、上記べプチ ド固定ィ匕担体を滅菌水で洗浄し、 ScanArray 4000 (GSI社製)を用いて蛍光を測定し た。
[0094] 紫外線を照射した担体上のリン酸ィ匕ペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭 、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確実に固定ィ匕されていることが示さ れた。また、コントロール (紫外線を照射していないスポット及びリン酸ィ匕されていない ペプチドを含むスポット)では、蛍光を検出しな力つた。
実施例 6
[0095] <光反応性基によるペプチドの担体への固定化、ペプチド固定化担体の抗体反応 による評価 >
4-ベンゾィル安息香酸力 4-ベンゾィル安息香酸クロライドを常法により合成した。 4-ベンゾィル安息香酸クロライド (30g)をクロ口ホルム (500ml)に溶解し、 6-ァミノへキサ ン酸溶液 (17g/400ml IN NaOH)を 0°Cにて滴下し、 60分間室温にて攪拌した。反応 混合溶液に 12N HCl(40ml)を加え、有機溶媒層を抽出した。有機溶媒層を減圧濃縮 し、乾燥した。次いで、得られた乾燥物に 1,4-ジォキサン (500ml)をカ卩えて、溶解し、 N-ヒドロキシスクシンイミド (10.7g)、 1,3-ジシクロへキシルカルボジイミド (20. lg)をカロえ 、室温にて 18時間攪拌した。濾過後、溶液を減圧濃縮して、 N-スクシンィミジル 6-(4- ベンゾィルベンズアミド)へキサノエートを 25g得ることができた。
[0096] 常法に従!、、ペプチド合成機を用いて、配列番号 5に示すアミノ酸配列を有するぺ プチド (8残基)を合成した。さらに、配列番号 6で示すセリンをリン酸ィ匕したペプチド（ 8残基)も合成した。次いで、ペプチド (10應 ol)に対して 1M炭酸水素ナトリウムバッフ ァー (pH 9.0)(0.5ml)をカ卩えて溶解し、 DMFに溶解した N-スクシンィミジル 6-(4-ベンゾ ィルベンズアミド)へキサノエート (lOOnmol)をカ卩えて、室温にて 18時間攪拌した。次い で、 NAP5カラム（アマシャム ノィォサイエンス社製）を用いて精製'濃縮し、 50mMリ ン酸水溶液 (pH 8.5)に溶解してペプチド溶液（lpmol/ μ 1)を調製した。
[0097] 前記ペプチド溶液を巿販のポリプロピレン担体（ポリプロピレンプレート：タキロン社 製）上の所定の位置にスポットした。スポット量は、それぞれ 0.5 μ 1であり、スポット径 の大きさは直径 lmmであった。次いで、 CRM-FA Spectro Iradiator (JASCO社製)を 用い、中心波長 335 nmの紫外線を照射した。このときの照射強度は、 1.5mW/cm2で あり、照射時間は 120秒であった。その後、前記担体を水中で 30分間振とうし、洗浄し た後に乾燥させた。また、コントロールとして、紫外線を照射していない担体も作製し た。
[0098] 上記ペプチド固定ィ匕担体のペプチド固定部分に、ローダミン標識抗リン酸ィ匕ァミノ 酸抗体を含む溶液 (1 μ g/100 μ 1抗体， 1 X PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA)を載せ、 5 時間インキュベートした。ローダミン標識抗リン酸ィ匕アミノ酸抗体は、ローダミン NHS( モレキュラープローブス社製)を用いて 0. 1M NaHCO (pH 9)中でローダミンを抗リン
3
酸ィ匕アミノ酸抗体 (コスモバイオ社製）に導入したものを用いた。次いで、上記べプチ ド固定ィ匕担体を滅菌水で洗浄し、 ScanArray 4000 (GSI社製)を用いて蛍光を測定し た。
[0099] 紫外線を照射した担体上のリン酸ィ匕ペプチドを含むスポットのみにシグナルが明瞭 、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確実に固定ィ匕されていることが示さ れた。また、コントロール (紫外線を照射していないスポット及びリン酸ィ匕されていない ペプチドを含むスポット)では、蛍光を検出しな力つた。
実施例 7
[0100] <光反応性基によるタンパク質の担体への固定化、タンパク質固定化担体の抗体反 応による評価 >
Protein G (フナコシ社製）及び BSA (シグマアルドリッチ社製）各 500 gに対して 1M 炭酸水素ナトリウムバッファー (pH9.0)(lml)をカ卩えて、実施例 6で作製した N-スクシン ィミジル 6- (4-ベンゾィルベンズアミド)へキサノエ一 Kl00nmol)DMF溶液を加えて、室 温にて 18時間攪拌した。次いで、 NAP5カラム（アマシャム ノィォサイエンス社製）を 用いて精製'濃縮し、 50mMリン酸水溶液 (pH 8.5)に溶解してタンパク質溶液 (30 g/ml)を調製した。 [0101] 得られたタンパク質を巿販のポリカーボネート担体（一般ポリカーボネートプレート： タキロン社製）上の所定の位置にスポットした。スポット量は、それぞれ 0.5 1であり、 スポット径の大きさは直径 lmmであった。次いで、 CRM-FA Spectro IradiatorOASCO 社製)を用い、中心波長 335 應の紫外線を照射した。このときの照射強度は、 1.5mW/cm2であり、照射時間は 120秒であった。その後、前記担体を水中で 30分間 振とうし、洗浄した後に乾燥させた。また、コントロールとして、紫外線を照射していな い担体も作製した。
[0102] 上記タンパク質固定ィ匕担体のタンパク質固定部分に、 Cy3標識抗 Protein G IgG (ァ マシャム バイオサイエンス）を含む溶液 (0.5 μ g/200 μ 1 IgG, 1 X PBS, 0.2%
TritonX- 100)を載せ、 5時間インキュベートした。次いで、上記タンパク質固定化担 体を 1 X PBS-0.2% TritonX-100溶液で洗浄し、 ScanArray 4000 (GSI社製）を用いて 蛍光を測定した。
[0103] 紫外線を照射した担体上の Protein Gを含むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、 特異的に検出されたことから、タンパク質が確実に固定ィ匕されていることが示された。 また、コントロール (紫外線を照射して 、な 、スポット及び BSAを含むスポット）では、 蛍光を検出しな力つた。
実施例 8
[0104] <糖の担体への固定化、糖固定ィ匕担体のレクチンを用いた相互作用による評価 >
2 アミノエチルー β D ガラクトピラノシド (三谷産業株式会社製)及び配列番号 7 に示すデォキシチミジル酸とデォキシシチジル酸カゝら構成されるポリマーの 5'末端に アミノ基を導入したオリゴヌクレオチド（ 10塩基）をメタノール:イソプロピルアルコール ：滅菌水： DMSO (5 : 5 : 5 : 1)に溶解し、トリプチルァミン溶液 (和光純薬社製)を加え て ρΗを 8.0に調整した。次いで、 2倍モルの DSS (ピアス社製）をカ卩えて、 42°Cにて 5時 間インキュベートした。次いで、逆相 HPLC (Waters社製， μ Bondaspphere, C8 300A, 3.9x150)を用いて精製した後に濃縮し、 45mMクェン酸二アンモ-ゥム水溶液に溶解 して糖溶液（1 pmol/ μ 1)を調製した。
[0105] 平底型 96-wellポリスチレン製マイクロタイタープレート (株式会社テックジャム社製） の所定の位置に、前記糖溶液及びバッファー溶液をそれぞれスポットした。スポット 量は、それぞれ 0.5 μ 1であり、スポット径の大きさは直径 lmmであった。次いで、 Uvstratalinker 2400(ストラタジーン社製， 中心波長 254nm)を用い、紫外線を 16cmの 距離から、 80m J/cm2照射した。照射時間は 30秒であった。その後、前記担体を水中 で 30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとして紫外線を照射 していない担体も作製した。
[0106] A. McPherson等（McPherson, A.; Hankins, C. N.; Shannon, L. J. Biol. Chem.
1987, 262, 1791-1794)の方法に準じて作製した FITC標識レクチン（Sophora japonica由来）を 1% BSAを含む 1 X PBST溶液に 1 mMの濃度で溶解した。次いで、上 記担体の糖固定部分に、 FITC標識レクチンを含む溶液を載せ、室温で 12時間イン キュペートした。次いで、上記糖固定化担体を滅菌水で洗浄し、 FLA 5000 (富士写 真フィルム社製)を用いて蛍光を測定した。
[0107] 紫外線を照射した担体上のガラクトースを含むスポットのみにシグナルが明瞭、力 つ、特異的に検出されたことから、糖が確実に固定化されていることが示された。また 、コントロール (紫外線を照射していないスポット）では、ノ ックグラウンドノイズ (バッフ ァー溶液)と同じ強度の蛍光強度しか検出できな力つた。
実施例 9
[0108] <ペプチドのポリアクリルアミド担体への固定化、ペプチド固定ィ匕担体の酵素反応に よる評価 >
ペプチド合成機を用いて、配列番号 8に示すアミノ酸配列を有するペプチド (6残基 )を合成した。前記合成ペプチド及び配列番号 7に示すオリゴヌクレオチド（10塩基） の 5'末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドを等モルずつ 0.1M炭酸水素ナトリ ゥムバッファー（pH 8.0)に溶解し、 DMFに溶解した 10倍モルの DSS (ピアス社製)を加 えて、 37°Cにて 2時間インキュベートした。次いで、逆相 HPLC (Waters社製， μ Bondaspphere, C8 300A, 3.9x150)を用いて精製した後に濃縮し、 45mMクェン酸二 アンモ -ゥム水溶液に溶解してペプチド溶液 (5 pmol/ μ 1)を調製した。
[0109] Nano-Plotter™ (GeSim社製)を用いて、前記ペプチド溶液をスライド表面にポリアク リルアミドを有する 3D- Link™ Activated Slide (Surmodics社製)上にスポットした。スポ ット径の大きさは直径 0.3 mmであった。次いで、 Uvstratalinker 2400(ストラタジーン社 製， 中心波長 254nm)を用い、紫外線を 16cmの距離から、 60 mj/cm2照射した。照射 時間は 24秒であった。その後、前記担体を水中で 30分間振とうし、洗浄した後に乾燥 させた。一方、コントロールとしてペプチドを含まない溶液 (タエン酸ニナトリウム水溶 液)も同様に担体にスポットし、前述のような固定ィ匕の操作を行った。
[0110] 上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に、チロシン p6(Tsrc kinase (Upstate社製 )を含むバッファー [2 U/50 μ 1酵素， 25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl , 7 mM
2
MnCl , 0.5 mM EGTA, 100 μ M ATP]を載せ、 5時間インキュベートした。次いで、上
2
記試料固定化担体を 1 X PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、 FITC標識
anti-phosphotyrosine (シグマアルドリッチ社製)を含むバッファー (1 μ g/100 μ 1抗体, I X PBS, 0.2% Tween 20, 1%BSA)を上記ペプチド固定化担体のペプチド固定部分に 載せ、 2時間インキュベートした。次いで、上記ペプチド固定化担体を 1 X PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、 FLA 5000 (富士写真フィルム社製）を用いて蛍光を測定し た。
[0111] 一方、チロシン p6(Tsrc kinaseを含まないバッファー [25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl , 7 mM MnCl , 0.5 mM EGTA, 100 μ M ATP]を載せ、 5時間インキュベートし
2 2
、前記 FITC標識 anti- phosphotyrosineを用いて 2時間インキュベートしたペプチド固 定化担体も作製した。
[0112] チロシン p6(T src kinaseを含むバッファーでインキュベートした担体上のペプチドを含 むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確 実に固定化され、特異的な酵素反応を検出できることが示された。また、コントロール (チロシン p6(Tsrc kinaseを含まな!/、バッファーでインキュベートした担体上のペプチド スポット及びペプチドを含まな 、スポット）では、蛍光を検出しな力つた。
実施例 10
[0113] <ペプチドのニトロセルロース担体への固定化、ペプチド固定化担体の酵素反応に よる評価 >
Nano- Plotter™ (GeSim社製)を用いて、実施例 9で作製したペプチド溶液 (5 pmol/ μ 1)をスライド表面に-トロセルロースを有する FAST Slide (Schleicher & Schuell社製 )上にスポットした。スポット径の大きさは直径 0.4 mmであった。次いで、 Uvstratalinker 2400(ストラタジーン社製， 中心波長 254nm)を用い、紫外線を 16cmの距離から、 120 mj/cm2照射した。照射時間は 48秒であった。その後、前記担体を 3%BSA溶液中で 30 分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとしてペプチドを含まない 溶液 (タエン酸ニナトリウム水溶液)も同様に担体にスポットし、前述のような固定化の 操作を行った。
[0114] 上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に、チロシン p6(Tsrc kinase (Upstate社製 )を含むバッファー [2 U/50 μ 1酵素， 25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl , 7 mM
2
MnCl , 0.5 mM EGTA, 100 μ M ATP)を載せ、 5時間インキュベートした。次いで、
2
上記ペプチド固定化担体を 1 X PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、 FITC標識 anti-phosphotyrosine (シグマアルドリッチ社製)を含むバッファー (1 μ g/100 μ 1抗体， I X PBS, 0.2% Tween 20, 1%BSA)を上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に載せ 、 2時間インキュベートした。次いで、上記ペプチド固定化担体を 1 X PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、 FLA 5000 (富士写真フィルム社製）を用いて蛍光を測定し た。
[0115] 一方、チロシン p6(Tsrc kinaseを含まないバッファー [25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl , 7 mM MnCl , 0.5 mM EGTA, 100 μ M ATP]を載せ、 5時間インキュベートし
2 2
、前記 FITC標識 anti- phosphotyrosineを用いて 2時間インキュベートしたペプチド固 定化担体も作製した。
[0116] チロシン p6(T src kinaseを含むバッファーでインキュベートした担体上のペプチドを含 むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確 実に固定化され、特異的な酵素反応を検出できることが示された。また、コントロール (チロシン p6(Tsrc kinaseを含まな!/、バッファーでインキュベートした担体上のペプチド スポット及びペプチドを含まな 、スポット）では、蛍光を検出しな力つた。
実施例 11
[0117] <ペプチドのアクリルアミドゲル担体への固定化、ペプチド固定化担体の酵素反応 による評価 >
スライド表面にアクリルアミドゲルを有するスライドを Nallur等の方法 [Nallur G, Luo し, rang L,し oolev S, Dave V, Lambert J, Kukanskis K, Kingsmore ¾, Lasken R, Schweitzer B. (2001 Signal amplification by rolling circle amplification on DNA microarrays. Nucleic Acids Res., 29, el 18.]に準して作製した。 Nano— Plotter™ (GeSim社製)を用いて、実施例 9で作製したペプチド溶液 (5 pmol 1)を前記スライド 表面にアクリルアミドゲルを有するスライド上にスポットした。スポット径の大きさは直径 0.5 mmであった。次いで、 Uvstratalinker 2400(ストラタジーン社製， 中心波長 254nm) を用い、紫外線を 16cmの距離から、 120 mj/cm2照射した。照射時間は 48秒であった 。その後、前記担体を 3%BSA溶液中で 30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一 方、コントロールとしてペプチドを含まな 、溶液 (タエン酸ニナトリウム水溶液)も同様 に担体にスポットし、前述のような固定ィ匕の操作を行った。
[0118] 上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に、チロシン p6(Tsrc kinase (Upstate社製 )を含むバッファー [2 U/50 μ 1酵素， 25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl , 7 mM
2
MnCl , 0.5 mM EGTA, 100 μ M ATP]を載せ、 5時間インキュベートした。次いで、上
2
記ペプチド固定化担体を 1 X PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、 FITC標識 anti-phosphotyrosine (シグマアルドリッチ社製)を含むバッファー (1 μ g/100 μ 1抗体， I X PBS, 0.2% Tween 20, 1%BSA)を上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に載せ 、 2時間インキュベートした。次いで、上記ペプチド固定化担体を 1 X PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、 FLA 5000 (富士写真フィルム社製）を用いて蛍光を測定し た。
[0119] 一方、チロシン p6(Tsrc kinaseを含まないバッファー [25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl , 7 mM MnCl , 0.5 mM EGTA, 100 μ M ATP]を載せ、 5時間インキュベートし
2 2
、前記 FITC標識 anti- phosphotyrosineを用いて 2時間インキュベートしたペプチド固 定化担体も作製した。
[0120] チロシン p60e— src kinaseを含むバッファーでインキュベートした担体上のペプチドを含 むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確 実に固定化され、特異的な酵素反応を検出できることが示された。また、コントロール (チロシン p6(Tsrc kinaseを含まな!/、バッファーでインキュベートした担体上のペプチド スポット及びペプチドを含まな 、スポット）では、蛍光を検出しな力つた。
実施例 12 [0121] <ペプチドのポリリジン担体への固定化、ペプチド固定ィ匕担体の酵素反応による評 価 >
ペプチド合成機を用いて、配列番号 8に示すアミノ酸配列を有するペプチド (6残基 )を合成した。前記合成ペプチド及び配列番号 9に示すオリゴヌクレオチド（20塩基） の 5'末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドを等モルずつ 0.1M炭酸水素ナトリ ゥムバッファー（pH 8.0)に溶解し、 DMFに溶解した 10倍モルの DSS (ピアス社製)を加 えて、 37°Cにて 2時間インキュベートした。次いで、逆相 HPLC (Waters社製， μ Bondaspphere, C8 300A, 3.9x150)を用いて精製した後に濃縮し、 45mMクェン酸二 アンモ -ゥム水溶液に溶解してペプチド溶液（10 pmol/ μ 1)を調製した。
[0122] SP-BIO (Hitachi社製)を用いて、前記ペプチド溶液をスライド表面にポリリジンを有 するスライド上にスポットした。スポット径の大きさは直径 0.3 mmであった。次いで、 Uvstratalinker 2400(ストラタジーン社製， 中心波長 254nm)を用い、紫外線を 16cmの 距離から、 240 mj/cm2照射した。照射時間は 96秒であった。その後、前記担体を 1% BSA溶液中で 30分間振とうし、洗浄した後に乾燥させた。一方、コントロールとしてべ プチドを含まない溶液 (タエン酸ニナトリウム水溶液)も同様に担体にスポットし、前述 のような固定化の操作を行った。
[0123] 上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に、チロシン p6(Tsrc kinase (Upstate社製 )を含むバッファー [2 U/50 μ 1酵素, 25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl , 7 mM MnCl
2
, 0.5 mM EGTA, 100 μ M ATP]を載せ、 5時間インキュベートした。次いで、上記べ
2
プチド固定化担体を 1 X PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、 FITC標識
anti-phosphotyrosine (シグマアルドリッチ社製)を含むバッファー (1 μ g/100 μ 1抗体， I X PBS, 0.2% Tween 20, 1%BSA)を上記ペプチド固定化担体の試料固定部分に載せ 、 2時間インキュベートした。次いで、上記ペプチド固定化担体を 1 X PBS-0.2% Tween 20溶液で洗浄し、 FLA 5000 (富士写真フィルム社製）を用いて蛍光を測定し た。
[0124] 一方、チロシン p6(Tsrc kinaseを含まないバッファー [25 mM Tris (pH 7.4), 15 mM MgCl , 7 mM MnCl , 0.5 mM EGTA, 100 μ M ATP]を載せ、 5時間インキュベートし
2 2
、前記 FITC標識 anti- phosphotyrosineを用いて 2時間インキュベートしたペプチド固 定化担体も作製した。
[0125] チロシン p6(Tsrc kinaseを含むバッファーでインキュベートした担体上のペプチドを含 むスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたことから、ペプチドが確 実に固定化され、特異的な酵素反応を検出できることが示された。また、コントロール (チロシン p6(Tsrc kinaseを含まな!/、バッファーでインキュベートした担体上のペプチド スポット及びペプチドを含まな 、スポット）では、蛍光を検出しな力つた。
実施例 13
[0126] くペプチドのポリカルボジイミド担体への固定化、 SPOT法による伸長反応、ペプチド 固定化担体の抗体反応による評価 >
実施例 1記載の方法に準じて、配列番号 10に示すポリヌクレオチドが結合したぺプ チド (Ala-Ala： 2残基)を作製し、カルポジイミド基を有する高分子化合物で処理した ガラス基材上に前記ポリヌクレオチドが結合したペプチドを固定した。
[0127] Tegge等の方法 u'egge W, Frank R: Determination ofし yclic
Nucleotide— Dependent Protein Kinase Substrate Specificity by the Use of Peptide Libraries on Cellulose Paper. Biochemistry 1995, 34:10569-105777.)に準じて、前 記ガラス基材上の試料固定部分でアミノ酸のカップリング (伸長)反応を繰り返し行 ヽ 、配列番号 11に示すペプチド（12残基)を前記ガラス基板上に合成した。このとき、 N 末端を Fmoc基、側鎖 - Bu基、 trityl基あるいは Boc基で保護したアミノ酸を用い、さ らに、カップリング試薬として、等モルのジイソプロピルカルポジイミド (和光純薬社製 )及びヒドロキシベンゾトリアゾール (和光純薬社製)を用いて伸長反応を行った。また 、各伸長反応において、 DMF溶液に溶解したブロモフエノールブルー (0.1 mg/ml)を 用いて、前記ガラス基材の試料固定部分を処理して試料固定部分が青色を呈色す ることを確認した後に、次の伸長反応を行った。
[0128] 次いで、前記ガラス基材の試料固定部分を 2%無水酢酸/ DMF溶液で処理して合 成したペプチドの N末端をァセチルイ匕し、さらに、 3%トリイソプチルシラン及び 2%水 を含むジクロロメタン/トリフルォロ酢酸（1： 1)溶液を用いて、前記ガラス基材の試料 固定部分を 2時間室温にて処理してペプチド側鎖の脱保護反応を行った。
[0129] また、コントロールとして、前記ポリヌクレオチドが結合したペプチドを前記ガラス基 板上に固定した後に、前記伸長反応を行わない試料も作製した。
[0130] 上記担体の試料固定部分に、 Cy3標識抗アンジォテンシン I抗体を含む溶液 (2.2 μ g/100 μ 1抗体， 1 X PBS, 0.2% Tween 20, 1% BSA)を載せ、 2時間インキュベートし た。 Cy3標識抗アンジォテンシン I抗体は、 Cy3- NHS (GEヘルスケア社製）を用いて 0.1M NaHCO (pH 9)中で Cy3を抗アンジォテンシン I抗体（コスモバイオ社から購入）
3
に導入したものを用いた。次いで、上記担体を滅菌水で洗浄し、 ScanArray 4000 ( GSI社製)を用いて蛍光を測定した。
[0131] 伸長反応を行ったスポットのみにシグナルが明瞭、かつ、特異的に検出されたこと から、ペプチドが確実に固定ィ匕されていることが示された。また、コントロール (伸長反 応を行って ヽな 、スポット）では、蛍光を検出しな力つた。
産業上の利用の可能性
[0132] タンパク質が強固に基材又は基材上の担体に結合できるため、本発明のタンパク 質固定ィ匕基材は、再現性、定量性に優れたプロテインチップ等としての用途に有効 なタンパク質固定ィ匕基材となり得る。

Claims

請求の範囲
[1] 固定ィ匕生体分子 (ただし、核酸を除く）を用いた該生体分子と相互作用し得る物質 の検出法に用いられる固定化される生体分子であって、該生体分子が固定化される 生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合物が結合し た生体分子。
[2] 前記生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合物が 不飽和結合を有する化合物を含むポリマーである請求項 1に記載の生体分子。
[3] 前記ポリマーの平均重合度が 2以上で 1000000以下である請求項 2に記載の生 体分子。
[4] 前記ポリマーを構成するモノマーがヌクレオチドである請求項 2又は 3に記載の生 体分子。
[5] 前記生体分子固定化用基材又は基材上の担体に結合し得る基を有する化合物が ナイトレン前駆体、カルベン前駆体又はケトン基を有する化合物力 選ばれる、少な くとも一つの光反応性基を有する化合物である請求項 1に記載の生体分子。
[6] 前記生体分子が、タンパク質、糖、抗原、抗体、ペプチド及び酵素から選ばれる請 求項 1一 5のいずれ力 1項に記載の生体分子。
[7] 生体分子固定ィ匕用基材と、この基材上に固定化された請求項 1一 6のいずれか 1 項に記載の生体分子とを有する生体分子固定化基材。
[8] 生体分子固定化用基材と請求項 1一 6のいずれか 1項に記載の生体分子を接触さ せ、接触部に電磁波を照射することを含む生体分子固定化基材の製造法。
[9] 固定ィ匕生体分子を用いた該固定ィ匕生体分子と相互作用し得る物質の検出法にお いて、請求項 7記載の生体分子固定ィ匕基材を用いることを特徴とする固定ィ匕生体分 子と相互作用し得る物質の検出法。
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