JP2001508647A

JP2001508647A - ヒドロラーゼ結合アッセイ

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Publication number: JP2001508647A
Application number: JP52090498A
Authority: JP
Inventors: デスマライス，シルビー; フリーセン，リチヤード; グレツサー，マイケル; ケネデイー，ブライアン; ニコルソン，ドン; ラマチヤンドラン，チダンバラン; スコレイ，キヤサリン; フオード―ハツチンソン，アンソニー
Original assignee: メルクフロストカナダアンドカンパニー
Priority date: 1996-11-04
Filing date: 1997-11-03
Publication date: 2001-07-03
Also published as: EP0937157A1; WO1998020156A1; CA2269659A1; US6114132A

Abstract

(57)【要約】結合部位にシステインを含有するかまたは酵素結合に必要な構造成分としてシステインを含有するプロテアーゼ及びホスファターゼに対する結合アッセイが開示されている。システインのスルフヒドリル基は酵素の機構的タンパク質分解特性及び加水分解特性の求核基である。アッセイを使用すると、新規な未知のリガンド及び混合化合物の酵素結合能力を、既知の酵素結合物質、例えば既知の酵素阻害物質に競合的に結合させることによって測定できる。自然または先天性の野生型酵素のシステインがセリンまたは別のアミノ酸例えばアラニンによって置換された変異形態を使用することによって、外来の酸化剤及びアルキル化剤によってアッセイ手順中に生じる干渉の問題が解消される。システインのスルフヒドリル基−ＳＨ（または−Ｓ−）の酸化またはアルキル化によって干渉が生じ、この干渉は酵素の結合能力に不利な影響を及ぼす。より特定的には本発明は、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）法を利用するチロシンホスファターゼ及びシステインプロテアーゼ、例えばカテプシンＫ（Ｏ２）のようなカテプシン及びキャプサーゼに対するアッセイを開示している。このアッセイの重要な用途は、糖尿病、免疫抑制、癌、アルツハイマー病及び骨粗鬆症などを治療及び研究するための化合物の発見である。変異酵素の使用によって得られた新規な特徴は、このような酵素の使用範囲を慣用の比色アッセイ、光度測定アッセイ、分光光度測定アッセイ、ラジオイムノアッセイ及びリガンド結合競合アッセイのような多様なアッセイに拡大できることである。

Description

【発明の詳細な説明】ヒドロラーゼ結合アッセイ発明の分野本発明は、競合的結合アッセイにおけるホスファターゼ及びプロテアーゼの変異酵素の使用に関する。酵素の特定例はチロシンホスファターゼ及びカテプシンＫのようなシステインプロテアーゼであり、特定的に記載されたアッセイは放射性阻害物質を使用してシンチレーションを誘導するシンチレーション近接アッセイである。発明の背景酵素の結合及び相互作用の研究に使用されるシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）は新しい種類のラジオイムノアッセイであり、当業界で公知である。慣用のラジオイムノアッセイまたはリガンド結合アッセイに比べて、ＳＰＡ法の利点は、リガンド測定に先立って未結合リガンドから結合リガンドを分離する必要がないことてある。例えば、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４１，ｐｐ．１６７−１７８に収載のＮ．ＢｏｓｗｏｒｔｈａｎｄＰ．Ｔｏｗｅｒｓの諭文“シンチレーション近接アッセイ（ＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎＰｒｏｘｉｍｉｔｙＡｓｓａｙ）”、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２１７，ｐｐ．１３９−１４７（１９９４）に収載のＡ．Ｍ．Ｂｒｏｗｎらの論文“カテプシンＧの阻害の研究に有用な試薬としてのビオチニル化システイン修飾ペプチド（ＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄａｎｄＣｙｓｔｅｉｎｅ−ＭｏｄｉｆｉｅｄＰｅｐｔｉｄｅｓａｓＵｓｅｆｕｌＲｅａｇｅｎｔｓＦｏｒＳｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＣａｔｈｅｐｓｉｎＧ”、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２２３，ｐｐ．２５９−２６５（１９９４）に収載のＲ．Ｈ．Ｓｋｉｎｎｅｒらの論文“シンチレーション近接アッセイを用いたニューロフィブロミンに対するＲＡＳの結合の直接測定（ＤｉｒｅｃｔＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅＢｉｎｄｉｎｇｏｆＲＡＳｔｏＮｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍｉｎＵｓｉｎｇＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎＰｒｏｘｉｍｉｔｙＡｓｓａｙ）” 、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２３０，ｐｐ．１０１−１０７（１９９５）に収載のＪ．Ａ．Ｐａｃｈｔｅｒらの論文“抗体捕獲アルファ５β１インテグリンに対する可溶性フィブロネクチンの結合を測定するためのシンチレーション近接アッセイ（ＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎＰｒｏｘｉｍｉｔｙＡｓｓａｙｔｏＭｅａｓｕｒｅＢｉｎｄｉｎｇｏｆＳｏｌｕｂｌｅＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｔｏＡｎｔｉｂｏｄｙ−Ｃａｐｔｕｒｅｄａｌｐｈａ５β１Ｉｎｔｅｇｒｉｎ”を参照するとよい。アッセイの基本理念は、シンチレーション物質を含有する固体支持体の使用にあり、ターゲット酵素は例えば第二酵素の酵素−抗酵素結合を介して支持体に結合する。トリチウム化またはＩ¹²⁵ヨウ素化した既知の結合物質、即ち放射性阻害物質リガンドを、ターゲット酵素に対する対照として使用する。このような放射性リガンドはターゲット酵素の活性部位に結合したときにシンチレーション物質に極めて近接し、シンチレーションシグナル、例えば光子放出を誘導する。放出された光子は慣用のシンチレーション／ラジオグラフィーの方法で測定できる。未結合のトリチウム化（ホット）リガンドはシンチレーション物質から十分に遠方に除去されるので、干渉性の測定可能なシンチレーションシグナルを生じることができない。従って、慣用のリガンド結合アッセイの場合のように未結合のリガンドを例えば濾過によって分離する必要がない。次に、未知のリガンド即ち有望な新しいリガンド（コールド、非放射性）を既知のラジオリガンドに対する競合的アッセイで試験し、シンチレーションシグナルの変化を測定する。未知のリガンドもまた良好な結合特性を有するときには、シンチレーションシグナルが有意に減少する。しかしながら、使用されるターゲット酵素が遊離チオール結合−ＳＨ（または −Ｓ−として存在）を有するシステイン基を含んでおり、該システイン基が活性部位の領域に存在するかまたは活性部位に緊密に関連しており、酵素−リガンド結合に重要であるような場合には問題が生じる。未知のリガンドまたは混合物、例えば天然物質の抽出物、ヒトの体液、細胞流体、などがシステインのチオール基のアルキル化、酸化または化学的干渉を生じ得る試薬を含有しているならば、正常な酵素−リガンド結合が破壊され、アッセイにおいて誤った読取り値が得られることになろう。酵素結合試験におけるシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）手順中のシステイン干渉の問題を阻止及び回避する方法が当業界で要望されている。発明の概要発明者らは、野生型酵素−天然リガンドの結合プロセス中で通常は活性結合部位の触媒性求核基としてシステインが活性に作用するようなターゲット酵素中のシステインをセリンで置換することによって活性部位のシステイン干渉を全く生じることなくシンチレーション近接アッセイで好適に使用できる変異体が形成されることを知見した。この知見は、ブロテアーゼまたはヒドロラーゼのような結合活性及び／または触媒活性に重要であるかまたは必須であるシステイン基を含有する任意の酵素に利用でき、酵素の例としてはチロシンホスファターゼなどのホスファターゼ、及び、システインプロテアーゼなどのプロテアーゼ、例えば、カテプシンＫ（Ｏ２）などのカテプシン及びキャプサーゼがある。更に、変異酵素の使用はシンチレーション近接アッセイに限定されることなく、比色アッセイ、分光光度測定アッセイ、リガンド結合アッセイ、ラジオイムノアッセイなどの多様な公知のアッセイで使用できる。発明者らは更に、２つ以上のホスホチロシン残基を４−ホスホノ（ジフルオロメチル）フェニルアラニン（Ｆ₂Ｐｍｐ）部分で置換することによって、アッセイに有用な結合リガンド例えば放射性阻害物質の効果を増幅する新規な方法を発見した。得られた阻害物質は、ターゲット酵素による加水分解により安定でより大きい結合親和性を示し、また、より強力なシンチレーションシグナルを示す。本発明によれば、システインを含有する野生型酵素に対するリガンドの結合能力を測定する方法が提供される。方法は、（ａ）野生型酵素の活性部位のシステインがセリンで置換された変異形態を含む複合体を、変異酵素に対する既知の結合物質の存在下でリガンドに接触させる段階から成り、結合物質が変異酵素に結合して測定可能なシグナルを発生し得ることを特徴とする。本発明は更に、活性部位にシステインを含有する野生型チロシンホスファターゼに対するリガンド、好ましくは非放射性(コールド)リガンドの結合能力を測定する方法を提供する。方法は、（ａ）野生型酵素の２１５位のシステインが変異酵素ではセリンで置換されている以外は変異酵素ＰＴＰ１Ｂが野生型酵素と同じアミノ酸配列１−３２０を含んでいる野生型酵素の変異形態を含む複合体を、変異酵素に対する既知の放射性リガンドから成る結合物質の存在下でリガンドに接触させる段階から成り、結合物質が変異酵素に結合して測定可能なベータ線誘導シンチレーションシグナルを発生し得ることを特徴とする。また、以下のグループから選択された新しいクラスのペプチドから成る結合物質が提供される：Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド（ＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂）{式中、Ｅはグルタミン酸であり、Ｊは４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニルを表す}；Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ −フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−リシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−セリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−プロリニルー〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；及びＬ−イソロイシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；並びにそれらのトリチウム化及びＩ¹²⁵ヨウ素化誘導体。更に、新規なトリチウム化ペプチド、トリチウム化ＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂ 、即ち、Ｎ−（３，５−ジトリチオ）ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド｛式中、Ｅはグルタミン酸であり、Ｊは（Ｆ₂Ｐｍｐ）部分，（４−ホスホノ（ジフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニル）を表す｝が提供される。本発明は更に、チロシンホスファターゼまたはシステインプロテアーゼに対するリガンドの結合親和性を増強する方法を提供する。方法は、リガンドに２つ以上の４−ホスホノ（ジフルオロメチル）−フェニルアラニン基を導入する段階から成る。本発明はまた、得られたジ置換リガンドを提供する。本発明は更に、（ａ）活性部位の活性に必要なシステインがセリンで置換された野生型酵素の変異形態と、（ｂ）上記の（ａ）を結合させた固体支持体と、から成る複合体を提供する。図面の簡単な説明図１は本発明の主要要素、即ち、シンチレーション物質１、支持ビーズ（蛍光微小球）５、表面結合プロテインＡ１０、連結用抗ＧＳＴ酵素１５、融合酵素構築物２０、ＧＳＴ酵素２５、変異酵素３０、トリチウム化ペプチド阻害物質３５、放射性ペプチド阻害物質３５によって放出されるベータ線４０、誘導シンチレーションによって放出される光４５を示す。図２（Ａ及びＢ）は、チロシンホスファターゼの１−３２０位のアミノ酸を含む切断形態の酵素ＰＴＰ１ＢのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す（活性部位のシステイン２１５は下線の付いた太字で示されている）。図３（Ａ、Ｂ及びＣ）はカテプシンＫのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。上部のヌクレオチド配列は、カテプシンＫのプレプロ酵素（対応する３文字アミノ酸コードで表す）をコードするカテプシンＫのｃＤＮＡ配列を示す。番号はｃＤＮＡのヌクレオチド位置を示す。下線の付いたアミノ酸はＳｅｒまたはＡｌａに変異した活性部位のＣｙｓ¹³⁹残基である。図４（Ａ及びＢ）はキャプサーゼ即ちアポパインのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。上部のヌクレオチド配列はアポパインのプロ酵素（対応する３文字アミノ酸コードで表す）をコードするアポパイン（ＣＰＰ³²）のｃＤＮＡ配列を示す。番号はｃＤＮＡのヌクレオチド位置を示す。下線の付いたアミノ酸はＳｅｒに変異した活性部位のＣｙｓ¹⁶³である。発明の詳細な説明本発明の主な実施態様の基本理論は図１を参照することによって容易に理解されよう。表面に免疫吸着プロテインＡ１０を含む微小ビーズ（イットリウムシリケートまたはＰＶＴの蛍光微小球、ＡＭＥＲＳＨＡＭ）５にシンチレーション物質１が組込まれている。ＧＳＴ酵素２５とＰＴＰ１Ｂ変異酵素３０とを含むＧＳＴ融合酵素構築物２０は抗ＧＳＴ酵素抗体１５を介してプロテインＡで被覆されたビーズ５に結合する。放射性ペプチド例えばトリチウム化ペプチド３５が変異ホスファターゼ酵素３０に結合したとき、該ペプチドはビーズ５に十分緊密に近接してベータ線４０（またはＩ¹²⁵の場合はオージェ電子）を放出し、シンチレーション物質１を刺激して光（光子）４５を放出させる。この光４５をベータプレートカウンタでカウント数として測定する。トリチウム化ペプチド３５が未結合のとき、該ペプチドはシンチレーション物質１から離間して存在し、ビーズ５に到達する前にエネルギーが散逸するので、測定されるカウント数は少ない。変異ホスファターゼ酵素３０の同一結合部位に対してトリチウム化ペプチド３５と競合する非放射性リガンドは変異酵素３０からトリチウム化ペプチド３５を除去するか及び／または該ペプチドに置換するので、得られるカウント数は競合リガンド非含有のペプチド対照よりも少ない。未知のリガンドの濃度を変更し、得られるカウント数の減少を測定することによって、変異酵素３０に対する結合を５０％阻害する未知のリガンドの濃度（ＩＣ５０）が得られる。この値は、変異酵素及び野生型酵素に対するリガンドの結合能力の判定基準となり得る。本文中で使用された“複合体”なる用語は、変異酵素を含有する集成体を意味する。最も簡単な実施態様では、複合体は、その表面に変異酵素が結合した固体支持体から成る。リンカーの使用も可能である。図１に示すように、複合体は更に、ビーズ（フルオポリマー）、抗酵素ＧＳＴ／酵素ＧＳＴ−変異酵素ＰＴＰ１Ｂの連結構築物、免疫吸着プロテインＡ、及び、シンチレーション物質を含み得る。一般に、複合体は固体支持体（ビーズ、例えばＡｌ₂Ｏ₃のイムノアッセイカラムまたはシリカゲル）を必要とし、変異酵素は、免疫吸着剤（プロテインＡ、プロテインＧ、抗マウス、抗ウサギ、抗ヒツジ）のような適当なリンカーと、固体支持体に結合した酵素／抗酵素の構築物のような連結用集成体とを介して結合することによって固体支持体に固定または固着されている。本文中で使用された“システイン含有野生型酵素”なる用語は、活性部位に活性求核基としてシステインを含有するかまたは結合活性に重要な活性部位に明らかに関連したシステインを含有するすべての先天性酵素または自然酵素、例えばホスファターゼ、システインプロテアーゼを意味する。本文中で使用された“結合物質”なる用語は、野生型酵素に結合できかつ通常は酵素阻害物質として作用できることが判っているすべてのリガンド（化合物）を意味する。結合物質は測定可能なシグナルを発生させるシグナル発生物質、例えば放射性核種を担持している。ＳＰＡアッセイでは、結合物質は放射性リガンドである。本文中で使用された“測定可能なシグナル”なる用語は、放射性リガンドから成る結合物質が変異酵素に結合したときに発生する任意の種類のシグナル、例えば、放射性シグナル、比色性シグナル、光度シグナル、分光光度シグナル、シンチレーションシグナルなどを意味する。本発明のアッセイは更に、従来のホスファターゼ活性アッセイで生じた問題を解消し得る。従来のアッセイでは、酵素の反応速度に影響を与える化合物の能力によって化合物を評価していた。しかしながら、該アッセイは、化合物が酵素の活性部位に実際に結合したという直接証拠を与えることはできなかった。本文中に記載の本発明の結合アッセイは、基質類似体を使用しており、天然物質の混合物がターゲット酵素中の活性部位のシステインを不可逆的に修飾しその結果として酵素活性を阻害したか否かを直接決定し得る。ホスファターゼアッセイ中のこれらの夾雑物による阻害を解消するために、Ｃｙｓ²¹⁵がＳｅｒ²¹⁵に変異した形態のチロシンホスファターゼＰＴＰ１Ｂをクローニングし発現させて、触媒的に不活性の酵素を得た。一般に、システインをセリンで置換すると、触媒的に不活性の変異酵素または実質的に低下した活性の変異酵素が得られる。ＰＴＰ１Ｂは、ほぼ均質になるまで精製され{Ｔｏｎｋｓら，ＪＢＣ２６３，６７３１−６７３７（１９８８）}、Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕら，ＰＮＡＳ８５，７１８２−７１８６（１９８８）によって配列決定された最初のタンパク質チロシンホスファターゼである。酵素の配列は、ＬＣＡまたはＣＤ４５などの種々の名称で呼ばれている造血細胞中に多量に存在するタンパク質の重複ドメインに実質的な相同を示した。このタンパク質は、チロシンホスファターゼ活性を有していることが判明した｛Ｔｏｎｋｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７，８６９５−８７０１（１９８８）｝。タンパク質チロシンホスファターゼは、チオール酸化剤に感受性であることか知られており、ＰＴＰ１Ｂの配列を以後にクローニングされたショウジョウバエ及び哺乳類のチロシンホスファターゼに位置合せすると、システイン残基が保存されていることが観察された｛（Ｍ．Ｓｔｒｕｅｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，ｐｐ．８６９８−７６０２（１９８９）｝。この残基がＳｅｒに変異すると酵素の触媒活性が失われた。Ｇｕａｎら（１９９１）｛Ｊ．Ｂ．Ｃ．Ｖｏｌ．２６６，１７９２６−１７０３０，１９９１｝は、ラットのＰＴＰ１Ｂ相同タンパク質をクローニングし、このタンパク質の切断形態を細菌中で発現させ、精製して、２１５位のＣｙｓが活性部位残基であることを証明した。Ｃｙｓ²¹⁵からＳｅｒ²¹⁵への変異の結果として触媒活性が失われた。ヒトＰＴＰ１ＢはＣｈｅｒｎｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，２７３５−２７３９（１９９０）によってクローニングされた。ホスホチロシル類似のＦ₂Ｐｍｐを含有するヘキサマーペプチドの合成に関してＴ．Ｂｕｒｋｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０５，ｐｐ．１２９−１３４（１９９４）によって発表された研究が、ＰＴＰ１Ｂの基質類似体ＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂の開発に導いた。発明者らは、(Ｆ₂ Ｐｍｐ)部分（４−ホスホノ−（ジフルオロメチル）フェニルアラニル）を種々のペプチドに組込んで、ＰＴＰ１Ｂの活性（５ｎＭ）阻害物質であるＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂（式中のＥはグルタミン酸であり、本文中で使用したＪはＦ₂Ｐｍｐ部分を表す）を発見した。次いでこれをトリチウム化すると、結合アッセイに必要な放射性基質類似体が得られた。アミノ酸１−３２０（図２参照）を含有する切断形態の変異酵素は、基質類似体Ｂｚ−ＮＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂に高い親和性で結合することが初めて証明された。変異酵素は野生型酵素よりも酸化剤に対する感受性が低いので、この酵素ファミリーに対する新規な阻害物質の同定に好適である。薬剤スクリーニング中の干渉性夾雑物を排除する目的で変異酵素を使用することはチロシンホスファターゼに限定されることなく、他の酵素結合アッセイにも使用できる。本発明の基本原理を利用し得る他の結合アッセイ、即ち、活性に対して重要な反応性システインをセリン（または他の低反応性アミノ酸）で置換した変異酵素を使用し、アルキル化剤及び酸化剤のようなシステイン修飾試薬に対して酵素をより安定にするような他の結合アッセイが当業界に存在する。このような他のリガンド結合アッセイとしては例えば、色または蛍光、燐光の発生を測定する比色アッセイ、分光光度測定アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、固体吸着剤検定法（ｓｏｌｉｄａｂｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｓ）、及び、紫外線及びガンマ線のような短い波長または長い波長の光線を発生する他のラジオイムノアッセイがある。更に、図１に示すようなフルオポリマー支持ビーズ（ＡＭＥＲＳＨＡＭ）を使用しないシンチレーション近接アッセイを行うことも可能である。例えば、Ｓｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐｓ（登録商標）は市販されており（ＷａｌｌａｃＯｙ，Ｆｉｎｌａｎｄ）、変異酵素複合体のためのシンチラント含有固体支持体として使用できる。また、当業界で慣用の他の固体支持体も使用できる。本文中に記載の本発明のアッセイは、タンパク質ホスファターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、などの種々のシステイン含有酵素に使用できる。ターゲット酵素中のシステインからセリンへの変換は、後出の引用文献中にＭ．Ｓｔｒｕｅｌｉらによって記載されたＣｙｓ２１５をＳｅｒ２１５に変換するための分子クローニング法をＰＴＰ１Ｂに応用することによって容易に達成できる。従って、この特定目的に関する該文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。特に有用なホスファターゼのクラスは細胞機能に重要なチロシンホスファターゼである。このクラスの例はＰＴＰ１Ｂ、ＬＣＡ、ＬＡＲ、ＤＬＡＲ、ＤＰＴＰ（Ｓｔｒｕｅｌｉら，後出、参照）である。例えばＰＴＰ１Ｂを使用してこのアッセイで発見されたリガンドは、糖尿病の治療及び免疫抑制に役立つ。有用な種は、Ｍ．ＳｔｒｕｅｌｉらによってＰｒｏｃ．Ｎａｔ’１，ＡｃａｄＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，ｐｐ．８６９８−７６０２、及び、Ｊ．ＣｈｅｒｎｏｆｆらによってＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８７，ｐｐ．２７３５−２７３９に記載されたＰＴＰ１Ｂである。別の有用な酵素のクラスはシステインプロテアーゼ（チオールプロテアーゼ）、カテプシン及びキャプサーゼなどのプロテアーゼである。カテプシンクラスのシステインプロテアーゼが重要である。その理由は、カテプシンＫ（別名カテプシン０２、Ｄ．Ｂｒｏｍｍｅら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，Ｖｏｌ．３７６，ｐｐ．３７９−３８４，１９９５年６月参照）は主としてヒトの砕骨細胞中で発現されるので、本発明のアッセイを骨粗鬆髭症の研究及び治療に役立てることができるからである。カテプシンＫ（Ｏ２）の配列、クローニング及び単離に関しては、ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＳｃｉｅｎｃｅｓの米国特許第５，５０１，９６５号（１９９６）を参照するとよい。また、Ｆ．ＤｒａｋｅらによるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．１２５１１−１２５１６（１９９６）及び前出のＤ．ＢｒｏｍｍｅらによるＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ，Ｖｏｌ．３７６，ｐｐ．３７９−３８４（１９８５）を参照するとよい。カテプシンの例としては、カテプシンＢ、カテプシンＧ、カテプシンＪ、カテプシンＫ（Ｏ２）、カテプシンＬ、カテプシンＭ及びカテプシンＳなどがある。酵素の別の例はキャプサーゼファミリーのシステインプロテアーゼであり、ＳＰＡ法と変異酵素とを使用してこれらの酵素の放射性阻害物質と競合する未知の化合物またはその混合物の能力を決定できる。活性部位が変異したヒトアポパインＣＰＰ３２（キャプサーゼ−３）の変異体を調製した。活性部位のチオールが変異した酵素は酸化剤に対する感受性が低下しており、このファミリーの酵素に対する新規な阻害物質の同定に好適である。キャプサーゼファミリーの例としては、キャプサーゼ−１（ＩＣＥ）、キャプサーゼ−２（ＩＣＨ−１）、キャプサーゼ−３（ＣＰＰ３２、ヒトアポパイン、Ｙａｍａ）、キャプサーゼ−４（ＩＣＥｒｅｌ−１１、ＴＸ、ＩＣＨ−２）、キャプサーゼ−５（ＩＣＥｒｅｌ−１１１、ＴＹ）、キャプサーゼ−６（Ｍｃｈ２）、キャプサーゼ−７（Ｍｃｈ３、ＩＣＥ−ＬＡＰ３、ＣＭＨ−１）、キャプサーゼ−８（ＦＬＩＣＥ、ＭＡＣＨ、Ｍｃｈ５）、キャプサーゼ−９（ＩＣＥ−ＬＡＰ６、Ｍｃｈ６）及びキャプサーゼ−１０（Ｍｃｈ４）がある。システインがセリン（または酸化剤及びアルキル化剤に対する活性を低下させる他の任意のアミノ酸、例えばアラニン）で置換されても、天然リガンドに対する変異酵素の結合能力は変化しない。結合の程度、即ち結合定数は増加または減少するかもしれない。しかしながら、変異酵素の触媒活性は実質的に減少するかまたは完全に除去される。従って、天然の野生型酵素に結合する天然リガンド及び合成リガンドは変異酵素にも結合するであろう。また、システインがセリンで置換されると、天然酵素と同じ定性的結合能力を有するが触媒活性は有意に低下した変異酵素が産生される。従って、本発明のアッセイでは被験リガンドの正確な結合能力が実際に測定される。本文中に記載の被験リガンドは、薬剤スクリーニングの目的に有用であると予測される新規なリガンドであり、その作用モードは一般には酵素の阻害物質として機能することである。結合物質は通常は、対照として使用される既知のリガンドであり、天然の野生型酵素及びアッセイで使用される変異酵素に結合することができ、既知の酵素ペプチド阻害物質として選択される。結合物質はまた、アッセイ中にシグナルを発生または誘導する既知のシグナル発生物質、例えば燐光または蛍光（ＥＬＩＳＡ）、呈色反応またはシンチレーションシグナルを誘導する物質を含有し得る。アッセイがシンチレーションアッセイである本発明の実施態様において、シグナル物質は固体支持体中のシンチラントによる測定可能な光線の放出、即ち光子の放出を誘導する放射性核種、即ちトリチウム、Ｉ¹²⁵である。放出された光線は慣用のシンチレーションカウンタ及びベータ線カウンタを使用して測定できる。発明者らはまた、既知の結合物質に２つ以上の４−ホスホノジフルオロメチルフェニルアラニン（Ｆ２Ｐｍｐ）基を導入すると、酵素に対する結合物質の結合親和性が著しく増進され、形成された複合体の加水分解性開裂を生じ難くすることによって複合体の安定性が改善されることを知見した。１個のＦ２Ｐｍｐ部分をリガンドに導入する方法は当業界で公知であり、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．Ｖｏｌ．２０４，ｐp．１２９−１３４（１９９４）に詳細に記載されている。この特定目的に関する該文献の記載は参照によって本発明に含まれるものとする。この方法の結果として、発明者らはＰＴＰ１Ｂに対して極めて優れた結合親和性を有している新規なリガンドのクラスを発見した。これらのリガンドの例は、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ −フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−リシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−セリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−プロリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕 −Ｌ−フェニルアラニンアミド；及びＬ−イソロイシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；である。この系列の有用なリガンドは、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミドという化学名のＢｚ−ＮＥＪＪ− ＣＯＮＨ₂、及び、そのトリチウム化形態Ｎ−（３，５−ジトリチオ）ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミドである。ホットリガンド及びコールドリガンドの双方の合成を実施例に記載する。以下の実施例は本発明の実施の代表例であり、本発明の範囲及び要旨がこれらの実施例に限定されると考えてはならない。実施例１．切断形態のＰＴＰ１Ｂ（アミノ酸配列１−３２０）及び融合構築物ＧＳＴ− ＰＴＰ１Ｂの調製全長のＰＴＰＩＢタンパク質を発現するＰＥＴプラスミドを担持する大腸菌培養物は、Ｊ．Ｃｈｅｒｎｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，ｐｐ．２７３５−２７３９（１９９０）に開示されている。この方法の改正方法を使用し、アミノ酸１−３２０（両端を含む）から成る活性部位含有の切断形態のＰＴＰ１Ｂ酵素の複合体を以下の手順で作製した。ＰＥＴベクターにクローニングした全長ヒトＰＴＰ−１ＢｃＤＮＡ配列（Ｊ．Ｃｈｅｒｎｏｆｆら，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，前出に発表）をＤｒ．ＲａｙｍｏｎｄＥｒｉｃｋｓｏｎ（ＨａｒｖａｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。全長配列を鋳型として用い、アミノ酸１−３２０（配列１）をコードしているＰＴＰ−１ＢｃＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅した。増幅に使用した５’プライマーは５’端にＢａｍＨＩ部位を含み、３’プライマーは３’端にＥｃｏＲＩ部位を有していた。増幅したフラグメントをｐＣＲ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定して、増幅中にＴａｑポリメラーゼによって配列エラーが導入されなかったことを確認した。この配列をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化によってｐＣＲ２から分離し、ＰＴＰ−１ＢｃＤＮＡフラグメントを、同じ酵素で消化しておいたＧＳＴ融合ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させた。大腸菌中で発現した融合タンパク質ＧＳＴ−ＰＴＰ−１Ｂは活性のタンパク質チロシンホスファターゼ活性を有している。この同じ１−３２０ＰＴＰ−１Ｂ配列（配列１）を次に、発現ベクタ−ｐＦＬＡＧ−２にクローニングした。ＦＬＡＧはオクタペプチドＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓである。このクローニングのために、ＰＴＰ−１Ｂ配列をｐＧＥＸ− ２ＴベクターからＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ消化によって分離し、このフラグメントの末端をクレノウによって埋め戻し、平滑末端をｐＦＬＡＧ２の平滑化したＥｃｏＲＩ部位に結合させた。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＣａｍｅｌｅｏｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）二重鎖変異誘発キットを用いてｐＦＬＡＧ２−ＰＴＰ−１Ｂの部位特異的変異を誘発し、活性部位Ｃｙｓ−２１５をセリンで置換した。ほぼ製造業者の指示通りに変異誘発を行って、変異体をＤＮＡ配列決定によって同定した。ＦＬＡＧ−ＰＴＰ−１ＢＣｙｓ²¹⁵Ｓｅｒ変異体（配列７）を発現させ、精製し、ホスファターゼ活性が全くないことを確認した。ＧＳＴ −ＰＴＰ−１ＢＣｙｓ²¹⁵Ｓｅｒ変異体は、ｐＦＬＡＧ２に既にクローニングしたＰＴＰ−１ＢのＣｙｓ²¹⁵Ｓｅｒ変異配列を用いて以下の手順で作製した。プラスミドｐＦＬＡＧ２−ＰＴＰ−１ＢＣｙｓ²¹⁵Ｓｅｒ（配列７）をＳａｌＩ（ＰＴＰ−１Ｂ配列の３’端）で消化し、クレノウポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いて埋め戻し、酵素を熱失活させ、ＤＮＡをＢｇｌＩＩで再度消化した。変異した活性部位を含む５００ｂｐの３’ＰＴＰ −１ＢｃＤＮＡフラグメントを分離し回収した。プラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ− ＰＴＰ−１ＢをＥｃｏＲＩ（ＰＴＰ−１Ｂ配列の３’端）で消化し、クレノウで埋め戻し、フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。このＤＮＡを次にＢｇｌＩＩで消化すると、２つのＤＮＡフラグメント、即ち、活性部位を含む５００ｂｐの３’ＰＴＰ−１ＢｃＤＮＡフラグメントと、ＰＴＰ−１Ｂの５’端が付加されたｐＧＥＸ−２Ｔベクターを含む５．５Ｋｂのフラグメントとが得られた。５．５ＫｂのｐＧＥＸ−２Ｔ，５’ＰＴＰ−１Ｂフラグメントを回収し、変異活性部位を含む５００ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩフラグメントに結合させた。結合物で細菌（タイプＤＨ５α，Ｇ）を形質転換させ、変異活性部位配列を含むクローンを配列決定によって同定した。ＧＳＴ−ＰＴＰ−１ＢＣｙｓ²¹⁵Ｓｅｒ変異体を超発現させ、精製し、ホスファターゼ活性を全く有していないことを確認した。２．トリチウム化Ｂｚ−ＮＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂の調製この化合物は後出の反応スキーム１に概略的に示し以下に記載する手順によって合成できる。Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ −フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド（ＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂）の合成反応スキーム１の陰影をつけたビーズによって表す１．０ｇのＴｅｎｔＧｅｌ（登録商標）ＳＲＡＭ樹脂（ＲＡＰＰポリマー、〜０．２ミリモル／ｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）中のピペリジン（３ｍｌ）で３０分間処理した。樹脂（円Ｐで示す、有機分子のアミノ基以外の部分を含む）をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）及びＣＨ₂ Ｃｌ₂（１０ｍｌ）で順次洗浄し、風乾した。ＤＭＦ（５ｍｌ）とＮ^∞−Ｆｍｏｃ−４−〔ジエチルホスホノ−（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニン（３５０ｍｇ）〔ここでＦｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル〕とＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウラニウムヘキサフルオロホスフェート（頭文字語はＨＡＴＵ、２２８ｍｇ）との溶液をジイソプロピルエチルアミン（０．２１ｍｌ）で処理し、１５分後、３ｍｌもＤＭＦ中の樹脂に添加した。１時間後、樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）及びＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）で順次洗浄し、風乾した。１回目はＮ^∞−Ｆｍｏｃ−４−〔ジエチルホスホノ−（ジフルオロメチル）〕 −Ｌ−フェニルアラニンを使用し、２回目はＮ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸ガンマ−ｔ−ブチルエステルを使用して、この手順を２回繰り返した。最終結合の後、樹脂結合トリペプチドをＤＭＦ（５ｍｌ）中のピペリジン（３ｍｌ）の混合物で３０分間処理し、次いでＤＭＦ（３×１０ｍｌ）及びＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）で順次洗浄し、風乾した。ＤＭＦ（１ｍｌ）中の安息香酸（６１ｍｇ）とＨＡＴＵ（１９０ｍｇ）との溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．１７ｍｌ）を添加し、この混合物を１５分後に、先に調製した樹脂の一部（２９０ｍｇ）を含む１ｍｌのＤＭＦに添加した。９０分後、樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）及びＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）で順次洗浄し、風乾した。樹脂を２ｍｌのＴＦＡ：水（９：１）混合物及び０．０５ｍｌのトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ−Ｈ）で１時間処理した。樹脂を濾別し、濾液を水（２ｍｌ）で希釈し、真空下、３５℃で濃縮した。残渣を２．５ｍｌのＴＦＡ：ＤＭＳ：ＴＭＳＯＴｆ（５：３：１）混合物及び０．０５ｍｌのＴＩＰＳ−Ｈで処理し、２５℃で１５時間撹拌した（ＴＦＡはトリフルオロ酢酸、ＤＭＳはジメチルスルフェート、ＴＭＳＯＴｆはトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートである）。標題化合物である所望のトリペプチドを、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、２５ ×１００ｍｍ）によって、４０分間で水中０．２％ＴＦＡから５０／５０アセトニトリル／水中０．２％ＴＦＡまでの移動相勾配を用いて精製し、２３０ｎｍでモニターした。約１４．３分後に溶出した画分を捕集し、濃縮し、凍結乾燥すると、標題化合物が白色泡状物質として得られた。Ｎ−（３，５−ジトリチオ）ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミドの合成安息香酸の代わりに３，５−ジブロモ安息香酸を用い、ＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂の合成に関する上述の手順を繰り返した。３０分間の勾配の使用及び約１８．３分後の画分の捕集を除けば前述と同様のＨＰＬＣ精製後、ジブロモ含有トリペプチドが白色泡状物質として得られた。この物質の一部（２ｍｇ）をメタノール／トリエチルアミン（０．５ｍｌ、１／４）に溶解し、１０％のＰｄ−Ｃ（２ｍｇ）を添加し、混合物をトリチウムガス雰囲気下で２４時間撹拌した。混合物をセライトで濾過し、メタノールで洗浄し、濾液を濃縮した。Ｃ１８カラム及びアセトニトリル／水中０．２％ＴＦＡ（１５：１００）のアイソクラチック移動相を用いる準分取ＨＰＬＣによる精製後に標題化合物が得られた。約５分後に溶出する画分を捕集し、真空下で濃縮した。標題化合物を１０ｍｌのメタノール／水（９：１）に溶解させると、比活性３９．４Ｃｉ／ミリモルを有する０．１ｍｇ／ｍｌの溶液が得られた。反応スキーム１反応スキーム１続き反応スキーム１続き上述のＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂の合成手順に従って、以下の他のペプチド阻害物質を同様にして調製した：Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ −フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−リシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−セリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−プロリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；及びＬ−イソロイシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド。４．ホスファターゼアッセイプロコトル材料：ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（Ｓｉｇｍａ）；ＤＭＨ：Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）−ヒドラジン（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６，ｐｐ．２３３２−２３３７，（１９９１）にＲ．Ｓｉｎｇｈ及びＧ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓによって発表された手順で合成できＤＴＴ−ジチオトレイトールで置換できる）；ビストリス：２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリロトリエタノール（Ｓｉｇｍａ）；トリトンＸ−１００：オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）１０（Ｐｉｅｒｃｅ）；抗体：抗−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼウサギ（Ｈ及びＬ）画分（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）；酵素：アフィニティクロマトグラフィーで精製したＧＳＴ酵素（グルタチオンＳ −トランスフェラーゼ）に融合したアミノ酸１−３２０（配列１）含有のヒト組換えＰＴＰ１Ｂ。野生型(配列１)は活性部位システイン（２１５）を含むが、変異体（配列７）は活性部位セリン（２１５）を含む；トリチウム化ペプチド：Ｂｚ−ＮＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂、分子量８０８、実験式Ｃ₃ ₂ Ｈ₃₂Ｔ₂Ｏ₁₂Ｐ₂Ｆ₄：予製液：アッセイバッファ：５０ｍＭのビストリス（Ｓｉｇｍａ），（１０×）ｐＨ６．２，分子量２０９．２；２０ｍＭのＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）（４℃で保存）新鮮な毎日調製液：アッセイバッファ：５０ｍＭのビストリス（１×）２ｍＭのＥＤＴＡ（室温）５ｍＭのＤＭＨ（分子量２０８）酵素希釈液：バッファ：５０ｍＭのビストリス（氷上保存）２ｍＭのＥＤＴＡ５ｍＭのＤＭＨ２０％のグリセロール（Ｓｉｇｍａ）０．０１ｍｇ／ｍｌのトリトンＸ−１００（Ｐｉｅｒｃｅ）抗体希釈液：バッファ：５０ｍＭのビストリス（氷上保存）２ｍＭのＥＤＴＡＩＣ₅₀結合アッセイプロトコル：特異的ホスファターゼに対する放射性リガンドの結合を阻害する能力をもつと予測される化合物（リガンド）を９６ウェルプレートフォーマットで以下の手順でスクリーニングする。以下の溶液（２５℃）を以下の順序で各ウェルに添加する。１．１１０μｌのアッセイバッファ。２．アッセイバッファ（１×）中に５０ｎＭのトリチウム化ＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂を含む１０μｌの溶液（２５℃）。３．ＤＭＳＯ中に異なる１０段階の系列希釈濃度（最終濃度はＤＭＳＯ中で約５％ｖ／ｖ）の被験化合物を含む１０μｌの溶液の重複サンプル（２５℃）。４．酵素希釈バッファ中に３．７５μｇ／ｍｌの精製ヒト組換えＧＳＴ−ＰＴＰ１Ｂを含む１０μｌの溶液。５．プレートを２分間振盪させる。６．０．３μｇ／ｍｌの抗−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（抗−ＧＳＴ）ウサギＩｇＧ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を抗体希釈バッファに希釈した１０μｌのサンプル（２５℃）。７．プレートを２分間振盪させる。８．５０μｌのプロテインＡ−ＰＶＴＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（２５℃）。９．プレートを５分間振盪させる。Ｍｉｃｒｏｂｅｔａの９６ウェルプレートカウンターで結合シグナルを定量する。１０．非特異的シグナルは抗−ＧＳＴ抗体の非存在下の酵素−リガンド結合であると定義する。１１．１００％結合活性は抗−ＧＳＴ抗体の存在下で被験リガンドの非存在下の酵素−リガンド結合から非特異的結合を減算した値であると定義する。１２．上記に基づいて阻害パーセンテージを計算する。１３．（“ＲｏｂｕｓｔＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ”，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＷｉｌｅｙにＰ．Ｊ．Ｈｕｂｅｒ（１９８１）によって記載された）４変数／多数部位の式による非線形回帰適合によってＩＣ₅₀値を概算し単位ｎＭで記録する。１４．１０ｎＭで９０％を上回る阻害を示した被験リガンド（化合物）を活性リガンドであると定義する。以下の表Ｉは結合物質ＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ２の結合を競合的に阻害する公知化合物の実例の代表的なアッセイ結果を示す。カテプシンＫ（Ｏ₂）の変異体の調製（ＣＡＴ−Ｋ変異体）カテプンシＫはヒト砕骨細胞中の主要なシステインプロテアーゼであり、砕骨細胞に介在される骨吸収に重要な役割を果たすと考えられている。カテプシンＫの阻害物質は、過度の骨吸収が生じる骨疾患（例えば骨粗鬆症）の治療に有用であろう。カテプシンＫは不活性のプレプロ酵素（配列４）として合成される。完全な触媒活性を発揮するためには、プレドメイン（Ｍｅｔ¹−Ａｌａ¹⁵）とプロドメイン（Ｌｅｕ¹⁶−Ａｒｇ¹¹⁴）との双方が除去される必要がある。成熟形態のプロテアーゼ（Ａｌａ¹¹⁵−Ｍｅｔ³²⁹）は活性部位にＣｙｓ残基（Ｃｙｓ¹³⁹ ）を含んでいる。同定されたクローンのＰＣＲ指令鋳型修飾によってＭｅｔＡｌａ¹¹⁵−Ｍｅｔ³ ²⁹ 構築物として細菌及びその他の組換え系中で発現するように成熟形態のカテプシンＫを作製する。エピトープで標識した変異体（Ｍｅｔ〔ＦＬＡＧ〕Ａｌａ¹¹ ⁵ −Ｍｅｔ³²⁹及びＭｅｔＡｌａ¹¹⁵−Ｍｅｔ³²⁹〔ＦＬＡＧ〕；ここにＦＬＡＧはオクタペプチドＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓである）も作製する。結合アッセイを設計する目的で、Ｍｅｔ〔ＦＬＡＧ〕Ａｌａ¹¹⁵−〔Ｃｙｓ¹³⁹ をＳｅｒ¹³⁹で置換〕−Ｍｅｔ³²⁹及びＭｅｔＡｌａ¹¹⁵−〔Ｃｙｓ¹³⁹をＳｅｒ¹³ ⁹ で置換〕−Ｍｅｔ³²⁹〔ＦＬＡＧ〕（ここでは活性部位ＣｙｓがＳｅｒ残基に変異している）、並びに、Ｍｅｔ〔ＦＬＡＧ〕ＡＬａ¹¹⁵−〔Ｃｙｓ¹³⁹をＡｌａ¹³ ⁹ で置換〕−Ｍｅｔ³²⁹及びＭｅｔＡｌａ¹¹⁵−〔Ｃｙｓ¹³⁹をＡｌａ¹³⁹で置換〕 −Ｍｅｔ³²⁹〔ＦＬＡＧ〕（ここでは活性部位ＣｙｓがＳＡｌａ残基に変異している）を含む別の幾つかの構築物を作製する。どの場合にも、得られた新しいポリペプチドを結合アッセイに使用でき、使用するときは市販の特異的抗ＦＬＡＧ抗体（ＩＤＩ−ＫＯＤＡＫ）を介して変異酵素をＳＰＡビーズに結合させるとよい。他のエピトープ標識、ＧＳＴ及び他の融合物もこの目的に使用でき、また、ＳＰＡ以外の結合アッセイフォーマットも使用できる。カテプシンＫの好ましい基質（例えば、Ａｃ−Ｐ２−Ｐ１、Ａｃ−Ｐ２−Ｐ１−アルデヒド、Ａｃ−Ｐ２ −Ｐ１−ケトン；ここでＰ１は親水性側鎖をもつアミノ酸好ましくはＡｒｇまたはＬｙｓであり、Ｐ２は小さい疎水性側鎖をもつアミノ酸、好ましくはＬｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅである）に基づくリガンドは、放射性標識(トリチウム化)形態でＳＰＡ利用結合アッセイに好適である。他のカテプシンファミリーの酵素に対しても同様の結合アッセイを設計し得る。アポパイン（キャプサーゼ−３）変異体の調製アポパインはキャプサーゼスーパーファミリーのＩＣＥ／ＣＥＤ−３様酵素に属する活性形態のシステインプロテアーゼである。アポパインは、３２ｋＤａのプロ酵素ポリペプチド（ｐ３２）内部に触媒活性酵素の１７ｋＤａの大サブユニット（ｐ１７）と１２ｋＤａの小サブユニット（ｐ１２）との双方を含有する触媒的に不活性のプロ酵素に由来する。アポパインは、アポプトーシスによる細胞死のエフェクターメカニズムの重要な介在物質であり、この酵素または構造的に近縁のアイソフォームの活性を調節するモジュレーターは、例えばアルツハイマー病のような不適切なアポプトーシスが顕著に生じる疾病の治療に有用であろう。アポパインの産生に使用した方法では、大腸菌中で個別に発現されたその構成成分ｐ１７サブユニット及びｐ１２サブユニットから活性酵素を折り畳む。ＰＣＲ指令鋳型修飾によってそれぞれ構築物ＭｅｔＳｅｒ²⁹−Ａｓｐ¹⁷⁵及びＭｅｔＳｅｒ¹⁷⁶−Ｈｉｓ²⁷⁷として発現するようにアポパインｐ１７サブユニット（Ｓｅｒ²⁹−Ａｓｐ¹⁷⁵）及びｐ１２サブユニット（Ｓｅｒ¹⁷⁶−Ｈｉｓ²⁷⁷）を作製する。結合アッセイを設計するために、ＭｅｔＳｅｒ²⁹−〔Ｃｙｓ¹⁶³をＳｅｒ¹⁶³で置換〕−Ａｓｐ１７５の大サブユニット及びＭｅｔ１−〔Ｃｙｓ¹⁶³をＳｅｒ¹⁶³で置換〕−Ｈｉｓ²⁷⁷プロ酵素などの複数の別の構築物を作製する。前者の場合には、大サブユニット（ｐ１７）中の活性部位Ｃｙｓ残基を部位特異的変異誘発によってＳｅｒ残基で置換する。この大サブユニットを次に組換えｐ１２サブユニットと共に再生し、活性部位ＣｙｓがＳｅｒに変異しただけの成熟形態の酵素を作製する。後者の場合には、同様にＣｙｓ¹⁶³をＳｅｒ¹ ⁶³ に変異させるが、完全プロ酵素が発現される。双方の場合に、得られた新しいポリペプチドは結合アッセイに使用でき、使用するときはアポパインを認識するために作製した特異的抗体（プロドメイン、大サブユニットｐ１７、小サブユニットｐ１２及び完全なｐ１７：ｐ１２活性酵素のそれぞれに対する抗体を作製した）を介して変異酵素をＳＰＡに結合させる。エピトープ標識またはＧＳＴまたは他の融合物もこの目的に使用でき、また、ＳＰＡ以外の結合アッセイフォーマットも使用できる。Ａｃ−ＡｓｐＧｌｕＶａｌＡｓｐ、Ａｃ−ＡｓｐＧｌｕＶａｌＡｓｐ−アルデヒド、Ａｃ−ＡｓｐＧｌｕＶａｌＡｓｐ−ケトンのようなアポパインの好ましい基質（ＡｓｐＧｌｕＶａｌＡｓｐの変異体）に基づくリガンドは、放射性標識形態でＳＰＡ利用結合アッセイに好適である。他のキャプサーゼファミリーの酵素に対しても同様の結合アッセイを設計し得る。配列表の説明配列１は、図２Ａ及び図２Ｂの上の行に示すＰＴＰ１Ｂチロシンホスファターゼ酵素のセンスＤＮＡ鎖である。配列２は、図２Ａ及び図２Ｂに示すＰＴＰ１Ｂチロシンホスファターゼ酵素のアミノ酸配列である。配列３は、図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃの上の行に示すカテプシンＫプレプロ酵素のセンスｃＤＮＡ鎖である。配列４は、図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃに示すカテプシンＫプレプロ酵素のアミノ酸配列である。配列５は、図４Ａ及び図４Ｂの上の行に示すＣＰＰ３２アポパインプロ酵素のセンスｃＤＮＡ鎖である。配列６は、図４Ａ及び図４Ｂに示すＣＰＰ３２アポパインプロ酵素のアミノ酸配列である。配列７は、ヒトＰＴＰ−１Ｂ_1-320Ｓｅｒ変異体のｃＤＮＡ配列である。配列８は、ヒトＰＴＰ−１Ｂ_1-320Ｓｅｒ変異体のアミノ酸配列である。配列９は、アポパインＣ１６３Ｓ変異体のｃＤＮＡ配列である。配列１０は、アポパインＣ１６３Ｓ変異体のアミノ酸配列である。配列１１は、アポパインＣ１６３Ｓ変異体の大サブユニットのヘテロダイマーのアミノ配列である。配列１２は、カテプシンＫＣ１３９Ｓ変異体のｃＤＮＡ配列である。配列１３は、カテプシンＫＣ１３９Ａ変異体のｃＤＮＡ配列である。配列１４は、カテプシンＫＣ１３９Ｓ変異体のアミノ配列である。配列１５は、カテプシンＫＣ１３９Ａ変異体のアミノ配列である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１１月１３日（１９９８．１１．１３）【補正内容】請求の範囲１．システイン含有野生型酵素に対するリガンドの結合能力を測定する方法であって、活性部位のシステインがセリンで置換された、野生型酵素の変異形態と固体支持体とを含む複合体を、変異酵素に対する既知の結合物質の存在下で前記リガンドに接触させる段階から成り、前記結合物質と前記リガンドとは変異酵素の活性部位において結合について競合して測定可能なシグナルを発生し得ることを特徴とする方法。２．更に、測定可能な初期シグナルを発生させるために、リガンドの非存在下で複合体を結合物質に接触させる段階を含む請求項１に記載の方法。３．シグナルが比色シグナル、光度シグナル、分光光度シグナルまたは放射性シグナルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。４．シグナルがベータ線誘導シンチレーションであることを特徴とする請求項３に記載の方法。５．既知の結合物質が野生型酵素の阻害物質であり、変異酵素に接触してシンチレーションを誘導する放射性核種を含有していることを特徴とする請求項１に記載の方法。６．複合体が更に、固体支持体、シンチレーション物質及び融合酵素連結構築物を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。７．複合体が更に、（ａ）シンチレーション物質とプロテインＡとを含有しているフルオロポリマービーズと、（ｂ）プロテインＡを介して前項（ａ）のビーズに結合している抗ＧＳＴ抗体と、（ｃ）変異酵素に融合したＧＳＴ酵素から成り、ＧＳＴ端に前項（ｂ）の抗体が結合している融合酵素連結構築物と、から成ることを特徴とする請求項６に記載の方法。８．野生型酵素が、プロテアーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ及びキナーゼから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。９．野生型酵素が、チロシンホスファターゼ及びシステインプロテアーゼから成るグループから選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．チロシンホスファターゼがＰＴＰ１Ｂ、ＬＣＡ、ＬＡＲ、ＤＬＡＲ及びＤＰＴＰから成るグループから選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。１１．チロシンホスファターゼが、２１５位のシステインに置換したセリンを含有するＰＴＰ１Ｂであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。１２．ＰＴＰ１Ｂホスファターゼが、アミノ酸１−３２０から成り活性結合部位を含有している切断形態で存在することを特徴とする請求項１１に記載の方法。１３．システインプロテアーゼがカテプシンまたはキャプサーゼであることを特徴とする請求項９に記載の方法。１４．カテプシンが、カテプシンＢ、カテプシンＧ、カテプシンＪ、カテプシンＫ（Ｏ２）、カテプシンＬ、カテプシンＭ及びカテプシンＳから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。１５．カテプシンがカテプシンＫ（Ｏ２）であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。１６．キャプサーゼが、キャプサーゼ−１（ＩＣＥ）、キャプサーゼ−２（ＩＣＨ−１）、キャプサーゼ−３（ＣＰＰ３２、ヒトアポパイン、Ｙａｍａ）、キャプサーゼ−４（ＩＣＥｒｅｌ−１１、ＴＸ、ＩＣＨ−２）、キャプサーゼ−５（ＩＣＥｒｅｌ−１１１、ＴＹ）、キャプサーゼ−６（Ｍｃｈ２）、キャプサーゼ−７（Ｍｃｈ３、ＩＣＥ−ＬＡＰ３、ＣＭＨ −１）、キャプサーゼ−８（ＦＬＩＣＥ、ＭＡＣＨ、Ｍｃｈ５）、キャプサーゼ −９（ＩＣＥ−ＬＡＰ６、Ｍｃｈ６）及びキャプサーゼ−１０（Ｍｃｈ４）から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。１７．キャプサーゼがヒトアポパインＣＰＰ３２であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。１８．チロシンホスファターゼがＰＴＰ１Ｂであり、結合物質が、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド（ＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂）{式中、Ｅはグルタミン酸であり、Ｊは４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニルを表す}；Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ −フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−リシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−セリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−プロリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；及びＬ−イソロイシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミドから成るグループから選択されたペプチドであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。１９．ペプチドがトリチウム化形態であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。２０．ペプチドが、トリチウム化Ｎ−（３，５−ジトリチオ）ベンゾイル−Ｌ− グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル− 〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド、即ち、トリチウム化Ｂｚ−ＮＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂｛式中、Ｅはグルタミン酸であり、Ｊは（Ｆ₂Ｐｍｐ）部分，（４−ホスホノ（ジフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニル）を表す｝であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。２１．システイン含有野生型チロシンホスファターゼに対するリガンドの結合能力を測定する方法であって、（ａ）野生型酵素の２１５位のシステインが変異酵素ではセリンで置換されている以外は変異酵素ＰＴＰ１Ｂが野生型酵素と同じアミノ酸１−３２０の配列を含んでいる野生型酵素の変異形態を含む複合体を、変異酵素に対する既知の放射性リガンドから成る結合物質の存在下でリガンドに接触させる段階から成り、結合物質が変異酵素に結合して測定可能なベータ線誘導シンチレーションシグナルを発生し得ることを特徴とする方法。２２．更に、測定可能な初期ベータ線誘導シンチレーションシグナルを発生させるために、段階（ａ）に先立って、複合体をリガンドの非存在下で結合物質に結合させる段階を含む請求項２１に記載の方法。２３．結合物質が、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド（ＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂）{式中、Ｅはグルタミン酸であり、Ｊは４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニルを表す}；Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ −フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−リシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−セリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−プロリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；及びＬ−イソロイシニルー〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミドから成るグループから選択されたペプチドであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。２４．ペプチドがトリチウム化形態またはＩ¹²⁵ヨウ素化形態であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。２５．ペプチドが、トリチウム化Ｎ−（３，５−ジトリチオ）ベンゾイル−Ｌ− グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル− 〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド、即ち、トリチウム化Ｂｚ−ＮＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂｛式中、Ｅはグルタミン酸であり、Ｊは（Ｆ₂Ｐｍｐ）部分，（４−ホスホノ（ジフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニル）を表す｝であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。２６．（ａ）活性に必要な活性部位のシステインがセリンで置換された野生型酵素の変異体と、（ｂ）前記変異体を結合させた固体支持体と、から成る複合体。２７．更に、変異酵素に対する結合物質を含み、前記結合物質が変異酵素に結合して測定可能なシグナルを発生し得ることを特徴とする請求項２６に記載の複合体。２８．Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド（ＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂）{式中、Ｅはグルタミン酸であり、Ｊは４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニルを表す}；Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ −フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−リシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−セリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−プロリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；及びＬ−イソロイシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミドから成るグループから選択されることを特徴とする変異酵素に対する結合物質として使用するためのペプチド。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 5/097 Ｃ０７Ｋ 5/097 Ｃ１２Ｎ 11/00 Ｃ１２Ｎ 11/00 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＧ０１Ｎ 33/573 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者フリーセン，リチヤードカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者グレツサー，マイケルカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者ケネデイー，ブライアンカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者ニコルソン，ドンカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者ラマチヤンドラン，チダンバランカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者スコレイ，キヤサリンカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者フオード―ハツチンソン，アンソニーカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711

Claims

【特許請求の範囲】１．システイン含有野生型酵素に対するリガンドの結合能力を測定する方法であって、（ａ）活性部位のシステインがセリンで置換された、野生型酵素の変異形態を含む複合体を、変異酵素に対する既知の結合物質の存在下でリガンドに接触させる段階から成り、前記結合物質は変異酵素に結合して測定可能なシグナルを発生し得ることを特徴とする方法。２．更に、測定可能な初期シグナルを発生させるために、リガンドの非存在下で複合体を結合物質に接触させる段階を含む請求項１に記載の方法。３．シグナルが比色シグナル、光度シグナル、分光光度シグナルまたは放射性シグナルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。４．シグナルがベータ線誘導シンチレーションであることを特徴とする請求項３に記載の方法。５．既知の結合物質が野生型酵素の阻害物質であり、変異酵素に接触してシンチレーションを誘導する放射性核種を含有していることを特徴とする請求項１に記載の方法。６．複合体が更に、固体支持体、シンチレーション物質及び融合酵素連結構築物を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。７．複合体が更に、（ａ）シンチレーション物質とプロテインＡとを含有しているフルオロポリマービーズと、（ｂ）プロテインＡを介して前項（ａ）のビーズに結合している抗ＧＳＴ抗体と、（ｃ）変異酵素に融合したＧＳＴ酵素から成り、ＧＳＴ端に前項（ｂ）の抗体が結合している融合酵素連結構築物と、から成ることを特徴とする請求項６に記載の方法。８．野生型酵素が、プロテアーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ及びキナーゼから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。９．野生型酵素が、チロシンホスファターゼ及びシステインプロテアーゼから成るグループから選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．チロシンホスファターゼがＰＴＰ１Ｂ、ＬＣＡ、ＬＡＲ、ＤＬＡＲ及びＤＰＴＰから成るグループから選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。１１．チロシンホスファターゼが、２１５位のシステインに置換したセリンを含有するＰＴＰ１Ｂであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。１２．ＰＴＰ１Ｂホスファターゼが、アミノ酸１−３２０から成り活性結合部位を含有している切断形態で存在することを特徴とする請求項１１に記載の方法。１３．システインプロテアーゼがカテプシンまたはキャプサーゼであることを特徴とする請求項９に記載の方法。１４．カテプシンが、カテプシンＢ、カテプシンＧ、カテプシンＪ、カテプシンＫ（Ｏ２）、カテプシンＬ、カテプシンＭ及びカテプシンＳから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。１５．カテプシンがカテプシンＫ（Ｏ２）であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。１６．キャプサーゼが、キャプサーゼ−１（ＩＣＥ）、キャプサーゼ−２（ＩＣＨ−１）、キャプサーゼ−３（ＣＰＰ３２、ヒトアポパイン、Ｙａｍａ）、キャプサーゼ−４（ＩＣＥｒｅ１ −１１、ＴＸ、ＩＣＨ−２）、キャプサーゼ−５（ＩＣＥｒｅｌ−１１１、ＴＹ）、キャプサーゼ−６（Ｍｃｈ２）、キャプサーゼ−７（Ｍｃｈ３、ＩＣＥ−ＬＡＰ３、ＣＭＨ−１）、キャプサーゼ−８（ＦＬＩＣＥ、ＭＡＣＨ、Ｍｃｈ５）、キャプサーゼ−９（ＩＣＥ−ＬＡＰ６、Ｍｃｈ６）及びキャプサーゼ−１０（Ｍｃｈ４）から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。１７．キャプサーゼがヒトアポパインＣＰＰ３２であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。１８．チロシンホスファターゼがＰＴＰ１Ｂであり、結合物質が、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド（ＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂）{式中、Ｅはグルタミン酸であり、Ｊは４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニルを表す}；Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ −フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−リシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−セリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−プロリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；及びＬ−イソロイシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミドから成るグループから選択されたペプチドであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。１９．ペプチドがトリチウム化形態であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。２０．ペプチドが、トリチウム化Ｎ−（３，５−ジトリチオ）ベンゾイル−Ｌ− グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル− 〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド、即ち、トリチウム化Ｂｚ−ＮＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂{式中、Ｅはグルタミン酸であり、Ｊは（Ｆ₂Ｐｍｐ）部分，（４−ホスホノ（ジフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニル）を表す}であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。２１．システイン含有野生型チロシンホスファターゼに対するリガンドの結合能力を測定する方法であって、（ａ）野生型酵素の２１５位のシステインが変異酵素ではセリンで置換されている以外は変異酵素ＰＴＰ１Ｂが野生型酵素と同じアミノ酸１−３２０の配列を含んでいる野生型酵素の変異形態を含む複合体を、変異酵素に対する既知の放射性リガンドから成る結合物質の存在下でリガンドに接触させる段階から成り、結合物質が変異酵素に結合して測定可能なベータ線誘導シンチレーションシグナルを発生し得ることを特徴とする方法。２２．更に、測定可能な初期ベータ線誘導シンチレーションシグナルを発生させるために、段階（ａ）に先立って、複合体をリガンドの非存在下で結合物質に結合させる段階を含む請求項２１に記載の方法。２３．結合物質が、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド（ＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂）{式中、Ｅはグルタミン酸であり、Ｊは４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニルを表す}；Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ −フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−リシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−セリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−プロリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；及びＬ−イソロイシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミドから成るグループから選択されたペプチドであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。２４．ペプチドがトリチウム化形態またはＩ¹²⁵ヨウ素化形態であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。２５．ペプチドが、トリチウム化Ｎ−（３，５−ジトリチオ）ベンゾイル−Ｌ− グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル− 〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド、即ち、トリチウム化Ｂｚ−ＮＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂{式中、Ｅはグルタミン酸であり、Ｊは（Ｆ₂Ｐｍｐ）部分，（４−ホスホノ（ジフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニル）を表す}であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。２６．（ａ）活性に必要な活性部位のシステインがセリンで置換された野生型酵素の変異体と、（ｂ）前記変異体を結合させた固体支持体と、から成る複合体。２７．更に、変異酵素に対する結合物質を含み、前記結合物質が変異酵素に結合して測定可能なシグナルを発生し得ることを特徴とする請求項２６に記載の複合体。２８．Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド（ＢｚＮ−ＥＪＪ−ＣＯＮＨ₂）{式中、Ｅはグルタミン酸であり、Ｊは４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニルを表す}；Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕− Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ −フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−グルタミル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−リシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−セリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Ｌ−プロリニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕 −Ｌ−フェニルアラニンアミド；及びＬ−イソロイシニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニル−〔４−ホスホノ（ジフルオロメチル）〕−Ｌ−フェニルアラニンアミドから成るグループから選択されることを特徴とする変異酵素に対する結合物質として使用するためのペプチド。