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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Detektieren biologisch
aktiver Substanzen, die intrazelluläre Prozesse beeinflussen, und
ein DNA-Konstrukt und eine Zelle zur Verwendung in dem Verfahren.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Zweite
Botschafter und Proteinkinasen spielen Schlüsselrollen in den Signalwegen,
die die Reaktion von Säugerzellen
(und wahrscheinlich aller eukariotischer Zellen) auf die meisten
Stimuli steuern. Obwohl derartige Signalwege ausführlichen
Studien unterzogen wurden, ist es oft schwierig, eine detaillierte
Kenntnis von z. B. den genauen Zeiteinteilungs- und räumlichen
Eigenschaften von Signaltransduktionsereignissen zu erhalten, aufgrund
des Mangels einer günstigen
Technologie. Es gibt jedoch eine Ausnahme für diese Regel: Unser Verständnis der
Rolle von Ca2+ in z. B. der intrazellulären Signaltransduktion
wurde stark verbessert aufgrund der Entwicklung der fluoreszierenden
Ca2+-Sonde FURA-2, die Echtzeitstudien von
Ca2+ in einzelnen lebenden Zellen ermöglicht.
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Außerdem wurde
die Konstruktion von Sonden für
cAMP (Adams et al., Nature 349 (1991), 694–697) und die Aktivität für die cAMP-abhängige Proteinkinase
(Sala-Newby und
Campbell, FEBS 307 (2) (1992), 241–244) versucht. Die Proteinkinase A-Sonde unterliegt
jedoch dem Nachteil, dass sie auf der Leuchtkäfer-Luziferase basiert und
demgemäss zu
wenig Licht für
schnelle Messungen einer einzelnen Zelle produziert. Die cAMP-Sonde
muss andererseits mikroinjiziert werden und ist deshalb nicht gut für Routine-Laborarbeit
geeignet. Als Schlussfolgerung fehlt beiden Sonden etwas von den
eleganten Eigenschaften, die zu der weitverbreiteten Verwendung
von FURA-2 führten.
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Kürzlich wurde
entdeckt, dass das grün
fluoreszierende Protein (GFP), das in vielen verschiedenen Zelltypen,
einschließlich
Säugerzellen,
exprimiert wird, hoch fluoreszent wurde (Chalfie et al., Science
263 (1994), 802–805).
WO/07463 beschreibt eine Zelle, die zum Exprimieren von GFP fähig ist, und
ein Verfahren zum Selektieren von Zellen, die ein Protein von Interesse
und GFP exprimieren, basierend auf der Detektion der GFP-Fluoreszenz
in den Zellen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Der
Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Detektieren
einer biologisch aktiven Substanz bereitzustellen, die intrazelluläre Prozesse
beeinflusst, basierend auf der Verwendung von grün fluoreszierendem Protein,
einschließlich Wild-Typ-GFP,
das von der Qualle Aequorea victoria abgeleitet ist und Modifikationen
von GFP, wie Modifikationen, die die spektralen Eigenschaften der GFP-Fluoreszenz ändern, für die Konstruktion
von Sonden, bevorzugt Echtzeitsonden für zweite Botschafter und Proteinkinase-Aktivität.
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In
einem Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren
zum Charakterisieren der biologischen Aktivität einer Probe, wobei das Verfahren
umfasst:
- a) Exprimieren einer DNA-Sequenz in
einer Zelle, wobei die DNA-Sequenz ein Protein oder ein Polypeptid
codiert, das ausgewählt
ist aus der Gruppe, die besteht aus
(i) einem grün fluoreszierenden
Protein mit einer Proteinkinase-Erkennungsstelle,
oder
(ii) einem grün
fluoreszierenden Protein, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren substituiert,
inseriert oder deletiert worden sind, um eine Bindungsdomäne eines
zweiten Botschafters oder eine Enzymerkennungsstelle bereit zu stellen, oder
(iii)
einem Hybridpolypeptid des grün
fluoreszierenden Proteins (GFP) oder eines modifizierten GFP und
einer Bindungsdomäne
eines zweiten Botschafters oder einer Enzymerkennungsstelle; und
- b) Messen der Fluoreszenz des GFP in der Zelle in Abwesenheit
und Anwesenheit einer Testprobe; und
- c) Vergleichen der GFP-Fluoreszenz, die in Schritt (b) gemessen
wurde;
wobei ein Unterschied zwischen der Fluoreszenz, die
in Abwesenheit und Anwesenheit der Probe gemessen wurde, die biologische
Aktivität
der Testprobe anzeigt.
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Außerdem haben
Studien der Substratspezifität
der verschiedenen Proteinkinase A (PKA)-Isoformen unter Verwenden
synthetischer Peptide gezeigt, dass Peptide, die die Motive RRXSX oder RXKRXXSX (wobei S die
phosphorylierte Aminosäure
ist) enthalten, dazu neigen, die besten Substrate für PKA zu sein,
und ein Überblick
von Zetterquist, Ö.
et al. (in Kemp, B.E. (Herausgeber) Peptide und Protein Phosphorylation
(1990), 172–188,
CRC Press, Boca Raton, Florida, USA) bestätigt, dass die meisten bekannten
Substrate von PKA die Motive enthalten.
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Verfügbare Aminosäuresequenzen
von GFP weisen nicht darauf hin, dass GFP ein PKA-Substrat ist,
wegen eines Mangels an Erkennungsstellen, die die Motive RRXSX oder RXKRXXSX umfassen. Es ist deshalb überraschend,
dass ein natives grün
fluoreszierendes Protein (GFP) oder ein grün fluoreszierendes Protein
(GFP) vom Wild-Typ, abgeleitet von der Qualle Aequorea victoria,
durch Proteinkinase A phosphoryliert werden kann und dadurch die
spektralen Eigenschaften des GFP geändert werden, was zu einem
wesentlichen Anstieg der Fluoreszenz führt.
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Im
vorliegenden Kontext ist beabsichtigt, dass der Begriff „grün fluoreszierendes
Protein" ein Protein
anzeigt, das, wenn es durch eine Zelle exprimiert wird, Fluoreszenz
emittiert (vgl. Chalfie et al., Science 263, 1994, Seiten 802–805). Im
folgenden wird GFP, in dem eine oder mehrere Aminosäuren substituiert,
inseriert oder deletiert worden ist, am meisten oft „modifiziertes
GFP" genannt.
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Der
Begriff „zweiter
Botschafter" wird
verwendet, um eine Komponente niedrigen Molekulargewichts anzuzeigen,
die in den frühen
Ereignissen von intrazellulären
Signaltransduktionswegen involviert ist.
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Der
Begriff „Bindungsdömäne eines
zweiten Botschafters" wird
zum Anzeigen eines Segmentes eines Proteins verwendet, das, im Verlauf
von intrazellulären
metabolischen Prozessen, den zweiten Botschafter bindet.
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Es
ist beabsichtigt, dass der Begriff „Enzymerkennungsstelle" eine Peptidsequenz
anzeigt, die durch ein Enzym kovalent modifiziert ist (z. B. phosphoryliert,
glycosyliert oder gespalten), bevorzugt ist die Enzymerkennungsstelle
eine Proteinkinaseerkennungsstelle, für die beabsichtigt ist, dass
sie eine Peptidsequenz anzeigt, die durch eine Kinase kovalent modifiziert
ist, d. h. phosphoryliert ist.
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Es
sollte betont werden, dass der Phosphorylierung eines Proteins an
einer Proteinkinaseerkennungsstelle oft eine Dephosphorylierung
des Proteins folgt (oder davon begleitet ist). Eine auf GFP-basierende
Sonde für
die Aktivität
einer (von) gegebenen Proteinkinase(n) würde deshalb auch Information über die
Aktivität
der relevanten Proteinphosphatasen liefern, da der überwachte
Parameter die Netto-Phosphorylierung
der auf GFP basierenden Sonde ist.
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Es
ist beabsichtigt, dass der Begriff „Hybridpolypeptid" ein Polypeptid anzeigt,
das eine Fusion von mindestens einem Teil von jedem zweier Proteine
ist, in diesem Fall mindestens einem Teil des grün fluoreszierenden Proteins
und mindestens einem Teil einer Bindungsdomäne eines zweiten Botschafters oder
einer Enzymerkennungsstelle.
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Im
vorliegenden Kontext ist beabsichtigt, dass der Begriff „biologisch
aktive Substanz" eine Substanz
anzeigt, die eine biologische Funktion besitzt oder einen biologischen
Effekt im menschlichen oder tierischen Körper ausübt. Die Probe kann eine Probe
eines biologischen Materials, wie eines mikrobiologischen Extraktes
sein, oder sie kann eine Probe sein, die eine Verbindung oder Mischung
von Verbindungen enthält,
die durch organische Synthese hergestellt sind.
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Der
Ausdruck „eine
beliebige Änderung
in der Fluoreszenz" bedeutet
eine beliebige Änderung in
Absorptionseigenschaften, wie Wellenlänge und Intensität, oder
eine beliebige Änderung
in spektralen Eigenschaften des emittierten Lichts, wie eine Änderung
der Wellenlänge,
der Fluoreszenz-Lebensdauer, der Intensität oder der Polarisation.
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Der/die
Mechanismus/Mechanismen hinter einer Änderung in z. B. der Fluoreszenzintensität eines
modifizierten GFP bei der Phosphorylierung könnte(n) mehrere sein. Als eine
Möglichkeit
könnte die
Phosphorylierung der GFP-Variante die Chromophor-Umgebung ändern, entweder
aufgrund der Nachbarschaft der zugegebenen Phosphatgruppe oder der
durch Phosphorylierung induzierten Konformationsänderungen. Dementsprechend
könnte
das Binden von z. B. einem zweiten Botschafter an die Bindungsdomäne einer
GFP-Variante oder eines GFP-Fusionsproteins
Konformationsänderungen
induzieren, die letztendlich die Chromophor-Umgebung und dadurch
die Fluoreszenz ändern.
Als Unterstützung
für diese
Vorschläge
wurde gezeigt, dass Aminosäuresubstitutionen
entfernt vom Chromophor (z. B. Aminosäuren 167, 202, 203 und 222)
die Fluoreszenzintensität
und die spektralen Eigenschaften von GFP ändern können (Ehrig et al. (1995) FEBS Letters
367:163; Heim et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:12501).
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Die
Entwicklung von lumineszierenden Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung
ermöglicht Echtzeitstudien
von zweiten Botschaftern und spezifischen Enzymen, wie Proteinkinasen,
in einzelnen lebenden Zellen, wodurch es möglich gemacht wird, die präzise Zeiteinteilung
und die räumlichen
Eigenschaften dieser Faktoren zu studieren. Außerdem werden Studien über die
Heterogenität
in Zellpopulationen möglich
gemacht.
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Aufgrund
der starken Fluoreszenz von GFP kann die Lumineszenz von Zellen,
die die Sonden exprimieren, einfach detektiert und analysiert werden durch
Einsetzen einer Kombination von Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse.
Außerdem
sollte betont werden, dass die beschriebenen Sonden einfach in Zellen
einzuführen
sind, da sie in den Zellen von Interesse nach der Transfektion mit
einem geeigneten Expressionsvektor exprimiert werden können.
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Rekombinante
Echtzeit-Sonden für
zweite Botschafter und Enzymaktivität, wie Kinase-Aktivität, sind
nicht nur in der Grundlagenforschung, sondern auch in Screening-Programmen
nützlich,
die auf das Identifizieren neuer biologisch aktiver Substanzen zielen.
Viele gegenwärtig
verwendete Screening-Programme, die zum Finden von Verbindungen entwickelt
sind, die die cAMP-Konzentration und die Proteinkinase-Aktivität beeinflussen,
basieren auf Rezeptor-Bindung und/oder Reportergenexpression. Die
hier beschriebenen rekombinanten Sonden machen es andererseits möglich, einen
gänzlich
neuen Typ von Screening-Assays zu entwickeln, die zum Überwachen
unmittelbarer und flüchtiger Änderungen
der cAMP-Konzentration
und Proteinkinase-Aktivität
in intakten lebenden Zellen fähig
sind.
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Ein
beliebiges neues Merkmal oder eine Kombination von Merkmalen, die
hier beschrieben sind, wird für
diese Erfindung als wesentlich betrachtet.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das Gen, das GFP kodiert, von der
Qualle Aequorea victoria abgeleitet. Die Sequenz dieses Gens wird
in Prasher et al., Gene 111, 1992, Seiten 229–233 (GenBank Zugangs-Nr. M62653)
beschrieben. Das Gen kann modifiziert werden, damit es für eine GFP-Variante kodiert,
in der eine oder mehrere Aminosäurereste
substituiert, inseriert oder deletiert wurden, um eine Bindungsdomäne für einen
zweiten Botschafter oder eine Enzymerkennungsstelle bereitzustellen.
Gemäß dieser Ausführungsform
ist es bevorzugt, eine DNA-Sequenz zu inserieren, die für eine Enzymerkennungsstelle
kodiert, in das Gen, das für
GFP kodiert, z. B. an einer der folgenden Positionen: Zwischen Aminosäure 39 und
40, zwischen Aminosäure
71 und 72, zwischen Aminosäure
79 und 80, zwischen Aminosäure
107 und 108, zwischen Aminosäure
129 und 130, zwischen Aminosäure
164 und 165, oder zwischen Aminosäure 214 und 215. Punkte der
Insertion können
auf der Basis der Oberflächen-Wahrscheinlichkeit
ausgewählt
werden (die unter Verwenden des GCG-Software-Paketes berechnet werden kann, das eine
Formel von Emini et al., J. Virol. 55(3), 1985, Seiten 836–839 einsetzt).
Wenn das Enzym Proteinkinase C ist, sollte die inserierte Erkennungsstelle
bevorzugt das Motiv XRXXSXRX
enthalten, wobei S die phosphorylierte Aminosäure ist. In erfolgreichen Konstrukten
dieses Typs kann die Phosphorylierung des modifizierten GFP zu detektierbar
geänderten
optischen Eigenschaften von GFP führen. Es sollte beachtet werden,
dass eine extensive Deletion zum Verlust der Fluoreszenzeigenschaften
von GFP führen
kann. Es wurde gezeigt, dass nur ein Rest vom Aminoterminus und
weniger als 10 oder 15 vom Carboxylterminus geopfert werden kann,
bevor die Fluoreszenz verloren geht, vgl. Cubitt et al. TIBS Vol.
20 (11), Seiten 448–456,
November 1995. Daher ist gemäß dieser
Erfindung die Modifikation des GFP-Gens, um für eine GFP-Variante zu kodieren,
in der eine oder mehrere Aminosäurereste
substituiert, inseriert oder deletiert worden sind, auf Modifikationen
begrenzt, die zu einer GFP-Variante mit Fluoreszenzeigenschaften
führen.
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Die
Bindungsdomäne
eines zweiten Botschafters kann ein Rezeptor eines zweiten Botschafters
sein. Der zweite Botschafter kann sein ein zyklisches ADP, Inositolphosphat
3, zyklisches GMP, zyklisches ADP oder Diacylglycerol. Die Bindungsdomäne ist bevorzugt
der zyklische AMP-Rezeptor (CRP, z. B. wie beschrieben in Weber
und Steitz, J. Mol. Biol. 198, 1987, Seiten 311–326; Schroeder und Dobrogosz,
J. Bacteriol. 167, 1986, Seiten 612–622) oder ein Teil davon,
der zum Binden von zyklischem AMP fähig ist.
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Natives
CRP besitzt zwei verschiedene Domänen: Eine N-terminate cAMP-Bindungsdomäne, wie
auch eine C-terminate DNA-Bindungsaktivität (Weber und Steitz, J. Mol.
Biol. 198 (1987), 311–326). Beim
Binden von cAMP an den N-terminalen
Teil von CRP wird eine Konformationsänderung im C-Terminus induziert,
was die Bindung von CRP an die Promotoren von bestimmten Genen ermöglicht.
In den erfolgreichen Fusionen von CRP (oder eines Teils davon) an
GFP (oder eines Teils davon) werden cAMP-induzierte Konformationsänderungen
in CRP an GFP übertragen,
wodurch die optischen Eigenschaften von GFP geändert werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das Gen oder die cDNA-Sequenz, die
ein Wild-Typ-GFP kodiert, von der Qualle Aequorea victoria abgeleitet.
Eine bevorzugte Sequenz dieses Gens ist hier durch 4a offenbart. 4a zeigt
die Nukleotidsequenz eines Wild-Typ-GFP (Hind3-EcoR1 R1-Fragment)
und die 4b zeigt die Aminosäuresequenz,
bei der das Startcodon ATG der Position 8 entspricht und das Stopcodon
TAA der Position 722 in der Nucleotidsequenz der 4a entspricht.
Eine andere Sequenz eines Isotyps dieses Gens ist von Prusher et
al., Gene 111, 1992, Seiten 229–233
(GenBank Zugangs-Nr. M62653) offenbart. Ein beliebiges Gen, das
für ein
fluoreszierendes Protein kodiert, wie Wild-Typ-GFP, mit einer Proteinkinaseerkennungsstelle
und abgeleitet von einem beliebigen Organismus, der ein grün fluoreszierendes
Protein oder ein ähnliches
fluoreszierendes, phosphoreszierendes oder lumineszierendes Protein
exprimiert, kann in dieser Erfindung verwendet werden.
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Die
Enzymerkennungsstelle oder Proteinkinaseerkennungsstelle ist bevorzugt
eine Ser/Thr-oder Tyr-Proteinkinase, wie Proteinkinase C- oder eine
Proteinkinase A-Erkennungsstelle
(beide sind im Überblick
in z. B. B.E. Kemp und R.B. Pearson dargestellt; TIBS 15, Sept.
1990, Seiten 342–346),
oder der Insulinrezeptor oder die Src-Kinase oder ein Teil davon,
der ein Motiv enthält,
das als ein Substrat für
Proteinkinase erforderlich ist, wie oben vorgeschlagen. Kinase-katalysierte
Phosphorylierung kann zu detektierbar geänderten optischen Eigenschaften
von GFP führen.
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Die
DNA-Sequenz, die für
GFP kodiert, die Bindungsdomäne
eines zweiten Botschafters oder die Enzymerkennungsstelle kann geeigneterweise von
genomischem oder cDNA-Ursprung sein, z. B. Erhalten durch Herstellen
einer geeigneten genomischen oder cDNA-Bibliothek und Screenen nach DNA-Sequenzen, die für alle oder
einen Teil von beliebigen dieser Proteine kodieren, durch Hybridisierung
unter Verwenden synthetischer Oligonukleotidsonden gemäß Standardtechniken
(vgl. Sambrook et al., supra).
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Das
DNA-Konstrukt der Erfindung, dass das Wild-Typ-GFP, das modifizierte
GFP oder Hybridpolypeptid kodiert, kann auch synthetisch durch etablierte
Standardverfahren hergestellt werden, z. B. das Phosphoamidit-Verfahren
beschrieben von Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859–1869, oder
das Verfahren beschrieben von Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984),
801–805.
Gemäß des Phosphoamidit-Verfahrens
werden Oligonukleotide synthetisiert, z. B. in einem automatischen DNA-Synthetisierer,
gereinigt, assoziiert, ligiert und kloniert in geeigneten Vektoren.
Für die
meisten Zwecke kann es praktisch sein, eine kürzere DNA-Sequenz herzustellen,
wie die DNA-Sequenz, die für
die Enzymerkennungsstelle synthetisch kodiert, während die DNA, die für GFP oder
die Bindungsdomäne eines
zweiten Botschafters kodiert, typischerweise durch Screenen einer
DNA-Bibliothek isoliert werden wird.
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Außerdem kann
das DNA-Konstrukt von gemischtem synthetischen und genomischen,
gemischtem synthetischen und cDNA- oder gemischtem genomischen cDNA-Ursprung
sein, hergestellt durch Ligieren von Fragmenten synthetischen, genomischen
oder cDNA-Ursprungs (wie geeignet), wobei die Fragmente verschiedenen
Teilen des gesamten DNA-Konstruktes entsprechen, gemäß Standardtechniken
(vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989,
Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA).
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Das
DNA-Konstrukt kann auch durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter
Verwenden spezifischer Primer hergestellt werden, z. B. wie beschrieben
in
US 4,683,202 oder
Saiki et al., Science 239 (1988), 487–491. Ein neuerer Überblick über PCR-Verfahren
kann gefunden werden in PCR-Protocols, 1990, Academic Press, San
Diego, California, USA.
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Die
DNA-Sequenz, die für
GFP kodiert, kann auch durch andere Mittel modifiziert werden, wie durch
konventionelle chemische Mutagenese oder durch Insertion, Deletion
oder Substitution eines oder mehrerer Nukleotide in der Sequenz,
entweder als willkürliche
oder als auf Stellen gerichtete Mutagenese. Es wird erwartet, dass
derartige Mutanten geänderte
optische Eigenschaften oder eine geänderte Wärmestabilität aufweisen.
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Das
DNA-Konstrukt der Erfindung kann in einen rekombinanten Vektor inseriert
werden, der ein beliebiger Vektor sein kann, der günstig rekombinanten
DNA-Prozeduren unterzogen
werden kann. Die Wahl des Vektors wird oft von der Wirtszelle abhängen, in
die er eingeführt
werden soll. Daher kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor
sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert,
deren Replikation von chromosomaler Replikation unabhängig ist,
z. B. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn
er in einer Wirtszelle integriert wird, in das Wirtszellen-Genom integriert
und zusammen mit dem/den Chromosomen) repliziert wird, in das/die
er integriert worden ist.
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Der
Vektor ist bevorzugt ein Expressionsvektor, in dem die DNA-Sequenz,
die das Wild-Typ-GFP, das modifizierte GFP oder das Hypridpolypeptid
kodiert, funktionsfähig
an zusätzliche
Segmente gebunden ist, die für
die Transkription der DNA erforderlich sind. Im Allgemeinen wird
der Expressionsvektor von Plasmid- oder viraler DNA abgeleitet,
oder kann Elemente von beiden enthalten. Der Begriff „funktionsfähig gebunden" zeigt an, dass die
Segmente derart angeordnet sind, dass sie im Konzert für ihre beabsichtigten
Zwecke funktionieren, z. B. dass die Transkription in einem Promotor
initiiert wird und durch die DNA-Sequenz voranschreitet, die für das modifizierte GFP
oder Hypridpolypeptid kodiert.
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Der
Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die eine Transkriptionsaktivität in der Wirtszelle
der Wahl zeigt und von Genen abgleitet werden kann, die Proteine
entweder homolog oder heterolog zur Wirtszelle kodieren.
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Beispiele
geeigneter Promotoren zum Ausrichten der Transkription der DNA-Sequenz, die Wild-Typ-GFP,
das modifizierte GFP oder das Hybridpolypeptid in Säugerzellen
kodiert, sind der SV40-Promotor (Subramani et al., Mol. Cell Biol.
1 (1981), 854–864)
der MT-1 (metallothionein gene)-Promotor (Palmiter et al., Science
222 (1983), 809–814)
oder der Adenovirus 2-major-late-promotor.
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Ein
Beispiel eines geeigneten Promotors zur Verwendung in Insektenzellen
ist der Polyhedrin-Promotor (
US
4,745,051 ; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7–11), der
P10-Promotor (J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, Seiten
765–776),
der Autographa-californica-polyhedrosis-virus-basisprotein-promotor
(
EP 397 485 ), der Baculovirus-immediate-early-gene-1-promotor
(
US 5,155,037 ;
US 5,162,222 ), oder der
Baculovirus 39K-delayed-early-gene-promotor (
US 5,155,037 ;
US 5,162,222 ).
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Beispiele
geeigneter Promotoren zur Verwendung in Hefewirtszellen umfassen
Promotoren von glycolytischen Hefegenen (Hitzeman et al., J. Biol.
Chem. 255 (1980), 12073–12080;
Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419–434) oder Alkoholdehydrogenase-Gene
(Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender
et al., Herausgeber), Plenum Press, New York 1982), oder die TPI1-(
US 4,599,311 ) oder ADH2-4c-(Russel
et al., Nature 304 (1983), 652–654) Promotoren.
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Beispiele
geeigneter Promotoren zur Verwendung in Fadenpilz-Wirtszellen sind
z. B. der ADH3-Promotor (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985),
2093–2099)
oder der tpiA-Promotor. Beispiele anderer nützlicher Promotoren sind jene,
die vom Gen abgeleitet sind, das die TAKA-Amylase von A. oryzae,
die Asparaginproteinase von Rhizomucor miehei, die neutrale α-Amylase
von A. niger, die säurestabile α-Amylase
von A. niger, die Glucoamylase (gluA) von A. niger oder A. awamori,
die Lipase von Rhizomucor miehei, die alkalische Protease von A. oryzae,
die Triosephosphatisomerase von A. oryzae oder Acetamidase von A.
nidulans. Bevorzugt sind die TAKA-Amylase und gluA-Promotoren.
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Beispiele
geeigneter Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Wirtszellen
umfassen den Promotor des Maltogenamylasegens von Bacillus stearothermophilus,
das α-Amylasegen
des Bacillus licheniformis, das BAN-Amylasegen des Bacillus amyloliquefaciens,
das Gen der alkalischen Protease von Bacillus subtilis oder das
Xylosidasegen von Bacillus pumilus oder die Phagen-Lambda-PR- oder PL-Promotoren oder die
lac-, trp- oder tac-Promotoren von E.coli.
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Die
DNA-Sequenz, die das Wild-Typ-GFP, das modifizierte GFP oder das
Hybridpolypeptid der Erfindung kodieren, können auch, falls nötig, funktionsfähig an einen
geeigneten Terminator gebunden sein, wie den menschlichen Wachstumshormon-Terminator
(Palmiter et al., op. cit.) oder (für Pilzwirte) die TPI1-(Alber und Kawasaki,
op. cit.) oder ADH3-(McKnight et al., op. cit.) Terminatoren. Der Vektor
kann weiter Elemente umfassen, wie Polyadenylierungs-Signale (z.
B. von SV40 oder der Adenuvirus 5-Elb-Region), transkriptionale
Verstärkersequenzen
(z. B. den SV40-Verstärker)
und translationale Verstärkersequenzen
(z. B. diejenigen, die Adenuvirus VA-RNAs kodieren).
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Der
rekombinante Vektor kann weiter eine DNA-Sequenz umfassen, die den
Vektor befähigt,
in der fraglichen Wirtszelle zu replizieren. Ein Beispiel einer
derartigen Sequenz (wenn die Wirtszelle eine Säugerzelle ist) ist der SV40-Ursprung
der Replikation.
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Wenn
die Wirtszelle eine Hefezelle ist, sind geeignete Sequenzen, die
den Vektor zum Replizieren befähigen,
die Hefe-Plasmid 2μ-Replikationsgene
REP 1–3
und der Ursprung der Replikation.
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Der
Vektor kann auch einen auswählbaren Marker
umfassen, z. B. ein Gen, dessen Produkt einen Defekt in der Wirtszelle
ergänzt,
wie das Gen, das für
die Dihydrofolatreduktase (DHFR) oder das TPI-Gen von Schizosaccharomyces
pombe (beschrieben von P.R. Russel, Gene 40, 1985, Seiten 125–130) kodiert,
oder eines, das Widerstandsfähigkeit
gegenüber
einem Arzneimittel, z. B. Ampicillin, Kanamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol,
Neomycin oder Hygromycin verleiht. Für Fadenpilze umfassen auswählbare Marker
amdS, pyrG, argB, niaD, sC.
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Die
Prozeduren, die verwendet werden zum Ligieren der DNA-Sequenzen,
die für
Wild-Typ-GFP, das modifizierte GFP oder das Hybridpolypeptid, den Promotor
und ggf. dem Terminator und/oder die sekretorische Signalsequenz
entsprechend kodieren, und um sie in geeignete Vektoren zu inserieren,
die die zur Replikation nötigen
Information enthalten, sind Fachleuten gut bekannt (vgl. z. B. Sambrook
et al., op.cit.)
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Die
Wirtszelle, in die das DNA-Konstrukt oder der rekombinante Vektor
der Erfindung eingeführt
wird, kann eine beliebige Zelle sein, die zum Exprimieren des vorliegenden
DNA-Konstruktes fähig ist
und umfasst Bakterien, Hefe, Pilze und höhere eukariotische Zellen wie
Säugerzellen.
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Beispiele
von bakteriellen Wirtszellen, die bei Kultivierung fähig sind,
das DNA-Konstrukt
der Erfindung zu exprimieren, sind grampositive Bakterien, wie Stämme von
Bacillus, wie Stämme
von B. subtilis, B. licheniformis, B. lenus, B. brevis, B. stearothermophilus,
B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans,
B. lautus, B. megatherium oder B. thuringiensis, oder Stämme von Streptomyces,
wie S. lividans oder S. murinus, oder gram-negative Bakterien, wie
Echerichia coli. Die Transformation der Bakterien kann durch Protoplasten-Transformation
oder unter Verwenden kompetenter Zellen in einer Weise, die an sich
bekannt ist (vgl. Sambrook et al., supra), bewirkt werden.
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Beispiele
geeigneter Säugerzelllinien
sind die HEK293- und die HeLa-Zelllinien, primäre Zellen, und die COS-(z.
B. ATCC CRL 1650), BHK-(z. B. ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL-(z.
B. ATCC CCU9) oder CHO-(z. B. ATCC CCL 61) Zelllinien. Verfahren
zum Transfizieren von Säugerzellen
und Exprimieren von DNA-Sequenzen,
die in die Zellen eingeführt
sind, werden beschrieben in z. B. Kauftnan und Sharp, J. Mol. Biol.
159 (1982), 601–621; Southern
und Berg, J. Mol. ApIRL Genet. 1 (1982), 327–341; Loyter et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. US 79 (1982), 422–426; Wigler et al., Cell 14
(1987), 725; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981),
603, Graham und van der Eb, Virology 52 (1973), 456; und Neumann
et al., EMBO J. 1 (1982), 841–845.
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Beispiele
geeigneter Hefezellen umfassen Zellen von Saccharomyces spp. oder
Schizosaccharomyces spp., insbesondere Stämme von Saccharomyces cerivisiae
oder Saccharomyces kluyveri Verfahren zum Transformieren von Hefezellen
mit heterologer DNA und zum Erzeugen heterologer Polypeptide davon
werden beschrieben z. B. in
US 4,599,311 ,
US 4,931,373 ,
US 4,870,008 , 5,037,743, und
US 4,845,075 . Transformierte
Zellen werden durch einen Phänotyp
ausgewählt,
der durch einen selektierbaren Marker bestimmt ist, allgemein Arzneimittel-Resistenz
oder die Fähigkeit,
in Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffes zu wachsen, z. B.
Leucin. Ein bevorzugter Vektor zur Verwendung in Hefe ist der POT1-Vektor,
der in
US 4,931,373 offenbart ist.
Der DNA-Sequenz, die das modifizierte GFP oder Hybridpolypeptid
kodiert, kann eine Signalsequenz und ggf. eine Leitsequenz vorangestellt
sein, z. B. wie oben beschrieben. Weitere Beispiele geeigneter Hefezellen
sind Stämme
von Kluyveromyces, wie K. lactis, Hansenula, z. B. H. polymorpha
oder Pichia, z. B. P. pastoris (vgl. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132,
1986, Seiten 3459–3465;
US 4,882,279 ).
-
Beispiele
anderer Pilzzellen sind Zellen von Fadenpilzen, z. B. Aspergillus
spp., Neurospora spp., Fusarium spp. oder Trichoderma spp., in besonderen Stämmen von
A. oryzae, A. nidulans oder A. niger. Die Verwendung von Aspergillus
spp. für
die Expression von Proteinen ist beschrieben in z. B.
EP 272 277 ,
EP 230 023 ,
EP 184 438 . Wenn ein Fadenpilz als
die Wirtszelle verwendet wird, kann er mit dem DNA-Konstrukt der
Erfindung transformiert werden, günstigerweise durch Integrieren
des DNA-Konstruktes in das Wirts-Chromosom, um eine rekombinante Wirtszelle
zu erhalten. Diese Integration wird allgemein als ein Vorteil betrachtet,
da die DNA-Sequenz wahrscheinlicher
stabil in der Zelle gehalten wird. Die Integration der DNA- Konstrukte in das
Wirts-Chromosom kann ausgeführt
werden gemäß herkömmlicher
Verfahren, z. B. durch homologe oder heterologe Rekombination.
-
Die
Transformation von Insektenzellen und die Produktion heterologer
Polypeptide darin kann ausgeführt
werden wie beschrieben in
US
4,745,051 ;
US 4,879,236 ;
US 5,155,037 ; 5,162,222;
EP 397 485 . Die Insekten-Zelllinie,
die als der Wirt verwendet wird, kann geeigneterweise eine Lepitoptera-Zelllinie sein,
wie Spodoptera frugiperda-Zellen oder Trichoplusia ni-Zellen (vgl.
US 5,077,214 ). Kulturbedingungen
können
geeigneterweise sein wie beschrieben in z. B. WO 98/01029 oder WO
89/01028, oder eine beliebige der vorstehenden Literaturstellen.
-
Die
transformierte oder transfizierte Wirtszelle, die oben beschrieben
ist, wird dann in einem geeigneten Nährmedium unter Bedingungen
kultiviert, die die Expression des vorliegenden DNA-Konstruktes
erlauben, wonach die Zellen im Screening-Verfahren der Erfindung
verwendet werden können.
Alternativ können
die Zellen gesprengt werden, wonach die Zellextrakte und- oder Überstände auf
Fluoreszenz analysiert werden können.
Das zum Kultivieren der Zellen verwendete Medium kann ein beliebiges
herkömmliches
Medium sein, das zum Wachsenlassen der Wirtszellen geeignet ist,
wie Minimal-oder Komplex-Medien, die geeignete Ergänzungsstoffe enthalten.
Geeignete Medien sind von herkömmlichen
Lieferanten erhältlich
oder können
gemäß veröffentlichter
Rezepte (z. B. in Katalogen der American Type Culture Colllection)
hergestellt werden.
-
Im
Verfahren der Erfindung kann die Fluoreszenz von mit dem DNA-Konstrukt
der Erfindung transformierten oder transfizierten Zellen geeigneterweise
in einem Spektrometer gemessen werden, bei dem die spektralen Eigenschaften
der Zellen in flüssiger
Kultur als Scans von Lichtanregung und -emission bestimmt werden
können.
Alternativ können
derartige Zellen, die man auf Nitrozellulosefiltern wachsen ließ, die auf
Platten angeordnet sind, die feste Medien enthalten, mit einer polychromatischen
Scanning-Lichtquelle bestrahlt und mit einer integrierenden Farbkamera
abgebildet werden. Die Farbe des emittierten Lichtes kann dann durch
Bildanalyse unter Verwenden spezialisierter Software bestimmt werden.
-
Die
Erfindung ist ferner in den folgenden Beispielen mit Bezugnahme
auf die beigefügten
Zeichnungen veranschaulicht, in denen
-
1 eine
Karte der pUC19-GFP-Plasmid-Konstruktion zeigt. GFP-Nukleotid-Zahlen, auf die unten
mit einem „G" Bezug genommen wird, stammen
von der GenBank-GFP-Sequenz-Registrierung (Zugangs-Nr. M62653).
Kursive Bezugsgrößen stellen
eine GFP-Sequenz dar. Die pUC19-Nukleotid-Zahlen, auf die unten
mit einem „P" Bezug genommen wird,
stammen von der GenBank-UC19-Sequenz-Registrierung
(Zugangs Nr. X02514). Bezugsgrößen in einfachem
Text repräsentieren
eine pUC19-Sequenz. Fettgedruckte Bezugsgrößen repräsentieren eine nicht-GFP-nicht-pUC19-Sequenz, die
durch PCR für
die Einführung
günstiger
Restriktionsstellen inseriert worden ist.
-
2 Karten
der vier grundliegenden GFP-CRP-Fusionskonstrukte zeigt:
- A) GFP voller Länge am N-Terminus fusioniert
mit CRP voller Länge
am C-Terminus.
- B) Verkürztes
GFP am N-Terminus fusioniert mit CRP voller Länge am C-Terminus.
- C) CRP voller Länge
am N-Terminus fusioniert mit GFP voller Länge am C-Terminus.
- D) Verkürztes
CRP am N-Terminus fusioniert mit GFP voller Länge am C-Terminus, entsprechend dem Konstrukt,
bei dem die DNA-Bindungsdomäne
von CRP durch GFP ersetzt worden ist.
-
GFP-Nukleotidzahlen,
auf die unten mit einem „G" Bezug genommen wird,
stammen von der GenBank-GFP-Sequenz-Registrierung (Zugangs-Nr. M62653).
CRP-Nukleotid-Zahlen,
auf die unten mit einem „C" Bezug genommen wird,
stammen von der GenBank-CRP-Sequenz-Registrierung (Zugangs-Nr. M13770).
Die pUC19- Nukleotidzahlen
auf die unten mit einem „P" Bezug genommen wird,
stammen von der GenBank-pUC19-Sequenz-Registrierung (Zugangs-Nr.
X02514).
-
Beispiel 1
-
Klonieren von cDNA, die
das grün
fluoreszierende Protein kodiert
-
Kurz
gesagt wurde die gesamte RNA, die aus A. victoria durch eine Standardprozedur
isoliert wurde (Sambrook et al., Molecular Cloning. 2., Herausgeber
(1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor,
New York), 7.19–7.22),
zu cDNA umgewandelt durch Verwenden der AMV-Reverse-Transkriptase (Promega,
Madison, WI, USA), wie vom Hersteller empfohlen. Die cDNA wurde
dann PCR-amplifiziert, unter Verwenden von PCR-Primern, die auf
der Basis einer zuvor veröffentlichten GFP-Sequenz
entworfen waren (Prasher et al., Gene 111 (1992), 229–233; GenBank-Zugangs-Nr. M62653),
zusammen mit der UITmaTM-Polymerase (Perkin
Elmer, Foster City, CA USA). Die Sequenzen der Primer waren: GFP2:
TGGAATAAGCTTTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTT und GFP-1: AAGAATTCGGATCCCTTTAGTGTCAATTGGAAGTCT.
-
Restriktionsendonuklease-Stellen,
die in die 5'-(eine
Hindlll-Stelle) und 3'-(EcoRI- und-BamHI-Stellen)
Primer inseriert waren, vereinfachten das Klonieren der PCR-amplifizierten GFP-cDNA
in einen leicht modifizierten pUC19-Vektor. Die Details der Konstruktion
sind wie folgt: LacZ Shine-Dalgarno AGGA, unmittelbar gefolgt von
der 5'-Hindlll-Stelle plus
einem extra T und dem GFP ATG-Codon, was die folgende DNA-Sequenz
am IacZ-Promotor-GFP-Fusionspunkt ergibt. PLacZ-AGGAAAGCTTTATG-GFP.
Am 3'-Ende der GFP-cDNA,
wurde das Basenpaar, das dem Nucleotid 770 in der veröffentlichten
GFP-Sequenz (GenBank-Zugangs-Nr. M62653) entspricht, an die EcoRI-Stelle
der multiplen-pUC19-Klonierungsstelle (MCS) durch einen mit PCR
erzeugten BamHI-, EcoRI-Linkerbereich fusioniert.
-
Beispiel 2
-
Isolierung
von Mutanten-GFPs
-
Eine
Variante von GFP mit geänderten
optischen Eigenschaften und/oder Wärmestabilität wird durch Unterziehen des
in Beispiel 1 beschriebenen GFP einer Runde chemischer Mutagenese
gefolgt von Screening möglicher
Mutanten für
geänderte
Eigenschaften hergestellt.
-
Kurz
gesagt wird die GFP-kodierende DNA-Sequenz, die in Beispiel 1 beschrieben
ist (das Hindlll-EcoRI-Fragment) mit Wärme denaturiert und chemischen
Mutagenen ausgesetzt, im wesentlichen wie beschrieben von Myer et
al, Science 229, 1985, Seite 242. Das Mutagen ist entweder salpetrige
Säure oder
Permanganat oder Ameisensäure.
Die resultierende mutierte Population von Einzelstrang-GFP-Fragmenten werden
entweder durch PCR amplifiziert unter Verwenden der in Beispiel
1 beschriebenen Primer, oder revers transkribiert durch AMV-Reverse-Transkriptase, wie
in Beispiel 1 beschrieben, vor der Amplifizierung durch PCR. Die PCR-Produkte
werden durch Restriktionsenzyme Hindlll und EcoRI gespalten und
die Produkte dieser Reaktion werden in das modifizierte pUC19-Plasmid, das
in Beispiel 1 beschrieben wird, ligiert.
-
Die
Ligationsreaktion wird in einen E. coli-Strang transformiert und
auf LB-Agar-Platten,
die 100 μg/ml
Ampicillin enthielten, ausplattiert, um annähernd 500 Transformanten pro
Platte zu ergeben. Die Fluoreszenz von GFP in den Zellen wird durch Anregen
der Platten mit einer Lichtquelle bei 398 nm oder 365 nm detektiert.
Replikas von Kolonien werden auf frischen Platten oder Platten hergestellt,
auf denen ein Nitrozellulosefilter vor der Replikation angeordnet
worden war. Wenn Kolonien wieder einmal gebildet worden sind, werden
sie individuell gesammelt und in Wasser resuspendiert. Die Zellsuspensionen
werden in einem LS50B Lumineszenz Spektrometer (Perkin Elmer Ltd.,
Beaconsfield, Buckinghamshire, England), ausgerüstet mit einem temperaturgesteuerten
Cuvettenhalter, angeordnet, und die spektralen Eigenschaften (Scans
von sowohl der Lichtanregung als auch der -emission) werden bestimmt.
Alternativ werden gesamte Platten mit annähernd 500 Transformanten mit
einer polychromatischen Scanning-Lichtquelle bestrahlt (schneller Monochromator
von T.I..L.L. Photonics, München, Deutschland)
und mit einer integrierenden RGB-Farbkamera (Photonic Science Color
Cool View) abgebildet. Die tatsächliche
Farbe des emittierten Lichts wurde durch Bildanalyse unter Verwenden der
SpecR4 Software bestimmt (Signal Analytics Corporation, Vienna,
VA, USA).
-
Die
Wärmeempfindlichkeit
des mutierten GFP wird durch Charakterisieren seiner spektralen Eigenschaften
getestet, wie oben beschrieben, nach einem sequentiellen Anstieg
der Temperatur von 20°C
auf 80°C.
-
In
einer anderen Runde der Mutagenese werden E.coli-Zellen, die das
GFP-pUC19-Plasmid, das
in Beispiel 1 beschrieben ist, enthalten, einer Behandlung mit N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin
bei einer Konzentration von 25 mg pro Liter 18 Stunden lang unterzogen,
und die Zellen werden ausplattiert und analysiert wie oben beschrieben.
Alternativ werden zuerst Plasmide von den behandelten Zellen wiedergewonnen
und in E.coli transformiert und ausplattiert und analysiert wie
oben beschrieben.
-
Beispiel 3
-
Konstruktion
einer auf GFP-basierenden rekombinanten cAMP-Sonde
-
Die
Basis der auf GFP basierenden rekombinanten cAMP-Sonde, die hier
beschrieben wird, ist die Fusion eines Teils des cAMP-Rezeptorproteins (CRP)
von E.coli an GFP.
-
Es
wurde entschieden, vier grundlegende GFP-CRP-Fusionskonstrukte herzustellen,
von denen eine gesamte Reihe von halb-willkürlichen Fusionskonstrukten
erzeugt werden kann, wobei von einigen davon erwartet wird, dass
sie die Fähigkeit
haben, Konformationsänderungen
in GFP zu induzieren, wenn cAMP an den N-termalen Teil von CRP gebunden
wird, was zu detektierbaren Änderungen
in den optischen Eigenschaften von GFP führt.
-
1. Beschreibung
der vier grundlegenden GFP-CRP-Fusionen
-
Das
Plasmid, das die GFP-CRP-Fusion, die in 2A)
gezeigt ist, enthält,
wurde auf dem folgenden Weg konstruiert: das CRP-Insert des Plasmids pHA7
(Aiba et al, Nucl. Acids Res. 10 (1982) 1345–1377) wurde mit PCR amplifiziert
mit dem PCR-Primern
CRP1(CGATACAGATCTAAGCITTATGGTGCTTGGCAAACCGC) und CRP-2(CGGAATTCTTAAAAGCTTAGATCTTTACCGTGTGCGGAGATCAG),
gefolgt von Verdauen mit den Restriktionsendonucleasen Bglll und
EcoRI. Das GFP-Insert des Plasmids pUC19-GFP (siehe Beispiel 1)
wurde mit PCR amplifiziert unter Verwenden der PCR-Primer GFP2 (siehe
Beispiel 1) und GFP-4(GAATCGTAGATCTTTGTATAGTTCATCCATGCCATG), gefolgt
von Verdauen mit den Restriktionsendonucleasen Hindlll und Bglll.
Nachfolgend wurde in einer drei-teiligen Ligation das Bglll/EcoRI-Fragment
der mit PCR amplifizierten CRP-DNA und das Hindlll/Bglll-Fragment
der mit PCR amplifizierten GFP-DNA mit einem Hindlll/EcoRI-Vektorfragment des
in Beispiel 1 beschriebenen leicht modifizierten pUC19-Plasmids
ligiert, gefolgt von Transformation des E.coli.
-
Das
Plasmid, das die GFP-CRP-Fusion enthielt, die in 2B)
gezeigt ist, wurde im wesentlichen wie oben beschrieben für das 2A) -Plasmid mit einer einzelnen Modifikation
konstruiert:
Der PCR-Primer GFP-3(GAATCGTAGATCTTTGACTTCAGCACGTGTCTTGTA)
wurde anstelle des GFP-4 PCR-Primers verwendet.
-
Das
Plasmid, das die in 2C) gezeigte CRP-GFP-Fusion
enthielt, wurde durch PCR-Amplifikation des CRP-Inserts des Plasmids
pHA7 mit PCR-Primern CRP1 und CRP-2, gefolgt von Verdauen mit Restriktionsendonuklease
Hindlll und Ligation in die Hindlll-Stelle des Plasmids pUC19-GFP
(siehe Beispiel 1) hergestellt.
-
Das
Plasmid, das die in 2D) gezeigte GFP-CRP-Fusion
enthielt, wurde im wesentlichen wie oben für das 2C)
-Plasmid mit einer einzelnen Modifikation konstruiert: Der PCR-Primer
GFP-1(CCAGTTAAGCTTAGATCTTCCGGGTGAGTCATAGCGTCTGG)
wurde anstelle des CRP-2 PCR-Primers verwendet.
-
2. Erzeugung
von halb-willkürlichen
GFP-CRP-Fusionen
-
Die
4 grundlegenden GFP-CRP-Fusionsplasmide, die oben beschrieben sind,
werden mit der Restriktionsendonuklease Bglll (Öffnen der Plasmide an GFP-CRP-Fusionspunkten) verdaut,
gefolgt von Behandlung mit der doppelstrangigen Exonuclease Bal31
für 1 Minute,
2 Minuten, 3 Minuten etc. bis zu 20 Minuten (vgl. Sambrook et al,
op., cit. bei 15.24). Nachfolgend wird die mit Bal31-behandelte
DNA mit der T4 DNA-Polymerase (vgl. Sambrook et al, op. cit. bei
15.24) inkubiert, um stumpfe Enden zu erzeugen, gefolgt von Selbstligation
(im wesentlichen wie beschrieben durch Sambrook of al op. cit bei
1.68). Schließlich
wird die selbst-ligierte Bal31-behandelte Plasmid-DNA in E.coli
transformiert.
-
3a. Screening der CRP-GFP-Fusionen
nach cAMP-induzierfen Änderungen
in der Fluoreszenz
-
E.coli-Transformanten,
die eine der vier grundlegenden CRP-GFP-Fusionen oder eine der halb-willkürlichen
GFP-CRP-Fusionen exprimieren, lässt
man über
Nacht in 2ml Luria-Bertani-Medium mit zugebenem Ampicillin (100 μg/ml) wachsen.
Die Zellen werden dann durch Zentrifugation pelletiert, gefolgt
von Resuspension in 0,5 ml Lyse-Puffer (100 mM NaCl, 1 mM EDTA und
50 mM Tris pH 8,0). Nachfolgend werden 25 μl 10 mg/ml Lysozym zu den resuspendierten
Zellen gegeben, gefolgt von Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur,
kräftigem Verwirbeln
und Zentrifugation für
5 Minuten bei 20000 × g.
Schließlich
werden Emissions- und Anregungsspektren für die resultierenden Proteinextrakte (die Überstände) aufgenommen
durch Verwenden des LS50B Lumineszenzspektrometers und das FL Data
Manager-Software-Paket (beide von Perkin Elmer Ltd., Beaconsfield, Buckinghamshire,
England). Die Spektren, die vor, wie auch nach der Zugabe von cAMP
auf eine Endkonzentration von 0,5 mM aufgenommen wurden, werden
durch Verwenden des Graph Builder-Software-Paketes (Perkin Elmer)
verglichen. Die CRP-GFP-Fusionen, die cAMP-induzierte Änderungen
in der Fluoreszenz zeigen, werden weiter durch Expression in Säugerzellen
untersucht.
-
3b. (alternatives Protokoll)
Screening der CRP-GFP-Fusionen nach cAMP-induzierten Änderungen in der Fluoreszenz.
-
Gehalte
von zyklischem AMP in E.coli-Zellen variieren gemäß der bereitgestellten
Kohlenstoffquelle; siehe z. B. Epstein et al (1975) Proc.Natl.Acad.Sci.USA
72, Seiten 2300–2304
und Botsford und Harman (1992), Microbiological Reviews 56, Seiten
100–122.
Zum Beispiel enthalten Zellen, die auf Glucose gewachsen sind, einen
niedrigeren Gehalt von cAMP als Zellen, die auf z. B. Glycerol gewachsen
sind. Außerdem ändert das
Verschieben von Zellen von einer Kohlenstoffquelle zu einer anderen
oder die Zugabe von Glucose zu einer Kultur, die auf einer Nicht-Glukose-Kohlenstoffquelle gewachsen
ist, den cAMP-Gehalt der Zellen. Daher kann die cAMP-induzierte Änderung
in der Fluoreszenz der CRP-GFP-Fusionen durch kontinuierliches Messen
der Fluoreszenz von Zellen, die die Fusionen exprimieren, bestimmt
werden, nach dem Transfer von Medium, das z.B. Glycerol als Kohlenstoff
enthält,
zum Medium, das 0,2% Glucose enthält. Die Zellen werden in flüssiger Kultur
im LS50B Lumineszenzspektrometer analysiert, oder durch sie wachsen
lassen auf Nitrocellulosefiltern, die auf Platten mit festen Medien
angeordnet sind; die Filter werden von Platten mit einem Typ Medium
zu Platten mit einem anderen Typ Medium transferiert und die Fluoreszenz
wird kontinuierlich überwacht,
durch Anregen der Platten mit einer polychromatischen Scanning-Lichtquelle
(schneller Monochromator von T.I.L.L. Photonics, München, Deutschland)
und Sammeln von Farbbildern mit einer integrierenden RGB-Farbkamera
(Photonic Science Color Cool View). Die tatsächliche Farbe des emittierten
Lichtes wird durch Bildanalyse unter Verwenden des Spec R4-Software-Paketes
(Signal Analytics Corporation, Vienna, VA, USA) bestimmt.
-
Beispiel 4
-
Konstruktion
einer auf GFP basierenden rekombinanten Sonde für Proteinkinase-Aktivität
-
Beschreibung der auf GFP
basierenden rekombinanten Proteinkinase C (PKC)-Substrate
-
Untersuchungen
der Substratspezifität
der verschiedenen PKC-Isoformen unter Verwenden synthetischer Peptide
haben gezeigt, dass Peptide, die das Motiv XRXXSXRX (wobei S die
phosphorylierte Aminosäure
ist) enthalten, dazu neigen, die besten Substrate für PKC zu
sein (wie im Überblick geschildert
in Kemp., B.E. und Pearson, R.B. (1990) TIBS 15. Sept., 342–346). Außerdem besitzt
das natürlich
auftretende neuronale PKC-Substrat GAP-43 die folgende Aminosäuresequenz
um den phosphorylierten Serinrest (unterstrichen): AATICIQASFRGHIT (Kosik, K.S et al.
(1988) Neuron 1, 127–132).
Auf der Basis dieser Daten haben wir das vermeintliche PKC-Erkennungsmotiv
RQASFRS für die Insertion in GFP an verschiedenen
Positionen ausgewählt.
Insertionspunkte wurden auf der Basis der Oberflächenwahrscheinlichkeit ausgewählt (berechnet
unter Verwenden des GCG-Softwarepaketes,
das eine Formel einsetzt von Emini et al. (1985) J. Virol., 55(3),
836–839),
leicht modifiziert für
die Endwerte der Proteinketten. Die einzelnen Wahrscheinlichkeiten
werden Janin et al. (1987) J. Mol. Biol. 125, 357–386 und/oder
der Nachbarschaft des GFP-Chromphors entnommen. Das Heptapeptid wird
in GFP durch PCR an den folgenden Positionen inseriert:
Zwischen
Aminosäure
(aa) 39 und aa 40 (PCR-Primer PKC-1:
GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGGTATGTTGCATCACCTTCACC
und
PKC1:
GATACCAAAGATCTGGAAAACTTACCCTTAAATTT),
zwischen
aa 52 und aa 53 (PCR-Primer PKC-2:
GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGTTTTCCAGTAGTGCAAATAAA
und
PKC2:
GATACCAAAGATCTCTACCTGTTCCATGGCCAACAC),
zwischen
aa 71 und aa 72 (PCR-Primer PKC-3:
GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGAAAGCATTGAACACCATAAGA
und
PKC3:
GATACCAAAGATCTTCAAGATACCCAGATCATATG),
zwischen
aa 79 und 80 (PCR-Primer und PKC-4:
GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGTTTCATATGATCTGGGTATCT
und
PKC4:
GATACCAAAGATCTCAGCATGACTTTTTCAAGAGT),
zwischen
aa 107 und 108 (PCR-Primer PKC-5:
GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGCTTGTAGTTCCCGTCATCTTT
und
PKC5:
GATACCAAAGATCTACACGTGCTGAAGTCAAGTTT),
zwischen
aa 129 und 130 (PCR-Primer PKC-6:
GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGATCAATACCTTTTAACTCGAT
und
PKC6:
GATACCAAAGATCTTTTAAAGAAGATGGAAACATT),
zwischen
aa 164 und 165 (PCR-Primer PKC-7:
GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGGTTAACTTTGATTCCATTCTT
und
PKC7:
GATACCAAAGATCTTTCAAAATTAGACACAACATT)
und
zwischen aa 214 und 215 (PCR-Primer PKC-8:
GATACCAAAGATCTGAAAGAAGCTTGTCGCTTTTCGTTGGGATCTTTCGA
und
PKC8:
GATACCAAAGATCTAGAGACCACATGGTCCTTCTT).
-
Die
PCR-Primer wurden auf folgende Weise entworfen: Reverse-Primer:
5'-GATACCAA AGA TCT
GAA AGA AGC TTG TCG-3' +
21 Nukleotide des Gegensinn-Stranges
(stromaufwärts
des zweiten erwähnten
aa) und Vorwärts-Primer:
5'-GATACCAA AGA TCT-3' + 21 Nukleotide
des Sinn-Stranges (stromabwärts
des ersten aa), wobei jeder PCR-Primer mit einer einzelnen Bglll-Stelle
versehen ist (was zu den Arginin- und Serin-Resten auf dem Heptapeptid
Anlass gibt). Die PKC-Stelle wird durch PCR der pUC19-GFP-Plasmid-DNA
(siehe Beispiel 1) mit den acht Vorwärts-Primern und den acht übereinstimmenden
Reversen-Primern inseriert, gefolgt von Verdauen mit Bglll, Selbst-Ligation
und Transformation von E.coli (vgl. Sambrook et al., op. cit.).
-
2. Screenen der auf GFP
basierenden rekombinanten PKC-Substrate nach durch Phosphorylierung
induzierten Änderungen
in der Fluoreszenz.
-
E.coli-Transformanten,
die eines der acht auf GFP basierenden rekombinanten PKC-Substrate exprimieren,
ließ man über Nacht
in zwei ml Luria-Bertani-Medium mit zugegebenem Ampicillin (100 μg/ml) wachsen.
Die Zellen werden dann durch Zentrifugation pelletiert, gefolgt
von Resuspension in 0,5 ml Lyse-Puffer (100 mM NaCl, 1 mM EDTA und
50 mM Tris pH 8,0). Nachfolgend werden 25μl 10 mg/ml Lysozym zu den resuspendierten
Zellen gegeben, gefolgt von Inkubation für 10 Min. bei Raumtemperatur,
kräftigem
Verwirbeln und Zentrifugation für
5 Min. bei 20000 × g.
Schließlich
werden Emissions- und Anregungsspektren für die resultierenden Proteinextrakte (die Überstände) unter
Verwenden des LS50B Lumineszensspektrometers und des FL Data Manager-Softwarepaketes
(Perkin Elmer) aufgenommen. Die aufgenommenen Spektren vor, wie
auch nach der Behandlung der Extrakte mit gereinigtem PKC (Promega,
Madison, WI, USA) gemäß der Anweisung
des Herstellers, werden durch Verwenden des Graph Builder-Softwarepaketes (Perkin
Elmer) verglichen. Die auf GFP basierenden rekombinanten PKC-Substrate,
die durch Phosphorylierung induzierte Änderungen in der Fluoreszenz
zeigen, werden weiter durch Expression in Säugerzellen untersucht.
-
Beispiel 5
-
Charakterisierung
der rekombinanten Fusionssonden in Säugerzellen
-
Die
CRP-GFP-Fusionen (Beispiel 3), die cAMP-induzierte Änderungen
in der Fluoreszenz zeigen, wie auch die auf GFP basierenden rekombinaten
PKC-Substrate, die
durch Phosphorylierung induzierte Änderungen in der Fluoreszenz
zeigen, werden weiter durch Expression in Säugerzellen untersucht.
-
Inserts
der entsprechenden Plasmide werden durch Verdauen mit den Restriktionsendonukleasen
Hindlll und BamHI isoliert und in die Hindlll- und BamHI-Stellen des MCS des
Säuger-pREP4-Vektors ligiert
(Invitrogen, San Diego, Kalifornien, USA). Nachfolgend werden Baby
Hamster Kidney (BHK) mit den resultierenden Plasmidkonstrukten gemäß des Kalzium-Phosphat-DNA-Präzipitat-Standardprotokolls
(vgl. Sambrook et al., op. cit. bei 16.33–16.35) transfiziert. Stabile
Transfektanten mit einer starken Expression der rekombinanten Sonden
werden identifiziert und kloniert nach 6 bis 14 Tagen in Kultur durch
Quantifizieren der Fluoreszenz in einem Bildanalysesystem, das aus
einem Nikon-Diaphot 200-Mikroskop
mit einer Temperatur-gesteuerten Bühne, einer CCD-Kamera mit langsamen
Scan (T.I.L.L. Photonics), einer polychromatischen Lichtquelle (T.I.L.L. Photonics),
und einem auf einem PC basierenden Bildanalyse-Softwarepaket (FUCAL
von T.I.L.L. Photonics) besteht. Alternativ werden die Fluoreszenzeigenschaften
in einem auf einem Photometer basierenden System überwacht.
In diesem System wird die CCD-Kamera durch einen Photovervielfacher D104
(PTI, Kanada) ersetzt.
-
Die
Klone werden für
ein paar Tage in Deckglaskammern (NUNC, Kopenhagen, Dänemark)
vor der Bildanalyse kultiviert.
-
Die
Fähigkeit
der Klone, Änderungen
in cAMP zu detektieren, wird durch Erhöhen des intrazellulären cAMP-Gehaltes
durch Challenging der Zellen mit Forskolin (0,1–10 μM) oder Dibutyryl-cAMP (1–100 μM) und Überwachen
der damit zusammenhängenden Änderung
spektraler Eigenschaften charakterisiert. Auf ähnliche Weise werden Klone,
die für
Variationen in der PKC-Aktivität
empfindlich sind, durch Aktivieren von PKC darin mit PMA (Phorbol
12-myristat 13-acetat) (10–1000
nM) oder OAG (1-Oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol) (1–100 μM) charakterisiert. Die durch
das Stimulans induzierten Änderungen
der Fluoreszenzeigenschaften werden kontinuierlich unter Verwenden
des oben erwähnten Bildgebungssystems überwacht.
Kombinieren der Bildgebung mit Photometrie macht es möglich, die Reaktion
der rekombinanten Sonden in sowohl hoher räumlicher als auch hoher zeitlicher
Auflösung
zu charakterisieren.
-
Beispiel 6
-
GFP als eine rekombinante
Sonde für
Proteinkinase-Aktivität
-
Die
Reinigung von GFP von E. coli-Zellen, die GFP exprimieren E.coli-Zellen,
die ein Plasmid enthalten, das die Expression von GFP ermöglicht, ließ man über Nacht
bei 24°C
wachsen. Zellen wurden pelletiert, der Überstand wurde entladen und
das Pellet wurde in 1/20 des ursprünglichen Volumens in 100 mM
Natriumphosphatbuffer (pH 8,0) resuspendiert. Die Zellen wurde durch
Beschallen gesprengt, und die Zelltrümmer wurden bei 12000 g 20
Minuten lang pelletiert. Der Überstand
wurde wiedergewonnen, Ammoniumsulfat wurde auf eine Endkonzentration
von 1,5 M zugegeben, und die resultierende Lösung wurde einer Chromatographie
hydrophober Wechselwirkung unterzogen durch sie Aufbringen auf eine
Phenyl-SepharoseCL-4B-Säule,
die mit 1,5 M Ammoniumsulfat ins Gleichgewicht gebracht war. Die
Säule wurde
mit Wasser eluiert und Fraktionen, die GFP enthielten, wurden durch
grüne Fluoreszenz identifiziert,
wenn sie mit UV-Licht von 365 nm bestrahlt wurden. Zu GFP-enthaltenden
Fraktionen wurde ein Volumen 20 mM Tris, NCl (pH 7,5) zugegeben,
und diese wurden einer Anionen-Austauschchromatographie
durch Aufbringen auf eine Q-Sepharose-Säule unterzogen. Die Säule wurde
mit 20 mM Tris, HCl (pH 7,5) + 1,0 M NaCl eluiert. GFP-enthaltende
Fraktionen wurden durch grüne
Fluoreszenz identifiziert, wenn sie mit UV-Licht von 365 nm bestrahlt
wurden. GFP-enthaltende Fraktionen wurden Gelfiltration unterzogen,
durch sie Aufbringen auf eine Superose-12-Säule, die mit 100 mM Na-Phosphatbuffer
(pH 8,0) ins Gleichgewicht gebracht war. Die Säule wurde mit 100 mM Na-Phosphatbuffer
(pH 8,0) eluiert und Fraktionen, die GFP enthielten, wurden durch
grüne Fluoreszenz
identifiziert, wenn sie mit UV-Licht von 365 nm bestrahlt wurden.
Das resultierende GFP-Präparat
war mehr als 95 % rein, wie durch HPLC-Analyse beurteilt.
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In-vitro-GFP-Phoshorylierungs-Assay
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Für eine in-vitro-Phosphorylierung
von GFP wurde μg
Wild-Typ-GFP (gereinigt wie oben beschrieben) in 40 mM Tris, pH
7,4, 20 mM MgOAc und 0,2 mM ATP (alle von Sigma, St. Louis, MO,
USA) 1 bis 60 Minuten lang bei 37°C
mit 0–20
Casein-Einheiten
der katalytischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase (Promega,
Madison, WI., USA) und 0–200 μM cAMP-abhängige. Proteinkinase-Inhibitor inkubiert.
Emissions-(Anregungswellenlänge 395
nm oder 470 nm) und Anregungs-(Emissionswellenlänge 508 nm) Spektren wurden
für alle
Proben unter Verwenden des LS50B Lumineszenzspektrometers und des
FL data Manager-Softwarepaketes
(Perkin Elmer) aufgenommen. Die Spektren wurden nachfolgend unter
Verwenden des Graph Bilder-Softwarepakets (Perkin Elmer) verglichen.
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Wie
aus 3 gesehen werden kann, steigt die Fluoreszenzintensität von Wild-Typ-GFP annähernd zweifach,
wenn es mit der katalytischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase
inkubiert wird. Außerdem
inhibiert 5 μm
cAMP-abhängiger
Proteinkinaseinhibitor den Effekt der katalytischen Untereinheit
der cAMP-abhängigen Proteinkinase.
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3 zeigt
Emissionspektren von 0.5 μg Wild-Typ-GFP
(gereinigt wie beschrieben in Beispiel 6) in 40 mM Tris, pH 7,4,
20 mM MgOAc und 0,2 mM ATP (alle von Sigma), inkubiert für 5 Minuten
bei 37°C
mit 10 Caseineinheiten der katalytischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase
(Promega) mit oder ohne 5 μm
cAMP-abhängigem
Proteinkinaseinhibitor (PKI). Die Kontrolle (w/o PKA) wurde 5 Minuten
lang bei 37°C
ohne die katalytische Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase inkubiert. Die
Anregungswellenlänge
betrug 395 nm. RFI in der Figur bedeutet relative Fluoreszenzintensität.
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Beispiel 7
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Charakterisierung
von Wild-Typ-GFP als eine PKA-Aktivitäts-Sonde in Säugerzellen
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Die
grün fluoreszierenden
Proteine, die Phosphorylierungs-induzierte Änderungen in der Fluoreszenz
zeigen, werden weiter durch Expression in Säugerzellen untersucht.
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Inserts
der entsprechenden Plasmide werden durch Verdauen mit den Restriktionsendonukleasen
Hindlll und BamHI isoliert und in die Hindlll- und BamHI-Stellen des MCS des
Säuger-pZEO-SV-Vektors
ligiert (Invitrogen, San Diego, Kalifornien, USA). Nachfolgend werden
Baby Hamster Kidney (BHK) mit den resultierenden Plasmidkonstrukten
gemäß des Kalziumphosphat-DNA-Präzipitat-Standardprotokolls
(vgl. Sambrook et al., op. cit. bei 16.33–16.35) transfiziert. Stabile
Transfektanten mit hoher Expression der rekombinanten Sonden werden
identifiziert und nach 6 bis 14 Tagen in Kultur kloniert, durch Quantifizieren
der Fluoreszenz in einem Bildanalysesystem, das aus einem Nikon-Diaphot
200-Mikroskop mit einer Temperatur-gesteuerten Bühne, einer CCD-Kamera mit langsamen
Scan (T.I.L.L. Photonics), einer polychromatischen Lichtquelle (T.I.L.L. Photonics)
und einem auf einem PC basierenden Bildanalyse-Softwarepaket (FUCAL
von T.I.L.L. Photonics) besteht. Alternativ werden die Fluoreszenzeigenschaften
in einem auf einem Photometer basierendem System überwacht.
In diesem System wird die CCD-Kamera
durch einen Photovervielfacher D104 (PTI, Kanada) ersetzt.
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Die
Klone werden für
ein paar Tage in Deckglaskammern (NUNC, Kopenhagen, Dänemark)
vor der Bildanalyse kultiviert.
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Die
Fähigkeit
der Klone, Änderungen
in der Aktivität
der Proteinkinase A zu detektieren, wird durch Erhöhen des
intrazellulären
cAMP-Gehaltes durch Challenging der Zellen mit Forskolin (0,1–10 μM) oder Dibutyryl-cAMP
(1–100 μM) und Überwachen
der damit zusammenhängenden Änderung spektraler
Eigenschaften charakterisiert. Die durch Stimulans induzierten Änderungen
der Fluoreszenzeigenschaften werden kontinuierlich unter Verwenden
des oben erwähnten
Bildgebungssystemes überwacht.
Kombinieren der Bildgebung mit Photometrie macht es möglich, die
Reaktion der rekombinanten Sonden in sowohl hoher räumlicher
als auch hoher zeitlicher Auflösung
zu charakterisieren.