WO2020040159A1 - 表面プラズモン共鳴を担体粒子を用いて増幅させるイムノクロマト法 - Google Patents

表面プラズモン共鳴を担体粒子を用いて増幅させるイムノクロマト法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an immunochromatography method in which a solution containing a test substance is developed by utilizing capillary action, and a labeled test substance is captured and detected.
  • the immunochromatography method generally uses a sandwich immunoassay method using a detection antibody labeled with a capture antibody and particles such as colloid particles in a detection area.
  • the immunochromatography method is performed in the following flow.
  • a liquid sample containing a test substance is developed and moved on a test piece for immunochromatography
  • a complex of a labeled detection antibody and a test substance (“:” indicates binding) is formed.
  • the liquid sample containing this complex develops and moves downstream by capillary action.
  • the complex is captured by a capture antibody immobilized on a detection site on a test piece for immunochromatography.
  • a complex of labeled detection antibody: test substance: capture antibody (“:” indicates binding) is formed, and the test substance is detected using the line formation by the label substance as an index.
  • metal colloid for example, gold colloid
  • colored nanoparticles for example, latex particles
  • surface plasmon resonance are used as those that can be visually identified.
  • colloid particles and the like do not require a special device for observation, but if the concentration of the test substance in the sample solution is low, the signal intensity may be small and may not reach a level recognizable to the naked eye.
  • JP 2008-286590 A International Publication No.WO2011 / 062157 JP 2017-40631 A JP 2005-233744 A JP 2009-281760 A JP 2018-36176 A
  • An object of the present invention is to achieve high sensitivity of detection of a test substance in an immunochromatography method using carrier particles that can be prepared in a conventional process, and the detection is easy, and the background is not increased. is there.
  • the present inventors consider that, in the immunochromatography method, when the resonance particles used for labeling are locally concentrated, the absorption of light around a specific wavelength increases, and the signal is sensitized. went.
  • the present inventors use colloidal gold particles produced by a conventional method as resonance particles and two types of particles as latex particles as holding particles, and bind the colloidal gold particles to the holding particles and accumulate them.
  • the present inventors have found that signal sensitization can be realized by a simple technique, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows. [1] Resonant particles that cause surface plasmon resonance, and holding particles that are larger in size than the resonance particles and do not cause surface plasmon resonance, wherein an affinity substance that binds to a test substance in a specimen sample is immobilized.
  • An immunochromatographic assay method using a resonance particle and a retention particle wherein an affinity substance-binding retention particle that binds to a test substance: a test substance: an affinity substance-binding resonance particle that binds to a test substance (“:” indicates binding) are formed on the holding particles by forming a complex represented by the following formula), and the complex is immobilized on a test piece for immunochromatography in which an affinity substance that binds to a test substance is immobilized as a capture substance.
  • the number of resonance particles is at least X times the number of retained particles [X is represented by (3 (R + r) 2 ) / r 2 when the retained particle size is R and the resonance particle size is r.
  • the particle diameter is a median value when measured in all directions], the immunochromatography method of [7].
  • the kit for immunochromatography according to [18] or [19], wherein the retained particles are latex particles.
  • the number of resonance particles is at least X times the number of retained particles [X is represented by (3 (R + r) 2 ) / r 2 when the retained particle diameter is R and the resonance particle diameter is r.
  • the particle size is the median value when measured in all directions.] [24].
  • the immunochromatography kit according to any one of [18] to [25], wherein the resonance particles and the holding particles are contained in a labeled portion of the immunochromatography test piece.
  • a test strip for an immunochromatography method which comprises, at a labeling site, retention particles to which an affinity substance for a test substance is bound and resonance particles to which an affinity substance for the test substance is bound.
  • [28] The test piece for immunochromatography according to [27], wherein the resonance particles are colloidal gold particles.
  • the test piece for immunochromatography according to any one of [27] to [32], wherein the number of resonance particles is at least 12 times the number of retained particles.
  • the number of resonance particles is at least X times the number of retained particles. [X is represented by (3 (R + r) 2 ) / r 2 when the retained particle size is R and the resonance particle size is r.
  • the particle size is the median value when measured in all directions].
  • the test piece for immunochromatography This description includes part or all of the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2018-154995, which is a priority document of the present application.
  • the present invention realizes an increase in signal / noise ratio and an increase in sensitivity for detection of a test substance in an immunochromatography method. At this time, there is no need for a material manufacturing process and a complicated inspection operation technique that are more than conventional techniques. Further, since this phenomenon occurs only in the presence of the test substance, the background is not sensitized by the mechanism of the present invention.
  • resonance particles such as gold colloid particles (or a part thereof) are captured and accumulated on the surface of a limited number of holding particles such as latex particles, so that only the resonance particles are tested for immunochromatography. Higher sensitivity is achieved than when binding is performed in a state of low integration on a wide range of detection sites where a capture substance (a substance having an affinity for a test substance, for example, an antibody or an antigen) exists on the piece.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the ratio of the number of retained particles / the number of resonance particles and the signal peak area. It is a figure showing that a retention particle and a resonance particle bind via a test substance.
  • FIG. 3 is a diagram showing that a detection signal is increased by binding of a resonance particle to a retained particle via a test substance.
  • the present invention is an immunochromatography method characterized by the label particles used.
  • the immunochromatography method including the lateral flow immunoassay, a test piece in which an affinity substance that specifically recognizes and binds to a test substance is immobilized, and an insoluble carrier to which an affinity substance that specifically recognizes the test substance is bound Use particles. That is, the affinity substance is used after being labeled with insoluble carrier particles.
  • the insoluble carrier particles bind to the test substance, develop and move in the test piece having a porous structure by capillary action, and specifically bind to the test substance immobilized on the detection site in the test piece.
  • a complex of capture substance: test substance: insoluble carrier particles (“:” indicates binding) is formed at the detection site, and the aggregated insoluble carrier particles are accumulated. Utilizing that, the light emitted at the site where the insoluble carrier particles have accumulated is measured as detection light by a detection device or visually, and the presence or absence of accumulation of the insoluble carrier particles is detected, and the presence or absence of the test substance is analyzed.
  • an affinity substance that binds to a test substance may be simply referred to as an affinity substance.
  • Metal nanoparticles that cause surface plasmon resonance or nanoparticles using organic materials such as colored latex particles have been widely used as labeling substances for labeling affinity substances that bind to test substances.
  • the two different kinds of particles are used as the insoluble carrier particles as the labeling substance.
  • the two types of particles are resonance particles and retention particles.
  • the resonance particles are particles that cause surface plasmon resonance
  • the retained particles are particles having a diameter larger than the resonance particles
  • the resonance particles are bonded to the surface of the retained particles.
  • the resonance particles and the retained particles used are those having an affinity substance that binds to a test substance immobilized on the surface.
  • the affinity substance is a substance that binds to a test substance. If the test substance is an antibody, it is an antigen to which the antibody binds. If the test substance is an antigen, it is an antibody that binds to the antigen.
  • the test substance and the affinity substance are not limited to a combination of an antigen and an antibody.
  • the test substance and the affinity substance may be in a relationship between a ligand and a receptor or a receptor and a ligand.
  • affinity substances include polypeptides and other compounds that can bind to the test substance.
  • the method of immobilizing the affinity substance that binds to the test substance on the surface of the resonance particle or the holding particle may use physical binding, electrical binding, chemical binding, or the like. For example, immobilization using a covalent bond between functional groups or immobilization by physical adsorption can be mentioned.
  • high-molecular polymers such as polyethylene glycol, bovine serum albumin (BSA), and milk are used to suppress nonspecific binding of other substances to these particles.
  • the particle surface may be blocked with a protein such as casein.
  • a holding particle having an affinity substance bound to a test substance and a resonance particle having an affinity substance bound to the test substance are referred to as an affinity substance-binding holding particle and an affinity substance, respectively.
  • Resonant particles may be any particles that absorb light around a specific wavelength by causing surface plasmon resonance.
  • a metal colloid can be mentioned, and if it is a metal colloid, the type and shape of a metal, an alloy, a metal oxide, a metal compound and the like are not limited.
  • the diameter of the resonant particles is between 10 and 200 nm, preferably between 10 and 100 nm, more preferably between 10 and 50 nm.
  • a core-shell type in which one colloidal gold particle is further coated with silica or the like is also included.
  • the resonant particles need not be single metal nanoparticles, but may be a combination of these. It is preferable that the color tone of these combinations be advantageous to the observer or the wavelength of the absorbed / unabsorbed light be advantageous to the observer.
  • the holding particles are larger in size than the resonance particles, but the material, shape and the like are not limited.
  • the diameter of the holding particles is several tens nm to several hundreds nm, preferably 50 nm to 800 nm, and more preferably 200 to 600 nm.
  • Examples of the holding particles include colored latex particles and latex particles containing a fluorescent dye.
  • Latex particles are particles that form an emulsion that is colloidally dispersed in water.
  • the material of the particles is not limited, but those used as materials for solid carriers that bind proteins such as antibodies, antigens, ligands and receptors in the technical field such as test agents can be used.
  • polystyrene, styrene copolymers such as styrene-acrylic acid copolymer, polycarbonate, polymethylene methacrylate (PMMA), resins such as polyvinyl toluene, silica, cellulose and the like can be mentioned.
  • particles based on styrene are preferred.
  • the styrene-based particles refer to particles made of a copolymer of polystyrene, styrene, or a derivative of styrene, and a polymerizable unsaturated carboxylic acid, a polymerizable unsaturated sulfonic acid, or the like.
  • styrene derivative examples include chloromethylstyrene and divinylbenzene.
  • polymerizable unsaturated carboxylic acid include acrylic acid and methacrylic acid.
  • polymerizable unsaturated sulfonic acid include sodium styrene sulfonate. Is mentioned.
  • latex particles based on styrene are referred to as polystyrene latex particles.
  • retention particles which exhibit a color similar to the resonance particles or whose fluorescence intensity increases due to interaction with the resonance particles. In order to achieve these, a plurality of types of materials, shapes and sizes of holding particles can be used.
  • the detection sensitivity may be increased by using a non-absorption peak (wavelength outside the absorption peak) of the resonance particles or a hue recognized as a similar color to the resonance particles.
  • the holding particles contain a fluorescent dye
  • the holding particles containing a fluorescent dye having the same excitation wavelength or fluorescence wavelength as the non-absorption peak of the resonance particles, or the fluorescent particles having such a fluorescence wavelength were bonded to the holding particles. It may be something.
  • a combination of a resonance particle and a retention particle containing a fluorescent dye, or a retention particle combined with a fluorescence particle, which causes surface-enhanced fluorescence (SEF: also called surface-enhanced-fluorescence, metal-enhanced-fluorescence, or plasmon-enhanced-fluorescence) Good.
  • SEF surface-enhanced fluorescence
  • metal-enhanced-fluorescence metal-enhanced-fluorescence
  • plasmon-enhanced-fluorescence plasmon-enhanced-fluorescence
  • the resonance particles are bound to the surface of the retained particles.
  • the resonance particles are bonded to the surface of the holding particles so as to cover the entire surface of the holding particles.
  • the resonance particles may be previously bound to a part of the surface of the holding particles.
  • the bonding of the resonance particles to the holding particles may be performed by physical bonding, electrical bonding, chemical bonding, or the like.
  • a bond utilizing a covalent bond between functional groups or a bond by physical adsorption may be mentioned.
  • the resonance particles may be included in the holding particles in advance. Including the resonance particles inside the holding particles is also referred to as including the resonance particles in the holding particles.
  • core-shell particles may be used as the holding particles.
  • Core-shell particles refer to particles in which a porous layer is present as a shell on the surface of non-porous core particles, and resonance particles can be present in the pores of the porous layer.
  • the type of the core-shell particles is not limited, and for example, commercially available core-shell particles can be used.
  • particles that cause surface plasmon resonance are included inside detection particles (particles on which detection antibodies are fixed) made of silica or resin (Japanese Patent Laid-Open No. 2009-281760). And JP-A-2018-36176), and a technique of modifying the surface of a detection particle with particles that cause surface plasmon resonance (JP-A-2017-40631, JP-A-2005-233744). According to the descriptions in these documents, it is possible to produce retention particles containing resonance particles inside or on the surface. Further, the resonance particles and the holding particles may be bonded via the test substance.
  • affinity substance that binds to the test substance that is bound to the resonance particles and the affinity substance that binds to the test substance that is bound to the retention particles are bound via the test substance, and thus the Resonant particles combine.
  • affinity substance binding holding particles test substance: affinity substance binding resonance particles (“:” indicates binding) is formed.
  • a liquid sample flows on a test piece while dissolving a reagent and spreads and moves.At this time, the affinity substance binding holding particles and the affinity substance binding resonance particles spread on the test piece.
  • the above complex is formed.
  • the complex is captured and accumulated by the affinity substance that binds to the test substance immobilized on the detection site on the immunochromatographic test strip, and absorbs light around a specific wavelength by surface plasmon resonance at the detection site.
  • a signal is emitted from the resonance particles and a signal is emitted from the holding particles, so that a total signal including the signal from the surface plasmon resonance and the signal from the holding particles can be detected.
  • the holding particles and the resonance particles may be combined in the developing solution by using the holding particles that do not contain the resonance particles inside or on the surface.
  • the resonance particles may be further bound to the holding particles in a developing solution. According to this method, the density of the resonance particles on the surface of the holding particles is increased, the surface plasmon resonance is sensitized, and the sensitivity can be increased with a higher signal / noise ratio than the conventional technology.
  • the affinity substance that binds to the test substance includes at least three of the affinity substance to be immobilized at the detection site on the test piece, in addition to the affinity substance to be bound to the resonance particles and the affinity substance to be bound to the retention particles. .
  • Each of these affinity substances (groups) may be one kind or plural kinds.
  • the configurations of the respective affinity substances or groups of affinity substances may be the same, or some or all may be different.
  • that the affinity substances are the same or common means that the affinity substances bind to the same site of the same test substance, and that the affinity substances are different or not common are It means that the affinity substance binds to the same test substance but binds to a different site of the test substance.
  • Having the same configuration of the affinity substance group means that all use the same affinity substance regardless of the amount or ratio of each affinity substance.
  • Partially different configurations mean that each includes at least one non-common affinity substance and at least one common affinity substance. All different configurations refer to the absence of a common affinity substance.
  • the affinity substance is an antibody against the test substance
  • the fact that the affinity substance bound to the resonance particles and the affinity substance bound to the holding particles are the same or the same means that both the affinity substances are the same.
  • the substance recognizes and binds to the same epitope of the test substance which is an antigen.
  • both affinity substances are different or not common, both affinity substances recognize different epitopes of the test substance which is an antigen.
  • the test substance is a large molecule such as a virus particle or a polymer
  • the test substance is a relatively small molecule, this complex is difficult to form. This is because the number of sites to which the affinity substance binds in the same test substance is small, and the common affinity substances on each particle or detection site compete with each other for binding to the test substance. Therefore, the affinity substance of the resonance particles, the affinity substance of the retention particles, and the affinity substance of the detection site on the immunochromatographic test strip are preferably different substances or all have different configurations.
  • the ratio between the number of resonance particles and the number of retained particles has a preferable range.
  • the case where the maximum number of resonance particles are bonded to the holding particles that is, the case where the ratio of the number of holding particles / the number of resonance particles is minimized, is considered when these particles are spherical.
  • the reaction time is infinite, the size of the resonance particles and the size of the retained particles are comparable, and the distance between the particle surfaces and the size of the test substance are negligible compared to these, the resonance particles that can bind to the retained particles
  • the number is considered to be 12 from the three-dimensional kiss number.
  • the optimal value of the ratio of the number of retained particles / the number of resonant particles implemented in the present invention is often 1/12 or less in order to maximize surface plasmon resonance.
  • the number of three-dimensional kisses refers to the maximum number that can be arranged when the unit spheres are arranged so as to touch each other without overlapping them around the three-dimensional unit sphere. That is, the number of resonance particles is preferably at least 12 times the number of retained particles. This multiple is considered to be affected by the reaction time, the ratio of the particle size of the resonance particles to the retained particles, the size of the test substance, the concentration of the test substance, and the like.
  • This approximation can be used to calculate the maximum number of contact particles between antigen particles, resonance particles, and retained particles, and is affected by the reaction time and analyte concentration. May be useful for estimating values.
  • Test substance and specimen The test substance mainly includes a marker in a living body and a pathogenic microorganism.
  • a marker in a living body refers to a substance such as a protein, a low-molecular compound, a lipid, and a sugar for detecting a specific disease.
  • a sample in an aqueous phase or a diluted solution of the sample with a buffer solution can be used as the sample. Samples include serum, plasma, blood, urine, saliva, tissue fluid, cerebrospinal fluid, pharyngeal or nasal swabs, pharyngeal or nasal washings, bodily fluids such as nasal aspirate, feces, fecal suspensions, culture fluids, etc.
  • the size of the test substance is not limited, but if the size is significantly larger than the retained particles, it is expected that the effect of increasing the detection sensitivity according to the present invention will decrease. When the size of the retained particles is smaller than that of the resonance particles, the effect of increasing the detection sensitivity according to the present invention is expected to be reduced. From these, it is preferable that the size of the resonance particles ⁇ the size of the test substance ⁇ the size of the retained particles, or the size of the test substance ⁇ the size of the resonance particles ⁇ the size of the retained particles.
  • the immunochromatography can be performed by a known method using a known immunochromatography device.
  • the device for immunochromatography is also called a test strip for immunochromatography, and is made of a material such as nitrocellulose, cellulose acetate, nylon, polyethersulfone, polyvinyl alcohol, polyester, glass fiber, polyolefin, cellulose, or a mixed fiber thereof. It is made of the resulting porous water-absorbing material, and the specimen sample solution can move by capillary action.
  • the thickness of the membrane is not particularly limited, but is preferably about 100 to 200 ⁇ m.
  • the membrane is used as a rectangular strip, and its size is not particularly limited, but is usually about 3 mm to 9 mm ⁇ 40 mm to 60 mm in short side ⁇ long side.
  • the test piece for immunochromatography has a detection site, a sample addition site, an absorption band, and the like, and may have a label site.
  • the detection site is immobilized with an affinity substance capable of specifically binding to the test substance to be detected and capturing the test substance.
  • the detection site may be called a capture site.
  • an affinity substance immobilized on a detection site of a test piece for immunochromatography may be referred to as a detection site-immobilized affinity substance.
  • the sample addition site is a site where the sample sample solution is added, and the sample sample solution may be directly added to the immunochromatographic test piece, but a pad having a water-absorbing material such as a sponge or a nonwoven fabric such as glass fiber may be used. It may be provided on a test piece and added to that portion.
  • the pad at the sample addition site is called a sample pad.
  • the absorption band is also referred to as an absorption pad site, and is provided at one end different from the sample addition site of the immunochromatographic test specimen of the present invention. Promotes the flow of the sample liquid over the test piece.
  • the absorption band is made of a water-absorbing material so that a large amount of liquid can be absorbed.
  • a nonwoven fabric made of cellulose, glass fiber, or the like is used.
  • the size is not particularly limited, it is usually about 3 mm to 15 mm ⁇ 10 mm to 40 mm, and about 0.5 mm to 3 mm in thickness.
  • the labeling site is a site containing the affinity substance-binding holding particles and / or the affinity substance-binding resonance particles.
  • the marker portion is made of a water-absorbing material, for example, a material such as a sponge or a nonwoven fabric made of glass fiber, and the size thereof is not particularly limited, but usually, the short side ⁇ long side is 3 mm to 10 mm ⁇ 3 mm to It has a thickness of about 10 mm and a thickness of about 0.5 mm to 3 mm, and contains affinity substance-binding retention particles and / or affinity substance-binding resonance particles in a dry state.
  • the labeling site can be referred to as a conjugate pad.
  • the affinity substance-binding retention particles and the affinity substance-binding resonance particles may be contained in the same labeling site or in different labeling sites.
  • the affinity substance-binding retention particles and the affinity substance-binding resonance particles do not necessarily have to be contained on the immunochromatographic test strip. In this case, there is no labeled site on the test strip. Further, only one of the affinity substance binding holding particles and the affinity substance binding resonance particles may be contained on the test piece.
  • the labeling site may be obtained by impregnating the above-mentioned water-absorbing material with affinity substance-binding holding particles and / or affinity substance-binding resonance particles and drying the material. When the sample addition site side is the upstream and the absorption band side is the downstream when the sample sample solution flows from the sample addition site to the absorption band on the test piece, the labeling site is downstream of the sample addition site and upstream of the detection site. May be provided.
  • the test piece for immunochromatography may further have a control indication site.
  • the control indication site is a site that indicates that the test was performed correctly.
  • the control display site exists downstream of the detection site, and emits a signal by coloring or the like when the specimen sample passes through the detection site and reaches the control display site.
  • a substance that binds to the affinity substance that binds to the test substance bound to the particles for example, an antibody, may be immobilized, or a pH indicator that changes color when the sample reaches the sample. Or the like may be immobilized.
  • test substance is detected in the following steps.
  • an affinity substance immobilized on the detection site test substance: ⁇ affinity substance-binding retention particle: test substance: affinity substance-binding resonance particle> (“:” Indicates the binding.
  • the part enclosed by “ ⁇ >” indicates that the test substance and the affinity substance-binding retention particles or the affinity substance-binding resonance particles alternately bind to each other, and these three substances bind in a branch shape.
  • Test substance Affinity substance binding resonance particle>
  • the test substance may be the same or different.
  • Specimen particle complex " Make. Surface plasmon resonance at the detection site increases the absorption of light near a specific wavelength by the resonance particles. The absorption of light near a specific wavelength by the resonance particles appears as a color to the naked eye, and appears as a (non) absorption peak wavelength in other cases, and the analyte can be detected by measuring these visually or with a detection device. .
  • the smallest unit of the test substance particle complex captured at the detection site is a complex in which the maximum number of resonance particles capable of binding via the test substance to the holding particle surface are bound. It is preferable that this is bound to the affinity substance immobilized on the detection site via the test substance.
  • an affinity substance binding retention particle and an affinity substance binding resonance particle are formed by capillary action.
  • the sample is spread and moved on the test piece together with the test substance.
  • the affinity substance-binding holding particles are developed and moved before the affinity substance-binding resonance particles, and the detection site-immobilized affinity substance: test substance: affinity substance binding holding particles (" : Indicates binding), then expand and move the affinity substance-bound resonance particles to form a test substance particle complex at the detection site, and signal from the resonance particles by surface plasmon resonance. Should be detected.
  • test substance affinity substance-binding resonance particles> (“ :: Indicates the binding.
  • the part surrounded by " ⁇ >" indicates that the test substance alternately binds to either the affinity substance-binding retention particles or the affinity substance-binding resonance particles, and these three substances bind in a branch shape.
  • this is the state of the complex of the holding particles, the resonance particles, and the substance to be detected in FIG. 1B), and finally captured at the detection site while forming a complex What is necessary is just to form a test substance particle complex and detect a signal from a resonance particle by surface plasmon resonance.
  • the detection site of the immunochromatographic test strip is first combined with a detection site-immobilized affinity substance: an affinity substance binding retention particle: a test substance (“:” indicates binding).
  • a body is formed, after which the affinity substance-binding resonance particles bind to the complex, and ultimately form a test substance particle complex captured at the detection site.
  • the affinity substance-binding retention particles and the sample are mixed, the mixed solution (first solution) is added to the test piece addition site, and the sample is developed and moved on the immunochromatographic test sample.
  • the liquid (the second liquid) containing the active substance-bound resonance particles may be added to the addition site of the test piece for immunochromatography, and may be developed and moved.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the complex formation of the model of (1).
  • an antibody is used as an affinity substance to be immobilized on a detection site of a test piece for immunochromatography, and as an affinity substance to be bound to retention particles and resonance particles.
  • FIG. 1A shows a reaction when the first liquid is added, and a complex of antibody-binding retention particles: test substance: detection site capture antibody is formed at the detection site (“:” indicates binding).
  • FIG. 1B shows the reaction when the second solution containing the antibody-bound resonance particles is added, and the final complex is formed at the detection site.
  • the antibodies of the antibody-binding holding particles, the antibody-binding resonance particles, and the detection site capturing antibodies may be the same or different.
  • the affinity substance-binding retention particles, the affinity substance-binding resonance particles, and the specimen containing the test substance may be mixed, and the mixture may be added to the sample addition site of the immunochromatographic test strip.
  • the affinity substance-binding retention particles and the affinity substance-binding resonance particles are contained in the same or different labeling sites on the immunochromatographic test strip, and the affinity substance-binding retention particles and the affinity substance are determined by the added sample. What is necessary is just to expand and move the coupled resonance particles together with the test substance.
  • FIG. 2 shows the state of complex formation in the model of (2). During the movement, the complexes shown in FIGS.
  • the complex shown in FIG. 2C is preferably used as the complex formed at the detection site of the test piece for immunochromatography.
  • the antibodies of the antibody-binding holding particles, the antibody-binding resonance particles, and the detection site capturing antibodies may be the same or different.
  • a resonance substance to which an affinity substance is not previously bound is present in the inside or a part of the surface of the affinity substance binding holding particle, and further, the affinity substance binding resonance particle is added to the affinity substance binding holding particle. They may be combined.
  • the affinity substance-binding resonance particles added to the test piece later further bind to the affinity substance-binding holding particles.
  • the signal generated by surface plasmon resonance is more sensitized because the degree of accumulation of the above resonance particles is increased, and thus the test substance can be detected with higher sensitivity.
  • the developing solution for developing and moving the solution and the reagent containing the affinity substance binding retention particles and / or the affinity substance binding resonance particles contains a polymer, a protein, a buffer, and a surfactant that suppress nonspecific reactions.
  • the buffer to be contained is not limited as long as it has a buffering action that does not cause a fatal effect on detection due to addition of a sample, change in concentration, or contamination with foreign matter.
  • Preferred are HEPES buffer, phosphate buffer, acetate buffer, Tris-HCl buffer and the like, and particularly preferred is Tris-HCl buffer.
  • the present invention also includes an immunochromatography kit including a retention particle to which an affinity substance for a test substance is bound and a resonance particle to which an affinity substance for the test substance is bound.
  • the kit further includes a test strip for immunochromatography, a blocker, a buffer, and the like.
  • the affinity substance binding retention particles and the affinity substance binding resonance particles may be included as a separate reagent from the immunochromatographic test strip, or may be included in a labeled portion of the immunochromatographic test strip. .
  • the present invention also includes a test strip for immunochromatography, which comprises a retention particle having an affinity substance bound to a test substance and a resonance particle having an affinity substance bound to the test substance. Retained particles to which an affinity substance to the target substance is bound and resonance particles to which an affinity substance to the test substance is bound are included in the labeling site.
  • Example 1 Test Method Gold colloid particles having a diameter of 20 nm (BBI, UK) as resonance particles and white latex particles having a diameter of 400 nm (JSR, Japan) were purchased as holding particles. Antibodies to norovirus were immobilized on each particle.
  • the immunochromatographic strip (white) had a capture antibody that binds to norovirus immobilized at the detection site, and an anti-mouse antibody as a positive control was immobilized in a line at the downstream control display site.
  • a fixed concentration of colloidal gold particles, various concentrations of latex particles, and the test substance Norovirus VLP were mixed in a Tris buffer containing 1.5% Tx-100, and the strip for immunochromatography was immediately immersed, and the mixture was subjected to immunochromatography. And moved on the strip. After 15 minutes, the sample pad (the material part to be brought into contact with the solution) is cut, the image is scanned for the detection area, and the obtained image is analyzed by the image processing software ImageJ as shown in FIG. 3, and the obtained signal peak area is statistically obtained.
  • a significance test was performed using Soft R.
  • FIG. 3 shows peak areas when various concentrations of white latex particles were mixed with respect to a constant gold colloid concentration. Bars represent SD, "+” indicates significant difference to Control (Dunnett's test; p ⁇ 0.05).
  • the white latex particles have the same color as the immunochromatographic strip, and do not directly contribute to the detection sensitivity in this example. Therefore, it is considered that the increase in the sensitivity near the peak was caused by the density of gold colloids on the white latex and amplifying the effect of surface plasmon resonance.
  • the sensitivity is lower than the optimum value, but this is the case where the ratio of white latex particles is higher than the optimum value. It is considered that the sensitivity was lowered due to an effect such as physically hiding the gold colloid on the back side of the white latex from the observation visual field.
  • the optimum value of the resonance particle / retention particle number ratio is smaller than 1/12.
  • the reason why the optimum ratio in the results of this example was smaller than this was that the virus particle size was about twice as large as the gold colloid particle size, the limited antigen concentration, the limited reaction time, etc. Conceivable. From the above results, it has been clarified that the sensitivity is higher than that of the resonance particles alone by mixing the resonance particles with the retention particles at a specific resonance particle / retention particle number ratio.
  • white latex was used to see the effect of surface plasmon resonance.
  • various combinations of resonance particles and colored or fluorescent dye-labeled holding particles can further increase the sensitivity.
  • Example 2 Test method An immunochromatography method was performed using a membrane on which streptavidin was solid-phased in a line. The membrane was impregnated with a 1.5% Tx-100-containing Tris solution containing biotinylated influenza virus antibody solid latex particles (blue), influenza virus antibody solid gold colloid particles (red), and inactivated influenza virus. As a negative control, those excluding any of latex particles, colloidal gold particles, and viruses were used.
  • FIG. 4 shows the test results. As shown in FIG. 4, a purple line of a complex of streptavidin: biotinylated influenza virus antibody solid phase latex particles: inactivated influenza virus: influenza virus antibody solid phase colloidal gold particles (: indicates binding) was observed. In the negative control, no colored line was observed, or a blue line was observed.
  • Example 3 Test method An immunochromatography method was performed using a membrane on which streptavidin was solid-phased in a line. The membrane was impregnated with a 1.5% Tx-100-containing Tris solution containing biotinylated norovirus antibody solid phase latex particles (red), norovirus antibody solid gold colloid particles (red), and norovirus virus like particles. As a negative control, those excluding any of latex particles, colloidal gold particles, and viruses were used.
  • FIG. 5 shows the test results. As shown in FIG. 5, when no complex was formed due to the formation of a streptavidin: biotinylated norovirus antibody solid phase latex particle: norovirus virus like particle: norovirus antibody solid phase gold colloid particle (: indicates binding) , A higher signal was detected.
  • the immunochromatography method of the present invention can be used for highly sensitive detection of a test substance. All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

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Abstract

複雑な作成工程や検査手技を必要としない表面プラズモン共鳴を増幅させたイムノクロマト法の提供。　表面プラズモン共鳴起こす共鳴粒子を被検物質を介して別の保持粒子上に集積した複合体を形成させ、この複合体をイムノクロマト法用試験片上で捕捉し、検出することで、被検物質を検出するイムノクロマト法。該方法においては、表面プラズモン共鳴を起こす粒子のみを用いた場合に比べ感度を増幅する。

Description

表面プラズモン共鳴を担体粒子を用いて増幅させるイムノクロマト法
　本発明は毛細管現象を利用して被検物質を含む溶液を展開し、標識した被検物質を捕捉して検出するイムノクロマト法に関する。
　イムノクロマト法は検出エリアにおける捕捉抗体とコロイド粒子等の粒子により標識された検出抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイ法を利用した方法が一般的である。イムノクロマト法は以下の流れで行われる。被検物質を含む液体サンプルをイムノクロマト法用試験片上に展開移動させる際、標識された検出抗体：被検物質（「：」は結合を示す）の複合体が形成される。この複合体を含む液体試料が毛細管現象により下流に展開移動する。複合体はイムノクロマト法用試験片上の検出部位上に固相化された捕捉抗体により捕捉される。最後に検出部位において、標識された検出抗体：被検物質：捕捉抗体（「：」は結合を示す）の複合体が形成され、標識物質によるライン形成などを指標として被検物質を検出する。
　標識物質には肉眼で識別できるものとして、表面プラズモン共鳴を起こす金属コロイド（たとえば金コロイド）や着色されたナノ粒子（たとえばラテックス粒子）などが用いられる。これらのコロイド粒子等は観測に特別な装置を必要としないが、試料溶液中の被検物質濃度が低いとシグナル強度が小さくなり、肉眼で認識可能なレベルに到達しないことがある。
　銀増感法（特許文献１を参照）などの二次的な増感法は、感度が高くなるが、操作ステップの増加、もしくは観測に専用の機器などを必要とすることが多い。
　その他、コロイド粒子の着色の色彩強度の高度化（特許文献２を参照）や金属コロイドの複合粒子化（特許文献３および４を参照）やコアシェル構造による高感度化（特許文献５および６を参照）が報告されているが、結合しなかった粒子が流路上に残存した場合など、バックグラウンドも高くなりやすく、また、粒子作製に特別な材料や工程を必要とする。
特開2008-286590号公報 国際公開第WO2011/062157号 特開2017-40631号公報 特開2005-233744号公報 特開2009-281760号公報 特開2018-36176号公報
　本発明の課題はイムノクロマト法において、従来の工程で作製可能な担体粒子を用いて、検出が容易であり、またバックグラウンドを高くすることなく、被検物質検出の高感度化を達成することである。
　表面プラズモン共鳴による特定波長付近の光の吸収は共鳴粒子表面電子の集団的な振動によるとされる。
　本発明者らは、イムノクロマト法において、標識に用いる共鳴粒子が局所に集中した場合、特定波長付近の光の吸収が増加し、シグナルが増感されると考え、シグナル増感方法について鋭意検討を行った。本発明者らは、従来通りの方法で作製した金コロイド粒子を共鳴粒子として、またラテックス粒子を保持粒子として２種類の粒子を用い、金コロイド粒子を保持粒子に結合させ、集積されることにより、簡易な手技でシグナル増感を実現することを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　表面プラズモン共鳴を起こす共鳴粒子、および共鳴粒子よりもサイズが大きい表面プラズモン共鳴を起こさない保持粒子であって、検体試料中の被検物質と結合する親和性物質が固定化されている共鳴粒子および保持粒子を用いたイムノクロマトアッセイ法であって、被検物質と結合する親和性物質結合保持粒子：被検物質：被検物質と結合する親和性物質結合共鳴粒子（「：」は結合を示す）で表される複合体を形成させることにより共鳴粒子を保持粒子上に集積させ、該複合体を被検物質と結合する親和性物質を捕捉物質として固定化したイムノクロマト法用試験片上の検出部位において捕捉し、共鳴粒子および保持粒子からのシグナルを検出することにより被検物質を検出するイムノクロマト法。
[２]　共鳴粒子が金コロイド粒子である[１]のイムノクロマト法。
[３]　保持粒子がラテックス粒子である、[１]または[２]のイムノクロマト法。
[４]　あらかじめ表面に共鳴粒子を結合させた保持粒子を用いる、[１]～[３]のいずれかのイムノクロマト法。
[５]　あらかじめ共鳴粒子を内包させた保持粒子を用いる、[１]～[３]のいずれかのイムノクロマト法。
[６]　共鳴粒子と結合した親和性物質と保持粒子と結合した親和性物質が、被検物質の異なる部位に結合する、[１]～[５]のいずれかのイムノクロマト法。
[７]　共鳴粒子数が保持粒子数の12倍以上である、[１]～[６]のいずれかのイムノクロマト法。
[８]　共鳴粒子数が保持粒子数のＸ倍以上[Ｘは、保持粒子径=R、共鳴粒子径=rとした時、（3(R+r)2）/r2で表され、ただし粒子径はそれぞれ全方向で測定した際の中央値とする]である、[７]のイムノクロマト法。
[９]　保持粒子と被検物質を先にイムノクロマト法用試験片に添加し、その後に共鳴粒子を添加する、[１]～[８]のいずれかのイムノクロマト法。
[１０]　共鳴粒子および保持粒子を被検物質と混合し、イムノクロマト法用試験片に添加する、[１]～[８]のいずれかのイムノクロマト法。
[１１]　共鳴粒子および保持粒子がイムノクロマト用法試験片の標識部位に含有されている、[１]～[８]のいずれかのイムノクロマト法。
[１２]　保持粒子が色素で着色または標識されている、[１]～[１１]のいずれかのイムノクロマト法。
[１３]　保持粒子の色素の色が共鳴粒子の色（非吸収ピーク）と同系色である、[１２]のイムノクロマト法。
[１４]　保持粒子が蛍光色素を粒子内に含む、[１]～[１１]のいずれかのイムノクロマト法。
[１５]　保持粒子表面に蛍光色素を結合させた、[１]～[１１]のいずれかのイムノクロマト法。
[１６]　被検物質が、生体中に存在する抗原または抗体である、[１]～[１５]のいずれかのイムノクロマト法。
[１７]　被検物質が、病原性微生物およびその一部である、[１]～[１５]のいずれかのイムノクロマト法。
[１８]　被検物質に対する親和性物質を結合させた保持粒子および被検物質に対する親和性物質を結合させた共鳴粒子を含む、イムノクロマト法用キット。
[１９]　共鳴粒子が金コロイド粒子である[１８]のイムノクロマト法用キット。
[２０]　保持粒子がラテックス粒子である、[１８]または[１９]のイムノクロマト法用キット。
[２１]　あらかじめ表面に共鳴粒子を結合させた保持粒子を用いる、[１８]～[２０]のいずれかのイムノクロマト法用キット。
[２２]　あらかじめ共鳴粒子を内包させた保持粒子を用いる、[１８]～[２０]のいずれかのイムノクロマト法用キット。
[２３]　共鳴粒子と結合した親和性物質と保持粒子と結合した親和性物質が、被検物質の異なる部位に結合する、[１８]～[２２]のいずれかのイムノクロマト法用キット。
[２４]　共鳴粒子数が保持粒子数の12倍以上である、[１８]～[２３]のいずれかのイムノクロマト法用キット。
[２５]　共鳴粒子数が保持粒子数のＸ倍以上[Ｘは、保持粒子径=R、共鳴粒子径=rとした時、（3(R+r)2）/r2で表され、ただし粒子径はそれぞれ全方向で測定した際の中央値とする]である、[２４]のイムノクロマト法用キット。
[２６]　共鳴粒子および保持粒子がイムノクロマト用法試験片の標識部位に含有されている、[１８]～[２５]のいずれかのイムノクロマト法用キット。
[２７]　被検物質に対する親和性物質を結合させた保持粒子および被検物質に対する親和性物質を結合させた共鳴粒子を標識部位に含む、イムノクロマト法用の試験片。
[２８]　共鳴粒子が金コロイド粒子である[２７]のイムノクロマト法用の試験片。
[２９]　保持粒子がラテックス粒子である、[２７]または[２８]のイムノクロマト法用の試験片。
[３０]　あらかじめ表面に共鳴粒子を結合させた保持粒子を用いる、[２７]～[２９]のいずれかのイムノクロマト法用の試験片。
[３１]　あらかじめ共鳴粒子を内包させた保持粒子を用いる、[２７]～[２９]のいずれかのイムノクロマト法用の試験片。
[３２]　共鳴粒子と結合した親和性物質と保持粒子と結合した親和性物質が、被検物質の異なる部位に結合する、[２７]～[３１]のいずれかのイムノクロマト法用の試験片。
[３３]　共鳴粒子数が保持粒子数の12倍以上である、[２７]～[３２]のいずれかのイムノクロマト法用の試験片。
[３４]　共鳴粒子数が保持粒子数のＸ倍以上[Ｘは、保持粒子径=R、共鳴粒子径=rとした時、（3(R+r)2）/r2で表され、ただし粒子径はそれぞれ全方向で測定した際の中央値とする]である、[３３]のイムノクロマト法用の試験片。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-154995号の開示内容を包含する。
　本発明は、イムノクロマト法の被検物質の検出についてシグナル/ノイズ比の上昇と高感度化を実現する。この時、従来の技術を超える材料作製工程や複雑な検査操作技術を必要としない。また、被検物質の存在下においてのみこの現象がおきるため、バックグラウンドは本発明の機序によって増感されない。本発明の方法においては、金コロイド粒子等の共鳴粒子（あるいはその一部）が限られた数のラテックス粒子等の保持粒子表面に捕捉され集積することにより、共鳴粒子のみが、イムノクロマト法用試験片上の捕捉物質（被検物質に対して親和性のある物質、たとえば抗体、あるいは抗原等）の存在する検出部位の広い範囲に集積度の低い状態で結合する場合よりも高い感度を実現する。
検出部位における複合体形成モデル（１）の模式図を示す図である。 検出部位における複合体形成モデル（２）の模式図を示す図である。 保持粒子数/共鳴粒子数比とシグナルピーク面積の関係を示す図である。 保持粒子と共鳴粒子が被検物質を介して結合することを示す図である。 共鳴粒子が被検物質を介して保持粒子に結合することにより、検出シグナルが高くなることを示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、用いる標識粒子に特徴があるイムノクロマト法である。
　ラテラルフローイムノアッセイを含むイムノクロマト法においては、被検物質を特異的に認識し結合する親和性物質を固相化した試験片と被検物質を特異的に認識する親和性物質を結合させた不溶性担体粒子を用いる。すなわち、親和性物質を不溶性担体粒子により標識して用いる。該不溶性担体粒子が被検物質と結合し、多孔質構造を持つ試験片中を毛細管現象により展開移動し、試験片中の検出部位に固相化された被検物質に特異的に結合する親和性物質である捕捉物質と結合することにより、該検出部位に、捕捉物質：被検物質：不溶性担体粒子の複合体（「：」は結合を示す）を形成し、凝集した不溶性担体粒子が集積することを利用し、不溶性担体粒子が集積した部位において発せられる光を検出光として検出装置または目視により測定し、不溶性担体粒子の集積の有無を検出し、被検物質の有無を分析する。
　本明細書において、被検物質に結合する親和性物質を、単に親和性物質ということがある。
　被検物質に結合する親和性物質を標識するための標識物質として表面プラズモン共鳴を起こす金属ナノ粒子、または着色ラテックス粒子などの有機材料を用いたナノ粒子が広く用いられてきた。
　本発明においては、標識物質である不溶性担体粒子として、異なる２種類の粒子を用いる。２種類の粒子は、共鳴粒子と保持粒子である。共鳴粒子は表面プラズモン共鳴を起こす粒子であり、保持粒子は共鳴粒子より直径が大きい粒子であり、共鳴粒子は保持粒子表面に結合する。
１．　保持粒子および共鳴粒子
　共鳴粒子および保持粒子は、被検物質に結合する親和性物質を表面に固定したものを用いる。親和性物質は、被検物質に結合する物質であり、被検物質が抗体であればその抗体が結合する抗原、被検物質が抗原であればその抗原に結合する抗体である。被検物質と親和性物質は、抗原と抗体の組合せだけでなく、例えば、被検物質と親和性物質がリガンドとレセプターまたはレセプターとリガンドの関係にあってもよい。そのような親和性物質として、被検物質に結合し得るポリペプチドやその他の化合物が挙げられる。
　共鳴粒子または保持粒子表面への被検物質に結合する親和性物質の固定化方法は物理的結合、電気的結合、化学的結合などを用いればよい。例えば、官能基どうしの共有結合を利用した固定化や物理的吸着による固定化が挙げられる。共鳴粒子や保持粒子に親和性物質を固定化した後に、これらの粒子に対する他の物質の非特異的な結合を抑制するために、ポリエチレングリコールなどの高分子ポリマーやウシ血清アルブミン（BSA）やミルクカゼイン等のタンパク質などで粒子表面をブロッキングしてもよい。本明細書において、被検物質に結合する親和性物質を結合させた保持粒子および被検物質に結合する親和性物質を結合させた共鳴粒子を、それぞれ、親和性物質結合保持粒子および親和性物質結合共鳴粒子と呼ぶことがある。
　共鳴粒子は、表面プラズモン共鳴を引き起こすことにより特定波長付近の光を吸収する粒子であればどのような粒子でもよい。例えば、金属コロイドが挙げられ、金属コロイドであれば、金属、合金、酸化金属、金属化合物等の種類、形状を問わない。共鳴粒子の直径は、10～200nm、好ましくは10～100nm、さらに好ましくは10～50nmである。また、金コロイド粒子１つに一層シリカ等でコーティングされているコアシェル型のものも含む。共鳴粒子は、単一金属ナノ粒子である必要はなく、これらの組み合わせでもよい。これらの組合せによる色調が観察者にとって有利あるいは吸収される/吸収されない光の波長が観察機器にとって有利であることが好ましい。
　保持粒子は、サイズが共鳴粒子よりも大きいが、材料、形状等は限定されない。保持粒子の直径は、数十nm～数百nm、好ましくは50nm～800nm、さらに好ましくは200～600nmである。保持粒子として、例えば、着色ラテックス粒子や蛍光色素を含むラテックス粒子等が挙げられる。ラテックス粒子とは、コロイド状に水中に分散した乳濁液を形成する粒子をいう。粒子の材質は限定されないが、検査薬等の技術分野で抗体、抗原、リガンド、レセプター等のタンパク質を結合する固相担体の材料に用いられるものを用いることができる。例えば、ポリスチレン、スチレン-アクリル酸共重合体などのスチレン共重合体、ポリカーボネート、ポリメチレンメタアクリレート（PMMA）、ポリビニルトルエンなどの樹脂、シリカ、セルロース等が挙げられる。この中でも、スチレンをベースとする粒子が好ましい。スチレンをベースとする粒子とは、ポリスチレンやスチレンまたはスチレンの誘導体と重合性不飽和カルボン酸や重合性不飽和スルホン酸等との共重合体でできた粒子をいう。スチレンの誘導体としては、クロロメチルスチレン、ジビニルベンゼン等が挙げられ、重合性不飽和カルボン酸としては、アクリル酸、メタクリル酸等が挙げられ、重合性不飽和スルホン酸としては、スチレンスルホン酸ソーダ等が挙げられる。本発明において、スチレンをベースとするラテックス粒子をポリスチレンラテックス粒子という。また、共鳴粒子と同系色の色を呈し、または共鳴粒子との相互作用により蛍光強度が上昇する保持粒子が好ましい。また、これらを達成するために複数種類の材料、形状、サイズの保持粒子を用いることができる。保持粒子の色素による着色では共鳴粒子の非吸収ピーク（吸収ピーク外波長）、または共鳴粒子と同系色と認識される色相を用いることで検出感度が上昇することがある。保持粒子が蛍光色素を含む場合、共鳴粒子の非吸収ピークと同程度の励起波長あるいは蛍光波長を有する蛍光色素を含む保持粒子、またはそのような蛍光波長を有する蛍光粒子を保持粒子に結合させたものであってもよい。また、表面増強蛍光（SEF：surface enhanced fluorescence、metal enhanced fluorescence、またはplasmon enhanced fluorescenceとも呼ばれる）を引き起こす共鳴粒子と蛍光色素を含む保持粒子、または蛍光粒子を結合させた保持粒子の組み合わせであってもよい。保持粒子が蛍光色素を含む場合は、蛍光を蛍光検出装置により検出することができる。
　本発明のイムノクロマト法において、最終的に、共鳴粒子は保持粒子表面に結合させる。好ましくは、保持粒子表面の全体を覆うように共鳴粒子を保持粒子表面に結合させる。
　共鳴粒子は、あらかじめ保持粒子表面の一部に結合させておいてもよい。共鳴粒子の保持粒子への結合は、物理的結合、電気的結合、化学的結合などを用いればよい。例えば、官能基どうしの共有結合を利用した結合や物理的吸着による結合が挙げられる。また、共鳴粒子を、あらかじめ保持粒子の内部に含ませておいてもよい。共鳴粒子を保持粒子の内部に含ませることを、共鳴粒子を保持粒子に内包させるともいう。共鳴粒子を保持粒子に内包させるには、例えば、保持粒子としてコアシェル粒子を用いればよい。コアシェル粒子とは、無孔性のコア粒子の表面に多孔質層がシェル（殻）として存在する粒子をいい、共鳴粒子は多孔質層の孔内に存在し得る。コアシェル粒子の種類は限定されず、例えば、市販のコアシェル粒子を用いることができる。
　保持粒子内部または表面に共鳴粒子を含ませる既存技術としてシリカや樹脂を材料とした検出粒子（検出抗体を固定した粒子）の内部に表面プラズモン共鳴を起こす粒子を含ませたり（特開2009-281760号公報および特開2018-36176号公報）、検出粒子表面を表面プラズモン共鳴を起こす粒子で修飾する技術（特開2017-40631号公報、特開2005-233744号公報）がある。これらの文献の記載に従って、内部または表面に共鳴粒子を含ませた保持粒子を製造することができる。さらに、共鳴粒子と保持粒子とを被検物質を介して結合させてもよい。すなわち、共鳴粒子に結合している被検物質に結合する親和性物質と保持粒子に結合している被検物質に結合する親和性物質が被検物質を介して結合することにより保持粒子表面に共鳴粒子が結合する。この際、親和性物質結合保持粒子：被検物質：親和性物質結合共鳴粒子（「：」は結合を示す）で表される複合体が形成される。
　イムノクロマト法においては、試験片上を液体である検体が試薬を溶解させながら流れて展開移動していくが、この際、親和性物質結合保持粒子と親和性物質結合共鳴粒子が試験片上を展開しながら上記の複合体が形成される。最終的に、複合体はイムノクロマト法用試験片上の検出部位上に固定化された被検物質に結合する親和性物質により捕捉され集積し、検出部位において表面プラズモン共鳴による特定波長付近の光の吸収により共鳴粒子からシグナルを発すると共に保持粒子からシグナルが発するので、表面プラズモン共鳴によるシグナルと保持粒子からのシグナルを含めたトータルのシグナルを検出することができる。このときには、内部または表面に共鳴粒子を含ませていない保持粒子を用いて、展開液中で保持粒子と共鳴粒子を結合させてもよく、また内部または表面に保持粒子を含ませた保持粒子を用いて、さらに展開液中で共鳴粒子を保持粒子に結合させてもよい。この方法により、保持粒子表面における共鳴粒子の密度が大きくなり、表面プラズモン共鳴が増感され、従来の技術よりシグナル/ノイズ比が高い高感度化が可能となる。
　被検物質に結合する親和性物質は、共鳴粒子に結合させる親和性物質および保持粒子に結合させる親和性物質の他に、試験片上の検出部位に固定化する親和性物質の少なくとも３つが存在する。これらの親和性物質(群)は、それぞれが一種類ずつであっても複数種類であってもよい。また、それぞれの親和性物質あるいは親和性物質群の構成が、同じであっても、一部あるいは全部が異なっていてもよい。ここで、親和性物質が同じあるいは共通のものであるとは、当該親和性物質が同じ被検物質の同じ部位に結合することをいい、親和性物質が異なるあるいは共通でないものであるとは、当該親和性物質が同じ被検物質に結合するが被検物質の異なる部位に結合することをいう。親和性物質群の構成が同じであるとは、それぞれの親和性物質の量や割合に関係なく、すべて共通の親和性物質を用いていることを指す。一部が異なる構成とは、共通でない親和性物質と共通の親和性物質をそれぞれ少なくとも一つずつ含むことを指す。全てが異なる構成とは、共通の親和性物質を含まないことを指す。例えば、親和性物質が被検物質に対する抗体である場合、共鳴粒子に結合させた親和性物質と保持粒子に結合させた親和性物質が同じ、もしくは共通のものであるとは、両方の親和性物質は抗原である被検物質の同じエピトープを認識し結合する。一方、両方の親和性物質が異なる、もしくは共通でないものである場合は、両方の親和性物質は抗原である被検物質の異なるエピトープを認識する。被検物質がウイルス粒子やポリマー等の大分子である場合、同一被検物質中に親和性物質が結合する部位が複数存在するので、共鳴粒子上および/または保持粒子上および/または試験片上の検出部位上共通の親和性物質によってイムノクロマト法用試験片上の検出部位に共鳴粒子と保持粒子の複合体が形成され得る。一方、被検物質が比較的小分子の場合、この複合体は形成が困難である。これは同一被検物質中に親和性物質が結合する部位が少数であり、各粒子あるいは検出部位上の共通の親和性物質が互いに被検物質に対する結合について競合するためである。従って、共鳴粒子の親和性物質、保持粒子の親和性物質およびイムノクロマト法用試験片上の検出部位の親和性物質は好ましくは異なる物質あるいは全てが異なる構成である。
　共鳴粒子数と保持粒子数の比には、好ましい範囲がある。保持粒子に最大数の共鳴粒子が結合した場合、つまり保持粒子数/共鳴粒子数比率が最小となる場合を、これら粒子が球体であった場合について考察する。反応時間が無限大で、共鳴粒子と保持粒子のサイズが同程度であり、粒子表面間距離および被検物質のサイズがこれらに比して無視できるサイズである場合、保持粒子に結合できる共鳴粒子数は３次元接吻数より12と考えられる。このため、本発明で実施される保持粒子数/共鳴粒子数比の最適値は、表面プラズモン共鳴を最大にするため、多くの場合、1/12以下となる。ここで、３次元接吻数とは、３次元の単位球の周囲に単位球を重ならずに触れ合うように並べるときに、最大並べられる数をいう。すなわち、共鳴粒子数は、保持粒子数の12倍以上であることが好ましい。この倍数は、反応時間、共鳴粒子/保持粒子粒径比、被検物質のサイズ、被検物質濃度などにより影響を受けると考えられる。
　粒子径に応じた、一般化した最適値について考察する。半径Rの球体Aに対し半径rの球体B（R≧r）が最大数接触した状態を仮定すると、B中心が形成する球表面積とB最大断面積から近似的にBの最大接触粒子数を推定すると、充填率（3次元球で最大で0.75程度、2次元円では最大0.9程度。本近似法ではRがrに比べ大きいほど0.9に近づく）をaとした場合、球体Aに対する球体Bの最大接触粒子数Ｘは以下のように近似することができる。
X=4a(r+R)2/r2
　この近似は抗原粒子、共鳴粒子、保持粒子の各間の最大接触粒子数の計算に用いることができ、反応時間、被検物質濃度により影響を受けるが、保持粒子数/共鳴粒子数比の最適値の推測に有用である可能性がある。
　保持粒子径=R、共鳴粒子径=rとした時、共鳴粒子数が保持粒子数の（4a(R+r)2）/r2倍であることが好ましい。a=0.75とした場合、共鳴粒子数が保持粒子数の（3(R+r)2）/r2倍であることが好ましい。
２．　被検物質および検体
　被検物質としては、おもに生体中のマーカーや病原性微生物が挙げられる。生体中のマーカーとは特定の疾患を検出するためのタンパク質、低分子化合物、脂質、糖等の物質をいう。検体としては、主に水相の検体または検体の緩衝液による希釈液等を用いることができる。検体としては、血清、血漿、血液、尿、唾液、組織液、髄液、咽頭若しくは鼻腔拭い液、咽頭若しくは鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液等の体液等、糞便、糞便懸濁液、培養液などが挙げられる。被検物質のサイズは限定されないが、保持粒子より著しく大きい場合には本発明による検出感度上昇効果が小さくなることが予測される。また、共鳴粒子より保持粒子のサイズが小さい場合には本発明による検出感度上昇効果が小さくなることが予測される。これらより、共鳴粒子のサイズ＜被検物質のサイズ＜保持粒子のサイズ、あるいは被検物質のサイズ＜共鳴粒子のサイズ＜保持粒子のサイズであることが好ましい。
３．　イムノクロマト法
　イムノクロマト法は公知のイムノクロマト法用デバイスを用いて公知の方法で行うことができる。イムノクロマト法用デバイスは、イムノクロマト法用試験片（ストリップ）とも呼び、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、これらの混合繊維からなる材質等でできた多孔性の吸水性の材質でできており、検体試料液が毛細管現象により移動し得る。メンブランの厚さは特に限定されないが、好ましくは100～200μm程度である。また、メンブランは長方形のストリップとして用い、その大きさは、特に限定されないが、通常、短辺×長辺が３mm～９mm×40mm～60mm程度である。イムノクロマト法用試験片は、検出部位、試料添加部位、吸収帯等を有し、標識部位を有していてもよい。検出部位は、検出すべき被検物質と特異的に結合して被検物質を捕捉し得る親和性物質が固定化されている。検出部位を捕捉部位と呼ぶこともある。本明細書において、イムノクロマト法用試験片の検出部位に固定化された親和性物質を検出部位固定化親和性物質と呼ぶことがある。試料添加部位は、検体試料液を添加する部位で、検体試料液をイムノクロマト法用試験片上に直接添加してもよいが、吸水性のある材質、例えばスポンジ、ガラス繊維などの不織布等のパッドを試験片上に設けその部分に添加してもよい。試料添加部位のパッドをサンプルパッドと呼ぶ。吸収帯は、吸収パッド部位とも呼び、本発明のイムノクロマト法用試験片の試料添加部位とは異なる一端に設けられ、試料添加部位に添加した後、試験片上を展開移動する試料液体を吸収することにより試験片上の試料液体の流れを促進する。吸収帯は、多量の液を吸収できるよう、吸水性の材質でできており、例えば、セルロース、ガラス繊維などでできた不織布等が用いられる。また、その大きさは、特に限定されないが、通常、短辺×長辺が３mm～15mm×10mm～40mm、厚さ0.5mm～３mm程度である。標識部位は、親和性物質結合保持粒子および／または親和性物質結合共鳴粒子が含有された部位である。標識部位は、吸水性の材質、例えばスポンジおよびガラス繊維などでできた不織布等の材質が用いられ、その大きさは、特に限定されないが、通常、短辺×長辺が３mm～10mm×３mm～10mm、厚さ0.5mm～３mm程度で、親和性物質結合保持粒子および／または親和性物質結合共鳴粒子が乾燥状態で含有されている。標識部位として上記の吸水性の材質に親和性物質結合保持粒子および／または親和性物質結合共鳴粒子を含有させて用いる場合、該標識部位をコンジュゲートパッドと呼ぶことができる。親和性物質結合保持粒子と親和性物質結合共鳴粒子は同じ標識部位に含有されていても、異なる標識部位に含有されていてもよい。
　また、親和性物質結合保持粒子と親和性物質結合共鳴粒子は、必ずしもイムノクロマト法用試験片上に含有されていなくてもよい。この場合、試験片上に標識部位は存在しない。また、親和性物質結合保持粒子と親和性物質結合共鳴粒子の一方のみが試験片上に含有されていてもよい。標識部位は、上記の吸水性の材質に親和性物質結合保持粒子および／または親和性物質結合共鳴粒子を含浸させ、乾燥させればよい。試験片上を検体試料液が試料添加部位から吸収帯に流れるときの試料添加部位側を上流、吸収帯側を下流とした場合、標識部位は、試料添加部位の下流であって、検出部位の上流に設ければよい。イムノクロマト法用試験片は、さらに対照表示部位が存在していてもよい。対照表示部位は試験が正確に実施されたことを示す部位である。例えば、対照表示部位は、検出部位の下流に存在し、検体試料が検出部位を通過し、対照表示部位に到達したときに着色等によりシグナルを発する。対照表示部には、粒子に結合させた被検物質に結合する親和性物質に結合する物質、例えば抗体を固定化しておいてもよいし、検体試料が到達したときに色が変化するpHインジケーター等の試薬を固定化しておいてもよい。
　本発明のイムノクロマト法は、以下の工程で被検物質の検出を行う。
　本発明のイムノクロマト法においては、最終的に検出部位において、検出部位固定化親和性物質：被検物質：＜親和性物質結合保持粒子：被検物質：親和性物質結合共鳴粒子＞（「：」は結合を示す。「＜＞」でかこまれた部分は親和性物質結合保持粒子、親和性物質結合共鳴粒子のいずれかと被検物質が交互に結合し、これら３物質が枝状に結合している状態を指す。例えば、図１Ｂの保持粒子と共鳴粒子と被検出物質の複合体の状態である。検出部位固定化親和性物質に結合している被検物質と＜親和性物質結合保持粒子：被検物質：親和性物質結合共鳴粒子＞で示す被検物質が同じであっても異なっていてもよい。）で表される複合体（本明細書において、「検出部位において捕捉された被検物質粒子複合体」と呼ぶことがある）を形成させる。検出部位における表面プラズモン共鳴により共鳴粒子による特定波長付近の光の吸収が増加する。この共鳴粒子による特定波長付近の光の吸収は肉眼では呈色、それ以外では（非）吸収ピーク波長として表れ、これらを目視または検出装置により測定することにより、被検物質を検出することができる。この時、検出部位において捕捉された被検物質粒子複合体の最小単位は、保持粒子表面に被検物質を介して結合できる最大数の共鳴粒子が結合した複合体であることが高いシグナルを得る上で好ましく、これが被検物質を介して検出部位固定化親和性物質に結合している必要がある。
　例えば、検体試料中の被検物質を検出するイムノクロマト法においては、試験片上の試料添加部位に検体試料を添加することにより、毛管現象により、親和性物質結合保持粒子と親和性物質結合共鳴粒子を被検物質と一緒に試験片上を展開移動させる。この際、（１）親和性物質結合保持粒子を親和性物質結合共鳴粒子より先に展開移動させ、検出部位において、検出部位固定化親和性物質：被検物質：親和性物質結合保持粒子（「：」は結合を示す）で表される複合体を形成させ、次いで親和性物質結合共鳴粒子を展開移動させ、検出部位において被検物質粒子複合体を形成、表面プラズモン共鳴による共鳴粒子からのシグナルを検出すればよい。あるいは、（２）親和性物質結合保持粒子と親和性物質結合共鳴粒子を同時に展開移動させ、展開移動中に、＜親和性物質結合保持粒子：被検物質：親和性物質結合共鳴粒子＞（「：」は結合を示す。「＜＞」でかこまれた部分は親和性物質結合保持粒子、親和性物質結合共鳴粒子のいずれかと被検物質が交互に結合し、これら３物質が枝状に結合している状態を指す。例えば、図１Ｂの保持粒子と共鳴粒子と被検出物質の複合体の状態である。）で表される複合体を形成させつつ、最終的に検出部位において捕捉された被検物質粒子複合体を形成、表面プラズモン共鳴による共鳴粒子からのシグナルを検出すればよい。
　（１）の場合、イムノクロマト法用試験片の検出部位に、最初に検出部位固定化親和性物質：親和性物質結合保持粒子：被検物質（「：」は結合を示す）で表される複合体が形成され、その後に該複合体に親和性物質結合共鳴粒子が結合し、最終的に、検出部位において捕捉された被検物質粒子複合体が形成される。（１）の場合、最初に親和性物質結合保持粒子と検体を混合し該混合液（第１液）を試験片の添加部位に添加し、イムノクロマト法用試験片上を展開移動させ、その後に親和性物質結合共鳴粒子を含む液体（第２液）をイムノクロマト法用試験片の添加部位に添加し展開移動させればよい。図１に（１）のモデルの複合体形成の模式図を示す。図１においては、イムノクロマト法用試験片の検出部位に固定化する親和性物質、ならびに保持粒子および共鳴粒子に結合させる親和性物質として抗体を用いている。図１Ａは、第１液を添加したときの反応を示し、検出部位に抗体結合保持粒子:被検物質：検出部位捕捉抗体の複合体（「：」は結合を示す）が形成される。図１Ｂは、抗体結合共鳴粒子を含む第２液を添加したときの反応を示し、検出部位に最終的な複合体が形成される。図１において、抗体結合保持粒子、抗体結合共鳴粒子および検出部位捕捉抗体の抗体は同じものであっても、異なるものであってもよい。
　（２）の場合、親和性物質結合保持粒子と親和性物質結合共鳴粒子と被検物質を含む検体を混合し、該混合物をイムノクロマト法用試験片の試料添加部位に添加すればよい。あるいは、親和性物質結合保持粒子および親和性物質結合共鳴粒子をイムノクロマト法用試験片上の同じ標識部位または異なる標識部位に含有させておき、添加した検体試料により親和性物質結合保持粒子と親和性物質結合共鳴粒子を被検物質と共に展開移動させればよい。図２に（２）のモデルの複合体形成の状態を示す。展開移動中に、図２Ａ、ＢおよびＣで表される複合体、あるいはこれらがさらに被検物質を介して結合した複合体が形成され、これらの複合体がイムノクロマト法用試験片の検出部位において捕捉される。本発明のイムノクロマト法では、イムノクロマト法用試験片の検出部位に形成させる複合体として、図２Ｃの複合体が好ましい。図２において、抗体結合保持粒子、抗体結合共鳴粒子および検出部位捕捉抗体の抗体は同じものであっても、異なるものであってもよい。
　なお、親和性物質結合保持粒子の内部または表面の一部にあらかじめ親和性物質を結合させていない共鳴物質を存在させておき、さらに、この親和性物質結合保持粒子に親和性物質結合共鳴粒子を結合させてもよい。この場合、親和性物質結合保持粒子にあらかじめ含まれる共鳴粒子に加え、後で試験片に添加した親和性物質結合共鳴粒子がさらに親和性物質結合保持粒子に結合するため、親和性物質結合保持粒子上の共鳴粒子の集積度が大きくなるので、表面プラズモン共鳴により発生するシグナルはより増感されるので、被検物質をより高感度で検出することができる。
　親和性物質結合保持粒子および／または親和性物質結合共鳴粒子を含む液および試薬を展開移動させるための展開液は、非特異反応を抑制する高分子やタンパク質、緩衝剤、界面活性剤を含有させることが好ましい。含有させる緩衝剤は、試料の添加や濃度の変化、異物の混入によって検出に致命的な影響を生じない緩衝作用を持つものであれば制限はない。好ましくはHEPES緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等であり、特に好ましくは、トリス塩酸緩衝液である。
　本発明は、被検物質に対する親和性物質を結合させた保持粒子および被検物質に対する親和性物質を結合させた共鳴粒子を含む、イムノクロマト法用キットをも包含する。該キットは、さらに、イムノクロマト法用の試験片、ブロッシャー、緩衝液等を含む。前記の親和性物質結合保持粒子および親和性物質結合共鳴粒子は、イムノクロマト用法試験片とは別の試薬として含まれていてもよいし、イムノクロマト法用試験片の標識部位に含まれていてもよい。
　本発明は被検物質に対する親和性物質を結合させた保持粒子および被検物質に対する親和性物質を結合させた共鳴粒子を含む、イムノクロマト法用試験片も包含する、該試験片において、被検物質に対する親和性物質を結合させた保持粒子および被検物質に対する親和性物質を結合させた共鳴粒子を標識部位に含まれる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
＜実施例１＞
試験方法
　共鳴粒子として直径20nmの金コロイド粒子（BBI社、イギリス）および保持粒子として直径400nmの白色ラテックス粒子（JSR社、日本）を購入した。それぞれの粒子にはノロウイルスに対する抗体を固定した。
　イムノクロマト法用ストリップ（白色）は、検出部位にノロウイルスに結合する捕捉抗体を固定し、ポジティブコントロールとして抗マウス抗体をその下流の対照表示部位にそれぞれライン状に固定した。一定濃度の金コロイド粒子、様々な濃度のラテックス粒子、および被検物質であるノロウイルスVLPを1.5%Tx-100含有トリス緩衝液中で混合し、イムノクロマト法用ストリップを直ちに浸し、混合液をイムノクロマト法用ストリップ上に展開移動させた。15分後にサンプルパッド（溶液に接触させる材料部）を切断し、検出エリアについて画像スキャン、得られた画像について図３で示す通り、画像処理ソフトImageJで解析、得られたシグナルピーク面積値について統計ソフトRで有意差検定を行った。
試験結果
　図３に、一定の金コロイド濃度に対して様々な濃度の白色ラテックス粒子を混合させた際のピーク面積を示す。バーはSDを表し、「+」はControlに対し有意の差をもつことを指す（Dunnett's test; p<0.05）。
　図３に示す通り、保持粒子数/共鳴粒子数比が3×10-5において有意にシグナルの増加が認められた。
考察
　白色ラテックス粒子はイムノクロマト法用ストリップと同色であり、本実施例においては検出感度に直接的には貢献しない。そのため、ピーク付近での感度の上昇は白色ラテックス上に金コロイドが密集し、表面プラズモン共鳴の効果を増幅することにより起こったと考えられる。
　ピーク値より左側は最適値に比べ感度の低下がみとめられるが、これは最適値より白色ラテックス粒子の割合が高い場合であり、表面プラズモン共鳴の低下、立体障害による金コロイド表面抗体の結合阻害や物理的に白色ラテックス裏側にある金コロイドを観測視野から隠してしまうなどの効果により感度が低下したと考えられる。
　共鳴粒子/保持粒子数比の最適値は1/12より小さい。この理由としては共鳴粒子/保持粒子粒径比が１より離れていることが第一に考えられる。保持粒子に対し共鳴粒子が接することができる最大数Ｘをa=0.9として再計算すると、Ｘ=4a(r+R)2/r2=1587となり、保持粒子数/共鳴粒子数比最適値は1/1587以下となり本実施例の結果もそれを満たす。本実施例の結果において最適比率がこれよりさらに小さくなった理由としてはウイルス粒子粒径が金コロイド粒子粒径の約2倍であることや、限られた抗原濃度、限られた反応時間などが考えられる。以上の結果より、特定の共鳴粒子/保持粒子数比において共鳴粒子を保持粒子と混合させることにより、共鳴粒子単独より感度が上昇することが明らかとなった。
　また、本実施例では表面プラズモン共鳴の効果をみるために白色ラテックスを用いたが、共鳴粒子と着色あるいは蛍光色素標識された保持粒子の様々な組み合わせで更なる感度の上昇が可能である。
＜実施例２＞
試験方法
　ストレプトアビジンがライン状に固相されたメンブランを用いて、イムノクロマト法を行った。ビオチン化インフルエンザウイルス抗体固相ラテックス粒子（青）、インフルエンザウイルス抗体固相金コロイド粒子（赤）、不活化インフルエンザウイルスを含む1.5%Tx-100含有トリス溶液にメンブランを含浸させた。ネガティブコントロールにはラテックス粒子、金コロイド粒子、ウイルスのいずれかを除いたものを用いた。
試験結果
　図４に、試験結果を示す。
　図４に示す通り、ストレプトアビジン：ビオチン化インフルエンザウイルス抗体固相ラテックス粒子：不活化インフルエンザウイルス：インフルエンザウイルス抗体固相金コロイド粒子（：は結合を示す）複合体の紫色のラインが観察された。ネガティブコントロールは、着色ラインが観察されないか、あるいは青色のラインが観察された。
考察
　保持粒子と共鳴粒子が被検物質を介して結合していることが示唆された。
　インフルエンザウイルスを被検物質として用いた際、本発明が実施可能であることが示唆された。
＜実施例３＞
試験方法
　ストレプトアビジンがライン状に固相されたメンブランを用いて、イムノクロマト法を行った。ビオチン化ノロウイルス抗体固相ラテックス粒子（赤）、ノロウイルス抗体固相金コロイド粒子（赤）、ノロウイルスvirus like particleを含む1.5%Tx-100含有トリス溶液にメンブランを含浸させた。ネガティブコントロールにはラテックス粒子、金コロイド粒子、ウイルスのいずれかを除いたものを用いた。
試験結果
　図５に、試験結果を示す。
　図５に示す通り、ストレプトアビジン：ビオチン化ノロウイルス抗体固相ラテックス粒子：ノロウイルスvirus like particle：ノロウイルス抗体固相金コロイド粒子（：は結合を示す）複合体形成により、複合体を形成しなかった場合に比べ高いシグナルが検出された。 
考察
　共鳴粒子が被検物質を介して保持粒子に結合することにより、検出シグナルが高くなることが示唆された。
　本発明のイムノクロマト法は、被検物質の高感度の検出に利用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (34)

  1. 　表面プラズモン共鳴を起こす共鳴粒子、および共鳴粒子よりもサイズが大きい表面プラズモン共鳴を起こさない保持粒子であって、検体試料中の被検物質と結合する親和性物質が固定化されている共鳴粒子および保持粒子を用いたイムノクロマトアッセイ法であって、
    被検物質と結合する親和性物質結合保持粒子：被検物質：被検物質と結合する親和性物質結合共鳴粒子（「：」は結合を示す）で表される複合体を形成させることにより共鳴粒子を保持粒子上に集積させ、該複合体を被検物質と結合する親和性物質を捕捉物質として固定化したイムノクロマト法用試験片上の検出部位において捕捉し、共鳴粒子および保持粒子からのシグナルを検出することにより被検物質を検出するイムノクロマト法。
  2. 　共鳴粒子が金コロイド粒子である請求項１記載のイムノクロマト法。
  3. 　保持粒子がラテックス粒子である、請求項１または２に記載のイムノクロマト法。
  4. 　あらかじめ表面に共鳴粒子を結合させた保持粒子を用いる、請求項１～３のいずれか１項に記載のイムノクロマト法。
  5. 　あらかじめ共鳴粒子を内包させた保持粒子を用いる、請求項１～３のいずれか１項に記載のイムノクロマト法。
  6. 　共鳴粒子と結合した親和性物質と保持粒子と結合した親和性物質が、被検物質の異なる部位に結合する、請求項１～５のいずれか１項に記載のイムノクロマト法。
  7. 　共鳴粒子数が保持粒子数の12倍以上である、請求項１～６のいずれか１項に記載のイムノクロマト法。
  8. 　共鳴粒子数が保持粒子数のＸ倍以上[Ｘは、保持粒子径=R、共鳴粒子径=rとした時、（3(R+r)2）/r2で表され、ただし粒子径はそれぞれ全方向で測定した際の中央値とする]である、請求項７記載のイムノクロマト法。
  9. 　保持粒子と被検物質を先にイムノクロマト法用試験片に添加し、その後に共鳴粒子を添加する、請求項１～８のいずれか１項に記載のイムノクロマト法。
  10. 　共鳴粒子および保持粒子を被検物質と混合し、イムノクロマト法用試験片に添加する、請求項１～８のいずれか１項に記載のイムノクロマト法。
  11. 　共鳴粒子および保持粒子がイムノクロマト用法試験片の標識部位に含有されている、請求項１～８のいずれか１項に記載のイムノクロマト法。
  12. 　保持粒子が色素で着色または標識されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載のイムノクロマト法。
  13. 　保持粒子の色素の色が共鳴粒子の色（非吸収ピーク）と同系色である、請求項１２記載のイムノクロマト法。
  14. 　保持粒子が蛍光色素を粒子内に含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のイムノクロマト法。
  15. 　保持粒子表面に蛍光色素を結合させた、請求項１～１１のいずれか１項に記載のイムノクロマト法。
  16. 　被検物質が、生体中に存在する抗原または抗体である、請求項１～１５のいずれか１項に記載のイムノクロマト法。
  17. 　被検物質が、病原性微生物およびその一部である、請求項１～１５のいずれか１項に記載のイムノクロマト法。
  18. 　被検物質に対する親和性物質を結合させた保持粒子および被検物質に対する親和性物質を結合させた共鳴粒子を含む、イムノクロマト法用キット。
  19. 　共鳴粒子が金コロイド粒子である請求項１８記載のイムノクロマト法用キット。
  20. 　保持粒子がラテックス粒子である、請求項１８または１９に記載のイムノクロマト法用キット。
  21. 　あらかじめ表面に共鳴粒子を結合させた保持粒子を用いる、請求項１８～２０のいずれか１項に記載のイムノクロマト法用キット。
  22. 　あらかじめ共鳴粒子を内包させた保持粒子を用いる、請求項１８～２０のいずれか１項に記載のイムノクロマト法用キット。
  23. 　共鳴粒子と結合した親和性物質と保持粒子と結合した親和性物質が、被検物質の異なる部位に結合する、請求項１８～２２のいずれか１項に記載のイムノクロマト法用キット。
  24. 　共鳴粒子数が保持粒子数の12倍以上である、請求項１８～２３のいずれか１項に記載のイムノクロマト法用キット。
  25. 　共鳴粒子数が保持粒子数のＸ倍以上[Ｘは、保持粒子径=R、共鳴粒子径=rとした時、（3(R+r)2）/r2で表され、ただし粒子径はそれぞれ全方向で測定した際の中央値とする]である、請求項２４記載のイムノクロマト法用キット。
  26. 　共鳴粒子および保持粒子がイムノクロマト用法試験片の標識部位に含有されている、請求項１８～２５のいずれか１項に記載のイムノクロマト法用キット。
  27. 　被検物質に対する親和性物質を結合させた保持粒子および被検物質に対する親和性物質を結合させた共鳴粒子を標識部位に含む、イムノクロマト法用の試験片。
  28. 　共鳴粒子が金コロイド粒子である請求項２７記載のイムノクロマト法用の試験片。
  29. 　保持粒子がラテックス粒子である、請求項２７または２８に記載のイムノクロマト法用の試験片。
  30. 　あらかじめ表面に共鳴粒子を結合させた保持粒子を用いる、請求項２７～２９のいずれか１項に記載のイムノクロマト法用の試験片。
  31. 　あらかじめ共鳴粒子を内包させた保持粒子を用いる、請求項２７～２９のいずれか１項に記載のイムノクロマト法用の試験片。
  32. 　共鳴粒子と結合した親和性物質と保持粒子と結合した親和性物質が、被検物質の異なる部位に結合する、請求項２７～３１のいずれか１項に記載のイムノクロマト法用の試験片。
  33. 　共鳴粒子数が保持粒子数の12倍以上である、請求項２７～３２のいずれか１項に記載のイムノクロマト法用の試験片。
  34. 　共鳴粒子数が保持粒子数のＸ倍以上[Ｘは、保持粒子径=R、共鳴粒子径=rとした時、（3(R+r)2）/r2で表され、ただし粒子径はそれぞれ全方向で測定した際の中央値とする]である、請求項３３記載のイムノクロマト法用の試験片。
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