JP4180531B2

JP4180531B2 - 金属コロイド粒子及びその製造方法

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Publication number: JP4180531B2
Application number: JP2004042543A
Authority: JP
Inventors: 聖宮下; 良平小川; 昌道毛塚
Original assignee: Nippon Sheet Glass Co Ltd; BL KK
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Priority date: 2004-02-19
Filing date: 2004-02-19
Publication date: 2008-11-12
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Description

本発明は、免疫学的測定用標識及びタンパク質染色剤として好適な金属コロイド粒子及びその製造方法、並びに該金属コロイド粒子を担体に担持させてなる金属微粒子担持体及びその製造方法に関する。

免疫学的測定方法の一つの手法として、イムノクロマト法（以下「ＩＣＡ法」という）が知られており、簡易で迅速な臨床診断法として実用化されている。ＩＣＡ法では、細菌やウイルスを特異的に検出するために、金コロイドで標識された抗体を用いることが一般的であるが、金コロイドを標識としたＩＣＡ法の感度は、必ずしも十分とはいえず、一層高感度な標識が求められている。タンパク質の染色に用いられる白金コロイド粒子を抗体の標識に用いることも考えられるが、ＩＣＡ法においては、白金コロイドの粒径が小さいために、発色が不十分となる。
これを解決する手法として、金コロイド粒子の表面に白金を担持させてなる金属コロイド粒子が提案されている（特許文献１、特許請求の範囲参照）。この発明によれば、金コロイド粒子よりも一層高感度で、免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤として好適な金属コロイド粒子が得られる。
しかしながら、病原菌の種類によっては、感染可能なウイルスの濃度は極めて低く、さらに高感度な免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤が求められている。

特開２００３−２６２６３８号公報

本発明は、上記特開２００３−２６２６３８号公報に開示される発明を、さらに改良したものであって、より感度の高い金属コロイド粒子を提供するものであり、一層高感度で、免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤として好適な金属コロイド粒子を提供するものである。

本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、金コロイド粒子の表面に、白金コロイド粒子を担持してなる金属コロイド粒子であって、担持された白金微粒子の平均粒径が５ｎｍ以下である白金微粒子を含有する金属コロイド粒子、及び金コロイド粒子を製造する際の還元剤の配合量、白金を金コロイド粒子に還元担持する際の還元剤の配合量を、特定の範囲とすることを特徴とする金属コロイド粒子の製造方法によって、その目的を達成し得ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明は、
（１）金コロイド粒子の表面に、白金コロイド粒子を担持してなる白金微粒子を含有する金属コロイド粒子であって、該白金微粒子の平均粒径が５ｎｍ以下であることを特徴とする金属コロイド粒子、
（２）前記金コロイド粒子の平均粒径が３０〜１００ｎｍである上記（１）に記載の金属コロイド粒子、
（３）金と白金のモル比が１：１〜１：５である上記（１）又は（２）に記載の金属コロイド粒子、
（４）媒体中にて、金コロイド粒子形成化合物を還元して、金コロイド粒子を生成せしめた後に、該金コロイド粒子の存在下で、白金含有化合物を還元し、該金コロイド粒子上に白金微粒子を担持させてなる金属コロイド粒子の製造方法であって、該白金微粒子の平均粒径が５ｎｍ以下であり、媒体中に保護コロイド形成剤を実質上含まないことを特徴とする金属コロイド粒子の製造方法
（５）保護コロイド形成剤の含有量が、金及び白金の含有量に対し、全炭素として０〜２００質量ｐｐｍである上記（４）に記載の白金微粒子含有金属コロイド粒子の製造方法、
（６）金コロイド粒子形成化合物を還元する還元剤の配合量が、金の当量濃度に対して、当量濃度比で１〜３の範囲であり、白金含有化合物を還元する還元剤の配合量が、白金の当量濃度に対して、当量濃度比で１０以上であり、白金微粒子の平均粒径が５ｎｍ以下であり、かつ金コロイド粒子の平均粒径が３０〜１００ｎｍである上記（５）に記載の金属コロイド粒子の製造方法、
（７）前記金コロイド粒子形成化合物が塩化金酸であり、白金含有化合物が塩化白金酸である上記（４）〜（６）のいずれかに記載の金属コロイド粒子の製造方法、
（８）還元剤としてクエン酸ナトリウムを使用する上記（６）又は（７）に記載の金属コロイド粒子の製造方法、
（９）金コロイド粒子上に白金を担持させた後に、イオン交換樹脂で処理する上記（４）〜（８）のいずれかに記載の金属コロイド粒子の製造方法、
（１０）金コロイド粒子上に白金を担持させた後の塩素イオン濃度を２０質量ｐｐｍ以下とする上記（９）に記載の金属コロイド粒子の製造方法、
（１１）金コロイド粒子上に白金を担持させた後のナトリウムイオン濃度を２０質量ｐｐｍ以下とする上記（９）に記載の金属コロイド粒子の製造方法、
（１２）上記（４）〜（１１）のいずれかに記載の方法で製造した金属コロイド粒子、
（１３）上記（１）〜（３）のいずれか、又は上記（１２）に記載の金属コロイド粒子を、担体に担持させてなる金属微粒子担持体、
（１４）担体を構成する材料が、炭素、無機セラミックス、有機ポリマーの中から選ばれる上記（１３）に記載の金属微粒子担持体、
（１５）上記（１）〜（３）のいずれか、又は上記（１２）に記載の金属コロイド粒子を分散させた液を担体に接触させる金属微粒子担持体の製造方法、及び
（１６）担体を構成する材料が、炭素、無機セラミックス、有機ポリマーの中から選ばれる上記（１５）に記載の金属微粒子担持体の製造方法、
を提供するものである。

本発明によれば、免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤として好適な、従来のものよりも感度の高い金属コロイド粒子を得ることができる。

本発明の金属コロイド粒子は、金コロイド粒子の表面に、白金コロイド粒子を担持したものであって、担持された白金微粒子の平均粒径が５ｎｍ以下であることを特徴とする。白金の平均粒径が５ｎｍ以下であることによって、免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤として用いた場合に、従来のものよりも感度の高い金属コロイド粒子となる。また、光の吸収率が高くなって、色目が濃くなり、ＩＣＡ法での目視検出感度が高いという利点を有する。
さらには、本発明の金属コロイド粒子における白金微粒子は、その粒径のばらつきが小さく均一であり、より感度の高い金属コロイド粒子を形成する。
本発明の金属コロイド粒子における金コロイド粒子の平均粒径については、本発明の効果を奏する範囲で限定されないが、３０〜１００ｎｍであることが好ましい。金コロイド粒子の平均粒径が３０ｎｍ以上であると、金の持つ活性を十分に発揮させることができ、免疫学的測定用標識剤及びタンパク質染色剤として好適である。また、金コロイド粒子の平均粒径が１００ｎｍ以下であると、金コロイド粒子の表面が安定化することがなく、白金が担持されやすくなる。以上の観点から、金コロイド粒子の平均粒径は、４０〜８０ｎｍであることがさらに好ましい。
本発明の金属コロイド粒子において、金と白金のモル比については、金コロイド粒子及び白金粒子が上記平均粒径をとり得る範囲であれば、特に制限はないが、金と白金の金属としてのモル比が、１：１〜１：５の範囲であることが、上記平均粒径の範囲の金属コロイド粒子を得る上で好適である。以上の観点から、さらに金と白金のモル比は、１：１〜１：２の範囲であることが好ましい。
なお、ここで金コロイド粒子及び白金コロイド粒子の平均粒径は、透過型電子顕微鏡（トプコン社製「ＥＭ−００２Ｂ」、定格加速電圧２００ｋＶ）による観察結果から求めたものである。

次に、本発明の金属コロイド粒子の製造方法について、以下に詳細に説明する。
本発明の金属コロイド粒子は、まず媒体中に金コロイド粒子形成化合物を含有させておき、これを還元して、金コロイド粒子を生成させる。金コロイド粒子形成化合物としては、媒体に溶解し、還元剤により還元されるもので、金コロイド粒子となり得るものであればその種類はとくに限定されるものではなく、金の塩化物、硝酸塩、硫酸塩またはこれらの金属錯化合物などが挙げられる。これらのうち取り扱いやすさなどの点から、塩化金酸が好ましい。
金コロイド粒子形成化合物の濃度については、平均粒径３０〜１００ｎｍ程度の金コロイド粒子を安定な状態に保つとの観点から、媒体全量に対して０．００１〜０．０５質量％であることが好ましく、さらに０．００３〜０．０３質量％であることが好ましい。

上記金コロイド粒子形成化合物を還元して金コロイド粒子を生成させる還元剤についても特に限定されるものではなく、アルコール類、クエン酸類、カルボン酸類、ケトン類、エーテル類、アルデヒド類またはエステル類が例示される。また、これらの二種以上を併用してもよい。アルコール類としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、エチレングリコール、グリセリンなどが例示される。クエン酸類としては、クエン酸や、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウムなどのクエン酸塩が例示される。カルボン酸類としては、ぎ酸、酢酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、アスパラギン酸及びそれらのカルボン酸塩などが例示される。ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトンなどが例示される。エーテル類としては、ジエチルエーテルなどが例示される。アルデヒド類としては、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒドなどが例示される。エステル類としては、ぎ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチルなどが例示される。これらの中でも、還元性が高く、取り扱いも容易なクエン酸ナトリウムが特に好ましい。

還元剤の配合量としては、金の当量濃度に対して、当量濃度比で１〜３の範囲であることが好ましい。該当量濃度比が１以上であると、未反応の金イオンを液中に残存させることがなく、該当量濃度比が３以下であると、金コロイド粒子の平均粒径を３０〜１００ｎｍ、好ましくは４０〜８０ｎｍに制御することが容易であり、しかも粒径のばらつきを抑制することが可能である。これは、還元剤による還元反応の初期段階で、金属核の発生量がある範囲内に制御され、金コロイド粒子あたりの金の原子数を適当な範囲とすることができるためと考えられる。
なお、当量濃度比とは、還元する金の価数、及び還元剤が１モルあたりいくつの電子を供与し得るかによって、決定されるものであり、例えば還元剤としてクエン酸ナトリウムを使用する場合では、クエン酸ナトリウムが一電子供与体として機能するため、金の価数が一価の場合には、金１モルに対して、クエン酸ナトリウムのモル数は１〜３の範囲が好ましい。また、金の価数が三価の場合には、金１モルに対して、クエン酸ナトリウムのモル数は３〜９の範囲が好ましい。

金コロイド粒子形成化合物を溶解させ、また生成する金コロイド粒子を分散する媒体としては、後述する金属コロイドの製造上の面から、例えば、水、アルコール類、ケトン類、エステル類、エーテル類などを用いることができる。アルコール類としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどが例示でき、ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなどが例示できる。また、エステル類としては、ぎ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチルなどが、エーテル類としては、メチルエチルエーテル、ジエチルエーテルなどが例示できる。該媒体は一種を単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよいが、水又はアルコール類あるいはそれらの混合物のような水性媒体が好ましい。

本発明では、媒体中に保護コロイド形成剤を実質的に含まないことを特徴とする。保護コロイド形成剤とは、従来、コロイド粒子の分散安定性を保持するためにコロイド液に含有されているもので、コロイド粒子表面に付着して保護コロイドを形成する物質のことである。このような保護コロイド形成剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチンなどの水溶性高分子物質、界面活性剤、高分子キレート化剤（例えば、特開２０００−２７９８１８号公報における〔００１３〕に記載の化合物）などが挙げられる。
通常、保護コロイド形成剤を用いた場合には、活性発現のために、該保護コロイド形成剤を、加熱や還元等によって除去する必要が生じ、これらの操作によって、金属コロイドが凝集するなど、金属コロイド粒子に悪影響を与える場合がある。これに対し、本発明においては、保護コロイド形成剤を使用しないため、こうした操作をする必要がなく、金属コロイドに粒子に悪影響を与えることがない。

次に、上記方法によって、金コロイド粒子を生成させた後、該金コロイドが分散した液に、白金含有化合物を添加するか、もしくは、白金含有化合物を媒体中に溶解させた液に、生成した金コロイド粒子を添加する。
白金含有化合物としては、媒体に溶解し、還元剤により還元されるもので、白金コロイド粒子となり得るものであればその種類はとくに限定されるものではなく、白金の塩化物、硝酸塩、硫酸塩またはこれらの金属錯化合物などが挙げられる。これらのうち、コロイド粒子の粒径の均一化を図るとの観点から塩化白金酸が好ましい。
白金含有化合物の濃度については、金原子１モルに対して、白金原子が１〜５モルの範囲となるように、さらには、金原子１モルに対して、白金原子が１〜２モルの範囲となるように調整することが好ましい。

次に、上記白金含有化合物を還元して、金コロイドの表面に白金を担持する。ここで使用する還元剤としては、金コロイド粒子を生成させる際に用いた還元剤と同様のものが挙げられる。金コロイド粒子を生成させる際に用いた還元剤と、白金を担持する際に用いる還元剤は、同一のものを使用してもよいし、異なったものを用いてもよいが、作業性の観点から同一のものを使用することが好ましい。本発明においては、上述のようにクエン酸ナトリウムを使用することが最も好ましい。

白金を金コロイド粒子に還元担持する際の還元剤の配合量は、白金の当量濃度に対して、当量濃度比で１０以上であることが好ましい。還元剤の配合量を多くすることによって、白金の還元反応の初期段階において、金属核を多く発生させることができ、白金の各粒子の粒径を抑制することができる。該当量濃度比が１０以上であると、白金粒子の平均粒径を５ｎｍ以下に抑制することが容易となり、しかも白金粒子の粒径のばらつきを抑えることが可能となる。
なお、ここで既にコロイド粒子を形成している金コロイド粒子に対しては、該金コロイド粒子が媒体中に安定して存在しているため、還元剤のさらなる添加によって、その平均粒径が変化することはない。

本発明では、金コロイドが分散した液に、白金含有化合物を添加するか、もしくは、白金含有化合物を媒体中に溶解させた液に、生成した金コロイド粒子を添加した後に、該白金含有化合物を還元して、金コロイド粒子に白金を担持するが、通常の条件では、該白金含有化合物は還元されて白金コロイド粒子を形成し、該白金コロイド粒子が金コロイド粒子に担持されるものと考えられる。本発明においては、白金コロイド粒子の粒径を制御して、金コロイドに担持される白金微粒子の粒径を５ｎｍ以下にすることが重要である。
通常、ある程度の濃度の白金コロイドを、５ｎｍ以下の微小粒径のものとして、分散媒中で維持するためには、保護コロイドが必須であり、分散媒に保護コロイド形成剤を含有させることが必要である。

これに対して、本発明の金属コロイドの製造方法においては、上述のように保護コロイド形成剤を実質上含まないことが特徴であり、白金イオンの濃度、還元剤の含有量、及び反応時間を制御することで、保護コロイド形成剤を含有させずに、粒径５ｎｍ以下の白金コロイド粒子の分散状態を維持するものである。
本発明にかかる白金コロイド粒子は、保護コロイド形成剤を実質上含まなくても、分散安定性が良好であり、実用上十分な長期間、例えば３〜３０日間程度安定した分散性を保持することができる。
なお、保護コロイド形成剤を実質上含まないとは、媒体中の保護コロイド形成剤の含有量が、金及び白金の含有量に対し、全炭素として０〜２００質量ｐｐｍ程度であることを意味する。

保護コロイド形成剤を実質上含まなくても、分散安定性が良好である白金コロイド粒子の製造方法について、分散媒として水を用いた場合について、具体的に説明する。
水としては、蒸留水、イオン交換水、限外ろ過水などの純水を十分に煮沸して、溶存酸素を除いたものを使用する。上記の純水を用いて調製した金属塩水溶液に、還元剤水溶液を、金属塩濃度が１×１０^-4〜１５×１０^-4モル／リットル程度になるように、かつ還元剤が金属塩に対して、１〜２０倍当量程度になるように加え、煮沸状態で３０〜３００分間程度反応を行ったのち、室温まで急冷して反応を停止させる。
このようにして、保護コロイド形成剤を実質上含まなくても、分散安定性が良好である白金コロイド粒子を製造することができる。

本発明では、上述のように、媒体中に実質上保護コロイド形成剤を含まないので、該白金コロイド粒子が担持された金コロイド粒子に対して、コロイド形成剤を除去する処理、例えば加熱や還元等の処理をしなくてすみ、製造工程を簡素化することができる。さらに、コロイド形成剤の除去工程による白金コロイド粒子の凝集や、発生する残渣及び不純物を考慮する必要がないという利点がある。

以上のように、通常の製造条件においては、平均粒径３０〜３００ｎｍ程度の金コロイド粒子の表面に、平均粒径５ｎｍ以下の白金微粒子が担持された金属コロイド粒子が得られるが、金コロイド粒子の表面が部分的に又は全体的に、白金で被覆されている態様も本発明に包含され、例えば、金コロイド粒子の表面を薄膜上に白金が被覆する態様を排除するものではない。

上記方法によって、製造される金属コロイド粒子が分散した液において、金属コロイド粒子をさらに高濃度化することができる。その方法としては、該液を穏やかな条件（例えば非煮沸状態）にて加熱処理し、該コロイド液中の分散媒体を留去させ、濃縮することにより調製することができる。濃縮の条件によって、例えば煮沸状態になった場合などは、対流や生じる気泡の破裂などの影響によって、コロイド粒子の凝集が生じやすくなる。従って、コロイド粒子の凝集が生じないような穏やかな条件を選択することが好ましい。分散媒体が水である場合には、常圧下又は減圧下に５０〜９０℃程度の温度で、１５分〜２４０分程度の時間をかけて水を留去させればよく、減圧度、温度及び濃縮の時間を変化させることによって、コロイド溶液の濃度を制御することができる。

また、本発明の金属コロイド粒子の製造方法においては、所望に応じ、イオン交換樹脂を充填したカラムに、反応終了液を通し、未反応の金属塩及び還元剤を除去することが好ましい。このようにイオン交換樹脂で処理することによって、塩素イオンの濃度を２０質量ｐｐｍ以下に、またナトリウムイオンの濃度を２０質量ｐｐｍ以下にすることが好ましい。
塩素イオンの濃度及びナトリウムイオンの濃度を２０質量ｐｐｍ以下とすることで、本発明の金属コロイド粒子の活性を阻害する要因を排除することができる。

本発明の金属コロイド粒子は、担体に担持して金属微粒子担持体として使用することもできる。ここで用いられる担体としては、金属コロイド粒子を高分散に保持し得るものであれば、特に制限はなく、種々のものが挙げられる。担体を構成する材料としては、炭素材料、無機セラミックス、有機ポリマー等が挙げられ、これらの材料からなり、ある程度の表面積を有するものが担体として好適である。
炭素材料としては、例えば、活性炭、木炭、カーボンブラック、グラファイト、炭素繊維、炭素質中空繊維、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンなどが、無機セラミックスとしては、アルミナ、チタニア、マグネシア、シリカ、シリカ・アルミナ、ジルコニア、ゼオライト、炭化珪素、窒化珪素、ガラス、粘度鉱物などが、有機ポリマーとしては、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリカーボネートなどのポリエステル系樹脂、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル系樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、脂環式構造含有重合体などのポリオレフィン系樹脂、セロファン、ジアセチルセルロース、トリアセチルセルロース、アセチルセルロースブチレートなどのセルロース類、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエーテルイミド、ポリイミド、フッ素樹脂、ポリアミドなどが挙げられる。
金属コロイド粒子を担体に担持して使用する場合には、担体成分１００質量部に対して、金属コロイド粒子を０．１〜３質量部程度含有することが好ましい。金属コロイド粒子が０．１質量部以上であると、染色反応や発色反応等の効果を十分発揮し、３質量部以下であると、金属コロイド粒子が担体上に均一に高分散な状態で維持される。

担体の形態・形状もとくに限定されるものではなく、棒状体、繊維、織布、不織布、フィルム、シート、板状体または粉体などが例示される。これらの中でもガラス繊維及び鱗片状ガラスからなる担体が好適である。ガラス繊維及び鱗片状ガラスは、酸・アルカリ溶液を用いて薬液処理されると、その表面が容易に多孔質化する。この多孔質における細孔の平均径は、通常は１〜１０ｎｍ程度であることから、上記のコロイド粒子であれば、多孔質の細孔内に上手く入り込むことができ、そこに強固に定着することができる。
本発明はまた、担体と、それに担持されてなる前記担持用材料由来の金属ナノコロイド粒子とを有する金属担持体をも提供する。この金属担持体における基体としては、前述の金属担持体の製造方法において、基体として例示したものと同じものを挙げることができる。

本発明の金属コロイド粒子を、担体に担持する方法としては、通常、触媒などの調製方法に用いられる担持法として公知の方法を用いることができる。例えば、上述の方法で得られた金属コロイド粒子を、分散媒に分散し、該分散液に担体を浸漬する方法や、分散媒が水系である場合などは、担体の吸水量を測定しておき、該吸水量に見合う分散液を担体に接触させ、担体の細孔及び該表面に金属コロイド粒子を担持するポアフィリング法などを用いることができる。
また、上述した金属コロイド粒子の製造段階において、媒体中に担体をも浸漬させておき、金属コロイド粒子を担体に担持することもできる。

本発明の金属コロイド粒子は、常法により抗原及び抗体の標識とすることができ、ＩＣＡ法やその他の免疫学的測定法に使用できる。また、本発明の金属コロイド粒子は、通常の白金コロイド粒子と同様に、タンパク質に吸着して集積し、黒色を呈するので各種タンパク質の染色剤として使用することができる。さらに、金属コロイド粒子の表面に存在する白金微粒子が高い酸化還元触媒活性を有するため、酸化還元反応によって呈色する発色剤との併用によって、タンパク質を高感度で検出できる。ここで、発色剤としては、例えば、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用することができる。

次に、本発明を実施例により、さらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
（評価方法）３,３',５,５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いた発色性の評価
ＴＭＢを用い、ペルオキシダーゼ反応により青色に変色する程度の差により、評価した。具体的には以下の手順にて行った。
１）実施例及び比較例の方法にて調製した金属コロイド溶液を、５６０ｎｍにおける吸光度が０．０１０以下になるように希釈してサンプルとした。
２）サンプル（コロイド溶液２００μＬ）にＴＭＢ２００μＬを加えて、３０℃で５分間培養した。
３）反応停止液として、２Ｎの硫酸を２００μＬ加えた後、分光光度計により波長４５０ｎｍでの吸光度を測定し、ＴＭＢ反応前後における吸光度の差（ΔＯ．Ｄ．）で評価した。ΔＯ．Ｄ．が大きいほど高感度であり、免疫学的測定用標識及びタンパク質染色剤として優れるものである。
なお、吸光度の定義は、ランベルトベールの法則に則って、Ａ＝ｅＣＩのＡを吸光度とした（ｅ；モル吸光度係数（Ｍ^-1ｃｍ^-1）、Ｃ；モル濃度（Ｍ）、Ｉ；光路長）。

実施例１
１５００ｍｌフラスコ、１００ｍｌ三角フラスコを２個、２００ｍｌ三角フラスコ２個、還流コンデンサー及び撹拌子を王水中に一昼夜浸し、イオン交換及び限外濾過した純水を用いて前記器具を十分に洗浄した。イオン交換及び限外濾過した純水８５０ｍｌと撹拌子とを前記１５００ｍｌフラスコに投入し、還流コンデンサーをフラスコ上部に設置して、これを１００℃まで加熱・昇温した。純水中の溶存酸素を取り除くため、そのまま１時間煮沸を行った。
一方、１００ｍｌ三角フラスコＡに、塩化金酸（ＨＡｕＣｌ₄・４Ｈ₂Ｏ）５２ｍｇ（金として２５ｍｇ）を秤量して投入し、そこにイオン交換及び限外濾過した純水を加えて２５ｍｌとした。また、２００ｍｌ三角フラスコＢに、クエン酸ナトリウム０．０５ｇを秤量して投入し、イオン交換及び限外濾過した純水を加えて１０ｍｌとした。純水の溶存酸素を取り除いた後、１５００ｍｌフラスコに１００ｍｌ三角フラスコＡから塩化金酸水溶液を投入し、再度１００℃まで加熱・昇温した。さらに、溶存酸素を除去するため、３０分間煮沸を行った。続いて、２００ｍｌフラスコＢからクエン酸ナトリウム水溶液を煮沸状態が維持されるように徐々に添加した。なお、煮沸状態を維持するのは、溶存酸素の濃度を低く保つためであり、蒸発する水は還流操作によって液中に戻るようにした。
この反応溶液において、金濃度は２５ｍｇ／Ｌ＝１．２７×１０^-4ｍｏｌ／Ｌ＝３．８１×１０^-4Ｎであり、金のモル濃度に対するクエン酸ナトリウムのモル濃度比は約１．４８となる。なお、ここでクエン酸ナトリウムのモル濃度は、クエン酸ナトリウム水溶液の調製時のモル濃度である。

次に、もう１つの１００ｍｌ三角フラスコＣに、塩化白金酸（Ｈ₂ＰｔＣｌ₆・６Ｈ₂Ｏ）１３３ｍｇ（白金として５０ｍｇ）を秤量して投入し、そこにイオン交換及び限外濾過した純水を加えて２５ｍｌとした。また、もう１つの２００ｍｌ三角フラスコＤに、クエン酸ナトリウム１．０ｇを秤量して投入し、イオン交換及び限外濾過した純水を加えて１００ｍｌとした。
前記１５００ｍｌフラスコに、塩化金酸溶液を投入してから約３０分経過後に、１００ｍｌ三角フラスコＣから塩化白金酸水溶液を投入し、再度１００℃まで加熱・昇温した。続いて、２００ｍｌフラスコＤからクエン酸ナトリウム水溶液を煮沸状態が維持されるように徐々に添加した。なお、煮沸状態を維持する理由、及び還流操作によって蒸発する水を液中に戻す点は上記と同様である。
この反応溶液において、白金濃度は５０ｍｇ／Ｌ＝２．５６×１０^-4ｍｏｌ／Ｌ＝１．０２×１０^-3Ｎであり、白金のモル濃度に対するクエン酸ナトリウムのモル濃度比は約１３．２８となる。なお、ここでクエン酸ナトリウムのモル濃度は、上記と同様にクエン酸ナトリウム水溶液の調製時のモル濃度である。

２００ｍｌフラスコＤからクエン酸ナトリウム水溶液を１５００ｍｌフラスコに全て添加した後、煮沸状態で還元反応を継続させ、反応開始から１２０分後に反応を止めて、その反応液を室温まで急冷した。冷却した反応溶液をイオン交換樹脂アンバーライトＭＢ-１(オルガノ株式会社製)を詰めたカラムに通し、反応溶液中に残存する金属イオンおよび還元剤を取り除いて安定な金属コロイド液を得た。この金属コロイド液について、プラズマ発光分光分析法により金属コロイド粒子の濃度を測定すると共に、透過型電子顕微鏡を用いて、その平均粒径を測定した。その結果、金コロイド粒子の濃度は２０ｍｇ／Ｌ、平均粒径は５０ｎｍ、これに担持された白金微粒子の濃度は４０ｍｇ／Ｌ、平均粒径は３ｎｍであった。
また、イオン交換樹脂で処理する前の、塩素イオン濃度、ナトリウムイオン濃度及びクエン酸の含有量は、それぞれ６０ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、及び５８０ｍｇ／Ｌであり、イオン交換樹脂で処理した後のそれぞれの濃度は、１ｍｇ／Ｌ以下、４ｍｇ／Ｌ、及び１ｍｇ／Ｌ以下であった。
以上のようにして調製された金属コロイド粒子について、上記評価方法にて評価した結果、ΔＯ．Ｄ．は１．０４８であり、高い感度を持っていた。

比較例１
実施例１において、２００ｍｌ三角フラスコＢに、クエン酸ナトリウム１．０ｇを秤量して投入したこと以外は、実施例１と同様にして、金属コロイド粒子を得た。各反応溶液における金濃度、白金濃度、金及び白金のモル濃度に対するクエン酸ナトリウムのモル濃度比は、以下のようである。
金濃度；２５ｍｇ／Ｌ＝１．２７×１０^-4ｍｏｌ／Ｌ＝３．８１×１０^-4Ｎ
金のモル濃度に対するクエン酸ナトリウムのモル濃度比；約２９．６
（クエン酸ナトリウムのモル濃度は、クエン酸ナトリウム水溶液の調製時のモル濃度）
白金濃度；５０ｍｇ／Ｌ＝２．５６×１０^-4ｍｏｌ／Ｌ＝１．０２×１０^-3Ｎ
白金のモル濃度に対するクエン酸ナトリウムのモル濃度比；約１３．２８
（クエン酸ナトリウムのモル濃度は、クエン酸ナトリウム水溶液の調製時のモル濃度）
金コロイド粒子の濃度は２０ｍｇ／Ｌ、平均粒径は１５ｎｍ、これに担持された白金微粒子の濃度は４０ｍｇ／Ｌ、平均粒径は７ｎｍであった。
また、イオン交換樹脂で処理する前の、塩素イオン濃度、ナトリウムイオン濃度及びクエン酸の含有量は、それぞれ６０ｍｇ／Ｌ、２５０ｍｇ／Ｌ、及び５８０ｍｇ／Ｌであり、イオン交換樹脂で処理した後のそれぞれの濃度は、１ｍｇ／Ｌ以下、４ｍｇ／Ｌ、及び１ｍｇ／Ｌ以下であった。
以上のようにして調製された金属コロイド粒子について、上記評価方法にて評価した結果、ΔＯ．Ｄ．は０．６８８であった。

実施例１の金属コロイド粒子は、そのΔＯ．Ｄ．が、比較例１の金属コロイド粒子におけるΔＯ．Ｄ．に対して約１．５２倍の値を示し、高い感度を持っていることがわかる。これは、実施例１の金属コロイドにおける金コロイド粒子の粒径、白金コロイド粒子の粒径と比較例１の金属コロイドにおける金コロイド粒子の粒径、白金コロイド粒子の粒径との差に起因するものと考えられる。

本発明の金属コロイド粒子は、金コロイド粒子に担持された白金微粒子の平均粒径が５ｎｍ以下であり、しかも粒径のばらつきが小さく、均一性が高いことから、従来の金属コロイド粒子に比較して、活性が高く、例えば免疫学的測定用標識及びタンパク質染色剤として使用した場合に、非常に高い性能を示す。

Claims

金コロイド粒子の表面に、白金コロイド粒子を担持してなる白金微粒子を含有する金属コロイド粒子であって、該白金微粒子の平均粒径が５ｎｍ以下であることを特徴とする金属コロイド粒子。
前記金コロイド粒子の平均粒径が３０〜１００ｎｍである請求項１に記載の金属コロイド粒子。
金と白金のモル比が１：１〜１：５である請求項１又は２に記載の金属コロイド粒子。
媒体中にて、金コロイド粒子形成化合物を還元して、金コロイド粒子を生成せしめた後に、該金コロイド粒子の存在下で、白金含有化合物を還元し、該金コロイド粒子上に白金微粒子を担持させてなる金属コロイド粒子の製造方法であって、該白金微粒子の平均粒径が５ｎｍ以下であり、媒体中に保護コロイド形成剤を実質上含まないことを特徴とする金属コロイド粒子の製造方法。
保護コロイド形成剤の含有量が、金及び白金の含有量に対し、全炭素として０〜２００質量ｐｐｍである請求項４に記載の白金微粒子含有金属コロイド粒子の製造方法。
金コロイド粒子形成化合物を還元する還元剤の配合量が、金の当量濃度に対して、当量濃度比で１〜３の範囲であり、白金含有化合物を還元する還元剤の配合量が、白金の当量濃度に対して、当量濃度比で１０以上であり、白金微粒子の平均粒径が５ｎｍ以下であり、かつ金コロイド粒子の平均粒径が３０〜１００ｎｍである請求項５に記載の金属コロイド粒子の製造方法。
前記金コロイド粒子形成化合物が塩化金酸であり、白金含有化合物が塩化白金酸である請求項４〜６のいずれかに記載の金属コロイド粒子の製造方法。
還元剤としてクエン酸ナトリウムを使用する請求項６又は７に記載の金属コロイド粒子の製造方法。
金コロイド粒子上に白金を担持させた後に、イオン交換樹脂で処理する請求項４〜８のいずれかに記載の金属コロイド粒子の製造方法。
金コロイド粒子上に白金を担持させた後の塩素イオン濃度を２０質量ｐｐｍ以下とする請求項９に記載の金属コロイド粒子の製造方法。
金コロイド粒子上に白金を担持させた後のナトリウムイオン濃度を２０質量ｐｐｍ以下とする請求項９に記載の金属コロイド粒子の製造方法。
請求項４〜１１のいずれかに記載の方法で製造した金属コロイド粒子。
請求項１〜３のいずれか、又は請求項１２に記載の金属コロイド粒子を、担体に担持させてなる金属微粒子担持体。
担体を構成する材料が、炭素、無機セラミックス、有機ポリマーの中から選ばれる請求項１３に記載の金属微粒子担持体。
請求項１〜３のいずれか、又は請求項１２に記載の金属コロイド粒子を分散させた液を担体に接触させる金属微粒子担持体の製造方法。
担体を構成する材料が、炭素、無機セラミックス、有機ポリマーの中から選ばれる請求項１５に記載の金属微粒子担持体の製造方法。