ES2277866T3

ES2277866T3 - Ensayos de moduladores de receptores activados por proteasas (par).

Info

Publication number: ES2277866T3
Application number: ES00991185T
Authority: ES
Inventors: Ludger Altrogge; Denis Monard
Original assignee: Novartis Forschungsstiftung Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research; Novartis Forschungsstiftung
Current assignee: Novartis Forschungsstiftung Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research; Novartis Forschungsstiftung
Priority date: 1999-12-15
Filing date: 2000-12-13
Publication date: 2007-08-01
Anticipated expiration: 2020-12-13
Also published as: ATE349699T1; CY1106384T1; AU3158501A; GB9929674D0; EP1238283A2; WO2001044496A2; WO2001044496A3; DK1238283T3; US7148018B2; EP1238283B1; US20030148921A1; DE60032632D1; PT1238283E; DE60032632T2

Abstract

Un método para identificar o detectar una molécula de segmentación de PAR, comprendiendo dicho método las etapas de (a) proporcionar un péptido de segmentación de PAR inmovilizado enlazado a una molécula informadora; (b) poner en contacto dicho péptido de segmentación de PAR inmovilizado con una molécula que segmenta PAR; y (c) detectar la molécula informadora liberada.

Description

Ensayos de moduladores de receptores activados por proteasas (PAR).

Campo técnico

La presente invención se refiere a ensayos para moduladores de receptores activados por proteasas, útiles en los campos de la trombogénesis, la neurobiología, la oncología, la osteoporosis y la movilidad intestinal.

Introducción

El receptor de trombina (receptor activado por proteasa 1, PAR1; Nystedt y otros (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91, 9208-9212) es el miembro prototípico de una familia de siete receptores dominiales de transmembrana acoplados a proteína G, denominados receptores activados por proteasas (PARs), que comprende ahora cuatro miembros identificados tanto en ratón como en ser humano, algunos de los cuales también se han identificado en un número de otros vertebrados (Nystedt y otros (1994); Nystedt y otros (1995) J Biol Chem 270, 5950-5955; Ishihara y otros (1997) Nature 386, 502-506; Kahn y otros (1998) Nature 394, 690-694; Vu y otros (1991) Cell 64, 1057-1068; Bohm y otros (1996) Biochem J 314 (Pt 3), 1009-1016; Xu y otros (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 6642-6646; Rasmussen y otros (1991) FEBS Lett 288, 123-128; Zhong y otros (1992) J Biol Chem 267, 16975-16979; Saifeddine y otros (1996) Br J Pharmacol 118, 521-530; Gerszten y otros (1994) Nature 368, 648-651).

La trombina segmenta PAR1 humano después de la Arg^{41}, conduciendo a un nuevo extremo N que inicia intramolecularmente la activación del receptor (Vu y otros, 1991). De forma similar, otros miembros de la familia de los PAR son activados mediante segmentación con proteasas. La activación de PAR1 también puede alcanzarse mediante la aplicación de péptidos activadores del receptor de trombina (TRAPs) que imitan el extremo N generado por la segmentación con trombina (Vu y otros, 1991). Los PARs pueden así considerarse receptores peptídicos que tienen su propio ligando que se desenmascara con la segmentación proteolítica.

Los PARs se han relacionado con diversos procesos biológicos. El tratamiento con trombina o TRAP provoca retracción de las neuritas en células de neuroblastoma cultivadas (Gurwitz y Cunningham (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85, 3440-3444; Suidan y otros (1992) Neuron 8, 363-375) y la inversión de la estelación así como la proliferación de los astrocitos (Cavanaugh y otros (1990) J Neurochem 54, 1735-1743; Grabham y Cunningham (1995) J Neurochem 64, 583-591; Loret y otros (1989) J Biol Chem 264, 8319-8327; Nelson y Siman (1990) Brain Res Dev Brain Res 54, 93-104; Pindon y otros (1998) Eur J Biochem 255, 766-774; Suidan y otros (1997) Glia 21, 244-25; Perraud y otros (1987) Int J Dev Neurosci 5, 181-188). Bajas cantidades de trombina incrementan la supervivencia de neuronas y astrocitos hipocampales estimulados, pero altas dosis de la proteasa provocan apoptosis neuronal, sugiriendo un papel modulador para el PAR1 en la muerte celular programada (Vaughan y otros (1995) J Neurosci 15, 5389-5401; Smith-Swintosky y otros (1995) J Neurosci 15, 5840-5850). Bloquear la activación de PAR1 con un anticuerpo dirigido contra el extremo N recientemente creado antagoniza la activación de plaquetas inducida por trombina (Hung y otros (1992) J Cell Biol 116, 827-832; Brass y otros (1992) J Biol Chem 267, 13795-13798) así como la respuesta de retracción de neuritas de células de neuroblastoma (Suidan y otros (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91, 8112-8116). El PAR1 se expresa altamente en líneas celulares y biopsias de cáncer humano, indicando su implicación en el comportamiento mitogénico y metastático de las células tumorales (Even-Ram y otros (1998) Nat Med 4, 909-914; Kaufmann y otros (1997) Cancer 80, 2068-2074; Kaufmann y otros (1998a) Neuroreport 9, 709-712; Nierodzik y otros (1998) Blood 92, 3694-3700). Aunque la activación de PAR1 estimula la síntesis de DNA en células cancerosas Hep-2g (Kaufmann, y otros, 1997), la activación de PAR2 conduce a una disminución en la síntesis de DNA en las células de tumor pancreático humano MIA PaCa-2 (Kaufmann y otros (1998b) Int. J. Pancreatol. 24, 97-102). El PAR1 media en la activación de plaquetas humanas, mientras que las plaquetas derivadas de ratones son activadas por PAR3 (Ishihara y otros, 1997). Se han detectado bajos niveles de PAR4 como un segundo receptor sensible a trombina en plaquetas (Kahn y otros, 1998; Xu y otros, 1998).

El PAR1 puede segmentarse y activarse mediante trombina, tripsina, plasmina, granzima A y posiblemente también mediante proteína C activada (Ishihara y otros, 1997; Vu y otros, 1991; Suidan y otros, 1994; Parry y otros (1996) Biochem J 320, 335-341). En contraste, la segmentación de PAR1 mediante catepsina G, quimotripsina, elastasa de leucocitos o mieloblastina (proteinasa 3) retira el sitio de segmentación de trombina, indicando un papel para estas proteasas en la inactivación del receptor (Vu y otros, 1991; Parry y otros, 1996; Molino y otros (1995) J Biol Chem 270, 11168-11175; Renesto y otros (1997) Blood 89, 1944-1953), ya que la segmentación en un sitio alternativo produce un nuevo extremo N inactivo en la transducción de señales. El PAR2 difiere de otros miembros conocidos de la familia de PAR en que contiene un sitio de segmentación susceptible a serina proteasas tales como tripsina, triptasa de células cebadas y acrosina. (Nystedt y otros (1994); Molino y otros (1997a) J Biol Chem 272, 4043-4049; Fox y otros (1997) FEBS Lett 417, 267-269). El activador fisiológico de PAR2 en los enterocitos es lo más probablemente la tripsina (Kong y otros (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94, 8884-8889), mientras que en otros tejidos los activadores de PAR2 son en gran parte desconocidos.

En resumen, se han realizado estudios detalladas para identificar proteasas que sean capaces de activar o inactivar PAR1 (Vu y otros, 1991; Parry y otros, 1996; Molino y otros, 1995; Renesto y otros, 1997; Ishii y otros (1995) J Biol Chem 270, 16435-16440); sin embargo, poco se sabe para PAR2 (Nystedt y otros (1994); Molino y otros (1997a); Fox y otros (1997); Molino y otros (1997b) J Biol Chem 272, 11133-11141), PAR3 (Ishihara y otros, 1997) o PAR4 (Kahn y otros, 1998; Xu y otros, 1998).

Los ensayos de segmentación y activación de PAR se han basado previamente en el análisis de productos de segmentación purificados resultantes de la acción de proteasas sobre substratos peptídicos solubles basados en el sitio de segmentación de PAR (Ishii, K. (1995) J. Biol. Chem. 270:16435-16440) o en medir la liberación de ^{45}Ca^{2+} iniciada por activación con proteasas de PARs microinyectados en oocitos de Xenopus (Vu y otros, 1991). WO 9818456 e Ishii, K. y otros (1993) J. Biol. Chem. 268: 9780-9786 describen métodos para estudiar la segmentación con trombina de PAR1 o PAR3 detectando anticuerpo M1 que se une a PAR etiquetado con epítopo expresado sobre la superficie celular de células COS-7 o Rat-1 antes y después del tratamiento con trombina. Estos métodos son bastante engorrosos, insensibles y no son particularmente susceptibles de metodologías de alto rendimiento. Además, el ensayo de señalización con Ca^{2+} no excluye proteasas que afecten a la señalización con Ca^{2+} de una manera independiente de la activación de PAR. Se requieren ensayos que permitan la identificación de proteasas que segmentan PAR y la caracterización de la especificidad de la proteasa para esbozar adicionalmente el importante papel biológico de los PARs.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para identificar o detectar una molécula que segmenta PAR, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un péptido de segmentación de PAR inmovilizado enlazado a una molécula informadora; (b) poner en contacto el péptido de segmentación de PAR inmovilizado con una molécula que segmenta PAR; y (c) detectar la molécula informadora liberada. La molécula informadora proporciona preferiblemente una señal amplificable, tal como es el caso cuando la molécula informadora es una enzima informadora. El método es útil para identificar activadores e inactivadores de PAR, así como moduladores de la activación de PAR. La presente invención también proporciona estuches que comprenden una proteína de fusión de PAR, en los que dicha proteína de fusión de PAR es una proteína de fusión de PAR con un informador enzimático, y en los que dicha proteína de fusión de PAR está inmovilizada sobre un soporte sólido para el uso en los métodos de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1. A Dibujo esquemático de un plásmido para la producción de una proteína de fusión GPAR1 biotinilada en E. coli. BAD, dominio aceptor de biotina; BirA, biotina holoenzima sintetasa. B Extremos C-terminales de las proteínas de fusión GAPR. Minúsculas, enlazadores; mayúsculas, fragmentos de dominios N-terminales extracelulares de PAR; itálicas, etiquetas de afinidad; negritas y flecha, residuo del sitio de activación.

Descripción detallada de la invención

Se proporciona un método sensible para la detección de proteasas que sean capaces de segmentar receptores activados por proteasas (PARs). Los ensayos permiten la detección de proteasas que segmentan los dominios extracelulares de PARs en cantidades minúsculas de muestras biológicas, una ventaja muy oportuna para los ensayos clínicos. Los ensayos también pueden usarse con propósitos de rastreo, y permiten al operario detectar y caracterizar actividades de proteasas presentes en bajas cantidades, pero sin embargo concentraciones biológicamente pertinentes para los efectos biológicos mediados por PARs. Además, puede diseñarse un substrato de proteasa más natural que los usados previamente para ensayos de segmentación de PARs. Así, el método es útil para el análisis de la regulación proteolítica de PARs y para rastrear moduladores de PARs.

En un aspecto de la invención, se proporciona un método para identificar o detectar una molécula que segmenta PAR, comprendiendo el método las etapas de:

(a): proporcionar un péptido de segmentación de PAR inmovilizado enlazado a una molécula informadora;

(b): poner en contacto el péptido de segmentación de PAR inmovilizado con una molécula que segmenta PAR; y

(c): detectar la molécula informadora liberada.

Según se usa aquí, el término "receptor activado con proteasa" o "PAR" se usa para abarcar una proteína de la superficie de células eucarióticas que puede ser activada específicamente por una proteasa y que puede señalizar la cascada apropiada de episodios biológicos (por ejemplo, hidrólisis de fosfoinosítidos, aflujo de Ca^{2+} o agregación de plaquetas). Una molécula que segmenta PAR puede ser cualquier molécula capaz de segmentar PAR, tal como una proteasa específica para un sitio cuya función es activar (o inactivar) un PAR en un sistema biológico.

El término "péptido de segmentación de PAR", según se usa aquí, significa un péptido o polipéptido que comprende el exodominio aminoterminal de PAR o un fragmento del mismo, y que comprende el sitio de segmentación con proteasa endógeno que activa (o inactiva) el PAR. Por ejemplo, PAR1 de ratón y ser humano es segmentado por trombina después de Arg^{41}. Tres aminoácidos directamente aguas arriba (N-terminales a, en la secuencia natural) de Arg^{41} seguido por Arg se requieren mínimamente para detectar la presencia de un activador con proteasa de PAR1 (VNPR). El PAR2 de ratón se segmenta después de Arg^{38}. Tres aminoácidos directamente aguas arriba de Arg^{38} seguidos por Arg se requieren mínimamente para detectar la presencia de un activador con proteasa de ratón PAR2 (SKGR). El PAR3 de ratón se segmenta después Lys^{37}. Tres aminoácidos directamente aguas arriba de Lys^{37} seguidos por Lys se requieren mínimamente para detectar la presencia de un activador con proteasa de PAR3 (LTIK). El PAR4 humano se segmenta después de Arg^{47}. Tres aminoácidos directamente aguas arriba de Arg^{47} seguidos por Arg se requieren mínimamente para detectar la presencia de un activador con proteasa de PAR4 humano (PAPR). De forma similar, para otros PARs y para la detección de inactivadores de proteasa, los cuatro aminoácidos N-terminales al sitio de segmentación se incluyen mínimamente en el péptido de segmentación de PAR para la detección de una proteasa.

Típicamente, se incluyen aminoácidos adicionales en el péptido de segmentación de PAR, en particular, secuencias del dominio extracelular de PAR aguas arriba del sitio de segmentación. Por ejemplo, para la detección de trombina usando PARs sensibles a trombina, la inclusión de la "secuencia similar a hirudina", GDEee, se prefiere, donde la "secuencia similar a hirudina" comprende mínimamente GDE, pero típicamente incluye residuos de aminoácidos ácidos adicionales, en particular residuos de E adicionales. Así, para la detección de trombina, el péptido de segmentación de PAR mínimo puede enlazarse directamente o indirectamente a la "secuencia similar a hirudina", donde el enlace indirecto puede alcanzarse usando secuencias de PAR presentes en la naturaleza entre el péptido de segmentación de PAR mínimo y la "secuencia similar a hirudina", o usando una secuencia enlazadora no relacionada. Preferiblemente, se incluyen secuencias dominiales extracelulares aguas abajo del sitio de segmentación en el péptido de segmentación de PAR, en particular cuando el ensayo se está usando para detectar proteasas inactivantes.

Más preferiblemente, secuencias de aminoácidos que rodean el sito de segmentación en el PAR presente en la naturaleza se incluyen en el péptido de segmentación de PAR, imitando así el substrato de proteasa natural. Por ejemplo, los fragmentos exodominiales (dominio extracelular) aminoterminales de PAR1 de ratón (Nº de Registro de EMBL L03529), PAR2 de ratón (Nº de Registro de EMBL Z48043), PAR3 de ratón (Nº de Registro de EMBL U92972) y PAR4 humano (Nº de Registro de EMBL AF055917) usados en los Ejemplos posteriores se extienden desde los aminoácidos 27 a 78, 26 a 78, 21 a 92 y 17 a 78, respectivamente (la numeración de aminoácidos corresponde a la numeración de la base de datos de EMBL), permitiendo así la detección de activadores e inactivadores de PAR.

Aunque los ejemplos específicos proporcionados aquí se limitan a PARs conocidos, será evidente para un experto normal en la técnica que PARs pendientes de identificar, o fragmentos de los mismos, se preparan fácilmente a la luz de las enseñanzas de la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, plantillas oligonucleotídicas para la amplificación por PCR de las secuencias de codificación para los dominios extracelulares de los diferentes PARs pueden modificarse para el uso de acuerdo con la extensión de homología entre los PARs conocidos y nuevos y dependiendo de las condiciones de hibridación. Alternativamente, si existe suficiente identidad entre las dos secuencias, la misma plantilla puede usarse sin modificación adicional. Alternativamente, pueden usarse pares adecuados de plantillas oligonucleotídicas. Además, se prevén variantes de la secuencia presente en la naturaleza, en particular substituciones conservativas de aminoácidos no esenciales para la segmentación en el sitio de segmentación biológica.

Es ventajoso incluir un dominio de transmembrana en el péptido de segmentación de PAR. Un dominio de transmembrana son regiones hidrófobas que pueden identificarse como tales mediante gráficas de hidropatía asistidas por ordenador. Por ejemplo, los siete dominios de transmembrana de PAR1 son identificados de esta manera por Vu y otros (1991, véase la Figura 5). La inclusión de un dominio de transmembrana en el péptido de segmentación de PAR es particularmente útil para la detección de proteasas durante la expresión del péptido de segmentación de PAR sobre una superficie celular, permitiendo el dominio de transmembrana el anclaje del péptido a la membrana celular. El dominio de transmembrana puede ser de cualquier origen, aunque se prefiere la inclusión de un dominio de transmembrana de PAR. Para facilitar la preparación, el exodominio de PAR seguido por su primer dominio de transmembrana se usaría típicamente en esta modalidad (por ejemplo, incluyendo los aminoácidos 99-127 de PAR1 (Vu y otros (1991)).

El péptido de segmentación de PAR está conectado a una molécula informadora. La molécula informadora (es decir, una molécula que genera señales) puede ser cualquier molécula capaz de proporcionar un cambio detectable. Tales moléculas informadoras incluyen restos fluorescentes (por ejemplo, proteínas fluorescentes o rótulos fluorescentes químicos), restos radiactivos, restos fosforescentes, antígenos, enzimas informadoras y similares. Preferiblemente, la molécula informadora es una enzima informadora cuya actividad provoca un cambio detectable. Tales enzimas informadoras incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: beta-galactosidasa, glucosidasas, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), glucuronidasas, luciferasa, peroxidasas, fosfatasas, oxidorreductasas, deshidrogenasas, transferasas, isomerasas, quinasas, reductasas, desaminasas, catalasas y ureasa.

Al seleccionar una molécula informadora que ha de usarse en el método actualmente reivindicado, es imperativo que la molécula informadora no se someta a inactivación por ningún agente de la muestra, incluyendo inactivación por cualquier actividad de proteasa presente en una muestra. La selección de una molécula informadora apropiada será fácilmente evidente para los expertos en la técnica. Moléculas informadoras actualmente preferidas son enzimas informadoras, tales como beta-galactosidasa, según se ejemplifica en el Ejemplo 1 posteriormente.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un péptido de segmentación de PAR conectado a un par de moléculas informadoras interactivas. Al segmentar el péptido de segmentación de PAR, un informador se libera del péptido de segmentación de PAR, efectuando un cambio detectable en la segunda molécula informadora. Por ejemplo, puede diseñarse una proteína de fusión que comprende en orden N-terminal a C-terminal: una primera proteína fluorescente (por ejemplo proteína fluorescente cian, CFP; proteína fluorescente amarilla, YFP; proteína fluorescente azul, BFP; proteína fluorescente verde, GFP, todas disponibles comercialmente, Clontech Living Colors User Manual), un péptido de segmentación de PAR y una segunda proteína fluorescente. La inmovilización del péptido de segmentación de PAR puede alcanzarse como se describe posteriormente. Al segmentar en el sitio de segmentación de PAR, se produce un cambio medible en la longitud de onda de fluorescencia de la segunda molécula informadora.

Modalidades preferidas de este aspecto de la invención comprenden en orden N-terminal a C-terminal proteína fluorescente cian, péptido de segmentación de PAR, proteína fluorescente amarilla y una etiqueta inmovilizadora (por ejemplo, una etiqueta de biotina o un dominio de transmembrana); o proteína fluorescente amarilla, péptido de segmentación de PAR, proteína fluorescente roja y una etiqueta inmovilizadora (por ejemplo, una etiqueta de biotina o un dominio de transmembrana). Será evidente para los expertos en la técnica que pueden usarse otras moléculas informadoras interactivas, por ejemplo Aequorin y GFP, luciferasa e YFP. Preferiblemente, las dos moléculas informadoras interactivas están separadas por al menos 15 aminoácidos, más preferiblemente al menos 20 aminoácidos, lo más preferiblemente al menos 30 aminoácidos, imitando así a las secuencias de PAR presentes en la naturaleza.

El enlace de la molécula informadora al péptido de segmentación de PAR puede alcanzarse mediante cualquier medio conocido en la técnica (o medios todavía por descubrir) con tal de que (i) el péptido de segmentación de PAR pueda ser reconocido por su proteasa y (ii) durante la acción de la proteasa sobre el péptido de segmentación de PAR una molécula informadora se libere de una manera detectable. Así, la segmentación puede alcanzarse mediante reacción química, mediante incorporación de una molécula informadora durante la síntesis del péptido de segmentación de PAR o mediante síntesis contigua. Por ejemplo, cuando la molécula informadora es una proteína, una proteína de fusión que comprende la molécula informadora, el péptido de segmentación de PAR y otras secuencias opcionales puede prepararse fácilmente mediante métodos recombinantes o químicos.

En resumen, el DNA que codifica para la proteína de fusión puede estar comprendido en un casete de expresión de ácido nucleico que comprende un promotor enlazado operablemente al ácido nucleico que codifica la proteína de fusión y opcionalmente a señales de terminación de la transcripción. Los polipéptidos fusionados de la proteína de fusión pueden estar conectados directamente o mediante un espaciador. El péptido de segmentación de PAR puede ser N-terminal o C-terminal con respecto a la molécula informadora, dependiendo del diseño particular del ensayo (véase posteriormente).

El promotor puede ser casi de cualquier origen, por ejemplo, es posible usar un promotor estrechamente regulado o el promotor que es adyacente naturalmente a un gen de PAR. Se prefieren promotores que son activos en las células huésped elegidas como el promotor de SV40, tac, beta-actina, metalotioneína, T7, poliedrina y citomegalovirus. Un promotor particularmente preferido es el promotor lacZ, según se ejemplifica en el Ejemplo 1, posteriormente. Secuencias promotoras adecuadas para el uso con huéspedes de levadura pueden estar reguladas o ser constitutivas y se derivan preferiblemente de un gen de levadura altamente expresado, especialmente un gen de Saccharomyces cerevisiae. Así, puede usarse el promotor del gen TRP1, el gen ADHI o ADHII o el gen de fosfatasa ácida (PH05).

Una secuencia de DNA que contiene las señales de terminación de la transcripción es preferiblemente la secuencia de flanqueo 3' de un gen que contiene señales apropiadas para la terminación de la transcripción y la poliadenilación para el huésped deseado. Señales adecuadas son, por ejemplo, la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento humana, del gen DHFR y del gen de beta-globina de conejo.

En algunas modalidades, en las que no se desea el anclaje a una membrana celular, también es posible usar un casete de expresión polipeptídico que contiene adicionalmente una secuencia de señal que hace que la proteína se secrete en el medio. Secuencias de señal adecuadas son conocidas en la técnica. De acuerdo con esto, en estos tipos de casetes de expresión un promotor está enlazado operablemente a una primera secuencia de DNA que codifica un péptido de señal enlazado en el marco de lectura apropiado a una segunda secuencia de DNA que codifica para la proteína de fusión, y una secuencia de DNA que contiene señales de terminación de la transcripción.

El promotor, la secuencia de DNA que codifica para la proteína de fusión y la secuencia de DNA que contiene señales de terminación de la transcripción están enlazados operablemente entre sí, es decir, están yuxtapuestos de tal manera que se mantiene en sus funciones normales. La disposición es tal que el promotor efectúa la expresión apropiada del gen estructural y las señales de terminación de la transcripción efectúan la terminación apropiada de la transcripción y la poliadenilación.

Los casetes de expresión para la síntesis de la proteína de fusión pueden insertarse en el huésped deseado en la forma de un plásmido estable o directamente en los cromosomas, de los cuales se prefiere lo último.

Asimismo, es posible que los plásmidos de expresión incluyan uno o más, especialmente uno o dos, marcadores genéticos selectivos para el huésped usado para la construcción, la amplificación y la prueba del plásmido, tal como un marcador y un origen de replicación para un huésped bacteriano, especialmente Escherichia coli.

En cuanto a los marcadores génicos selectivos, puede usarse cualquier gen marcador que facilite la selección para los transformantes debido a la expresión fenotípica del gen marcador. Marcadores adecuados son, por ejemplo, los que expresan resistencia a antibióticos o, en el caso de mutantes de huéspedes auxótrofos, genes que complementan lesiones del huésped. Los genes correspondientes confieren, por ejemplo, resistencia a los antibióticos tetraciclina, ampicilina, G418, higromicina, kanamicina, cloranfenicol, carbenicilina, zeocina, blasticidina o bleomicina, o proporcionan prototrofía en un mutante auxótrofo, por ejemplo el gen URA3, LEU2, LYS2, HIS3 o TRP1.

Como la amplificación de los plásmidos de expresión se realiza habitualmente en un procariota, tal como E. coli, se incluye ventajosamente un origen de replicación. Este puede obtenerse a partir de plásmidos procarióticos correspondientes, por ejemplo plásmidos de E. coli, tales como pBluescript® pBR322, pTZ18R o un plásmido pUC, por ejemplo pUC18 o pUC19, que contienen tanto origen de replicación procariótico, por ejemplo, de E. coli, como marcador genético que confiere resistencia a antibióticos, tales como ampicilina y tetraciclina.

Ácidos nucleicos preferidos que codifican para la proteína de fusión se describen en los Ejemplos 1-5 posteriormente.

Los plásmidos de expresión se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo enlazando el casete de expresión polipeptídico, los fragmentos de DNA que contienen marcadores genéticos selectivos para el huésped y el origen o los orígenes de replicación en el orden predeterminado usando procedimientos de síntesis in vitro químicos o biológicos convencionales. Preferiblemente, los plásmidos se construyen y preparan usando técnicas de DNA recombinante. Para la preparación mediante técnicas de DNA recombinante, fragmentos de DNA adecuados se ligan in vitro de manera convencional. La mezcla de ligación se transforma a continuación en un huésped procariótico o eucariótico adecuado dependiendo de la naturaleza de los elementos reguladores usados, y un transformante que contiene el vector deseado se selecciona de acuerdo con procedimientos convencionales. Los plásmidos pueden multiplicarse por medio de los huéspedes transformados y pueden aislarse de manera convencional. La elección del huésped depende de las secuencias reguladoras situadas en el vector. Para la construcción y multiplicación del vector, se prefiere un huésped procariótico, por ejemplo E. coli.

Un huésped adecuado para la producción de la proteína de fusión es una célula eucariótica o procariótica, por ejemplo una célula de mamífero, nematodo, insecto, levadura o bacteria. El huésped adecuado puede transfectarse mediante el método estándar en ingeniería genética, por ejemplo con la ayuda de un virus, vesículas lipídicas, una pistola de partículas o electroporación. Para incrementar la cantidad de proteína producida, es ventajoso usar un plásmido de alto número de copias o el DNA plasmídico se integra en el genoma en varias copias. Lo último puede alcanzarse, por ejemplo, a través de la aplicación de un estrés selectivo, por ejemplo usando metotrexato. Las células huésped transfectadas pueden cultivarse mediante métodos estándar en el cultivo celular.

También pueden obtenerse proteínas por medios sintéticos en vez de aportarse a partir de fuentes naturales, usando sintetizadores de proteínas disponibles comercialmente o incluso pedirse en un servicio de síntesis de péptidos comercial. Las proteínas sintetizadas pueden comprender cualesquiera modificaciones de secuencia deseadas, incluyendo el uso de residuos de aminoácido alterados o la adición de grupos heterólogos o cadenas laterales en el polipéptido, e incorporación de rótulos o etiquetas.

Para el uso en los ensayos de segmentación de PAR de la presente invención, el péptido de segmentación de PAR-la molécula informadora se inmoviliza sobre un soporte sólido. El soporte sólido puede ser una placa de varios pocillos, un gel, una matriz, una cuenta, una membrana o un tubo, por ejemplo, y puede estar hecho de diversos materiales, incluyendo, sin limitación, celulosa, agarosa, dextrano, policarbonato, nailon, polietileno y vidrio. En algunas modalidades, el soporte sólido puede ser una membrana o superficie, tal como la proporcionada por un liposoma o una célula.

El péptido de segmentación de PAR-la molécula informadora se inmoviliza sobre un soporte sólido de una manera tal que una molécula informadora se libere durante la acción de la proteasa si la proteasa enzimáticamente activa está presente en la muestra. La inmovilización puede alcanzarse de cualquier manera con tal de que el sitio de segmentación de PAR sea accesible a su proteasa. Así, se requiere típicamente un empalme orientado del péptido de segmentación de PAR. Tal empalme orientado puede alcanzarse mediante diversos métodos conocidos en la técnica, incluyendo reacción química específica del extremo terminal de la molécula con grupos reactivos del soporte, el empalme de una etiqueta al extremo terminal de la proteína que puede capturarse mediante un receptor que se une específicamente a la etiqueta (por ejemplo, podrían usarse interacciones biotina-estreptavidina, biotina-avidina, anticuerpo-epítopo como pares receptor-etiqueta) o cualquier otra manera que sea evidente para el experto. Aunque el péptido de segmentación de PAR puede ser N-terminal o C-terminal con respecto a la molécula informadora, el péptido de segmentación de PAR típicamente separará la etiqueta (u otro medio de inmovilización) de la molécula informadora para permitir la liberación de la molécula informadora durante la acción de la proteasa.

Un medio de inmovilización preferido que usa interacciones biotina-estreptavidina se describe en el Ejemplo 1 posteriormente. Aunque este ejemplo particular ilustra la invención incorporando biotina en la proteína de fusión, puede usarse cualquier método para incorporar tales rótulos, con tal de que el sitio de segmentación no se enmascare o destruya. Esto es importante, no solo para la presentación del sitio de segmentación a una proteasa, sino también para permitir la separación de la molécula informadora liberada por proteasa del péptido de segmentación de PAR-la molécula informadora inmovilizados. Así, la reticulación química no específica del péptido de segmentación de PAR-la molécula informadora a una superficie sólida no se prevé en la práctica de la presente
invención.

En un aspecto de la invención, la proteína de fusión se expresa sobre la superficie de una célula y contiene un dominio de transmembrana. El dominio de transmembrana expresado como parte de la proteína de fusión puede preverse como una "etiqueta" que inmoviliza la proteína de fusión a la superficie celular. Una molécula informadora se proporciona N-terminal con respecto al péptido de segmentación de PAR para permitir la liberación y la detección subsiguiente de la molécula informadora durante la acción de la proteasa.

El péptido de segmentación de PAR-la molécula informadora inmovilizados se ponen en contacto con una molécula de segmentación de PAR (o proteasa). La proteasa puede ser una proteasa conocida, que puede estar disponible comercialmente, o puede estar presente en una muestra biológica, por ejemplo. La proteasa también puede proporcionarse en la forma de una biblioteca de proteínas y el ensayo de la invención se usa entonces para detectar y aislar, o identificar de otro modo, la proteasa.

Muestras de proteasa pueden obtenerse, por ejemplo, mediante extracción de una fuente natural, mediante expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica una proteasa o sintetizando químicamente la proteasa. Se sabe que numerosas líneas celulares tumorales (por ejemplo, líneas celulares de melanoma, carcinoma de mama y neuroblastoma, disponibles del ATCC) liberan proteasas conocidas y no caracterizadas, que pueden usarse como una fuente de proteasas. Además, pueden usarse tejidos que se sabe que tienen PARs activados (y, por lo tanto, proteína biológicamente pertinente), tales como secciones cerebrales, secciones de tejido reproductor o secciones de tejido intestinal. Alternativamente, fluidos corporales, tales como fluido cerebroespinal, ascitis, orina, suero o sangre, pueden usarse como una fuente de proteasas.

La proteasa puede aislarse de fuentes naturales por medios convencionales, de tejidos o de células cultivadas. Durante el aislamiento, pueden añadirse aditivos convencionales como estabilizantes de proteínas, inhibidores específicos de proteinasas y similares. Por ejemplo, cuando el polipéptido se aísla de un cultivo tisular, la primera etapa consiste habitualmente en someter a lisis las células o, en el caso en el que el polipéptido se secreta en un medio, en separar las células del fluido de cultivo, típicamente por medio de centrifugación. En presencia de proteínas adicionales e impurezas, el sobrenadante resultante puede enriquecerse con respecto a la proteasa retirando la mayoría del material no proteínico y precipitando proteínas saturando la solución con sulfato amónico o similar. Las proteínas contaminantes también pueden precipitarse por medio de acidificación con ácido acético u otros medios convencionales. Pueden incluirse otras etapas de purificación, por ejemplo, retirar lectinas, desalación, procedimientos cromatográficos, tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de reparto, HPLC, HPLC en fase inversa y similares. La separación de los constituyentes de la mezcla también se efectúa mediante diálisis, de acuerdo con la carga por medio de electroforesis en gel o electroforesis libre de portador, de acuerdo con el tamaño molecular por medio de una columna Sephadex adecuada, penetración en gel o ultrafiltración, mediante cromatografía de afinidad, o mediante otros procedimientos, especialmente los conocidos de la bibliografía.

La pureza de la proteasa puede medirse mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis mediante HPLC. La proteasa es substancialmente pura y puede aislarse en una banda en un gel.

Alternativamente, diversas bibliotecas de productos naturales pueden probarse con respecto a la actividad de proteasa o, en efecto, bibliotecas de expresión pueden rastrearse con respecto a la actividad de proteasa liberada usando los ensayos de la invención. Por ejemplo, aunque pueden probarse iones simples, por facilidad de manejo, conjuntos de clones de una biblioteca de expresión pueden expresarse en una línea celular adecuada, tal como una línea celular que es capaz de expresar, secretar y activar proteasas. Haciendo crecer las células en un medio adecuado (por ejemplo, medio libre de suero, tal como medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) o medio RPMI 1640, opcionalmente repuesto con elementos traza y suplementos que mantienen el crecimiento) dentro de un receptáculo (por ejemplo, placas de 96 pocillos), se produce medio acondicionado (es decir, medio que contiene factores secretados a partir de las células) que puede a continuación analizarse con respecto a la actividad de proteasa usando los métodos descritos aquí. Una vez que se identifica que una fracción reunida produce niveles superiores de actividad de proteasa, las células pueden diluirse con medio, separarse, hacerse crecer y probarse como se describe anteriormente hasta que se identifica el clon que expresa la proteasa.

La muestra de proteasa, ya se proporcione como una mezcla de moléculas, en forma aislada, como un fluido corporal, un extracto celular, un medio acondicionado, células o como una muestra de tejido, se pone en contacto con el péptido de segmentación de PAR-la molécula informadora inmovilizados para permitir la segmentación del péptido de segmentación de PAR, liberando de ese modo la molécula informadora. La liberación de la molécula informadora se detecta a continuación e indica la presencia de una molécula de segmentación de PAR en la muestra.

Debido a que la molécula informadora enlazada al péptido de segmentación de PAR puede interferir con la detección de la molécula informadora liberada, la molécula informada liberada típicamente se separará del péptido de segmentación de PAR-la molécula informadora antes de la detección. Esto se alcanza fácilmente cuando el péptido de segmentación de PAR-la molécula informadora se inmovilizan para permitir la liberación de la molécula informadora al medio circundante durante la incubación con la muestra de proteasa. Así, después de la segmentación con una proteasa, el medio puede extraerse y determinarse la presencia de informador liberado en el medio. Alternativamente, si el péptido de segmentación de PAR-la molécula informadora están inmovilizados sobre un soporte retirable, el péptido de segmentación de PAR-la molécula informadora inmovilizados se retiran dejando el medio en un receptáculo adecuado para al análisis adicional.

La liberación de la molécula informadora puede determinarse detectando cualquier señal medible, tal como un cambio en episodios de color, fluorescencia, luminiscencia o radiación en la muestra. Cuando la molécula informadora es una enzima, la muestra (o el medio que tiene contenida la muestra) se combina con un indicador. El indicador es cualquier especie que sea susceptible de un cambio detectable (por ejemplo, un cambio de pH, un cambio de color, un cambio de fluorescencia o luminiscencia o un substrato/enzima que pueda detectarse mediante un segundo indicador) durante la acción de la enzima informadora. Un cambio detectable en el indicador es una indicación de que la proteasa enzimáticamente activa está presente en la muestra. A la inversa, la falta de un cambio detectable en el indicador es una indicación de que la proteasa enzimáticamente activa está ausente de la muestra. Típicamente, el "cambio detectable" es un incremento de al menos 2 veces en la señal sobre el fondo (donde los ensayos de control se realizan en ausencia de muestra), preferiblemente un incremento de al menos 5 veces, más preferiblemente un incremento de al menos 10 veces en la señal sobre la del ensayo de control.

Según se describe anteriormente, los sitios de segmentación biológica para agentes activantes de PAR son conocidos para PAR-1 humano y de ratón (después de Arg^{41}), PAR-2 de ratón (después de ARg^{38}), PAR-3 de ratón (después de Lys^{37}) y PAR-4 humano (después de Arg^{47}). Según se usa aquí, el término "sitio de segmentación biológica" se refiere al sitio segmentable in vitro que da como resultado una respuesta biológica (por ejemplo, aflujo de Ca^{2+}, retracción de neuritas, hidrólisis de fosfoinosítidos o agregación de plaquetas). Así, durante la identificación de una molécula que segmenta PAR, la molécula que segmenta PAR puede identificarse como un activador de PAR potencial o un inactivador de PAR potencial basándose en dónde es segmentado por la proteasa el péptido de segmentación con proteasa. Las moléculas segmentadoras de PAR que segmentan el péptido de segmentación de PAR en un sitio distinto al "sitio de segmentación biológica" se clasifican como inactivadores de PAR potenciales, mientras que las moléculas de segmentadoras de PAR que segmentan el péptido de segmentación de PAR en el "sitio de segmentación biológica" se clasifican como activadores de PAR potenciales.

El sitio de segmentación biológica puede determinarse fácilmente como es evidente para el experto. Los ejemplos posteriores describen el uso de péptidos de segmentación de PAR mutados en los que el sitio de segmentación biológica está alterado de modo que se rompe la segmentación en este sitio. Cualquier segmentación del péptido de segmentación de PAR mutado está por lo tanto en un sitio alternativo al "sitio de segmentación biológica", indicando la presencia de un activador. Alternativamente, el resto (poli)peptídico segmentado con informador liberado o, preferiblemente, las secuencias de PAR segmentadas inmovilizadas pueden someterse a secuenciación, o un anticuerpo específico para el sitio de segmentación puede usarse para determinar si la segmentación es en el sitio de segmentación biológica o no.

Una vez que se clasifica el activador/inactivador potencial, puede llevarse a cabo un análisis adicional para confirmar la clasificación. Tales pruebas son conocidas en la técnica e incluyen ensayos de sobrecrecimiento de neuritas, ensayos de hidrólisis de fosfoinosítidos, ensayos de aflujo de Ca^{2+} y ensayos de agregación de plaquetas.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método de acuerdo con la reivindicación 7 para rastrear moduladores de PAR potenciales poniendo en contacto el péptido de segmentación de PAR inmovilizado con un activador/inactivador de PAR y un modulador de PAR potencial, y determinando un cambio en la cantidad de segmentación en el sitio de segmentación en comparación con cuando dicho modulador de PAR está ausente. Los moduladores de PAR pueden inhibir la acción de un inactivador, permitiendo de ese modo la activación de PAR, o potenciar la acción de un inactivador, mejorando de ese modo la inactivación de PAR. A la inversa, los moduladores de PAR pueden inhibir la acción de un activador, inhibiendo de ese modo la activación de PAR, o potenciar la acción de un activador, aumentando de ese modo más la activación de PAR.

La presencia de un modulador de PAR se detecta mediante un cambio en la cantidad de segmentación del péptido de segmentación de PAR en presencia del modulador de PAR en comparación con cuando está ausente.

Preferiblemente, el cambio en la actividad difiere en 20% de el del nivel de control, más preferiblemente 50% de el del nivel de control, o más preferiblemente 90% o más de el del nivel de control. Un incremento en la segmentación en el sitio de segmentación biológica refleja la presencia de un agonista, mientras que una disminución en la segmentación en el sitio de segmentación biológica refleja la presencia de un antagonista. Un incremento en la segmentación en un sitio distinto del sitio de segmentación biológica (en particular C-terminal con respecto al sitio de segmentación biológica) también refleja la presencia de un antagonista.

Así, un agonista es una molécula que mejora la activación de PAR según se caracteriza mediante la segmentación en el sitio de segmentación biológica, con relación a ensayos de control en ausencia de posible activador o agonista. Un antagonista es una molécula que reduce la activación de PAR con relación a ensayos de control en ausencia de posible antagonista bien (i) promoviendo la segmentación en un sitio distinto a la segmentación biológica o bien (ii) inhibiendo la segmentación en el sitio de segmentación biológica (por ejemplo, uniéndose a PAR y de ese modo bloqueando la activación de PAR, o uniéndose a un activador de PAR).

Agonistas y antagonistas adecuados pueden obtenerse de las mismas fuentes que las proteasas, según se describe anteriormente. Alternativamente, pueden usarse como fuentes bibliotecas de compuestos químicos, péptidos, anticuerpos o productos naturales, o química combinatoria.

Una vez identificada, la acción de los agonistas o antagonistas puede confirmarse mediante ensayos funcionales. Además, los agonistas o antagonistas pueden usarse potencialmente para obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completamente o parcialmente una enfermedad/estado o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una curación parcial o completa de una enfermedad/estado y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", según se usa aquí, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un ser humano, e incluye:

(a): prevenir que se produzca la enfermedad/el estado o el síntoma en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad/el estado o el síntoma pero que todavía no ha sido diagnosticado de tenerlo;

(b): inhibir la enfermedad/el estado o el síntoma, es decir, detener su desarrollo; o

(c): aliviar la enfermedad/el estado o el síntoma, es decir, provocar una regresión de la enfermedad/el estado.

Por ejemplo, la activación de PAR1 se ha relacionado con proporcionar un efecto neuroprotector (Vaughan y otros, 1995); PAR1 se expresa altamente en líneas celulares y biopsias de cáncer, sugiriendo su implicación en el comportamiento mitogénico y metastático en las células tumorales; el PAR1 también se ha relacionado con la enfermedad de Alzheimer; la expresión de PN-1, un potente antagonista de la activación de PAR-1, es regulada al alza persistentemente en astrocitos reactivos después de isquemia y apoplejía, o ciertos tipos de lesiones inducidas por neurotoxinas (Hoffmann y otros, 1992; Nitsch y otros, 1993; Scotti y otros, 1994); la activación de PAR-3 se ha relacionado con mejorar la movilidad intestinal: proporcionando todos ejemplos de posibles enfermedades o estados elegidos como objetivo.

En un aspecto adicional de la invención, el ensayo de segmentación de PAR puede usarse al medir el contenido de proteasa o actividad inhibidora de proteasa en pruebas clínicas. El Ejemplo 7 posterior demuestra que el ensayo es suficientemente sensible para detectar por primera vez la presencia y la cantidad de actividad de trombina en el CSF de seres humanos, tanto en pacientes sanos como después de una lesión traumática de cabeza, conduciendo a un nivel de trombina incrementado en la mayoría de los casos. De forma similar, el CSF de pacientes o animales experimentales después de isquemia o apoplejía puede analizarse con respecto a sus niveles de trombina o actividad inhibidora de trombina. El nivel de proteasa o actividad inhibidora de proteasa en una muestra clínica puede actuar por lo tanto como un indicador de diagnóstico y/o pronóstico.

En un aspecto adicional más de la invención, se proporciona un estuche que comprende al menos uno de los materiales descritos aquí, por ejemplo uno cualquiera de un péptido de segmentación de PAR, una proteína de fusión de PAR como la descrita aquí, tal como proteína de fusión de PAR-beta-galactosidasa, un ácido nucleico que codifica los mismos, en combinación con instrucciones para el uso del ensayo de la invención.

Los ejemplos posteriores se proporcionan solamente con propósitos ilustrativos y no debe encontrarse que limiten las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Detección de proteasa que segmenta PAR-1

Este ejemplo describe la preparación de galactosidasa-PAR1 (GPAR1) como una proteína recombinante obtenida mediante fusión de \beta-galactosidasa, el dominio extracelular de PAR-1, una etiqueta His_{6} y un dominio aceptor de biotina para la biotinilización in vivo. La segmentación de la proteína de fusión GPAR-1 inmovilizada en estreptavidina conduce a la liberación de \beta-galactosidasa soluble activa que proporciona un medio para verificar proteasas capaces de segmentar el dominio extracelular de PAR-1. Usada como un substrato inmovilizado, la proteína de fusión GPAR-1 permite por primera vez la detección de trombina en el intervalo subpicomolar.

Cepas y medios

Se usó cepa de E. coli SCS110 (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU. de A.) para propagar plásmido recombinante. Se expresó GPAR-1 recombinante bien en la cepa de E. coli M15[pREP4] (Qiagen), bien SCS110 o bien XL1-Blue MR (Stratagene). Células de E. coli se hicieron crecer en medio 2xYT, complementado con 100 \mug/ml de ampicilina (Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). El medio se complementó adicionalmente con biotina 50 \muM (Tsao y otros (1996) Gene 169, 59-64) para la producción de GPAR-1 recombinante biotinilada.

Construcción del vector de expresión de GPAR-1

El plásmido pGPAR1 se construyó mediante ligación de cuatro fragmentos generados mediante PCR:

(i): un fragmento que codifica \beta-galactosidasa,

(ii): un fragmento que codifica el exodominio de PAR1,

(iii): un fragmento que codifica etiquetas de afinidad, y

(iv): un fragmento que codifica la enzima BirA (biotina holoenzima sintetasa), que cataliza una modificación de biotina (Barker y Campbell (1981) J. Mol. Biol. 146, 451-467), todos flanqueados por sitios de restricción.

El fragmento de DNA que codifica \beta-galactosidasa se amplificó a partir de pSV-\beta-galactosidasa (disponible comercialmente de Promega) usando 5'-CACACAGCGGCCGCGTCGACGATGAGC GAAAAATACATCGTCACCT-3' (Nº ID SEC: 1) y 5'-CACACTTAATTAATCTAGATTTGT ACAGTTTTTGACACCAGACCAACTGGTAA-3'
(Nº ID SEC: 2) como cebadores.

El fragmento que codifica el exodominio de PAR1 se amplificó a partir de pBSmThR, que contiene cDNA de PAR1 de ratón en pBluescript (Niclouy otros (1994) Cell Mol Biol 40, 421-428) usando 5'-CACACACCATGGGGTCGAC
GATGAGCGTGTACAGTGGAGGTTCAGGCGGATCAAGCCA GCCAGAATCAGAGAGGAC-3' (Nº ID SEC: 3) y 5'-GAGAGAACTAGTGGGGCTGGTCA GATATCCGGAG-3' (Nº ID SEC: 4) como cebadores.

El fragmento de DNA que codifica las etiquetas de afinidad y que contiene sitios de restricción adicionales para permitir la subclonación de los otros productos de PCR se generó mediante PCR usando un oligonucleótido de DNA sintético (5'-CACACACCATGGGACTCGAGGAGGTACTAGTGGAGGTTCACACCAT CATCACCACCATGCAGCGG
CTCTGAACGATATTTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCA CGAGTAGTCTAGACGTCCAGGTACCAGAGA
G-3' (Nº ID SEC: 5).

El fragmento BirA se amplificó directamente de células de E. coli SCS110 suspendidas usando 5'-CACACATC
TAGATAAGGATCCATGAAGGATAACACCGTGCCACTG-3' (Nº ID SEC: 6) y 5'-CACACAGGTACCAAGCT
TATTTTTCTGCACTACGCAGGGAT-3' (Nº ID SEC: 7) como cebadores. Una colonia de células SCS110 se suspendió en 50 \mul de medio LB. Se usaron 2 \mul de la suspensión de células como una plantilla en una reacción de PCR de 100 \mul bajo condiciones estándar.

Todas las reacciones de PCR se realizaron con DNA polimerasa de Taq, complementada con 1/50 de volumen de DNA polimerasa de Pwo, en una reacción de 100 \mul de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Todas las manipulaciones con DNA recombinante se llevaron a cabo siguiendo procedimientos estándar (Pepper y otros (1993) J Cell Biol 122, 673-684) y de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes. Las secuencias de DNA se verificaron mediante secuenciación de DNA.

En resumen, un fragmento del sitio de clonación múltiple de pBluescript SK- (disponible comercialmente de Stratagene) se retiró segmentando con ClaI y SstII, seguido por tratamiento con polimerasa de T4 para crear extremos romos, y a continuación se ligó para crear pBS-CS. Los productos de PCR (fragmentos (i) a (iv) anteriores) se ligaron por etapas en los sitios KpnI y SalI de pBS-CS, dando pGPAR1 (Fig. 1A). El plásmido recombinante resultante, pGPAR1, tiene así un primer marco abierto de lectura que codifica \beta-galactosidasa, fusionado C-terminalmente al fragmento dominial extracelular de PAR1, una etiqueta His_{6} y un dominio aceptor de biotina (BAD). Un segundo marco abierto de lectura, precedido por un sitio interno de entrada al ribosoma, se introdujo en el constructo para producir la biotina holoenzima sintetasa (enzima BirA) a partir del mismo mRNA (Tsao y otros, (1996) Gene 169, 59-64).

Expresión y purificación de GPAR1 en E. coli

Células de E. coli SCS110 transformadas con pGPAR1 formaban colonias azules cuando se cultivaban en placa sobre medios que contenían isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiránosido (X-Gal), mientras que las células transformadas con pBS-CS daban colonias blancas debido al gen roto del fragmento de complementación \alpha de \beta-galactosidasa (Sambrook y otros, 1989). Se inoculó 1 litro de medio 2xYT que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y biotina 50 \muM (Tsao y otros (1996)) con célula de E. coli recombinante, desarrolladas hasta una DO_{600} de 0,7, y la expresión de la proteína se indujo con 0,4 g/l de IPTG. Después de la inducción durante al menos 16 horas, las células se recogieron mediante centrifugación a 5500 rpm durante 30 minutos a 4ºC en una centrífuga Beckman J-6B/P con un rotor JS-5.2 y se resuspendieron en 80 ml de 1 x tampón de lisis [fosfato sódico 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, MgCl_{2} 0,2 mM, imidazol 10 mM, \beta-mercaptoetanol 30 mM], complementado con 1 mg/ml de aprotinina y 1 mg/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) como inhibidores de proteasa. Después de prensar en prensa francesa, la suspensión se clarificó mediante centrifugación a 35000 g durante 30 min a 4ºC en un rotor Sorvall SS-34.

Se purificó GPAR1 por medio de la etiqueta de afinidad de His_{6} usando Ni^{2+}-NTA agarose (disponible comercialmente de Qiagen). El lisado celular, producido como se describe anteriormente, se incubó durante la noche con 25 ml de Ni^{2+}-NTA agarosae a 4ºC con batimiento suave. Después de rellenar en una columna adecuada (por ejemplo, BioRad Econocolumn, 1,5x15 cm, disponible de BioRad, Hercules, CA, EE.UU. de A.), la agarosa se lavó con 100 ml de 1 x tampón de lisis, 100 ml de tampón de lavado de EtOH [Tris/HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 60 mM, MgCl_{2} 0,2 mM, imidazol 10 mM, \beta-mercaptoetanol 30 mM, etanol al 30%], seguido por otros 100 ml de tampón de lisis sin adición de inhibidores de proteasas. La columna se incubó durante 30 min a 4ºC con 5 ml de tampón de elución [fosfato sódico 50 mM, pH 8,0, NaCl 2,5 M, imidazol 0,5 M] antes de recoger proteína de fusión GPAR1 purificada eluida. El eluato se dializó frente a tampón de Tris/acetato [Tris/acetato 50 mM, pH 7,3, Nacl 300 mM, MgCl_{2} 1 mM]. Para el almacenamiento a largo plazo se añadió un volumen igual de glicerol al 100% a la preparación de GPAR purificada y se almacenaron partes alícuotas a -80ºC.

Análisis de GPAR-1 purificada

GPAR-1 recombinante se analizó mediante SDS-PAGE en geles de acrilamida al 7,5% (Laemmli (1970) Nature 227, 680-685). La proteína GPAR1 se sometió a electroforesis durante 1 hora a 200 V junto con marcadores del peso molecular apropiados (por ejemplo, marcadores del peso molecular de escalera proteínica de Benchmark disponibles de Life Technologies o marcadores del peso molecular proteínico disponibles de Amersham Pharmacia Biotech).

Para la inmunotransferencia y la detección de la modificación con biotina de GPAR1, proteínas sometidas a electroforesis se transfirieron a membrana de nitrocelulosa (Towbin y otros (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354). Después de lavar la membrana y bloquear la unión de proteína no específica con tampón de bloqueo [solución salina tamponada con fosfato (PBS), Triton X-100 al 1%, albúmina de suero bovino (BSA) al 1%], una membrana se sondeó con un anticuerpo anti-\beta-galactosidasa policlonal de conejo (disponible comercialmente de 5 Prime _ 3 Prime, Boulder CO, EE.UU. de A.), seguido por tres lavados con tampón de lavado [PBS, Triton X-100 al 1%] e incubación con un anticuerpo porcino anti-conejo etiquetado con fosfatasa alcalina, diluido 1/200 en tampón de bloqueo. La otra membrana se sondeó con conjugado de fosfatasa alacalina-estreptavidina, diluido 1/200 en tampón de bloqueo. Todas las incubaciones eran durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con tampón de lavado y una vez con tampón de fosfatasa alcalina [Tris/HCl 100 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM], el revelado del color se realizó con nitroazultetrazolio (NBT)/fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) en tampón de fosfatasa alcalina [330 \mug/ml de NBT, 165 \mug/ml de BCIP] durante cinco minutos.

Propiedades de la proteína GPAR-1 purificada

GPAR1 purificada aparecía como dos bandas en SDS-PAGE bajo condiciones reductoras, lo que era independiente de la cepa de E. coli usada. La banda superior mostraba la masa molecular aparente esperada de 136 kDa y su reactividad con estreptavidina después de la transferencia sobre una membrana de nitrocelulosa indicaba que estaba biotinilada. La banda inferior mostraba una masa molecular aparente de 127 kDa y no estaba biotinilada. Ambas bandas eran inmunopositivas para \beta-galactosidasa. La ausencia de biotinilación y el peso molecular aparente menor de la segunda banda sugerían que era una forma truncada de la proteína, carente de la parte C-terminal. Esta suposición se substanció adicionalmente por el hecho de que retirar la parte C-terminal de GPAR1 mediante tratamiento con trombina afectaba solo a la proteína de longitud completa, conduciendo a la aparición de una sola banda a 127 kDa en SDS-PAGE. La relación de proteína truncada a completa se obtenía de forma consecuente.

Ensayo de actividad de \beta-galactosidasa

La actividad de galactosidasa se midió para cuantificar la cantidad de GPAR-1 en una muestra purificada. Una muestra de GPAR-1 (25/75 \mul) se añadió a cada pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos. Después de la adición de solución de substrato [Tris/acetato 25 mM, pH 7,3, NaCl 150 mM, MgSO_{4} 0,5 mM, 2,5 mg/ml de ONPG, concentración final] hasta un volumen final de 200 \mul, el incremento en la DO_{405} se registró a temperatura ambiente durante de 5 a 30 min y se presentó como la velocidad de reacción. La cantidad de \beta-galactosidasa que daba un cambio en la densidad óptica de 0,001 DO/min se definió como una unidad. El desarrollo de la DO se registró usando un lector de microplacas THERMOmax usando SOFTmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU. de A.).

Calibración de la reacción cromática de \beta-galactosidasa

Para calibrar el ensayo y establecer la relación entre la velocidad de reacción y la concentración de \beta-galactosidasa, se midieron 75 \mul de una solución estándar que contenía de 35 ng/ml a 10 \mug/ml de \beta-galactosidasa (disponible comercialmente de Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suiza) bajo las condiciones mencionadas anteriormente y el desarrollo de la DO_{405} se registró durante 30 min.

Una curva de respuesta a la dosis con \beta-galactosidasa indicaba que 1 pmol de \beta-galactosidasa era equivalente a 819 unidades, según se define anteriormente. Una unidad era así equivalente a una concentración de \beta-galactosidasa 16,2 pM en la muestra. La velocidad de reacción como una función de la concentración de \beta-galactosidasa era lineal hasta 1,2 DO_{405}/min, correspondiente a 20 mM de \beta-galactosidasa.

Inmovilización de GPAR1

Se inmovilizó GPAR1 sobre la superficie de partículas paramagnéticas revestidas con estreptavidina (SA-PMP's disponibles comercialmente de Promega, Madison, WI, EE.UU. de A.), como sigue. 25 \mul de SA-PMPs en suspensión se lavaron tres veces con 1 ml de PBS. Se añadieron 250 unidades de GPAR1 en un volumen total de 200 \mul de PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con batimiento constante. Después de lavar tres veces con 1 ml de PBS, GPAR1/CA-PMPs se suspendieron en 100 \mul de PBS y se ensayaron con respecto a la actividad de \beta-galactosidasa añadiendo 100 \mul de solución de substrato e incubando a temperatura ambiente durante 2 min. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 \mul de EDTA 0,5 M, pH 8, y el sobrenadante coloreado se separó de las partículas. La extensión de la reacción cromática se midió fotométricamente a 405 nm. Aproximadamente 95% de la actividad de \beta-galactosidasa purificada se inmovilizaba sobre SA-PMPs, mientras que solo aproximadamente 20% de la actividad de \beta-galactosidasa total expresada por el constructo de GPAR1 podía inmovilizarse sobre SA-PMPs, probablemente debido a la formación de un truncamiento C-terminal de GPAR1.

Para la inmovilización de GPAR1 sobre placas de microvaloración de 96 pocillos revestidas con estreptavidina (disponibles comercialmente de Labsystems, Helsinki, Finlandia), se añadieron 125 unidades de GPAR1 por pocillo en un volumen total de 100 \mul de PBS y las placas se mantuvieron a 4ºC durante de 2 a 4 días hasta que se usaban. Después de la inmovilización, 75 \mul de la solución se midieron con respecto a la actividad de \beta-galactosidasa según se describe anteriormente, para determinar la eficacia de inmovilización. Se encontró que las eficacias de inmovilización estaban coherentemente en el intervalo de 70 a 75%, estando la eficacia de inmovilización a su máximo después de dos días de incubación a 4ºC.

Trombina humana fue preparada y caracterizada previamente por Stone y Hofsteenge (1986, Biochemistry 25, 4622-4628). Placas de microvaloración con GPAR1 inmovilizada se lavaron rápidamente tres veces con PBS para retirar cualquier proteína GPAR1 no unida. Las muestras de proteasa (por triplicado) se añadieron inmediatamente en 100 \mul de tampón enzimático [Tris/HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, PEG 6000 al 0,1%, Tween 20 al 0,02%]. Por ejemplo, se añadió trombina a la GPAR1 inmovilizada en concentraciones que variaban de 50 fM a 10 pM en 100 \mul de tampón enzimático. Para asegurar que se estaba midiendo la actividad de trombina, se incluyeron muestras de control idénticas, excepto por la adición de hirudina 5 pM o PN-1 5 pM.

Las placas de microvaloración se incubaron a 37ºC durante 3 horas en una atmósfera húmeda para permitir la segmentación con proteasa de GPAR1, conduciendo a una liberación de \beta-galactosidasa en el medio. El medio de muestra (75 \mul) se transfirió a continuación a una placa reciente y se ensayó con respecto a la actividad de \beta-galactosidasa según se describe anteriormente, midiendo el cambio de densidad óptica durante de 15 min a 405 nm. Los datos se expresaron como picomoles de \beta-galactosidasa liberados frente a la concentración de proteasa y el tiempo en minutos. La sensibilidad de GPAR1 inmovilizada frente a la segmentación por diferentes proteasas se evaluó mediante el cálculo de las pendientes iniciales obtenidas a partir de las curvas de respuesta a la dosis realizadas para cada proteasa.

Bajo estas condiciones, era detectable trombina 50 fM con un intervalo lineal de hasta 250 fM. El ensayo se saturaba por encima de 0,5 a 1 pM. La pendiente inicial, que se calculaba a partir de los valores dentro de la primera fase lineal, mostraba que bajo estas condiciones de ensayo se liberaban 2,6 moles de \beta-galactosidasa por minuto por mol de trombina. En presencia de hirudina recombinante o la proteasa de rata nexina-1 (Markwardt (1957) Hoppe Seylers Z Physiol Chem 308, 147-156; Baker y otros (1980) Cell 21, 37-45; PN-1; Sommer y otros (1989) Gene 85, 453-459), ambas potentes inhibidores de trombina, la señal del ensayo de GPAR1 se suprimía casi completamente, mostrando la estricta dependencia con la actividad proteolítica de la trombina.

Como un control para asegurar que las diferentes muestras de proteasas no afectaban a la actividad de \beta-galactosidasa (por ejemplo, destruyendo la actividad enzimática), 90 unidades de GPAR1 se incubaron por pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos sin revestimiento por estreptavidina, con 100 \mul de tampón enzimático que contenía las proteasas en diferentes concentraciones. Las muestras de control se probaron con respecto a la actividad de \beta-galactosidasa del mismo modo que las muestras ensayadas usando placas de microvaloración revestidas con estreptavidina.

En resumen, el ensayo para moléculas que segmentan PAR usando la proteína de fusión GPAR1 es exquisitamente sensible, permitiendo la detección de trombina en concentraciones tan bajas como 50 fM, al menos 10 veces más sensible que los métodos previamente usados que se basan en el substrato cromogénico específico S2238 (Chromogenix, Mölndal, Suecia).

Ejemplo 2

Especificidad del ensayo de GPAR1 e identificación de activadores e inactivadores de PAR1

Para mostrar que la segmentación con trombina tiene lugar en su sitio de segmentación esperado, se generó una forma mutante de GPAR1, en la que una mutación R^{45}S evita la segmentación por serina proteasas similares a tripsina. Los vectores de expresión para GPAR1 mutante se generaron mediante corte del fragmento de PAR1 de pGPAR1 (véase el Ejemplo 1) y substitución por un fragmento de DNA que codifica PAR1 mutante. El constructo de PAR1 mutante tenía una mutación puntual en el codón para el primer residuo de aminoácido del sitio de activación, conduciendo a una incorporación de serina en lugar de arginina, haciendo así a este sitio resistente a la segmentación por serina proteasas similares a tripsina, incluyendo trombina. El fragmento que codifica PAR1 mutante se preparó a partir de pBSmThrR usando 5'-CTCATGTACAGTGGAGGTTCAGGAGGCTCGAGCCAGCCAGAA TCAGA
GAGGACAGATGCTACGGTGAACCCCAGCTCATTCTTTCTAAGGAATC-3' (Nº ID SEC: 8) y 5'-GAGAGAAC
TAGTGGGGCTGGTCAGATATCCGGAG-3' (Nº ID SEC: 4) como cebadores. Intercambiar el residuo de ARg^{45} por serina daba lugar a la proteína de fusión mutante en el sitio de activación GPAR1^{R45S}.

Se llevaron a cabo ensayos de proteasas como de se describe en el Ejemplo 1, excepto que tanto GPAR1 como la GPAR mutante (GPAR1^{R45S}) se usaron para análisis comparativos. La incubación de trombina humana (Stone y Hofsteenge, 1986) con GPAR1^{R45S} inmovilizada conducía a una reducción drástica del mutante de señal detectado demostrando que la trombina en efecto segmenta la GPAR1 predominantemente después de Arg^{45}. Era necesaria más de 30000 veces más trombina para producir una respuesta con GPAR^{R45S}. La velocidad inicial para la respuesta a trombina disminuía desde 2,6 moles_{\beta}_{-galactosidasa}/(mol_{trombina}*min) hasta aproximadamente 70 nmol_{\beta}_{-galactosidasa}/(mol_{trombina}*min) (Tabla 1). Esta señal no se debía a una actividad contaminante en la preparación de trombina, ya que estaba ausente en presencia de hirudina, un inhibidor de trombina específico. La velocidad de segmentación inferior de GPAR1^{R45S} sugiere la existencia de un segundo sitio de segmentación para la trombina en PAR1 de ratón, que se segmenta con menor eficacia. Se sabe que el PAR1 humano contiene un segundo sitio de segmentación con trombina situado cinco residuos C-terminalmente del sitio de activación (Vu y otros (1991); Parry y otros (1996)).

Perfil de liberación de GPAR1 y GPAR^{R45S}

Después de mostrar que el ensayo de GPAR1 refleja bien la capacidad de la trombina para segmentar y activar PAR1, se examinó el efecto de otras proteasas sobre GPAR1 y su mutante del sitio de activación, GPAR1^{R45S}. Las siguientes proteasas adicionales se ensayaron esencialmente como se describe anteriormente: quimotripsina bovina tipo II (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU. de A.), proteína C activada bovina (ICN, Costa Mesa, CA, EE.UU. de A.), plasmina humana, uroquinasa humana de alta masa molecular y tripsina bovina (todas disponibles de Fluka, Buchs, Suiza), elastasa de leucocitos humanos (Merck Darmstadt, Alemania) y tPA monocatenario humano (Calbiochem La Jolla, CA, EE.UU. de A.).

En los casos de la tripsina y la plasmina, la señal máxima era incluso superior que para la trombina. Con GAPR1^{R45S} como un substrato, las curvas de respuesta a la dosis para la tripsina y la plasmina estaban ligeramente desplazadas a la derecha en comparación con GPAR1 y las velocidades iniciales disminuían (Tabla 1), indicando que la segmentación en el sitio de activación de PAR1 está favorecida por estas proteasas. Así, la tripsina y la plasmina era claramente detectables y su eficacia sensible a la mutación del sitio de activación (Tabla 1), confirmando así su capacidad para activar PAR1 (Ishihara y otros (1997); Vu y otros (1991); Parry y otros (1996)). Ninguna de las proteasas probadas resultaba ser tan potente como la trombina.

La quimotripsina y la elastasa, proteasas con preferencia para la segmentación después de residuos hidrófobos, no mostraban preferencia para la segmentación de GPAR1 sobre GPAR1^{R45S}, y por lo tanto pueden clasificarse como inactivadores potenciales de PAR1. La quimotripsina y la elastasa eran aún más eficaces cuando se incubaban con GPAR1^{R45S} inmovilizada (Tabla 1).

Los dos activadores del plasminógeno probados eran incapaces de segmentar GPAR1 a velocidades considerables y así no parecen estar implicados en la señalización o regulación de PAR1 (Tabla 1). Solo a la concentración de uroquinasa más alta probada se obtenía una señal marginal.

Se ha presentado que tanto la trombina como la proteína C activada son activadores de PAR1 (Parry y otros (1996)). Se demostró mediante el presente ensayo que la proteína C activada segmentaba solo GPAR1 y era casi inactiva sobre GPAR1^{R45S} inmovilizada. La actividad de la proteína C activada era aproximadamente 1000 veces menor en comparación con la trombina. Para probar si la actividad resultante de la proteína C activada se debía a una contaminación de la preparación con trombina, la proteína C activada se ensayó con GPAR1 inmovilizada en presencia de hirudina. En presencia de hirudina, la señal resultante de la proteína C activada se suprimía completamente (Tabla 1) y es así lo más probablemente debido a una contaminación con trombina de la preparación (Tabla 1) (Perry y otros (1996)).

A concentraciones superiores, la tripsina, la plasmina, la elastasa y la quimotripsina segmentaban GPAR1 y GPAR1^{R45S} no solo en el dominio PAR1 sino también en el dominio de \beta-galactosidasa, provocando una disminución de la señal incluso por debajo del nivel del fondo. Sin embargo, estas proteasas podían medirse satisfactoriamente a un intervalo de concentración inferior, demostrando la amplia aplicación de los ensayos.

Para evaluar a qué concentraciones las diferentes proteasas podrían influir en el ensayo destruyendo la actividad de \beta-galactosidasa, se incubó GPAR1 con estas proteasas sin inmovilización previa, y la actividad de \beta-galactosidasa restante se midió como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Ninguna de las proteasas examinadas provocaba una disminución en la actividad de \beta-galactosidasa a concentraciones por debajo de 100 pM. Las pendientes iniciales de las curvas de respuesta a la dosis derivadas de valores por debajo de esta concentración crítica demostraban que la destrucción de \beta-galactosidasa no contribuye a los datos obtenidos con este formato de ensayo.

Así, en resumen, el ensayo es útil para la detección de la segmentación en el sitio de trombina específico. El ensayo también es suficientemente sensible para detectar proteasas diferentes de la trombina y en sitios de segmentación distintos del sitio de segmentación con trombina, permitiendo de ese modo la detección e identificación de activadores e inactivadores de PAR1 potenciales. Si necesita detectarse actividad de trombina específicamente en una mezcla de proteasas, la trombina puede medirse como la actividad que puede ser inhibida específicamente por hirudina.

Ejemplo 3

Identificación de activadores e inactivadores de PAR-2

Este ejemplo describe la preparación de una proteína de fusión de galactosidasa-PAR2 (GPAR2) y su uso en ensayos diseñados para detectar activadores e inactivadores de PAR2.

Los vectores de expresión para GPAR2 o GPAR2^{R34S} se prepararon mediante corte del fragmento de PAR1 de pGPAR1 con XhoI y SpeI (véase el Ejemplo 1) y la substitución del fragmento cortado por un fragmento de DNA que codifica el dominio extracelular de PAR-2 de ratón o su mutante del sitio de activación. La secuencia que codifica el exodominio PAR2 de ratón se preparó mediante PCR usando los oligonucleótidos de DNA sintéticos 5'-CACAC
ATGTACAGTGGAGGTTCAGGCGGCT CGAGCGAGAACCTTGCACCGGGACGCAACAACAGTAAAGGAAG
AAGTCTTATTGGCAG ATTAGAAACCCAGCCTCCAATCACTG-3' (Nº ID SEC: 9) y 5'-CACACAACTAGTGAC
C GTGGTCAGCTTCCCGGTGAGGATGGACGCAGAGAACTCATCGATGGAAAAGCCTGGTT CTACCGGAAC
CCCTTTCCCAGTGATTGGAGGCTGGGTT-3' (Nº ID SEC: 10) como plantillas. El mutante del sitio de activación de PAR2 se preparó del mismo modo, pero en lugar del oligonucleótido Nº ID SEC: 9, se usó un oligonucleótido similar en el que el AGA subrayado se reemplazaba por AGC. Reasociar los dos oligonucleótidos apropiados complementarios en sus extremos 3' daba una plantilla parcialmente de doble hebra, que se usó en una reacción de PCR. Todas las otras técnicas se realizaron como se describe en el Ejemplo 1 anteriormente. La secuencia de DNA del clon resultante se identificó mediante secuenciación de DNA.

Se expresó GPAR2 en la cepa de E. coli SCS110 (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU. de A.) o M15[pREP4]
(Qiagen). Como con GPAR1, una GPAR2 truncada también estaba presente en la fracción purificada de GPAR2. La relación de proteínas truncada a de longitud total era coherente con la obtenida con GPAR1, como lo era la eficacia de inmovilización para la práctica del ensayo. En ensayos de segmentación llevados a cabo como se describe en el Ejemplo 2 pero usando proteínas de fusión GPAR2 y GPAR2^{R34S} inmovilizadas, se demostraba que GPAR2 era el substrato preferente para la tripsina a una velocidad inicial de 370 mmol_{\beta}_{-galactosidasa}/(mol_{tripsina}*min) (Tabla 1). En comparación, una velocidad inicial de 97 mmol_{\beta}_{-galactosidasa}/(mol_{tripsina}*min) se detectaba para GPAR1 (Tabla 1). Eran necesarias aproximadamente 9 veces más tripsina para segmentar el mutante del sitio de activación GAPR2^{R34S}. La plasmina segmentaba la GPAR2 dos veces más eficazmente que la GPAR2^{R34S}, pero solo a una velocidad 560 veces inferior que la tripsina (Tabla 1). La quimotripsina y la elastasa mostraban una preferencia menor para GPAR2 silvestre sobre GPAR2^{R34S} (Tabla 1). La quimotripsina y la elastasa segmentaban la GPAR2 a una velocidad inferior que la GPAR1. No se obtenía señal con proteína C activada, los activadores del plasminógeno probados o trombina (Tabla 1).

Ejemplo 4

Identificación de activadores de PAR-3

Este ejemplo describe la preparación de una galactosidasa-PAR3 (GPAR3) y su uso en ensayos diseñados para detectar activadores e inactivadores de PAR3.

Los vectores de expresión para GPAR-3 o GPAR3^{K37S} se prepararon mediante el corte del fragmento de PAR1 de pGPAR1 con XhoI y SpeI (véase el Ejemplo 3) y substitución del fragmento cortado por un fragmento de DNA que codifica el dominio extracelular de PAR-3 de ratón o su mutante del sitio de activación. La secuencia que codifica el exodominio PAR3 de ratón se preparó mediante PCR usando los oligonucleótidos de DNA sintético 5'-TGTA
CAGTGGAGGTTCAGGCGGCTCGA GCGGCATAAATGTTTCAGACAACTCAGCAAAGCCAACCTTAACTAT
TAAGAGTTTTAATG GGGGTCCCCAAAATACCTTTGAAGAATTCCCACTTTCTGACATAGAGG-3' (Nº ID
SEC: 11) y 5'-ACTAGTACTTAAGGAACTTCTCAGGTATCCTATGGTAGCATTATTCACGTGG AGAGTTGAAA
TACTGTCCTCGGGACACTCCGCTTTTATAGTTGTGGTGGCTCCTGTCCA GCCCTCTATGTCAGAAAGTGG
GA-3' (Nº ID SEC: 12) como plantillas. El mutante del sitio de activación de PAR3 se preparó del mismo modo, pero en lugar del oligonucleótido Nº ID SEC: 11, se usó un oligonucleótido similar en el que el AAF subrayado se reemplazaba por TCG. Todas las otras técnicas se realizaron como se describe en el Ejemplo 3. Como con GPAR1 y GPAR2, una GPAR3 truncada también estaba presente en la fracción purificada de GPAR3. La relación de proteína truncada a de longitud completa era coherente con la obtenida con GPAR1, como lo era la eficacia de inmovilización para la práctica del ensayo.

Se llevaron a cabo ensayos de segmentación como se describe en el Ejemplo 3, pero usando proteínas de fusión GPAR3 y GPAR3^{K37S} inmovilizadas. PAR3 es el principal receptor de trombina en plaquetas de ratón (Ishihara y otros (1997), Kahn y otros (1998) Nature 394, 690-694) y de forma correspondiente la proteína de fusión GPAR3 inmovilizada también es segmentada eficazmente por trombina (Tabla 1). Sin embargo, la velocidad inicial de 41 \mumol_{\beta}_{-galactosidasa}/(mol_{trombina}*min) es aproximadamente seis veces inferior que para GPAR1. El mutante del sitio de activación GPAR3^{K37S} muestra una velocidad para la liberación de \beta-galactosidasa por trombina de 3,4 mmol_{\beta}_{-galactosidasa}/(mol_{trombina}*min), reflejando así la presencia de un segundo posible sitio de segmentación con trombina, que se segmenta a una velocidad superior que el segundo sitio de segmentación con trombina en PAR1 (Tabla 1). Cuando se inoculaba tripsina con GPAR3 o GPAR3^{K37S}, solo se observaba una pequeña preferencia para la segmentación de GPAR3 (Tabla 1). Un efecto más fuerte de la mutación en el sitio de activación de GPAR3 se observaba con plasmina, que era aproximadamente 120 veces menos activa que la trombina (Tabla 1). El activador del plasminógeno tisular mostraba solamente una señal muy débil con GPAR3, que se reducía cuando se usaba GPAR3^{K37S}, indicando una segmentación preferida en la unión K37-S38 (Tabla 1). Los valores de uPA eran demasiado bajos para detectar una diferencia similar (Tabla 1). No se encontró preferencia para GPAR3 para la quimotripsina o la elastasa (Tabla 1). La proteína C activada no segmentaba GPAR3 ni GPAR^{K37S} en una extensión apreciable en presencia de hirudina (Tabla 1).

Ejemplo 5 Identificación de activadores e inactivadores de PAR-4

Este ejemplo describe la preparación de una proteína de fusión de galactosidasa-PAR4 (GPAR4) y su uso en ensayos diseñados para detectar activadores e inactivadores de PAR4.

Los vectores de expresión para GPAR-4 o GPAR3^{K37S} se prepararon mediante el corte del fragmento de PAR1 de pGPAR1 con XhoI y SpeI (véase el Ejemplo 3) y la substitución del fragmento cortado por un fragmento de DNA que codifica el fragmento dominial extracelular de PAR-4 humano o su mutante del sitio de activación. La secuencia de codificación del fragmento exodominial de PAR4 humano se preparó mediante PCR usando los oligonucleótidos de DNA sintéticos 5'-CACACACTCGAGCGGCGG CACCCAGACCCCCAGCGTCTACGACGAGAG
CGGGAGCACCGGAGGTGGTGATGACAG CACGCCCTCAATCCTGCCTGCCCCCCGCGGCTACCCAGGC-3' (Nº ID SEC: 13) y 5'-TGTGTGACTAGTCCTGGTGGGCACCCAGCCCAGAAGCAGTGCCCGTGAGCTGTCCG
GA AGCTCCAGGGTGTCACTGTCATTGGCACAGACTTGGCCTGGGTAGCCGCGGGGGG-3' (Nº ID SEC: 14) como plantillas. El sitio de activación de PAR4 se preparó sintéticamente y era similar al fragmento exodominial de PAR4 pero el CGC subrayado en el Nº ID SEC: 13 se reemplazó por ACAG. Todas las otras técnicas se realizaron como se describe en el Ejemplo 3. Como con GPAR1, GPAR2 y GPAR3, también estaba presente una GPAR4 truncada en la fracción purificada de GPAR4. La relación de proteína truncada a de longitud completa era coherente con la obtenida con GPAR1.

Perfil de liberación de GPAR4 y GPAR4^{R47S}

GPAR4 y GPAR4^{R47S} también se probaron con el mismo grupo de proteasas bajo las mismas condiciones que para las otras GPARs. La GPAR4 se segmentó eficazmente mediante tripsina con una velocidad de 15 mmol_{\beta}_{-galactosidasa}/
(mol_{tripsina}*min) (Tabla 1). En comparación con las velocidades de segmentación más altas observadas con GPAR1, GPAR2 y GPAR3, la velocidad de segmentación de GPAR4 era al menos un orden de magnitud inferior (Tabla 1). La trombina, que es un activador conocido de PAR4 (Kahn y otros (1998), Xu y otros (1998)), segmentaba la GPAR4 a una velocidad de 4,3 mmol_{\beta}_{-galactosidasa}/(mol_{trombina}*min), que era todavía tres órdenes de magnitud inferior que con GPAR1 (Tabla 1). Sin embargo, tanto la tripsina como la trombina eran claramente menos eficaces cuando se incubaban con GPAR4^{R47S}, presentando la trombina un grado de especificidad superior (Tabla 1). La plasmina segmentaba tanto GPAR4como GPAR4^{R47S} con baja eficacia pero también presentaba una preferencia para la segmentación en el sitio de activación de PAR4. La quimotripsina y la elastasa segmentaban ambos substratos sin preferencia para el substrato silvestre. Ninguno de los activadores del plasminógeno, como tampoco la proteína C activada, segmentaba GPAR4 o GPAR4^{R47S} a velocidades considerables (Tabla 1). En comparación con GPAR1, todas las proteasas probadas segmentaban GPAR4 y GPAR4^{R47S}a velocidades muy inferiores (Tabla 1).

Ejemplo 6

Análisis comparativo de activadores e inactivadores de PAR

En este ejemplo, el uso de dominios de PAR extracelulares silvestres y mutantes permite el análisis de la regulación proteolítica de los diferentes miembros identificados de la familia de PARs y también proporciona una herramienta nueva y altamente sensible para identificar proteasas que segmentan PAR hasta ahora desconocidas.

Se realizó un análisis comparativo para la segmentación proteolítica de PAR1, PAR2, PAR3 múridas y PAR4 humana, que implicaba proteínas de fusión GPAR mutadas y no mutadas. Los ensayos se llevaron a cabo esencialmente como se describe anteriormente pero con la adición de diversas proteasas.

Trombina

La trombina segmentaba GPAR1 (2,6 mol_{\beta}_{-galactosidasa}/(mol_{trombina}*min), GPAR3 (410 mmol_{\beta}_{-galactosidasa}/(mol_{trombina}*
min) y GPAR4 (4,3 mmol_{\beta}_{-galactosidasa}/(mol_{trombina}*min), específicamente en el sitio de activación proteolítica, es decir, la segmentación estaba comprometida por la mutación del sitio de activación (Tabla 1). En contraste, la segmentación de GPAR2 no podía observarse (Tabla 1).

Tripsina

La tripsina segmentaba todas las proteínas de fusión receptoras con poca especificidad para el sitio de activación, excepto por una preferencia notable de la tripsina para la segmentación del sitio de activación de GPAR2 (Tabla 1). Las formas mutantes se segmentaban menos eficazmente, indicando el potencial de la tripsina para activar todos los PARs. Aunque pueden encontrarse seis sitios de segmentación potenciales para la tripsina en el exodominio de PAR2, la mutación del sitio de activación todavía conducía a una reducción de nueve veces en la eficacia de segmentación con tríptica de GPAR2. Someter a mutación el sitio de activación de las otras proteínas de fusión GPAR no conducía a tal reducción fuerte en la segmentación mediante tripsina, mostrando claramente que el PAR2 está optimizado para la segmentación por tripsina en este sitio (Tabla 1).

Proteína C activada y activadores del plasminógeno

Ni la proteína C activada (en presencia de hirudina) ni los activadores del plasminógeno segmentaban ninguna proteína de fusión GPAR a velocidades considerables.

Plasmina

La plasmina, la proteasa fibrinolítica generada a partir del plasminógeno por la acción de los activadores del plasminógeno, segmentaba todas las proteínas GPAR no mutadas a una velocidad afectada todavía por la mutación del sitio de activación, pero al menos diez veces inferior en comparación con la tripsina (Tabla 1). La débil eficacia con la que la plasmina es capaz de segmentar los PARs sensibles a trombina permite posiblemente que represente un papel en la modulación de respuestas mediadas por PAR en plaquetas, lo que no puede reemplazar a PARs activados mediante síntesis e inserción en la membrana de nuevas moléculas receptoras (Molino y otros (1997) J Biol Chem 272, 6011-6017). La débil capacidad de la plasmina para segmentar GPAR2 en el sitio de activación está en contraste con hallazgos de Fox y otros, que, usando un inhibidor de peptidilclorometano basado en los cuatro residuos aguas arriba del sitio de activación de PAR2, encontraron que era improbable que ni la trombina ni la plasmina fueran activadores de PAR2 (Fox y otros (1997) FEBS Lett 417, 267-269). Sin embargo, ese ensayo solo podía detectar interacciones mediadas por los cuatro residuos aguas arriba del sitio de activación, mientras que la presente determinación usa secuencias dominiales extracelulares N-terminales de PAR2 adicionales, un substrato más biológicamente pertinente.

Quimotripsina y elastasa

También se ha examinado la segmentación de las presentes proteínas de fusión GPAR mediante elastasa y quimotripsina, dos proteasas que poseen una preferencia para la segmentación después de residuos hidrófobos. La GPAR1 se segmentaba bien con ambas enzimas y la GPAR1^{R45S} mutante se segmentaba con una eficacia aún mayor, mostrando claramente que ambas proteasas reconocen y segmentan sitios distintos al sitio de activación (Tabla 1). La segmentación mejorada de GPAR1^{R45S} puede explicarse por la introducción de un sitio de segmentación adicional al crear la mutación R^{45}S. En el caso de GPAR2 y GPAR2^{R34S}, la elastasa daba una señal aproximadamente cinco veces menor que con GPAR1 y aún menor para la forma mutante (Tabla 1). Además, la quimotripsina segmentaba la GPAR2 mejor que el mutante: la señal era aproximadamente diez veces inferior que con GPAR1 y similar a aquella con GPAR3 y GPAR4 y sus mutantes (Tabla 1). Las señales para elastasa y quimotripsina varían entre por debajo o alrededor de 10 \mumol_{\beta}_{-galactosidasa}/(mol_{proteasa}*min) y por encima o alrededor de 100 \mumol_{\beta}_{-galactosidasa}/(mol_{protesa}*min), (Tabla 1). Las velocidades de segmentación inferiores reflejan probablemente una segmentación fuera de los dominios de PAR. Aunque la inactivación de PAR2 por elastasa no puede excluirse, los presentes datos indican que la PAR4 no es un substrato para esta enzima. La quimotripsina segmenta GPAR1 con una velocidad (58 m\mumol_{\beta}_{-galactosidasa}/(mol_{trombina}*min), lo que sugiere la inactivación quimotríptica de PAR1.

Ejemplo 7

Medida de trombina activa en el fluido cerebroespinal de pacientes después de trauma severo de cabeza

El fluido cerebroespinal (CSF) es un líquido que rodea las neuronas y las células gliales en el sistema nervioso. Está separado del sistema sanguíneo por la barrera sangre-cerebro y su composición de solutos está bien controlada y mantenida para permitir una función neuronal normal. Las lesiones en la cabeza pueden conducir a una rotura temporal de la barrera sangre-cerebro, posiblemente conduciendo así al aflujo de componentes sanguíneos, incluyendo trombina, al cerebro. Se ha descrito que la trombina afecta tanto a la supervivencia celular como a la muerte celular de neuronas y astrocitos después de la privación de glucosa o estrés oxidativo (Smith-Swintosky y otros, 1995; Vaughan y otros, 1995; Pike y otros, 1996). La adición de trombina a células de neuroblastoma o neuronas cultivadas provoca una retirada muy rápida de neuritas (Gurwitz y Cunningham, 1988; Grand y otros, 1989; Baird y Raper, 1995). Estos efectos de la trombina se producen a concentraciones picomolares (Gurwitz y Cunningham, 1988).

En un estudio previo que usa el substrato de pNA S2238, no se encontró trombina activa en el CSF (Smimova y otros, 1997). Sin embargo, usando un ensayo de la presente invención, pudo medirse trombina en cantidades subpicomolares y se han medido satisfactoriamente niveles de trombina en el CSF.

Se obtuvieron muestras de fluidos cerebroespinales CSFs humanos del Kantonspital, Basilea. Las muestras se obtuvieron de pacientes con trauma severo de cabeza, un paciente con una hemorragia subaracnoide y muerte cerebral diagnosticada y un sujeto sano. Las muestras se obtuvieron entre 3 horas y 17 días después de la lesión; para comparación, también se proporcionó una muestra de sangre de un paciente.

Medida del contenido en sangre

La cantidad de sangre contaminante se determinó midiendo la DO_{405} de diferentes diluciones de las muestras antes de empezar el ensayo de GPAR. Las pendientes de las curvas de DO_{405} frente a dilución recíproca se determinaron y compararon. El valor para la muestra de sangre se definió como 100%, mientras que el valor para el CSF de control del sujeto sano se definió como 0%. Se supuso una relación lineal entre el contenido en sangre y los valores de DO_{405}.

Medida de la concentración de trombina

Muestras de CSF se diluyeron en serie en tampón enzimático 1xEB_{T} [Tris/HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, PEG 6000 al 0,1%, Tween 20 al 0,02%] con diluciones que variaban de ½ a 1/30.000. Después de la medida del contenido en sangre, las muestras diluidas se ensayaron con respecto a la presencia de actividad similar a trombina por triplicado bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 1.

Las pendientes de la parte lineal de las curvas de respuesta a la dosis se determinaron y compararon con la pendiente para el patrón de trombina, para expresar los datos como la concentración picomolar de trombina en la muestra. Debido a una fuerte absorción intrínseca a 405 nm en sangre, el substrato de \beta-galactosidasa ONPG no podía usarse para la muestra de sangre. En cambio, se usó el substrato alternativo rojo de clorofenol-\beta-D-galactopiránosido (CPRG; disponible comercialmente de Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suiza) que permite una medida de la actividad de \beta-galactosidasa a 590 nm sin la interferencia de la absorción intrínseca de sangre. Se usó CPRG a la misma concentración que ONPG. El patrón de trombina se midió de acuerdo con esto.

La concentración de trombina podía determinarse precisamente en las muestras de CSF, según se indica mediante la curva de respuesta a la dosis de referencia para trombina, incluida dentro de la medida de cada grupo de tres muestras. En la muestra de CSF normal y en sangre, se detectaron niveles de trombina muy similares con una concentración de 25 y 29 pM, respectivamente. En las muestras de CSF procedentes de pacientes después de un trauma grave de cabeza, frecuentemente se encontró un nivel de trombina substancialmente superior, que en el paciente 1 era incluso 17 veces superior que el nivel normal ya a las 4 horas después de la lesión y todavía 5 veces superior después de 10 horas. En los otros pacientes se observaba tanto un incremento en la concentración de trombina a lo largo del tiempo (pacientes 2, 4) como una disminución (paciente 3). A partir de los pacientes restantes estaba disponible una sola muestra, no permitiendo esto una comparación directa. A partir de todos los pacientes había al menos una muestra que presentaba un nivel de trombina elevado, excepto para el CSF de un paciente tomado dos días después de la hemorragia subaracnoide. En este caso, el nivel de trombina era normal pero la muestra de CSF presentaba la cantidad más alta de contaminación sanguínea (\sim18%) (paciente 6). No había una correlación entre la cantidad de contaminación sanguínea en el CSF y la concentración de trombina. A partir de un paciente adicional estaba disponible una serie mayor de muestras de CSF, que se tomaban entre 20 y 280 h después de una lesión grave de cabeza. Mientras que en la primera fase después del trauma la concentración de trombina estaba en el intervalo del CSF normal, repentinamente se incrementaba intensamente después de 2 días hasta un nivel máximo de trombina 370 pM, que se alcanzaba 6 días después del trauma. Incluso hasta 12 días después del trauma, todavía se medía un nivel tres veces incrementado de trombina. Las fluctuaciones en los niveles de trombina eran fácilmente evidentes, incluso sobre una base diaria, tal como un fuerte incremento observado entre los días 2 y 3 y una disminución seguida de nuevo por un incremento entre los días 5 y 8. Cuando el mismo ensayo se realizaba en presencia de hirudina, no era detectable liberación de \beta-galactosidasa, identificando la actividad de proteasa observada como trombina.

En resumen, se ha medido la concentración de trombina en CSF con concentraciones en sangre normal o CSF en el intervalo de 25 a 30 pM y, en casos de CSF procedentes de pacientes después de un trauma severo de cabeza con niveles tan altos como 400 pM o más. En todos los casos en los que se medía un nivel de trombina incrementado, la concentración de trombina era al menos 100 pM. La alta sensibilidad del ensayo permite la medida de cantidades minúsculas de trombina en muestras biológicas o clínicas, incluyendo CSF. Así, el ensayo facilita estudios para determinar si la trombina es un factor de riesgo en la lesión traumática de cabeza, para predecir el comienzo de la lesión dependiendo de los niveles de trombina y para determinar si debe tenerse cuidado para bloquear específicamente las actividades de trombina en el CSF.

Ejemplo 8

Medida de la actividad de proteasa y la actividad inhibidora de proteasa en homogenados de cerebro de ratones con inactivación total de expresión ("knockout") de PN-1 y machos recién nacidos heterocigóticos o silvestres

El inhibidor de serina proteasa PN-1 muestra un patrón de expresión temporal y espacial distinto en el cartílago en desarrollo, el pulmón, la piel, el tracto urogenital y en el sistema nervioso central y periférico (Mansuy y otros, 1993). El gen para PN-1 se ha roto en ratones para definir mejor los papeles sugeridos para PN-1 durante el desarrollo y la edad adulta (Lüthi y otros, 1997). El presente ejemplo demuestra la medida de las cantidades de actividad de proteasa o inhibidora de proteasa en homogenados cerebrales obtenidos de ratones deficientes en PN-1 y de machos recién nacidos heterocigóticos y silvestres usando el substrato S2238 y el ensayo de GPAR. Se analizaron ratones y machos recién nacidos con inactivación total de la expresión ("knockout") de PN-1 descritos previamente (Lüthi y otros, 1997) que se retrocruzaron en la línea de ratones C57/BI6 (disponible comercialmente).

Preparación de homogenados cerebrales

Tres ratones de una camada de ratones con inactivación total de la expresión de ("knockout") PN-1 retrocruzados se anestesiaron y se perfundieron con tampón de sacarosa [HEPES 10 mM, pH 7,5, sacarosa 320 mM, EDTA 1 mM, Tween 20 al 0,2%]. Los cerebros se extirparon a continuación y se homogeneizaron durante 45 segundos en tampón de sacarosa a una relación de 2 ml por cerebro usando un homogeneizador Polytron (Kinematica, Luzern, Suiza). El residuo celular se separó centrifugando a 13.000 rpm en una centrífuga de sobremesa Heraeus a temperatura ambiente durante 15 minutos. El sobrenadante se esterilizó subsiguientemente filtrando en primer lugar a través de un filtro Millipore de 0,45 \mum y a continuación a través de uno de 0,22 \mum. Los homogenados se almacenaron congelados a -80ºC hasta el uso.

Medida de la actividad inhibidora de proteasa y trombina

Los sobrenadantes de homogenados cerebrales se diluyeron en serie en tampón enzimático 1xEB_{T} [Tris/HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, PEG 6000 al 0,1%, Tween 20 al 0,02%] con diluciones que variaban de 1/100 a 1/10.000. Las muestras diluidas se ensayaron con respecto a la presencia de actividad similar a trombina por triplicado bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 1. Para la medida de la actividad inhibidora de trombina los homogenados se diluyeron en tampón enzimático que contenía trombina 1 pM. Las concentraciones de actividad similar a trombina o actividad inhibidora de trombina se determinaron a partir de las pendientes de la parte lineal de la curva de respuesta a la dosis.

Los homogenados cerebrales de ratones silvestres o con inactivación total de la expresión ("knockout") de PN-1 de 14 días no liberaban cantidades medibles de actividad de \beta-galactosidasa soluble durante la incubación con GPAR-1 inmovilizada. Un exceso de actividad inhibidora de trombina se hacía evidente cuando los homogenados cerebrales se ensayaban en presencia de trombina 1 pM. De hecho, una reducción de la liberación de \beta-galactosidasa se detectaba en presencia del homogenado cerebral. La cantidad de inhibidor de trombina presente en los homogenados cerebrales se calculó a partir de estas curvas. La concentración más alta de inhibidor era 817 \pm 122 pM, presente en el homogenado del cerebro silvestre, mientras que la actividad inhibidora de trombina se reducía hasta 79 \pm 8 pM en el cerebro con inactivación total de la expresión ("knockout") de PN-1, equivalente a 9,7% del nivel silvestre. En el cerebro del ratón heterocigótico con inactivación total de la expresión ("knockout") de PN-1, se encontraba una concentración intermedia de 487 \pm 65 pM de actividad inhibidora de trombina. El inhibidor detectado es lo más probablemente PN-1, debido al nivel reducido que se encontraba en los cerebros de los ratones heterocigóticos. Sin embargo, incluso en el homogenado procedente del ratón heterocigótico con inactivación total de la expresión ("knockout") de PN-1, la actividad inhibidora de trombina era evidentemente medible, indicando la presencia de un inhibidor distinto de PN-1.

En resumen, se proporciona mediante el presente método la medida precisa y sensible de actividad de proteasa y actividad inhibidora de proteasa específicas de PAR en muestras de tejido. La ruptura buscada del gen de PN-1 conduce a una fuerte reducción, pero no a una anulación de la actividad inhibidora de trombina en homogenados cerebrales, demostrando así la presencia de un segundo inhibidor de trombina. La reducción en la actividad inhibidora podía medirse usando el substrato de trombina S2238, pero se confirmaba a un nivel más sensible usando el presente ensayo. No era detectable actividad similar a trombina, permitiendo la identificación de una proteasa buscada putativa para PN-1, en los animales con inactivación total de la expresión ("knockout").

Ejemplo 9

Medida de la actividad de proteasa y la actividad inhibidora de proteasa en fluidos del sistema reproductor múrido del macho

Después de la generación de ratones con eliminación total de la expresión ("knockout") de PN-1, el cruce subsiguiente de la línea de ratones mutantes indicaba que muchos machos con inactivación total de la expresión ("knockout") de PN-1 homocigóticos eran estériles. Puesto que PN-1 se expresa en altos niveles de un modo dependiente de andrógenos en el sistema reproductor masculino de ratones silvestres (Mansuy y otros, 1993; Vassalli y otros, 1993), su ausencia puede tener graves consecuencias para la fertilidad del animal. Posibles objetivos para PN-1 son las serina proteasas uPA y plasmina, que puede generarse mediante uPA a partir de plasminógeno. Se analizaron ratones con inactivación total de la expresión ("knockout") de PN-1 de 14 días de edad retrocruzados en la línea de ratones C57/BI6 descrita en el Ejemplo 8.

Recogida de fluidos del sistema reproductor masculino de ratones

Dos pares de ratones con inactivación total de la expresión ("knockout") de PN-1 retrocruzados adultos se anestesiaron y se sacrificaron mediante decapitación. La vesícula seminal, la glándula de coagulación y el vaso deferente/la cola de la epididimis se disecaron y su contenido se introdujo con fórceps en tubos de Eppendorf y se mezcló con 100 \mul de tampón enzimático (1xEB_{T} [Tris/HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, PEG 6000 al 0,1%, Tween 20 al 0,02%]. Las muestras se almacenaron congeladas a -80ºC hasta el uso.

Determinación de proteína

La determinación de proteína de diluciones en serie de las muestras de fluido se llevó a cabo usando un estuche para la determinación de proteína de tipo Bradford de BioRad de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Bradford, 1976).

Medida de la actividad de proteasa e inhibidora de proteasa

Los fluidos se diluyeron en serie en tampón enzimático con diluciones que variaban de 1/200 a 1/600.000. Las muestras diluidas se ensayaron por triplicado con respecto a la presencia de actividad similar a trombina bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 1, así como para la actividad inhibidora de trombina según se describe en el Ejemplo 7. Alternativamente, el ensayo se realizó en presencia de tripsina 10 pM. Las concentraciones de actividad similar a trombina o actividad inhibidora de trombina se determinaron a partir de las pendientes de la parte lineal de las curvas de respuesta a la dosis.

Todos los fluidos examinados contenían bien una cantidad medible de actividad proteolítica o bien de actividad inhibidora de trombina. La vesícula seminal contiene un exceso de actividad inhibidora de trombina de aproximadamente 240 fmol por mg de proteína, que se reduce hasta 19% en el ratón con inactivación total de la expresión ("knockout") de PN-1. En la glándula de coagulación del ratón silvestre está presente una actividad inhibidora de trombina a una concentración de aproximadamente 10 fmol por mg de proteína. En el ratón mutante que es incapaz de sintetizar PN-1, la actividad inhibidora de trombina se suprime, desenmascarando de ese modo un exceso de actividad de proteasa. El fluido procedente del vaso deferente presentaba una actividad de proteasa de aproximadamente 400 fmol por mg de proteína, que se incrementaba en 150% en el ratón con inactivación total de la expresión ("knockout") de PN-1. Para un ratón silvestre, la medida se realizó en presencia de tripsina 10 pM, mostrando que la actividad inhibidora en la vesícula seminal y en la glándula de coagulación también era capaz de inhibir la tripsina. El ensayo sensible descrito aquí ha permitido la detección de trombina y proteasas similares a tripsina y sus inhibidores en fluidos procedentes del sistema reproductor de ratones con inactivación total de la expresión ("knockout") de PN-1 y silvestres.

En resumen, se detectaba un exceso de actividad inhibidora de trombina en la glándula de coagulación de ratones silvestres, que estaba ausente en los ratones con inactivación total de la expresión ("knockout") de PN-1, dando como resultado un exceso de una actividad de proteasa similar a trombina no identificada. Una segunda actividad inhibidora de trombina se detectó en la vesícula seminal. En el vaso deferente y la cola de la epididimis, la rotura del gen de PN-1 conduce a un incremento de una actividad de proteasa no identificada que también estaba presente en el ratón silvestre a niveles inferiores. Así, el método de la presente invención puede usarse para detectar proteasas e inhibidores de proteasa no identificados hasta ahora que proporcionan objetivos biológicos adicionales para la regulación de PARs.

Ejemplo 10

Análisis de proteasas solubles o asociadas a la superficie celular

Este ejemplo describe la preparación de una proteína de fusión expresada de un modo unido a la membrana sobre la superficie de células de mamífero en cultivo, permitiendo de ese modo el análisis de proteasas solubles o asociadas a la superficie celular. Usando este formato, se ha podido demostrar la liberación mediada por trombina de una enzima informadora al medio de células cultivadas. Las células de neuroblastoma de ratón (células Nb2a o Cho-E) cultivadas se transfectaron con el cDNA de una proteína de fusión anclada a la membrana de fosfatasa alcalina placentaria humana y los dominios extracelular y primero de transmembrana de PAR1.

Las intensidades de la señal pueden optimizarse fácilmente para cada constructo de fusión de PAR, por ejemplo, mediante la selección de una línea celular que permite niveles de expresión altos y creando una línea celular que expresa establemente la proteína de fusión receptora. El formato basado en células del ensayo puede usarse para la detección sensible de proteasas que son capaces de activar proenzimas, tales como protrombina, o de segmentar y liberar la enzima informadora directamente.

Como es evidente para un experto normal en la técnica, los Ejemplos anteriores pueden modificarse fácilmente para incluir el uso de diversas moléculas informadoras o secuencias de PAR para detectar activadores, inactivadores, agonistas y antagonistas de PAR en muestras de diversos orígenes. Además, las proteínas de fusión de PAR descritas aquí son útiles para rastrear cualquier proteína o molécula que se une a PAR, que puede a continuación identificarse mediante métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, proteómica).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Ensayos de GPAR: Velocidades de liberación de \beta-galactosidasa mediante activadores e inactivadores potenciales de PARs

1

<110> Novartis Research Foundation

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<120> Ensayos de Moduladores de Receptores Activados de Proteasas (PARs)

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<130> Secuencias de ensayo de PARs

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<140>

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<141>

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<160> 18

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 46

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<212> DNA

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<213> mus

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<400> 1

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cacacagcgg ccgcgtcgac gatgagcgaa aaatacatcg tcacct

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46

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<210> 2

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<211> 53

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<212> DNA

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<213> mus

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<400> 2

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cacacttaat taatctagat ttgtacagtt tttgacacca gaccaactgg taa

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53

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<210> 3

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<211> 76

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<212> DNA

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<213> mus

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<400> 3

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cacacaccat ggggtcgacg atgagcgtgt acagtggagg ttcaggcgga tcaagccagc

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60

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cagaatcaga gaggac

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76

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<210> 4

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> mus

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<400> 4

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gagagaacta gtggggctgg tcagatatcc ggag

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34

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<210> 5

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<211> 136

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<212> DNA

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<213> mus

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<400> 5

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2

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<210> 6

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<211> 45

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<212> DNA

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<213> mus

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<400> 6

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cacacatcta gataaggatc catgaaggat aacaccgtgc cactg

\hfill

45

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<210> 7

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<211> 41

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<212> DNA

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<213> mus

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<400> 7

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cacacaggta ccaagcttat ttttctgcac tacgcaggga t

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41

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<210> 8

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<211> 42

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<212> DNA

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<213> mus

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<400> 8

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ctcatgtaca gtggaggttc aggaggctcg agccagccag aa

\hfill

42

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<210> 9

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<211> 114

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<212> DNA

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<213> mus

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<400> 9

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3

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<210> 10

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<211> 112

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<212> DNA

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<213> mus

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<400> 10

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4

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<210> 11

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<211> 135

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<212> DNA

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<213> mus

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<400> 11

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5

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<210> 12

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<211> 134

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<212> DNA

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<213> humano

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<400> 12

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6

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<210> 13

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<211> 115

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<212> DNA

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<213> human

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<400> 13

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7

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<210> 14

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<211> 113

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<212> DNA

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<213> humano

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<220>

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<400> 14

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8

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<210> 15

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<211> 112

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ratón flanqueada por secuencias no relacionadas

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<400> 15

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9

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<210> 16

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<211> 87

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<400> 16

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10

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<210> 17

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<211> 106

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<400> 17

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11

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<210> 18

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<211> 96

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<400> 18

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12

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Claims

1. Un método para identificar o detectar una molécula de segmentación de PAR, comprendiendo dicho método las etapas de

(b): poner en contacto dicho péptido de segmentación de PAR inmovilizado con una molécula que segmenta PAR; y

(c): detectar la molécula informadora liberada.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho péptido de segmentación de PAR comprende VNPR, SKGR, LTIK o PAPR.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho péptido de segmentación de PAR está enlazado a un resto de biotina y está inmovilizado a través de una interacción biotina-avidina o biotina-estreptavidina.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, que comprende además determinar el sitio de segmentación de dicho péptido de segmentación de PAR mediante dicha molécula que segmenta PAR.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha molécula que segmenta PAR se identifica por ser un activador de PAR si dicho sitio de segmentación está en un sitio de segmentación biológica.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha molécula que segmenta PAR se identifica como un inactivador de PAR si dicho sitio de segmentación no está en un sitio de segmentación biológica.

7. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, que comprende además poner en contacto dicho péptido de segmentación de PAR inmovilizado con un modulador de PAR potencial y determinar un cambio en el nivel de molécula informadora liberada en comparación con cuando dicho modulador de PAR está ausente.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha molécula informadora es una enzima informadora.

9. El método de acuerdo la reivindicación 8, en el que dicha enzima informadora se selecciona del grupo que consiste en beta-galactosidasa, glucosidasas, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), glucuronidasas, luciferasa, peroxidasas, fosfatasas, oxidorreductasas, deshidrogenasas, transferasas, isomerasas, quinasas, reductasas, desaminasas, catalasas y ureasa.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha enzima informadora es beta-galactosidasa.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho péptido de segmentación de PAR está inmovilizado en una placa de múltiples pocillos, un gel, una matriz, una cuenta, una membrana o un tubo.

12. Un estuche que comprende una proteína de fusión de PAR, en el que dicha proteína de fusión de PAR es una proteína de fusión de PAR con un informador enzimático y en el que dicha proteína de fusión de PAR está inmovilizada sobre un soporte sólido, para el uso en los métodos de acuerdo con las reivindicaciones 8 ó 9.

13. El estuche de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha proteína de fusión de PAR es una proteína de fusión de PAR-beta\beta-galactosidasa.