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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Tests für Modulatoren von Protease-aktivierten
Rezeptoren, die in den Gebieten der Thrombogenese, Neurobiologie,
Onkologie, Osteoporose und Darmmotilität brauchbar sind.
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Einführung
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Der
Thrombinrezeptor (Protease-aktivierter Rezeptor 1, PAR1, Nystedt
et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9208–9212) ist
der prototypische Vertreter einer Familie an G-Protein-gekuppelten
Rezeptoren mit 7 Transmembrandomänen,
die Protease-aktivierte Rezeptoren (PARs) genannt werden, die jetzt
4 identifizierte Vertreter sowohl in der Maus als auch beim Menschen
umfasst, von denen einige auch in mehreren Vertebraten identifiziert
wurden (Nystedt et al. (1994), Nystedt et al. (1995), J. Biol. Chem.
270, 5950–5955, Ishihara
et al. (1997) Nature 386, 502–506,
Kahn et al. (1998), Nature 394, 690–694, Vu et al. (1991) Cell
64, 1057–1068,
Bohm et al. (1996) Biochem. J. 314 (Pt 3), 1009–1016, Xu et al. (1998), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 95, 6642–6646,
Rasmussen et al. (1991) FEBS Lett 288, 123–128, Zhong et al. (1992),
J. Biol. Chem. 267, 16975–16979,
Saifeddine et al. (1996) Br. J. Pharmacol. 118, 521–530, Gerszten
et al. (1994) Nature 368, 648–651).
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Thrombin
spaltet humanes PAR1 nach Arg4 1,
was zu einem neuen N-Terminus führt,
der intramolekular die Aktivierung des Rezeptors auslöst (Vu et
al., 1991). Ähnlich
werden andere Vertreter der PAR Familie durch die Proteasespaltung
aktiviert. Die Aktivierung von PAR1 kann auch durch die Anwendung
der Thrombinrezeptor-aktivierenden Peptide (TRAPs) erreicht werden,
die den durch Thrombinspaltung erzeugten N-Terminus nachahmen (Vu
et al. 1991). PARs können
so als Peptidrezeptoren betrachtet werden, die ihren eigenen Liganden
tragen, der nach der proteolytischen Spaltung unmaskiert ist.
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PARs
sind bei verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt. Thrombin
oder TRAP Behandlung verursacht eine Neuritenrückbildung in kultivierten Neuroblastomzellen
(Gurwitz und Cunnigham (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3440–3444, Suidan
et al. (1992) Neuron 8, 363–375)
und die Rückbildung
der sternförmigen
Verzweigungen wie auch die Proliferation von Astrocyten (Cavanaugh
et al. (1990) J. Neurochem 54, 1735–1743, Grabham und Cunningham
(1995), J. Neurochem 64, 583–591,
Loret et al., (1989), J. Biol. Chem. 264, 8319–8327, Nelson und Siman (1990),
Brain Res. Dev. Brain Res. 54, 93–104, Pindon et al. (1998)
Eur. J. Biochem 255, 766–774,
Suidan et al. (1997), Glia 21, 244–25, Perraud et al. (1987)
Int. J. Dev. Neurosci 5, 181–188).
Geringe Mengen an Thrombin erhöhen
die Überlebensrate
von provozierten Hippokampusneuronen und Astrocyten, aber hohe Dosen
der Protease verursachen eine neuronale Apoptose, was eine modulatorische
Rolle für
PAR1 im programmierten Zelltod nahelegt (Vaughan et al. (1995),
J. Neurosci. 15, 5389–5401,
Smith-Swintosky et al. (1995), J. Neurosci. 15, 5840–5850).
Die Blockierung der PAR1 Aktivierung mit einem Antikörper, der
gegen den neu geschaffenen N-Terminus gerichtet ist, wirkt der durch
Thrombin induzierten Blutplättchenaktivierung
(Hung et al. (1992) J. Cell. Biol. 116, 827–832, Brass et al. (1992) J.
Biol. Chem. 267, 13795–13798)
wie auch der Neuritenrückbildungsreaktion
der Neuroblastomzellen (Suidan et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91, 8112–8116)
entgegen. PAR1 wird in humanen Krebszelllinien und Biopsien stark
exprimiert, was die Beteiligung im mitogenen und metastasierenden
Verhalten von Tumorzellen andeutet (Even-Ram et al. (1998), Nat.
Med. 4, 909–914,
Kaufmann et al. (1997), Cancer 80, 2068–2074, Kaufmann et al. (1998a)
Neuroreport 9, 709–712,
Nierodzik et al. (1998) Blood 92, 3694–3700). Während die PAR1 Aktivierung
die DNA Synthese in Hep-2g Krebszellen stimuliert (Kaufmann et al.,
1997), führt
die PAR2 Aktivierung zu einer Verringerung der DNA Synthese in den
humanen Pankreastumorzellen MIA PaCa-2 (Kaufmann et al. (1998b)
Int. J. Pancreatol. 24, 97–102).
PAR1 vermittelt die Aktivierung von humanen Blutplättchen, während die
von Mäusen
stammenden Blutplättchen
durch PAR3 aktiviert werden (Ishihara et al. 1997). Geringe Mengen
an PAR4 wurden als zweiter Thrombin-sensitiver Rezeptor in Blutplättchen detektiert
(Kahn et al. 1998, Xu et al. 1998).
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PAR1
kann durch Thrombin, Trypsin, Plasmin, Granzym A und möglicherweise
auch durch aktiviertes Protein C aktiviert werden (Ishihara et al.
1997, Vu et al. 1991, Suidan et al. 1994, Parry et al. (1996) Biochem J.
320, 335–341).
Im Gegensatz dazu entfernt die Spaltung von PAR1 durch Cathepsin
G, Chymotrypsin, Leukozytenelastase oder Myeloblastin (Proteinase
3) die Thrombinspaltstelle, was eine Rolle für diese Proteasen bei der Inaktivierung
des Rezeptors andeutet (Vu et al. 1991, Parry et al. 1996, Molino
et al. (1995), J. Biol. Chem. 270, 11168–11175, Renesto et al. (1997)
Blood 89, 1944–1953),
da die Spaltung an einer alternativen Stelle einen neuen N-Terminus
bildet, der bei der Signaltransduktion inaktiv ist. PAR2 unterscheidet
sich von anderen bekannten Vertretern der PAR Familie dahingehend,
dass es eine Spaltstelle enthält,
die gegenüber Serinproteasen
empfindlich ist, wie Trypsin, Mastzelltryptase und Acrosin (Nystedt
et al (1994), Molino et al. (1997a), J. Biol. Chem. 272, 4043–4049, Fox
et al. (1997), FEBS Lett. 417, 267–269). Der physiologische Aktivator
von PAR2 in Enterozyten ist höchstwahrscheinlich
Trypsin (Kong et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8884–8889),
während
in anderen Geweben die Aktivatoren von PAR2 großteils unbekannt sind.
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Zusammengefasst
wurden detaillierte Studien ausgeführt, um Proteasen zu identifizieren,
die zur Aktivierung oder Inaktivierung von PAR1 fähig sind
(Vu et al. 1991, Pary et al. 1996, Molino et al. 1995, Renesto et
al. 1997, Ishii et al. (1995), J. Biol. Chem. 270, 16435–16440),
jedoch ist für
PAR2 (Nystedt et al. (1994), Molino et al. (1997a), Fox et al. (1997),
Molino et al. (1997b), J. Biol. Chem. 272, 11133–11141), PAR3 (Ishihara et
al. 1997) oder PAR4 (Kahn et al. 1998, Xu et al. 1998) wenig bekannt.
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Die
Tests für
die PAR Spaltung und Aktivierung basierten früher auf der Analyse von gereinigten
Spaltprodukten, die aus der Wirkung von Proteasen auf lösliche Peptidsubstrate
resultieren, die auf der PAR Spaltstelle basieren (K. Ishii (1995),
J. Biol. Chem. 270: 16435–16440)
oder auf der Messung der 45Ca2+ Freisetzung, die
durch eine Proteaseaktivierung der PARs aufgelöst wird, die in Xenopus Oocyten
mikroinjiziert werden (Vu et al. 1991). Die WO 98 18 456 A und K.
Ishii et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 9780–9786 beschreiben Verfahren
zur Untersuchung der Thrombinspaltung von PAR1 oder PAR3 durch die
Detektion der M1 Antikörperbindung
an mit Epitop versehenes PAR, das auf der Zelloberfläche von
COS-7 oder Ratten-1 Zellen exprimiert wird, vor und nach der Thrombinbehandlung.
Diese Verfahren sind entweder aufwändig, unsensitiv und für Methoden
mit hohem Durchsatz nicht besonders passend. Zusätzlich schließt der Ca2+ Signaltest nicht Proteasen aus, die die
Ca2+ Signalbildung auf eine Weise beeinflussen,
die unabhängig
von der PAR Aktivierung ist. Tests, die die Identifizierung der
PAR-spaltenden Proteasen
und die Charakterisierung der Proteasespezifität erlauben sind erforderlich,
um weiter die wichtige biologische Rolle der PARs zu ermitteln.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zur Identifikation oder Detektion eines
PAR Spaltmoleküls
bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Bereitstellung eines immobilisierten PAR
Spaltpeptids, das an ein Reportermolekül gebunden ist,
- (b) Zusammenbringen des immobilisierten PAR Spaltpeptids mit
einem PAR Spaltmolekül,
und
- (c) Detektion des freigesetzten Reportermoleküls. Das
Reportermolekül
liefert vorzugsweise ein amplifizierbares Signal, wie dies der Fall
ist, wenn das Reportermolekül
ein Reporterenzym ist. Das Verfahren ist bei der Identifizierung
der Aktivatoren und Inaktivatoren von PAR wie auch von Modulatoren
der PAR Aktivierung brauchbar. Die vorliegende Erfindung liefert
auch Kits, die ein PAR Fusionsprotein umfassen, worin das PAR Fusionsprotein
ein PAR Fusionsprotein mit einem enzymatischen Reporter ist und
worin das PAR Fusionsprotein auf einem festen Träger immobilisiert ist zur Verwendung
in den erfindungsgemäßen Verfahren.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1A:
Schematische Zeichnung eines Plasmids zur Produktion eines biotinylierten
GPAR1 Fusionsproteins in E. coli. BAD: Biotinakzeptordomäne. BirA:
Biotinholoenzymsynthetase. 1B: C-terminales Ende der
GPAR Fusionsproteine. Kleine Buchstaben: Linker. Große Buchstaben:
Extrazelluläre
Fragmente der N-terminalen Domäne
von PAR. Kursive Buchstaben: Affinitätsanhänge. Fette Buchstaben und Pfeil:
Rest der Aktivierungsstelle.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Ein
sensitives Verfahren zur Detektion von Proteasen, die zur Spaltung
der Protease-aktivierten Rezeptoren (PARs) fähig sind, wird bereitgestellt.
Die Tests erlauben die Detektion von Proteasen, die die extrazellulären Domänen der
PARs spalten, in kleinen Mengen an biologischen Proben, ein ziemlich
relevanter Vorteil für
klinische Tests. Die Tests können
auch für
Screeningzwecke verwendet werden und erlauben dem Anwender die Detektion
und Charakterisierung von Proteasemengen, die in kleinen Mengen
aber trotzdem biologisch relevanten Konzentrationen für die durch
PARS vermittelten biologischen Effekte vorhanden sind. Zusätzlich kann
ein natürlicheres
Proteasesubstrat entworfen werden, als jene, die vorher für PAR Spalttests
verwendet wurden. Daher ist das Verfahren zur Analyse der proteolytischen
Regulation von PARs und zum Screening von PAR Modulatoren brauchbar.
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In
einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Identifikation
oder Detektion eines PAR Spaltmoleküls bereitgestellt, wobei das
Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- (a)
Bereitstellung eines immobilisierten PAR Spaltpeptids, das an ein
Reportermolekül
gebunden ist,
- (b) Zusammenbringen des immobilisierten PAR Spaltpeptids mit
einem PAR Spaltmolekül,
und
- (c) Detektion des freigesetzten Reportermoleküls.
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Wie
hierin verwendet wird der Ausdruck "Protease-aktivierter Rezeptor" oder "PAR" verwendet, um ein Oberflächenprotein
einer eukaryontischen Zelle zu bezeichnen, das spezifisch durch
eine Protease aktiviert werden kann und die geeignete Kaskade biologischer
Ereignisse einleiten kann (beispielsweise Phosphoinositidhydrolyse,
Ca2+ Efflux oder Blutplättchenaggregation). Ein PAR
Spaltmolekül
kann jedes Molekül
sein, das zur Spaltung von PAR fähig
ist, wie eine ortsspezifische Protease, deren Funktion es ist, ein
PAR in einem biologischen System zu aktivieren (oder inaktivieren).
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Der
Ausdruck "PAR Spaltpeptid" meint, wie er hierin
verwendet wird, ein Peptid oder Polypeptid, das die aminoterminale
PAR Exodomäne
oder ein Fragment hiervon umfasst und die endogene Proteasespaltstelle
umfasst, die PAR aktiviert (oder inaktiviert). Beispielsweise wird
PAR1 der Maus und des Menschen durch Thrombin nach Arg4 1 gespalten. Es sind minimal 3 Aminosäuren stromaufwärts von
Arg4 1 (N-terminal
hierzu in der natürlichen
Sequenz) gefolgt von einem Arg minimal erforderlich, um das Vorkommen
eines Proteaseaktivators von PAR1 (VNPR) zu detektieren. Das PAR2
der Maus wird nach Arg38 gespalten. Drei
Aminosäuren direkt
stromaufwärts
von Arg38 gefolgt von Arg sind minimal erforderlich,
um das Vorkommen des Proteaseaktivators von PAR2 der Maus (SKGR)
zu detektieren. Das PAR3 der Maus wird nach dem Lys3 7 gespalten. Es sind drei Aminosäuren direkt
stromaufwärts
von Lys37 gefolgt von Lys minimal erforderlich,
um das Vorkommen eines Proteaseaktivators von PAR3 (LTIK) zu detektieren.
Das humane PAR4 wird nach Arg47 gespalten.
Es sind minimal 3 Aminosäuren
direkt stromaufwärts
von Arg47 gefolgt von Arg erforderlich,
um das Vorkommen eines Proteaseaktivators von humanem PAR4 (PAPR)
zu detektieren. Ähnlich
für andere
PARs und zur Detektion der Proteaseinaktivatoren sind die 4 Aminosäuren N-terminal
zur Spaltstelle minimal im PAR Spaltpeptid zur Detektion einer Protease
enthalten.
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Typischerweise
werden zusätzliche
Aminosäuren
im PAR Spaltpeptid enthalten, insbesondere Sequenzen der extrazellulären PAR
Domäne
stromabwärts
der Spaltstelle. Beispielsweise ist zur Detektion von Thrombin mittels
Thrombin-sensitiver PARs der Einbau der "Hirudin-ähnlichen Sequenz" GDEee bevorzugt, wobei
die "Hirudin-ähnliche
Sequenz" minimal
GDE umfasst, aber typischerweise zusätzliche saure Aminosäurereste,
insbesondere zusätzliche
E Reste umfasst. Daher kann zur Detektion von Thrombin das minimale PAR
Spaltpeptid direkt oder indirekt an die "Hirudin-ähnliche Sequenz" gebunden werden,
bei der eine indirekte Bindung mittels PAR Sequenzen, die natürlich zwischen
dem minimalen PAR Spaltpeptid und der "Hirudin-ähnlichen Sequenz" vorkommen oder mittels
einer Linkersequenz ohne Bezug erreicht werden. Vorzugsweise werden
die Sequenzen der extrazellulären
Domäne
der Spaltstelle in das PAR Spaltpeptid einbezogen, insbesondere
wenn der Test zur Detektion von inaktivierenden Proteasen verwendet
wird.
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Bevorzugter
werden Aminosäuresequenzen,
die die Spaltstelle im natürlich
vorkommenden PAR umgeben, in das PAR Spaltpeptid aufgenommen und
so das natürliche
Proteasesubstrat nachgeahmt. Beispielsweise erstrecken sich die
in den folgenden Beispielen verwendeten Fragmente der aminoterminalen
Exodomäne
(extrazellulären
Domäne)
von den Aminosäuren
27 bis 78, 26 bis 78, 21 bis 92 und 17 bis 78 (die Aminosäurenummerierung
entspricht der EMBL Datenbanknummerierung) jeweils von Maus PAR1
(EMBL Hinterlegungsnummer L03529), Maus PAR2 (EMBL Hinterlegungsnummer
Z48043), Maus PAR3 (EMBL Hinterlegungsnummer U92972) und Mensch
PAR4 (EMBL Hinterlegungsnummer AF055917) und erlaubt so die Detektion
von PAR Aktivatoren und Inaktivatoren.
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Obwohl
die spezifischen Beispiele, die hierin bereitgestellt werden, auf
bekannte PARs beschränkt sind,
ist es für
den Fachmann ersichtlich, dass bisher nicht identifizierte PARs
oder Fragmente hiervon leicht in Anbetracht der Beschreibungen der
vorliegenden Spezifikation hergestellt werden können. Beispielsweise können Oligonukieotidmatrizen
für die
PCR Amplifikation der kodierenden Sequenzen für die extrazellulären Domänen der
unterschiedlichen PARs zur Verwendung gemäß dem Ausmaß der Homologie zwischen den
bekannten und den neuen PARs und in Abhängigkeit der Hybridisierungsbedingungen
modifiziert werden. Alternativ dazu kann, falls ausreichend Identität zwischen
den zwei Se quenzen besteht, die selbe Matrize ohne weitere Modifikation
verwendet werden. Alternativ dazu können geeignete Paare an Oligonukleotidmatrizen
verwendet werden. Zusätzlich
sind Varianten der natürlich
vorkommenden Sequenzen vorgesehen, insbesondere konservative Substitutionen
von Aminosäuren,
die an der biologischen Spaltstelle nicht für eine Spaltung essentiell
sind.
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Es
ist vorteilhaft, eine Transmembrandomäne in das PAR Spaltpeptid mitaufzunehmen.
Eine Transmembrandomäne
besteht aus hydrophoben Regionen, die identifiziert werden können, wie
durch computergestützte
Hydropathieplots. Beispielsweise werden die sieben Transmembrandomänen von
PAR1 auf diese Weise durch Vu et al. (1991, siehe 5)
identifiziert. Die Aufnahme einer Transmembrandomäne in das
PAR Spaltpeptid ist besonders brauchbar zur Detektion von Proteasen
nach einer Expression des PAR Spaltpeptids auf der Zelloberfläche, wobei
die Transmembrandomäne
die Verankerung des Peptids in die Membran der Zelle erlaubt. Die
Transmembrandomäne
kann jeden Ursprungs sein, obwohl die Einbeziehung einer PAR Transmembrandomäne bevorzugt
ist. Zur leichteren Herstellung wird die PAR Exodomäne gefolgt
von der ersten Transmembrandomäne
typischerweise in der Ausführungsform
verwendet (beispielsweise einschließlich der Aminosäuren 99
bis 127 von PAR1 (Vu et al. (1991)).
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Das
PAR Spaltpeptid ist an ein Reportermolekül gebunden. Das Reportermolekül (das heißt ein Signal-erzeugendes
Molekül)
kann jedes Molekül
sein, das zur Bereitstellung einer detektierbaren Veränderung fähig ist.
Solche Reportermoleküle
umfassen Fluoreszenzreste (beispielsweise Fluoreszenzproteine oder
chemische Fluoreszenzmarkierungen), radioaktive Reste, phophoreszierende
Reste, Antigene, Reporterenzyme und dergleichen. Vorzugsweise ist
das Reportermolekül
ein Reporterenzym, dessen Aktivität eine detektierbare Veränderung
herbeiführt.
Solche Reporterenzyme umfassen unter anderem die folgenden: Beta-Galactosidase,
Glucosidasen, Chloramphenicolacetyltransferasen (CAT), Glucuronidasen,
Luciferase, Peroxidasen, Phosphatasen, Oxidoreduktasen, Dehydrogenasen,
Transferasen, Isomerasen, Kinasen, Reduktasen, Desaminasen, Katalasen
und Urease.
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Bei
der Auswahl eines im vorliegenden Verfahren verwendeten Reportermoleküls ist es
zwingend, dass das Reportermolekül
keiner Inaktivierung durch ein Mittel in der Probe unterzogen wird,
einschließlich
der Inaktivierung durch eine Proteaseaktivität, die in einer Probe vorhanden
ist. Die Selektion eines geeigneten Reportermoleküls ist für den Fachmann
leicht ersichtlich. Derzeit bevorzugte Reportermoleküle sind
Reporterenzyme, wie beta-Galactosidase, wie dies im Beispiel 1 dargestellt
ist.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das bereitgestellte PAR
Spaltpeptid an ein Paar aus wechselwirkenden Reportermolekülen gebunden.
Nach der Spaltung des PAR Spaltpeptids wird ein Reporter aus dem
PAR Spaltpeptid freigesetzt, was zu einer detektierbaren Veränderung
im zweiten Reportermolekül führt. Beispielsweise
kann ein Fusionsprotein entworfen werden, das in N-terminaler zu
C-terminaler Richtung umfasst:
Ein erstes Fluoreszenzprotein (beispielsweise Cyanfluoreszenzprotein
CFP, gelbes Fluoreszenzprotein YFP, blaues Fluoreszenzprotein BFP,
grünes
Fluoreszenzprotein GFP, wobei alle im Handel erhältlich sind, Clontech Living
Colors User Manual), ein PAR Spaltpeptid und ein zweites Fluoreszenzprotein.
Die Immobilisierung des PAR Spaltpeptids kann wie im folgenden beschrieben
erreicht werden. Nach der Spaltung an der PAR Spaltstelle tritt
eine messbare Veränderung
in der Fluoreszenzwellenlänge
des zweiten Reportermoleküls
auf.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
dieses Aspekts der Erfindung umfassen in N-terminaler zu C-terminaler Reihenfolge
Cyanfluoreszenzprotein, PAR Spaltpeptid, gelbes Fluoreszenzprotein
und einen Immobilisierungsanhang (beispielsweise ein Biotinanhang
oder eine Transmembrandomäne)
oder ein gelbes Fluoreszenzprotein, PAR Spaltpeptid, rotes Fluoreszenzprotein
und einen Immobilisierungsanhang (beispielsweise ein Biotinanhang
oder eine Transmembrandomäne).
Es ist für
den Fachmann ersichtlich, dass andere wechselwirkende Reportermoleküle verwendet
werden können,
beispielsweise Aequorin und GFP, Luciferase und YFP. Vorzugsweise
sind die zwei wechselwirkenden Reportermoleküle durch mindestens 15 Aminosäuren, bevorzugter
mindestens 20 Aminosäuren,
vor allem mindestens 30 Aminosäuren
getrennt, was die natürlich
vorkommenden PAR Sequenzen nachahmt.
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Die
Bindung des Reportermoleküls
an das PAR Spaltpeptid kann durch jedes in der Technik bekannte Mittel
(oder noch aufzufindende Mittel) erreicht werden, mit der Maßgabe, dass
(i) das PAR Spaltpeptid durch die Protease erkannt werden kann und
(ii) nach der Proteasewirkung auf das PAR Spaltpeptid ein Reportermolekül auf eine
detektierbare Weise freigesetzt wird. Daher kann die Bindung erreicht
werden durch eine chemische Reaktion, durch Einbau eines Reportermoleküls während der
Synthese des PAR Spaltpeptids oder durch zusammenhängende Synthese.
Wenn beispielsweise das Reportermolekül ein Protein ist, kann ein
Fusionsprotein, das das Reportermolekül, das PAR Spaltpeptid und
andere optionale Sequenzen umfasst, leicht durch rekombinante oder
chemische Verfahren hergestellt werden.
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Kurz
gesagt kann die DNA, die für
das Fusionsprotein kodiert, in einer Nukleinsäureexpressionskassette enthalten
sein, die einen Promotor umfasst, der operativ an die für das Fusionsprotein
kodierende Aminosäure
gebunden ist und wahlweise an Transkriptionsterminationssignale.
Die fusionierten Polypeptide des Fusionsproteins können direkt
oder über
einen Spacer gebunden sein. Das PAR Spaltpeptid kann in Abhängigkeit
vom bestimmten Design des Tests (siehe unten) N-terminal oder C-terminal
zum Reportermolekül
sein.
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Der
Promotor kann aus fast jedem Ursprung stammen. Es ist beispielsweise
möglich
einen eng regulierten Promotor oder den Promotor zu verwenden, der
natürlich
benachbart zu einem PAR gen liegt. Bevorzugt sind Promotoren, die
in den ausgewählten
Wirtszellen aktiv sind, wie die Promotoren SV40, tac, beta-Aktin,
Metallothionin, T7, Polyhedrin und Cytomegalovirus. Ein besonders
bevorzugter Promotor ist der IacZ Promotor, wie er im folgenden
in Beispiel 1 beispielhaft dargestellt ist. Geeignete Promotorsequenzen
zur Verwendung mit den Hefewirten können reguliert oder konstitutiv
sein und leiten sich vorzugsweise von einem stark exprimierten Hefegen
ab, speziell einem Saccharomyces cerevisae Gen. Daher kann der Promotor
der TRP1 Gens des ADHI oder ADHII Gens oder des Gens der sauren
Phosphatase (Pho5) verwendet werden.
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Eine
DNA Sequenz, die die Transkriptionsterminationssignale enthält, ist
vorzugsweise die 3'-flankierende Sequenz
eines Gens, das geeignete Signale zur Transkriptionstermination
und Polyadenylierung für
den gewünschten
Wirt enthält.
Geeignete Signale sind beispielsweise das Polyadenylierungssignal
des humanen Wachstumshormons, des DHFR Gens und des Kaninchen ß-Globingens.
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In
einigen Ausführungsformen,
in denen die Verankerung der Zellmembran nicht erwünscht ist,
ist es auch möglich,
eine Polypeptidexpressionskassette zu verwenden, die zusätzlich eine
Signalsequenz enthält, die
verursacht, dass das Protein in das Medium sekretiert wird. Geeignete
Signalsequenzen sind in der Technik bekannt. Demnach ist in dieser
Art von Expressionskassetten ein Promotor operativ an eine erste
DNA Sequenz gebunden, die für
ein Signalpeptid kodiert, das im richtigen Leserahmen an eine zweite
DNA Sequenz gebunden ist, die für
das Fusionsprotein kodiert und an eine DNA Sequenz, die die Transkriptionsterminationssignale
enthält.
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Der
Promotor, die für
das Fusionsprotein kodierende DNA Sequenz und die die Transkriptionsterminationssignale
enthaltende DNA Sequenz werden operativ miteinander verbunden, das
heißt
sie werden so zusammengesetzt, dass ihre normalen Funktionen erhalten
bleiben. Das Ziel ist, dass der Promotor eine korrekte Expression
des Strukturgens und die Transkriptionsterminationssignale eine
korrekte Termination der Transkription und Polyadenylierung bewirken.
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Die
erfindungsgemäßen Expressionskassetten
zur Synthese des Fusionsproteins können in den gewünschten
Wirt in Form eines stabilen Plasmids oder direkt in das Chromosom
eingebaut werden, wobei letzteres bevorzugt ist.
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Es
ist auch möglich,
dass die erfindungsgemäßen Expressionsplasmide
einen oder mehrere, speziell ein oder zwei genetische Selektionsmarker
für den
zur Konstruktion, Amplifikation und zum Testen des Plasmids verwendeten
Wirt umfassen, wie einen Marker und einen Replikationsursprung für einen
bakteriellen Wirt, speziell Escherichia coli.
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Als
genetischer Selektionsmarker kann jedes Markergen verwendet werden,
das die Selektion auf Transformanden aufgrund der phänotypischen
Expression des Markergens erleichtert. Geeignete Marker sind beispielsweise
die, die Antibiotikumresistenz exprimieren, oder im Fall von auxotrophen
Wirtsmutanten, Gene, die die Wirtsschäden komplementieren. Entsprechende
Gene verleihen beispielsweise eine Resistenz gegenüber den
Antibiotika Tetracyclin, Ampicillin, G418, Hygromycin, Kanamycin,
Chloramphenicol, Carbenicillin, Zeocin, Blasticydin oder Bleomycin
oder sorgen für
eine Prototrophie in einer auxotrophen Mutante, beispielsweise das
URA3, LEU2, LYS2, HIS3 oder TRP1 Gen.
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Da
die Amplifizierung der Expressionsplasmide gewöhnlich in einem Prokaryonten
durchgeführt
wird, wie E.coli, wird vorteilhafterweise ein Replikationsursprung
einbezogen. Diese können
aus entsprechenden prokaryontischen Plasmiden erhalten werden, beispielsweise
E. coli Plasmiden, wie pBluescript®, pBR322, pTZ18R
oder einem pUC Plasmid, beispielsweise pUC18 oder pUC19, die beide
einen prokaryontischen, beispielsweise E. coli Replikationsursprung
und einen Genmarker enthalten, der eine Resistenz gegenüber Antibiotika
verleiht, wie Ampicillin und Tetracyclin.
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Bevorzugte
Nukleinsäuren,
die für
das Fusionsprotein kodieren, sind in den späteren Beispielen 1 bis 5 beschrieben.
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Die
erfindungsgemäßen Expressionsplasmide
werden durch in der Technik bekannte Verfahren hergestellt, beispielsweise
durch Verbinden der Polypeptidexpressionskassette, der die selektiven
Genmarker für den
Wirt enthaltenden DNA Fragmente und des Replikationsursprungs in
der vorbestimmten Reihenfolge mittels herkömmlicher chemischer oder biologischer
in vitro Syntheseverfahren. Vorzugsweise werden die Plasmide mittels
rekombinanter DNA Techniken konstruiert und hergestellt. Zur Herstellung
durch rekombinante DNA Techniken werden geeignete DNA Fragmente
in vitro auf herkömmliche
Weise ligiert. Das Ligationsgemisch wird dann in einen geeigneten
prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt in Abhängigkeit
der Art der verwendeten Regulationselemente transformiert und eine
Transformante, die den gewünschten
Vektor enthält, wie
gemäß herkömmlicher
Verfahren ausgewählt.
Die Plasmide können
durch die transformierten Wirte vermehrt und auf herkömmliche
Weise isoliert werden. Die Wahl des Wirts hängt von den auf dem Vektor
liegenden Regulationssequenzen ab. Zur Konstruktion und Vermehrung
des Vektors ist ein prokaryontischer Wirt bevorzugt, beispielsweise
E. coli.
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Ein
geeigneter Wirt zur Bildung des Fusionsproteins ist eine eukaryontische
oder prokaryontische Zelle, beispielsweise eine Säuger-, Nematoden-,
Insekten-, Hefe- oder Bakterienzelle. Der geeignete Wirt kann durch
Standardverfahren der Gentechnik transfiziert werden, beispielsweise
mit Hilfe von Viren, Lipidvesikeln, Partikelbeschuss oder Elektroporation.
Um die Menge an gebildetem Protein zu erhöhen, ist es vorteilhaft, ein Plasmid
mit einer hohen Kopienzahl zu verwenden oder dass die Plasmid DNA
in das Genom in mehreren Kopien integriert ist. Das letztere kann
beispielsweise durch Anwendung von Selektionsstress erreicht werden, beispielsweise
unter Verwendung von Methotrexat. Die transfizierten Wirtszellen
können
durch Standardverfahren in Zellkultur kultiviert werden.
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Proteine
können
auch durch synthetische Mittel anstelle der Gewinnung aus natürlichen
Quellen mittels im Handel erhältlicher
Proteinsynthesegeräte
erhalten werden oder sogar von einem kommerziellen Peptidsyntheseservice
bezogen werden. Synthetisierte Proteine können alle gewünschten
Sequenzmodifikationen umfassen, einschließlich die Verwendung von veränderten
Aminosäureresten
oder der Zugabe von heterologen Gruppen oder Seitenketten an das
Polypeptid und den Einbau von Markierungen oder Anhängen.
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Zur
Verwendung in den PAR Spaltsystemen der vorliegenden Erfindung wird
das PAR Spaltpeptid-Reportermolekül auf einem festen Träger immobilisiert.
Der feste Träger
kann beispielsweise eine Mikrotiterplatte, ein Gel, eine Matrix,
ein Kügelchen,
einer Membran oder ein Röhrchen
sein und kann aus verschiedenen Materialien hergestellt werden,
einschließlich
ohne Beschränkung
Cellulose, Agarose, Dextran, Polycarbonat, Nylon, Polyethylen, Polycarbonaten
und Glas. In einigen Ausführungsformen
kann der feste Träger
eine Membran oder Oberfläche
sein, wie sie durch ein Liposom oder eine Zelle bereitgestellt wird.
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Das
PAR Spaltpeptid-Reportermolekül
ist auf einem festen Träger
auf eine Weise immobilisiert, dass ein Reportermolekül nach der
Wirkung der Protease freigesetzt wird, falls die enzymatisch aktive
Protease in der Probe vorhanden ist. Die Immobilisierung kann auf
eine beliebige Weise erreicht werden, vorausgesetzt die PAR Spaltstelle
ist für
die Protease zugänglich.
Daher ist typischerweise ein orientierter Anhang an das PAR Spaltpeptid
erforderlich. Eine solche orientierte Anfügung kann durch verschiedene
in der Technik bekannte Verfahren erreicht werden, einschließlich spezifischer
chemischer Reaktion des terminalen Endes des Proteins an reaktive
Gruppen auf dem Träger,
der Anfügung
eines Anhangs an das terminale Ende des Proteins, das durch einen
Rezeptor gefangen werden kann, der spezifisch an den Anhang bindet
(beispielsweise können
Biotin-Strepavidin, Biotin-Avidin, Antikörper-Epitop Wechselwirkungen
als Rezeptor-Anhang-Paare verwendet werden) oder auf jede andere
Weise, die dem Fachmann bekannt ist. Obwohl das PAR Spaltpeptid sich
N-terminal oder C-terminal zum Rezeptormolekül befinden kann, trennt das
PAR Spaltpeptid typischerweise den Anhang (oder ein anderes Immobilisierungsmittel)
vom Reportermolekül,
um die Freisetzung des Reportermoleküls nach der Wirkung der Protease
zu erlauben.
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Ein
bevorzugtes Immobilisierungsmittel mittels Biotin-Streptavidinwechselwirkungen
ist später
in Beispiel 1 beschrieben. Obwohl dieses bestimmte Beispiele die
Erfindung durch den Einbau von Biotin in das Fusionsprotein erläutert, kann
jedes Einbauverfahren für
solche Anhänge
verwendet werden, mit der Maßgabe, dass
die Spaltstelle nicht maskiert oder zerstört wird. Dies ist nicht nur
zur Präsentation
der Spaltstelle an eine Protease wichtig, sondern auch, um die Trennung
des durch die Protease freigesetzten Reportermoleküls vom immobilisierten
PAR Spaltpeptid-Reportermolekül
zu erlauben. Daher ist die unspezifische chemische Quervernetzung
des PAR Spaltpeptids-Reportermoleküls an eine feste Oberfläche nicht
bei der Durchführung
der vorliegenden Erfindung angedacht.
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In
einem Aspekt der Erfindung wird das Fusionsprotein auf der Oberfläche einer
Zelle exprimiert und enthält
eine Transmembrandomäne.
Die Transmembrandomäne,
die als Teil des Fusionsproteins exprimiert wird, kann als "Anhangsimmobilisierung" des Fusionsproteins
an die Zeltoberfläche
angesehen werden. Es wird ein Reportermolekül N-terminal zum PAR Spaltpeptid
bereitgestellt, um die Freisetzung und anschließende Detektion des Reportermoleküls nach
der Proteasewirkung zu erlauben.
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Das
immobilisierte PAR Spaltpeptid-Reportermolekül wird mit einem PAR Spaltungsmolekül (oder
einer Protease) zusammengebracht. Die Protease kann eine bekannte
Protease sein, die im Handel erhältlich oder
beispielsweise in einer biologischen Probe vorhanden ist. Die Protease
kann auch in Form einer Proteinbank bereitgestellt werden und der
erfindungsgemäße Test
wird dann verwendet, um die Protease zu detektieren und zu isolieren
oder anderweitig zu identifizieren.
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Es
können
Proteaseproben beispielsweise durch Extraktion einer natürlichen
Quelle, durch Expression einer rekombinanten Nukleinsäure, die
für eine
Protease kodiert, oder durch chemische Synthese der Protease erhalten
werden. Es ist von mehreren Tumorzelllinien (beispielsweise Melanom,
Brustcarzinom und Neuroblastomzelllinien, erhältlich von der ATCC) bekannt,
dass sie bekannte und uncharakterisierte Proteasen sekretieren,
die als Quelle für
eine Protease verwendet werden können.
Zusätzlich
können
Gewebe, die bekanntermaßen
aktivierte PARs (und daher eine biologisch relevante Protease) aufweisen,
verwendet werden, wie Gehirnschnitte, Schnitte von Reproduktionsgewebe
oder Schnitte von Darmgewebe. Alternativ dazu können Körperflüssigkeiten, wie Cerebrospinalflüssigkeit,
Ascites, Serum oder Blut als Proteasequelle verwendet werden.
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Die
Protease kann aus natürlichen
Quellen durch herkömmliche
Mittel, aus Geweben oder aus kultivierten Zellen isoliert werden.
Während
der Isolierung können
zusätzliche
Additive, wie Proteinstabilisatoren, spezifische Proteinaseinhibitoren
und dergleichen, zugegeben werden. Wenn beispielsweise das Polypeptid aus
der Gewebekultur isoliert wird, besteht der erste Schritt gewöhnlich in
der Lyse der Zellen oder, falls das Polypeptid in das Medium sekretiert
wird, in der Abtrennung der Zellen aus der Kulturflüssigkeit,
typischerweise durch Zentrifugation. In Gegenwart von zusätzlichen
Proteinen und Verunreinigungen kann der entstehende Überstand
auf die Protease durch die Entfernung des meisten nicht-proteinartigen Materials
und der Fällung der
Proteine durch Sättigen
der Lösung
mit Ammoniumsulfat oder dergleichen angereichert werden. Kontaminierende
Proteine können
auch durch Ansäuerung
mit Essigsäure
und anderen herkömmlichen
Mitteln gefällt werden.
Andere Reinigungsschritte können
beispielsweise die Entfernung von Lektinen, Entsalzung, chromatographische
Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie,
Verteilungschromatographie, HPLC, Umkehrphasen HPLC und dergleichen
umfassen. Die Abtrennung der Bestandteile des Gemisches kann auch
durch Dialyse, gemäß Ladung
durch Gelelektrophorese oder Träger-freie
Elektrophorese, gemäß Molekülgröße durch
eine geeignete Sephadexsäule,
Gelpermeation oder Ultrafiltration, durch Affinitätschromatographie
oder durch andere Verfahren bewirkt werden, speziell jenen, die
aus der Literatur bekannt sind.
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Die
Reinheit der Protease kann durch jedes geeignete Verfahren gemessen
werden, beispielsweise Säulenchromatographie,
Polyacrylamidgelelektrophorese oder HPLC Analyse. Die Protease ist
im wesentlichen rein, wenn sie in einer Bande in einem Gel isoliert
werden kann.
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Alternativ
dazu können
verschiedene Banken natürlicher
Produkte auf eine Proteaseaktivität getestet werden oder tatsächlich Expressionsbanken
auf eine freigesetzte Proteaseaktivität mittels der erfindungsgemäßen Tests
gescreent werden. Beispielsweise können, obwohl einzelne Klone
getestet werden können,
zur einfacheren Handhabung Pools an Klonen aus einer Expressionsbank
in einer geeigneten Zelllinie exprimiert werden, wie einer Zelllinie,
die auch zür
Expression, Sekretion und Aktivierung der Protease fähig ist.
Durch die Anzucht der Zellen in einem geeigneten Medium (beispielsweise
Serumfreien Medium, wie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) oder
RPMI 1640 Medium, das wahlweise mit Spurenelementen und Wachstums-erhaltenden
Supplementen versetzt ist) in einem Behälter (beispielsweise Platten
mit 96 Vertiefungen), wird konditioniertes Medium gebildet (das
heißt
Medium, das aus den Zellen sekretierte Faktoren enthält), das dann
mittels der hierin beschriebenen Verfahren auf eine Proteaseaktivität getestet
werden kann. Wenn ein Pool identifiziert wird, dass er höhere Mengen
an Proteaseaktivität
bildet, können
die Zellen mit Medium verdünnt,
abgetrennt, angezogen und wie oben beschrieben getestet werden,
bis der die Protease exprimierende Klon identifiziert ist.
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Die
Proteaseprobe wird, egal ob sie als Molekülgemisch, in isolierter Form,
als Körperflüssigkeit,
Zellextrakt, konditioniertes Medium, Zellen oder als Gewebeprobe
bereitgestellt wird, mit dem immobilisierten PAR Spaltpeptid-Reportermolekül zusammengebracht,
um die Spaltung des PAR Spaltpeptids zu erlauben, wobei das Reportermolekül freigesetzt
wird. Die Freisetzung des Reportermoleküls wird dann detektiert und zeigt
das Vorkommen eines PAR Spaltmoleküls in der Probe an.
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Da
das Reportermolekül,
das an das PAR Spaltpeptid gebunden ist, mit der Detektion des freigesetzten
Reportermoleküls
wechselwirken kann, wird das freigesetzte Reportermolekül typischerweise
vor der Detektion vom PAR Spaltpeptid-Reportermolekül abgetrennt.
Dies wird leicht erreicht, wenn das PAR Spaltpeptid-Reportermolekül immobilisiert
wird, um die Freisetzung des Reportermoleküls in das umgebende Medium nach
der Inkubation mit der Proteaseprobe zu erlauben. Daher kann das
Medium nach der Spaltung durch eine Protease abgezogen werden und
das Vorkommen des freigesetzten Reporters im Medium bestimmt werden. Alternativ
dazu wird das PAR Spaltpeptid-Reportermolekül auf einem entfernbaren Träger immobilisiert,
das immobilisierte PAR Spaltpeptid-Reportermolekül wird entfernt, wobei das
Medium in einem geeigneten Gefäß zur weiteren
Analyse zurückbleibt.
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Die
Freisetzung des Reportermoleküls
kann durch die Detektion jedes messbaren Signals bestimmt werden,
wie der Veränderung
in Farbe, Fluoreszenz, Lumineszenz oder Strahlungsereignissen in
der Probe. Wenn das Reportermolekül ein Enzym ist, wird die Probe
(oder das Medium, das die Probe enthalten hat) mit einem Indikator
kombiniert. Der Indikator ist jede Spezies, die gegenüber einer
detektierbaren Veränderung (beispielsweise
einer pH Veränderung,
Farbänderung,
Fluoreszenz- oder Lumineszenzveränderung
oder ein Substrat/Enzym, das durch einen zweiten Indikator detektiert
werden kann) nach einer Einwirkung des Reporterenzyms zugänglich ist.
Eine detektierbare Veränderung
im Indikator ist eine Indikation, dass die enzymatisch aktive Protease
in der Probe vorkommt. Im Gegensatz dazu ist das Fehlen einer detektierbaren
Veränderung
im Indikator eine Indikation, dass die enzymatisch aktive Protease
nicht in der Probe vorhanden ist. Typscherweise ist die "detektierbare Veränderung" mindestens eine
zweifache Erhöhung
des Signals gegenüber
dem Hintergrund (wenn die Kontrolltests in Abwesenheit der Probe
ausgeführt
werden), vorzugsweise mindestens eine fünffache Erhöhung, vor allem mindestens
eine zehnfache Erhöhung
des Signals gegenüber einem
Kontrolltest.
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Wie
oben beschrieben sind die biologischen Spaltstellen für die PAR
Aktivierungsmittel für
PAR 1 des Menschen und der Maus (nach Arg41),
Par 2 der Maus (nach Arg38), PAR 3 der Maus
(nach Lys3 7) und
PAR 4 vom Menschen (nach Arg47) bekannt.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "biologische Spaltstelle" auf die in vivo
gespaltene Stelle, die zu einer biologischen Reaktion führt (beispielsweise
Ca2+ Einstrom, Neuritenretraktion, Phosphoinositidhydrolyse
oder Blutplättchenaggregation).
Daher kann nach einer Indentifizierung eines PAR Spaltmoleküls das PAR
Spaltmolekül
als potentieller PAR Aktivator oder potentieller PAR Inaktivator
auf der Basis identifiziert werden, wo das Proteasespaltpeptid durch
die Protease gespalten wird. PAR Spaltmoleküle, die das PAR Spaltpeptid
an einer anderen als die "biologische
Spaltstelle" spalten,
werden als potentielle PAR Inaktivatoren klassifiziert, während PAR
Spaltmoleküle,
die das PAR Spaltpeptid an der "biologischen
Spaltstelle" spalten,
als potentielle PAR Aktivatoren klassifiziert werden.
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Die
biologische Spaltstelle kann leicht bestimmt werden, wie es dem
Fachmann bekannt ist, Die späteren
Beispiele beschreiben die Verwendung von mutierten PAR Spaltpeptiden,
bei denen die biologische Spaltstelle so verändert ist, dass die Spaltung
an dieser Stelle zerstört
ist. Jede Spaltung des mutierten PAR Spaltpeptids ist daher eine
alternative Stelle zur "biologischen
Spaltstelle", was
das Vorkommen eines Inaktivators anzeigt. Alternativ dazu können der
freigesetzte Reporter-abgespaltene Polypeptidrest oder vorzugsweise
die immobilisierten gespaltenen PAR Sequenzen sequenziert werden
oder es kann ein Antikörper,
der für
die Spaltstelle spezifisch ist, verwendet werden, um zu bestimmen,
ob die Spaltung an der biologischen Spaltstelle stattfindet oder
nicht.
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Wenn
der potentielle Aktivator/Inaktivator klassifiziert ist, kann eine
weitere Analyse ausgeführt
werden, um die Klassifizierung zu bestätigen. Solche Tests sind in
der Technik bekannt und umfassen Neuritenwachstumstests, Phosphoinositidhydrolysetests,
Ca2+ Effluxtests und Blutplättchenaggregationstests.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren nach Anspruch
7 zum Screening potentieller PAR Modulatoren durch die Zusammenbringung
des immobilisierten PAR Spaltpeptids mit einem PAR Aktivator/Inaktivator
und einem potentiellen PAR Modulator und die Bestimmung der Veränderung
in der Spaltmenge an der Spaltstelle im Vergleich dazu, wenn der
PAR Modulator fehlt, bereitgestellt. PAR Modulatoren können die
Wirkung des Inaktivators hemmen, wobei sie die PAR Aktivierung erlauben
oder die Wirkung eines Inaktivators potenzieren, wobei eine PAR
Inaktivierung gefördert
wird. Im Gegensatz dazu können
PAR Modulatoren die Wirkung eines Aktivators hemmen, wobei sie die
PAR Aktivierung hemmen oder die Wirkung eines Aktivators potenzieren,
wobei sie die PAR Aktivierung weiter verbessern.
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Das
Vorkommen eines PAR Modulators wird durch eine Veränderung
in der Spaltmenge des PAR Spaltpeptids in Gegenwart des PAR Modulators
im Vergleich zur Abwesenheit dessen detektiert. Vorzugsweise unterscheidet
sich die Veränderung
der Aktivität
um 20 % zu der der Kontrollmenge, bevorzugter um 50 % zu der der
Kontrollmenge, vor allem um 90 % oder mehr zu der der Kontrollmenge.
Eine Erhöhung
der Spaltung an der biologischen Spaltstelle reflektiert das Vorkommen
eines Agonisten. Eine Zunahme der Spaltung an einer anderen Spaltstelle
als der biologischen Spaltstelle (insbesondere C-terminal zur biologischen
Spaltstelle) reflektiert auch das Vorkommen eines Antagonisten.
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Daher
ist ein Agonist ein Molekül,
das die PAR Aktivierung fördert,
wie dies durch die Spaltung an der biologischen Spaltstelle charakterisiert
ist, relativ zu den Kontrolltests in Abwesenheit des Aktivators
oder des Kandidatenagonisten. Ein Antagonist ist ein Molekül, das die
PAR Aktivierung relativ zu den Kontrolltests in Abwesenheit eines
Kandidatenantagonisten entweder durch (i) Förderung der Spaltung an einer
anderen Stelle als der biologischen Spaltung oder (ii) Hemmung der
Spaltung an der biologischen Spaltstelle (beispielsweise durch Bindung
an PAR und die Blockierung der PAR Aktivierung hierdurch oder durch
Bindung an den PAR Aktivator) verringert.
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Geeignete
Agonisten und Antagonisten können
aus denselben Quellen wie die Proteasen erhalten werden, wie dies
oben beschrieben ist. Alternativ dazu können Banken an chemischen Verbindungen,
Peptiden, Antikörpern
oder natürlichen
Produkten oder kombinatorische Chemie als Quellen verwendet werden.
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Nach
einer Identifizierung kann die Wirkung der Agonisten oder Antagonisten
durch funktionelle Tests bestätigt
werden. Zusätzlich
können
die Agonisten oder Antagonisten potentiell verwendet werden, um
einen gewünschten
pharmakologischen und/oder physiologischen Effekt zu erhalten. Die
Wirkung kann in Bezug auf die vollständige oder partielle Prävention
einer Erkrankung/eines Zustands oder eines Symptoms hiervon prophylaktisch
sein und/oder in Bezug auf eine partielle oder vollständige Heilung
einer Erkrankung/eines Zustands und/oder des schädlichen Effekts, der dieser
Erkrankung zugeordnet wird, therapeutisch sein. "Behandlung", deckt, wie es hierin verwendet wird,
jede Behandlung einer Erkrankung bei einem Säuger, insbesondere einem Menschen,
und umfasst
- (a) Prävention der Erkrankung/des
Zustands oder des Symptoms vor dem Auftreten bei einem Individuum, das
für die
Erkrankung/den Zustand oder das Symptom prädisponiert ist, das aber bisher
nicht als positiv diagnostiziert wurde,
- (b) Hemmung der Erkrankung/des Zustands oder Symptoms, das heißt Anhalten
der Entwicklung oder
- (c) Linderung der Erkrankung/des Zustands oder Symptoms, das
heißt
Veranlassung der Regression der Erkrankung/des Zustands.
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Beispielsweise
ist die PAR1 Aktivierung bei der Bereitstellung eines neuroprotektiven
Effekts beteiligt (Vaughan et al. 1995), PAR1 wird in Krebszelllinien
und Biopsien stark exprimiert, was die Beteiligung bei mitogenem
und metastatischem Verhalten von Tumorzellen nahelegt, PAR1 ist
vermutlich auch bei der Alzheimerschen Erkrankung beteiligt, die
Expression von PN-1, eines potenten Antagonisten der PAR-1 Aktivierung, ist
in reaktiven Astrozyten nach einer Ischämie und einem Schlaganfall
oder bestimmten Typen von Neurotoxin-induzierten Läsionen dauerhaft
hochreguliert (Hoffmann et al., 1992, Nitsch et al., 1993, Scotti
et al., 1994), die PAR-3 Aktivierung ist vermutlich bei der Erhöhung der
Darmmotilität
beteiligt: Dies stellt alle möglichen
Zielerkrankungen oder Zustände
bereit.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung kann der PAR Spaltungstest beim
Messen des Gehalts an Protease oder der Protease-hemmenden Aktivität in klinischen
Proben verwendet werden. Das spätere
Beispiel 7 zeigt, dass der Test ausreichend sensitiv ist, um zum
ersten Mai das Vorkommen und die Menge an Thrombinaktivität in den
CSF beim Menschen sowohl in gesunden Patienten und nach einer traumatischen Kopfverletzung
zu messen, was in der Mehrzahl der Fälle zu einem erhöhten Thrombinspiegel
führt. Ähnlich kann
CSF von Patienten oder Versuchstieren nach einer Ischämie oder
einem Schlaganfall auf die Mengen an Thrombin oder Thrombin-hemmender
Aktivität
analysiert werden. Die Menge an Protease oder Proteaseinhibitoraktivität in einer
klinischen Probe kann daher als diagnostischer und/oder prognostischer
Indikator wirken.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Kit bereitgestellt,
der zumindest eines der hierin beschriebenen Materialien umfasst,
beispielsweise ein PAR Spaltpeptid, ein PAR Fusionsprotein, wie
hierin beschrieben, wie PAR beta-Glucosidasefusionsprotein oder
die hierfür
kodierende Aminosäure
in Kombination mit Anleitungen zur Verwendung im erfindungsgemäßen Test.
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Die
folgenden Beispiele werden ausschließlich zu Erläuterungszwecken
bereitgestellt und sollen die Patentansprüche nicht beschränken.
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Beispiele
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Beispiel 1: Detektion
von PAR 1 Spaltprotease
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Dieses
Beispiel beschreibt die Herstellung eines Galactosidase-PAR1 (GPAR1)
als rekombinantes Protein, das durch Fusion einer ß-Galactosidase,
der extrazellulären
Domäne
von PAR 1, einen His6-Tag und eine Biotinakzeptordomäne zur in
vitro Biotinylierung erhalten wird. Die Spaltung des GPAR-1 Fusionsproteins, das
an Streptavidin immobilisiert ist, führt zur Freisetzung einer aktiven
löslichen ß-Galactosidase, die
ein Mittel zur Verfolgung von Proteasen darstellt, die zur Spaltung
der extrazellulären
Domäne
von PAR-1 fähig
sind. Durch die Verwendung als immobilisiertes Substrat erlaubt
das GPAR-1 Fusionsprotein zum ersten Mal die Detektion von Thrombin
im subpicomolaren Bereich.
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Stämme und Medien
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Der
E. coli Stamm SCS 110 (Stratagene, La Jolla, CA, USA) wird zur Vermehrung
der rekombinanten Plasmide verwendet. Das rekombinante GPAR-1 wird
entweder im E. coli Stamm M15 [pREP4] (Qiagen), SCS110 oder XL-1
Blue MR (Strategene) exprimiert. Die E. coli Zellen werden in 2 × YT Medium
angezogen, das mit 100 μg/ml
Ampicillin supplementiert ist (Sambrook et al. (1989) Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY). Das Medium wird ferner mit 50 μM Biotin (Tsao
et al. (1996) Gene 169, 59–64)
zur Herstellung des biotinylierten rekombinanten GPAR-1 supplementiert.
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Konstruktion des GPAR-1
Expressionsvektors
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Das
Plasmid pGPAR1 wird durch Ligation von vier Fragmenten konstruiert,
die durch PCR generiert werden:
- (i) ein Fragment,
das für ß-Galactosidase
kodiert
- (ii) ein Fragment, das für
die PAR1 Exodomäne
kodiert
- (iii) ein Fragment, das für
Affinitätsanhänge kodiert,
und
- (iv) ein Fragment, das das BirA Enzym (Biotinholoenzymsynthetase)
kodiert, die eine Biotinmodifizierung katalysiert (Barker and Campbell
(1981), J. Mol. Biol. 146, 451–467),
die alle durch Restriktionsstellen flankiert sind.
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Das
für ß-Galactosidase
kodierende DNA Fragment wird aus pSV-ß-Galactosidase (im Handel
erhältlich
von Promega) mittels 5'-CACACAGCGGCCGCGTCGACGATGAGCGAAAAATACATCGTCACCT-3' (SEQ ID Nr. 1) und
5'-CACACTTAATTAATCTAGATTTGTACAGTTTTTGACACCAGACCAACTGGTAA-3' (SEQ ID Nr. 2) als
Primer amplifiziert.
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Das
für die
PAR1 Exodomäne
kodierende Fragment wird aus pBSmThR, das die Maus PAR1 cDNA in
Bluescript (Nicloulet al. (1994) Cell Mol. Biol. 40, 421–428) enthält, mittels
5'-CACACACCATGGGGTCGACGATGAGCGTGTACAGTGGAGGTTCAGGCGGATCAAGCCAGCCAGAATCAGAGAGGA
C-3' (SEQ ID Nr.
4) und 5'-GAGAGAACTAGTGGGGCTGGTCAGATATCCGGAG-3' (SEQ ID Nr. 4) als
Primer amplifiziert.
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Das
für die
Affinitätsanhänge kodierende
DNA Fragment, das zusätzliche
Restriktionsschnittstellen enthält,
um die Subklonierung der anderen PCR Produkte zu erlauben, wird
durch PCR mittels eines synthetischen DNA Oligonukleotids erzeugt
(5'-CACACACCATGGGACTCGAGGAGGTACTAGTGGAGGTTCACACCATCATCACCACCATGCAGCGGCTCTGAACGATATTTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAGTAGTCTAGACGTCCAGGTACCAGAGAG3' (SEQ ID Nr. 5)).
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Das
BirA Fragment wird direkt aus suspendierten SCS 110 E. coli Zellen
mittels 5'-CACACATCTAGATAAGGATCCATGAAGGATAACACCGTGCCACTG-3' (SEQ ID Nr. 6) und 5'-CACACAGGTACCAAGCTTATTTTTCTGCACTACGCAGGGAT-3' (SEQ ID Nr. 7) als
Primer amplifiziert. Eine Kolonie an SCS 110 Zellen wird in 50 μl an LB Medium
suspendiert. Zwei μl
dieser Zellsuspension werden als Matrize in einer 100 μl PCR Reaktion
unter Standardbedingungen verwendet.
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Alle
PCR Reaktionen werden mit Taq DNA Polymerase, die mit 1/50 Volumina
Pwo DNA Polymerase supplementiert ist, in einer 100 μl Reaktion
gemäß den Empfehlungen
des Herstellers ausgeführt.
Alle Manipulationen mit rekombinanter DNA werden gemäß Standardverfahren
(Pepper et al. (1993) J. Cell. Biol. 122, 673–684) und gemäß den Anleitungen
der Hersteller ausgeführt.
Die DNA Sequenzen werden durch DNA Sequenzierung verifiziert.
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Kurz
gesagt wird ein Fragment der multiplen Klonierungsstelle von pBluescript
SK– (im
Handel erhältlich
von Stratagene) durch die Spaltung mit Clal und Sstll entfernt,
wonach eine Behandlung mit T4 Polymerase zur Bildung von stumpfen
Enden erfolgt und dann unter Bildung von pBS-CS ligiert. Die PCR
Produkte (Fragmente (i) bis (iv) oben) werden in die Kpnl und Sall
Schnittstellen von pBS-CS unter Bildung von pGPAR1 (1A)
schrittweise ligiert. Das entstehende rekombinante Plasmid pGPAR1
hat daher einen ersten offenen Leserahmen, der für ß-Galactosidase kodiert, C-terminal
an das Fragment der extrazellulären
Domäne
von PAR1 fusioniert ist, einen His6-Anhang
und eine Biotinakzeptordomäne
(BAD). Ein zweiter offener Leserahmen, dem eine interne Ribosomenbindungstelle
vorausgeht, wird in das Konstrukt unter Bildung der Biotinholoenzymsynthetase
(BirA Enzym) aus derselben mRNA eingefügt (Tsao et al. (1996) Gene,
169, 59–64).
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Expression und Reinigung
von GPAR1 in E. coli
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SCS
110 E. coli Zellen, die mit pGPAR1 transformiert sind, bilden blaue
Kolonien, wenn sie auf Medien ausplattiert werden, die Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid
(IPTG) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid
(X-Gal) enthalten. während
Zellen, die mit pBS-CS transformiert sind, aufgrund des zerstörten Gens des α-Komplementationsfragments
der ß-Galactosidase
weiße
Kolonien ergeben (Sambrook et al., 1989). 1 Liter des 2 × YT Mediums,
das 100 μg/ml
Ampicillin und 50 μM
Biotin enthält
(Tsao et al (1996)) wird mit rekombinanten E. coli Zellen beimpft,
auf eine OD600 von 0,7 angezogen und die
Proteinexpression wird mit 0,4 g/l IPTG induziert. Nach einer Induktion
für mindestens
16 Stunden werden die Zellen durch Zentrifugation bei 5500 Upm für 30 Minuten
bei 4°C
in einer Beckman J-6B/P Zentrifuge mit einem JS-5.2 Rotor geerntet
und in 80 ml 1 × Lysepuffer
[50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,2 mM MgCl2, 10 mM Imidazol, 30 mM ß-Mercaptoethanol] resuspendiert,
das mit 1 mg/ml Aprotinin und 1 mg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid
(PMSF) als Proteaseinhibitoren versetzt ist. Nach der French-Press
wird die Suspension durch eine Zentrifugation bei 35 000 × g für 30 Minuten
bei 4°C
in einem Sorvall SS-34 Rotor geklärt. GPAR1 wird mittels des
His6 Affinitätsanhangs mittels Ni2+-NTA Agarose (im Handel erhältlich von
Qiagen) gereinigt. Das wie oben beschrieben hergestellte Zelllysat
wird über
Nacht mit 2,5 ml Ni2+-NTA Agarose bei 4°C mit sanftem
Schütteln
inkubiert. Nach dem Packen in eine geeignete Säule (beispielsweise BioRad
Econocolumn, 1,5 × 15
cm, erhältlich
von BioRad, Hercules, CA, USA) wird die Agarose mit 100 ml 1 × Lysepuffer,
100 ml EtOH Waschpuffer [10 mM Tis/HCl, pH 8,0, 60 mM NaCl, 0,2
mM MgCl2, 10 mM Imidazol, 30 mM ß-Mercaptoethanol,
30 % Ethanol], gefolgt von weiteren 100 ml Lysepuffer ohne der Zugabe
der Proteaseinhibitoren gewaschen. Die Säule wird für 30 Minuten bei 4°C mit 5 ml
Elutionspuffer [50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 2,5 M NaCl, 0,5 M
Imidazol] inkubiert, bevor eluiertes gereinigtes GPAR1 Fusionsprotein
gewonnen wird. Das Eluat wird gegen Tris/Acetat Puffer [50 mM Tris/Acetat
pH 7,3, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2] dialysiert.
Für eine
Langzeitlagerung wird ein gleiches Volumen an 100 % Glycerin zur
gereinigten GPAR1 Präparation
gegeben und die Aliquots werden bei –80°C gelagert.
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Analyse von gereinigtem
GPAR-1
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Rekombinantes
GPAR-1 wird durch SDS-PAGE auf 7,5 % Acrylamidgelen (Laemmli (1970)
Nature 227, 680–685)
analysiert. Das GPAR1 Protein wird für 1 Stunde bei 200 V zusammen
mit geeigneten Molekulargewichtsmarkern einer Elektrophorese unterzogen
(beispielsweise Benchmark Proteinleitermolekulargewichtsmarker,
die von Life Technologies erhältlich
sind oder Proteinmolekulargewichtsmarker, die von Amersham Pharmacia
Biotech erhältlich
sind).
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Für die Immunblots
und die Detektion der Biotinmodifikation von GPAR1 werden die Proteine
nach der Elektrophorese auf eine Nitrocellulosemembran transfiziert
(Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350–4354).
Nach dem Waschen der Membran und der Blockierung der unspezifischen
Proteinbindung mit Blockierungspuffer [Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS),
1 % Triton X-100,
1 % Rinderserumalbumin (BSA)] wird eine Membran mit einem polyklonalen
Kaninchen anti-ß-Galactosidaseantikörper sondiert
(erhältlich
von 5 Prime_3 Prime, Boulder CO, USA), gefolgt von 3 Waschschritten
mit Waschpuffer [PBS, 1 % Triton X-100] und einer Inkubation mit
einem durch eine alkalische Phosphatase markierten Schwein-anti-Kaninchen Antikörper, der
1/200 in Blockierungspuffer verdünnt
ist. Die andere Membran wird mit einem Konjugat aus alkalischer
Phosphatase-Streptavidin sondiert, das 1/200 in Blockierungspuffer
verdünnt
ist. Alle Inkubationen erfolgen für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
Nach dem dreimaligen Waschen mit Waschpuffer und einmal mit alkalischem
Phosphatasepuffer [100 mM Tris/HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2), wird die Farbentwicklung mit Nitrobluetetrazolium
(NBT) 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) in alkalischem Phosphatasepuffer
[330 μg/ml
NBT, 165 μg/ml
BCIP] für
5 Minuten ausgeführt.
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Eigenschaften des gereinigten
GPAR1 Proteins
-
Gereinigtes
GPAR1 erscheint als zwei Banden auf der SDS-PAGE unter reduzierenden
Bedingungen, was vom verwendeten E. coli Stamm unabhängig ist.
Die obere Bande zeigt das erwartete Molekulargewicht von 136 kDa
und die Reaktivität
mit Streptavidin nach einem Blot auf eine Nitrocellulose membran,
was anzeigt, dass sie biotinyliert ist. Die untere Bande zeigt ein
scheinbares Molekulargewicht von 127 kDa und ist nicht biotinyliert.
Beide Banden sind für ß-Galactosidase
immunpositiv. Das Fehlen der Biotinylierung und das kleinere scheinbare
Molekulargewicht der zweiten Bande legen nahe, dass sie eine verkürzte Form
des Proteins ist, dem der C-terminale Teil fehlt. Diese Annahme
wird weiter durch die Tatsache verstärkt, dass die Entfernung des
C-terminalen Teils von GPAR1 durch Thrombinbehandlung nur das Vollängenprotein
beeinflusst, was zum Auftreten von nur einer Bande bei 127 kDa auf
der SDS-PAGE führt.
Das Verhältnis
des verkürzten zum
Volllängenprotein
wird gleichbleibend erhalten.
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Test der ß-Galactosidaseaktivität
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Es
wird die Galactosidaseaktivität
gemessen, um die Menge an GPAR-1 in einer gereinigten Probe zu messen.
Eine gereinigte GPAR1 Probe (25–75 μl) wird zu
jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben.
Nach der Zugabe der Substratlösung
[25 mM Tris/Acetat, pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,5 mM MgSO4,
2,5 mg/ml ONPG, Endkonzentration] auf ein Endvolumen von 200 μl wird die
Zunahme der OD405 bei Raumtemperatur für 5 bis
30 Minuten aufgezeichnet und als Reaktionsgeschwindigkeit dargestellt
wird. Die Menge an ß-Galactosidase,
die eine Veränderung
der optischen Dichte von 0,001 OD/min ergibt, wird als 1 Einheit
definiert. Die OD Entwicklung wird mittels eines Thermomax Mikrotiterplattenlesegeräts unter
Verwendung von SOFTmax verfolgt (Molecular Devices, Sunnyvale, CA,
USA).
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Kalibriering der ß-Galactosidasefarbreaktion
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Um
den Test zu kalibrieren und eine Beziehung zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit
und der Konzentration der ß-Galactosidase
zu etablieren werden 75 μl
einer Standardlösung,
die 35 ng/ml bis 10 mg/ml ß-Galactosidase
enthält
(erhältlich
von Roche Diagnostics, Rotkreuz, Schweiz) unter den oben erwähnten Bedingungen
gemessen und die OD405 Entwicklung wird
für 30
Minuten aufgezeichnet.
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Eine
Dosis-Antwort-Kurve mit ß-Galactosidase
zeigt, dass 1 pmol an ß-Galactosidase
zu 819 Einheiten äquivalent
ist, wie dies oben definiert ist. Eine Einheit ist somit zu einer
Konzentration von 16,3 mM ß-Galactosidase
in der Probe äquivalent.
Die Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Konzentration von ß-Galactosidase
ist bis zu 1,2 OD405/min linear, was 20
nM ß-Galactosidase
entspricht.
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Immobilisierung von GPAR1
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GPAR1
wird auf der Oberfläche
von Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Partikeln (SA-PMP's, im Handel erhältlich von
Promega, Madison, WI, USA) wie folgt immobilisiert. 25 μl SA-PMPs
in Suspension werden dreimal mit 1 ml PBS gewaschen. 250 Einheiten
an GPAR1 werden in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS zugegeben und bei Raumtemperatur
für 1 Stunde
mit konstantem Schütteln
inkubiert. Nach dem dreimaligen Waschen mit 1 ml PBS werden die
GPAR1/SA-PMPs in 100 μl
PBS resuspendiert und auf ß-Galactosidaseaktivität durch
die Zugabe von 100 μl
Substratlösung
und einer Inkubation für
2 Minuten bei Raumtemperatur getestet. Die Reaktion wird durch die
Zugabe von 50 μl
an 0,5 M EDTA, pH 8 gestoppt und der gefärbte Überstand wird von den Partikeln
abgetrennt. Das Ausmaß der
Farbreaktion wird photometrisch bei 405 nm gemessen. Etwa 95 % der
gereinigten ß-Galactosidaseaktivität, wird
auf SA-PMPs immobilisiert, während
nur etwa 20 % der gesamten ß- Galactosidaseaktivität, die vom
GPAR1 Konjugat exprimiert wird, auf den SA-PMPs immobilisiert werden
können,
vermutlich durch die Bildung einer C-terminalen Verkürzung von
GPAR1.
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Zur
Immobilisierung von GPAR1 auf Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten
mit 96 Vertiefungen (erhältlich
von Labsystems, Helsinki, Finnland), werden 125 Einheiten an GPAR1
pro Vertiefung in einem Gesamtvolumen von 100 μl PBS zugegeben und die Platten
werden bei 4°C
für 2 bis
4 Tage gelagert bis sie verwendet werden. Nach der Immobilisierung
werden 75 μl
der Lösung
wie oben beschrieben auf ß-Galactosidaseaktivität gemessen,
um die Immobilisierungseffizienz zu bestimmen. Die Immobilisierungseffizienzen
sind im Bereich von 70 bis 75 % konsistent, wobei die Immobilisierungseffizienz
nach 2 Tagen Inkubation bei 4°C
am höchsten
ist.
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Humanthrombin
wird vorher präpariert
und durch Stone und Hofsteenge (1986, Biochemistry 25, 4622–4628) charakterisiert.
Mikrotiterplatten mit immobilisiertem GPAR1 werden dann schnell
dreimal mit PBS gewaschen, um das ungebundene GPAR1 Protein zu entfernen.
Proteaseproben (dreifach) werden unmittelbar in 100 μl Enzympuffer
[50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 % PEG 6000, 0,02 Tween
20] zugegeben. Beispielsweise wird Thrombin zum immobilisierten
GPAR1 in Konzentrationen zugegeben, die von 50 fM bis 10 pM in 100 μl Enzympuffer
reichen. Um sicherzustellen, dass die Thrombinaktivität gemessen
wird, werden identische Kontrollproben mitaufgenommen, die keine
Zugabe von 5 pM Hirudin oder 5 pM PN-1 erhalten.
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Die
Mikrotiterplatten werden bei 37°C
für 3 Stunden
in einer feuchten Atmosphäre
inkubiert, um die Proteasespaltung von GPAR1 zu erlauben, was zu
einer Freisetzung der ß-Galactosidase
in das Medium führt. Das
Probenmedium (75 μl)
wird dann in eine frische Platte überführt und auf ß-Galactosidaseaktivität getestet, wie
dies oben beschrieben ist, indem man die optische Veränderung
für 15
Minuten bei 405 nm misst. Die Daten werden als Picomol ß-Galactosidasefreisetzung
gegen die Proteasekonzentration und Zeit in Minuten ausgedrückt. Die
Empfindlichkeit der immobilisierten GPAR1 gegenüber der Spaltung durch verschiedene
Proteasen wird durch die Berechnung der anfänglichen Steigungen evaluiert,
die aus den Dosis-Antwortkurven erhalten werden, die für jede Protease
ausgeführt
werden.
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Unter
diesen Bedingungen sind 50 fM Thrombin mit einem linearen Bereich
bis zu 250 fM detektierbar. Der Test ist über 0,5 bis 1 pM gesättigt. Die
anfängliche
Steigung, wie sie aus den Werten innerhalb der ersten linearen Phase
berechnet wird, zeigt, dass unter diesen Testbedingungen 2,6 Mol ß-Galactosidase pro
Minute pro Mol Thrombin freigesetzt werden. In Gegenwart von rekombinantem
Hirudin oder Rattenproteasenexin-1 (Markwardt (1957) Hoppe Seylers
Z. Physiol. Chem. 308, 147–156,
Baker et al. (1980), Cell 21, 37–45, PN-1, Sommer et al. (1989)
Gene 85, 453–459),
die beide starke Thrombininhibitoren sind wird das Signal des GPAR1
Tests fast vollständig
aufgehoben, was die starke Abhängigkeit
von der proteolytischen Aktivität
von Thrombin zeigt.
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Um
als Kontrolle sicherzustellen, dass die unterschiedlichen Proteaseproben
nicht die ß-Galactosidaseaktivität beeinflussen
(beispielsweise durch die Zerstörung
der Enzymaktivität)
werden 90 Einheiten GPAR1 pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte
mit 96 Vertiefungen ohne Streptavidinbeschichtung mit 100 μl Enzympuffer inkubiert,
die die Proteasen in verschiedenen Konzentrationen enthalten. Die
Kontrollproben werden auf ß-Galactosidaseaktivität auf dieselbe
Weise getestet, wie die Proben, die mittels der Streptavidin-beschichteten Mikkotiterplatten
getestet werden.
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Zusammengefasst
ist der Test auf PAR Spaltmoleküle
mittels des Fusionsproteins GPAR1 ausgesprochen sensitiv und erlaubt
die Detektion von Thrombin bei Konzentrationen bis zu 50 fM, zumindest
zehnfach sensitiver als die vorher verwendeten Verfahren, die auf
dem spezifischen chromogenen Substrat S2238 beruhen (Chromogenix,
Mölndal,
Schweden).
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Beispiel 2: Spezifität des GPAR1
Tests und die Identifizierung der PAR1 Aktivatoren und Inaktivatoren
-
Um
zu zeigen, dass die Thrombinspaltung an der erwarteten Spaltstelle
stattfindet, wird eine mutierte Form von GPAR1 erzeugt, worin eine
R45S Mutation die Spaltung durch Trypsin-ähnliche
Serinproteasen verhindert. Die Expressionsvektoren für das mutierte
GPAR1 werden durch das Ausschneiden des PAR1 Fragments aus pGPAR1
(siehe Beispiel 1) und den Ersatz mit einem mutierten für PAR1 kodierenden
DNA Fragment erzeugt. Das mutierte PAR1 Konstrukt trägt eine
Punktmutation am Codon für
den ersten Aminosäurerest der
Aktivierungsstelle, was zu einem Einbau eines Serins anstelle eines
Arginins führt,
was diese Stelle gegenüber
einer Spaltung durch Trypsin-ähnliche
Serinproteasen einschließlich
Thrombin resistent macht. Das mutierte für PAR1 kodierende Fragment
wird aus pBSmThR mittels 5'-CTCATGTACAGTGGAGGTTCAGGAGGCTCGAGCCAGCCAGAATCAGAGAGGACAGATGCTACGGTGAACCCCAGCTCATTCTTTCTAAGGAATC-3' (SEQ ID Nr. 8) und
5'-GAGAGAACTAGTGGGGCTGGTCAGATATCCGGAG-3' (SEQ ID Nr. 4) als
Primer hergestellt. Der Austausch des Arg45 Rests
gegen Serin ergibt das an der Aktivierungsstelle mutierte Fusionsprotein
GPAR1R45S.
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Die
Proteasetests werden wie in Beispiel 1 beschrieben ausgeführt, außer dass
sowohl GPAR1 als auch das mutierte GPAR (GPAR1R45S)
zur vergleichenden Analyse verwendet werden. Die Inkubation von
humanem Thrombin (Stone und Hofsteenge, 1986) mit immobilisierten
GPAR1R45S führt zu einer dramatischen Reduktion
der detektierten Signalmutante, was zeigt, dass Thrombin tatsächlich GPAR1
vorwiegend nach Arg45 spaltet. Es wird mehr
als 30 000 fach mehr Thrombin benötigt, um eine Reaktion mit
GPAR1R45S auszulösen. Die anfängliche
Geschwindigkeit für
die Thrombinreaktion verringert sich von 2,6 molß-Galactosidase/(molThrombin × min) auf etwa 70 nmolß-Galactosidase/(molThrombin × min) (Tabelle 1). Dieses
Signal kommt nicht durch eine kontaminierende Aktivität in der
Thrombinpräparation
zustande, da es in Gegenwart von Hirudin fehlt, einem spezifischen
Thrombininhibitor. Die geringere Spaltgeschwindigkeit von GPAR1R45S legt das Vorkommen einer zweiten Spaltstelle
für Thrombin
in Maus PAR1 nahe, das mit einer geringeren Effizienz gespalten
wird. Humanes PAR1 enthält
bekanntermaßen
eine zweite Thrombinspaltstelle, die 5 Reste C-terminal der Aktivierungsstelle
liegt (Vu et al. (1991), Parry et al (1996)).
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Proteaseprofil von GPAR1
und GPAR1R45S
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Nach
der Demonstration, dass der GPAR1 Test die Fähigkeit von Thrombin reflektiert,
PAR1 zu spalten und zu aktivieren, wird der Effekt von anderen Proteasen
auf GPAR1 und des GPAR1R45S mit mutierter
Aktivierungsstelle evaluiert. Die folgenden zusätzlichen Proteasen werden im
wesentlichen wie oben beschrieben getestet: Rinderchymotrypsin vom
Typ II (Sigma, St. Louis, MO, USA), aktiviertes Protein C vom Rind
(ICN, Costa Mesa, CA, USA), Humanplasmin, humane Urokinase mit hohem
Molekulargewicht und Rindertrypsin (alle erhältlich von Fluka, Buchs, Schweiz),
Elastase von humanen Leukozyten (Merck Darmstadt, Deutschland) und
humanes Einzelketten t-PA (Calbiochem La Jolla, CA, USA).
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In
den Fällen
von Trypsin und Plasmin ist das maximale Signal sogar höher als
das für
Thrombin. Mit GPAR1R45S als Substrat werden
die Dosis-Antwortkurven für
Trypsin und Plasmin im Vergleich zu GPAR1 leicht nach rechts verschoben
und die anfänglichen
Geschwindigkeiten nehmen ab (Tabelle 1), was zeigt, dass die Spaltung
an der PAR1 Aktivierungsstelle durch diese Proteasen bevorzugt wird.
Daher sind Trypsin und Plasmin klar detektierbar und ihre Effizienz
ist gegenüber
einer Mutation der Aktivierungsstelle empfindlich (Tabelle 1), was
ihre Fähigkeit
zur Aktivierung von PAR1 bestätigt
(Ishihara et al. (1997), Vu et al. (1991), Parry et al. (1996)).
Keine der getesteten Proteasen stellt sich als so stark wie Thrombin
heraus.
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Chymotrypsin
und Elastase, Proteasen mit einem Vorzug für die Spaltung nach hydrophoben
Resten, zeigen keine Bevorzugung für die Spaltung von GPAR1 gegenüber GPAR1R45S und können daher als potentielle
Inaktivatoren von PAR1 klassifiziert werden. Chymotrypsin und Elastase
sind sogar effektiver, wenn sie mit immobilisiertem GPAR1R45S inkubiert werden (Tabelle 1).
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Die
zwei getesteten Plasminogenaktivatoren sind jeweils unfähig zur
Spaltung von GPAR1 mit beträchtlichen
Geschwindigkeiten und scheinen so nicht bei der PAR1 Signalbildung
oder Regulation beteiligt zu sein (Tabelle 1). Nur bei der höchsten gestesteten
Urokinasekonzentration wird ein marginales Signal erhalten.
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Sowohl
Thrombin als auch aktiviertes Protein C sind Aktivatoren von PAR1
(Parry et al. (1996)). Von aktiviertem Protein C wurde im vorliegenden
Test gezeigt, dass es nur GPAR1 spaltet und gegenüber immobilisiertem
GPARR45S fast inaktiv ist. Die Aktivität von aktiviertem
Protein C ist etwa 1000 fach geringer im Vergleich zu Thrombin.
Um zu testen, ob die von aktiviertem Protein C resultierende Aktivität von einer
Kontamination der Präparation
mit Thrombin herrührt,
wird aktiviertes Protein C mit immobilisiertem GPAR1 in Gegenwart
von Hirudin getestet. In Gegenwart von Hirudin wird das Signal,
das von aktiviertem Protein C resultiert, vollständig aufgehoben (Tabelle 1)
und beruht so höchstwahrscheinlich
auf einer Thrombinkontamination der Präparation (Tabelle 1) (Parry
et al. (1996)).
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Bei
höheren
Konzentrationen spalten Trypsin, Plasmin, Elastase und Chymotrypsin
GPAR1 und GPAR1R45S nicht nur in der PAR1
Domäne,
sondern auch in der ß-Galactosidasedomäne, was
eine Abnahme des Signals sogar unter das Hintergrundsignal verursacht.
Jedoch können
diese Proteasen erfolgreich in einem geringeren Konzentrationsbereich
gemessen werden, was die breite Anwendung dieser Tests zeigt.
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Um
zu evaluieren, bei welchen Konzentrationen die unterschiedlichen
Proteasen den Test durch die Zerstörung der ß-Galactosidaseaktivität beeinflussen
können,
wird GPAR1 mit diesen Proteasen ohne vorherige Immobilisierung inkubiert
und die verbleibende ß-Galactosidaseaktivität wird wie
oben in Beispiel 1 beschrieben gemessen. Keine der untersuchten
Proteasen verursacht eine Verringerung in der ß-Galactosidaseaktivität in Konzentrationen
unter 100 pM. Die anfänglichen
Steigungen der Dosis-Antwortkurven,
die unter dieser kritischen Konzentration erzeugt wurden, zeigen,
dass die Zerstörung
der ß-Galactosidase
nicht zu den Daten beiträgt,
die in diesem Testformat erhalten werden.
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Daher
ist in der Zusammenfassung der Test zur Detektion einer spezifischen
Thrombinspaltstelle brauchbar. Der Test ist auch ausreichend empfindlich
zur Detektion von anderen Proteasen als Thrombin und an anderen
Spaltstellen als der Thrombinspaltstelle, wobei er die Detektion
und Identifizieurng von potentiellen PAR1 Aktivatoren und Inaktivatoren
erlaubt. Falls die Thrombinaktivität spezifisch in einem Gemisch
aus Proteasen detektiert werden muss, kann Thrombin als die Aktivität gemessen
werden, die spezifisch durch Hirudin gehemmt wird.
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Beispiel 3: Identifizierung
von PAR-2 Aktivatoren und Inaktivatoren
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Dieses
Beispiel beschreibt die Herstellung eines Galactosidase-PAR2 (GPAR2)
Fusionsproteins und dessen Verwendung in den Tests, die zur Detektion
von PAR2 Aktivatoren und Inaktivatoren angelegt sind.
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Die
Expressionsvektoren für
GPAR-2 oder GPAR-2R34S werden durch Ausschneiden
des PAR1 Fragments aus pGPAR1 mit Xhol und Spüel (siehe Beispiel 1) und den
Ersatz des ausgeschnittenen Fragments mit einem DNA Fragment hergestellt,
das für
die extrazelluläre
Domäne
des Maus PAR-2 oder dessen Aktivierungsstellenmutante kodiert. Die
für die
Exodomäne
des Maus PAR2 kodierende Sequenz wird durch PCR mittels der synthetischen
DNA Oligonukleotide 5'-CACACATGTACAGTGGAGGTTCAGGCGGCTCGAGCGAGAACCTTGCACCGGGACGCAACAACAGTAAAGGAAGAAGTCTTATTGGCAGATTAGAAACCCAGCCTCCAATCACTG-3' (SEQ ID Nr. 9) und
5'-CACACAACTAGTGACCGTGGTCAGCTTCCCGGTGAGGATGGACGCAGAGAACTCATCGATGGAAAAGCCTGGTTCTACCGGAACCCCTTTCCCAGTGATTGGAGGCTGGGTT-3' (SEQ ID Nr. 10)
als Matrizen hergestellt. Die PAR2 Mutante an der Aktivierungsstelle
wird auf dieselbe Weise hergestellt, aber anstelle des Oligonukleotids
der SEQ ID Nr. 9 wird ein ähnliches Oligonukleotid
verwendet, worin das unterstrichene AGA durch AGC ersetzt ist. Die
Annelierung der geeigneten zwei Oligonukleotide, die an ihren 3'-Enden komplementär sind,
ergibt eine partiell doppelsträngige
Matrize, die in einer PCR Reaktion verwendet wird. Alle anderen
Techniken werden ausgeführt,
wie dies oben in Beispiel 1 beschrieben ist. Die DNA Sequenz des
entstehenden Klons wird durch DNA Sequenzierung verifiziert.
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GPAR2
wird im E. coli Stamm SCS110 (Stratagene, La Jolla, CA, USA) oder
M15 [pREP4] (Qiagen) exprimiert. Wie bei GPAR1 ist auch ein verkürztes GPAR2
in der gereinigten Fraktion von GPAR2 vorhanden. Das Verhältnis der
verkürzten
Proteine zu den Vollängenproteinen
stimmt auch mit dem überein,
das mit GPAR1 erhalten wurde, wie auch die Immobilisierungseffizienz
zur Durchführung
des Tests. Bei den in Beispiel 2 beschriebenen Spaltungstests aber
unter Verwendung von immobilisierten GPAR2 und GPAR2R34S Fusionsproteinen
wird gezeigt, dass GPAR2 das bevorzugte Substrat für Trypsin
bei einer Anfangsgeschwindigkeit von 370 mmolß-Galactosidase/(molTrypsin × min)
(Tabelle 1) ist. Im Vergleich dazu wird eine anfängliche Geschwindigkeit von
97 mmolß-Galactosidase/(molTrypsin × min)
für GPAR1
(Tabelle 1) detektiert. Man benötigt
etwa neunfach mehr Trypsin, um das an der Aktivierungsstelle mutierte
GPAR2R34S zu spalten. Plasmin spaltet GPAR2
zweifach effizienter als GPAR2R34S, aber
nur mit einer 560 fach geringeren Geschwindigkeit als Trypsin (Tabelle
1). Chymortrypsin und Ealstase zeigen eine geringe Präferenz für Wildtyp
GPAR2 gegenüber
GPAR2R34S. Chymotrypsin und Elastase spalten
GPAR2 mit einer geringeren Geschwindigkeit als GPAR1. Man erhält kein
Signal mit aktiviertem Protein C, den getesteten Plasminogenaktivatoren
oder Thrombin (Tabelle 1).
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Beispiel 4: Identifizierung
von PAR-3 Aktivatoren und Inaktivatoren
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Dieses
Beispiel beschreibt die Herstellung von Galactosidase-PAR3 (GPAR3)
und dessen Verwendung in Tests, die zur Detektion von PAR3 Aktivatoren
und Inaktivatoren entworfen werden.
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Die
Expressionsvektoren für
GPAR-3 oder GPAR3K3 7S werden
durch Ausschneiden des PAR1 Fragments aus pGPAR1 mit Xhol und Spel
(siehe Beispiel 3) und den Ersatz des ausgeschnittenen Fragments durch
ein DNA Fragment hergestellt, das für die extrazelluläre Domäne von PAR-3
der Maus oder die Aktivierungsstellenmutante kodiert. Die für die PAR3
Exodomäne
der Maus kodierende Sequenz wird durch PCR mittels folgender synthetischer
DNA Oligonukleotide als Matrize hergestellt: 5'TGTACAGTGGAGGTTCAGGCGGCTCGAGCGGCATAAATGTTTCAGACAACTCAGCAAAGCCAACCTTAACTATTAAGAGTTTTAATGGGGGTCCCCAAAATACCTTTGAAGAATTCCCACTTTCTGACATAGAGG-3' (SEQ ID Nr. 11) und
5'-ACTAGTACTTAAGGAACTTCTCAGGTATCCTATGGTAGCATTATTCACGTGGAGAGTTGAAATACTGTCCTCGGGACACTCCGCTTTTATAGTTGTGGTGGCTCCTGTCCAGCCC
TCTATGTCAGAAAGTGGGA-3' (SEQ
ID Nr. 12). Die PAR3 Aktivierungsstellenmutante wird auf dieselbe
Weise hergestellt, aber anstelle des Oligonukleotids SEQ ID Nr.
11 wird ein ähnliches
Oligonukleotid verwendet, worin das unterstrichene AAG durch TCG
ersetzt ist. Alle anderen Techniken werden wie in Beispiel 3 beschrieben
hergestellt. Wie bei GPAR1 und GPAR2 ist ebenfalls ein verkürztes GPAR3
in der gereinigten Fraktion von GPAR3 vorhanden. Das Verhältnis der
verkürzten
Proteine zu den Volllängenproteinen
ist zu dem konsistent, das mit GPAR1 erhalten wird, wie auch die
Immobilsierungseffizienz zur Durchführung des Tests.
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Die
Spaltungstests werden wie in Beispiel 3 aber unter Verwendung von
immobilisierten GPAR3 und GPAR3K3 7S Fusionsproteinen ausgeführt. PAR3
ist der Hauptthrombinrezeptor in Mausblutplättchen (Ishihara et al. (1997),
Kahn et al. (1998) Nature 394, 690–694) und dementsprechend wird
auch das immobilisierte GPAR3 Fusionsprotein effizient durch Thrombin
(Tabelle 1) gespalten. Jedoch ist die anfängliche Geschwindigkeit von
41 mmolß-Galactosidase/(molThrombin × min) etwa sechsfach geringer
als die für
GPAR1. Die Aktivierungsstellenmutante GPAR3K37S zeigt
eine Geschwindigkeit für
die ß-Galactosidasefreisetzung
durch Thrombin von 3,4 mmolß-Galactosidase/(molThrombin × min) und zeigt so das Vorkommen
einer zweiten möglichen
Thrombinspaltstelle, die mit einer höheren Geschwindigkeit gespalten
wird, als die zweite Thrombinspaltstelle in PAR1 (Tabelle 1). Wenn
Trypsin mit GPAR3 oder GPAR3K37S inkubiert
wird, beobachtet man nur eine geringe Präferenz für die Spaltung von GPAR3 (Tabelle
1). Ein stärkerer
Effekt der Mutation in der Aktivierungsstelle von GPAR3 wird mit
Plasmin beobachtet, das etwa 120-fach weniger aktiv als Thrombin
ist (Tabelle 1). Der Gewebeplasminogenaktivator zeigt nur ein sehr
schwaches Signal mit GPAR3, das verringert wird, wenn GPAR3K37S verwendet wird und somit eine bevorzugte
Spaltung an der K37-S38 Bindung nahelegt (Tabelle 1). Die Werte
für uPA
sind zu gering, um einen ähnlichen
Unterschied zu detektieren (Tabelle 1). Es gibt keine Präferenz für GPAR3
für Chymotrypsin
oder Elastase (Tabelle 1). Aktiviertes Protein C spaltet weder GPAR3
noch GPAR3K37S in einem nennenswerten Ausmaß in Gegenwart
von Hirudin (Tabelle 1).
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Beispiel 5: Identifizierung
von PAR-4 Aktivatoren und Inaktivatoren
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Dieses
Beispiel beschreibt die Herstellung eines Galactosidase-PAR4 (GPAR4)
Fusionsproteins und dessen Verwendung in Tests, die zur Detektion
von PAR4 Aktivatoren und Inaktivatoren ausgelegt sind.
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Die
Expressionsvektoren für
GPAR-4 oder GPAR3K37S werden durch das Ausschneiden
des PAR1 Fragments aus pGPAR1 mit Xhol und Spel (siehe Beispiel
3) und den Ersatz des ausgeschnittenen Fragments durch ein DNA Fragment
hergestellt, das das Fragment für
die extrazelluläre
humane PAR-4 Domäne
oder die Aktivierungsstellenmutante kodiert. Die für das humane
PAR4 Exodomänenfragment
kodierende Sequenz wird durch PCR mittels der synthetischen DNA
Oligonukleotide 5'CACACACTCGAGCGGCGGCACCCAGACGCCCAGCGTCTACGAGGAGAGCGGGAGCACCGGAGGTGGTGATGACAGCACGCCCTCAATCCTGCCTGCCCCCCGCGGCTACCCAGGC-3' (SEQ ID Nr. 13)
und 5'-TGTGTGACTAGTCCTGGTGGGCACCCAGCCCAGAAGCAGTGCCCGTGAGCTGTCCGGAAGCTCCAGGGTGTCACTGTCATTGGCACAGACTTGGCCTGGGTAGCCGCGGGGGG-3' (SEQ ID Nr. 14)
als Matrizen hergestellt. Die PAR4 Aktivierungsstellenmutante wird
synthetisch hergestellt und ist zum PAR4 Exodomänenfragment ähnlich,
aber das in SEQ ID Nr. 13 unterstrichene CGC wird durch AGC ersetzt.
Alle anderen Techniken werden wie in Beispiel 3 beschrieben ausgeführt. Wie
bei GPAR1, GPAR2 und GPAR3 ist auch ein verkürztes GPAR4 in der gereinigten
Fraktion von GPAR4 vorhanden. Das Verhältnis von verkürzten Proteinen zu
Vollängenproteinen
stimmt mit dem überein,
das mit GPAR1 erhalten wird.
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Proteaseprofil für GPAR4
und GPSR4R47S
-
GPAR4
und GPAR4R47S werden auch mit demselben
Satz an Proteasen unter denselben Bedingungen wie für die anderen
GPARs getestet. GPAR4 wird effizient durch Trypsin mit einer Geschwindigkeit
von 15 mmolß-Galactosidase/(molTrypsin × min)
(Tabelle 1) gespalten. Im Vergleich zu den höchsten Spaltungsgeschwindigkeiten,
die mit GPAR1, GPAR2 und GPAR3 beobachtet werden, ist die Spaltungsgeschwindigkeit
von GPAR4 mindestens eine Größenordnung
geringer (Tabelle 1). Thrombin, das ein bekannter Aktivator von
PAR4 ist (Kahn et al. (1998), Xu et al. (1998)) spaltet GPAR4 mit
einer Geschwindigkeit von 4,3 mmolß-Galactosidase/(molThrombin × min), was immer noch drei
Größenordnungen
geringer ist als mit GPAR1 (Tabelle 1). Jedoch sind sowohl Trypsin
als auch Thrombin deutlich weniger effektiv, wenn sie mit GPAR4R47S inkubiert werden, wobei Thrombin ein
höheres
Maß an
Spezifität
zeigt (Tabelle 1). Plasmin spaltet sowohl GPAR4 und GPAR4R47S mit geringer Effizienz, zeigt aber auch
eine Präferenz
für eine
Spaltung an der Aktivierungsstelle von PAR4. Chymotrypsin und Elastase
spalten beide Substrate ohne Präferenz
für das
Wildtypsubstrat. Beide Plasminogenaktivatoren wie auch aktiviertes
Protein C spalten GPAR4 oder GPAR4R47S nicht
mit beträchtlichen
Geschwindigkeiten (Tabelle 1). Im Vergleich zu GPAR1 spalten alle
getesteten Proteasen GPAR4 und GPAR4R47S mit
viel geringeren Geschwindigkeiten (Tabelle 1).
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Beispiel 6: Vergleichende
Analyse von PAR Aktivatoren und Inaktivatoren
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In
diesem Beispiel erlaubt die Verwendung von extrazellulären PAR
Domänen
des Wildtyps und der Mutante die Analyse der proteolytischen Regulation
von unterschiedlichen Vertretern der PAR Familie und liefert auch
eine neues und hochempfindliches Werkzeug, um bisher unbekannte
PAR Spaltungsproteasen zu identifizieren.
-
Eine
vergleichende Analyse für
eine proteolytische Spaltung von PAR1, PAR2 und PAR 3 der Maus und
PAR4 vom Menschen wird unter Beteiligung der mutierten und nicht
mutierten GPAR Fusionsproteine durchgeführt. Die Tests werden im wesentlichen
ausgeführt,
wie es oben beschrieben ist, aber mit der Zugabe von verschiedenen
Proteasen.
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Thrombin
-
Thrombin
spaltet GPAR1 (2,6 molß-Galactosidase/(molThrombin min), GPAR3 (410 mmolß-Galactosidase/(molThrombin min) und GPAR 4 (4,3 mmolß-Galactosidase/(molThrombin × min), insbesondere an der
proteolytischen Aktivierungsstelle, das heißt die Spaltung wird durch
die Mutation der Aktivierungsstelle (Tabelle 1) gestört. Im Gegensatz
dazu kann keine Spaltung von GPAR2 beobachtet werden (Tabelle 1).
-
Trypsin
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Trypsin
spaltet alle Rezeptorfusionsproteine mit einer geringen Spezifität an der
Aktivierungsstelle mit Ausnahme einer deutlichen Präferenz von
Trypsin für
die Spaltung an der Aktivierungsstelle von GPAR2 (Tabelle 1). Die
mutierten Formen werden weniger effizient gespalten, was das Protential
von Trypsin anzeigt, alle PARs zu aktivieren. Während 6 potentielle Spaltstellen
für Trypsin
in der Exodomäne
von PAR2 gefunden werden, führt
die Mutation der Aktivierungsstelle zu einer neunfachen Reduktion
in der Effizienz der Trypsinspaltung von GPAR2. Die Mutation der
Aktivierungsstelle der anderen GPAR Fusionsproteine führt nicht
zu einer so starken Verringerung der Spaltung durch Trypsin, was
deutlich zeigt, dass PAR2 für
die Spaltung durch Trypsin an dieser Stelle optimiert ist (Tabelle
1).
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Aktiviertes Protein C
und Plasminogenaktivatoren
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Weder
aktiviertes Protein C (in Gegenwart von Hirudin) noch die Plasminogenaktivatoren
spalten eines der GPAR Fusionsproteine mit beträchtlichen Geschwindigkeiten.
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Plasmin
-
Plasmin,
die fibrinolytische Protease, die aus Plasminogen durch die Wirkung
der Plasminogenaktivatoren erzeugt wird, spaltet alle nicht mutierten
GPAR Proteine mi einer Geschwindigkeit, die immer noch durch die
Mutation der Aktivierungsstelle beeinflusst wird, aber mindestens
zehnfach geringer im Vergleich zu Trypsin (Tabelle 1). Die schwache
Effizienz mit der Plasmin zur Spaltung der Thrombinsensitiven PARs
fähig ist, erlaubt
es möglicherweise,
eine Rolle bei der Modulation von PAR1 vermittelten Reaktionen in
Blutplättchen zu
spielen, die keine aktivierten PARs durch die Synthese und den Membraneinbau
von neuen Rezeptormolekülen
ersetzen können
(Molino et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 6011–6017). Die schwache Fähigkeit
von Plasmin, GPAR2 an der Aktivierungsstelle zu spalten, steht im
Gegensatz zu den Befunden von Fox et al., die mittels eines Peptidylchlormethaninhibitors
auf der Grundlage der vier Reste stromaufwärts der Aktivierungsstelle
von PAR2 festgestellt haben, dass sowohl Thrombin als auch Plasmin
keine Aktivatoren von PAR2 sein dürften (Fox et al. (1997) FEBS
Lett 417, 267–269).
Jedoch kann dieser Test nur die durch die vier Reste stromaufwärts der
Aktivierungsstelle vermittelten Wechselwirkungen detektieren, während die
vorliegende Bestimmung zusätzliche
N-terminale Sequenzen
der extrazellulären
PAR2 Domäne
verwendet, ein biologisch relevanteres Substrat.
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Chymotrypsin und Elastase
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Es
wurde auch die Spaltung der GPAR Fusionsproteine durch Elastase
und Chymotrypsin untersucht, zwei Proteasen, die eine Präferenz für eine Spaltung
nach hydrophoben Resten besitzen. GPAR1 wird gut durch beide Enzyme
gespalten und die Mutante GPAR1R45S wird
mit einer noch größeren Effizienz
gespalten, was deutlich zeigt, dass beide Proteasen andere Stellen
als die Aktivierungsstelle erkennen und spalten (Tabelle 1). Die
erhöhte
Spaltung von GPAR1R45S kann durch die Einführung einer
zusätzlichen
Spaltstelle bei der Erzeugung der R45S Mutation
erklärt
werden. Im fall von GPAR2 und GPAR2R34S gibt
die Elastase ein etwa fünffach
geringeres Signal als mit GPAR1 und noch geringer für die mutierte
Form (Tabelle 1). Chymotrypsin spaltet auch GPAR2 besser als die
Mutante: Das Signal ist etwa zehnfach geringer als mit GPAR1 und ähnlich zu dem
mit GPAR3 und GPAR4 und ihrer Mutanten (Tabelle 1). Die Signale
für Elastase
und Chymotrypsin variieren unter oder um die 10mmolß-Galactosidase/(molProtease × min) und unter oder um die
100 mmolß-Galactosidase/(molProtease × min) (Tabelle 1). Die geringeren
Spaltungsgeschwindigkeiten reflektieren möglicherweise die Spaltung außerhalb
der PAR-Domänen. Während die
Inaktivierung von PAR2 durch Elastase nicht ausgeschlossen werden
kann, zeigen die vorliegenden Daten, dass PAR4 kein Substrat für dieses
Enzym ist. Chymotrypsin spaltet GPAR1 mit einer Geschwindigkeit
von 58 mmolß-Galactosidase/(molThrombin × min), was eine chymotryptische
Inaktivierung von PAR1 nahelegt.
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Beispiel 7: Messung von
aktivem Thrombin in der cerebrospinalen Flüssigkeit von Patienten nach
schwerem Kopftrauma
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Die
cerebrospinale Flüssigkeit
(CSF) ist eine Flüssigkeit,
die Neuronen und Gliazellen im Nervensystem umgibt. Sie ist vom
Blutsystem durch die Blut-Hirn-Schranke getrennt und die Solutzusammensetzung wird
gut kontrolliert und aufrechterhalten, um eine normale neuronale
Funktion zu erlauben. Kopfverletzungen können zu einer temporären Zerstörung der
Blut-Hirn-Schranke führen
und so zum Einstrom von Blutkomponenten, einschließlich Thrombin,
in das Gehirn.
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Von
Thrombin wurde beschrieben, dass es sowohl das Überleben der Zellen als auch
den Zelltod von Neuronen und Astrocyten nach einem Glucosemangel
oder einem oxidativem Stress beeinflusst (Smith-Swintosky et al,
1995, Vaughan et al. 1995, Pike et al. 1996). Die Thrombinzugabe
zu kultivierten Neuroblastomzellen oder Neuronen ruft einen sehr
schnellen Rückzug
von Neuriten hervor (Gurwitz und Cunningham, 1988, Grand et al.,
1989, Baird und Raper, 1995). Diese Thrombineffekte finden in picomolaren
Konzentrationen statt (Gurwitz und Cunningham, 1988).
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In
einer vorherigen Studie mittels des pNA-Substrats S2238 findet sich
kein aktives Thrombin in der CSF (Sminova et al, 1997). Jedoch ist
es mittels des Tests der vorliegenden Erfindung möglich, Thrombin
in subpicomolaren Mengen zu messen und es wurden erfolgreich Thrombinmengen
in der CSF gemessen.
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Proben
von humanen cerebrospinalen Flüssigkeiten
(CSFs) werden vom Kantonspital, Basel erhalten. Die Proben werden
aus Patienten mit schwerem Kopftrauma, einem Patienten mit einer
subarachnoiden Hämorrhagie
und diagnostiziertem Hirntod und einem gesunden Patienten erhalten.
Die Proben werden zwischen 3 Stunden und 17 Tagen nach der Verletzung
erhalten und zum Vergleich wird auch eine Blutprobe von einem Patienten
bereitgestellt.
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Messung des
Blutgehalts
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Die
Menge an kontaminierendem Blut wird durch Messen der OD405 von
verschiedenen Verdünnungen der
Proben vor dem Start des GPAR Tests bestimmt. Die Steigungen der
Kurven der OD405 gegen die reziproke Verdünnung werden
bestimmt und verglichen. Der Wert für die Blutprobe wird als 100
definiert, wobei der Wert für
die Kontroll-CSF vom gesunden Patienten als 0 % definiert wird.
Es wird eine lineare Beziehung zwischen Blutgehalt und OD405 Werten angenommen.
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Messung der
Thrombinkonzentration
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CSF
Proben werden seriell in Enzympuffer 1 × EB
[50
mM Tris/HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 PEG 6000, 0,02 % Tween 20]
verdünnt,
wobei die Verdünnungen
von 1:2 bis 1:30 000 reichen. Nach dem Messen des Blutgehalts werden
die verdünnten
Proben auf das Vorkommen der Thrombinähnlichen Aktivität dreifach unter
den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen getestet.
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Die
Steigungen des linearen Teils der Dosis-Antwort-Kurven werden bestimmt
und mit der Steigung für
den Thrombinstandard verglichen, um die Daten als picomolare Konzentration
von Thrombin in der Probe auszudrücken. Aufgrund einer starken
intrinsischen Absorption bei 405 nm in Blut kann das ß-Galactosidasesubstrat
ONPG nicht für
die Blutprobe verwendet werden. Anstelle dessen wird das alternative
Substrat Chlorphenolrot-ß-D-galactopyranosid
(CPRG, erhältlich
von Roche Diagnostics, Rotkreuz, Schweiz) verwendet, das die Messung
der ß-Galactosidaseaktivität bei 590
nm ohne der Wechselwirkung mit der intrinsischen Absorption von
Blut verwendet. CPRG wird in derselben Konzentration verwendet,
wie ONPG. Der Thrombinstandard wird dementsprechend gemessen.
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Die
Thrombinkonzentration kann präzise
in den CSF Proben bestimmt werden, wie dies durch die Referenzdosis-Reaktionskurve
für Thrombin
angezeigt wird, die währen
der Messung jedes Satzes an 3 Proben mitaufgenommen wird. In der
normalen CSF Probe und im Blut werden sehr ähnliche Mengen an Thrombin mit
einer Konzentration von jeweils 25 und 29 pM detektiert. In den
CSF Proben von Patienten nach einem schweren Kopftrauma wird häufig eine
signifikant höhere
Menge an Thrombin gefunden, die bei Patient 1 bereits 4 Stunden
nach der Verletzung sogar 17 fach höher war als der Normalspiegel
und nach 10 Stunden immer noch 5 fach höher. Bei den anderen Patienten
wird sowohl eine Zunahme der Thrombinkonzentration über die
Zeit beobachtet (Patienten 2, 4), wie auch eine Abnahme (Patient
3). Von den verbleibenden Patienten ist nur eine einzige Probe verfügbar, was
keinen direkten Vergleich erlaubt. Von allen Patienten existiert
mindestens 1 Probe, die einen erhöhten Thrombinspiegel zeigt,
außer
die CSF von einem Patienten, die zwei Tage nach der subarachnoiden
Hämorrhagie
entnommen wurde. In diesem Fall ist der Thrombinspiegel normal, aber
die CSF Probe zeigt die höchste
Menge an Blutkontamination (∼ 18
%) (Patient 6). Es gibt keine Korrelation zwischen der Menge an
Blutkontamination in der CSF und der Thrombinkonzentration. Von
einem zusätzlichen
Patienten ist eine größere Serie
an CSF Proben verfügbar,
die zwischen 20 und 280 Stunden nach einer schweren Kopfverletzung
entnommen wurden. Während
in der ersten Phase nach dem Trauma die Thrombinkonzentration im
Bereich von normalem CSF liegt, steigt sie nach 2 Tagen stark auf
eine Maximalmenge von 370 pM Thrombin an, die 6 Tage nach dem Trauma
erreicht wird. Sogar bis 12 Tage nach dem Trauma wird immer noch
ein dreifach erhöhter
Thrombinspigel gemessen. Fluktuationen in den Thrombinspiegeln sind
leicht ersichtlich, sogar auf einer täglichen Basis, wobei eine starke
Zunahme zwischen den Tagen 2 und 3 und eine Abnahme, erneut gefolgt
von einer Zunahme zwischen den Tagen 5 und 8 beobachtet wird. Wenn
der selbe Test in Gegenwart von Hirudin ausgeführt wird, ist keine ß-Galactosidasefreisetzung
detektierbar, was die beobachtete Proteaseaktivität als Thrombin
identifiziert.
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Zusammengefasst
wurde die Thrombinkonzentration in CSF mit Konzentrationen in normalem
Blut oder CSF im Bereich von 25 bis 30 pM gemessen und in Fällen von
CSF aus Patienten nach einem schweren Kopftrauma in Mengen bis zu
400 pM oder mehr. In allen Fällen,
bei denen eine erhöhte
Thrombinmenge gemessen wird, beträgt die Thrombinkonzentration
mindestens 100 pM. Die hohe Empfindlichkeit des Tests erlaubt die
Messung von geringen Mengen an Thrombin in biologischen oder klinischen
Proben, einschließlich CSF.
Daher erleichtert der Test Studien zur Bestimmung, ob Thrombin ein
Risikofaktor bei einer traumatischen Kopfverletzung ist, um den
Verlauf der Verletzung in Abhängigkeit
der Thrombinspiegel vorherzusagen und um zu bestimmen, ob darauf
geachtet werden soll, um die Thrombinaktivitäten in der CSF spezifisch zu
blockieren.
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Beispiel 8: Messung der
Proteaseaktivität
und der Protease-hemmenden Aktivität in Gehirnhomogenaten von PN-1
Knockout-Mäusen
und heterozygoten oder Wildtypgeschwister eines Wurfes
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Der
Seinproteaseinibitor PN-1 zeigt ein distinktes temporäres und
räumliches
Expressionsmuster bei der Entwicklung von Knorpel, Lunge, Haut,
Urogenitaltrakt und im zentralen und peripheren Nervensystem (Mansuy
et al. 1993). Das Gen für
PN-1 wurde bei den Mäusen
zerstört,
um die vorgeschlagenen Rollen für PN-1
während
der Entwicklung und dem Erwachsenen besser zu definieren (Lüthi et al.
1997). Das vorliegende Beispiel zeigt die Messung der Mengen an
Protease oder Protease-hemmender Aktivität in Gehirnhomogenaten, die
von PN-1 defizienten Mäusen
und von heterozygoten und Wildtypgeschwister eines Wurfes erhalten
wurden, mittels des Substrats S2238 und des GPAR Tests. Es wurden
14 Tage alte PN-1 Knockout Mäuse
und vorher beschriebene Geschwister eines Wurfes (Lüthi et al.,
1997) analysiert, die in die C57/B16 Mauslinie (im Handel erhältlich)
rückgekreuzt
werden.
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Präparation von Gehirnhomogenaten
-
Drei
Mäuse von
einem Wurf aus rückgekreuzten
PN-1 Knockoutmäusen
werden betäubt
und mit Saccharose perfundiert [10 mM HEPES, pH 7,5, 320 mM Saccharose,
1 mM EDTA, 0,2 % Tween 20]. Die Gehirne werden dann ausgeschnitten
und für
45 Sekunden in Saccharosepuffer in einem Verhältnis von 2 ml pro Gehirn mittels
eines Polytronhomogenisiergeräts
homogenisiert (Kinematica, Luzern, Schweiz). Der Zelldbris wird durch
eine Zentrifugation bei 13 000 Upm in einer Heraeus Tischzentrifuge
bei Raumtemperatur für
15 Minuten abgetrennt. Der Überstand
wird anschließend
durch Filtration zuerst durch ein 0,45 μm und dann durch ein 0,22 μm Millipore
Filter sterilisiert. Die Homogenate werden bei –80°C bis zur Verwendung gefroren.
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Messung der Protease und
Thrombin-hemmenden Aktivität
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Die
Gehirnhomogenatüberstände werden
seriell in Enzympuffer 1 × EB
[50
mM Tris/HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 % PEG 6000, 0,02 % Tween 20]
in Verdünnungen
vedünnt,
die von 1:100 bis 1:10 000 reichen. Die verdünnten Proben werden auf das
Vorkommen der Thrombin-ähnlichen
Aktivität
dreifach unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen gemessen.
Zur Messung der Thrombinhemmenden Aktivität werden die Homogenate in
Enzympuffer verdünnt,
der 1 pM Thrombin enthält.
Die Konzentrationen an Thrombin-ähnlicher Aktivität oder Thrombin-hemmender
Aktivität
werden aus den Steigungen des linearen Teils der Dosis-Antwort-Kurve
bestimmt.
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Die
Gehirnhomogenate aus 14 Tage alten Wildtyp oder PN-1 Knockout Mäusen setzen
keine messbaren Mengen an löslicher ß-Galactosidaseaktivität nach einer
Inkubation mit immobilisiertem GPAR1 frei. Ein Überschuss an Thrombin-hemmender
Aktivität
wird deutlich, wenn die Gehirnhomogenate in Gegenwart von 1 pM Thrombin
getestet werden. Tatsächlich
wird eine Verringerung der ß-Galactosidasefreisetzung
in Gegenwart der Gehirnhomogenate detektiert. Die Menge an Thrombininhibitor,
die in den Gehirnhomogenaten vorhanden ist, wird aus diesen Kurven
berechnet. Die höchste
Konzentration an Inhibitor beträgt
817 ± 122
pM und ist im Homogenat des Wildtypgehirns vorhanden, während die
Thrombin-hemmende Aktivität
in der PN-1 Knockout Maus auf 79 ± 8 pM verringert ist, was
9,7 der Wildtypmenge entspricht. Im Gehirn der heterozygoten PN-1
Knockout Maus wird eine mittlere Konzentration von 487 ± 65 pM
Thrombin-hemmende Aktivität
gefunden. Der detektierte Inhibitor ist aufgrund der reduzierten
Menge, die in den Gehirnen der heterozygoten Maus gefunden wurden,
höchstwahrscheinlich
PN-1. Jedoch ist sogar im Homogenat aus der homozygoten PN-1 Knockout
Maus eine Thrombin-hemmende Aktivität evident messbar, was die
Anwesenheit eines Inhibitors zeigt, der nicht PN-1 ist.
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Zusammengefasst
wird eine präzise
und empfindliche Messung der PAR-spezifischen Proteaseaktivität und Protease-hemmenden
Aktivität
in Gewebeproben durch das vorliegende Verfahren erreicht. Die gezielte
Zerstörung
des PN-1 Gens führt
zu einer starken Reduktion aber keiner völligen Auslöschung der Thrombin-hemmenden
Aktivität
in Gehirnhomogenaten, was das Vorkommen eines zweiten Thrombininhibitors
zeigt. Die Verringerung der hemmenden Aktivität ist mittels des Thrombinsubstrats
S2238 messbar, wird aber in einem empfindlicheren Niveau mittels
des vorliegenden Tests bestätigt.
Es ist keine Thrombin-ähnliche
Aktivität in
diesen Knock-out Tieren detektierbar, was die Identifizierung einer
putativen Zielprotease für
PN-1 erlaubt.
-
Beispiel 9: Messung der
Proteaseaktivität
und Protease-hemmenden Aktivität
in Flüssigkeiten
aus dem männlichen
Reproduktionssystem der Maus
-
Nach
der Erzeugung der PN-1 Knockout Maus zeigt die anschließende Züchtung der
mutierten Mauslinie, dass viele homozygote PN-1 Knockout Mäuse steril
sind. Da PN-1 mit hohen Mengen in einer Androgen-abhängigen Weise
im männlichen
Reproduktionssystem der Wildtypmaus exprimiert wird (Mansuy et al., 1993,
Vassalli et al. 1993) kann dessen Abwesenheit schwere Konsequenzen
für die
Fertilität
des Tieres haben. Mögliche
Ziele für
PN-1 sind die Serinproteasen uPA und Plasmin, die aus uPA aus Plasminogen
erzeugt werden können.
Es wurden 14 Tage alte PN-1 Knockout Mäuse in die C57/B16 Mauslinie
rückgekreuzt,
wie dies in Beispiel 8 beschrieben ist.
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Gewinnung der Flüssigkeiten
aus dem männlichen
Reproduktionssystem der Maus
-
Zwei
Paare an erwachsenen, rückgekreuzten
PN-1 Knockout Mäusen
werden betäubt
und durch Enthauptung getötet.
Die Samenvesikel, die Koagulationsdrüse und die Vas deferens/Cauda
epididymis werden herausgeschnitten und ihr Inhalt wird mit Pinzetten
in Eppendorfröhrchen
gedrückt
und mit 100 μl
Enzympuffer 1 × EB
[50
mM Tris/HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 % PEG 6000, 0,02 % Tween 20]
gemischt. Die Proben werden bis zur Verwendung bei –80°C gefroren
gelagert.
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Proteinbestimmung
-
Die
Proteinbestimmung von seriellen Verdünnungen der Flüssigkeitsproben
wird mittels eines Proteinbestimmungskits vom Bradfordtyp von BioRad
gemäß den Anleitungen
des Herstellers ausgeführt
(Bradford, 1976).
-
Messung der Proteaseaktivität und der
Protease-hemmenden Aktivität
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Die
Flüssigkeiten
werden seriell in Enzympuffer mit Verdünnungen verdünnt, die
von 1/200 bis 1/600 000 reichen. Die verdünnten Proben werden dreifach
auf die Anwesenheit einer Thrombinähnlichen Aktivität unter
den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen wie auch auf eine Thrombinhemmende
Aktivität
getestet, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist. Alternativ dazu
wird der Test in Gegenwart von 10 pM Trypsin ausgeführt. Die
Konzentrationen der Thrombin-ähnlichen
Aktivität
oder der Thrombin-hemmenden Aktivität werden aus den Steigungen
des linearen Teils der Dosis-Antwort-Kurven bestimmt.
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Alle
untersuchten Flüssigkeiten
enthalten entweder eine messbare Menge der proteolytischen Aktivität oder der
Thrombin-hemmenden Aktivität.
Die Samenvesikel enthalten einen Überschuss an Thrombin-hemmender
Aktivität
von etwa 240 fmol pro mg Protein, die in der PN-1 Knockout Maus
auf 19 verringert ist. In der Koagulationsdrüse der Wildtypmaus ist eine
Thrombin-hemmende Aktivität
mit einer Konzentration von etwa 10 fmol pro mg Protein vorhanden.
In der Mutantenmaus, die unfähig
zur Synthese von PN-1 ist, ist die Thrombin-hemmende Aktivität aufgehoben
und deckt damit einen Überschuss
an Proteasekativität
auf. Die Flüssigkeit
aus dem Vas Deferens zeigt eine Proteaseaktivität von etwa 400 fmol pro mg
Protein, die in der PN-1 Knockout Maus um 150 % erhöht ist.
Für eine
Wildtypmaus wird die Messung in Gegenwart von 10 pM Trypsin ausgeführt, was
zeigt, dass die hemmende Aktivität
im Samenvesikel und der Koagulationsdrüse auch zur Hemmung von Trypsin
fähig ist.
Der hierin beschriebene empfindliche Test erlaubt die Detektion
von Thrombin und Thrombin-ähnlichen
Proteasen und ihren Inhibitoren in Flüssigkeiten aus dem Reproduktionssystem
der PN-1 Knockout und Wildtypmaus.
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Zusammengefasst
wird ein Überschuss
der Thrombin-hemmenden Aktivität
in der Koagulationsdrüse der
Wildtypmaus detektiert, die in der PN-1 Knockout Maus fehlt, was
zu einem Überschuss
einer nicht identifzierten Thrombin-ähnlichen Proteaseaktivität führt. Eine
zweite Thrombin-hemmende Aktivität
wird im Samenvesikel detektiert. In der Vas deferens und der Cauda
epididymis führt
die Zerstörung
des PN-1 Gens zu einer Zunahme einer nicht identifizierten Proteaseaktivität, die auch
in der Wildtypmaus in geringeren Mengen vorkommt. Daher können die
Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die bisher
nicht identifizierten Proteasen und Protease-inhibitoren zu detektieren,
die weitere biologische Ziele für
die PAR Regulation bereitstellen.
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Beispiel 10: Analyse von
löslichen
oder an Zelloberflächen
assoziierten Proteasen
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Herstellung eines Fusionsproteins, das in
einer membrangebundenen Weise auf der Oberfläche von Säugerzellen in Kultur exprimiert
wird, wobei es die Analyse von löslichen
oder an die Zelloberfläche
assoziierten Proteasen erlaubt. Unter Verwendung dieses Formats
war es möglich,
die durch Thrombin vermittelte Freisetzung eines Reporterenzyms
in das Medium von kultivierten Zellen zu zeigen. Die kultivierten
Mausneuroblastomzellen (Nb2a oder Cho-E Zellen) werden mit der cDNA
eines membranverankerten Fusionsproteins der humanen alkalischen
Phosphatase der Plazenta und den extrazellulären und ersten Transmembrandomänen von
PAR1 transfiziert.
-
Die
Signalintensitäten
können
leicht für
jedes PAR Fusionskonstrukt optimiert werden, beispielsweise durch
die Selektion einer Zelllinie, die hohe Expressionsmengen erlaubt
und durch die Erzeugung einer Zelllinie, die das Rezeptorfusionsprotein
stabil exprimiert. Das zellbasierte Format des Tests kann für die sensitive Detektion
von Proteasen verwendet werden, die zur Aktivierung von Proenzymen
fähig sind,
wie Prothrombin oder das Reporterenzym direkt spalten und freisetzen.
-
Wie
es für
den Fachmann ersichtlich ist, können
die obigen Beispiele leicht modifiziert werden, um die verschiedenen
Reportermoleküle
oder PAR Sequenzen zu umfassen und die PAR Aktivatoren, Inaktivatoren, Agonisten
und Antagonisten in Proben verschiedener Ursprünge zu detektieren. Zusätzlich sind
die hierin beschriebenen PAR Fusionsproteine brauchbar, um jedes
PAR Bindeprotein oder -molekül
zu screenen, das dann durch die in der Technik bekannten Verfahren
identifiziert werden kann (beispielsweise Proteomics). Tabelle
1 GPAR
Tests: ß-Galactosidasefreisetzungsgeschwindigkeiten
durch potentielle Aktivatoren und Inaktivatoren der PARs
- Anmerkung: Immobilisierte GPAR Fusionsproteine
werden mit den oben angegebenen Proteasen inkubiert und die Freisetzung
der ß-Galactosidase
wird wie beschrieben detektiert und evaluiert. Die Daten stellen
den Mittelwert aus mindestens 2 Experimenten mit Dreifachbestimmungen
dar. Alle Werte sind in mmolß-Galactosidase/(molProtease × min) angegeben.
- a Bestimmt in Gegenwart von Hirudin
Sequenzliste