JP2001508647A - ヒドロラーゼ結合アッセイ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
結合部位にシステインを含有するかまたは酵素結合に必要な構造成分としてシステインを含有するプロテアーゼ及びホスファターゼに対する結合アッセイが開示されている。システインのスルフヒドリル基は酵素の機構的タンパク質分解特性及び加水分解特性の求核基である。アッセイを使用すると、新規な未知のリガンド及び混合化合物の酵素結合能力を、既知の酵素結合物質、例えば既知の酵素阻害物質に競合的に結合させることによって測定できる。自然または先天性の野生型酵素のシステインがセリンまたは別のアミノ酸例えばアラニンによって置換された変異形態を使用することによって、外来の酸化剤及びアルキル化剤によってアッセイ手順中に生じる干渉の問題が解消される。システインのスルフヒドリル基−SH(または−S−)の酸化またはアルキル化によって干渉が生じ、この干渉は酵素の結合能力に不利な影響を及ぼす。より特定的には本発明は、シンチレーション近接アッセイ(SPA)法を利用するチロシンホスファターゼ及びシステインプロテアーゼ、例えばカテプシンK(O2)のようなカテプシン及びキャプサーゼに対するアッセイを開示している。このアッセイの重要な用途は、糖尿病、免疫抑制、癌、アルツハイマー病及び骨粗鬆症などを治療及び研究するための化合物の発見である。変異酵素の使用によって得られた新規な特徴は、このような酵素の使用範囲を慣用の比色アッセイ、光度測定アッセイ、分光光度測定アッセイ、ラジオイムノアッセイ及びリガンド結合競合アッセイのような多様なアッセイに拡大できることである。
Description
【発明の詳細な説明】
ヒドロラーゼ結合アッセイ 発明の分野
本発明は、競合的結合アッセイにおけるホスファターゼ及びプロテアーゼの変
異酵素の使用に関する。酵素の特定例はチロシンホスファターゼ及びカテプシン
Kのようなシステインプロテアーゼであり、特定的に記載されたアッセイは放射
性阻害物質を使用してシンチレーションを誘導するシンチレーション近接アッセ
イである。発明の背景
酵素の結合及び相互作用の研究に使用されるシンチレーション近接アッセイ(
SPA)は新しい種類のラジオイムノアッセイであり、当業界で公知である。慣
用のラジオイムノアッセイまたはリガンド結合アッセイに比べて、SPA法の利
点は、リガンド測定に先立って未結合リガンドから結合リガンドを分離する必要
がないことてある。例えば、Nature,Vol.341,pp.167−1
78に収載のN.Bosworth and P.Towersの諭文“シンチ
レーション近接アッ
セイ(Scintillation Proximity Assay)”、A
nal.Biochem.Vol.217,pp.139−147(1994)
に収載のA.M.Brownらの論文“カテプシンGの阻害の研究に有用な試薬
としてのビオチニル化システイン修飾ペプチド(Biotinylated a
nd Cysteine−Modified Peptidesas Usef
ul Reagents For Studying the Inhibit
ion of Cathepsin G”、Anal.Biochem.Vol
.223,pp.259−265(1994)に収載のR.H.Skinner
らの論文“シンチレーション近接アッセイを用いたニューロフィブロミンに対す
るRASの結合の直接測定(Direct Measurement of t
he Binding of RAS to Neurofibromin U
sing Scintillation Proximity Assay)”
、Anal.Biochem.Vol.230,pp.101−107(199
5)に収載のJ.A.Pachterらの論文“抗体捕獲アルファ5β1インテ
グリンに対する可溶性フィブロネクチンの結合を測定するためのシンチレーショ
ン近接アッ
セイ(Scintillation Proximity Assay to
Measure Binding of Soluble Fibronect
in to Antibody−Captured alpha5β1 Int
egrin”を参照するとよい。
アッセイの基本理念は、シンチレーション物質を含有する固体支持体の使用に
あり、ターゲット酵素は例えば第二酵素の酵素−抗酵素結合を介して支持体に結
合する。トリチウム化またはI125ヨウ素化した既知の結合物質、即ち放射性阻
害物質リガンドを、ターゲット酵素に対する対照として使用する。このような放
射性リガンドはターゲット酵素の活性部位に結合したときにシンチレーション物
質に極めて近接し、シンチレーションシグナル、例えば光子放出を誘導する。放
出された光子は慣用のシンチレーション/ラジオグラフィーの方法で測定できる
。未結合のトリチウム化(ホット)リガンドはシンチレーション物質から十分に
遠方に除去されるので、干渉性の測定可能なシンチレーションシグナルを生じる
ことができない。従って、慣用のリガンド結合アッセイの場合のように未結合の
リガンドを例えば濾過によって分離する必要がない。
次に、未知のリガンド即ち有望な新しいリガンド(コールド、非放射性)を既
知のラジオリガンドに対する競合的アッセイで試験し、シンチレーションシグナ
ルの変化を測定する。未知のリガンドもまた良好な結合特性を有するときには、
シンチレーションシグナルが有意に減少する。
しかしながら、使用されるターゲット酵素が遊離チオール結合−SH(または
−S−として存在)を有するシステイン基を含んでおり、該システイン基が活性
部位の領域に存在するかまたは活性部位に緊密に関連しており、酵素−リガンド
結合に重要であるような場合には問題が生じる。未知のリガンドまたは混合物、
例えば天然物質の抽出物、ヒトの体液、細胞流体、などがシステインのチオール
基のアルキル化、酸化または化学的干渉を生じ得る試薬を含有しているならば、
正常な酵素−リガンド結合が破壊され、アッセイにおいて誤った読取り値が得ら
れることになろう。
酵素結合試験におけるシンチレーション近接アッセイ(SPA)手順中のシス
テイン干渉の問題を阻止及び回避する方法が当業界で要望されている。発明の概要
発明者らは、野生型酵素−天然リガンドの結合プロセス中で通常は活性結合部
位の触媒性求核基としてシステインが活性に作用するようなターゲット酵素中の
システインをセリンで置換することによって活性部位のシステイン干渉を全く生
じることなくシンチレーション近接アッセイで好適に使用できる変異体が形成さ
れることを知見した。
この知見は、ブロテアーゼまたはヒドロラーゼのような結合活性及び/または
触媒活性に重要であるかまたは必須であるシステイン基を含有する任意の酵素に
利用でき、酵素の例としてはチロシンホスファターゼなどのホスファターゼ、及
び、システインプロテアーゼなどのプロテアーゼ、例えば、カテプシンK(O2
)などのカテプシン及びキャプサーゼがある。
更に、変異酵素の使用はシンチレーション近接アッセイに限定されることなく
、比色アッセイ、分光光度測定アッセイ、リガンド結合アッセイ、ラジオイムノ
アッセイなどの多様な公知のアッセイで使用できる。
発明者らは更に、2つ以上のホスホチロシン残基を4−ホスホノ(ジフルオロ
メチル)フェニルアラニン(F2Pmp)部分
で置換することによって、アッセイに有用な結合リガンド例えば放射性阻害物質
の効果を増幅する新規な方法を発見した。得られた阻害物質は、ターゲット酵素
による加水分解により安定でより大きい結合親和性を示し、また、より強力なシ
ンチレーションシグナルを示す。
本発明によれば、システインを含有する野生型酵素に対するリガンドの結合能
力を測定する方法が提供される。方法は、
(a)野生型酵素の活性部位のシステインがセリンで置換された変異形態を含
む複合体を、変異酵素に対する既知の結合物質の存在下でリガンドに接触させる
段階から成り、結合物質が変異酵素に結合して測定可能なシグナルを発生し得る
ことを特徴とする。
本発明は更に、活性部位にシステインを含有する野生型チロシンホスファター
ゼに対するリガンド、好ましくは非放射性(コールド)リガンドの結合能力を測定
する方法を提供する。方法は、
(a)野生型酵素の215位のシステインが変異酵素ではセリンで置換されて
いる以外は変異酵素PTP1Bが野生型酵素と同じアミノ酸配列1−320を含
んでいる野生型酵素の変異
形態を含む複合体を、変異酵素に対する既知の放射性リガンドから成る結合物質
の存在下でリガンドに接触させる段階から成り、結合物質が変異酵素に結合して
測定可能なベータ線誘導シンチレーションシグナルを発生し得ることを特徴とす
る。
また、以下のグループから選択された新しいクラスのペプチドから成る結合物
質が提供される:
N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−
L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニンアミド(BzN−EJJ−CONH2){式中、Eはグルタミン酸であり
、Jは4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニルを表す};
N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−
L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニンアミド;
N−アセチル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L
−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルア
ラニンアミド;
L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−
L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニンアミド;
L−リシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ
ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−セリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ
ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−プロリニルー〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)−L−フェニルアラニ
ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;及
び
L−イソロイシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミ
ド;並びにそれらのトリチウム化及びI125ヨウ素化誘導体。
更に、新規なトリチウム化ペプチド、トリチウム化BzN−EJJ−CONH2
、即ち、N−(3,5−ジトリチオ)ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホ
スホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフ
ルオロメチ
ル)〕−L−フェニルアラニンアミド{式中、Eはグルタミン酸であり、Jは(
F2Pmp)部分,(4−ホスホノ(ジフルオロメチル)−L−フェニルアラニ
ル)を表す}が提供される。
本発明は更に、チロシンホスファターゼまたはシステインプロテアーゼに対す
るリガンドの結合親和性を増強する方法を提供する。方法は、リガンドに2つ以
上の4−ホスホノ(ジフルオロメチル)−フェニルアラニン基を導入する段階か
ら成る。本発明はまた、得られたジ置換リガンドを提供する。
本発明は更に、
(a)活性部位の活性に必要なシステインがセリンで置換された野生型酵素の
変異形態と、
(b)上記の(a)を結合させた固体支持体と、
から成る複合体を提供する。図面の簡単な説明
図1は本発明の主要要素、即ち、シンチレーション物質1、支持ビーズ(蛍光
微小球)5、表面結合プロテインA10、連結用抗GST酵素15、融合酵素構
築物20、GST酵素25、変異酵素30、トリチウム化ペプチド阻害物質35
、放射性ペプチド阻害物質35によって放出されるベータ線40、誘導シ
ンチレーションによって放出される光45を示す。
図2(A及びB)は、チロシンホスファターゼの1−320位のアミノ酸を含
む切断形態の酵素PTP1BのDNA配列及びアミノ酸配列を示す(活性部位の
システイン215は下線の付いた太字で示されている)。
図3(A、B及びC)はカテプシンKのDNA配列及びアミノ酸配列を示す。
上部のヌクレオチド配列は、カテプシンKのプレプロ酵素(対応する3文字アミ
ノ酸コードで表す)をコードするカテプシンKのcDNA配列を示す。番号はc
DNAのヌクレオチド位置を示す。下線の付いたアミノ酸はSerまたはAla
に変異した活性部位のCys139残基である。
図4(A及びB)はキャプサーゼ即ちアポパインのDNA配列及びアミノ酸配
列を示す。上部のヌクレオチド配列はアポパインのプロ酵素(対応する3文字ア
ミノ酸コードで表す)をコードするアポパイン(CPP32)のcDNA配列を示
す。番号はcDNAのヌクレオチド位置を示す。下線の付いたアミノ酸はSer
に変異した活性部位のCys163である。発明の詳細な説明
本発明の主な実施態様の基本理論は図1を参照することによって容易に理解さ
れよう。
表面に免疫吸着プロテインA10を含む微小ビーズ(イットリウムシリケート
またはPVTの蛍光微小球、AMERSHAM)5にシンチレーション物質1が
組込まれている。GST酵素25とPTP1B変異酵素30とを含むGST融合
酵素構築物20は抗GST酵素抗体15を介してプロテインAで被覆されたビー
ズ5に結合する。放射性ペプチド例えばトリチウム化ペプチド35が変異ホスフ
ァターゼ酵素30に結合したとき、該ペプチドはビーズ5に十分緊密に近接して
ベータ線40(またはI125の場合はオージェ電子)を放出し、シンチレーショ
ン物質1を刺激して光(光子)45を放出させる。この光45をベータプレート
カウンタでカウント数として測定する。トリチウム化ペプチド35が未結合のと
き、該ペプチドはシンチレーション物質1から離間して存在し、ビーズ5に到達
する前にエネルギーが散逸するので、測定されるカウント数は少ない。変異ホス
ファターゼ酵素30の同一結合部位に対してトリチウム化ペプチド35と競合す
る非放射性リガンドは変異酵素30からトリ
チウム化ペプチド35を除去するか及び/または該ペプチドに置換するので、得
られるカウント数は競合リガンド非含有のペプチド対照よりも少ない。未知のリ
ガンドの濃度を変更し、得られるカウント数の減少を測定することによって、変
異酵素30に対する結合を50%阻害する未知のリガンドの濃度(IC50)が
得られる。この値は、変異酵素及び野生型酵素に対するリガンドの結合能力の判
定基準となり得る。
本文中で使用された“複合体”なる用語は、変異酵素を含有する集成体を意味
する。最も簡単な実施態様では、複合体は、その表面に変異酵素が結合した固体
支持体から成る。リンカーの使用も可能である。図1に示すように、複合体は更
に、ビーズ(フルオポリマー)、抗酵素GST/酵素GST−変異酵素PTP1
Bの連結構築物、免疫吸着プロテインA、及び、シンチレーション物質を含み得
る。一般に、複合体は固体支持体(ビーズ、例えばAl2O3のイムノアッセイカ
ラムまたはシリカゲル)を必要とし、変異酵素は、免疫吸着剤(プロテインA、
プロテインG、抗マウス、抗ウサギ、抗ヒツジ)のような適当なリンカーと、固
体支持体に結合した酵素/抗酵素の構築物のような連結用集成体とを介して結合
することによって固体支持体
に固定または固着されている。
本文中で使用された“システイン含有野生型酵素”なる用語は、活性部位に活
性求核基としてシステインを含有するかまたは結合活性に重要な活性部位に明ら
かに関連したシステインを含有するすべての先天性酵素または自然酵素、例えば
ホスファターゼ、システインプロテアーゼを意味する。
本文中で使用された“結合物質”なる用語は、野生型酵素に結合できかつ通常
は酵素阻害物質として作用できることが判っているすべてのリガンド(化合物)
を意味する。結合物質は測定可能なシグナルを発生させるシグナル発生物質、例
えば放射性核種を担持している。SPAアッセイでは、結合物質は放射性リガン
ドである。
本文中で使用された“測定可能なシグナル”なる用語は、放射性リガンドから
成る結合物質が変異酵素に結合したときに発生する任意の種類のシグナル、例え
ば、放射性シグナル、比色性シグナル、光度シグナル、分光光度シグナル、シン
チレーションシグナルなどを意味する。
本発明のアッセイは更に、従来のホスファターゼ活性アッセイで生じた問題を
解消し得る。従来のアッセイでは、酵素の反
応速度に影響を与える化合物の能力によって化合物を評価していた。しかしなが
ら、該アッセイは、化合物が酵素の活性部位に実際に結合したという直接証拠を
与えることはできなかった。本文中に記載の本発明の結合アッセイは、基質類似
体を使用しており、天然物質の混合物がターゲット酵素中の活性部位のシステイ
ンを不可逆的に修飾しその結果として酵素活性を阻害したか否かを直接決定し得
る。ホスファターゼアッセイ中のこれらの夾雑物による阻害を解消するために、
Cys215がSer215に変異した形態のチロシンホスファターゼPTP1Bをク
ローニングし発現させて、触媒的に不活性の酵素を得た。一般に、システインを
セリンで置換すると、触媒的に不活性の変異酵素または実質的に低下した活性の
変異酵素が得られる。
PTP1Bは、ほぼ均質になるまで精製され{Tonksら,JBC 263
,6731−6737(1988)}、Charbonneauら,PNAS
85,7182−7186(1988)によって配列決定された最初のタンパク
質チロシンホスファターゼである。酵素の配列は、LCAまたはCD45などの
種々の名称で呼ばれている造血細胞中に多量に存在するタンパク質の重複ドメイ
ンに実質的な相同を示した。このタンパ
ク質は、チロシンホスファターゼ活性を有していることが判明した{Tonks
ら,Biochemistry 27,8695−8701(1988)}。タ
ンパク質チロシンホスファターゼは、チオール酸化剤に感受性であることか知ら
れており、PTP1Bの配列を以後にクローニングされたショウジョウバエ及び
哺乳類のチロシンホスファターゼに位置合せすると、システイン残基が保存され
ていることが観察された{(M.Strueliら,Proc.Nat’l A
cad USA,Vol.86,pp.8698−7602(1989)}。こ
の残基がSerに変異すると酵素の触媒活性が失われた。Guanら(1991
){J.B.C.Vol.266,17926−17030,1991}は、ラ
ットのPTP1B相同タンパク質をクローニングし、このタンパク質の切断形態
を細菌中で発現させ、精製して、215位のCysが活性部位残基であることを
証明した。Cys215からSer215への変異の結果として触媒活性が失われた。
ヒトPTP1BはChernoffら,Proc.Natl.Acad.Sci
.USA 87,2735−2739(1990)によってクローニングされた
。
ホスホチロシル類似のF2Pmpを含有するヘキサマーペプチドの合成に関し
てT.Burkeら,Biochem.Biophys.Res.Comm.2
05,pp.129−134(1994)によって発表された研究が、PTP1
Bの基質類似体BzN−EJJ−CONH2の開発に導いた。発明者らは、(F2
Pmp)部分(4−ホスホノ−(ジフルオロメチル)フェニルアラニル)を種々
のペプチドに組込んで、PTP1Bの活性(5nM)阻害物質であるBzN−E
JJ−CONH2(式中のEはグルタミン酸であり、本文中で使用したJはF2P
mp部分を表す)を発見した。次いでこれをトリチウム化すると、結合アッセイ
に必要な放射性基質類似体が得られた。
アミノ酸1−320(図2参照)を含有する切断形態の変異酵素は、基質類似
体Bz−NEJJ−CONH2に高い親和性で結合することが初めて証明された
。変異酵素は野生型酵素よりも酸化剤に対する感受性が低いので、この酵素ファ
ミリーに対する新規な阻害物質の同定に好適である。薬剤スクリーニング中の干
渉性夾雑物を排除する目的で変異酵素を使用することはチロシンホスファターゼ
に限定されることなく、他の酵素結合アッセイにも使用できる。
本発明の基本原理を利用し得る他の結合アッセイ、即ち、活性に対して重要な
反応性システインをセリン(または他の低反応性アミノ酸)で置換した変異酵素
を使用し、アルキル化剤及び酸化剤のようなシステイン修飾試薬に対して酵素を
より安定にするような他の結合アッセイが当業界に存在する。このような他のリ
ガンド結合アッセイとしては例えば、色または蛍光、燐光の発生を測定する比色
アッセイ、分光光度測定アッセイ(例えばELISA、固体吸着剤検定法(so
lid absorbent assays)、及び、紫外線及びガンマ線のよ
うな短い波長または長い波長の光線を発生する他のラジオイムノアッセイがある
。
更に、図1に示すようなフルオポリマー支持ビーズ(AMERSHAM)を使
用しないシンチレーション近接アッセイを行うことも可能である。例えば、Sc
intistrips(登録商標)は市販されており(Wallac Oy,F
inland)、変異酵素複合体のためのシンチラント含有固体支持体として使
用できる。また、当業界で慣用の他の固体支持体も使用できる。
本文中に記載の本発明のアッセイは、タンパク質ホスファターゼ、プロテアー
ゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、などの種々の
システイン含有酵素に使用できる。
ターゲット酵素中のシステインからセリンへの変換は、後出の引用文献中にM
.Strueliらによって記載されたCys215をSer215に変換する
ための分子クローニング法をPTP1Bに応用することによって容易に達成でき
る。従って、この特定目的に関する該文献の記載内容は参照によって本発明に含
まれるものとする。
特に有用なホスファターゼのクラスは細胞機能に重要なチロシンホスファター
ゼである。このクラスの例はPTP1B、LCA、LAR、DLAR、DPTP
(Strueliら,後出、参照)である。例えばPTP1Bを使用してこのア
ッセイで発見されたリガンドは、糖尿病の治療及び免疫抑制に役立つ。
有用な種は、M.StrueliらによってProc.Nat’1,Acad
USA,Vol.86,pp.8698−7602、及び、J.Cherno
ffらによってProc.Nat’l Acad Sci.USA,Vol.8
7,pp.2735−2739に記載されたPTP1Bである。
別の有用な酵素のクラスはシステインプロテアーゼ(チオールプロテアーゼ)
、カテプシン及びキャプサーゼなどのプロテ
アーゼである。
カテプシンクラスのシステインプロテアーゼが重要である。その理由は、カテ
プシンK(別名カテプシン02、D.Brommeら,Biol.Chem.H
oppe−Seyler,Vol.376,pp.379−384,1995年
6月参照)は主としてヒトの砕骨細胞中で発現されるので、本発明のアッセイを
骨粗鬆髭症の研究及び治療に役立てることができるからである。カテプシンK(
O2)の配列、クローニング及び単離に関しては、Human Genome
Sciencesの米国特許第5,501,965号(1996)を参照すると
よい。また、F.DrakeらによるJ.Biol.Chem.Vol.271
,pp.12511−12516(1996)及び前出のD.Brommeらに
よるBiol.Chem.Hoppe−Seyler,Vol.376,pp.
379−384(1985)を参照するとよい。
カテプシンの例としては、カテプシンB、カテプシンG、カテプシンJ、カテ
プシンK(O2)、カテプシンL、カテプシンM及びカテプシンSなどがある。
酵素の別の例はキャプサーゼファミリーのシステインプロテ
アーゼであり、SPA法と変異酵素とを使用してこれらの酵素の放射性阻害物質
と競合する未知の化合物またはその混合物の能力を決定できる。活性部位が変異
したヒトアポパインCPP32(キャプサーゼ−3)の変異体を調製した。活性
部位のチオールが変異した酵素は酸化剤に対する感受性が低下しており、このフ
ァミリーの酵素に対する新規な阻害物質の同定に好適である。
キャプサーゼファミリーの例としては、キャプサーゼ−1(ICE)、キャプ
サーゼ−2(ICH−1)、キャプサーゼ−3(CPP32、ヒトアポパイン、
Yama)、キャプサーゼ−4(ICErel−11、TX、ICH−2)、キ
ャプサーゼ−5(ICErel−111、TY)、キャプサーゼ−6(Mch2
)、キャプサーゼ−7(Mch3、ICE−LAP3、CMH−1)、キャプサ
ーゼ−8(FLICE、MACH、Mch5)、キャプサーゼ−9(ICE−L
AP6、Mch6)及びキャプサーゼ−10(Mch4)がある。
システインがセリン(または酸化剤及びアルキル化剤に対する活性を低下させ
る他の任意のアミノ酸、例えばアラニン)で置換されても、天然リガンドに対す
る変異酵素の結合能力は変
化しない。結合の程度、即ち結合定数は増加または減少するかもしれない。しか
しながら、変異酵素の触媒活性は実質的に減少するかまたは完全に除去される。
従って、天然の野生型酵素に結合する天然リガンド及び合成リガンドは変異酵素
にも結合するであろう。
また、システインがセリンで置換されると、天然酵素と同じ定性的結合能力を
有するが触媒活性は有意に低下した変異酵素が産生される。従って、本発明のア
ッセイでは被験リガンドの正確な結合能力が実際に測定される。
本文中に記載の被験リガンドは、薬剤スクリーニングの目的に有用であると予
測される新規なリガンドであり、その作用モードは一般には酵素の阻害物質とし
て機能することである。
結合物質は通常は、対照として使用される既知のリガンドであり、天然の野生
型酵素及びアッセイで使用される変異酵素に結合することができ、既知の酵素ペ
プチド阻害物質として選択される。
結合物質はまた、アッセイ中にシグナルを発生または誘導する既知のシグナル
発生物質、例えば燐光または蛍光(ELISA)、呈色反応またはシンチレーシ
ョンシグナルを誘導する物質を含
有し得る。
アッセイがシンチレーションアッセイである本発明の実施態様において、シグ
ナル物質は固体支持体中のシンチラントによる測定可能な光線の放出、即ち光子
の放出を誘導する放射性核種、即ちトリチウム、I125である。放出された光線
は慣用のシンチレーションカウンタ及びベータ線カウンタを使用して測定できる
。
発明者らはまた、既知の結合物質に2つ以上の4−ホスホノジフルオロメチル
フェニルアラニン(F2Pmp)基を導入すると、酵素に対する結合物質の結合
親和性が著しく増進され、形成された複合体の加水分解性開裂を生じ難くするこ
とによって複合体の安定性が改善されることを知見した。
1個のF2Pmp部分をリガンドに導入する方法は当業界で公知であり、Bi
ochem.Biophys.Res.Comm.Vol.204,pp.12
9−134(1994)に詳細に記載されている。この特定目的に関する該文献
の記載は参照によって本発明に含まれるものとする。
この方法の結果として、発明者らはPTP1Bに対して極めて優れた結合親和
性を有している新規なリガンドのクラスを発
見した。これらのリガンドの例は、
N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−
L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニンアミド;
N−アセチル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L
−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルア
ラニンアミド;
L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ
ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−リシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ
ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−セリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ
ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−プロリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ
ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕
−L−フェニルアラニンアミド;及び
L−イソロイシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミ
ド;
である。
この系列の有用なリガンドは、N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホス
ホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフル
オロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミドという化学名のBz−NEJJ−
CONH2、及び、そのトリチウム化形態N−(3,5−ジトリチオ)ベンゾイ
ル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルア
ラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド
である。
ホットリガンド及びコールドリガンドの双方の合成を実施例に記載する。
以下の実施例は本発明の実施の代表例であり、本発明の範囲及び要旨がこれら
の実施例に限定されると考えてはならない。実施例
1.切断形態のPTP1B(アミノ酸配列1−320)及び融合構築物GST− PTP1Bの調製
全長のPTPIBタンパク質を発現するPETプラスミドを担持する大腸菌培
養物は、J.Chernoffら,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,87,pp.2735−2739(1990)に開示されている。この方
法の改正方法を使用し、アミノ酸1−320(両端を含む)から成る活性部位含
有の切断形態のPTP1B酵素の複合体を以下の手順で作製した。
PETベクターにクローニングした全長ヒトPTP−1BcDNA配列(J.
Chernoffら,PNAS,USA,前出に発表)をDr.Raymond
Erickson(Harvard University)から入手した。
全長配列を鋳型として用い、アミノ酸1−320(配列1)をコードしているP
TP−1B cDNA配列をPCRによって増幅した。増幅に使用した5’プラ
イマーは5’端にBamHI部位を含み、3’プライマーは3’端にEcoRI
部位を有していた。増幅したフラグメントをpCR2(Invitrogen)
にクローニングし、配列決定して、増幅中にTaqポリメラーゼによって配列エ
ラーが導入されなかったことを確認した。この配列をBamHI/EcoRI消
化によってpCR2から分離し、PTP−1B cDNAフラグメントを、同じ
酵素で消化しておいたGST融合ベクターpGEX−2T(Pharmacia
)に結合させた。大腸菌中で発現した融合タンパク質GST−PTP−1Bは活
性のタンパク質チロシンホスファターゼ活性を有している。この同じ1−320
PTP−1B配列(配列1)を次に、発現ベクタ−pFLAG−2にクローニ
ングした。FLAGはオクタペプチドAspTyrLysAspAspAspA
spLysである。このクローニングのために、PTP−1B配列をpGEX−
2TベクターからNcoI/EcoRI消化によって分離し、このフラグメント
の末端をクレノウによって埋め戻し、平滑末端をpFLAG2の平滑化したEc
oRI部位に結合させた。StratageneのCameleon(Stra
tagene)二重鎖変異誘発キットを用いてpFLAG2−PTP−1Bの部
位特異的変異を誘発し、活性部位Cys−215をセリンで置換した。ほぼ製造
業者の指示通りに変異誘発を行って、変異体をDNA配列決定
によって同定した。FLAG−PTP−1B Cys215Ser変異体(配列7
)を発現させ、精製し、ホスファターゼ活性が全くないことを確認した。GST
−PTP−1B Cys215Ser変異体は、pFLAG2に既にクローニング
したPTP−1BのCys215Ser変異配列を用いて以下の手順で作製した。
プラスミドpFLAG2−PTP−1B Cys215Ser(配列7)をSal
I(PTP−1B配列の3’端)で消化し、クレノウポリメラーゼ(New E
ngland Biolabs)を用いて埋め戻し、酵素を熱失活させ、DNA
をBglIIで再度消化した。変異した活性部位を含む500bpの3’PTP
−1B cDNAフラグメントを分離し回収した。プラスミドpGEX−2T−
PTP−1BをEcoRI(PTP−1B配列の3’端)で消化し、クレノウで
埋め戻し、フェノール/クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。このDN
Aを次にBglIIで消化すると、2つのDNAフラグメント、即ち、活性部位
を含む500bpの3’PTP−1B cDNAフラグメントと、PTP−1B
の5’端が付加されたpGEX−2Tベクターを含む5.5Kbのフラグメント
とが得られた。5.5KbのpGEX−2T,5’PTP−1Bフラグメントを
回
収し、変異活性部位を含む500bpのBglII/SalIフラグメントに結
合させた。結合物で細菌(タイプDH5α,G)を形質転換させ、変異活性部位
配列を含むクローンを配列決定によって同定した。GST−PTP−1B Cy
s215Ser変異体を超発現させ、精製し、ホスファターゼ活性を全く有してい
ないことを確認した。
2.トリチウム化Bz−NEJJ−CONH2の調製
この化合物は後出の反応スキーム1に概略的に示し以下に記載する手順によっ
て合成できる。N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L −フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルア ラニンアミド(BzN−EJJ−CONH2)の合成
反応スキーム1の陰影をつけたビーズによって表す1.0gのTentGel
(登録商標)S RAM樹脂(RAPPポリマー、〜0.2ミリモル/g)をD
MF(5ml)中のピペリジン(3ml)で30分間処理した。樹脂(円Pで示
す、有機分子のアミノ基以外の部分を含む)をDMF(3×10ml)及びCH2
Cl2(10ml)で順次洗浄し、風乾した。DMF
(5ml)とN∞−Fmoc−4−〔ジエチルホスホノ−(ジフルオロメチル)
〕−L−フェニルアラニン(350mg)〔ここでFmocは9−フルオレニル
メトキシカルボニル〕とO−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,
1,3,3−テトラメチルウラニウムヘキサフルオロホスフェート(頭文字語は
HATU、228mg)との溶液をジイソプロピルエチルアミン(0.21ml
)で処理し、15分後、3mlもDMF中の樹脂に添加した。1時間後、樹脂を
DMF(3×10ml)及びCH2Cl2(10ml)で順次洗浄し、風乾した。
1回目はN∞−Fmoc−4−〔ジエチルホスホノ−(ジフルオロメチル)〕
−L−フェニルアラニンを使用し、2回目はN−Fmoc−L−グルタミン酸ガ
ンマ−t−ブチルエステルを使用して、この手順を2回繰り返した。最終結合の
後、樹脂結合トリペプチドをDMF(5ml)中のピペリジン(3ml)の混合
物で30分間処理し、次いでDMF(3×10ml)及びCH2Cl2(10ml
)で順次洗浄し、風乾した。
DMF(1ml)中の安息香酸(61mg)とHATU(190mg)との溶
液に、ジイソプロピルエチルアミン(0.17ml)を添加し、この混合物を1
5分後に、先に調製した樹脂
の一部(290mg)を含む1mlのDMFに添加した。90分後、樹脂をDM
F(3×10ml)及びCH2Cl2(10ml)で順次洗浄し、風乾した。
樹脂を2mlのTFA:水(9:1)混合物及び0.05mlのトリイソプロ
ピルシラン(TIPS−H)で1時間処理した。樹脂を濾別し、濾液を水(2m
l)で希釈し、真空下、35℃で濃縮した。残渣を2.5mlのTFA:DMS
:TMSOTf(5:3:1)混合物及び0.05mlのTIPS−Hで処理し
、25℃で15時間撹拌した(TFAはトリフルオロ酢酸、DMSはジメチルス
ルフェート、TMSOTfはトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート
である)。
標題化合物である所望のトリペプチドを、逆相HPLC(C18カラム、25
×100mm)によって、40分間で水中0.2%TFAから50/50アセト
ニトリル/水中0.2%TFAまでの移動相勾配を用いて精製し、230nmで
モニターした。約14.3分後に溶出した画分を捕集し、濃縮し、凍結乾燥する
と、標題化合物が白色泡状物質として得られた。N−(3,5−ジトリチオ)ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジ フルオロメチル)〕−L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチ ル)〕−L−フェニルアラニンアミドの合成
安息香酸の代わりに3,5−ジブロモ安息香酸を用い、BzN−EJJ−CO
NH2の合成に関する上述の手順を繰り返した。30分間の勾配の使用及び約1
8.3分後の画分の捕集を除けば前述と同様のHPLC精製後、ジブロモ含有ト
リペプチドが白色泡状物質として得られた。
この物質の一部(2mg)をメタノール/トリエチルアミン(0.5ml、1
/4)に溶解し、10%のPd−C(2mg)を添加し、混合物をトリチウムガ
ス雰囲気下で24時間撹拌した。混合物をセライトで濾過し、メタノールで洗浄
し、濾液を濃縮した。C18カラム及びアセトニトリル/水中0.2%TFA(
15:100)のアイソクラチック移動相を用いる準分取HPLCによる精製後
に標題化合物が得られた。約5分後に溶出する画分を捕集し、真空下で濃縮した
。標題化合物を10mlのメタノール/水(9:1)に溶解させると、比活性3
9.4Ci/ミリモルを有する0.1mg/mlの溶液が得られた。反応スキーム1 反応スキーム1続き 反応スキーム1続き 上述のBzN−EJJ−CONH2の合成手順に従って、以下の他のペプチド
阻害物質を同様にして調製した:
N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−
L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニンアミド;
N−アセチル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L
−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフ
ルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ
ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−リシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ
ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−セリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ
ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−プロリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ
ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
及び
L−イソロイシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミ
ド。
4.ホスファターゼアッセイプロコトル 材料
:
EDTA:エチレンジアミン四酢酸(Sigma);
DMH:N,N’−ジメチル−N,N’−ビス(メルカプトアセチル)−ヒドラ
ジン(J.Org.Chem.56,pp.2332−2337,(1991)
にR.Singh及びG.M.Whitesidesによって発表された手順で
合成できDTT−ジチオトレイトールで置換できる);
ビストリス:2,2−ビス(ヒドロキシメチル)−2,2’,2”−ニトリロト
リエタノール(Sigma);
トリトンX−100:オクチルフェノールポリ(エチレングリコールエーテル)
10(Pierce);
抗体:抗−グルタチオンS−トランスフェラーゼウサギ(H及びL)画分(Mo
lecular Probes);
酵素:アフィニティクロマトグラフィーで精製したGST酵素(グルタチオンS
−トランスフェラーゼ)に融合したアミノ酸1−320(配列1)含有のヒト組
換えPTP1B。野生型(配列1)は活性部位システイン(215)を含むが、変
異体(配列7)は活性部位セリン(215)を含む;
トリチウム化ペプチド:Bz−NEJJ−CONH2、分子量808、実験式C3 2
H32T2O12P2F4:予製液
:
アッセイバッファ:50mMのビストリス(Sigma),
(10×) pH6.2,分子量209.2;
20mMのEDTA(GIBCO/BRL)
(4℃で保存)新鮮な毎日調製液
:
アッセイバッファ:50mMのビストリス
(1×) 2mMのEDTA
(室温) 5mMのDMH(分子量208)酵素希釈液
:
バッファ :50mMのビストリス
(氷上保存) 2mMのEDTA
5mMのDMH
20%のグリセロール(Sigma)
0.01mg/mlのトリトンX−100
(Pierce)抗体希釈液
:
バッファ :50mMのビストリス
(氷上保存) 2mMのEDTAIC50結合アッセイプロトコル
:
特異的ホスファターゼに対する放射性リガンドの結合を阻害する能力をもつと
予測される化合物(リガンド)を96ウェルプレートフォーマットで以下の手順
でスクリーニングする。
以下の溶液(25℃)を以下の順序で各ウェルに添加する。
1.110μlのアッセイバッファ。
2.アッセイバッファ(1×)中に50nMのトリチウム化BzN−EJJ−C
ONH2を含む10μlの溶液(25℃)。
3.DMSO中に異なる10段階の系列希釈濃度(最終濃度はDMSO中で約5
%v/v)の被験化合物を含む10μlの溶液の重複サンプル(25℃)。
4.酵素希釈バッファ中に3.75μg/mlの精製ヒト組換えGST−PTP
1Bを含む10μlの溶液。
5.プレートを2分間振盪させる。
6.0.3μg/mlの抗−グルタチオンS−トランスフェラーゼ(抗−GST
)ウサギIgG(Molecular Probes)を抗体希釈バッファに希
釈した10μlのサンプル(25℃)。
7.プレートを2分間振盪させる。
8.50μlのプロテインA−PVT SPAビーズ(Amersham)(2
5℃)。
9.プレートを5分間振盪させる。Microbetaの96ウェルプレートカ
ウンターで結合シグナルを定量する。
10.非特異的シグナルは抗−GST抗体の非存在下の酵素−リガンド結合であ
ると定義する。
11.100%結合活性は抗−GST抗体の存在下で被験リガンドの非存在下の
酵素−リガンド結合から非特異的結合を減算した値であると定義する。
12.上記に基づいて阻害パーセンテージを計算する。
13.(“Robust Statistics”,New York,Wil
eyにP.J.Huber(1981)によって記載された)4変数/多数部位
の式による非線形回帰適合によってIC50値を概算し単位nMで記録する。
14.10nMで90%を上回る阻害を示した被験リガンド(化合物)を活性リ
ガンドであると定義する。
以下の表Iは結合物質BzN−EJJ−CONH2の結合を競合的に阻害する
公知化合物の実例の代表的なアッセイ結果を示す。 カテプシンK(O2)の変異体の調製(CAT−K変異体)
カテプンシKはヒト砕骨細胞中の主要なシステインプロテアーゼであり、砕骨
細胞に介在される骨吸収に重要な役割を果たすと考えられている。カテプシンK
の阻害物質は、過度の骨吸収が生じる骨疾患(例えば骨粗鬆症)の治療に有用で
あろう。カテプシンKは不活性のプレプロ酵素(配列4)として合成される。完
全な触媒活性を発揮するためには、プレドメイン(Met1−Ala15)とプロ
ドメイン(Leu16−Arg114)との双方が除去される必要がある。成熟形態
のプロテアーゼ(Ala115−Met329)は活性部位にCys残基(Cys139
)を含んでいる。
同定されたクローンのPCR指令鋳型修飾によってMetAla115−Met3 29
構築物として細菌及びその他の組換え系中で発現するように成熟形態のカテプ
シンKを作製する。エピトープで標識した変異体(Met〔FLAG〕Ala11 5
−Met329及びMetAla115−Met329〔FLAG〕;ここにFLAGは
オクタペプチドAspTyrLysAspAspAspAspLysである)も
作製する。結合アッセイを設計する目的で、Met〔FLAG〕Ala115−〔
Cys139
をSer139で置換〕−Met329及びMetAla115−〔Cys139をSer13 9
で置換〕−Met329〔FLAG〕(ここでは活性部位CysがSer残基に変
異している)、並びに、Met〔FLAG〕ALa115−〔Cys139をAla13 9
で置換〕−Met329及びMetAla115−〔Cys139をAla139で置換〕
−Met329〔FLAG〕(ここでは活性部位CysがSAla残基に変異して
いる)を含む別の幾つかの構築物を作製する。どの場合にも、得られた新しいポ
リペプチドを結合アッセイに使用でき、使用するときは市販の特異的抗FLAG
抗体(IDI−KODAK)を介して変異酵素をSPAビーズに結合させるとよ
い。他のエピトープ標識、GST及び他の融合物もこの目的に使用でき、また、
SPA以外の結合アッセイフォーマットも使用できる。カテプシンKの好ましい
基質(例えば、Ac−P2−P1、Ac−P2−P1−アルデヒド、Ac−P2
−P1−ケトン;ここでP1は親水性側鎖をもつアミノ酸好ましくはArgまた
はLysであり、P2は小さい疎水性側鎖をもつアミノ酸、好ましくはLeu、
ValまたはPheである)に基づくリガンドは、放射性標識(トリチウム化)形
態でSPA利用結合アッセイに好適である。
他のカテプシンファミリーの酵素に対しても同様の結合アッセイを設計し得る。アポパイン(キャプサーゼ−3)変異体の調製
アポパインはキャプサーゼスーパーファミリーのICE/CED−3様酵素に
属する活性形態のシステインプロテアーゼである。アポパインは、32kDaの
プロ酵素ポリペプチド(p32)内部に触媒活性酵素の17kDaの大サブユニ
ット(p17)と12kDaの小サブユニット(p12)との双方を含有する触
媒的に不活性のプロ酵素に由来する。アポパインは、アポプトーシスによる細胞
死のエフェクターメカニズムの重要な介在物質であり、この酵素または構造的に
近縁のアイソフォームの活性を調節するモジュレーターは、例えばアルツハイマ
ー病のような不適切なアポプトーシスが顕著に生じる疾病の治療に有用であろう
。
アポパインの産生に使用した方法では、大腸菌中で個別に発現されたその構成
成分p17サブユニット及びp12サブユニットから活性酵素を折り畳む。PC
R指令鋳型修飾によってそれぞれ構築物MetSer29−Asp175及びMet
Ser176−His277として発現するようにアポパインp17
サブユニット(Ser29−Asp175)及びp12サブユニット(Ser176−H
is277)を作製する。結合アッセイを設計するために、MetSer29−〔C
ys163をSer163で置換〕−Asp175の大サブユニット及びMet1−〔
Cys163をSer163で置換〕−His277プロ酵素などの複数の別の構築物を
作製する。前者の場合には、大サブユニット(p17)中の活性部位Cys残基
を部位特異的変異誘発によってSer残基で置換する。この大サブユニットを次
に組換えp12サブユニットと共に再生し、活性部位CysがSerに変異した
だけの成熟形態の酵素を作製する。後者の場合には、同様にCys163をSer1 63
に変異させるが、完全プロ酵素が発現される。双方の場合に、得られた新しい
ポリペプチドは結合アッセイに使用でき、使用するときはアポパインを認識する
ために作製した特異的抗体(プロドメイン、大サブユニットp17、小サブユニ
ットp12及び完全なp17:p12活性酵素のそれぞれに対する抗体を作製し
た)を介して変異酵素をSPAに結合させる。エピトープ標識またはGSTまた
は他の融合物もこの目的に使用でき、また、SPA以外の結合アッセイフォーマ
ットも使用できる。
Ac−AspGluValAsp、Ac−AspGluValAsp−アルデ
ヒド、Ac−AspGluValAsp−ケトンのようなアポパインの好ましい
基質(AspGluValAspの変異体)に基づくリガンドは、放射性標識形
態でSPA利用結合アッセイに好適である。他のキャプサーゼファミリーの酵素
に対しても同様の結合アッセイを設計し得る。配列表の説明
配列1は、図2A及び図2Bの上の行に示すPTP1Bチロシンホスファター
ゼ酵素のセンスDNA鎖である。
配列2は、図2A及び図2Bに示すPTP1Bチロシンホスファターゼ酵素の
アミノ酸配列である。
配列3は、図3A、図3B及び図3Cの上の行に示すカテプシンKプレプロ酵
素のセンスcDNA鎖である。
配列4は、図3A、図3B及び図3Cに示すカテプシンKプレプロ酵素のアミ
ノ酸配列である。
配列5は、図4A及び図4Bの上の行に示すCPP32アポパインプロ酵素の
センスcDNA鎖である。
配列6は、図4A及び図4Bに示すCPP32アポパインプロ酵素のアミノ酸
配列である。
配列7は、ヒトPTP−1B1-320Ser変異体のcDNA配列である。
配列8は、ヒトPTP−1B1-320Ser変異体のアミノ酸配列である。
配列9は、アポパインC163S変異体のcDNA配列である。
配列10は、アポパインC163S変異体のアミノ酸配列である。
配列11は、アポパインC163S変異体の大サブユニットのヘテロダイマー
のアミノ配列である。
配列12は、カテプシンK C139S変異体のcDNA配列である。
配列13は、カテプシンK C139A変異体のcDNA配列である。
配列14は、カテプシンK C139S変異体のアミノ配列である。
配列15は、カテプシンK C139A変異体のアミノ配列である。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】平成10年11月13日(1998.11.13)
【補正内容】
請求の範囲
1.システイン含有野生型酵素に対するリガンドの結合能力を測定する方法であ
って、
活性部位のシステインがセリンで置換された、野生型酵素の変異形態と固体支
持体とを含む複合体を、変異酵素に対する既知の結合物質の存在下で前記リガン
ドに接触させる段階から成り、前記結合物質と前記リガンドとは変異酵素の活性
部位において結合について競合して測定可能なシグナルを発生し得ることを特徴
とする方法。
2.更に、測定可能な初期シグナルを発生させるために、リガンドの非存在下で
複合体を結合物質に接触させる段階を含む請求項1に記載の方法。
3.シグナルが比色シグナル、光度シグナル、分光光度シグナルまたは放射性シ
グナルであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
4.シグナルがベータ線誘導シンチレーションであることを特徴とする請求項3
に記載の方法。
5.既知の結合物質が野生型酵素の阻害物質であり、変異酵素
に接触してシンチレーションを誘導する放射性核種を含有していることを特徴と
する請求項1に記載の方法。
6.複合体が更に、固体支持体、シンチレーション物質及び融合酵素連結構築物
を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
7.複合体が更に、
(a)シンチレーション物質とプロテインAとを含有しているフルオロポリマ
ービーズと、
(b)プロテインAを介して前項(a)のビーズに結合している抗GST抗体
と、
(c)変異酵素に融合したGST酵素から成り、GST端に前項(b)の抗体
が結合している融合酵素連結構築物と、
から成ることを特徴とする請求項6に記載の方法。
8.野生型酵素が、プロテアーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ及
びキナーゼから成るグループから選択されることを特徴とする請求項1に記載の
方法。
9.野生型酵素が、チロシンホスファターゼ及びシステインプロテアーゼから成
るグループから選択されることを特徴とする請求項8に記載の方法。
10.チロシンホスファターゼがPTP1B、LCA、LAR、DLAR及びD
PTPから成るグループから選択されることを特徴とする請求項9に記載の方法
。
11.チロシンホスファターゼが、215位のシステインに置換したセリンを含
有するPTP1Bであることを特徴とする請求項11に記載の方法。
12.PTP1Bホスファターゼが、アミノ酸1−320から成り活性結合部位
を含有している切断形態で存在することを特徴とする請求項11に記載の方法。
13.システインプロテアーゼがカテプシンまたはキャプサーゼであることを特
徴とする請求項9に記載の方法。
14.カテプシンが、カテプシンB、カテプシンG、カテプシンJ、カテプシン
K(O2)、カテプシンL、カテプシンM及びカテプシンSから成るグループか
ら選択されることを特徴とする請求項13に記載の方法。
15.カテプシンがカテプシンK(O2)であることを特徴とする請求項14に
記載の方法。
16.キャプサーゼが、キャプサーゼ−1(ICE)、キャプサーゼ−2(IC
H−1)、キャプサーゼ−3(CPP32、
ヒトアポパイン、Yama)、キャプサーゼ−4(ICErel−11、TX、
ICH−2)、キャプサーゼ−5(ICErel−111、TY)、キャプサー
ゼ−6(Mch2)、キャプサーゼ−7(Mch3、ICE−LAP3、CMH
−1)、キャプサーゼ−8(FLICE、MACH、Mch5)、キャプサーゼ
−9(ICE−LAP6、Mch6)及びキャプサーゼ−10(Mch4)から
成るグループから選択されることを特徴とする請求項11に記載の方法。
17.キャプサーゼがヒトアポパインCPP32であることを特徴とする請求項
16に記載の方法。
18.チロシンホスファターゼがPTP1Bであり、結合物質が、
N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−
L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニンアミド(BzN−EJJ−CONH2){式中、Eはグルタミン酸であり
、Jは4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニルを表す};
N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフル
オロメチル)〕−L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)
〕−L−フェニルアラニンアミド;
N−アセチル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L
−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルア
ラニンアミド;
L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ
ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−リシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ
ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−セリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ
ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕L−フェニルアラニンアミド;
L−プロリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ
ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
及び
L−イソロイシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチ
ル)〕−L−フェニルアラニンアミド
から成るグループから選択されたペプチドであることを特徴とする請求項11に
記載の方法。
19.ペプチドがトリチウム化形態であることを特徴とする請求項18に記載の
方法。
20.ペプチドが、トリチウム化N−(3,5−ジトリチオ)ベンゾイル−L−
グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニル−
〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド、即ち、
トリチウム化Bz−NEJJ−CONH2{式中、Eはグルタミン酸であり、J
は(F2Pmp)部分,(4−ホスホノ(ジフルオロメチル)−L−フェニルア
ラニル)を表す}であることを特徴とする請求項18に記載の方法。
21.システイン含有野生型チロシンホスファターゼに対するリガンドの結合能
力を測定する方法であって、
(a)野生型酵素の215位のシステインが変異酵素ではセリンで置換されて
いる以外は変異酵素PTP1Bが野生型酵素と同じアミノ酸1−320の配列を
含んでいる野生型酵素の変異形態を含む複合体を、変異酵素に対する既知の放射
性リガン
ドから成る結合物質の存在下でリガンドに接触させる段階から成り、結合物質が
変異酵素に結合して測定可能なベータ線誘導シンチレーションシグナルを発生し
得ることを特徴とする方法。
22.更に、測定可能な初期ベータ線誘導シンチレーションシグナルを発生させ
るために、段階(a)に先立って、複合体をリガンドの非存在下で結合物質に結
合させる段階を含む請求項21に記載の方法。
23.結合物質が、
N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−
L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニンアミド(BzN−EJJ−CONH2){式中、Eはグルタミン酸であり
、Jは4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニルを表す};
N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−
L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニンアミド;
N−アセチル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L
−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフ
ルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ
ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−リシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ
ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−セリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ
ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−プロリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ
ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
及び
L−イソロイシニルー〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミ
ド
から成るグループから選択されたペプチドであることを特徴とする請求項21に
記載の方法。
24.ペプチドがトリチウム化形態またはI125ヨウ素化形態
であることを特徴とする請求項23に記載の方法。
25.ペプチドが、トリチウム化N−(3,5−ジトリチオ)ベンゾイル−L−
グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニル−
〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド、即ち、
トリチウム化Bz−NEJJ−CONH2{式中、Eはグルタミン酸であり、J
は(F2Pmp)部分,(4−ホスホノ(ジフルオロメチル)−L−フェニルア
ラニル)を表す}であることを特徴とする請求項24に記載の方法。
26.(a)活性に必要な活性部位のシステインがセリンで置換された野生型酵
素の変異体と、
(b)前記変異体を結合させた固体支持体と、
から成る複合体。
27.更に、変異酵素に対する結合物質を含み、前記結合物質が変異酵素に結合
して測定可能なシグナルを発生し得ることを特徴とする請求項26に記載の複合
体。
28.N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)
〕−L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェ
ニルアラニンアミド(Bz
N−EJJ−CONH2){式中、Eはグルタミン酸であり、Jは4−ホスホノ(
ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニルを表す};
N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−
L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニンアミド;
N−アセチル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L
−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルア
ラニンアミド;
L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ
ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−リシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ
ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−セリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ
ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド;
L−プロリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−
L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニンアミド;及び
L−イソロイシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル
アラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミ
ド
から成るグループから選択されることを特徴とする変異酵素に対する結合物質と
して使用するためのペプチド。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C07K 5/097 C07K 5/097
C12N 11/00 C12N 11/00
C12Q 1/48 C12Q 1/48 Z
G01N 33/573 G01N 33/573 A
// C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA
(72)発明者 フリーセン,リチヤード
カナダ国、ケベツク・アシユ・9・アシ
ユ・3・エル・1、カークランド、トラン
ス・カナダ・ハイウエイ・16711
(72)発明者 グレツサー,マイケル
カナダ国、ケベツク・アシユ・9・アシ
ユ・3・エル・1、カークランド、トラン
ス・カナダ・ハイウエイ・16711
(72)発明者 ケネデイー,ブライアン
カナダ国、ケベツク・アシユ・9・アシ
ユ・3・エル・1、カークランド、トラン
ス・カナダ・ハイウエイ・16711
(72)発明者 ニコルソン,ドン
カナダ国、ケベツク・アシユ・9・アシ
ユ・3・エル・1、カークランド、トラン
ス・カナダ・ハイウエイ・16711
(72)発明者 ラマチヤンドラン,チダンバラン
カナダ国、ケベツク・アシユ・9・アシ
ユ・3・エル・1、カークランド、トラン
ス・カナダ・ハイウエイ・16711
(72)発明者 スコレイ,キヤサリン
カナダ国、ケベツク・アシユ・9・アシ
ユ・3・エル・1、カークランド、トラン
ス・カナダ・ハイウエイ・16711
(72)発明者 フオード―ハツチンソン,アンソニー
カナダ国、ケベツク・アシユ・9・アシ
ユ・3・エル・1、カークランド、トラン
ス・カナダ・ハイウエイ・16711
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.システイン含有野生型酵素に対するリガンドの結合能力を測定する方法であ って、 (a)活性部位のシステインがセリンで置換された、野生型酵素の変異形態を 含む複合体を、変異酵素に対する既知の結合物質の存在下でリガンドに接触させ る段階から成り、前記結合物質は変異酵素に結合して測定可能なシグナルを発生 し得ることを特徴とする方法。 2.更に、測定可能な初期シグナルを発生させるために、リガンドの非存在下で 複合体を結合物質に接触させる段階を含む請求項1に記載の方法。 3.シグナルが比色シグナル、光度シグナル、分光光度シグナルまたは放射性シ グナルであることを特徴とする請求項1に記載の方法。 4.シグナルがベータ線誘導シンチレーションであることを特徴とする請求項3 に記載の方法。 5.既知の結合物質が野生型酵素の阻害物質であり、変異酵素に接触してシンチ レーションを誘導する放射性核種を含有して いることを特徴とする請求項1に記載の方法。 6.複合体が更に、固体支持体、シンチレーション物質及び融合酵素連結構築物 を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。 7.複合体が更に、 (a)シンチレーション物質とプロテインAとを含有しているフルオロポリマ ービーズと、 (b)プロテインAを介して前項(a)のビーズに結合している抗GST抗体 と、 (c)変異酵素に融合したGST酵素から成り、GST端に前項(b)の抗体 が結合している融合酵素連結構築物と、 から成ることを特徴とする請求項6に記載の方法。 8.野生型酵素が、プロテアーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ及 びキナーゼから成るグループから選択されることを特徴とする請求項1に記載の 方法。 9.野生型酵素が、チロシンホスファターゼ及びシステインプロテアーゼから成 るグループから選択されることを特徴とする請求項8に記載の方法。 10.チロシンホスファターゼがPTP1B、LCA、LAR、 DLAR及びDPTPから成るグループから選択されることを特徴とする請求項 9に記載の方法。 11.チロシンホスファターゼが、215位のシステインに置換したセリンを含 有するPTP1Bであることを特徴とする請求項11に記載の方法。 12.PTP1Bホスファターゼが、アミノ酸1−320から成り活性結合部位 を含有している切断形態で存在することを特徴とする請求項11に記載の方法。 13.システインプロテアーゼがカテプシンまたはキャプサーゼであることを特 徴とする請求項9に記載の方法。 14.カテプシンが、カテプシンB、カテプシンG、カテプシンJ、カテプシン K(O2)、カテプシンL、カテプシンM及びカテプシンSから成るグループか ら選択されることを特徴とする請求項13に記載の方法。 15.カテプシンがカテプシンK(O2)であることを特徴とする請求項14に 記載の方法。 16.キャプサーゼが、キャプサーゼ−1(ICE)、キャプサーゼ−2(IC H−1)、キャプサーゼ−3(CPP32、ヒトアポパイン、Yama)、キャ プサーゼ−4(ICEre1 −11、TX、ICH−2)、キャプサーゼ−5(ICErel−111、TY )、キャプサーゼ−6(Mch2)、キャプサーゼ−7(Mch3、ICE−L AP3、CMH−1)、キャプサーゼ−8(FLICE、MACH、Mch5) 、キャプサーゼ−9(ICE−LAP6、Mch6)及びキャプサーゼ−10( Mch4)から成るグループから選択されることを特徴とする請求項11に記載 の方法。 17.キャプサーゼがヒトアポパインCPP32であることを特徴とする請求項 16に記載の方法。 18.チロシンホスファターゼがPTP1Bであり、結合物質が、 N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕− L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル アラニンアミド(BzN−EJJ−CONH2){式中、Eはグルタミン酸であり 、Jは4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニルを表す}; N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕− L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジ フルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド; N−アセチル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L −フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルア ラニンアミド; L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド; L−リシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド; L−セリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド; L−プロリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド; 及び L−イソロイシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル アラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミ ド から成るグループから選択されたペプチドであることを特徴とする請求項11に 記載の方法。 19.ペプチドがトリチウム化形態であることを特徴とする請求項18に記載の 方法。 20.ペプチドが、トリチウム化N−(3,5−ジトリチオ)ベンゾイル−L− グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニル− 〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド、即ち、 トリチウム化Bz−NEJJ−CONH2{式中、Eはグルタミン酸であり、Jは (F2Pmp)部分,(4−ホスホノ(ジフルオロメチル)−L−フェニルアラ ニル)を表す}であることを特徴とする請求項18に記載の方法。 21.システイン含有野生型チロシンホスファターゼに対するリガンドの結合能 力を測定する方法であって、 (a)野生型酵素の215位のシステインが変異酵素ではセリンで置換されて いる以外は変異酵素PTP1Bが野生型酵素と同じアミノ酸1−320の配列を 含んでいる野生型酵素の変異形態を含む複合体を、変異酵素に対する既知の放射 性リガンドから成る結合物質の存在下でリガンドに接触させる段階から 成り、結合物質が変異酵素に結合して測定可能なベータ線誘導シンチレーション シグナルを発生し得ることを特徴とする方法。 22.更に、測定可能な初期ベータ線誘導シンチレーションシグナルを発生させ るために、段階(a)に先立って、複合体をリガンドの非存在下で結合物質に結 合させる段階を含む請求項21に記載の方法。 23.結合物質が、 N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕− L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル アラニンアミド(BzN−EJJ−CONH2){式中、Eはグルタミン酸であり 、Jは4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニルを表す}; N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕− L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル アラニンアミド; N−アセチル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L −フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルア ラニンアミド; L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド; L−リシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド; L−セリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド; L−プロリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド; 及び L−イソロイシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル アラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミ ド から成るグループから選択されたペプチドであることを特徴とする請求項21に 記載の方法。 24.ペプチドがトリチウム化形態またはI125ヨウ素化形態であることを特徴 とする請求項23に記載の方法。 25.ペプチドが、トリチウム化N−(3,5−ジトリチオ)ベンゾイル−L− グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニル− 〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド、即ち、 トリチウム化Bz−NEJJ−CONH2{式中、Eはグルタミン酸であり、Jは (F2Pmp)部分,(4−ホスホノ(ジフルオロメチル)−L−フェニルアラ ニル)を表す}であることを特徴とする請求項24に記載の方法。 26.(a)活性に必要な活性部位のシステインがセリンで置換された野生型酵 素の変異体と、 (b)前記変異体を結合させた固体支持体と、 から成る複合体。 27.更に、変異酵素に対する結合物質を含み、前記結合物質が変異酵素に結合 して測定可能なシグナルを発生し得ることを特徴とする請求項26に記載の複合 体。 28.N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル) 〕−L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェ ニルアラニンアミド(BzN−EJJ−CONH2){式中、Eはグルタミン酸で あり、J は4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニルを表す}; N−ベンゾイル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕− L−フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル アラニンアミド; N−アセチル−L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L −フェニルアラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルア ラニンアミド; L−グルタミル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド; L−リシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド; L−セリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニ ル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミド; L−プロリニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラ ニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕 −L−フェニルアラニンアミド;及び L−イソロイシニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニル アラニル−〔4−ホスホノ(ジフルオロメチル)〕−L−フェニルアラニンアミ ド から成るグループから選択されることを特徴とする変異酵素に対する結合物質と して使用するためのペプチド。
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