CN1869692A - 三功能纳米球 - Google Patents

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Abstract

三功能纳米球具有良好的荧光性、磁性和细胞识别能力，易于控制、跟踪，可以方便地用于捕获靶细胞。根据生物分析、生物医学成像、诊断和药物组合筛选等目的的需要，TFNs表面固定的分子可以任意变换。该纳米颗粒由中孔聚合物；附着在该中孔聚合物上的磁性材料；附着在该中孔聚合物上的荧光染料；以及偶联到该中孔聚合物的生物材料组成，其中该中孔聚合物经过肼处理，该生物材料经过氧化剂处理。

Description

三功能纳米球
                         发明背景
发明领域
本发明涉及三功能或多功能纳米颗粒(nanoparticle)，通过将生物材料结合到荧光-磁性双功能纳米颗粒(BFN)上而制成。
相关技术描述
荧光标记和磁选是两种重要的生物技术。同时具有这两种功能的材料在生物医学科学领域有众多应用。
对于迅速增多的医药应用以及生物医学研究而言，纳米球(nanosphere)正在成为一种可选择的材料。在相关技术中，已经开发了若干使用量子点(QDs)和磁性纳米颗粒、将这两种颗粒一起封装在聚合物微胶囊中的方法。
但是，这些相关技术主要依靠核-壳型技术。一般使用磁性材料如磁铁或荧光颗粒如QD作为核。这样的核-壳结构存在弊端，特别是对于荧光应用，因为壳倾向于吸收激发光和发射光中的一种或两种，从而使荧光信号变暗。在相关技术的一些实施方式中，荧光分子被加入到壳材料中。在这些情况下，荧光信号会因从激发荧光团向周围固态基质的能量转移而变暗。
                         附图简述
为了便于进一步理解发明，而被加入的附图构成了本申请的一部分，它们描述了本发明的实施方案，并和说明书一起用于解释本发明的主旨。
附图中：
图1A-B是a＝0.835nm的面心(face-centered)立方晶胞(cubic cell)的X射线衍射(XRD)图谱以及纳米-γ-Fe2O3的透射电镜(TEM)照片。
图2是同时嵌入了CdSe/ZnS QDs和纳-γ-Fe2O3的纳米球的TEM照片。
图3A-3D是嵌入到经过肼处理的苯乙烯/丙烯酰胺共聚物(H2N-St-AA)中的CdSe/ZnS QDs和γ- Fe2O3纳米颗粒的HRTEM高分辨率透射电镜(HRTEM)照片。
图4A-B是双功能纳米颗粒(BFNs)的明视场和荧光显微照片。
图5是三功能纳米颗粒(TFN)的制备及其捕获癌细胞的示意图。
图6A-I是三功能纳米颗粒(TFNs)的荧光显微照片，其中叶酸用作生物材料，且将TFNs结合到具有叶酸受体的癌细胞。
图7是制备三功能纳米颗粒的示意图。
图8A-8D是结合了兔抗人IgG-FITC的三功能抗兔IgG-纳米颗粒的显微照片。
图9A-9D是结合了链霉亲和素-藻红素的三功能生物素-纳米颗粒的显微照片。
                         发明描述
迫切希望开发出结构稳定性高于现有技术、且与细胞、蛋白质或其它颗粒呈现特异结合的双功能纳米颗粒。这些特异的结合可以通过将能提供特异识别受体等的生物分子偶联而实现。此外，当希望更特异用途、如捕获癌细胞时，生物材料与纳米颗粒的偶联变得更为重要。
本发明涉及制备一种多功能纳米颗粒或“纳米球”，它能基本上消除一种或多种由于相关技术的限制和弊端而产生的问题。本发明的任何一个特定实施方案都不可能解决上述相关技术中存在的所有问题。
本发明一方面涉及一种纳米颗粒，包括中孔聚合物、附着在该中孔聚合物上的磁性材料、附着在该中孔聚合物上的荧光染料、以及一种或多种与该中孔聚合物偶联的生物材料。该纳米颗粒可以是球形，也可以聚集成团。在某些情况下本发明所述纳米颗粒可以形成聚合体，但是悬浮在液体中时一般是分散的。
当本发明生物功能化的纳米颗粒(“三功能”或“多功能”纳米颗粒)被单一生物材料标记时，该纳米颗粒可以特异结合细胞、或蛋白质或生物材料特异结合的任何其它部分。例如，该生物材料可以是特异结合细胞表面受体的小分子配体。
一方面，本发明提供一种以上结合双功能纳米颗粒的活性生物材料。本发明所述的两种生物剂(bioagent)偶联到一个双功能纳米颗粒上的多功能纳米颗粒的潜在用途包括利用一种生物剂靶向大分子或细胞，而利用第二种生物剂改变该大分子或细胞的功能或特性，例如，利用蛋白质靶向细胞，利用毒素或细胞死亡蛋白来杀死被靶向的细胞，或者利用一种化学物质或蛋白质来靶向复合体中的蛋白质，而另一种化学物质或蛋白质用来改变该复合体中不同组份的功能。
在一个实施方案中，为将生物材料偶联到该纳米颗粒上，该中孔聚合物经过肼处理，且该生物材料经过氧化剂处理。
该生物材料可以是配体，如肽或蛋白质。蛋白质的实例可以包括肽，该生物材料优选的蛋白质的实例是糖蛋白。该生物材料也可以是小分子。该生物材料可以是抗体或特异于所需细胞受体的配体。该生物材料也可以是碳水化合物。从诸如IgG、抗生物素蛋白、生物素或链霉亲和素的材料中选择生物材料，允许本发明所述TFNs与多种能缀合这些分子的结合配偶体的物质络合(complexation)。
为了将该生物材料偶联到该纳米颗粒上，该中孔聚合物经过肼处理，且该生物材料经过氧化剂处理。该生物材料可以是配体如肽或糖蛋白。该生物材料也可以是小分子。该生物材料可以是抗体或特异于所需细胞受体的配体。该生物材料也可以是碳水化合物配体。一般来说，该生物材料可以选自但不限于诸如IgG、抗生物素蛋白、生物素或链霉亲和素的材料。
该磁性材料可以是Fe2O3。
该荧光染料可以是CdSe或CdSe/ZnS量子点。
该聚合物可以是经过肼处理的苯乙烯/丙烯酰胺(H2N-St-Aam)。
本发明中，该生物材料可以以下述结构偶联到纳米颗粒上：
其中X是该纳米颗粒，Y是该生物材料。Y可以是配体、肽、蛋白质、糖蛋白、抗体、抗生物素蛋白或链霉亲和素。也就是说，上述键合适于可以被氧化生成醛基的糖蛋白，包括抗体、抗生物素蛋白和链霉亲和素，也适用于其它包含醛基的生物材料。如果该生物材料Y是生物素，那么该纳米颗粒可以具有下述结构：
其中X是该纳米颗粒，LC是-C＝O(CH2)3-NH-。在本发明中，Sulfo-NHS-LC-LC-生物素(磺基琥珀酰亚胺基-6’-(生物素酰胺基)-6-己酰氨基己酸酯)具有下述结构：
本发明的一方面涉及一种多功能纳米颗粒，具有下述结构：
其中n≥1；x是由中孔聚合物，附着在该中孔聚合物上的磁性材料，附着在该中孔聚合物上的荧光染料形成的中孔纳米颗粒，Y是蛋白质。
本发明的一方面涉及一种制备多功能纳米颗粒的方法，包括提供中孔聚合物纳米颗粒，该纳米颗粒具有附着在该中孔聚合物上的磁性材料、附着在该中孔聚合物上的荧光染料；用肼处理该纳米颗粒；氧化生物材料；并将氧化的生物材料偶联到该纳米颗粒上。该生物材料可以用偏过碘酸钠氧化。也可以使用其它氧化剂，包括但不限于偏过碘酸钾或任何其它偏过碘酸盐。
任何蛋白质都可偶联到纳米颗粒上。糖蛋白最容易偶联，因为它们可以被氧化生成活性醛基。其它蛋白质可以通过其-COOH基团而偶联，但是效率较低。然而，本领域其它已知技术如二酰亚胺试剂也可以用于将无糖蛋白质偶联到该纳米颗粒上。
在优选实施方案中，该生物材料可以是IgG、抗生物素蛋白、生物素或链霉亲和素。该IgG、抗生物素蛋白、生物素或链霉亲和素可以进一步缀合到其它分子上，这反过来可以作为所需受体的配体，或者作为功能分子如毒素。
本发明纳米颗粒优选不具有磁芯。相反，通过该聚合物纳米颗粒与较小的磁性纳米颗粒相结合使本发明所述纳米颗粒具有磁性。
本发明的一部分涉及一种多功能纳米颗粒，具有下述结构：
Figure A20051007922700093
其中n≥1；X是由中孔聚合物，附着在该中孔聚合物上的磁性材料，附着在该中孔聚合物上的荧光染料形成的中孔纳米颗粒；PEG是聚乙二醇；FA是叶酸。优选n为3。
本发明纳米颗粒也可以用例举的叶酸和生物素之外的小分子配体来衍生。事实上，任何带有反应基如-COOH、-CHO、-NH2和-SH等的生物剂都可以偶联到该表面上。这些带有-COOH和-CHO的生物剂可以无需交联剂而直接偶联。可以购买到已经改性/活化的、可直接用于偶联的生物素。
本发明还涉及标记和收集细胞或被附在本发明TFNs上的配体所识别的部分的方法。例如，本发明提供一种分离细胞的方法，其中将具有所需受体的细胞导入多功能纳米颗粒，其中Y是配体，能特异地结合所需的受体，从而通过多功能纳米颗粒标记出这些细胞。随后，将表面上结合了多功能纳米颗粒的细胞引入固定细胞的磁场，例如在实验试管的底部或在多孔板的底部。随后，可以清洗掉没有被多功能纳米颗粒标记的细胞，随后移去该磁场，并收集这些细胞。
上述方法可以扩展至利用该多功能纳米颗粒的荧光功能、从样品中分离具有不同种类受体的细胞。在该方法中，将具有多种所需受体的细胞样品引入不同种类的多功能纳米颗粒的混合物中，其中每种多功能纳米颗粒具有不同的配体Y，它能特异地结合样品中至少一个细胞上的所需表面受体，进一步地，其中每个配体Y与特定颜色的荧光染料相配对，以获得与不同颜色的多功能纳米颗粒相结合的细胞。标记细胞的多功能纳米颗粒的不同颜色会反映出这些细胞上的不同配体Y的不同受体。随后将被标记的细胞引入磁场以使其固定不动。随后，清除未被标记的细胞，收集标记的细胞。随后根据收集的细胞表面上多功能纳米颗粒的颜色对这些细胞进行分选，例如通过荧光活化细胞分选。用这种方式，具有不同所需表面标记的细胞可以被分离和收集或计算。
本发明的一部分涉及一种分离和/或检测生物分子的方法，其包括将包含具有所需相互作用位点的生物分子的生物混合物与本发明上述多功能纳米颗粒相接触，其中Y由配体组成，它特异地结合所需受体或其它结合配偶体以获得与多功能纳米颗粒结合的生物分子；将这些与多功能纳米颗粒结合的生物分子引入磁场，从而使这些生物分子和结合的分子固定不动；清除未与多功能纳米颗粒结合的分子；将磁场从与多功能纳米颗粒结合的生物分子移去；收集结合的生物分子。该方法可以进一步包括通过与多功能纳米颗粒结合的生物分子的荧光，来纯化所述结合的生物分子和结合的分子。进一步纯化所述结合的生物分子的步骤在收集该结合生物分子步骤之前或之后进行，或者在该生物分子和结合的分子被固定后进行。此外，该生物分子可以是蛋白质，但不限于蛋白质。
现在将详细介绍本发明的优选实施方案，其实施例将在附图中予以说明。附图和优选实施方案不应理解为对本发明的限制；本发明的范围仅由下述权利要求限定。
通过将荧光CdSe/ZnS QDs(量子点)和磁性纳米-γ-Fe2O3同时嵌入经过肼处理的苯乙烯/丙烯酰胺(H2N-St-AAm)共聚物纳米球中，以制备双功能纳米颗粒(BFNs)。为了确保QDs和磁性纳米颗粒都被嵌入，所述颗粒必须很小、并且在单一溶液如5∶95(V/V)氯仿∶丁醇中能良好地分散。任何极性和表面张力达到适当均衡的溶剂都可以作为合适的溶剂。
纳米-γ-Fe2O3是通过S.Sun等人在J.Am.Chem.Soc.(2002)vol.124，pp.8204-8205中公开的高温方法制备的。
单分散性CdSe QDs是如L.H.Qu等人在J.Am.Chem.Soe.(2002)vol.124，pp.2049-2055中所述而获得的。
苯乙烯/丙烯酰胺纳米颗粒是如X.Zhao等人在J.Med.Coll.PLA(1997)vol.12，pp.62-65中所述而获得的。微球体的直径为3±0.05μm，表面上羧基的含量为190.5μmol/g(干燥固体)。
图1A所示为氧化铁的X射线衍射(XRD)分析，它表明该产物的晶体结构为立方γ-Fe2O3而非Fe3O4。得到该产品是因为合成是在空气中、没有可能会还原铁阳离子的1，2-hexadecanediol存在的情况下进行的。透射电镜(TEM)结果示于图1B，表明氧化铁颗粒的平均粒度小于20nm，粒度分布狭窄，而且分散良好。
St-AAm共聚物纳米颗粒是通过X.Zhao等人在J.Med.Coll.PLA(1997)vol.12，pp.62-65中所述的无乳化剂聚合的改良方法、由苯乙烯和丙烯酰胺合成的。通过调整原料的浓度和反应起始物的剂量，球体的粒径可以在50-500nm之间变化。扫描电镜(SEM)图像表明球体的表面为中孔的，从而为纳米颗粒提供了进入通道。由于聚合无乳化剂，因此表面比较清洁、便于与其它分子缀合。
本发明不受任何理论的束缚，发明人认为：由于该纳米颗粒是在水溶液中合成的，因而聚合物的亲水基团倾向位于朝向纳米颗粒的外表面，而疏水基团则存在于其内部，导致形成疏水的空腔。将疏水QDs(3-6nm)和纳米-γ-Fe2O3(5-20nm)嵌入弱极性有机溶剂中。图2所示为同时嵌入了CdSe/ZnS和纳米-γ-Fe2O3的纳米颗粒的透射电镜(TEM)图像，插图所示为H2N-St-Aam纳米球的扫描电镜(SEM)图像。如图2所示，该颗粒在纳米球中分布广泛，且表面比较清洁。
进行能散X射线(EDX)微观分析，以证实该颗粒的分布情况。当BFNs分散在极性水溶液中时，即使在一星期的持续超声处理后，也没有发现可检测的嵌入的疏水颗粒从疏水腔中泄漏。该结果表明疏水颗粒按所需嵌入了纳米颗粒内。
图3所示为嵌入H2N-St-AAm共聚物中的一些单独的QDs和γ-Fe2O3纳米颗粒的高分辨率TEM(HRTEM)图像。图3A是一个QD(CdSe/ZnS QD；A：(102方向)，d＝0.25nm；B：(111方向)，d＝0.21nm。晶面间角为92°)的图像。该晶体数据几乎可以适于纤维锌矿CdSe的结构，其晶胞(unit cell)参数a＝0.4299，c＝0.7010nm。图3B所示是俯视不同晶带轴线的另一个QD(CdSe/ZnS QD；C：(111)，d＝0.21nm；D：(201)，d＝0.17nm。晶面间角为57°。)图3C所示为一个QD和一个γ-Fe2O3颗粒，其粒度不同而互相重叠。图3C中，小晶体E的原子面可以标引为CdSe(111)，其d＝0.21nm，大颗粒F可以标引为立方γ-Fe2O3(200)，其d＝0.41nm。γ-Fe2O3纳米颗粒的另一张图像如图3D所示，缨状(fringes)区G标引为(222)，其d＝0.24nm。还观察了一些超级结构对应的大d间隙。BFNs的磁响应充分，而且分散在溶剂中的BFNs易于控制。收集和控制该BFNs和随后纳米球捕获的细胞仅需数十秒。还发现该BFNs的分散性良好，如图4A(明视场显微镜)和图4B(荧光显微镜)所示。
波长不同，γ-Fe2O3纳米颗粒的相对UV/Vis吸收强度也不同。另一方面，QDs的荧光放射波长取决于其粒径。颗粒越小，该荧光的波长越短。因此，γ-Fe2O3通过吸收荧光而对荧光强度所起的作用会因QDs的粒径和两类纳米颗粒的相对剂量而不同。虽然该相互作用总是以一定程度存在，但是QDs的荧光很强，足以在所有情况下都可以用荧光显微镜直接观察到(图4B)。
图4表明所述发荧光的颗粒具有均一的性质。因此，γ-Fe2O3与QDs的剂量比和该颗粒的浓度都可以相当的灵活。如果需要或希望更多的荧光，就加入更多的QDs。如果需要或希望较少的荧光，则加入较少的QDs。
叶酸是一种配体，可以用于获得本发明所述的三功能纳米颗粒(TFNs)。TFNs可以通过用叶酸(FA)修饰BFNs的表面而制备，叶酸是一种沿若干代谢途径进行单碳链转移反应所需的维生素，而且是生物合成核苷酸碱基所必需的。叶酸基于4-[(蝶啶-6-基甲基)氨基]苯甲酸(蝶酸)，其IUPAC名称是4-{[(2-氨基-3，4-二氢-4-氧代喋啶-6-基)甲基]氨基}苯甲酸。其中蝶酸与一个或多个L-谷氨酸分子缀合的化合物名为蝶酰谷氨酸、蝶酰二谷氨酸。四氢叶酸和叶酸分别是蝶酰谷氨酸和蝶酰二谷氨酸的优选异名。
FA受体(FR)是一种糖蛋白，它被发现在多种人类肿瘤、特别是上皮癌细胞中极大地过量表达。FA和FR之间的结合亲和力非常高，解离常数Kd为约10-9-10-10M。
图5所示为TFN的制备及其捕获癌细胞的示意图。图6A-C所示为与TFNs一起培养3小时(B)和6小时(C)的MCF-7细胞，QDs的最大发射波长为540nm；(A)明视场(B)，(C)荧光(FL))。图6D-E所示为与TFNs一起培养4小时的Hela细胞，QDs的最大发射波长为595nm，(D)明视场；E)荧光。图6F-G所示为对照实验，MRC-5细胞与TFNs一起培养6小时，QDs的最大发射波长为595nm，(F)明视场；G)荧光)。磁选后取出上清液观察。图6H-I所示为对照实验，MCF-7细胞与BFNs一起培养6小时，QDs的最大发射波长为610nm，(H)明视场；I)荧光；不进行磁选。
利用肼化反应以包含-NH-部分，从而提高表面上的NH2基团的反应性。用聚氧乙烯-二-胺(PEG-二-胺)作为隔离物。PEG也称为聚乙二醇。采用戊二醛来活化H2N-St-AAm纳米球，以进一步附着FA-PEG-NH2。戊二醛(HCO(CH2)3OCH)是优选的活化剂。但是，本发明并不仅限于戊二醛，任何适合的二醛或甲醛都可以使用。此外，带有多个醛基的分子也可以使用。
在培养3-4小时后，带有FA配体的TFNs可以捕获Hela和MCF-7癌细胞。随着培养时间增加，发现细胞表面有更多TFNs(图6A-6E)。对照试验表明即使在同样的条件下，将TFNs同MRC-5细胞(一种缺乏FR的正常人体细胞)一起培养6小时，也不发生捕获(图6F和6G)。对于无FA的BFNs，即使在培养6小时后，在BFNs和MCF-7之间也没有明显的反应。因此，在细胞表面没有发现荧光，且BFNs聚集在细胞培养基中(图6H和6I)。刻意将图6H和图6I中未结合的BFNs留下，而不清洗，以表明在培养基中共存时它们不能与该细胞反应。清洗后，在该细胞上观察不到荧光BFNs。所有这些结果表明TFNs可以通过FA和FR之间的特异识别相互作用来捕获癌细胞。另一方面，非特异吸收几乎可以全消除，而这在单独使用纳米颗粒时是不能实现的。
本发明还允许使用新的结合机制以将生物材料附着于双功能纳米颗粒。将荧光性和磁性结合在单一纳米球上将极大地增加其在生物医学和生物制药领域的应用潜力。本发明包括通过将量子点和纳米-γ-Fe2O3共同嵌入聚(苯乙烯/丙烯酰胺)共聚物纳米球中以制备荧光-磁性双功能纳米球。这些纳米球(直径为100-150nm)与免疫球蛋白G(IgG)，抗生物素蛋白，链霉亲和素或生物素随后的生物功能化生成了具有广泛生物医学应用的三功能纳米球。
本发明使用的示例性荧光探测(probe)物质是CdSe。然而，任何适合的半导体物质都可以使用。这些半导体物质包括但不限于CdTe、CuInSe2、CdS、InGa、InAs、CdSe/ZnS、PbSe等。
此外，所述磁性物质不限于Fe2O3。其它适合的磁性物质包括但不限于Co、Co合金、Co铁氧体、氮化钴、氧化钴、CoPd、CoPt、Fe合金、FeAu、FeCr、FeN、Fe3O4、FePd、FePt、FeZrNbB、MnN、NdFeB、NdFeBNdCu、Ni和Ni合金。
用作本发明所述三功能纳米颗粒的基础的优选聚合物为经过肼处理的苯乙烯/丙烯酰胺。但是，本发明并不限于这种聚合物体系，任何适合的聚合物都可以使用。该聚合物体系包括但不限于聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸甲酯、其它适合的丙烯酸或甲基丙烯酸体系的聚合物和共聚物，以及聚乙烯。
例如，苯乙烯和丙烯酰胺可以用于合成苯乙烯/丙烯酰胺共聚物纳米球。可以将水(150ml)、丙烯酰胺(5g)和NaCl(0.3g)混合，在静止N2气氛中加热至70℃，至少15分钟，苯乙烯(22ml)加入约10分钟。随后，将0.1g溶于20ml水的过硫酸钾，边搅拌边加入。在静止N2气氛中、于70℃进行7小时聚合。最后，将共聚物纳米球从反应溶液中分离出来，通过其表面酰胺官能团、使用肼对其改性，以产生活性纳米球表面。如果使用其它聚合材料，反应条件的细节会有所不同。
实施例
如L.H.Qu等人在J.Am.Chem.Soc.，(2002)vol.124，pp.2049-2055中所述，为制备CdSe/ZnS QDs，首先获得单分散性CdSe QDs.前体由hexamethyldisilathiane((TMS)2S)制备，逐滴将乙酰丙酮锌(Zn(ac)2)加入到新制备的200℃的CdSe溶液中。纳米-γ-Fe2O3通过乙酰丙酮铁、十六烷基胺(HDA)和油酸的反应制成。St-AAm共聚物纳米球通过St(苯乙烯)和AAm(丙烯酰胺)在水溶液中发生聚合而制成。H2N-St-AAm通过使用肼对St-AAm进行热液处理而制成。
通过在氯仿/丁醇溶剂(5∶59 v/v)中使H2N-St-AAm膨胀、以及控制量的CdSe/ZnS QDs和纳米-γ-Fe2O3，从而制备BFNs。随后进行30分钟超声处理，离心，用丁醇清洗三次。使用在20kV下运行的Acc.V Spot Maqn SEM、在200kV下运行的JEOL-JEM 2010 TEM、用于EDX的Oxford Link ISIS系统和D/max-RC衍射仪进行样品表征。
叶酸偶联
为了合成FA-PEG-NH2，在二环己基碳二亚胺(DCC；51mg)存在的情况下，使无水二甲亚砜(4mL)中的FA(90mg)和三乙胺(1mL)与N-羧基琥珀酰亚胺(NHS；50mg)在室温下反应。反应混合物在黑暗中搅拌4小时，随后加入PEG-二-胺(MW～3350，670mg)。随后将所得的混合物搅拌一夜。通过过滤去除二环己脲。在含有熟石膏和荧光团(硅胶GF)(75∶36∶6氯仿/甲醇/水)的硅胶上的薄层色谱表明有新的斑点(Rf～0.56)，这是由于形成了产物FA-PEG-NH2。上清液对盐水(NaHCO3，pH8.0，50mm)和水进行渗析，最后冻干。
FA-偶联的TFNs靶向癌细胞
为了说明FA-偶联的TFNs在癌细胞靶向方面的应用，按常规方式在37℃、含有5％CO2(空气中)的湿润气氛、在盛有无FA RPMI-1640培养基、补充10％胎牛血清(是FA的唯一来源)的烧瓶中培养Hela细胞(一种人类宫颈癌细胞系)、MCF-7细胞(一种人类乳腺癌细胞系)和MRC-5细胞(一种二倍体人类肺成纤维细胞系)。为了实施双功能纳米球(FA-PEG-BFN)捕获细胞，该细胞首先在六孔塑料平皿中培养24小时(癌细胞)和48小时(正常细胞)，随后补加已经分散了如上述所制备的TFNs的培养基。该细胞在37℃下培养固定的时间(3-6小时，见图5)。用磷酸盐缓冲盐水(pH7.4 PBS)清洗该细胞数次，以清除非特异吸收的FA-PEG-BFN纳米球，用胰蛋白酶-EDTA溶液分离，在培养基中重悬，进行磁选。弃掉上清液，磁选出的细胞悬浮在pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中。将该悬浮液(～10mL)滴到载玻片上进行荧光显微镜观察。
免疫球蛋白G偶联
在琥珀色瓶中使用偏过碘酸钠(0.1M pH 6.8 PBS中0.1mL，50mmol/L)、在室温下持续振荡30分钟使羊抗兔IgG(0.4mL，5mg/mL，Sigma)氧化，从而在其Fc片段内产生活性醛类。此外，过碘酸钾或其它过碘酸盐优先产生CHO基团，也可以用来代替偏过碘酸钠。停止反应停止后，使该混合物通过一脱盐柱(PD10，Amersham Biosciences)，从而去除未反应的偏过碘酸钠。在用PBS对含酰肼的、嵌入了桔红色量子点的双功能纳米球清洗三遍后，用超声处理几分钟彻底悬浮。将含酰肼的双功能纳米球(在PBS中0.5mL，20mg/mL)的悬浮物与氧化抗体(0.1M pH6.8PBS中0.5mL，ca.4mg/mL)混合，在室温下温育至少6小时，同时保持振荡(图7，示意图1A)，随后用PBS清洗十次。结果获得荧光性-磁性-生物靶向三功能IgG-纳米球。
为表征它们表面的羊抗兔IgG的生物活性，将三功能纳米球(0.2mL，在0.1M pH7.2 PBS)如上所述用兔抗人IgG-FITC(10μL，3.0g/L，北京中山金桥生物科技公司)在4℃下温育30分钟，同时轻微振荡，随后用PBS清洗十次，以去除未结合的兔抗人IgG-FITC。fluoroceinyl异硫氰酸盐(FITC)荧光的显微术分析清楚地显示了在纳米球的表面兔抗人IgG与羊抗兔IgG的结合(图8A和8B中同时存在绿色和红色荧光)，表明在偶联过程中羊抗兔IgG一直保持着活性。另一方面，当使用偶联了未氧化羊抗兔IgG抗体的纳米球与兔抗人IgG-FITC温育时(图8C)，或者，当使用兔抗人IgG-FITC与双功能纳米球温育时(图8D)，在纳米球上没有检测到fluoroceinyl异硫氰酸盐(FITC)荧光。这些结果表明该三功能纳米球通过它们表面羊抗人IgG而特异地识别兔抗人IgG，需要共价偶联来产生这些三功能纳米球。
抗生物素蛋白偶联
为了研究双功能纳米球生物功能化的通用性，使用抗生物素蛋白制备三功能纳米球。抗生物素蛋白偶联到如上所述用于羊抗兔IgG的双功能纳米球。当与PBS中的生物素-FITC温育这些抗生物素蛋白-纳米球1小时后，接着用PBS彻底清洗以清除多余的生物素-FITC。
荧光显微检验证实了生物素被该纳米球表面的抗生物素蛋白捕获，然而当双功能纳米球未偶联抗生物素蛋白、与生物素-FITC温育时，或者当生物素-FITC与曾用未氧化的抗生物素蛋白温育的纳米球温育时，则没有发生捕获，再一次表明了该三功能纳米球的特异性和生物活性。
生物素偶联
将生物素偶联到双功能纳米球。将硫代-NHS-LC-LC-生物素(4.8mg，Pierce)直接加入到含酰肼、嵌入了绿色量子点的双功能纳米球(0.5mL，在PBS中20mg/mL)的悬浮液中，随后在室温反应3小时，同时振荡，随后用PBS清洗十次，以制成带有表面生物素的三功能纳米球(图7，示意图1B)。
为了评估它们表面上的生物素的生物活性，将链霉亲和素-藻红素(10uL，Sigma)加入到三功能生物素-纳米球(0.2mL)中，在室温下温育1小时，同时轻微振荡，随后用PBS彻底清洗。藻红素荧光分析表明链霉亲和素结合该生物素-纳米球的表面(图9A和9B中同时存在红色和绿色荧光)，然而，对于与未改性生物素偶联的纳米球(图9C)、或未与生物素偶联而且无链霉亲和素-藻红素的双功能纳米球(图9D)来说，则不会发生结合。
总之，可以使用一种简单而便捷的手段来制备新颖的具有良好荧光性、磁性和细胞识别能力的三功能纳米球，该纳米球易于控制、跟踪，可以方便地用于捕获靶细胞。而且，根据生物分析、生物医学图像、诊断和药物组合筛选等目的的需要，TFNs表面固定的分子可以任意变换。
对于本领域技术人员而言，显然在不脱离本发明实质或保护范围的情况下，可以对上述发明内容作出众多改进或改变。如果这些改进和改变在所附权利要求及其等价语句的范围内，本发明将包括此发明的这些改进和改变。
本申请中引用了许多科学期刊文献。这些文献的每一篇在此处全文引用作为参考，且用于所有这类引用的目的。

Claims (30)

1、一种纳米颗粒，包括：
中孔聚合物；
附着在该中孔聚合物上的磁性材料；
附着在该中孔聚合物上的荧光染料；以及
与该中孔聚合物偶联的生物材料，其中
该中孔聚合物经过肼处理，该生物材料经过氧化剂处理。
2、如权利要求1所述的纳米颗粒，其中该生物材料选自IgG、抗生物素蛋白、生物素和链霉亲和素。
3、如权利要求1所述的纳米颗粒，其中该磁性材料包括Fe2O3。
4、如权利要求1所述的纳米颗粒，其中该荧光染料包括CdSe或CdSe/ZnS量子点。
5、如权利要求1所述的纳米颗粒，其中该聚合物包括经过肼处理的苯乙烯/丙烯酰胺(H2N-St-Aam)。
6、一种制备多功能纳米颗粒的方法，包括：
提供中孔聚合物纳米颗粒，该纳米颗粒具有附着在该中孔聚合物上的磁性材料，附着在该中孔聚合物上的荧光染料；
用肼处理该纳米颗粒；
氧化生物材料；以及
将该氧化的生物材料偶联到该纳米颗粒上。
7、如权利要求6所述的方法，其中使用偏过碘酸钠氧化该生物材料。
8、如权利要求6所述的方法，其中所述被氧化的生物材料具有活性醛基。
9、如权利要求6所述的方法，其中该生物材料选自IgG、抗生物素蛋白、生物素和链霉亲和素。
10、如权利要求6所述的方法，其中该磁性材料包括Fe2O3。
11、如权利要求6所述的方法，其中该荧光染料包括CdSe或CdSe/ZnS量子点。
12、如权利要求6所述的方法，其中该聚合物包括经过肼处理的苯乙烯/丙烯酰胺(H2N-St-Aam)。
13、如权利要求1所述的纳米颗粒，其中该纳米颗粒不具有磁芯。
14、如权利要求6所述的方法，其中该纳米颗粒不具有磁芯。
15、如权利要求1所述的纳米颗粒，其中该生物材料通过下述结构偶联到纳米颗粒上：
Figure A2005100792270003C1
其中X是该纳米颗粒，Y是该生物材料。
16、如权利要求15所述的纳米颗粒，其中Y是抗体、抗生物素蛋白或链霉亲和素。
17、如权利要求6所述的方法，其中该生物材料通过下述化学式偶联到纳米颗粒上：
其中X是该纳米颗粒，Y是该生物材料。
18、如权利要求15的方法，其中Y是抗体、抗生物素蛋白或链霉亲和素。
19、如权利要求1所述的纳米颗粒，其中该生物材料是通过下述结构偶联到纳米颗粒上的生物素：
其中X是该纳米颗粒，LC是-C＝O(CH2)3-NH-。
20、如权利要求6所述的方法，其中该生物材料是通过下述结构偶联到纳米颗粒的生物素：
Figure A2005100792270003C4
其中X是该纳米颗粒。
21、一种多功能纳米颗粒，包括：
Figure A2005100792270003C5
其中n≥1；
X是中孔纳米颗粒，包括中孔聚合物，附着在该中孔聚合物上的磁性材料以及附着在该中孔聚合物上的荧光染料；
Y是蛋白质。
22、如权利要求21所述的多功能纳米颗粒，其中Y是抗生物素蛋白、链霉亲和素或抗体。
23、一种多功能纳米颗粒，包括：
其中n≥1；
X是中孔纳米颗粒，包括中孔聚合物，附着在该中孔聚合物上的磁性材料以及附着在该中孔聚合物上的荧光染料；
PEG是聚乙二醇；和
FA是叶酸。
24、如权利要求23所述的多功能纳米颗粒，其中n是3。
25、一种分离细胞的方法，包括：
将具有所需受体的细胞与如权利要求1所述的多功能纳米颗粒相接触，其中Y是配体，它特异地结合于该所需受体以获得与多功能纳米颗粒结合的细胞；
将这些与多功能纳米颗粒结合的细胞引入磁场，从而固定这些细胞；
清除未与多功能纳米颗粒结合的细胞；
将磁场从与多功能纳米颗粒结合的细胞移去，收集该细胞。
26、一种分离和分选具有不同表面受体的细胞的方法，包括：
将具有多种所需受体的细胞样品与多种权利要求1所述的多功能纳米颗粒相接触，其中每种多功能纳米颗粒具有不同的配体Y，Y特异地结合样品中至少一种所述细胞上的所需表面受体，进一步地，每个配体Y同一种特定颜色的荧光染料相配对，以获得与多功能纳米颗粒相结合的细胞；
将所述与多功能纳米颗粒结合的细胞引入磁场，从而固定所述细胞；
清除未与多功能纳米颗粒结合的细胞；
将磁场从与多功能纳米颗粒结合的细胞移去，收集这些细胞；
随后根据与每种配体Y相配对的染料的荧光颜色，对收集的细胞进行分选。
27、一种分离和/或检测生物分子的方法，包括：
将生物混合物与权利要求1所述多功能纳米颗粒相接触，该生物混合物包括具有所需相互作用位点的生物分子，其中Y包括配体，它特异地结合所需受体或其它结合配偶体以获得与多功能纳米颗粒结合的生物分子；
将这些与多功能纳米颗粒结合的生物分子引入磁场，从而固定这些生物分子和相关联的分子；
清除未与多功能纳米颗粒结合的分子；
将磁场从与多功能纳米颗粒结合的生物分子移去；和
收集结合的生物分子。
28、如权利要求27所述的方法，其中进一步包括：
通过与多功能纳米颗粒结合的生物分子的荧光，进一步净化所述结合的生物分子和相关联的分子。
29、如权利要求27所述的方法，其中进一步净化所述结合生物分子的步骤在收集该结合生物分子步骤之前或之后进行。
30、如权利要求27所述的方法，其中该生物分子包括蛋白质。
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