JP2603422B2 - 分析物の測定方法および測定手段 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明の主題は、試料中のヒドロ
ラーゼ活性を有する物質の濃度を測定するための新規な
方法および前記の方法を実施するための手段並びにヒド
ロラーゼと分析物に結合し得る物質を含む複合体の助け
により体液中の分析物を測定する方法および前記の方法
のための試験手段である。

【０００２】

【従来の技術】最近の診断用薬において、ヒドロラーゼ
活性を有する物質の測定が次第に重要になってきてい
る。これはヒドロラーゼを検出するための試験および免
疫試験に当てはまる。臨床診断用薬において、血液中の
ヒドロラーゼを検出するための試験は、例えば、生体機
能の調節に重要な役割を果たす。

【０００３】最近、標識酵素としてヒドロラーゼを使用
する免疫学的方法が体液中の分析物濃度を測定するのに
使用されている。或る種の成分の存在は、被試験者の健
康の状態に関する結論を可能にする。しばしば、代謝障
害は個々の代謝産物の濃度に関して直接の影響を与え
る。それ故、代謝産物の定性分析および定量分析のため
の方法を有することが重要である。

【０００４】個々の成分は異なる特性を有しているため
に、分析方法もまた互いに大きく異なっている必要があ
る。これらの試験方法はしばしば或る一種の成分に関し
て特異的に適応される。そしてその機能に密接に関連す
る成分の特性がしばしば利用される。例えば、酵素はそ
の酵素活性を測定することにより体液中で検出し得る。
この酵素活性は、通常、適当な基質を添加することによ
り測定される。その反応の進行中に、反応混合物のUV吸
収がUV吸収物質の形成または排除の結果として変化す
る。次に、この吸収の変化は分析されるべき成分の濃度
または濃度変化に関して表し得る。

【０００５】最近の方法において、体液中の成分の分析
に免疫学的工程が含まれる。このことはハプテン、抗原
および抗体の測定に特に当てはまる。免疫反応は、免疫
学的パートナーの間、即ち一方で抗原であるハプテンと
他方での抗体との間の基本的な反応の正確な化学量論に
より特に区別される。更に、モノクローナル抗体の使用
が検出の特異性を大きく改良した。

【０００６】当業者には免疫学的アッセイの多数の方法
が知られている。実用的目的から、均一イムノアッセイ
と不均一イムノアッセイの間に区別がなされる。均一法
は全ての検出反応が溶液中で起こるという事実に基いて
いるが、不均一法における免疫学的に反応性の化合物
（例えば、ハプテン、抗原、抗体またはこれらの化合物
で形成される免疫複合体）は二相に分離される。成分の
一部、例えば分析されるべき免疫学的に反応性の成分は
アッセイの開始時に溶液中にあるが、その他の部分は不
溶性キャリヤー物質に吸着、共有または沈殿により結合
し得る。不均一イムノアッセイはさらに種々の別法に分
けられ、当業者はこれらの別法中から測定されるべき分
析物に応じた最も適した別法を選択し得る。従来技術に
おいて使用された種々方法の総説がHubbuch ら(Springe
r Verlag Berlin Heidelbergにより1986年に発行された
Progress in Clinical Chemistry and Medicine,Vol.4,
p.109 以下) に見られる。これらの例として、下記のア
ッセイが挙げられる。 −競合イムノアッセイ 未知の量の分析物を含む試料が、標識を有する既知の量
の分析物と一緒に、不溶性キャリヤー物質（これには分
析物の免疫パートナーが上記の方法により既知の量でか
つ不足状態で結合されている）と接触させられる。免疫
反応中に、分析物の一部と標識分析物の一部がこうして
有効に結合され、その結果、液相と固相の分離後に、そ
れは固相に付着されて残る。検出可能なインジケータ反
応において固相または液相中で測定された標識の量は、
測定されるべき分析物の濃度の関数である。この濃度は
二相中の標識の分布から測定し得る。

【０００７】このような競合イムノアッセイの例は欧州
特許第75379 号明細書に記載されている。 −非競合イムノアッセイ a)未知の量の分析物を含む試料が、過剰の量の相応する
標識免疫パートナーと共に、固相に結合している更に過
剰の量の分析物または分析物類縁体に接触させられる。
初期の免疫反応中に分析物と反応しなかった過剰量の免
疫パートナーは、こうして固相に結合される。固相の分
離後に、液相は分析物の初期濃度に比例する量の標識を
含む。

【０００８】このようなイムノアッセイの例は米国特許
第4,446,232 号明細書に示されている。 b)更に別のイムノアッセイでは、分析物を含む試料が、
過剰量の相応する免疫パートナー（これは上記の方法で
固相に結合されている）と接触させられる。続いて、過
剰量の標識免疫パートナー（これは分析物の別の部分に
特異的である）が添加される。免疫反応後に、過剰の標
識免疫パートナーが洗浄により固相から除去される。固
相で測定された標識の量は、試料中に含まれた分析物の
量に比例する。このような例は米国特許第4,098,876 号
明細書に記載されている。

【０００９】分析物を測定するこれらの免疫学的方法に
おいて、ハプテン、抗原または抗体が分析物として利用
でき、そして抗体、ハプテンおよび抗原が免疫パートナ
ーとして利用できる。上記のイムノアッセイは全て、酵
素標識または放射能標識された免疫学的に活性な化合物
（これは測定される分析物濃度に所定の関係で存在す
る）の濃度の測定に基いている。

【００１０】酵素標識の量を測定するために、適当なイ
ンジケータ酵素基質が溶液（これは特有の量のインジケ
ータ酵素を含む）に添加される。このインジケータ酵素
基質は、その濃度の変化が検出できるように選ばれる。
この要件は、特に、特徴的な光吸収、蛍光の発光を示す
基質により、またはインジケータ反応から得られるその
生産物が特徴的な光吸収、発光または蛍光を示す基質に
より満足される。ヒドロラーゼがまたインジケータ酵素
として使用されることもある。この場合に使用される基
質は、ヒドロラーゼの検出の場合のように、水の添加の
もとにヒドロラーゼにより開裂し得る化合物である。そ
の結果物は検出可能な生産物である。インジケータ酵素
としてβ−ガラクトシダーゼで標識する量を測定するた
めの基質の例は欧州特許出願第0146866 号のクロロフェ
ノールレッド- β-D- ガラクトシドである。

【００１１】小さい分析物濃度は少量の検出されるべき
標識を伴う。従って、試料中に存在するインジケータ酵
素の活性および時間単位当たりに反応した酵素基質の量
はまた非常に小さい。それ故、酵素基質の濃度の変化
は、それが検出し得るように顕著になるまでに時間がか
かる。そのアッセイの延長期間中の外部の影響（温度変
化、等）が測定の誤り率を増大することがある。

【００１２】小さい分析物濃度で見られる問題は、或る
種の方法を使用することにより減少し得る。例えば、基
質またはインジケータ反応の生産物の濃度の変化により
発生したシグナルの強さ（これは、順に酵素標識により
生じた）は、ランベルト・ベールの法則の適用による電
磁放射線の検出の測定距離が増大される場合に増大し得
る。しかしながら、これはかなり大きい試料容積の使用
を必要とする。一方で、このような大きい試料容積を用
いる方法を実施する場合には、大きくかつ不十分な操作
能を示す装置を必要とする。

【００１３】他方で、大きい試料容積を使用することが
不可能でありかつ所望されない場合もある。このこと
は、特に、体液中の分析物の直接測定に当てはまり、こ
の場合アッセイに１滴の液体のみを使用する方法が特に
有利であることが立証されている。それ故、例えばドイ
ツ特許第3247608 号の所謂乾燥試験では、大きい試料容
積を用いる方法は使用できない。

【００１４】標識の量が分析物濃度に反比例するような
免疫学的アッセイ方法が選ばれる場合、結果としての誤
り率は非常に小さい分析物濃度に関してかなり高い。当
該方法はこのような場合に推奨されない。上記のアッセ
イによれば、ヒドロラーゼ活性を有する物質、ひいては
体液中の分析物は、使用されるアッセイに応じて或る最
小濃度までしか測定し得ない。しかしながら、体液は更
に小さい濃度で存在しかつその測定が所望される成分を
含む。通常の方法によれば、これらの成分の濃度は全く
測定できないか、または大きな不正確さで測定し得るに
すぎない。

【００１５】イムノアッセイの感度を増大するために、
欧州特許第0060123 号はアルカリホスファターゼと抗体
の複合体により誘発される反応サイクルの使用を提案し
ている。酵素標識のために、NADPはNAD に変換される。
次にその反応サイクル中で、アルコールデヒドロゲナー
ゼがNAD をNADHに還元し、そしてテトラゾリウム塩が色
の形成のもとにNADHを逆にNAD に酸化する。この方法の
欠点は、それが全血では使用し得ないことである。なぜ
なら、それはそれ自体で種々の量でかつかなりの濃度の
ホスファターゼ、デヒドロゲナーゼおよびNADHを含むか
らである。これらの物質は複合体の検出を誤らせる。こ
の方法の別の欠点は、酵素基質、酵素またはコファクタ
ーの如き多数の試薬がこの方法の実現を複雑にし、そし
て安定性の問題をもたらすことである。

【００１６】また、欧州特許出願第0027036 号は、二つ
の酵素系を包含する増幅原理を提案している。この原理
の欠点は、その第二の酵素系が体液（そこでは、これら
の酵素の幾つかが種々の量で存在する）中に広く分布さ
れている酵素と作用することである。その事実が誤った
結果をもたらす。更に、この増幅反応を簡単な方法で停
止することは不可能である。一の酵素のみがインジケー
タ反応に使用し得るにすぎない。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】それ故、本発明の目的
は、上記の欠点を回避しながら、ヒドロラーゼ活性を有
する物質の濃度を測定する更に感度のよい方法を提供す
ることである。驚くことに、ヒドロラーゼ活性を有する
物質の濃度を測定するための方法の感度をかなり増大さ
せることが可能であることがわかった。感度の増大のた
めの手段は増幅因子である。これは、何モルの検出可能
な単位（例えば、着色分子）が分析物１モル当たりに遊
離されるかを示す。

【００１８】

【課題を解決するための手段】それ故、本発明の主題
は、試料中のヒドロラーゼ活性を有する物質の検出方法
であって、その試料を不溶性キャリヤー物質に結合され
たインジケータ酵素（該インジケータ酵素はヒドロラー
ゼ活性により可溶性にし得る）と接触させ、次に開裂さ
れたインジケータ酵素を分離し、そしてその酵素活性を
測定することを特徴とするヒドロラーゼ活性を有する物
質の検出方法である。

【００１９】更に、本発明は、試料中のヒドロラーゼ活
性を有する物質を検出するための手段をも開示する。該
手段は、不溶性キャリヤー物質に結合されておりそして
ヒドロラーゼ活性により可溶性にし得るインジケータ酵
素を含む。ヒドロラーゼ活性を有する物質は、ヒドロラ
ーゼそれ自体であるだけでなく、その他の所望の化学物
質とのヒドロラーゼの可溶性化合物であると理解され
る。

【００２０】ヒドロラーゼは主門３の天然産酵素または
人工的に合成された酵素を含む。それらは水を消費しな
がら特有の物質を開裂することができる。それらは、例
えば、エステラーゼ、ペプチダーゼ、およびグリコシダ
ーゼを含む。特に好適なヒドロラーゼは、エンドグリコ
シダーゼ、エンドペプチダーゼ、等の如き細胞内酵素と
の複合体を含む。（細胞内酵素という用語は、それらが
特異的である基質の末端から開裂しない酵素を表す）。
炭水化物を開裂する酵素、例えば、デキストラナーゼ、
アルギナーゼ、アガラーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ
またはキチナーゼからなる複合体が特に有効であること
がわかった。

【００２１】その他の化学物質とのヒドロラーゼの化合
物は、特に、ヒドロラーゼと免疫学的に活性な物質、例
えば、抗原、ハプテンもしくは抗体または免疫複合体、
またDNA の如き核酸との組み合わせを含む。これらの物
質は、以下、ヒドロラーゼ標識化合物またはヒドロラー
ゼ複合体と称される。本発明の方法の第一工程は、ヒド
ロラーゼ活性を有する物質を含む試料をインジケータ酵
素（これは不溶性キャリヤー物質に結合されている）と
接触させることである。

【００２２】ヒドロラーゼ活性を有する物質が検出し得
る試料は水溶液であると理解されることが好ましい。こ
れらの溶液は、例えば、水中にヒドロラーゼまたはヒド
ロラーゼ複合体の溶液を含むことができる。これらの溶
液はしばしば、例えば、貯蔵安定性を増大するために
塩、洗剤、等の如き混合物を含む。また、本発明の方法
は、この種の溶液を分析する場合に適用し得る。また、
その液体試料は体液または成分を添加または分離するこ
とによりこのような体液から得られたその他の液体であ
ってもよい。これらの例として、血液、血液血漿、血清
または尿が挙げられる。

【００２３】好ましい液体試料はイムノアッセイの進行
中に生産されるような液体であってもよい。それらは、
例えば、Annals of Clinical Biochemistry(1979) 16:2
21に記載されており、そしてその有利な更なる開発がイ
ムノアッセイの分野の当業者に知られている。これらの
方法では、生物特異的反応のパートナー、例えば、試験
で検出される分析物の抗体または分析物の競合パートナ
ーの抗体と、標識酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼ
からなる複合体が使用される。測定反応において、得ら
れる液体中の標識酵素の濃度がその酵素活性に関して測
定される。このような液体では、ヒドロラーゼ活性を有
する物質、特にヒドロラーゼと上記の化合物の複合体
を、本発明の方法を使用することにより検出することが
可能である。通常、これらの溶液は緩衝剤物質、安定
剤、湿潤剤、等を含むが、これらは検出を妨害しない。

【００２４】この場合、体液中に通常見られないヒドロ
ラーゼ複合体を使用することが好ましい。それらは上記
のヒドロラーゼ、そして特に、デキストラナーゼ、アル
ギナーゼ、アガラーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼおよ
びキチナーゼを含む。デキストラナーゼが特に好まし
い。本発明で理解されるようなインジケータ酵素は、そ
の酵素活性がこの酵素の一種または数種の基質により測
定し得るあらゆる酵素である。特に、酵素−基質反応に
基いている全ての既知のインジケータ反応を使用するこ
とが可能である。それらは、例えば、直接に検出できる
生産物を生産する反応を含むが、また検出可能なシグナ
ルを生じるために中間工程を必要とする反応を含む。付
加的な工程が後に行われる反応に使用される基質は、例
えば、別のインジケータ酵素が結合されるキャリヤー物
質であってもよい。色の変化を生じる反応または着色化
合物が生成され、または消失するような反応が特に有益
であると判明した。当業者はこのような酵素およびそれ
らの相当する基質をよく知っている。インジケータ酵素
／基質の例は、β−ガラクトシダーゼ／β−ガラクトシ
ド、ペルオキシダーゼ／ペルオキシドおよびホスファタ
ーゼ／ホスフェートである。このような試験に特に好ま
しいインジケータ酵素は、試料中に全く含まれないか、
またはごくわずかの量で含まれ、かつその活性がヒドロ
ラーゼを有する物質の活性と異なる酵素である。好適な
インジケータ酵素は、その基質特異性がヒドロラーゼ活
性を示す物質の基質特異性と異なる酵素である。

【００２５】更に、好ましいインジケータ酵素は、その
基質特異性がヒドロラーゼ活性を有する物質により実質
的に損なわれない酵素である。これが実際にその場合で
あるか否かという問題は、必要により二三の実験に基づ
き当業者により回答し得る。例えば、β−ガラクトシダ
ーゼは、デキストラナーゼが検出されるヒドロラーゼ活
性を有する物質である場合に、インジケータ酵素として
良好と判明した。

【００２６】ヒドロラーゼ活性を有する物質を含む試料
を添加する前に、このインジケータ酵素はキャリヤー物
質（これは試料に不溶性である）に結合され、こうして
固定化され、その結果、また不溶性にされる。キャリヤ
ー物質およびインジケータ酵素をキャリヤー物質に結合
する方法は、インジケータ酵素が、ヒドロラーゼ活性を
有する物質の効果の結果として、遊離され、そして可溶
性にされるように選ばれる。以下が特に好ましい場合で
ある。 −キャリヤー物質は、それがヒドロラーゼ活性を有する
物質により完全に、または部分的に加水分解し得るよう
に選ばれる。この場合、選ばれたキャリヤー物質はヒド
ロラーゼ活性を有する物質中に含まれるヒドロラーゼの
基質である。キャリヤー物質は分解されるので、これに
結合されたインジケータ酵素は遊離され、そして反応液
に溶解する。

【００２７】長鎖多糖または多糖類縁体、特にデキスト
ラン、デキストランスルフェート、アルギン酸、アガロ
ース、ペクチン、ペクチン酸、キチンおよびカルボキシ
メチルセルロースがキャリヤー物質として良好と判明し
た。長鎖ペプチドがエンドペプチダーゼに関して使用し
得る。この場合、エンドペプチダーゼがインジケータ酵
素それ自体を侵食しないことが確保される必要がある。

【００２８】デキストランという用語は、通常、デキス
トランとして知られている多糖並びに変性デキストラン
および架橋デキストラン、例えば、セファデックス（商
標）を表す。変性デキストランは、例えば、アミノ基ま
たはカルボキシル基の如き更に組み込まれた官能基を有
するデキストランである。それらは過ヨウ素酸カリウム
によるデキストランの部分酸化および1,n-ジアミノアル
カン、特に1,6-ジアミノヘキサン、２価の酸アミド、特
にスクシンジアミドまたは1,n-アミノアルカン酸、特に
6-アミノヘキサン酸との反応、続いて例えばホウ水素化
ナトリウムによる還元反応により得られる。

【００２９】これはデキストランの付加的な架橋の導入
を可能にして、例えば、それらの溶解性を更に低下す
る。好ましいデキストランまたはデキストランスルフェ
ートは約40,000D 〜500,000Dの分子量、110,000D〜250,
000Dの範囲の特に好ましい分子量、および20 x 10⁶D 〜
500 x 10⁶Dの間に架橋を有する。それ故、デキストラ
ン、ペクチンまたはセルロースを開裂する酵素、例え
ば、デキストラナーゼ、ペクチナーゼ、アルギナーゼお
よびアガラーゼがヒドロラーゼ活性を有する物質として
特に適している。 −その他の好適なキャリヤー物質は、上記の物質とその
他の無機または有機のキャリヤー物質、例えば、ポリア
ミド、ポリエステルおよびシラン化された二酸化チタン
の化合物である。デキストラン化合物がキャリヤー物質
として使用される場合、100 x 10⁶D〜500 x 10⁶Dの範囲
の特に有利な分子量を有する上記のデキストランが使用
し得る。また、ヒドロラーゼ活性を有する物質は上記の
ものである。

【００３０】これらのキャリヤー物質は購入することが
でき、またはよく知られている方法で当業者に利用でき
る。キャリヤー物質を含むポリエステルは、例えば、ポ
リエステルのエステル基のケン化、N-ヒドロキシスクシ
ンイミドによる活性化および上記のデキストラン、デキ
ストランスルフェート、等との反応により生成し得る。

【００３１】ポリアミドまたはトリエトキシシリルプロ
ピルアミンでシラン化された二酸化チタンは、遊離NH₂-
基を介してデキストランまたはデキストランスルフェー
トにカップリングし得る。また、デキストランへの無機
または有機のキャリヤー物質のカップリングは、過ヨウ
素酸カリウムによるデキストランの部分酸化、続いて無
機または有機のキャリヤー物質との反応により行い得
る。

【００３２】インジケータ酵素は、下記の方法で、こう
して得られたデキストランもしくはデキストランスルフ
ェートを含むキャリヤー物質および専らデキストランも
しくはデキストランスルフェートからなるキャリヤー物
質にカップリングし得る。 −キャリヤー物質が過ヨウ素酸カリウムで活性化され、
そしてインジケータ酵素と反応させられる。

【００３３】−キャリヤー物質がカップリング試薬およ
びインジケータ酵素と反応させられる。 −キャリヤー物質がベンゾキノンまたはその誘導体、例
えば、クロロアミドと反応させられ、続いてインジケー
タ酵素と反応させられる。 −変性デキストランの遊離アミノ基が3-マレイミドベン
ゾイル-N- スクシンイミド(MBS) の助けにより活性化さ
れ、そして特にそのスルフヒドリル残基を介してインジ
ケータ酵素にカップリングされる。

【００３４】インジケータ酵素がカップリングされる不
溶性キャリヤー物質は、あらゆる所望の形態で、例え
ば、ティッシュー、フリース、粉末、粒子として、また
は容器として存在してもよい。単位時間当たりに反応液
に溶解されるインジケータ酵素の量は、反応液に含まれ
るヒドロラーゼ活性を有する物質の量に比例し、それ
故、イムノアッセイの場合にはまた試料中の分析物の濃
度に比例する。前提条件は、キャリヤー物質に結合され
たインジケータ酵素の量が充分な量の開裂可能なインジ
ケータ酵素を与えるのに充分であることである。当業者
は、二三の簡単な試験でインジケータ酵素を含むキャリ
ヤーの必要量を決定することができる。

【００３５】反応液に溶解されているインジケータ酵素
は、その後、不溶性キャリヤー物質に結合されているイ
ンジケータ酵素から分離される。これは、反応液を除去
することにより、例えば、真空吸引、ピペット操作、濾
過、デカント、遠心分離等により特に簡単な方法で行わ
れる。こうして、更に多くのインジケータ酵素が、最終
的に反応液に溶解し得るヒドロラーゼ活性を有する物質
により別の反応液中で可溶性にされることは、最早不可
能である。これは有利である。何となれば、その反応は
特に簡単な方法で所定時間でこうして停止し得るからで
ある。

【００３６】キャリヤー物質から分離された溶液中に含
まれる遊離インジケータ酵素の量を測定するために、前
記の溶液が、所定時間で、それぞれのインジケータ酵素
に関して一定であり、また当業者に知られている条件の
もとに適当な基質に添加される。基質の消費量および生
産物の生成量が、その後、所定時間で測定される。欧州
特許出願第0146866 号明細書はβ−ガラクトシダーゼに
関するこのような検出可能なインジケータ反応の例を記
載している。

【００３７】色素産生の基質を使用する場合、その反応
の進行が目視で監視し得る。例えば蛍光光度計または反
射率光度計の如き光度計のような測定装置の助けにより
定量分析を行うことが実施可能である。遊離インジケー
タ酵素の濃度は、ヒドロラーゼ活性を有する物質の量に
関して正確に測定される目安である。

【００３８】インジケータ反応の結果をヒドロラーゼ活
性を有する物質の或る濃度と相関させるために、同一条
件下で異なるが既知の濃度で試料の較正曲線を作成する
ことが好ましい。未知の濃度を有する試料を使用して同
一条件下でインジケータ反応から結果を得た後に、測定
すべき濃度が較正曲線から直接読み取ることができる。

【００３９】正確な結果に重要な条件は、インジケータ
反応に使用された基質とキャリヤー物質に未だ結合され
ているインジケータ酵素の間の接触を、可能な限り、避
けることである。これは、通常、本発明によれば、結合
されたインジケータ酵素から遊離インジケータ酵素を空
間上分離することにより行われる。更に、結果の信頼性
は、インジケータ酵素を含む溶液が添加される基質が固
体マトリックスに結合される場合に更に増大し得る。こ
のマトリックスは試薬フィルムまたはティッシュー、紙
もしくは粒子であってもよい。

【００４０】基質は、インジケータ酵素との反応が実質
的に悪影響されないように結合される。これは、基質
を、例えば、スペーサーにより結合することにより行い
得る。しかしながら、基質とその反応に必要な試薬がま
た、乾燥形態で、マトリックス上の被覆物として、また
は混合物の凝集の固体状態へと導く物質との混合物とし
て溶液中に存在してもよい。これらの物質（また“構造
形成剤" として知られている）は混合物の容易な取扱お
よび操作を可能にする。

【００４１】その方法は、関与する反応、特に酵素反応
に整合するように最適化された条件下で行われる。その
温度は、反応速度が未だ充分に高い間に酵素が失活され
ないように選ばれる。好ましい温度範囲は18℃〜42℃、
特に25℃〜37℃である。個々の反応工程のpH値は同じで
あってもよくまた異なっていてもよい。全ての関与酵素
は或る最適pHを有するので、この値付近で実施すること
が有利である。例えば、デキストラナーゼの最適pHは6.
0 であり、ペクチナーゼの最適pHは4.0であり、セルラ
ーゼに関してそれは5.0 であり、β−ガラクトシダーゼ
に関して7.4 である。それ故、充分に速い速度を可能に
するpH範囲は3.0 〜9.0 、特に3.5 〜8.0 である。しか
しながら、緩衝剤をそれに応じて変化することによりそ
れぞれの反応工程のpHを最適にすることがまた可能であ
る。

【００４２】本発明の方法は非常に感度が良いので、非
常に迅速な濃度測定を行うことがまた可能である。その
方法の速度は、増幅因子が増大するにつれて増大する。
一般に言えば、測定は１時間未満、好ましくは10分未満
で行うことができる。本発明の方法の感度は通常の条件
下でヒドロラーゼ活性を有する物質の10^-12モル/lまで
の濃度さえもが10分以内に検出し得るようなものであ
る。勿論、更に高い濃度を検出することがまた可能であ
り、この場合には結果が更に短い期間内に入手できる。
これは臨床診断用薬に関して大きな利点である。

【００４３】本発明の方法の更なる利点として、その簡
単な実施；それがほんの少数の成分即ちキャリヤー物質
に結合されたインジケータ酵素およびインジケータ反応
で測定可能なシグナルを生じるインジケータ酵素用の基
質を伴うという事実（これは増大された安定性の原因で
あり、そして二次反応の機会を少なくする）；更に、或
るインジケータ反応を選択することにより、その方法
は、例えば体液のその他の成分が予測されない方法で反
応に影響しないように調節し得るという事実、が挙げら
れる。

【００４４】本発明の方法は所謂テスト・ストリップで
使用されるのに特に適している。テスト・ストリップは
基本的にはベース・プレートまたはホイル（これに、ア
ッセイに必要な試薬がフリースまたはフィルムにより付
着されている）からなる。インジケータ酵素が結合され
ているキャリヤー物質は、試験される試料が適用される
フリースのような形状にされることが有利である。その
他のフリースまたはフィルムが、インジケータ反応に必
要な試薬を保持する。このフリースでは、試験が目視ま
たは光度計により直ちに評価し得る。

【００４５】利点として、例えば、その方法が簡単かつ
安価であり、しかも信頼できる結果を与えることが挙げ
られる。また、その方法は所謂湿式試験として行うこと
ができる。このような湿式試験では、個々の反応工程が
１個または数個のチューブ（反応容器、キュベット）中
で行われ、試薬が溶液の形態で添加されることが好まし
い。少なくとも一つの固相、即ち、上記のキャリヤー物
質の一つの固相（インジケータ酵素がそれに結合されて
いる）がいずれにしても必要である。これは、例えば、
チューブ壁に被覆でき、または粒子の形態で使用し得
る。

【００４６】ヒドロラーゼ活性を有する物質を検出する
本発明の方法は、特に、分析物の検出のためのイムノア
ッセイの如きアッセイに使用し得る。イムノアッセイの
分野の当業者はこのような方法をよく知っている（例え
ば、Annals of Clinical Biochemistry(1979),16:221)
。これらの方法は、インジケータ酵素複合体がヒドロ
ラーゼ複合体により置換され、次にその複合体の必要と
される検出が本発明の方法で測定されるように改良され
る。

【００４７】当業者は酵素標識免疫パートナーおよびヒ
ドロラーゼ標識免疫パートナー、例えば、ハプテン、抗
原、抗体および抗体フラグメントの合成に関する方法を
よく知っており、または既知の方法と同様にこれらの方
法を行うことができる。分析物はハプテン、抗原および
抗体であると理解される。ハプテンは、比較的低分子量
の物質であり、これらは抗体により認識されるが、それ
自体で免疫反応を誘発することができない。ハプテンの
例として、チロキシン(T4)、トリヨードチロニン(T3)の
如き内在性物質、またはジゴキシン、テオフィリンもし
くは薬剤（麻酔薬）の如き治療上活性な化合物が挙げら
れる。

【００４８】抗原は、抗体により認識され、かつ免疫反
応を誘発し得るタンパク質である。これらのタンパク質
は天然産の物質または人工的に合成された物質であって
もよい。また、抗原は、その他の抗体により抗原として
認識される抗体を含む。生体中の測定が重要である抗原
は、例えば、チロトロピン(TSH) 、ろ胞刺激ホルモン(F
SH) 、黄体形成ホルモン(LH)、ヘモグロビン(Hb)、ヒト
コリオゴナドトロピン(hCG) 、免疫グロブリンＧ、ヒト
血清アルブミン(hSA) 、癌胎児性抗原(CEA) 、α−胎児
蛋白(AFP) およびまた酵素である。更に、抗原はタンパ
ク質の天然誘導体、例えば、糖タンパク質またはタンパ
ク質とその他の化学化合物からなる人工的に生産された
化合物を含む。

【００４９】抗体は、上記の抗原またはハプテンを結合
し得る免疫グロブリンであると理解される。分析物が抗
原またはハプテンである場合、下記の方法が特に良好と
判明した。 −分析物の抗体（分析物に特異的な物質）とヒドロラー
ゼを含む過剰量の複合体溶液が試料溶液（これは分析物
を含む）に添加されて分析物と複合体からなる免疫複合
体を生産する。免疫反応で、過剰の複合体がキャリヤー
（これには、過剰量の分析物または分析物類縁化合物が
結合されている）に結合される。分析物類縁化合物は、
反応パートナーとのその相互作用、例えば、免疫反応が
分析物の相互作用に似ている化合物である。分析物類縁
体の一般構造は分析物の一般構造とごくわずかに異なっ
ている。また、分析物類縁化合物は抗イディオタイプ抗
体であってもよい。

【００５０】抗イディオタイプ抗体は抗体の抗原結合部
位に対して誘導され、そして分析物と同じ方法でこの結
合部位と反応する。ヒドロラーゼの複合体および免疫複
合体を含む溶液がキャリヤーから分離され、本発明の方
法にかけられる。ヒドロラーゼ複合体に関して得られた
結果から結論が分析物の存在および量に関して出され
る。この実施態様が特に好ましい。何となれば、それは
複合体およびキャリヤー物質の正確な測定を必要としな
いからである。好ましい抗体はモノクローナル抗体であ
る。フラグメント、例えばFab フラグメントが特に好ま
しい。Fab:酵素の化学量論は1:2 〜1:4 の範囲である。

【００５１】−分析物の抗体（分析物に特異的な物質）
とヒドロラーゼを含む所定量の複合体が分析物を含む試
料溶液に添加され、前記の量は存在すると予想される分
析物の量よりも過剰である。複合体の量が知られてい
る。得られる生産物は分析物と複合体からなる免疫複合
体である。複合体の残りの過剰量が免疫反応でキャリヤ
ー（これには、複合体の抗体よりも分析物のその他の結
合部位を認識する過剰量の分析物の抗体（分析物に特異
的な物質）が結合されている）に結合される。過剰量の
ヒドロラーゼと抗体の複合体を含む溶液がキャリヤーか
ら分離され、そしてその溶液に含まれる抗体とヒドロラ
ーゼの複合体が本発明の方法に従って検出される。

【００５２】−分析物または分析物類縁体とヒドロラー
ゼを含む既知の量の複合体が、分析物を含む試料溶液に
添加される。その混合物がキャリヤー（これには、既知
の不足量の分析物の抗体（分析物に特異的な物質）およ
び分析物類縁体が結合されており、この不足量は分析物
と複合体の合計に基いている）に適用される。分析物と
複合体の一部がキャリヤーに結合される。本発明の方法
に従って、溶液に含まれる複合体は、溶液が一旦分離さ
れると、検出し得る。

【００５３】分析物が抗体である場合には、同じ原理が
適用される。しかしながら、上記の方法に記載された抗
体は抗原または前記の抗体の抗体により置換される必要
がある。分析物の検出のための免疫学的試験において、
本発明のヒドロラーゼ複合体の検出の後に評価操作が行
われる。最初の試料中の分析物の存在、または定量評価
の場合には、その量が検出されたヒドロラーゼ複合体の
存在または量から結論し得る。これは、例えば、較正曲
線により行い得る。

【００５４】ヒドロラーゼ活性を有する物質を検出する
本発明の方法の利点はまた分析物を検出するこの免疫学
的方法にも有効であろう。特別な利点は、ヒドロラーゼ
活性を有する物質が分析される溶液に含まれないヒドロ
ラーゼ活性を示すことである。非常に簡単な手段で誘発
し得る増幅効果を有するので、本発明の方法はまた試
料、例えば、体液中にごく少量で存在する分析物に適し
ている。

【００５５】この免疫学的試験はテスト・ストリップと
関連して有利に使用し得る。また、本発明の方法は、酵
素標識核酸の助けによる核酸の検出方法、例えば、核酸
ハイブリダイゼーション試験に同様に適用し得る。その
場合、酵素標識は、本発明の方法を適用することにより
検出されるヒドロラーゼである。核酸は特にDNA を意味
する。

【００５６】本発明のその他の主題は、標識酵素と分析
物に結合し得る物質を含む複合体を使用する体液中の分
析物の検出または測定方法である。使用される標識酵素
は、体液中で通常生じないヒドロラーゼである。或る量
のこのヒドロラーゼ複合体（前記の量は分析物の量に特
有である）が、不溶性キャリヤー物質に結合されたイン
ジケータ酵素と接触させられる。ヒドロラーゼの効果の
結果として、インジケータ酵素はまた分析物の量に依存
して開裂される。次に、開裂されたインジケータ酵素が
キャリヤー物質から分離され、そしてこのインジケータ
酵素の活性が測定される。

【００５７】本発明の更に別の主題は、液体試料中のヒ
ドロラーゼ活性を有する物質の濃度の測定のための手段
である。この手段は、ヒドロラーゼ活性を有する物質の
濃度を測定するために本発明の方法を実施するのに必要
な全ての試薬を含む。その手段は、特に、前記のヒドロ
ラーゼ活性により可溶性にし得る不溶性キャリヤー物質
に結合されたインジケータ酵素を含む。

【００５８】前記の手段は、インジケータ酵素の濃度を
測定するのに必要な試薬を更に含むことが適当である。
試薬は、例えば、インジケータ酵素基質を含む。インジ
ケータ酵素基質は、インジケータ酵素により触媒作用さ
れる検出可能な変化を生じる化合物である。特別な方法
では、それらは開裂でき、または酸化−還元（レドック
ス）系の一部である。基質またはインジケータ酵素とそ
の反応の生産物は比色検出、蛍光検出され、または電気
化学的方法で検出される。このような基質の例は、β−
ガラクトシダーゼ、レゾルフィン、クロロフェノレート
またはニトロフェノールのガラクトシドである。ペルオ
キシダーゼ基質の例はレゾルフィンおよびトリアリール
イミダゾールである。

【００５９】更に、必要により、その手段はまたpH緩衝
物質、安定剤、活性剤等を含むことができる。インジケ
ータ酵素基質およびその他の全ての成分の種類は、測定
されるインジケータ酵素に依存し、これらは当業者に知
られている。例えば、β−ガラクトシダーゼがインジケ
ータ酵素として使用される場合、欧州特許出願第014686
6 号明細書に列記された試薬が使用し得る。

【００６０】本発明の方法の前またはその間に、インジ
ケータ酵素の濃度を測定するのに使用される試薬は、偽
のインジケータ反応を避けるために、キャリヤー物質に
結合されたインジケータ酵素から分離して保たれること
が好ましい。本発明の手段は、例えば、必要により既知
のキャリヤー物質と一緒に、懸濁液、粉末、フリース、
ティッシュー、容器、錠剤、等を含む種々の形態で不溶
性キャリヤー物質に結合されているインジケータ酵素を
含むことができる。

【００６１】インジケータ反応に必要である本発明の手
段の試薬は、錠剤として粉末の形態、溶液の形態で利用
できるようにでき、またはフリース・ティッシュー等に
含浸し得る。テスト・ストリップの形態の手段の好まし
い第一の実施態様が図１に示されている。そのテスト・
ストリップは、試料が移動し得る幾つかの層を含む。こ
れらの層の目的は、試料中の物質を分離し、試薬とイン
キュベートし、反応を輸送または監視することである。
前記の層は、試料が毛細管力により一つの層から次の層
に進むように互いに接触していることが好ましい。フリ
ース３は、血液試料を試験する場合（ドイツ特許出願第
3029579 号) に赤血球の如き妨害試料成分を分離するの
に利用できる。また、それは試料適用の部位である。４
はインジケータ酵素が結合されているキャリヤー物質を
表す。デキストラナーゼ活性を有する物質を測定する場
合、これは、例えばインジケータ酵素が結合されている
デキストランである。フリース３を横断した試料はこの
領域中に分布され、その間にインジケータ酵素の一部が
ヒドロラーゼ活性を有する物質の影響下にキャリヤー物
質から開裂され、次の溶液に入る。フラップ５（これは
基質フリース６を保持する）をキャリヤー物資４（これ
はベース・ホイル２の上に載っている）に押しつけた
後、反応液が基質フリース６を浸透し、そしてインジケ
ータ反応が開始させられる。

【００６２】分析物の濃度を測定するための本発明の手
段は、ヒドロラーゼ活性を有する物質の濃度を測定する
ための上記の手段の全ての成分を含む。その他に、前記
の手段は、ヒドロラーゼ活性を有する物質の量（これ
は、測定される分析物濃度に特有である）の放出を可能
にする物質を含む。当業者は既知の方法と同様にしてこ
れらの試薬を使用し得る。

【００６３】本発明のその他の主題は、液体試料中の分
析物を検出するための試験手段（前記の試験手段は、試
料が移動でき、かつ固体キャリヤーに付着されている幾
つかの層を含む）であって、前記の試験手段が下記の順
に、 −分析物の抗体および試料中に存在しないヒドロラーゼ
の複合体を含む層、 −固定化された分析物または固定化された分析物類縁体
を含む層、 −不溶性キャリヤー物質に結合されたインジケータ酵素
を含む層（前記のインジケータ酵素はそれがヒドロラー
ゼと接触される際に可溶性にされる）、 −それぞれの層が隣接層と接触しているか、または隣接
層と接触し得る間に、インジケータ酵素の検出に必要な
試薬を含む層、を含むことを特徴とする液体試料中の分
析物を検出するための試験手段である。

【００６４】このような試験手段の実施態様が図２に示
されている。それは所謂イムノエンザイムメトリックア
ッセイに関する。上記の実施態様１に加えて、この実施
態様のテスト・ストリップ10は付加的なフリース11およ
び12を含む。測定される分析物の免疫パートナー（これ
はヒドロラーゼで標識されている）を含む所定量の複合
体がフリース11に含浸され、その複合体の量は分析物に
対し過剰である。フリース12は、分析物または分析物類
縁体が過剰に結合されているマトリックスを含む。

【００６５】試料中の分析物の濃度を測定するために、
試料がフリース３に適用される。その溶液がフリース11
を浸透した時、これに含まれた複合体がそれから除去さ
れ、そして免疫反応で試料中に含まれた分析物と反応す
る。こうして形成された免疫複合体および過剰の量の複
合体を含む溶液がフリース12を浸透する。このフリース
12中で、過剰量の複合体が、マトリックスに結合された
分析物または分析物類縁体との免疫反応の進行中に溶液
から除去される。免疫複合体（これはヒドロラーゼ活性
を有する物質である）を含む溶液がフリース４に入り、
そして上記のようにして測定される。ヒドロラーゼ活性
を有する物質の量は、試料中の分析物の量に直接に比例
する。

【００６６】更に、図１および２に示された試験手段
は、その方法の実施に有利な場合には、付加的な成分、
特にフリースまたはティッシュー（これらは反応性被覆
物を有していてもよい）を含んでもよい。フリースの配
置は当業者により適当に選択し得る。有利なことに、本
発明の方法は自動分析手段に適用される。何となれば、
これは迅速な結果および良好な再現性を確保するからで
ある。

【００６７】以下の実施例は本発明を更に詳しく説明す
る。

【００６８】

【実施例】実施例１ デキストラナーゼまたはデキストラナーゼ複合体の濃度
を測定するための化合物の調製 A)不溶性デキストランに結合されたβ−ガラクトシダー
ゼの調製 a)酸化されたデキストランの調製 乾燥した不溶性デキストラン（特性：セファデックス
（商標）6200)50mg を再蒸留水10ml中で90℃で２時間に
わたって浸軟する。沈積したゲルを室温で振とうしなが
ら過ヨウ素酸カリウム（再蒸留水中15ミリモル/l) ２ml
と30分間反応させる。

【００６９】得られたゲルを50ミリモルのリン酸カリウ
ム緩衝液（pH8.5)10mlで５回洗浄し、ガラス濾過器で濾
過する。 b)カップリング β−ガラクトシダーゼ（ベーリンガー・マンハイムGmb
H)25mg をリン酸カリウム緩衝液（50ミリモル、pH8.5)
0.5 mlに溶解し、そしてa)からの酸化されたデキストラ
ン１mlを添加する。カップリングを４℃でロール・アジ
テーターで一夜にわたって行う。

【００７０】c)アゾメチン化合物の還元 カップリング後、ゲルをホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8.
5)100 ミリモルで洗浄し、ホウ水素化ナトリウム溶液
（100 ミリモルのホウ酸ナトリウム緩衝液中5mg/ml、pH
8.5)１mlで０℃で１時間還元する。続いて、β−ガラク
トシダーゼ活性が最早測定されなくなるまでゲルをトゥ
イーン(Tween) 緩衝液（10ミリモルのリン酸ナトリウム
緩衝液、pH7.0 ；25ミリモルの塩化ナトリウム；0.05％
のトゥイーン（商標）20）で洗浄する。 B)基質溶液は2-ニトロフェノール- β- ガラクトシドの
２ミリモル溶液である。

【００７１】実施例２ 試料溶液中のデキストラナーゼまたはデキストラナーゼ
複合体の濃度の測定 試料溶液は、トゥイーン緩衝液（100 ミリモルのリン酸
カリウム緩衝液、pH6.0 ；0.05％のトゥイーン（商標）
20；５mg/ mlのクロテイン(Crotein, 商標)C)中のデキ
ストラナーゼまたはデキストラナーゼ複合体（デキスト
ラナーゼ＝1,6-グルカン- グルカノヒドロラーゼ：マイ
ルス社により製造されたEC3.2.11、比活性1700U/mg) の
2 ・10^-11Mおよび2 ・10^-12M溶液であった。

【００７２】試験を、実施例1A) で調製され、不溶性デ
キストランに結合されたβ−ガラクトシダーゼ1000μl
と試料溶液100 μl を混合し、次にその混合物を37℃で
10分間振とうすることにより行った。続いて、その懸濁
液を遠心分離し、そして500ミリモルのリン酸カリウム
緩衝液を使用して、上澄みを8.5 のpHに調節した。基質
溶液１mlを上澄み0.1 mlに添加し、吸光度を、同処理に
かけられた基準溶液（デキストラナーゼまたはデキスト
ラナーゼ複合体が添加されていない）と比較して37℃で
測定した。

【００７３】実施例３ 増幅因子の測定 増幅因子は、実施例1a) に記載されたようにしてβ−ガ
ラクトシダーゼにカップリングされたキャリヤー物質の
デキストラナーゼまたはその複合体の効果により遊離さ
れたβ−ガラクトシダーゼの量と使用されたデキストラ
ナーゼの量の間の比と定義される。

【００７４】Ｖ＝［遊離されたβ−ガラクトシダーゼの
活性（単位）］／［使用されたデキストラナーゼ複合体
の活性］ 活性は単位時間当たりの転化率と定義される。インキュ
ベーション期間を変えて、増幅因子を実施例２と同様に
して測定した。

【図面の簡単な説明】

【図１】テスト・ストリップの形態の本発明の手段の好
ましい第一の実施態様を示す図である。

【図２】本発明の試験手段の実施態様を示す図である。

【符合の説明】

２−ベース・ホイル ３、１１、１２−フリース ４−キャリヤー物質 ５−フラップ ６−基質フリース １０−テスト・ストリップ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンセルム ローテ ドイツ連邦共和国 Ｄ−6943 ビルケノ ー ティーフェンクリンガー ウェク 21 (56)参考文献 特開 昭63−110636（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 液体試料中の分析物の検出装置であっ
   て、 該装置は固体支持体上に液体試料が移動できる幾つかの
   層を含み、 各層は隣接する層に接触しているか、または接触するこ
   とができ、 該各層が以下の順で存在する該装置： ａ）分析物または分析物類縁体に特異的に結合する抗体
   と試料中に存在しないヒドロラーゼとの複合体を含む第
   １層、 ｂ）固定化された分析物または分析物類縁体を含む第２
   層、 ｃ）完全にまたは部分的にａ）のヒドロラーゼによって
   加水分解されうる不溶性キャリヤー物質に結合してい
   る、ａ）の複合体のヒドロラーゼとは異なるインジケー
   タ酵素を含み、キャリヤー物質がヒドロラーゼによって
   加水分解された結果、該キャリヤー物質に結合したイン
   ジケータ酵素が遊離され、液体試料中に溶解する第３
   層、 ｄ）インジケータ酵素検出試薬を含む第４層。
2. 【請求項２】 液体試料中の抗体の検出装置であって、 該装置は固体支持体上に液体が移動できる幾つかの層を
   含み、 各層は隣接する層に接触しているか、または接触するこ
   とができ、 該各層が以下の順で存在する該装置： ａ）抗体に特異的に結合する抗原またはハプテンと試料
   中に存在しないヒドロラーゼとの複合体を含む第１層、 ｂ）固定化された抗体または抗体類縁体を含む第２層、 ｃ）完全にまたは部分的にａ）のヒドロラーゼによって
   加水分解されうる不溶性キャリヤー物質に結合している
   ａ）の複合体のヒドロラーゼとは異なるインジケータ酵
   素を含み、キャリヤー物質がヒドロラーゼによって加水
   分解された結果、該キャリヤー物質に結合したインジケ
   ータ酵素が遊離され、液体試料中に溶解する第３層、 ｄ）インジケータ酵素検出試薬を含む第４層。