CN104931687B - 一种三维生物表面及其制备方法和一种三维生物芯片及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种三维生物表面及其制备方法以及包括该三维生物表面的三维生物芯片及其用途，所述三维生物表面包括链霉亲和素包被的基底，其特征在于：所述三维生物表面还包括生物素和通过生物素与所述链霉亲和素包被的基底结合的功能化的抗非特异性吸附材料，在所述三维生物表面中，未与所述功能化的抗非特异性吸附材料结合的生物素与结合了所述功能化的抗非特异性吸附材料的生物素的摩尔比是1：(0～12500)，该三维生物表面适用于SA基底，能增加生物大分子固定量，具有优良的抗非特异性吸附能力并且可以在商业化SA基底上固定药物小分子。

Description

一种三维生物表面及其制备方法和一种三维生物芯片及其 用途
技术领域
本发明属于生物芯片领域，尤其涉及一种三维生物表面及其制备方法和一种三维生物芯片及其用途。
背景技术
在生物分析领域，利用仪器分析(比如表面等离子基元共振，石英晶体微天平，酶联免疫吸附法等)研究生物大分子与靶标蛋白间的相互作用，需要将生物大分子(指抗原，蛋白等)固定到不同材质的基底上(比如纳米金膜、载玻片、硅片、磁珠、琼脂糖小球等)，制备成生物芯片进行生化检测。但是生物大分子的直接固定会使其发生变性，进而造成失活。通常情况下，都是利用1个链霉亲和素分子可与4个生物素分子(biotin)特异性结合的性能，先将生物大分子生物素化，然后通过链霉亲和素-生物素的相互作用，将生物大分子特异性地固定在SA基底上。得益于链霉亲和素在多种基底(磁珠、纳米金膜、琼脂糖小球，聚苯乙烯酶标板等)上所具有的优良吸附能力，通过这种表面，生物大分子能够被普适地间接固定在各种基底上。
近十年来，链霉亲和素包被的各种基底(比如链霉亲和素包被的纳米金膜、载玻片、硅片、磁珠、琼脂糖小球等)均已发展得十分商业化，制备操作简单，便捷，并且具有广泛的应用前景。比如，链霉亲和素包被的磁珠可用于捕获生物素标记的底物，包括生物素标记的抗原、抗体和核酸，从而进行靶标垂钓。再比如，将链霉亲和素直接或间接包被在酶标板上，并通过生物素将抗体固定在上面，可克服传统物理吸附方法造成的抗原抗体结合能力大量丧失的不足。然而，在目前商业化的SA包被基底中，有两个共同的缺陷。
首先，由于生物大分子在基底上的固定量越高，生物大分子间的相互作用就越容易被检测到。因此，如何提高生物大分子在SA基底上的固定量，并且不影响底物与靶标蛋白结合的生化活性，一直是在SA基底上固定这项技术最具有挑战性的难题。传统的固定方法就是将生物素化的生物大分子，通过链霉亲和素-生物素相互作用，直接固定在链霉亲和素包被的二维基底上。这种方法步骤简单，但所固定的生物大分子量十分少，与靶标蛋白的结合信号噪音大，灵敏度低。
2010年，中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所的马宏伟等报道了通过混合表面自组装单分子层(SAM)引发的原子转移自由基聚合(ATPR)反应来构建低密度三维生物芯片(Ma H,He J,Liu X,Gan J,Jin G,Zhou J.Surface initiated polymerization fromsubstrates of low initiator density and its applications in biosensors.ACSapplied materials&interfaces.2010；2：3223-30.)。在此工作中，他们在金表面首先固定两种末端巯基的混合SAM，然后利用其中一种SAM来引发高分子的聚合，另一种SAM来调控高分子密度，从而构建了一种密度可控的三维聚乙二醇高分子刷状表面。该表面可以通过支链末端功能化，来固定生物大分子。这项技术的优点在于，首先，功能化的三维刷状表面的结合位点要远远大于传统二维表面，因此对生物大分子的固定量要优于传统二维表面；同时，通过调节两种自组装单分子的比例，可以调控不同刷状高分子主链间的距离，进而控制所固定的生物大分子之间的距离，为靶标蛋白靠近生物大分子预留足够的空间；最后，聚乙二醇具有优良的抗非特异性吸附能力，可以降低检测背景的噪音信号。但是，该技术的缺点在于只能在金片上制备生物芯片，无法适用于链霉亲和素包被的基底。这是由于该技术所用的混合SAM末端含有巯基，只能与Au等贵金属发生配位反应进行固定。
除了固定量低之外，目前商业化的SA包被基底还存在第二个缺陷：通常链霉亲和素包被的磁珠可用于固定生物素标记的生物大分子作为诱饵，然后利用生物大分子间的相互作用，去捕获靶标蛋白。但是在靶标垂钓领域，为了达到药物筛选的目的，有时需要将药物小分子固定在表面，来研究药物小分子与靶标蛋白的相互作用。由于目前商业化的链霉亲和素芯片只能用来固定生物素化的底物，而大多数药物小分子由于不具备生物素化的能力，不能被普适地固定在芯片上。因此，设计出一种可将药物小分子普适地固定在基底上的方法，是一项非常有价值的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于SA基底的、能增加生物大分子固定量的、具有优良抗非特异性吸附能力并且可以固定药物小分子的三维生物表面及其制备方法以及包括该三维生物表面的三维生物芯片及其用途。
根据本发明的第一方面，提供了一种三维生物表面，所述三维生物表面包括链霉亲和素包被的基底，其特征在于：所述三维生物表面还包括通过生物素与所述链霉亲和素包被的基底结合的功能化的抗非特异性吸附材料，在所述三维生物表面中，未与所述功能化的抗非特异性吸附材料结合的生物素与结合了所述功能化的抗非特异性吸附材料的生物素的摩尔比是1：(0～12500)，优选1：(0～5000)，更优选1：1000。
本文所述的“链霉亲和素包被的基底”或“SA基底”是指通过物理吸附或化学固定的方法预先固定了链霉亲和素的固相衬底。
优选地，所述固相衬底选自但不限于硅片、金属薄膜、磁珠或者酶标板。
优选地，所述金属薄膜是金膜或银膜。
优选地，所述酶标板为聚苯乙烯。
优选地，所述磁珠内核为四氧化三铁。
本文所述的“生物大分子”是指作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、糖类等。
本文所述的“药物小分子”是指具有潜在药物作用或者显著药物作用的，相对分子量在一万左右或者以下的有机小分子。药物小分子通常可以与生物大分子进行相互作用。
本文所述的“抗非特异性吸附材料”是指用于对表面改性，使之能够具备特异性结合单一一种或者一类物质，对其他物质具有显著排斥作用的包被材料。
优选地，所述抗非特异性吸附材料是支链含羟基末端的高分子。
优选地，所述高分子为聚乙二醇、聚乙二醇的衍生物或者支链含羟基的含氟聚合物。
本文所述的“聚乙二醇”是指环氧乙烷的寡聚物或聚合物。
本文所述的“聚乙二醇的衍生物”是指具有两个或者两个以上的亚乙氧基重复单元的化学物质。
本文所述的“支链含羟基的含氟聚合物”是指支链末端为羟基，主碳链上氢原子被氟原子全部或者部分取代的化合物或者聚合物。
本文所述的“功能化”是指对材料表面进行化学或者物理改性使之能够完成特定功能称为功能化。
优选地，所述功能化是指酸化或者酯化。
根据本发明的第二方面，还提供了上述三维生物表面的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成生物素化的引发剂；
(2)将所述生物素化的引发剂和生物素固定在链霉亲和素包被的基底上，所述生物素化的引发剂和生物素的摩尔比为1：(0～12500)，优选1：(0～5000)，更优选1：1000；
(3)利用所述生物素化的引发剂引发单体聚合从而在所述链霉亲和素包被的基底上生成抗非特异性吸附材料；
(4)使所述抗非特异性吸附材料功能化；
任选地，所述制备方法包括以下步骤：
(1＇)合成生物素化的引发剂；
(2＇)利用所述生物素化的引发剂引发单体聚合从而合成生物素化的抗非特异性吸附材料；
(3＇)将所述生物素化的抗非特异性吸附材料和生物素接枝到链霉亲和素包被的基底上，所述生物素化的抗非特异性吸附材料和生物素的摩尔比为1：(0～12500)，优选1：(0～5000)，更优选1：1000；
(4＇)使所述抗非特异性吸附材料功能化。根据本发明的合成生物素化的引发剂的方法包括以下步骤：
(a)将生物素活化：将酰胺化反应活化剂、有机碱类催化剂分别加入生物素的有机溶剂中，在5℃～60℃下搅拌，优选10℃到50℃，优选20℃到30℃，更优选25°；酰胺化反应活化试剂、生物素、有机碱类催化剂三种物质的摩尔比优选1：(0.5～5)：(1～10)，优选1：(0.5～2)：(1～5)，更优选1:1:1.5；
(b)将活化后的生物素酰胺化：将单边保护的双氨基末端试剂加入步骤(a)所得的溶液中，在5℃～60℃下搅拌，优选10℃到50℃，优选20℃到30℃，更优选25°；单边保护的双氨基末端试剂以及活化后的生物素的摩尔比为(10～1)：1，最优选2:1；
(c)纯化步骤(b)所得的酰胺化的生物素；
(c)纯化步骤(b)所得的酰胺化的生物素；
(d)将上述步骤(c)所得产物进行去单边保护；
(e)将引发剂活化：将酰胺化反应活化剂、有机碱类催化剂分别加入引发剂的有机溶剂中，在5℃～60℃下搅拌；酰胺化反应活化试剂、引发剂、有机碱类催化剂三种物质的摩尔比最优为1：(0.5～5)：(1～10)，优选1:1:1.5；
(f)将活化的引发剂生物素化：将步骤(d)所得产物与步骤(e)所得产物进行反应，前者的摩尔量与后者摩尔量的优选摩尔比应为1：(1～10)，优选1：(1～5)，最优选1:2；
(g)纯化步骤(f)所得的生物素化的引发剂。
本文所述的“生物素化的引发剂”是指通过化学合成的，一端带有生物素，另一端具有能够引发高分子聚合的官能团的化学物质。
根据本发明的具体实施方案，所述生物素化的引发剂的结构为
其中，R为碳、氮和氧三种元素所形成的末端为-NH-的直链烷基，优选C3～C10的直链烷基，x为卤素；
优选地，所述直链烷基为-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH-或-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH-；
进一步优选地，所述生物素化的引发剂为
本文所述的“酰胺化反应活化剂”是指能够活化酰胺化反应的化学试剂。
本文所述的“有机碱类催化剂”是指能够催化某种或者某类化学反应的碱类有机物。例如能够催化酰胺化反应的三乙胺或者4-二甲氨基吡啶，优选三乙胺。
本文所述的“单边保护的双氨基末端试剂”是指一端氨基被保护基保护，中间部分为碳、氮和氧三种元素所形成的直链烷基，另一端为氨基的化学试剂，例如N-叔丁氧羰基-2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醇胺或者N-叔丁氧羰基-2-(2-氨基-乙氧基)-乙醇胺。
根据本发明的具体实施方案，在上述制备方法中，所述酰胺化反应活化剂是N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯或者1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；所述有机碱类催化剂是三乙胺或者4-二甲氨基吡啶，所述有机溶剂是N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或者二甲基亚砜；所述单边保护的双氨基末端试剂是N-叔丁氧羰基-2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醇胺或者N-叔丁氧羰基-2-(2-氨基-乙氧基)-乙醇胺；步骤(c)和(g)中的纯化方法是柱层析、重结晶或者过滤。
根据本发明的具体实施方案，步骤(4)和(4＇)的功能化方法是酸化或者酯化。
优选地，所述酸化方法是将酸酐类酸化剂和碱性催化剂溶解在有机溶剂中，然后铺在所述抗非特异性吸附材料的表面上，室温反应1～50h，优选10～40h，优选15～30h，更优选20h。
优选地，所述酯化方法是将步骤(3)或者(3＇)得到的固定了抗非特异性吸附材料的链霉亲和素包被的基底放入含小分子光交联剂、有机碱类催化剂和脱水剂的溶液中，在18～32℃的反应温度下反应1～40小时。优选温度和反应时间，温度优选20～25℃，更优选22℃，反应时间优选1～30h,优选5～20h，更优选10小时。
本文所述的“小分子光交联剂”是指带有羧基末端和可光交联官能团的能够通过酯化反应键合到所述抗非特异性吸附材料上的小分子。
根据本发明的优选实施方案，合成该生物素化的引发剂的方法为：
(A)将N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，三乙胺分别加入生物素的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室温搅拌反应1～20h。
作为优选，步骤(A)中的N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯与N,N-二甲基甲酰胺的配比为0.01～10M，优选0.01～1M，更优选0.1228M。
作为优选，步骤(A)中的生物素与N,N-二甲基甲酰胺的配比为0.01～10M，优选0.01～1M，更优选0.1228M。
作为优选，步骤(A)中三乙胺的用量为0.01～10mL，优选0.01～1mL，更优选0.1mL。
作为优选，步骤(A)中室温搅拌时间为1～20h，优选1～10h，更优选8h。
(B)将N-叔丁氧羰基-2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醇胺(CAS号：153086-78-3)加入(A)所得溶液中，室温搅拌反应1～100h。
作为优选，步骤(B)中N-叔丁氧羰基-2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醇胺与步骤A所得溶液的比例为0.01～10M，优选0.01～1M，更优选0.2456M。
作为优选，步骤(B)中的反应时间为1～100h，优选地为1～50h，更优选24h。(C)将步骤(B)中的试剂旋蒸干溶剂，加入二氯甲烷，搅拌2分钟，再抽滤，取滤渣。
作为优选，步骤(C)中旋蒸温度为1～100℃，优选地为50～100℃，更优选80℃。
作为优选，步骤(C)中加入二氯甲烷的量与步骤(B)中N,N-二甲基甲酰胺的量的比例为(0～20)：1，优选地为(0～10)：1，更优选4:1。
(D)将步骤(C)中的滤渣加入三氟乙酸溶液，反应1～20h，之后旋蒸干溶剂。
作为优选，步骤(D)中三氟乙酸溶液的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷或者四氢呋喃，优选地为二氯甲烷。
作为优选，步骤(D)中三氟乙酸溶液的浓度为1％～90％体积比，优选地为1％～50％体积比，更优选30％体积比。
作为优选，步骤(D)中反应时间为1～20h，优选地为1～10h，更优选3h。
作为优选，步骤(D)中的旋蒸温度为1～50℃，更优选1～30℃，优选25℃。
(E)将N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，三乙胺分别加入引发剂的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室温搅拌反应1～20h。
作为优选，步骤(E)中N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，三乙胺与N,N-二甲基甲酰胺的优选配比和步骤(A)中该试剂的优选配比一致。
作为优选，步骤(E)中反应时间为1～20h，优选地为1～10h，更优选8h。
(F)将步骤(E)所得物质加入步骤(D)所得溶液中，反应1～50h。
作为优选，步骤(F)中的反应时间为1～50h，优选地为1～30h，更优选24h。
(G)将步骤(F)所得物质过硅胶色谱柱分离，取滤液旋蒸，既得引发剂。
关于步骤(G)中所述的过硅胶色谱柱分离，可以使用本领域技术人员已知的所有方式。作为优选，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇、三氯甲烷/甲醇或者水/乙腈；更优选二氯甲烷/甲醇。作为优选，洗脱剂比例为(1～50):1，优选地为(1～20)：1，更优选5:1。
作为优选，步骤(G)中的旋蒸温度为1～80℃，优选地为1～50℃，更优选45℃。
将制备的引发剂做电喷雾质谱(ESI-MS)表征。
在上述三维生物表面的制备方法中，步骤(2)和步骤(3)统称为“表面引发方法”，本文所述的“表面引发方法”是指在SA基底表面引发聚合，即先在表面上固定生物素化的引发剂以及生物素，再利用引发剂引发单体聚合，从而获得抗非特异性吸附的高分子刷状表面。
在上述三维生物表面的制备方法中，步骤(2＇)和步骤(3＇)统称为“表面接枝方法”，本文所述的“表面接枝方法”是指在SA基底上接枝，即先在溶液中利用生物素化的引发剂合成具有抗非特异性吸附的高分子刷状表面，再利用引发剂末端的生物素基团与SA基底发生特异性结合，从而使高分子接枝到SA基底上。其中，还要加入生物素，使之与生物素化的高分子发生竞争接枝，以达到调控高分子刷密度的目的。
在优选的实施方案中，所述抗非特异性吸附材料为刷状PEG，在SA基底上修饰刷状PEG的方法为表面引发：
(1″)使用一定比例混合的生物素化的引发剂溶液和生物素溶液处理链霉亲和素包被的基底。
优选地，步骤(1″)中所述生物素化的引发剂为
，进一步优选地，所述生物素化的引发剂溶液的浓度为0.1～50mM，优选0.1～10mM，更优选1mM。
在优选实施方案中，所述生物素化的引发剂溶液的浓度为0.1mM、1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM。
优选地，步骤(1″)中所述一定比例的生物素化的引发剂和生物素的比例为1：(0～12500)，优选1：(0～5000)，更优选1：1000。
在优选的实施方案中，所述生物素化的引发剂和生物素的比例为1：10、1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12500。
优选地，使用一定比例混合的生物素化的引发剂溶液和生物素溶液处理SA基底的方法如下：将相同浓度且各为0.1～50mM，优选0.1mM～10mM，更优选1mM的生物素化的引发剂和生物素的乙醇溶液以1：(0～12500)，优选1：(0～5000)，更优选1:1000的体积比均匀混合，铺到所述基底表面上。
在优选的实施方案中，所述生物素化的引发剂和生物素的乙醇溶液浓度相同，且均为0.1mM、1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM，二者的体积比为1：10、1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12500。
(2″)在无氧环境中，将步骤(1″)中所得产物浸泡在含有还原剂，金属有机配位催化剂和带有PEG侧链的烯类单体的溶液中，进行高分子聚合反应。
作为优选，步骤(2″)中所述还原剂为辛酸亚锡，抗坏血酸或者葡萄糖；更优选抗环血酸。
作为优选，步骤(2″)中所述还原剂的含量为1nM～1mM、优选地，为1nM～0.1mM、更优选为0.04mM。
作为优选，步骤(2″)中所述金属有机配位催化剂为金属无机盐和有机螯合剂的混合物；优选地，所述金属无机盐为亚铁盐或铜盐；优选地，所述有机螯合剂为二联吡啶；进一步优选地，所述金属无机盐的浓度为1nM～1mM、优选地为1nM～0.1mM、更优选为0.04mM；进一步优选地，所述有机螯合剂的浓度为1nM～1mM、优选地为1nM～0.1mM、更优选为0.08mM。
作为优选，步骤(2″)中所述带有PEG侧链的烯类单体为甲基丙烯酸聚乙二醇酯；进一步优选地，所述带有PEG侧链的烯类单体含量为1mM～1M，优选地为1mM～100mM，更优选5mM。
作为优选，所述高分子刷状聚合物生长时间为1～40h，优选地，为1～20h，更优选18小时。
在另一个优选的实施方案中，所述抗非特异性吸附材料为刷状PEG，在SA基底上修饰刷状PEG的方法为表面接枝：
(1″＇)在无氧环境中，将生物素化的引发剂溶液加入含有还原剂，金属有机配位催化剂和带有PEG侧链的烯类单体的溶液中，进行高分子聚合反应，得到生物素化的高分子。
作为优选，步骤(1″＇)中所述生物素化的引发剂为
进一步优选地，所述生物素化的引发剂溶液的浓度为0.1～50mM，优选0.1～10mM，更优选1mM。
在具体的实施方案中，所述生物素化的引发剂溶液的浓度为0.1mM、1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM。
作为优选，步骤(1″＇)中所述还原剂为辛酸亚锡，抗坏血酸或者葡萄糖；更优选抗环血酸。
作为优选，步骤(1″＇)中所述还原剂的含量为1nM～1mM、优选地为1nM～0.1mM、更优选为0.04mM。
作为优选，步骤(1″＇)中所述金属有机配位催化剂为金属无机盐和有机螯合剂的混合物；优选地，所述金属无机盐为亚铁盐或铜盐；优选地，所述有机螯合剂为二联吡啶；进一步优选地，所述金属无机盐的浓度为1nM～1mM、优选地，为1nM～0.1mM、更优选为0.04mM；进一步优选地，所述有机螯合剂的浓度为1nM～1mM、优选地为1nM～0.1mM、更优选为0.08mM。
作为优选，步骤(1″＇)中所述带有PEG侧链的烯类单体为甲基丙烯酸聚乙二醇酯；进一步优选地，所述带有PEG侧链的烯类单体含量为1mM～1M，优选地，为1mM～100mM，更优选5mM。
作为优选，步骤(1″＇)中所述生物素化的高分子聚合物的生长时间为1～40h，优选地，为1～20h，更优选18小时。
(2″＇)将步骤(1″＇)中所得生物素化的高分子提纯，并制备成生物素化的高分子溶液，与生物素溶液混合均匀铺在链霉亲和素修饰的基底上。
作为优选，步骤(2″＇)中所述的物质提纯技术可以使用本领域人员已知的所有方式，常见的提纯技术主要有萃取，重结晶，透析，冻干，高效液相色谱提纯和液质联用提纯。
在具体的实施方案中，将步骤(1″＇)所得物质旋蒸，旋蒸温度为10～100℃，优选地为10～50℃，更优选45℃；再将旋蒸产物用有机试剂萃取，优选地有机试剂为二氯甲烷，乙醚，乙酸乙酯，更优选地为二氯甲烷；将萃取产物旋蒸干溶剂，旋蒸温度为10～100℃，优选地为10～50℃，更优选30℃；将旋蒸后的产物用透析袋透析，优选地透析袋规格为1000～10000，优选地为1000～5000，更优选3500；进一步优选，透析液为水，醋酸铵溶液，乙醇胺溶液，更优选水；进一步优选，透析时间为1～10天，优选地为1～5天，更优选3天。将透析产物冻干，作为优选，冻干时间为1～20h，优选1～10h，更优选8h。
作为表征手段，将步骤(2″＇)中所述提纯后的生物素化的高分子进行凝胶渗透色谱(GPC)表征分子量。
作为优选，步骤(2″＇)中所述提纯后的生物素化的高分子溶液浓度为0.1～50mM，优选0.1～10mM，更优选1mM。
在优选的实施方案中，所述生物素化的高分子溶液的浓度为0.1mM、1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM。
作为优选，步骤(2″＇)中生物素溶液浓度与生物素化的高分子溶液浓度相同且各为0.1～50mM、优选0.1mM～10mM，更优选1mM。
作为优选，步骤(2″＇)中生物素化的高分子溶液与生物素溶液比例为1：(0～12500)，优选1：(0～5000)，更优选1：1000。
在具体的实施方案中，步骤(2″＇)中所述生物素化的高分子溶液和生物素的乙醇溶液浓度相同，且均为0.1mM、1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM，二者的体积比为1：10、1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12500。
上述制备方法中，使所述抗非特异性吸附材料功能化的步骤可在将支链带有羟基末端的高分子接在链霉亲和素包被的基底上之后进行，也可在溶液中先将支链带有羟基末端的高分子功能化，再将其固定在链霉亲和素包被的基底上。同时，使所述抗非特异性吸附材料功能化包括但不限于以下两种：
(1″″)将酸酐类酸化剂和碱性催化剂溶解在有机溶剂中，铺在所述抗非特异性吸附材料的表面上，室温反应1～50h。
(2″″)将带羧基末端和可光交联官能团的小分子光交联剂通过酯化反应键合到所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料上。
作为优选，方法(1″″)中所述酸酐类酸化剂为马来酸酐或者丁二酸酐，优选地，为马来酸酐。
作为优选，方法(1″″)中所述碱性催化剂剂为4-二甲氨基吡啶，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐或三乙胺；优选地，为4-二甲氨基吡啶。
作为优选，方法(1″″)中所述酸酐类酸化剂和碱性催化剂的质量比为(0～50)：1，优选地为(0～10)：1，更优选1.5:1。
作为优选，方法(1″″)中所述酸酐类酸化剂的质量浓度为(1～100)g/L，优选地为(1～50)g/L，更优选10g/L。
作为优选，方法(1″″)中反应时间为1～50h，优选地为1～20h，更优选16h。
作为优选，方法(2″″)中，所述可光交联官能团选自乙酰苯、苯甲酮、醌蒽类、芳香叠氮化物和芳香吖丙因，优选为芳香吖丙因。
优选地，方法(2″″)具体包括：将固定了抗非特异性吸附材料的链霉亲和素包被的基底放入含所述小分子光交联剂、有机碱类催化剂和脱水剂的溶液中，18～32℃下、优选22～28℃下、更优选25℃下反应1～40小时、优选1～20小时、更优选18小时而得。
进一步优选地，所述溶液的溶剂为有机溶剂；更优选地，所述有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺。
进一步优选地，所述有机碱类催化剂选自4-二甲氨基吡啶、N,N-二异丙基乙胺和三乙胺。
进一步优选地，所述脱水剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和二环己基碳二亚胺。
进一步优选地，所述溶液中，小分子光交联剂的末端羧基与脱水剂、有机碱类催化剂的摩尔比为1：(1～3)：(1～3)，进一步优选为1：(1～2)：(1～2)，更进一步优选为1:1.5:1.5。
进一步优选地，所述溶液中，小分子光交联剂的末端羧基含量为1nM～100mM、优选为1mM～100mM、更优选为10mM。
根据本发明的第三方面，提供了一种三维生物芯片，所述三维生物芯片包括上述三维生物表面和与所述三维生物表面结合的配体。
本文所述的“配体”是指可共价结合在经过化学、物理或者生物修饰过的芯片表面上的任何分子都称为配体。
优选地，所述配体为生物大分子或者药物小分子。
根据本发明的第四方面，提供了上述三维生物芯片在靶标垂钓中的用途。
本文所述的“靶标”是指可以与某种或者某类配体进行特异性结合的生物分子，比如抗体，抗原，核酸等。
本文所述的“靶标垂钓”是指通过配体与靶标间的相互作用，设计覆盖有不同配体的生物表面，从而可以实现特异性地捕获某种或者某类靶标的目的，叫做靶标垂钓。
优选地，所述靶标是抗原、抗体和核酸。
本发明利用生物素与链霉亲和素的特异性相互作用将功能化的抗非特异性吸附材料固定在SA基底上，与传统的生物表面相比，根据本发明的三维生物表面的优点在于：
1)利用抗非特异性吸附材料提高了生物大分子的固定量。如图6所示，在本发明的三维生物表面上模式蛋白H-IgG固定量为19170RU；而对于传统的二维SA表面，模式蛋白H-IgG的固定量仅为8257RU。相对于传统SA基底，经过三维抗非特异性吸附材料修饰，生物大分子的固定量提高了132％。这是由于本发明的三维生物表面对蛋白的固定不再局限于二维平面内，而是可以在三维空间内固定蛋白，因此可以大幅度地提高蛋白的固定量。
2)利用SA基底上的结合了功能化的抗非特异性吸附材料的生物素和未结合功能化的抗非特异性吸附材料的生物素的比例不同，控制功能化的抗非特异性吸附材料的链间距的大小，从而保证有足够的空间使配体与靶标发生相互作用；
3)利用抗非特异性吸附材料的抗非特异性吸附能力降低生物大分子相互作用的信号背景；
4)利用抗非特异性吸附材料的多种功能化来达到不仅能够固定生物大分子，还能固定药物小分子的目的；
5)由于本发明的三维生物表面利用生物素来固定功能化的抗非特异性吸附材料，因此，可以使用任何商业化的SA基底。
附图说明
图1是本发明的三维生物芯片制备方法的示意图；
图2是本发明所合成的生物素化的引发剂的质谱图；
图3是本发明所制备的生物素化的高分子的凝胶色谱图；
图4是SA基底上依次固定功能化的高分子时在表面等离子基元共振成像生物传感器上的共振角度变化；以及检测模式蛋白H-IgG时在表面等离子基元共振成像生物传感器上的共振角度变化；
图5是本发明所制备的三维生物表面固定模式蛋白在表面等离子基元共振成像生物传感器上检测时的检测信号和背景强度。
图6是通过表面等离子基元成像(SPRi)技术，测量本发明三维表面与传统二维表面对H-IgG的不同固定量。
图7是利用表面等离子基元成像(SPRi)技术，来表征使用实施例1所得三维生物表面对药物小分子雷帕霉素的成功固定。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1表面接枝-刷状PEG三维生物表面(生物素化高分子与生物素比例为1:100)的制备
具体步骤：
(1)生物素化引发剂的制备：配制混合溶液30mL，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，其中包括生物素0.2M，N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯0.2M，三乙胺1毫升，室温搅拌反应8小时。
(2)往上述液体中加入1.5克N-叔丁氧羰基-2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醇胺，继续室温搅拌反应12小时。
(3)将上述溶液旋蒸干溶剂，加入200毫升二氯甲烷，并过滤。
(4)将上述滤渣溶解到50毫升含有30％三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应3小时。
(5)将上述溶液旋蒸干溶剂。
(6)配制10毫升混合溶液，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，其中包括溴代异丁酸0.18M，N,N'-二琥珀酰亚胺基碳0.18M，三乙胺300微升，并室温搅拌8小时。
(7)将步骤(5)的产物加入步骤(6)溶液中，室温搅拌12小时。
(8)将上述溶液旋干溶剂，用60～100目硅胶进行柱层析提纯。洗脱液为三氯甲烷：甲醇(7:1)。
(9)旋干溶液，可得生物素化的引发剂。
(10)配制单体溶液：单体溶液供20毫升，其中包括单体丙烯酸聚乙二醇酯(分子量516)0.5M，丙烯酸聚乙二醇酯(130)0.5M，抗坏血酸8mM、氯化亚铜4mM，二联吡啶4mM，溶剂为1:1的甲醇/水。
(11)将上述溶液用氮气脱气30分钟，加入0.6毫克步骤(9)制备的引发剂，放置在无氧环境下生长高分子，生长时间18小时。
(12)达到预定生长时间后，将溶剂旋蒸干，透析。透析袋规格为3500，透析时间为3天。
(13)透析完毕，将溶液冻干，可得支链为羟基末端的高分子。
(14)高分子的功能化：将150毫克上述高分子加入10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶液中，溶液内还含有150毫克丁二酸酐，150毫克4-二甲氨基吡啶，室温搅拌反应16小时。
(15)在上述溶液中加入冰乙醚萃取，过滤。取滤渣，烘干，可得功能化的高分子。
(16)取Plexera公司提供的PlexArrayTM裸金传感芯片，用超纯水和乙醇分别清洗三次后，氮气吹干，然后用表面等离子清洗仪(PDG-MG，Chengdu Mingheng Science&technology CO.,Ltd,China)清洗表面，作为三维生物表面的基底。
(17)配制400微升，50微克每毫升的链霉亲和素溶液，溶剂为pH＝4.5的乙酸钠缓冲液，滴加在步骤(16)所述金片表面，4℃孵育12小时。
(18)将步骤(15)所制备的功能化的高分子配制成10mg/mL的溶液，溶液内含有3mg/mL的生物素，功能化的高分子与生物素的摩尔比应为1:100，两者总体积为20毫升。将混合溶液铺在步骤(17)所得表面上，室温孵育16小时。
(19)用N,N-二甲基甲酰胺/水/乙醇交替清洗表面，既得本发明所述的三维生物表面。
上述制备过程中，还分别检测了生物素化引发剂的质谱与所合成的高分子的凝胶渗透色谱，分别如图2、图3所示。
由图2可以看出，峰523.1578(丰度100％)正代表了所制备的生物素化引发剂的分子量；峰525.1556(丰度：97％)，峰526.1591(丰度：26％)是由于引发剂内含有溴元素的同位素裂分所得，峰位移与丰度均与chemdraw所模拟的产物分子量结果一致。
由图3可以看出，生物素化的引发剂成功引发了单体的原子转移自由基聚合，所制备的粘均分子量为84万左右，分子量分布为1.038。
该三维生物表面结合表面等离子共振成像技术用来检测生物大分子同靶标蛋白的相互作用，具有更大的固定量，更普遍的应用范围。
实施例2表面引发-刷状PEG三维生物表面(生物素化引发剂与生物素比例为1:100)的制备
具体步骤如下：
(1)如实施例1中的步骤1～9，制备生物素化引发剂。
(2)如实施例1中步骤17～18，制备链霉亲和素包被的金片。
(3)如实施例1中步骤10，配制单体溶液。
(4)将步骤(1)所制备的生物素化引发剂与生物素制备成1mM的N,N-二甲基甲酰胺溶液，按照1:100的比例，配制成400微升的混合溶液。
(5)将步骤(4)的溶液铺在步骤(2)所制备的链霉亲和素包被的金片的表面，4℃下反应16小时。
(6)将步骤(3)配制的单体溶液取15毫升，在无水无氧环境中，铺到步骤(5)所制备的表面上，室温反应18小时。
(7)将步骤(6)所制备的表面浸泡在加入10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶液中，溶液内还含有150毫克丁二酸酐，150毫克4-二甲氨基吡啶，室温搅拌反应16小时。
(8)将表面取出，用N,N-二甲基甲酰胺，乙醇和水交替冲洗。既得本发明所述三维生物表面。
该三维生物表面结合石英晶体微天平(QCM)技术用来在线检测生物大分子同靶标蛋白的相互作用，具有高的检测信号以及普遍的商业应用，并可以进行实时在线监测。
实施例3表面引发-刷状PEG三维生物表面(生物素化引发剂与生物素比例为1:1000)的制备
具体步骤如下：
(1)如实施例1中的步骤1～9，制备生物素化引发剂。
(2)如实施例1中步骤17～18，制备链霉亲和素包被的金片。
(3)如实施例1中步骤10，配制单体溶液。
(4)将步骤(1)所制备的生物素化引发剂与生物素制备成1mM的N,N-二甲基甲酰胺溶液，按照1:1000的比例，配制成400微升的混合溶液。将步骤(4)的溶液铺在步骤(2)所制备的链霉亲和素包被的金片的表面，4℃下反应16小时。
(5)将步骤(3)配制的单体溶液取15毫升，在无水无氧环境中，铺到步骤(5)所制备的表面上，室温反应18小时。
(6)将步骤(6)所制备的表面浸泡在加入10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶液中，溶液内还含有150毫克丁二酸酐，150毫克4-二甲氨基吡啶，室温搅拌反应16小时。
(7)将表面取出，用N,N-二甲基甲酰胺，乙醇和水交替冲洗。既得本发明所述三维生物表面。
实施例4表面引发-刷状PEG三维生物表面(生物素化引发剂与生物素比例为1:5000)的制备
具体步骤如下：
(1)如实施例1中的步骤1～9，制备生物素化引发剂。
(2)如实施例1中步骤17～18，制备链霉亲和素包被的金片。
(3)如实施例1中步骤10，配制单体溶液。
(4)将步骤(1)所制备的生物素化引发剂与生物素制备成1mM的N,N-二甲基甲酰胺溶液，按照1:5000的比例，配制成400微升的混合溶液。将步骤(4)的溶液铺在步骤(2)所制备的链霉亲和素包被的金片的表面，4℃下反应16小时。
(5)将步骤(3)配制的单体溶液取15毫升，在无水无氧环境中，铺到步骤(5)所制备的表面上，室温反应18小时。
(6)将步骤(6)所制备的表面浸泡在加入10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶液中，溶液内还含有150毫克丁二酸酐，150毫克4-二甲氨基吡啶，室温搅拌反应16小时。
(7)将表面取出，用N,N-二甲基甲酰胺，乙醇和水交替冲洗。既得本发明所述三维生物表面。
实施例5表面引发-刷状PEG三维生物表面(生物素化引发剂与生物素比例为1:10000)的制备
具体步骤如下：
(1)如实施例1中的步骤1～9，制备生物素化引发剂。
(2)如实施例1中步骤17～18，制备链霉亲和素包被的金片。
(3)如实施例1中步骤10，配制单体溶液。
(4)将步骤(1)所制备的生物素化引发剂与生物素制备成1mM的N,N-二甲基甲酰胺溶液，按照1:10000的比例，配制成400微升的混合溶液。将步骤(4)的溶液铺在步骤(2)所制备的链霉亲和素包被的金片的表面，4℃下反应16小时。
(5)将步骤(3)配制的单体溶液取15毫升，在无水无氧环境中，铺到步骤(5)所制备的表面上，室温反应18小时。
(6)将步骤(6)所制备的表面浸泡在加入10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶液中，溶液内还含有150毫克丁二酸酐，150毫克4-二甲氨基吡啶，室温搅拌反应16小时。
(7)将表面取出，用N,N-二甲基甲酰胺，乙醇和水交替冲洗。既得本发明所述三维生物表面。
实施例6链霉亲和素磁珠上药物小分子的固定
具体步骤如下：
(1)如实施例1中的步骤1～9，制备生物素化引发剂。
(2)如实施例1中步骤10，配制单体溶液。
(3)取海狸生物科技有限公司的BeaverBeadsMag系列链霉亲和素包被磁珠500微升，在磁力加上用磁性分离除去上清液。
(4)如实施例2步骤4所述，配制15毫升生物素化引发剂与生物素的混合溶液。
(5)将磁珠用上述溶液重悬，室温摇洗16小时。
(6)将所得磁珠在磁力加上用磁性分离除去上清液。
(7)将步骤(6)所得磁珠用步骤(2)所得单体溶液重悬，在无水无氧条件下，室温放置18小时。
(8)将步骤(7)所得溶液在磁力加上用磁性分离除去上清液。
(9)磁珠的功能化：将步骤(8)所得磁珠放入溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(10毫升)，反应液中含光交联剂TFMAD 10mM、脱水剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)15mM、催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)15mM。
(10)将上述溶液密封，室温摇洗反应18小时。
(11)将所得磁珠在磁力架上用磁性分离除去上清液。
(12)将步骤(11)所得磁珠放入溶解有小分子的二甲基亚砜溶液中，干燥后将磁珠在365纳米紫外光下照射10分钟，光强为1J/cm2，达到预定时间后磁珠取出，用磷酸盐重悬液重悬，既得本发明所要求的技术。
该技术结合靶标垂钓，可以特异性地筛选出与不同药物小分子有相互作用的靶标蛋白，对于研究药物小分子的致病机理具有重要意义。
实施例7链霉亲和素包被玻璃上荧光素标记的模式蛋白芯片的制备
具体步骤如下：
(1)准备玻璃基底，将玻璃基底清洗吹干后，铺上50微克/毫升的链霉亲和素溶液在4℃下孵育16小时。
(2)达到预定时间后，将基底取出，清洗。
(3)如实施例1中步骤10，配制单体溶液。
(4)如实施例1中的步骤1～9，制备生物素化引发剂。
(5)将步骤(4)所制备的生物素化引发剂与生物素制备成1mM的N,N-二甲基甲酰胺溶液，按照1:1000的比例，配制成400微升的混合溶液。
(6)将步骤(5)的溶液铺在步骤(2)所制备的基底上，4℃下反应16小时。
(7)将步骤(3)配制的单体溶液取15毫升，在无水无氧环境中，铺到步骤(6)所制备的基底上，室温反应18小时。
(8)将基底取出，清洗，浸入15毫升0.4M的N-羟基琥珀酰亚胺溶液和0.1M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的混合溶液中，室温反应15分钟。
(9)取出基底，清洗，在基底的表面上手动点上50微克/毫升的蛋白H-IgG，4℃放置2小时。
(10)将芯片取出，在上面用50微克/毫升荧光素标记的FITC-G-H-IgG孵育2小时。
(11)用超纯水清洗，氮气吹干，既得本发明所要求的技术。
该蛋白芯片与倒置荧光显微镜技术相结合，可用来检测抗体-抗原间的特异性相互作用，具有低的背景信号，以及高的检测信号。
实施例8使用实施例1所得三维生物表面对模式蛋白的检测分析
基于表面等离子基元共振成像技术，表征芯片表面修饰的成功与否。并且，利用经典相互作用模式H-IgG和G-H-IgG，此相互作用为已知，来表征三维生物表面固定生物大分子并检测靶向蛋白的可行性。
具体步骤如下：
(1)将实施例1中步骤(17)所制备的链霉亲和素包被的金片放在SPRi仪器上，扫描共振角，并记录,见图4。
(2)将实施例1中步骤(19)中所制备的三维生物表面放在SPRi仪器上，扫描共振角，并记录，见图4。
(3)将实施例1中制备的三维生物表面浸入15毫升，0.4M的N-羟基琥珀酰亚胺溶液和0.1M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的混合溶液中，室温反应15分钟。
(4)取出上述三维生物表面，清洗，在其表面手动点上50微克/毫升的蛋白H-IgG，4°放置2小时。
(5)将固定有H-IgG蛋白的芯片放到SPRi仪器上，扫描共振角，并记录，见图4。
(6)调整光学位置为20.2，通入50微克/毫升靶标蛋白G-H-IgG的PBS溶液，记录背景信号变化以及结合和解离曲线，见图5。
上述试验中，由图4可以看出，将功能化的高分子铺在SA表面并清洗之后，共振角向右偏移，说明功能化的高分子在表面固定成功；然后，将模式蛋白H-IgG在芯片上孵育并清洗之后，共振角度继续向右偏移，说明蛋白在表面固定成功。
上述实验中，由图5可以看出，本发明所制备三维生物表面可以成功固定生物大分子，并用来检测与靶标蛋白的相互作用，并且具有背景小，信号强度大，信噪比高的特点。
实施例9使用实施例1所得三维生物表面对药物小分子雷帕霉素的固定
雷帕霉素是一种新型大环内酯类免疫抑制剂。雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，从而发挥免疫抑制效应。它与蛋白FKBP12的相互作用具有重要的研究意义。利用本发明所述三维表面，可以在其上固定雷帕霉素，并利用表面等离子基元成像(SPRi)技术，来表征雷帕霉素的成功固定。
具体步骤如下：
(1)用移液枪量取0.5微升，10mM的雷帕霉素/二甲基亚砜溶液，轻轻点一滴，在实施例1中步骤(19)所得芯片表面。
(2)重复上述操作20次，可以在芯片表面制备4X5的雷帕霉素液滴矩阵。
(3)将步骤(2)所制备芯片，放入真空干燥箱，干燥1小时。
(4)干燥后将步骤(3)所得芯片在365纳米紫外光下照射10分钟，光强为1J/cm2，进行光交联。
(5)将步骤(4)所制备芯片置于20毫升N,N-二甲基甲酰胺溶液内，摇洗15分钟。
(6)将步骤(5)所制备芯片置于20毫升去离子水内，摇洗15分钟。
(7)将步骤(6)所制备芯片置于20毫升乙醇内，摇洗15分钟。
(8)用氮气吹干步骤(7)所制备芯片，既得本发明所要求的技术。
将上述技术所制备的小分子(雷帕霉素)微阵列芯片置于表面等离子基元像生物传感器上，观察雷帕霉素在芯片表面的固定情况。结果如图七所示，雷帕霉素在实施例1所得三维生物表面成功固定。
实施例10使用实施例3所得三维生物表面对模式蛋白H-IgG的固定
与实施例8类似，使用实施例3所得三维生物表面对模式蛋白的固定步骤如下：
(1)将实施例3中步骤(7)所得的三维生物表面用乙醇/水交替清洗，氮气吹干。
(2)将步骤(1)所清洗的三维生物表面浸入15毫升，0.4M的N-羟基琥珀酰亚胺溶液和0.1M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的混合溶液中，室温反应15分钟。
取出上述生物表面，清洗，在其表面手动点上50微克/毫升的蛋白H-IgG，4℃下放置2小时。既得本发明所述生物芯片。
实施例11使用实施例3所得三维生物表面对药物小分子雷帕霉素的固定
与实施例9类似，使用实施例3所得三维生物表面对药物小分子雷帕霉素的固定如下：
具体步骤如下：
(1)用移液枪量取0.5微升，10mM的雷帕霉素/二甲基亚砜溶液，轻轻点一滴，在实施例1中步骤(19)所得芯片表面。
(2)重复上述操作20次，可以在芯片表面制备4X 5的雷帕霉素液滴矩阵。
(3)将步骤(2)所制备芯片，放入真空干燥箱，干燥1小时。
(4)干燥后将步骤(3)所得芯片在365纳米紫外光下照射10分钟，光强为1J/cm2，进行光交联。
(5)将步骤(4)所制备芯片置于20毫升N,N-二甲基甲酰胺溶液内，摇洗15分钟。
(6)将步骤(5)所制备芯片置于20毫升去离子水内，摇洗15分钟。
(7)将步骤(6)所制备芯片置于20毫升乙醇内，摇洗15分钟。
(8)用氮气吹干步骤(7)所制备芯片，既得本发明所要求的技术。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (36)

1.一种三维生物表面，所述三维生物表面包括链霉亲和素包被的基底，其特征在于：所述三维生物表面还包括生物素和通过生物素与所述链霉亲和素包被的基底结合的功能化的抗非特异性吸附材料，在所述三维生物表面中，未与所述功能化的抗非特异性吸附材料结合的生物素与结合了所述功能化的抗非特异性吸附材料的生物素的摩尔比是1：(1000～12500)；
并通过包括以下步骤的制备方法制备：
(1)合成生物素化的引发剂；
(2)将所述生物素化的引发剂和生物素固定在链霉亲和素包被的基底上，所述生物素化的引发剂和生物素的摩尔比为1：(10～12500)；
(3)利用所述生物素化的引发剂引发单体聚合从而在所述链霉亲和素包被的基底上生成抗非特异性吸附材料；
(4)使所述抗非特异性吸附材料功能化；
或通过包括以下步骤的制备方法制备：
(1＇)合成生物素化的引发剂；
(2＇)利用所述生物素化的引发剂引发单体聚合从而合成生物素化的抗非特异性吸附材料；
(3＇)将所述生物素化的抗非特异性吸附材料和生物素接枝到链霉亲和素包被的基底上，所述生物素化的抗非特异性吸附材料和生物素的摩尔比为1：(10～12500)；
(4＇)使所述抗非特异性吸附材料功能化；
所述生物素化的引发剂是指通过化学合成的，一端带有生物素，另一端具有能够引发高分子聚合的官能团的化学物质。
2.根据权利要求1所述的三维生物表面，其特征在于：所述抗非特异性吸附材料是支链含羟基末端的高分子。
3.根据权利要求1所述的三维生物表面，其特征在于，所述支链含羟基末端的高分子是聚乙二醇、聚乙二醇的衍生物或者支链含羟基的含氟聚合物。
4.根据权利要求1所述的三维生物表面，其特征在于，在所述三维生物表面中，未与所述功能化的抗非特异性吸附材料结合的生物素与结合了所述功能化的抗非特异性吸附材料的生物素的摩尔比为1：(1000～5000)。
5.根据权利要求4所述的三维生物表面，其特征在于，在所述三维生物表面中，未与所述功能化的抗非特异性吸附材料结合的生物素与结合了所述功能化的抗非特异性吸附材料的生物素的摩尔比为1：1000。
6.根据权利要求1-5任一项所述的三维生物表面，其特征在于：所述功能化是指酸化或者酯化。
7.权利要求1-6中任一项所述的三维生物表面的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)合成生物素化的引发剂；
(2)将所述生物素化的引发剂和生物素固定在链霉亲和素包被的基底上，所述生物素化的引发剂和生物素的摩尔比为1：(10～12500)；
(3)利用所述生物素化的引发剂引发单体聚合从而在所述链霉亲和素包被的基底上生成抗非特异性吸附材料；
(4)使所述抗非特异性吸附材料功能化；
或所述制备方法包括以下步骤：
(1＇)合成生物素化的引发剂；
(2＇)利用所述生物素化的引发剂引发单体聚合从而合成生物素化的抗非特异性吸附材料；
(3＇)将所述生物素化的抗非特异性吸附材料和生物素接枝到链霉亲和素包被的基底上，所述生物素化的抗非特异性吸附材料和生物素的摩尔比为1：(10～12500)；
(4＇)使所述抗非特异性吸附材料功能化；
所述生物素化的引发剂是指通过化学合成的，一端带有生物素，另一端具有能够引发高分子聚合的官能团的化学物质。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述生物素化的引发剂的合成方法包括以下步骤：
(a)将生物素活化：将酰胺化反应活化剂、有机碱类催化剂分别加入生物素的有机溶剂中，在5℃～60℃下搅拌，酰胺化反应活化剂、生物素、有机碱类催化剂之间的摩尔比是1：(0.5～5)：(1～10)；
(b)将活化后的生物素酰胺化：将单边保护的双氨基末端试剂加入步骤(a)所得的溶液中，在5℃～60℃下搅拌，所述单边保护的双氨基末端试剂与所述活化后的生物素的摩尔比为(10～1):1；
(c)纯化步骤(b)所得的酰胺化的生物素；
(d)将上述步骤(c)所得产物进行去单边保护；
(e)将引发剂活化：将酰胺化反应活化剂、有机碱类催化剂分别加入引发剂的有机溶剂中，在5℃～60℃下搅拌，所述酰胺化反应活化试剂、所述引发剂、所述有机碱类催化剂的摩尔比为1：(0.5～5)：(1～10)；
(f)将活化的引发剂生物素化：将步骤(d)所得产物与步骤(e)所得产物进行反应，后者的摩尔量与前者摩尔量的比例为(10～1):1；
(g)纯化步骤(f)所得的生物素化的引发剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，酰胺化反应活化剂、生物素、有机碱类催化剂之间的摩尔比是1：(0.5～2)：(1～5)。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，酰胺化反应活化剂、生物素、有机碱类催化剂之间的摩尔比是1:1:1.5。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述单边保护的双氨基末端试剂与所述活化后的生物素的摩尔比为(5～1):1。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述单边保护的双氨基末端试剂与所述活化后的生物素的摩尔比为2:1。
13.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述酰胺化反应活化试剂、所述引发剂、所述有机碱类催化剂的摩尔比为1：(0.5～2)：(1～5)。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述酰胺化反应活化试剂、所述引发剂、所述有机碱类催化剂的摩尔比为1:1:1.5。
15.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(e)所得产物与步骤(d)所得产物摩尔量的比例为(5～1):1。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，步骤(e)所得产物与步骤(d)所得产物摩尔量的比例为2:1。
17.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中所述生物素化的引发剂和生物素的摩尔比为1：(10～5000)。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述生物素化的引发剂和生物素的摩尔比为1：1000。
19.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3＇)中所述生物素化的抗非特异性吸附材料和生物素的摩尔比为1：(10～5000)。
20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述生物素化的抗非特异性吸附材料和生物素的摩尔比为1：1000。
21.根据权利要求7-20任一项所述的制备方法，其特征在于：所述生物素化的引发剂的结构为
其中，R为碳、氮和氧三种元素所形成的末端为-NH-的直链烷基，X为卤素。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述直链烷基为C3～C10的直链烷基。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述直链烷基为-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH-或-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH-。
24.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述生物素化的引发剂为
25.根据权利要求8-20任一项所述的制备方法，其特征在于：所述酰胺化反应活化剂是N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯或者1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
26.根据权利要求8-20任一项所述的制备方法，其特征在于，所述有机碱类催化剂是三乙胺或者4-二甲氨基吡啶。
27.根据权利要求8-20任一项所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂是N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或者二甲基亚砜中的任意一种或者至少两种的混合物。
28.根据权利要求8-20任一项所述的制备方法，其特征在于，所述单边保护的双氨基末端试剂是N-叔丁氧羰基-2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙醇胺或者N-叔丁氧羰基-2-(2-氨基-乙氧基)-乙醇胺。
29.根据权利要求8-20任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)与步骤(g)中的纯化方法是柱层析、重结晶或者过滤。
30.根据权利要求7-20中的任一项所述的制备方法，其中，步骤(4)和(4＇)的功能化方法独立地是酸化或者酯化。
31.根据权利要求30所述的制备方法，其特征在于，所述酸化方法是将酸酐类酸化剂和碱性催化剂溶解在有机溶剂中，然后铺在所述抗非特异性吸附材料的表面上，室温反应1～50h。
32.根据权利要求30所述的制备方法，其特征在于，所述酯化方法是将步骤(3)或者(3＇)得到的固定了抗非特异性吸附材料的链霉亲和素包被的基底放入含小分子光交联剂、有机碱类催化剂和脱水剂的溶液中，在18～32℃的反应温度下反应1～40小时。
33.一种三维生物芯片，其特征在于：所述三维生物芯片包括权利要求1-6中任一项所述的三维生物表面和与所述三维生物表面结合的配体。
34.根据权利要求33所述的三维生物芯片，其特征在于，所述配体为生物大分子或者药物小分子。
35.权利要求33或34所述的三维生物芯片在靶标垂钓中的用途。
36.根据权利要求35所述的三维生物芯片，其特征在于，所述靶标是抗原、抗体和核酸。
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