PT1238283E - Ensaios de modulares e receptores activados por proteases (par) - Google Patents

Description

ΡΕ1238283 1 DESCRIÇÃO "ENSAIOS DE MODULADORES DE RECEPTORES ACTIVADOS POR PROTEASES (PAR)"

Campo Técnico O presente invento refere-se a ensaios para moduladores de receptores activados por proteases, úteis nos campos da trombogénese, neurobiologia, oncologia, osteoporose e mobilidade dos intestinos.

Introdução O receptor da trombina (receptor activado por protease-1, PARI; Nystedt et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 9208-9212, 1994) é o membro protótipo de uma família de receptores de sete domínios transmembranares acoplados à proteína G, designados receptores activados por proteases (PARs), compreendendo actualmente quatro membros identificados tanto em ratinho como em humano, alguns dos quais foram também identificados em vários outros vertebrados (Nystedt et al., 1994; Nystedt et al., J. Biol. Chem. 270: 5950-5955, 1995; Ishihara et al., Nature 386: 502-506, 1997; Kahn et al., Nature 394: 690-694, 1998; Vu et al., Cell 64: 1057-1068, 1991; Bohm et al., Biochem J. 314 (Pt 3): 1009-1016, 1996; Xu et al., Proc. Natl. Acad. 2 ΡΕ1238283

Sei. USA 95: 6642-6646, 1998; Rasmussen et al.r FEBS Lett. 288: 123-128, 1991; Zhong et ai., J. Biol. Chem. 267: 16975-16979, 1992; Saifeddine et al., Br. J. Pharmacol. 118: 521-530, 1996,; Gerszten et al., Nature 368: 648-651, 1994. A trombina cliva o PARI humano a seguir a Arg41, conduzindo a um novo terminal N que desencadeia intramolecularmente a activação do receptor (Vu et al., 1991) . De modo semelhante, outros membros da família PAR são activados através da clivagem por proteases. A activação do PARI pode também ser alcançada através da aplicação de péptidos activadores do receptor de trombina (TRAPs) que imitam o terminal N gerado pela clivagem da trombina (Vu et al., 1991). Os PARs podem ser assim considerados como receptores peptídicos que possuem o seu próprio ligando que é desmascarado após clivaqem proteolítica.

Os PARs foram implicados em vários processos biológicos. O tratamento com trombina ou TRAP causa retraeção de neurites em células de neuroblastoma em cultura (Gurwitz e Cunningham, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 3440-3444, 1988; Suidan et al., Neuron 8: 363-375, 1992) e a reversão do estrelamento bem como da proliferação de astrócitos (Cavanaugh et al., J. Neurochem. 54: 1735- 1743, 1990; Grabham e Cunningham, J. Neurochem. 64: 583- 591, 1995; Loret et al., J. Biol. Chem. 264: 8319-8327, 1989; Nelson e Siman, Brain Res. Dev. Brain Res. 54: 93- 3 ΡΕ1238283 104, 1990; Pindon et al., Eur. J. Biochem. 255: 766-774, 1998; Suidan et al., Glia 21: 244-25, 1997; Perraud et al., Int. J. Dev. Neurosci. 5: 181-188, 1987). Pequenas quantidades de trorabina aumentam a sobrevivência de neurónios e astrócitos do hipocampo confrontados mas doses elevadas da protease causam apoptose neuronal, sugerindo um papel modulador para PARI na morte celular programada (Vaughan et al., J. Neurosci. 15: 5389-5401, 1995; Smith-Swintosky et al., J. Neurosci. 15: 5840-5850, 1995). O bloqueio da activação de PARI com um anticorpo dirigido contra o terminal N recentemente criado antagoniza a activação de plaquetas induzida por trombina (Hung et al., J. Cell Biol. 116: 827-832, 1992; Brass et al., J. Biol. Chem. 267: 13795-13798, 1992) bem como a resposta de retracção de neurites de células de neuroblastoma (Suidan et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 8112-8116, 1994). PARI é altamente expressa em linhas celulares de cancro humano e biopsias, indicando o seu envolvimento no comportamento mitogénico e metastático de células tumorais (Even-Ram et al., Nat. Med. 4: 909-914, 1998; Kaufmann et al., Câncer 80: 2068-2074, 1997; Kaufmann et al., Neuroreport 9: 709-712, 1998a; Nierodzik et al., Blood 92: 3694-3700, 1998. Enquanto que a activação de PARI estimula a síntese de ADN em células cancerígenas Hep2-2g (Kaufmann, et al., 1997), a activação de PAR2 conduz a uma diminuição na síntese de ADN nas células tumorais pancreáticas humanas MIA PaCa-2 (Kaufmann et al., Int. J. Pancreatol. 24: 97-102, 1998b). PARI medeia a activação das plaquetas humanas, enquanto que as plaquetas derivadas de ratinho são activadas por PAR3 (Ishihara et al., 1997). Níveis baixos 4 ΡΕ1238283 de PAR4 foram detectados como um segundo receptor sensível à trombina em plaquetas (Kahn et al., 1998; Xu et ai., 1998). PARI pode ser clivada e activada através de trombina, tripsina, plasmina, granzima A e possivelmente também através de proteína C activada (Ishihara et al., 1997; Vu et al., 1991; Suidan et al., 1994; Parry et al., Biochem. J. 320: 335-341, 1996). Em contraste, a clivagem de PARI através de catepsina G, quimotripsina, elastase de leucócitos ou mieloblastina (proteinase 3) remove o local de clivagem da trombina, indicando um papel para estas proteases na activação do receptor (Vu et al., 1991; Parry et al., 1996; Molino et al., J. Biol. Chem. 270: 11168-11175, 1995; Renesto et al., Blood 89: 1944-1953, 1997), uma vez que a clivagem num local alternativo produz um novo terminal N inactivo na transdução do sinal. PAR2 difere de outros membros conhecidos da família PAR por conter um local de clivagem susceptível a serina-proteases tais como tripsina, triptase de mastócitos e acrosina (Nystedt et al., 1994; Molino et al., J. Biol. Chem. 272: 4043-4049, 1997a; Fox et al., FEBS Lett. 417: 267-269, 1997). O activador fisiológico de PAR2 em enterócitos é muito provavelmente a tripsina (Kong et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 8884-8889, 1997), enquanto que noutros tecidos os activadores de PAR2 são largamente desconhecidos.

Em resumo, foram efectuados estudos detalhados para identificar proteases que são capazes de activar ou inactivar PARI (Vu et al., 1991; Parry et al., 1996; Molino 5 ΡΕ1238283 et al., 1995; Renesto et al., 1997; Ishii et al., J. Biol. Chem. 270: 16435-16440, 1995); no entanto, sabe-se pouco para PAR2 (Nystedt et al., 1994; Molino et al., 1997a; Fox et al., 1997; Molino et ai., J. Biol. Chem. 272: 11133-11141, 1997b), PAR3 (Ishihara et ai., 1997) ou PAR4 (Kahn et ai., 1998; Xu et ai., 1998).

Os ensaios de clivagem e activação de PAR basearam-se anteriormente na análise de produtos de clivagem purificados resultantes da acção de proteases em substratos peptidicos solúveis baseados no local de clivagem de PAR (Ishii, K., j. Biol. Chem. 270: 16435-16440, 1995) ou na medição da libertação de 45Ca2+ desencadeada pela activação por proteases de PARs microinjectadas em oócitos de Xenopus (Vu et al., 1991). WO 9818456 e Ishii, K. et al., J. Biol. Chem. 268: 9780-9786, 1993, descrevem métodos para estudo da clivagem por trombina de PARI ou PAR3 através da detecção da ligação do anticorpo Ml a PAR marcado com epitopo expresso à superfície celular de células COS-7 ou Rat-1 antes e após o tratamento de trombina. Estes métodos são bastante demorados, insensíveis e não são particularmente sujeitos a metodologias de elevado rendimento. Adicionalmente, o ensaio de sinalização de Ca2+ não considera proteases que afectem a sinalização de Ca2+ de um modo independente da activação de PAR. São necessários ensaios que permitam a identificação de proteases que clivam PARs e a caracterização da especificidade da protease para melhor delinear o importante papel biológico dos PARs. 6 ΡΕ1238283

SUMÁRIO DO INVENTO

De acordo com o presente invento, proporcionamos um método de identificação ou detecção de uma molécula que cliva um PAR compreendendo os passos de: (a) proporcionar um péptido de clivagem de PAR imobilizado ligado a uma molécula repórter; (b) colocar o péptido de clivagem de PAR imobilizado em contacto com uma molécula que cliva PAR; e (c) detectar a molécula repórter libertada. A molécula repórter proporciona de preferência um sinal amplificável, tal como no caso em que a molécula repórter é uma enzima repórter. 0 método é útil na identificação de activadores e inactivadores de PAR, bem como de moduladores da activação de PAR. 0 presente invento proporciona também estojos compreendendo uma proteína de fusão de PAR, em que a referida proteína de fusão de PAR é imobilizada num suporte sólido para utilizar nos métodos do invento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1. A Desenho esquemático de um plasmídeo para a produção de uma proteína de fusão GPAR1 biotinilada em E. coli. BAD, domínio aceitador da biotina; BirA, biotina-holoenzima-sintetase. B Extremidades C-terminais das proteínas de fusão GPAR. Letras minúsculas, ligadores; letras maiúsculas, fragmentos do domínio N-terminal extracelular de PAR; letras em itálico, etiquetas de afinidade; letras a cheio e seta, resíduo do local de activação. 7 ΡΕ1238283

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO É proporcionado um método sensível para a detecção de proteases que são capazes de clivar receptores activados por proteases (PARs). Os ensaios permitem a detecção de proteases que clivam os domínios extracelulares dos PARs em quantidades mínimas de amostras biolóqicas, uma vantaqem muito relevante para ensaios clínicos. Os ensaios podem também ser utilizados para fins de pesquisa e permitem ao praticante detectar e caracterizar actividades proteásicas presentes em pequenas quantidades, mas contudo concentrações biologicamente relevantes para os efeitos biológicos mediados por PARs. Adicionalmente, pode ser concebido um substrato de protease mais natural que os anteriormente utilizados para ensaios de clivagem de PAR. Assim, o método é útil para a análise da regulação proteolítica de PARs e para pesquisar moduladores de PARs.

Num aspecto do invento, é proporcionado um método de identificação ou detecção de uma molécula que cliva PAR, compreendendo o método os passos de: a) proporcionar um péptido de clivagem de PAR imobilizado ligado a uma molécula repórter; b) colocar o péptido de clivagem de PAR imobilizado em contacto com uma molécula que cliva PAR; e c) detectar a molécula repórter libertada.

Tal como aqui se utiliza, o termo "receptor activado por proteases" ou "PAR" é utilizado para englobar ΡΕ1238283 uma proteína da superfície das células eucarióticas que pode ser especificamente activada por uma protease e que pode sinalizar a cascata apropriada de acontecimentos biológicos (e.g., hidrólise da fosfoinositido, efluxo de Ca2+ ou agregação de plaquetas). Uma molécula que cliva PAR pode ser qualquer molécula capaz de clivar PAR, tal como uma protease específica de um local cuja função é activar (ou inactivar) um PAR num sistema biológico. 0 termo "péptido de clivagem de PAR" tal como aqui se utiliza significa um péptido ou polipéptido compreendendo um exodomínio amino-terminal de PAR ou um fragmento deste, e compreendendo o local de clivagem da protease endógena que activa (ou inactiva) o PAR. Por exemplo, o PARI de ratinho e humano é clivado pela trombina a seguir a Arg41. Três aminoácidos directamente a montante (N-terminais a, na sequência natural) de Arg41 seguidos por Arg são minimamente necessários para detectar a presença de um activador da protease de PARI (VNPR) . 0 PAR2 de ratinho é clivado a seguir a Arg38. Três aminoácidos directamente a montante de Arg38 seguidos por Arg são minimamente necessários para detectar a presença de um activador da protease de PAR2 de ratinho (SKGR) . 0 PAR3 de ratinho é clivado a seguir a Lys37. Três aminoácidos directamente a montante de Lys37 seguidos por Lys são minimamente necessários para detectar a presença de um activador da protease de PAR3 (LTIK). 0 PAR4 humano é clivado a seguir a Arg47. Três aminoácidos directamente a montante de Arg47 seguidos por Arg são minimamente necessários para detectar 9 ΡΕ1238283 a presença de um activador da protease do PAR4 humano (PAPR). De forma semelhante, para outros PARs e para a detecção de inactivadores da protease, os quatro amino-ácidos N-terminais ao local de clivagem são minimamente incluídos no péptido de clivagem de PAR para detecção de uma protease.

Tipicamente, são incluídos mais aminoácidos no péptido de clivagem de PAR, em particular, sequências do domínio extracelular de PAR a jusante do local de clivagem. Por exemplo, para a detecção de trombina utilizando PARs sensíveis à trombina, é preferida a inclusão da "sequência semelhante a hirudina", GDEee, onde a "sequência semelhante a hirudina", contém minimamente GDE, mas inclui tipicamente mais resíduos de aminoácidos acídicos, em particular mais resíduos E. Assim, para detecção da trombina, o péptido de clivagem de PAR mínimo pode ser ligado directamente ou indirectamente à "sequência semelhante a hirudina", onde a ligação indirecta pode ser alcançada utilizando sequências PAR que ocorram entre o péptido de clivagem de PAR mínimo e a "sequência semelhante a hirudina", ou utilizando uma sequência ligadora não relacionada. De preferência, sequências do domínio extracelular a jusante do local de clivagem estão incluídas no péptido de clivagem de PAR, em particular quando o ensaio está a ser utilizado para detectar proteases inactivadoras.

De maior preferência, estão incluídas sequências de aminoácidos circundando o local de clivagem no PAR de 10 ΡΕ1238283 ocorrência natural no péptido de clivagem de PAR, imitando assim o substrato natural da protease. Por exemplo, os fragmentos do exodominio (dominio extracelular) amino-terminal de PARI de ratinho (N° de Acesso EMBL L03529), PAR2 de ratinho (N° de Acesso EMBL Z48043), PAR3 de ratinho (N° de Acesso EMBL U92972) e PAR4 humano (N° de Acesso EMBL AF055917) utilizados nos Exemplos abaixo prolongam-se do aminoácido 27 ao 78, 26 a 78, 21 a 92, e 17 a 78, respectivamente (a numeração dos aminoácidos corresponde à numeração da base de dados EMBL), permitindo assim a detecção de activadores e inactivadores dos PARs.

Embora os exemplos específicos aqui proporcionados estejam limitados a PARs conhecidos, será aparente para um perito na técnica que PARs ainda por identificar, ou fragmentos destes, são facilmente preparados à luz dos ensinamentos do presente fascículo. Por exemplo, moldes oligonucleotídicos para a amplificação por PCR das sequências de codificação para os domínios extracelulares dos diferentes PARs podem ser modificados para utilizar de acordo com o grau de homologia entre os PARs conhecidos e novos e dependendo das condições de hibridação. Alternativamente, se existir uma identidade suficiente entre as duas sequências, o mesmo molde pode ser utilizado sem mais modificações. Alternativamente, podem ser utilizados pares de moldes oligonucleotídicos adequados. Adicionalmente, antecipam-se variantes da sequência de ocorrência natural, em particular substituições conservativas de aminoácidos não essenciais para clivagem no local de clivagem biológico. 11 ΡΕ1238283 É vantajoso incluir um domínio transmembranar no péptido de clivagem de PAR. Um domínio transmembranar é um conjunto de regiões hidrófobas que podem ser identificadas como tal através de gráficos de hidrofobicidade auxiliados por computador. Por exemplo, os sete domínios transmem-branares de PARI são identificados deste modo por Vu et al. (1991, ver Figura 5) . A inclusão de um domínio transmembranar no péptido de clivagem de PAR é particularmente útil para a detecção de proteases após expressão do péptido de clivagem de PAR à superfície de uma célula, permitindo o domínio transmembranar o ancoramento do péptido à membrana celular. 0 domínio transmembranar pode ser de qualquer origem embora seja preferida a inclusão de um domínio transmembranar de PAR. Para facilidade de preparação, nesta concretização seria tipicamente utilizado o exodomínio de PAR seguido pelo seu primeiro domínio transmembranar (e.g., incluindo os aminoácidos 99-127 de PARI (Vu et al., 1991). 0 péptido de clivagem de PAR é ligado a uma molécula repórter. A molécula repórter (i.e., uma molécula geradora de sinal) pode ser qualquer molécula capaz de proporcionar uma alteração detectável. Tais moléculas incluem porções fluorescentes (e.g., proteínas fluorescentes ou marcadores químicos fluorescentes), porções radioactivas, porções fosforescentes, antigénios, enzimas repórter e semelhantes. De preferência, a molécula repórter é uma enzima repórter cuja actividade leva a uma alteração detectável. Tais enzimas repórter incluem, mas não se 12 ΡΕ1238283 limitam às seguintes: beta-galactosidase, glucosidades, cloranfenicol-acetiltransferase (CAT), glucoronidases, lu-ciferase, peroxidases, fosfatases, oxido-redutases, desi-drogenases, transferases, isomerases, cinases, redutases, desaminases, catalases e urease.

Na selecção de uma molécula repórter a utilizar no método presentemente reivindicado, é imperativo que a molécula repórter não seja sujeita a inactivação por nenhum agente da amostra, incluindo inactivação por qualquer actividade proteásica presente numa amostra. A selecção de uma molécula repórter apropriada será facilmente aparente aos peritos na técnica. Moléculas repórter actualmente preferidas são enzimas repórter, tais como a beta-galactosidase, tal como exemplificado no Exemplo 1 abaixo.

Noutro aspecto do invento, é proporcionado um péptido de clivagem de PAR ligado a um par de moléculas repórter que interagem. Após clivagem do péptido de clivagem de PAR, é libertado um repórter do péptido de clivagem de PAR, efectuando uma alteração detectável na segunda molécula repórter. Por exemplo, pode ser desenhada uma proteína de fusão compreendendo no sentido N-terminal para C-terminal: uma primeira proteína fluorescente (e.g., proteína cianofluorescente, CFP; proteína fluorescente amarela, YFP; proteína fluorescente azul, BFP; proteína fluorescente verde, GFP; todas comercialmente disponíveis, Clontech Living Colors User Manual), um péptido de clivagem de PAR e uma segunda proteína fluorescente. A imobilização 13 ΡΕ1238283 do péptido de clivagem de PAR pode ser alcançada tal como descrito abaixo. Após clivagem no local de clivagem de PAR, ocorre uma alteração mensurável no comprimento de onda da fluorescência da segunda molécula repórter.

Concretizações preferidas deste aspecto do invento compreendem no sentido N-terminal para C-terminal: proteína cianofluorescente, péptido de clivagem de PAR, proteína fluorescente amarela e uma etiqueta de imobilização (e.g., uma etiqueta de biotina ou um domínio transmembranar); ou proteína fluorescente amarela, péptido de clivagem de PAR, proteína fluorescente vermelha e uma etiqueta de imobilização (e.g., uma etiqueta de biotina ou um domínio transmembranar). Será aparente para os peritos na técnica que podem ser utilizadas outras moléculas repórter que interajam, por exemplo, Aequorina e GFP, luciferase e YFP. De preferência, as duas moléculas repórter que interagem estão separadas por pelo menos 15 aminoácidos, de preferência pelo menos 20 aminoácidos, sendo preferível pelo menos 30 aminoácidos, imitando assim as sequências de PAR de ocorrência natural. A ligação da molécula repórter ao péptido de clivagem de PAR pode ser alcançada através de qualquer meio conhecido na técnica (ou meios ainda a descobrir) desde que (i) o péptido de clivagem de PAR possa ser reconhecido pela sua protease, e (ii) após acção da protease no péptido de clivagem de PAR, seja libertada uma molécula repórter de um modo detectável. Assim, a ligação pode ser alcançada 14 ΡΕ1238283 através de reacçâo química, através da incorporação de uma molécula repórter durante a síntese do péptido de clivagem de PAR ou através de síntese contígua. Por exemplo, quando a molécula repórter é uma proteína, uma proteína de fusão compreendendo a molécula repórter, o péptido de clivagem de PAR e outras sequências opcionais podem ser facilmente preparados através de métodos recombinantes ou químicos.

Em resumo, o ADN codificando para a proteína de fusão pode estar compreendido numa cassete de expressão de ácido nucleico compreendendo um promotor operativamente ligado ao ácido nucleico codificando a proteína de fusão e opcionalmente a sinais de terminação da transcrição. Os polipéptidos fundidos da proteína de fusão podem ser unidos directamente ou através de um espaçador. 0 péptido de clivagem de PAR pode ser N-terminal ou C-terminal à molécula repórter, dependendo do desenho particular do ensaio (ver abaixo). 0 promotor pode ser de quase qualquer origem. É por exemplo possível utilizar um promotor fortemente regulado ou o promotor que está naturalmente adjacente a um gene PAR. Promotores preferidos são os que são activos nas células hospedeiras escolhidas tais como o promotor de SV40, tac, beta-actina, metalotioneína, T7, poli-hedrina e citomegalovírus. Um promotor particularmente preferido é o promotor de lacz, tal como exemplificado no Exemplo 1, abaixo. As sequências promotoras adequadas para utilizar com hospedeiros de levedura podem ser reguladas ou 15 ΡΕ1238283 constitutivas e são de preferência derivadas de um gene de levedura altamente expresso, especialmente um gene de Saccharomyces cerevisiae. Assim, pode ser utilizado o promotor do gene TRPl, do gene ADHI ou ADHII, ou do gene da fosfatase ácida (PH05).

Uma sequência de ADN contendo os sinais de terminação da transcrição é de preferência a sequência flanqueadora a 3' de um gene que contém sinais apropriados para terminação da transcrição e poliadenilação para o hospedeiro desejado. Os sinais adequados são, por exemplo, o sinal de poliadenilação da hormona de crescimento humana, do gene de DHFR e do gene da beta-globina de coelho.

Nalgumas concretizações, onde não se deseja o ancoramento a uma membrana celular, é também possível utilizar uma cassete de expressão de um polipéptido contendo adicionalmente uma sequência sinal que faça com que a proteína seja segregada para o meio. Sequências sinal adequadas são conhecidas na técnica. De acordo com isto, nestes tipos de cassetes de expressão um promotor está operativamente ligado a uma primeira sequência de ADN codificando um péptido sinal ligado no enquadramento de leitura correcto a uma segunda sequência de ADN codificando para a proteína de fusão, e uma sequência de ADN contendo sinais de terminação da transcrição. 0 promotor, a sequência de ADN codificando para a proteína de fusão e a sequência de ADN contendo sinais de 16 ΡΕ1238283 terminação da transcrição estão operativamente ligados uns aos outros, i.e., estão justapostos de tal forma que as suas funções normais são mantidas. A série é tal que o promotor efectua a expressão correcta do gene estrutural e os sinais de terminação da transcrição efectuam a terminação da transcrição e a poliadenilação correctas.

As cassetes de expressão para síntese da proteína de fusão podem ser inseridas no hospedeiro desejado na forma de um plasmídeo estável ou directamente no cromossoma, dos quais o último é o preferido. É igualmente possível que os plasmídeos de expressão incluam um ou mais, especialmente um ou dois, marcadores genéticos selectivos para o hospedeiro utilizado para a construção, amplificação e teste do plasmídeo, tal como um marcador e uma origem de replicação para um hospedeiro bacteriano, especialmente Escherichia coli.

Quanto aos marcadores génicos selectivos, pode ser utilizado qualquer gene marcador que facilite a selecção de transformantes devido à expressão fenotípica do gene marcador. Marcadores adequados são, por exemplo, os que expressam resistência a antibióticos ou, no caso de mutantes hospedeiros auxotróficos, genes que complementam lesões do hospedeiro. Os genes correspondentes conferem, por exemplo, resistência aos antibióticos tetraciclina, ampicilina, G418, higromicina, canamicina, cloranfenicol, carbenicilina, zeocina, blasticidina ou bleomicina, ou 17 ΡΕ1238283 proporcionam prototrofia num mutante auxotrófico, por exemplo o gene URA3, LEU2, LYS2, HIS3 ou TRPl.

Como a amplificação dos plasmideos de expressão é habitualmente feita num procariota, tal como E. coli, é vantajosamente incluída uma origem de replicação. Esta pode ser obtida a partir dos plasmideos procarióticos correspondentes, por exemplo plasmideos de E. coli, tais como pBluescript® pBR322, pTZ18R ou um plasmídeo pUC, por exemplo pUC18 ou pUC19, que contêm tanto uma origem de replicação procariótica, e.g. de E. Coli, como um marcador genético conferindo resistência a antibióticos, tais como ampicilina e tetraciclina.

Os ácidos nucleicos preferidos codificando a proteína de fusão estão descritos nos Exemplos 1-5 abaixo.

Os plasmideos de expressão são preparados através de métodos conhecidos na técnica, por exemplo através da ligação da cassete de expressão do polipéptido, os fragmentos de ADN contendo os marcadores genéticos selectivos para o hospedeiro e a origem ou origens de replicação na ordem predeterminada utilizando procedimentos convencionais de síntese química ou biológica in vitro. De preferência, os plasmideos são construídos e preparados utilizando técnicas de ADN recombinante. Para a preparação através de técnicas de ADN recombinante, os fragmentos de ADN adequados são ligados in vitro de modo convencional. A mistura de ligação é então transformada num hospedeiro 18 ΡΕ1238283 procariótico ou eucariótico adequado dependendo da natureza dos elementos reguladores utilizados, e um transformante contendo o vector desejado é seleccionado de acordo com procedimentos convencionais. Os plasmídeos podem ser multiplicados por meio dos hospedeiros transformados e podem ser isolados de modo convencional. A escolha do hospedeiro depende das sequências reguladoras situadas no vector. Para a construção e multiplicação do vector é preferido um hospedeiro procariótico, e.g. E. coli.

Um hospedeiro adequado para a produção da proteína de fusão é uma célula eucariótica ou procariótica, por exemplo uma célula de mamífero, nematode, insecto, levedura ou bactéria. 0 hospedeiro adequado pode ser transfectado através de métodos padrão em engenharia genética, por exemplo com a ajuda de um vírus, vesículas lipídicas, canhão de partículas ou electroporação. Para aumentar a quantidade de proteína produzida, é vantajoso utilizar um plasmídeo de elevado número de cópias ou o ADN plasmídico é integrado no genoma em várias cópias. 0 último pode ser alcançado, por exemplo, através da aplicação de uma pressão selectiva, e.g., utilizando metotrexato. As células hospedeiras transfectadas podem ser cultivadas através de métodos padrão em cultura celular.

As proteínas podem também ser obtidas através de meios sintéticos em vez de serem derivadas de fontes naturais, utilizando sintetizadores proteicos comercialmente disponíveis ou mesmo encomendados a um serviço 19 ΡΕ1238283 comercial de síntese de péptidos. As proteínas sintetizadas podem compreender quaisquer modificações da sequência desejadas, incluindo a utilização de resíduos de amino-ácidos alterados ou a adição de grupos heterólogos ou de cadeias laterais ao polipéptido, e a incorporação de marcadores ou etiquetas.

Para utilizar nos ensaios de clivagem de PAR do presente invento, a molécula péptido de clivagem de PAR-repórter é imobilizada num suporte sólido. 0 suporte sólido pode ser, por exemplo, uma placa multi-poços, um gel, uma matriz, uma conta, uma membrana ou um tubo, e pode ser feito de vários materiais, incluindo sem limitação, celulose, agarose, dextrano, policarbonato, nylon, polietileno, policarbonatos e vidro. Nalgumas concretizações, o suporte sólido pode ser uma membrana ou superfície, tal como proporcionado por um lipossoma ou uma célula. A molécula péptido de clivagem de PAR-repórter é imobilizada num suporte sólido de um tal modo que uma molécula repórter é libertada após a acção da protease se a protease enzimaticamente activa estiver presente na amostra. A imobilização pode ser alcançada através de qualquer modo desde que o péptido de clivagem de PAR esteja acessível à sua protease. Assim, é tipicamente necessária uma ligação orientada do péptido de clivagem de PAR. Tal ligação orientada pode ser alcançada através de vários métodos conhecidos na técnica, incluindo reacção química específica da extremidade terminal da proteína com grupos 20 ΡΕ1238283 reactivos no suporte, a ligação de uma etiqueta à extremidade terminal da proteina que pode ser capturada por um receptor que se ligue especificamente à etiqueta (e.g., podiam ser utilizadas interacções biotina-estreptavidina, biotina-avidina, anticorpo-epitopo como pares receptor-etiqueta) ou qualquer outro modo que seja aparente para o perito. Embora o péptido de clivagem de PAR possa ser N-terminal ou C-terminal à molécula repórter, o péptido de clivagem de PAR tipicamente separará a etiqueta (ou outro meio de imobilização) da molécula repórter para permitir a libertação da molécula repórter após a acção da protease.

Um meio de imobilização preferido utilizando interacções biotina-estreptavidina está descrito no Exemplo 1 abaixo. Embora este exemplo particular ilustre o invento através da incorporação de biotina na proteína de fusão, pode ser utilizado qualquer método de incorporação de tais etiquetas, desde que o local de clivagem não fique mascarado ou destruído. Isto é importante, não só para a apresentação do local de clivagem a uma protease, com também para permitir a separação da molécula repórter libertada pela protease da molécula péptido de clivagem de PAR-repórter imobilizada. Assim, a ligação química cruzada não específica da molécula péptido de clivagem de PAR-repórter a uma superfície sólida não é considerada na prática do presente invento.

Num aspecto do invento, a proteína de fusão é expressa à superfície de uma célula e contém um domínio 21 ΡΕ1238283 transmembranar. 0 domínio transmembranar expresso como parte da proteína de fusão pode ser assim considerado como uma "etiqueta" que imobiliza a proteína de fusão na superfície celular. Uma molécula repórter é proporcionada N-terminal ao péptido de clivagem de PAR para permitir a libertação e subsequente detecção da molécula repórter após a acção da protease. A molécula péptido de clivagem de PAR-repórter imobilizada é colocada em contacto com uma molécula de clivagem de PAR (ou protease) . A protease pode ser uma protease conhecida, que pode, por exemplo, estar comercialmente disponível ou presente numa amostra biológica. A protease pode também ser proporcionada na forma de uma biblioteca de proteínas e o ensaio do invento é então utilizado para detectar e isolar, ou de outro modo identificar, a protease.

As amostras de protease podem ser obtidas, por exemplo, através de extracção de uma fonte natural, através da expressão de um ácido nucleico recombinante codificando uma protease ou através da síntese química da protease. Sabe-se que numerosas linhas celulares tumorais (e.g., linhas celulares de melanoma, carcinoma da mama e neuroblastoma, disponíveis em ATCC) libertam proteases conhecidas e não caracterizadas, que podem ser utilizadas como uma fonte de protease. Adicionalmente, podem ser utilizados tecidos que se saiba possuírem PARs activados (e portanto protease biologicamente relevante), tais como 22 ΡΕ1238283 secções do cérebro, secções de tecido reprodutivo ou secções de tecido dos intestinos. Alternativamente, podem ser utilizados como fonte de protease fluidos corporais, tais como liquido cerebrospinal, ascites, urina, soro ou sangue. A protease pode ser isolada a partir de fontes naturais através de meios convencionais, de tecidos ou de células em cultura. Durante o isolamento, podem ser adicionados aditivos convencionais como estabilizadores proteicos, inibidores específicos de proteinases e semelhantes. Por exemplo, quando o polipéptido é isolado a partir de cultura de tecidos, o primeiro passo consiste habitualmente na lise das células ou, no caso em que o polipéptido é segregado para o meio, na separação das células do líquido de cultura, tipicamente por meio de centrifugação. Na presença de proteínas e impurezas adicionais, o sobrenadante resultante pode ser enriquecido na protease através da remoção da maior parte do material não proteináceo e na precipitação das proteínas através da saturação da solução com sulfato de amónio ou semelhantes. As proteínas contaminantes podem também ser precipitadas por meio de acidificação com ácido acético e outros meios convencionais. Outros passos de purificação podem incluir, por exemplo, remoção de lectinas, dessalinação, processo cromatográficos, tais como cromatografia de permuta iónica, cromatografia de filtração em gel, cromatografia de partição, HPLC, HPLC de fase inversa e semelhantes. A separação dos constituintes da mistura é também efectuada 23 ΡΕ1238283 através de diálise, de acordo com a carga por meio de electroforese em gel ou electroforese livre de transportadores, de acordo com o tamanho molecular por meio de uma coluna de Sephadex adequada, permeação em gel ou ultrafiltração, através de cromatografia de afinidade, ou através de outros processos, especialmente os conhecidos da literatura. A pureza da protease pode ser medida através de qualquer método apropriado, e.g., cromatografia de coluna, electroforese em gel de poliacrilamida ou análise de HPLC. A protease é substancialmente pura se puder ser isolada numa banda num gel.

Alternativamente, podem ser testadas várias bibliotecas de produtos naturais quanto à actividade de protease ou, de facto, podem ser pesquisadas bibliotecas de expressão quanto a actividade de protease libertada utilizando os ensaios do invento. Por exemplo, embora possam ser testados clones individuais, para facilidade de manuseamento, os bancos de clones de uma biblioteca de expressão podem ser expressos numa linha celular adequada, tal como uma linha celular que seja capaz de expressar, segregar e activar a protease. Através do crescimento de células num meio adequado (e.g., meio isento de soro, tal como Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) ou meio RPMI 1640, opcionalmente cheio de elementos vestigiais e suplementos de manutenção do crescimento) dentro de um receptáculo (e.g., placas de 96 poços), é produzido meio 24 ΡΕ1238283 condicionado (i.e., meio contendo factores segregados pelas células) que podem então ser analisados quanto à actividade de protease utilizando os métodos aqui descritos. Uma vez identificado um banco como produtor de níveis mais elevados de actividade de protease, as células podem ser diluídas com meio, separadas, criadas e testadas tal como descrito acima até ser identificado o clone que expressa a protease. A amostra da protease, proporcionada como uma mistura de moléculas, na forma isolada, como um fluído corporal, extracto celular, meio condicionado, células ou como uma amostra de tecido, é colocada em contacto com a molécula péptido de clivagem de PAR-repórter imobilizada para permitir a clivagem do péptido de clivagem de PAR, libertando deste modo a molécula repórter. A libertação da molécula repórter é então detectada e indica a presença de uma molécula de clivagem de PAR na amostra.

Como a molécula repórter ligada ao péptido de clivagem de PAR pode interferir com a detecção da molécula repórter libertada, a molécula repórter libertada será tipicamente separada da molécula péptido de clivagem de PAR-repórter antes da detecção. Isto é facilmente alcançado quando a molécula péptido de clivagem de PAR-repórter é imobilizada para permitir a libertação da molécula repórter para o meio envolvente após incubação com a amostra da protease. Assim, após a clivagem por uma protease, o meio pode ser retirado e determinada a presença do repórter libertado no meio. Alternativamente, se a molécula péptido 25 ΡΕ1238283 de clivagem de PAR-repórter for imobilizada num suporte removível, a molécula péptido de clivagem de PAR-repórter imobilizada é removida deixando o meio num receptáculo adequado para posterior análise. A libertação da molécula repórter pode ser determinada através da detecção de qualquer sinal mensurável, tal como uma mudança de cor, acontecimentos de fluorescência, luminescência ou radiação na amostra. Quando a molécula repórter é uma enzima, a amostra (ou meio que continha a amostra) é combinada com um indicador. 0 indicador é qualquer espécie que seja susceptível a uma mudança detectável (e.g., uma mudança de pH, mudança de cor, mudança de fluorescência ou luminescência, ou um substrato/enzima que possa ser detectado por um segundo indicador) após a acção da enzima repórter. Uma mudança detectável no indicador é uma indicação de que a protease enzimaticamente activa está presente na amostra. Ao contrário, a falta de uma mudança detectável no indicador é uma indicação de que a protease enzimaticamente activa está ausente da amostra. Tipicamente, a "mudança detectável" é um aumento do sinal de pelo menos 2 vezes em relação ao fundo (onde são efectuados os ensaios de controlo na ausência de amostra), de preferência um aumento de pelo menos 5 vezes, sendo preferível um aumento de pelo menos 10 vezes do sinal em relação ao do sinal de controlo.

Tal como descrito acima, os locais de clivagem biológica para os agentes activadores de PAR são conhecidos 26 ΡΕ1238283 para PAR-1 humano e de ratinho (a seguir a Arg41) , PAR-2 de ratinho (a seguir a Arg38), PAR-3 de ratinho (a seguir a Lys37) e PAR-4 humano (a seguir a Arg47) . Tal como aqui se utiliza, o termo "local de clivagem biológica" refere-se ao local clivado in vivo que resulta numa resposta biológica (e.g., influxo de Ca2+, retracção de neurites, hidrólise de fosfoinositido ou agregação de plaquetas). Assim, após identificação de uma molécula que cliva PAR, a molécula que cliva PAR pode ser identificada como um potencial activador de PAR ou potencial inactivador de PAR tendo como base onde é que o péptido de clivagem da protease é clivado pela protease. As moléculas que clivam PAR que clivam o péptido de clivagem de PAR num local diferente do "local de clivagem biológica" são classificados como potenciais inactivadores de PAR, enquanto que as moléculas que clivam PAR que clivam o péptido de clivagem de PAR no "local de clivagem biológica" são classificadas como potenciais activadores de PAR. 0 local de clivagem biológica pode ser facilmente determinado tal como é aparente para o perito. Os exemplos abaixo descrevem a utilização de péptidos de clivagem de PAR mutados onde o local de clivagem biológica é alterado de modo a que a clivagem neste local seja impedida. Qualquer clivagem do péptido de clivagem de PAR mutado é portanto num local alternativo ao "local de clivagem biológica" indicando a presença de um inactivador. Alternativamente, a porção (poli)peptidica clivada repórter libertada, ou de preferência as sequências PAR clivadas 27 ΡΕ1238283 imobilizadas podem ser sequenciadas, ou pode ser utilizado um anticorpo especifico para o local de clivagem para determinar se a clivagem está ou não no local de clivagem biológica.

Uma vez classificado o potencial activador/inac-tivador, podem ser efectuadas mais análises para confirmar a classificação. Tais testes são conhecidos na técnica e incluem ensaios de crescimento de neurites, ensaios de hidrólise de fosfoinositido, ensaios de efluxo de Ca2+ e ensaios de agregação de plaquetas.

Noutro aspecto do invento, é proporcionado um método de acordo com a reivindicação 7 para pesquisa de potenciais moduladores de PAR através do contacto do péptido de clivagem de PAR imobilizado com um activa-dor/inactivador de PAR e um potencial modulador de PAR, e determinação de uma mudança na quantidade de clivagem no local de clivagem em comparação com quando o referido modulador de PAR está ausente. Os moduladores de PAR podem inibir a acção de um inactivador, permitindo deste modo a activação de PAR, ou potenciar a acção de um inactivador, aumentando deste modo a inactivação de PAR. Pelo contrário, os moduladores de PAR podem inibir a acção de um activador, inibindo deste modo a activação de PAR, ou potenciar a acção de um activador, melhorando deste modo ainda mais a activação de PAR. A presença de um modulador de PAR é detectada 28 ΡΕ1238283 através de uma mudança na quantidade de clivagem do péptido de clivagem de PAR na presença do modulador de PAR em comparação com quando está ausente.

De preferência, a mudança na actividade difere em 20% da do nível de controlo, de maior preferência em 50% da do nível de controlo, sendo preferível em 90% ou mais da do nível de controlo. Um aumento na clivagem no local de clivagem biológica reflecte a presença de um agonista, enquanto que uma diminuição na clivagem no local de clivagem biológica reflecte a presença de um antagonista. Um aumento na clivagem num local diferente do local de clivagem biológica (em particular C-terminal ao local de clivagem biológica) reflecte também a presença de um antagonista.

Assim, um agonista é uma molécula que aumenta a activação de PAR tal como caracterizado através de clivagem no local de clivagem biológica, relativamente aos ensaios de controlo na ausência de activador ou agonista candidato. Um antagonista é uma molécula que reduz a activação de PAR relativamente aos ensaios de controlo na ausência de antagonista candidato através (i) da promoção da clivagem num local diferente do local de clivagem biológica ou (ii) da inibição da clivagem no local de clivagem biológica (por exemplo, através da ligação a PAR e do bloqueando deste modo a activação de PAR, ou através da ligação a um activador de PAR). 29 ΡΕ1238283

Agonistas e antagonistas adequados podem ser obtidos a partir das mesmas fontes que as proteases, tal como descrito acima. Alternativamente, podem ser utilizadas como fontes bibliotecas de compostos químicos, péptidos, anticorpos ou produtos naturais, ou de química combinatória.

Uma vez identificada, a acção dos agonistas ou antagonistas pode ser confirmada através de ensaios funcionais. Adicionalmente, os agonistas ou antagonistas podem potencialmente ser utilizados para obter um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. 0 efeito pode ser profilático em termos de prevenir completamente ou parcialmente uma doença/condição ou sintoma desta e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa de uma doença/condição e/ou efeito adverso atribuível à doença. "Tratamento" tal como aqui se utiliza cobre qualquer tratamento de uma doença num mamífero, em particular num humano, e inclui: a) prevenção da ocorrência da doença/condição ou sintoma num sujeito que possa estar predisposto à doença/condição ou sintoma mas ao qual não lhe foi ainda diagnosticada; b) inibição da doença/condição ou sintoma, i.e., paragem do seu desenvolvimento; ou c) alívio do sintoma da doença/condição ou sintoma, i.e., causando regressão da doença/condição.

Por exemplo, a activação de PARI foi implicada no 30 ΡΕ1238283 proporcionar de um efeito neuroprotector (Vaughan et al., 1995); PARI é altamente expresso em linhas celulares de cancro e biopsias, sugerindo o seu envolvimento no comportamento mitogénico e metastático das células tumorais; PARI foi também implicado na doença de Alzheimer; a expressão de PN-1, um potente antagonista da activação de PAR-1 é persistentemente sobre-regulada em astrócitos reactivos após isquemia e acidente vascular cerebral, ou certos tipos de lesões induzidas por neurotoxinas (Hoffmann et al., 1992; Nitsch et al., 1993; Scotti et al., 1994); a activação de PAR-3 foi implicada no aumento da mobilidade dos intestinos: todos proporcionando exemplos de possíveis doenças ou condições alvo.

Noutro aspecto do invento, o ensaio de clivagem de PAR pode ser utilizado na medição do teor de protease ou de actividade inibidora de protease em amostras clínicas. O exemplo 7 abaixo demonstra que o ensaio é suficientemente sensível para detectar pela primeira vez a presença e a quantidade de actividade de trombina no LCE de humanos, tanto em pacientes saudáveis como após lesão traumática da cabeça, conduzindo a um maior nível de trombina na maioria dos casos. De modo semelhante, o LCE de pacientes ou animais experimentais após isquemia ou acidente vascular cerebral podem ser analisados quanto aos seus níveis de trombina ou de actividade inibidora da trombina. O nível de protease ou de actividade inibidora da protease numa amostra clínica pode portanto actuar como um indicador de diagnóstico e/ou prognóstico. 31 ΡΕ1238283

Ainda noutro aspecto do invento, é proporcionado um estojo compreendendo pelo menos um dos materiais aqui divulgados, por exemplo qualquer um de um péptido de clivagem de PAR, uma proteína de fusão de PAR tal como aqui descrito, tal como uma proteína de fusão beta-galactosidase-PAR, ou ácido nucleico codificando os mesmos, em combinação com instruções para utilização no ensaio do invento.

Os exemplos abaixo são proporcionados somente para fins ilustrativos e não devem ser entendidos como limitantes das reivindicações anexas.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Detecção da protease de clivagem de PAR-1

Este exemplo descreve a preparação de uma galactosidase-PARl (GPARl) como uma proteína recombinante obtida através da fusão da β-galactosidase, do domínio extracelular de PAR-1, de uma etiqueta His6 e de um domínio aceitador de biotina para biotinilação in vivo. A clivagem da proteína de fusão GPAR-1 imobilizada em estreptavidina conduz à libertação da β-galactosidase solúvel activa que proporciona um meio de monitorização de proteases capazes de clivar o domínio extracelular de PAR-1. Utilizada como um substrato imobilizado, a proteína de fusão GPAR-1 permite pela primeira vez a detecção de trombina no intervalo subpicomolar. 32 ΡΕ1238283

Estirpes e meios A estirpe de E. coli SCS110 (Stratagene, La Jolla, CA, USA) foi utilizada para propagação de plasmideos recombinantes. GPAR-1 recombinante foi expressa tanto na estirpe M15[pREP4] (Qiagen), SCS110 ou XLl-Blue MR (Stratagene) de E. coli. As células de E. coli foram criadas em meio YT 2χ, suplementado com 100 yg/ml de

ampicilina (Sambrook et al., "Molecular Cloning. A

Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . O meio foi ainda suplementado com biotina 50 μΜ (Tsao et al., Gene 169: 59-64, 1996) para a produção de GPAR-1 recombinante biotinilada.

Construção do vector de expressão de GPAR-1 O plasmideo pGPARl foi construído através da ligação de quatro fragmentos gerados por PCR: i) um fragmento codificando β-galactosidase, ii) um fragmento codificando o exodomínio de PARI, iii) um fragmento codificando etiquetas de afinidade, e

iv) um fragmento codificando a enzima BirA (biotina-holoenzima-sintetase), que catalisa uma modificação da biotina (Barker e Campbell, J. Mol. Biol. 146: 451-467, 1981), todos flanqueados por locais de restrição. 33 ΡΕ1238283 0 fragmento de ADN codificando a β-galactosidase foi amplificado a partir de pSV-h-Galactosidase (comercialmente disponível em Promega) utilizando 5'-CACACAGCGGCCGCG-TCGACGATGAGCGAAAAATACATCGTCACCT-3' (SEQ ID NO: 1) e 5'-CACACTTAATTAATCTAGATTTGTACAGTTTTTGACACCAGACCAA CTGGTAA-3' (SEQ ID NO: 2) como iniciadores. O fragmento codificando o exodominio de PARI foi amplificado a partir de pBSmThR, que contém ADNc de PARI de ratinho em pBluescript (Niclouet et al., Cell. Mol. Biol. 40: 421-428, 1994), utilizando 5'-CACACACCATGGGGTCGACGATGA-GCGTGTACAGTGGAGGTTCAGGCGGATCAAGCCAGCCAGAATCAGAGAGGAC-3' (SEQ ID NO: 3) e 5'-GAGAGAACTAGTGGGGCTGGTCAGATATCCGGAG-3' (SEQ ID NO: 4) como iniciadores. O fragmento de ADN codificando as etiquetas de afinidade e contendo locais de restrição adicionais para permitir a subclonagem dos outros produtos de PCR foi gerado através de PCR utilizando um oligonucleótido de ADN sintético (5'-CACACACCATGGGACTCGAGGAGGTACTAGT GGAGGTTCACA-CCATCATCACCACCATGCAGCGGCTCT GAAC GATAT T T T C GAAGC T CAGAAAAT C G AA-TGGCACGAGTAGTCTAGACGTCCAGGTACCAGAGAG-3' (SEQ ID NO: 5). O fragmento BirA foi amplificado directamente a partir de células de E. coli SCS110 utilizando 5'-CACACATCTAGATAAGGATCCATGAAGGATAACACCGTGCCACTG-3' (SEQ ID NO: 6) e 5'-CACACAGGTACCAAGCTTATTTTTCTGCACTACGCAGGGAT-3' (SEQ ID NO: 7) como iniciadores. Uma colónia de células SCS110 foi suspensa em 50 μΐ de meio LB. 2 μΐ da suspensão 34 ΡΕ1238283 celular foram utilizados como molde numa reacçâo de PCR de 100 μΐ sob condições padrão.

Todas as reacções de PCR foram efectuadas com ADN-polimerase Taq, suplementada com 1/50 do volume de ADN-polimerase Pwo, numa reacção de 100 μΐ de acordo com as recomendações do fabricante. Todas as manipulações com ADN recombinante foram efectuadas seguindo procedimentos padrão (Pepper et al., J. Cell. Biol. 122: 673-684, 1993) e de acordo com as especificações dos fabricantes. As sequências de ADN foram verificadas através de sequenciação do ADN.

Em resumo, um fragmento do local de clonagem múltipla de pBluescript SK” (comercialmente disponível em Stratagene) foi removido através de clivagem com Ciai e SstII, seguido de tratamento com polimerase T4 para criar extremidades cegas, e depois ligado para criar pBS-CS. Os produtos de PCR (fragmentos (i) a (iv) acima) foram ligados passo-a-passo nos locais Kpnl e Sall de pBS-CS, produzindo pGPARl (Fig. IA). O plasmídeo recombinante resultante, pGPARl, possui assim um primeiro enquadramento de leitura aberto codificando a β-galactosidase, fundido C-terminalmente com o fragmento do domínio extracelular de PARI, uma etiqueta HíSê e um domínio aceitador de biotina (BAD). Um segundo enquadramento de leitura aberto, precedido de um local de entrada no ribossoma interno foi introduzido na construção para produzir a biotina-holoenzima-sintetase (enzima BirA) do mesmo ARNm (Tsao et al., Gene 169: 59-64, 1996). 35 ΡΕ1238283

Expressão e purificação de GPAR1 em E. coli

As células SCS110 de E. coli transformadas com pGPARl formaram colónias azuis quando plaqueadas em meios contendo isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-h-galactosidase-D-galactopiranósido (X-Gal), enquanto que as células transformadas com pBS-CS deram colónias brancas devido ao gene desfeito do fragmento de α-complementação da β-galactosidase (Sambrook et al., 1989). Um litro de meio YT 2χ contendo 100 pg/ml de ampicilina e biotina 50 μΜ (Tsao et al., 1996) foi inoculado com células de E. coli recombinantes, que cresceram até uma D06oo de 0,7 e a expressão proteica foi induzida com 0,4 g/1 de IPTG. Após indução durante pelo menos 16 horas, as células foram colhidas através de centrifugação a 5500 rpm durante 30 min a 4°C numa centrífuga Beckman J-6B/P com um rotor JS-5.2, e ressuspensas em 80 ml de tampão de lise 1* [fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, MgCl2 0,2 mM, imidazole 10 mM, β-mercaptoetanol 30 mM], suplementado com 1 mg/ml de aprotinina e 1 mg/ml de fenilmetilsulfonil-fluoreto (PMSF) como inibidores de proteases. Após filtração, a suspensão foi clarificada através de centrifugação a 35000 g durante 30 min a 4°C num rotor Sorvall SS-34. GPAR1 foi purificada por meio da etiqueta de afinidade Hísô utilizando agarose Ni2+-NTA (comercialmente disponível em Qiagen). O lisado celular, produzido tal como descrito acima, foi incubado de um dia para o outro com 2,5 36 ΡΕ1238283 ml de agarose Ni2+-NTA, a 4°C com agitação suave. Após empacotamento numa coluna adequada (por exemplo, BioRad Econocolumn, 1,5><15 cm, disponível em BioRad, Hercules, CA, USA), a agarose foi lavada com 100 ml de tampão de lise 1*, 100 ml de tampão de lavagem com EtOH [Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 60 mM, MgCl2 0,2 mM, imidazole 10 mM, β-mercaptoetanol 30 mM, Etanol a 30%], seguido de mais 100 ml de tampão de lise sem adição de inibidores de proteases. A coluna foi incubada durante 30 min a 4°C com 5 ml de tampão de eluição [fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0, NaCl 2,5 M, imidazole 0,5 M] antes da recolha da proteína de fusão GPAR1 purificada eluída. O eluato foi dialisado contra tampão Tris/acetato [Tris/acetato 50 mM, pH 7,3, NaCl 300 mM, MgCl2 1 mM] . Para armazenamento a longo prazo foi adicionado um volume igual de glicerol a 100% à preparação de GPAR purificada e foram armazenadas alíquotas a -80°C.

Análise da GPAR-1 purificada A GPAR-1 recombinante foi analisada através de SDS-PAGE em géis de acrilamida a 7,5% (Laemmli, Nature 227: 680-685, 1970) A proteína GPAR1 foi sujeita a electroforese durante 1 hora a 200 V juntamente com marcadores de peso molecular apropriados (e.g., os marcadores de peso molecular graduados de proteínas

Benchmark disponíveis em Life Technologies ou os marcadores de peso molecular disponíveis em Amersham Pharmacia Biotech). 37 ΡΕ1238283

Para o "immunoblot" e a detecção da modificação da biotina de GPAR1, as proteínas sujeitas a electroforese foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Towbin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 4350-4354, 1979) . Após lavagem da membrana e bloqueio da ligação a proteínas não específicas com tampão de bloqueio [solução salina tamponada com fosfato (PBS), Triton X-100 a 1%, albumina de soro bovino (BSA) a 1 %], uma membrana foi sondada com um anticorpo policlonal de coelho anti-β-galactosidase (comercialmente disponível em 5 Prime_3 Prime, Boulder CO, USA), seguido de três lavagens com tampão de lavagem [PBS, Triton X-100 a 1%] e incubação com um anticorpo anti-coelho de suíno marcado com fosfatase alcalina, diluído 1/200 em tampão de bloqueio. A outra membrana foi sondada com conjugado de fosfatase alcalina-estreptavidina, diluído 1/200 em tampão de bloqueio. Todas as incubações duraram 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem três vezes com tampão de lavagem e uma vez com tampão de fosfatase alcalina [Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM], a revelação da cor foi efectuada com tetrazólio de nitro-azul (NBT)/fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) em tampão de fosfatase alcalina [330 yg/ml de NBT, 165 yg/ml de BCIP] durante cinco minutos.

Propriedades da proteína GPAR1 purificada A GPAR1 purificada surgiu como duas bandas em SDS-PAGE sob condições redutoras que eram independentes da estirpe de E. coli utilizada. A banda superior apresentou a 38 ΡΕ1238283 massa molecular aparente esperada de 136 kDa e a sua reactividade com estreptavidina após transferência para uma membrana de nitrocelulose indicou que estava biotinilada. A banda inferior apresentou uma massa molecular aparente de 127 kDa e não estava biotinilada. Ambas as bandas eram imunopositivas para β-galactosidase. A ausência de biotinilação e o menor peso molecular aparente da segunda banda sugeriram que esta era uma forma truncada da proteína, desprovida da parte C-terminal. Esta assunção foi ainda substanciada pelo facto da remoção da parte C-terminal de GPARl através do tratamento de trombina ter afectado apenas a proteína inteira, conduzindo ao aparecimento de apenas uma banda a 127 kDa em SDS-PAGE. A proporção de proteína truncada para inteira foi consistentemente obtida.

Ensaio da actividade de β-galactosidase

A actividade da galactosidase foi medida para quantificar a quantidade de GPARl numa amostra purificada. Uma amostra de GPARl purificada (25-75 μΐ) foi adicionada a cada poço de uma placa de microtítulo de 96 poços. Após a adição de solução de substrato [Tris/Acetato 25 mM, pH 7,3, NaCl 150 mM, MgS04 0,5 mM, 2,5 mg/ml de ONPG, concentração final] até um volume final de 200 μΐ, o aumento na DO405 foi registado à temperatura ambiente durante 5 a 30 min e foi apresentado como velocidade da reacção. A quantidade de β-galactosidase que deu uma mudança na densidade óptica de 0,001 DO/min, foi definida como 1 unidade. A evolução da DO 39 ΡΕ1238283 foi registada utilizando uma leitor de microplacas THERMOmax utilizando SOFTmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Calibração da reacção de cor da β-galactosidase

Para calibrar o ensaio e estabelecer a relação entre a velocidade de reacção e a concentração de β-galactosidase, foram medidos 75 μΐ de uma solução padrão contendo 35 ng/ml a 10 yg/ml de β-galactosidase (comercialmente disponível em Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suíça) sob as condições acima mencionadas e a revelação da DO405 foi registada durante 30 min.

Uma curva de resposta à dose com β-galactosidase indicou que 1 pmol de β-galactosidase era equivalente a 819 unidades, tal como descrito acima. Uma unidade era assim equivalente a uma concentração de 16,3 pM de β-galactosidase na amostra. A velocidade de reacção em função da concentração de β-galactosidase foi linear até uma DO405 de 1,2/min, correspondendo a 20 nM de β-galactosidase.

Imobilização da GPAR1 GPARl foi imobilizada à superfície de partículas paramagnéticas revestidas com Estreptavidina (SA-PMPs comercialmente disponíveis em Promega, Madison, WI, USA) tal como se segue: 25 μΐ de SA-PMPs em suspensão foram lavadas três vezes com 1 ml de PBS. Foram adicionadas 250 40 ΡΕ1238283 unidades de GPAR1 num volume total de 200 μΐ de PBS e incubou-se à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação constante. Após lavagem três vezes com 1 ml de PBS, GPAR1 /SA-PMPs foram ressuspensas em 100 μΐ de PBS e ensaiadas quanto à actividade de β-galactosidase através da adição de 100 μΐ de solução de substrato e incubação à temperatura ambiente durante 2 min. A reacção foi parada através da adição de 50 μΐ de EDTA 0,5 M, pH 8, e o sobrenadante colorido foi separado das partículas. O grau da reacção de cor foi medido fotometricamente a 405 nm. Cerca de 95% da actividade de β-galactosidase purificada ficou imobilizada em SA-PMPs, enquanto que apenas pôde ser imobilizada em SA-PMPs cerca de 20% da actividade de β-galactosidase total expressa pela construção de GPAR1, provavelmente devido à formação de uma truncagem C-terminal de GPAR1.

Para a imobilização de GPARl em placas de microtítulo de 96 poços revestidas com estreptavidina (comercialmente disponíveis em Labsystems, Helsínquia, Finlândia), foram adicionadas 125 unidades de GPARl por poço num volume total de 100 μΐ de PBS e as placas foram mantidas a 4°C durante dois a quatro dias até serem utilizadas. Após a imobilização, foram medidos 75 μΐ da solução para a actividade de β-galactosidase tal como descrito acima, para determinar a eficiência de imobilização. Verificou-se que as eficiências de imobilização estavam consistentemente no intervalo de 70 a 75%, estando a eficiência de imobilização no seu auge após dois dias de incubação a 4°C. 41 ΡΕ1238283 A trombina humana foi previamente preparada e caracterizada por Stone e Hofsteenge (Biochemistry 25: 4622-4628, 1986). As placas de microtítulo com GPARl imobilizada foram lavadas rapidamente três vezes com PBS para remover qualquer proteína GPARl não ligada. As amostras de protease (em triplicado) foram imediatamente adicionadas em 100 μΐ de tampão de enzima [Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, PEG 6000 a 0,1%, Tween 20 a 0,02%]. Por exemplo, a trombina foi adicionada à GPARl imobilizada em concentrações variando de 50 fM a 10 pM em 100 μΐ de tampão de enzima. Para assegurar que estava a ser medida a actividade da trombina, foram incluídas amostras de controlo idênticas excepto quanto à adição de hirudina 5 pM ou PN-1 5 pM.

As placas de microtítulo foram incubadas a 37°C durante 3 horas numa atmosfera húmida para permitir a clivagem da protease de GPARl, conduzindo a uma libertação de β-galactosidase para o meio. O meio da amostra (75 μΐ) foi então transferido para uma placa fresca e ensaiado quanto à actividade de β-galactosidase tal como descrito acima através da medição da mudança da densidade óptica durante 15 min a 405 nm. Os dados foram expressos como picomoles de β-galactosidase libertada versus a concentração de protease e o tempo em minutos A sensibilidade da GPARl imobilizada à clivagem por diferentes proteases foi avaliada através do cálculo dos declives iniciais obtidos a partir das curvas de resposta à dose efectuadas para cada protease. 42 ΡΕ1238283

Sob estas condições, foram detectáveis 50 fM de trombina com um intervalo linear até 250 fM. O ensaio foi saturado acima de 0,5 a 1 pM. O declive inicial, calculado a partir de valores dentro da primeira fase linear, mostrou que sob estas condições de ensaio são libertadas 2,6 moles de β-galactosidase por minuto por mole de trombina. Na presença de hirudina recombinante ou da protease de rato nexina-1 (Marwardt, Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 308: 147-156, 1957; Baker et al., Cell 21: 37-45, 1980; PN-1; Sommer et al., Gene 85: 453-459, 1989), ambos potentes inibidores da trombina, o sinal do ensaio da GPAR1 foi quase completamente abolido, mostrando a estrita dependência na actividade proteolitica da trombina.

Como controlo para assegurar que as diferentes amostras de protease não afectam a actividade da β-galactosidase (e.g., através da destruição da actividade enzimática) , foram incubadas 90 unidades de GPAR1 por poço numa placa de microtitulo de 96 poços sem revestimento de estreptavidina, com 100 μΐ de tampão de enzima contendo as proteases a diferentes concentrações. As amostras de controlo foram testadas quanto à actividade de β-galactosidase do mesmo modo que as amostras ensaiadas utilizando placas de microtitulo revestidas com estreptavidina.

Em resumo, o ensaio para moléculas que clivam PAR utilizando a proteína de fusão GPAR1 é extremamente sensível, permitindo a detecção de trombina a concentrações 43 ΡΕ1238283 tão baixas como 50 fM, pelo menos 10 vezes mais sensível que os métodos anteriormente utilizados baseados no substrato cromogénico específico S2238 (Chromogenix, Mõlndal, Suécia).

Exemplo 2: Especificidade do ensaio de GPAR1 e

identificação de activadores e inactivadores de PARI

Para mostrar que a clivagem da trombina ocorreu no seu local de clivagem esperado, foi gerada uma forma mutante de GPARl, onde uma mutação R S impede a clivagem por serina-proteases semelhantes a tripsina. Os vectores de expressão para a GPARl mutante foram gerados através da excisão do fragmento PARI de pGPARl (ver Exemplo 1) e substituição por um fragmento de ADN codificando um PARI mutante. A construção de PARI mutante possuía uma mutação pontual no codão para o primeiro resíduo de aminoácido do local de activação, conduzindo a uma incorporação de serina em vez de arginina, tornando assim este local resistente à clivagem por serina-proteases semelhantes a tripsina, incluindo a trombina. O fragmento codificando PARI mutante foi preparado a partir de pBSmThR utilizando 5'-CTCATGTACAGTGGAGGTTCAGGAGGCTCGAGCCAGCCAGAATCAGAGAGGACAGATG-CTACGGTGAACCCCAGCTCATTCTTTCTAAGGAATC-3' (SEQ ID NO: 8) e 5'-GAGAGAACTAGTGGGGCTGGTCAGATATCCGGAG-3' (SEQ ID NO: 4) como iniciadores. A mudança do resíduo Arg45 por serina deu origem à proteína de fusão de local de activação mutante GPARl

R4 5S 44 ΡΕ1238283

Os ensaios de proteases foram realizados tal como descrito no Exemplo 1, excepto que foram utilizadas tanto GPAR1 como GPAR1 mutante (GPAR1r45s) para análise comparativa. A incubação da trombina humana (Stone e Hofsteenge, 1986) com a GPAR1r45s imobilizada conduziu a uma redução dramática do sinal detectado do mutante demonstrando que a trombina cliva de facto a GPAR1 predominantemente apos Arg . Foi necessário mais de 30000 vezes mais trombina para provocar uma resposta com GPAR1r45s. A velocidade inicial para a resposta da trombina diminuiu de 2,6 molfi-gaiactosidase/ (moltr0mbina*min) para cerca de 70 nmolfi-galactosidase/ (moltrombina*^!^) (Tâbelâ 1) . O SÍnâl nãO foi devido a uma actividade contaminante na preparação de trombina, uma vez que esta estava ausente na presença de hirudina, um inibidor especifico da trombina. A menor taxa de clivagem de GPAR1r45s sugere a existência de um segundo local de clivagem para a trombina em PARI de ratinho, que é clivada com menor eficiência. Sabe-se que a PARI humana contém um segundo local de clivagem da trombina situado cinco resíduos C-terminalmente do local de activação (Vu et âl., 1991; Parry et âl., 1996).

Perfil de proteases para GPAR1 e GPAR1r45s

Após mostrar que o ensaio de GPAR1 reflecte bem a capacidade da trombina para clivar e activar PARI, examinámos o efeito de outras proteases em GPAR1 e no seu mutante de local de activação GPAR1r45s. As seguintes 45 ΡΕ1238283 proteases adicionais foram ensaiadas essencialmente tal como descrito acima: quimotripsina de tipo II bovina (Sigma, St. Louis, MO, USA), proteína C activada bovina (ICN, Costa Mesa, CA, USA), plasmina humana, urocinase de elevada massa molecular humana e tripsina bovina (todas disponíveis em Fluka, Buchs, Suiça), elastase de leucócitos humanos (merck Darmstadt, Alemanha) e tPA de cadeia simples humana (Calbiochem La Jolla, CA, USA).

Nos casos da tripsina e da plasmina, o sinal máximo foi ainda superior ao da trombina. Com GPAR1r45s como substrato, as curvas de resposta à dose para a tripsina e a plasmina foram ligeiramente deslocadas para a direita em comparação com GPAR1 e as velocidades iniciais diminuíram (Tabela 1), indicando que a clivagem no local de activação de PARI é favorecida por estas proteases. Assim, a tripsina e a plasmina foram claramente detectáveis e a sua eficiência sensível à mutação do local de activação (Tabela 1), confirmando assim a sua capacidade para activar PARI (Ishihara et al., 1997; Vu et al., 1991, Parry et ai., 1996) . Nenhuma das proteases testadas se revelou tão potente como a trombina. A quimotripsina e a elastase, proteases com referência por clivagem após resíduos hidrófobos, não mostraram preferência pela clivagem de GPAR1 sobre GPAR1r45s, e portanto podem ser classificadas como potenciais inactivadores de PARI. A quimotripsina e a 46 ΡΕ1238283 elastase foram mesmo mais eficazes quando incubadas com GPAR1r45s imobilizada (Tabela 1) .

Os dois activadores do plasminogénio testados foram incapazes de clivar GPAR1 a velocidades consideráveis e não parecem assim estar envolvidos na sinalização ou regulação de PARI (Tabela 1) . Apenas à concentração mais elevada de urocinase testada, se obteve um sinal marginal.

Foi relatado que tanto a trombina como a proteína C activada são activadores de PARI (Parry et al., 1996). Foi demonstrado através do presente ensaio que a proteína C activada cliva apenas GPAR1 e foi quase inactiva sobre GPAR1R45S imobilizada. A actividade da proteína C activada foi de aproximadamente 1000 vezes menos em comparação com a trombina. Para testar se a actividade resultante da proteína C activada era devida a uma contaminação da preparação com trombina, a proteína C activada foi ensaiada com GPAR1 imobilizada na presença de hirudina. Na presença de hirudina, o sinal resultante da proteína C activada foi completamente abolido (Tabela 1) e é assim muito provavelmente devido a uma contaminação de trombina da preparação (Tabela 1) (Parry et al., 1996). A concentrações superiores, a tripsina, a plasmina, a elastase e a quimotripsina clivaram GPAR1 e GPAR1r45s não só no domínio PARI como também no domínio β-galactosidase, causando uma diminuição do sinal mesmo 47 ΡΕ1238283 abaixo do nível de fundo. No entanto, estas proteases podem ser medidas com sucesso a um intervalo de concentrações inferior demonstrando a ampla aplicação dos ensaios.

Para avaliar a que concentrações as diferentes proteases podiam influenciar o ensaio através da destruição da actividade de β-galactosidase, GPARl foi incubada com estas proteínas sem imobilização anterior e a actividade de β-galactosidase restante foi medida tal como descrito acima no Exemplo 1. Nenhuma das proteases examinadas causou uma diminuição na actividade de β-galactosidase a concentrações abaixo de 100 pM. Os declives iniciais das curvas de resposta à dose derivados de valores abaixo desta concentração crítica demonstraram que a destruição da β-galactosidase não contribui para os dados obtidos com este formato de ensaio.

Assim, em resumo, o ensaio é útil para a detecçâo do local de clivagem da trombina específico. O ensaio é também suficientemente sensível para detectar proteases diferentes da trombina e em locais de clivagem diferentes do local de clivagem da trombina, permitindo deste modo a detecçâo e identificação de potenciais activadores e inactivadores de PARI. Se for necessário detectar especificamente a actividade de trombina numa mistura de proteases, a trombina pode ser medida como a actividade que pode ser especificamente inibida pela hirudina. 48 ΡΕ1238283

Exemplo 3: Identificação de Activadores e Inactivadores de PAR-2

Este exemplo descreve a preparação de uma proteína de fusão galactosidase-PAR2 (GPAR2) e sua utilização em ensaios desenhados para detectar activadores e inactivadores de PAR2.

Os vectores de expressão para GPAR2 mutante ou GPAR2r34s foram preparados através da excisão do fragmento PARI de pGPARl com xhol e Spel (ver Exemplo 1) e substituição do fragmento excisado por um fragmento de ADN codificando o domínio extracelular de PAR-2 de ratinho ou o seu mutante de local de activação. A sequência de codificação do exodomínio de PAR2 de ratinho foi preparada através de PCR utilizando os oligonucleótidos de ADN sintéticos 5'-CACACATGTACAGTGGAGGTTCAGGCGGCTCGAGCGAGAACC-TTGCACCGGGACGCAACAACAGTAAAGGAAGAAGTCTTATTGGCAGATTAGAAACCCA-GCCTCCAATCACTG-3', (SEQ ID NO: 9) e 5'-CACACAACTAGTGA-CCGTGGTCAGCTTCCCGGTGAGGATGGACGCAGAGAACTCATCGATGGAAAAGCCTGG-TTCTACCGGAACCCCTTTCCCAGTGATTGGAGGCTGGGTT-3', (SEQ ID NO: 10) como moldes. O mutante de local de activação de PAR2 foi preparado do mesmo modo mas em vez do oligonucleótido SEQ ID NO: 9, foi utilizado um oligonucleótido semelhante onde o AGA sublinhado foi substituído por AGC. A ligação dos dois oligonucleótidos apropriados complementares nas suas extremidades 3' produziu um molde parcialmente de cadeia dupla, que foi utilizado numa reacção de PCR. Todas as outras técnicas foram efectuadas tal como descrito no 49 ΡΕ1238283

Exemplo 1, acima. A sequência de ADN do clone resultante foi verificada através de sequenciação do ADN. GPAR2 foi expresso na estirpe de E. coli SCS110 (Stratagene, La Jolla, CA, USA) ou Ml5[pREP4] (Qiagen). Tal como com GPAR1, esteve também presente uma GPAR2 truncada na fracção purificada de GPAR2. A proporção de proteína truncada para inteira foi consistente com a obtida com GPAR1, tal como o foi a eficiência de imobilização para prática do ensaio. Em ensaios de clivagem realizados tal como descrito no Exemplo 2 mas utilizando as proteínas de fusão GPAR2 ou GPAR2r34s imobilizadas, demonstrou-se que GPAR2 era o substrato preferencial para a tripsina a uma velocidade inicial de 370 mmolfi-gaiactosidase/ (moltriPsina*min) (Tabela 1) . Em comparação, foi detectada uma velocidade inicial de 97 mmolB-gaiactosidase/ (moltripsina*min) para GPARl (Tabela 1) . Foi necessário cerca de 9 vezes mais tripsina para clivar o mutante de local de activação GPAR2R34S. A plasmina clivou GPAR2 duas vezes mais eficientemente que GPAR2r34s, mas apenas a uma velocidade 560 vezes inferior que a tripsina (Tabela 1) . A quimotripsina e a elastase mostraram uma preferência menor por GPAR2 de tipo selvagem em relação a GPAR2r34s (Tabela 1) . A quimotripsina e a elastase clivaram GPAR2 a uma velocidade inferior que GPARl. Não se obteve sinal com a proteína C activada, com os activadores de plasminogénio testados nem com a trombina (Tabela 1). 50 ΡΕ1238283

Exemplo 4: Identificação de Actlvadores e Inactivadores de PAR-3

Este exemplo descreve a preparação de uma galactosidase-PAR3 (GPAR3) e a sua utilização em ensaios desenhados para detectar activadores e inactivadores de PAR 3.

Os vectores de expressão para GPAR-3 ou GPAR3K37S foram preparados através de excisão do fragmento PARI de pGPARl com Xhol e SpeI (ver Exemplo 3) e substituição do fragmento excisado com um fragmento de ADN codificando o domínio extracelular de PAR-3 de ratinho ou o seu mutante de local de activação. A sequência de codificação do exodomínio de PAR3 de ratinho foi preparada através de PCR utilizando os oligonucleótidos de ADN sintéticos 5'-TGTACAGTGGAGGTTCAGGCGGCTCGAGCGGCATAAATGTTTCAGACAACTCAGCAAA-GCCAACCTTAACTATTAAGAGTTTTAATGGGGGTCCCCAAAATACCTTTGAAGAATTC-CCACTTTCTGACATAGAGG-3' (SEQ ID NO: 11) e 5'-ACTAGTACTTAA-GGAACTTCTCAGGTATCCTATGGTAGCATTATTCACGTGGAGAGTTGAAATACTGTCC-TCGGGACACTCCGCTTTTATAGTTGTGGTGGCTCCTGTCCAGCCCTCTATGTCAGAAA-GTGGGA-3' (SEQ ID NO: 12) como moldes. O mutante de local de activação de PAR3 foi preparado do mesmo modo mas em vez do oligonucleótido SEQ ID NO: 11, foi utilizado um oligonucleótido semelhante onde o AAG sublinhado foi substituído por TGC. Todas as outras técnicas foram efectuadas tal como descrito no Exemplo 3. Tal como com GPAR1 e GPAR2, esteve também presente uma GPAR3 truncada na fracção purificada de GPAR3. A razão de proteína truncada 51 ΡΕ1238283 para inteira foi consistente com a obtida com GPARl, tal como o foi a eficiência de imobilização para prática do ensaio.

Os ensaios de clivagem foram realizados tal como descrito no Exemplo 3 mas utilizando as proteínas de fusão GPAR3 ou GPAR3k37s imobilizadas. PAR3 é o principal receptor da trombina em plaquetas de ratinho (Ishihara et al., 1997, Kahn et al., Nature 394: 690-694, 1998) e corres pondentemente a proteína de fusão GPAR3 imobilizada é também eficientemente clivada pela trombina (Tabela 1) . No entanto, a velocidade inicial de 41 mmolB-gaiactosidase/ (rnoltrombina*^in) (Tabela 1) é cerca de seis vezes inferior que para GPARl. O mutante de local de activaçâo GPAR3K37S mostra uma velocidade para a libertação de β-galactosidase pela trombina de 3,4 mmol6-gaiactosidase/ (moltrombina*min), reflectindo assim a presença de um possível segundo local de clivagem da trombina, que é clivado a uma velocidade superior que o segundo local de clivagem da trombina em PARI (Tabela 1) . Quando a tripsina foi incubada com GPAR3 ou GPAR3K37S, foi observada apenas uma preferência menor para a clivagem de GPAR3 (Tabela 1) . Um efeito mais forte da mutação no local de activaçâo de GPAR3 foi observado com a plasmina, que foi cerca de 120 vezes menos activa que a trombina (Tabela 1) . O activador do plasminogénio tecidual mostrou apenas um sinal muito fraco com GPAR3, que foi reduzido quando se utilizou GPAR3k37s, indicando uma clivagem preferida na ligação K37-S38 (Tabela D · Os valores para uPA foram demasiado baixos para detectar uma 52 ΡΕ1238283 diferença semelhante (Tabela 1). Não se verificou preferência para GPAR3 com a quimotripsina nem com a elastase (Tabela 1). A proteina C activada não clivou GPAR3 nem GPAR3K37S até um grau apreciável na presença de hirudina (Tabela 1).

Exemplo 5: Identificação de Activadores e Inactivadores de PAR-4

Este exemplo descreve a preparação de uma proteina de fusão galactosidase-PAR4 (GPAR4) e a sua utilização em ensaios desenhados para detectar activadores e inactivadores de PAR4.

Os vectores de expressão para GPAR-4 ou GPAR3K37S foram preparados através de excisão do fragmento PARI de pGPARl com Xhol e SpeI (ver Exemplo 3) e substituição do fragmento excisado por um fragmento de ADN codificando o fragmento do domínio extracelular de PAR-4 humano ou o seu mutante de local de activação. A sequência de codificação do fragmento do exodomínio de PAR4 humano foi preparada através de PCR utilizando os oligonucleótidos de ADN sintéticos 5'-CACACACTCGAGCGGCGGCACCCAGACCCCCAGCGTCTACGAC-GAGAGCGGGAGCACCGGAGGTGGTGATGACAGCACGCCCTCAATCCTGCCTGCCCCCC^ GCGGCTACCCAGGC-3' (SEQ ID NO: 13) e 5'-TGTGTGACTAGTCCTGGTG-GGCACCCAGCCCAGAAGCAGTGCCCGTGAGCTGTCCGGAAGCTCCAGGGTGTCACTGT-CATTGGCACAGACTTGGCCTGGGTAGCCGCGGGGGG-3' (SEQ ID NO: 14) como moldes. 0 mutante de local de activação de PAR4 foi preparado sinteticamente e foi semelhante ao fragmento do 53 ΡΕ1238283 exodomínio de PAR 4 mas o CGC sublinhado na SEQ ID NO: 13 foi substituído por AGC. Todas as outras técnicas foram efectuadas tal como descrito no Exemplo 3. Tal como com GPAR1, GPAR2 e GPAR3, esteve também presente uma GPAR4 truncada na fracção purificada de GPAR4. A proporção de proteína truncada para inteira foi consistente com a obtida com GPAR1.

Perfil de proteases para GPAR4 e GPARr47s GPAR4 e GPAR4r47s foram também testadas com o mesmo conjunto de proteases sob as mesmas condições que para as outras GPARs. GPAR4 foi eficientemente clivada pela tripsina com uma velocidade de 15 mmol6-gaiactosidase/ (moltripsina*min) (Tabela 1) . Em comparação com as velocidades de clivagem mais elevadas observadas com GPAR1, GPAR2 e GPAR3, a velocidade de clivagem de GPAR4 foi pelo menos uma ordem de grandeza inferior (Tabela 1). A trombina, que é um activador conhecido de PAR4 (Kahn et al., 1998; Xu et al., 1998), clivou GPAR4 a uma velocidade de 4,3 mmolB-gaiactosidase/(moltroiTi3ina*min), que foi ainda três ordens de grandeza inferior que com GPARl (Tabela 1) . No entanto, tanto a tripsina como a trombina foram claramente menos eficazes quando incubadas com GPAR4R47S, com a trombina a mostrar um elevado grau de especificidade (Tabela 1) . A plasmina clivou tanto GPAR4 como GPAR4r47s com baixa eficiência mas mostrando também uma preferência para a clivagem no local de activação de PAR4. A quimotripsina e a elastase clivaram ambos os substratos sem preferência 54 ΡΕ1238283 pelo substrato de tipo selvagem. Ambos os activadores do plasminogénio, bem como a proteína C activada não clivaram GPAR4 nem GPAR4r47s a velocidades consideráveis (Tabela 1) . Em comparação com GPAR1, todas as proteases testadas clivaram GPAR4 e GPAR4r47s a velocidades muito inferiores (Tabela 1).

Exemplo 6: Análise comparativa dos activadores e inactivadores de PAR

Neste exemplo, a utilização dos domínios extracelulares de PAR de tipo selvagem e mutantes permite a análise da regulação proteolítica dos diferentes membros identificados da família PAR e proporciona também uma ferramenta nova e altamente sensível para identificar proteases que clivam PAR ainda desconhecidas.

Foi efectuada uma análise comparativa da clivagem proteolítica de PARI, PAR2, PAR3 de murídeo e PAR4 humano, envolvendo proteínas de fusão GPAR mutadas e não mutadas. Os ensaios foram realizados essencialmente tal como descrito mas com a adição de várias proteases.

Trombina A trombina clivou GPAR1 (2,6 molB-gaiactosidase/ (moltrombina*^Í^) r GPAR3 (410 mmolfi-gaiactosidase/ (moltrombina*^!^) © GPAR4 (4,3 mmolfi-gaiactosidase/ (moltrombina*rnin) , especificamente no local de activação proteolítica, i.e., a clivagem ficou 55 ΡΕ1238283 comprometida pela mutação do local de activação (Tabela 1). Em contraste, não pôde ser observada clivagem de GPAR2 (Tabela 1).

Tripsina A tripsina clivou todas as proteínas de fusão do receptor com pouca especificidade para o local de activação, excepto quanto a uma marcada preferência da tripsina para clivagem no local de activação de GPAR2 (Tabela 1). As formas mutantes foram clivadas de modo menos eficiente, indicando o potencial da tripsina para activar todos os PARs. Embora se possam encontrar seis potenciais locais de clivagem para a tripsina no exodominio de PAR2, a mutação do local de activação conduziu ainda a uma redução de 9 vezes na eficiência da clivagem triptica de GPAR2. A mutação do local de activação das outras proteínas de fusão GPAR não conduziu a uma tão forte redução na clivagem pela tripsina, mostrando claramente que PAR2 está optimizado para clivagem pela tripsina neste local (Tabela 1).

Proteína C activada e activadores de plasminogénio

Nem a proteína C activada (na presença de hirudina) nem os activadores de plasminogénio clivam qualquer proteína de fusão GPAR a velocidades consideráveis . 56 ΡΕ1238283

Plasmina

Plasmina, a protease fibrinolítica gerada a partir do plasminogénio através da acção dos activadores do plasminogénio, clivou todas as proteínas GPAR não mutadas a uma velocidade ainda afectada pela mutação do local de activação, mas pelo menos dez vezes inferior em comparação com a tripsina (Tabela 1) . A fraca eficiência com que a plasmina é capaz de clivar os PARs sensíveis à trombina permite-lhe ter um papel na modulação de respostas mediadas por PARI em plaquetas, que não podem substituir os PARs activados através de síntese e inserção na membrana de novas moléculas de receptor (Molino et al., J. Biol. Chem. 272: 6011-6017, 1997). A fraca capacidade da plasmina para clivar GPAR2 no local de activação está em contraste com as descobertas de Fox et al., que, utilizando um inibidor peptidilclorometano baseado nos quatro resíduos a montante do local de activação de PAR2, verificaram que é improvável que tanto a trombina como a plasmina sejam activadores de PAR2 (Fox et al., FEBS Lett. 417: 267-269, 1997). No entanto, esse ensaio pôde detectar apenas interacções mediadas pelos quatro resíduos a montante do local de activação, enquanto que a nossa determinação utiliza sequências do domínio extracelular N-terminal de PAR2 adicionais, um substrato biologicamente mais relevante.

Quimotripsina e elastase

Examinámos também a clivagem das nossas proteínas 57 ΡΕ1238283 de fusão GPAR pela elastase e quimotripsina, duas proteases que possuem uma preferência por clivagem após resíduos hidrófobos. GPAR1 foi bem clivada por ambas as enzimas e a GPAR1r45s mutante foi clivada com uma eficiência ainda maior, demonstrando claramente que ambas as proteases reconhecem e clivam locais diferentes do local de activação (Tabela 1) . A maior clivagem de GPAR1r45s pode ser explicada pela introdução de um local de clivagem adicional na criação da mutação R45S. No caso de GPAR2 e GPAR2r34s, a elastase deu um sinal cinco vezes inferior que com GPAR1 e menor ainda para a forma mutante (Tabela 1) . Também, a quimotripsina clivou GPAR2 melhor que o mutante: o sinal foi cerca de dez vezes inferior que com GPAR1 e semelhante àquele com GPAR3 e GPAR4 e seus mutantes (Tabela 1) . Os sinais para elastase e quimotripsina variam entre abaixo ou em torno de 10 mmolB-gaiact0Sidase/ (molprotease*min) e acima ou em torno de 100 mmolB-gaiactosidase/ (molprotease*min) , (Tabela 1). As menores velocidades de clivagem reflectem provavelmente a clivagem fora dos domínios PAR. Enquanto que a inactivação de PAR2 pela elastase não pode ser excluída, os nossos dados indicam que PAR4 não é um substrato para esta enzima. A quimotripsina cliva GPAR1 a uma velocidade (58 mmole-gaiactosídase/ (moltrombina*^in) ) r o que sugere inactivação quimotríptica de PARI.

Exemplo 7: Medição da trombina activa no liquido cerebrospinal de pacientes após traumatismo craniano grave O líquido cerebrospinal (LCE) é um líquido que 58 ΡΕ1238283 envolve os neurónios e as células da glia no sistema nervoso. Está separado do sistema sanguíneo através da barreira hematoencefálica e a sua composição de soluto é bem controlada e mantida para permitir a função neuronal. Os ferimentos cranianos podem conduzir a uma disrupção temporal da barreira hematoencefálica, conduzindo assim possivelmente ao influxo de componentes do sangue, incluindo trombina, para o cérebro.

Foi descrito que a trombina afecta tanto a sobrevivência celular como a morte celular dos neurónios e astrócitos após privação de glicose ou stress oxidativo (Smith-Swintosky et al., 1995; Vaughan et al., 1995; Pike et al., 1996). A adição de trombina a células de neuro-blastoma ou neurónios em cultura provoca uma retracção muito rápida das neurites (Gurwitz e Cunningham, 1988; Grand et al., 1989; Baird e Raper, 1995). Estes efeitos da trombina ocorrem a concentrações picomolares (Gurwitz e Cunningham, 1988) .

Num estudo anterior utilizando o substrato de pNA S2238, não se verificou trombina activa no LCE (Smimova et al., 1997). No entanto, utilizando um ensaio do presente invento, fomos capazes de medir trombina em quantidades subpicomolares e medimos com sucesso níveis de trombina no LCE.

As amostras de líquidos cerebrospinais humanos (LCEs) foram obtidas no Kantonspital, Basel. As amostras 59 ΡΕ1238283 foram obtidas de doentes com traumatismo craniano grave, um paciente com uma hemorragia subaracnóide e morte cerebral diagnosticada, e um sujeito saudável. As amostras foram obtidas 3 horas e 17 dias após os ferimentos; para comparação, foi também proporcionada uma amostra de sangue de um paciente.

Medição do teor sanguíneo A quantidade de sangue contaminante foi determinada através da medição da DO405 de diferentes diluições das amostras antes do início do ensaio de GPAR. Os declives das curvas da DO405 vs. diluição recíproca foram determinados e comparados. 0 valor para a amostra de sangue foi definido como 100%, enquanto que o valor para o LCE de controlo do sujeito saudável foi definido como 0%. Assumiu-se uma relação linear entre os valores do teor sanguíneo e da DO405·

Medição da concentração de trombina

As amostras de LCE foram diluídas em série em tampão de enzima EBT 1χ [Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, PEG 6000 a 0,1%, Tween 20 a 0,02%] com diluições variando de V2 a 1/30000. Após medição do teor sanguíneo, as amostras diluídas foram ensaiadas quanto à presença de actividade semelhante a trombina em triplicados sob as condições descritas no Exemplo 1. 60 ΡΕ1238283

Os declives da parte linear das curvas de resposta à dose foram determinados e comparados com o declive para o padrão de trombina, para expressar os dados como concentração picomolar de trombina na amostra. Devido a uma forte absorção intrínseca a 405 nm no sangue, o substrato da β-galactosidase ONPG não pôde ser utilizado para a amostra sanguínea. Em vez deste foi utilizado o substrato alternativo Clorofenol-vermelho-p-D-galactopira-nósido (CPRG; comercialmente disponível em Roche Diagnos-tics, Rotkreuz, Suiça), que permite a medição da actividade de β-galactosidase a 590 nm, sem a interferência da absorção intrínseca do sangue. O CPRG foi utilizado à mesma concentração que ONPG. O padrão de trombina foi medido de modo concordante. A concentração de trombina pôde ser exactamente determinada nas amostras de LCE, tal como indicado através da curva de resposta à dose de referência para a trombina, incluída durante a medição de cada conjunto de três amostras. Na amostra de LCE normal e no sangue, foram detectados níveis de trombina muito semelhantes com uma concentração e 25 e 29 pM, respectivamente. Nas amostras de LCE de pacientes após um traumatismo craniano grave, foi frequentemente verificado um nível substancialmente superior de trombina, que no paciente 1 foi mesmo 17 vezes superior ao nível normal logo 4 horas após a lesão e ainda 5 vezes superior após 10 horas. Nos outros pacientes foi observado um aumento na concentração de trombina ao longo do tempo (pacientes 2 e 4) bem como uma diminuição 61 ΡΕ1238283 (paciente 3) . Dos restantes pacientes apenas esteve disponível uma única amostra, não permitindo assim uma comparação directa. De todos os pacientes houve apenas uma amostra que apresentou um elevado nível de trombina, excepto para o LCE de um paciente tomado dois dias após hemorragia subaracnóide. Neste caso, o nível de trombina foi normal mas a amostra de LCE mostrou a mais elevada quantidade de contaminação sanguínea (»18%) (paciente 6) . Não havia correlação entre a quantidade de contaminação sanguínea no LCE e a concentração de trombina. De um doente adicional esteve disponível uma série maior de amostras de LCE, que foram tomadas entre 20 e 280 horas após um grave ferimento na cabeça. Embora na primeira fase após o traumatismo a concentração de trombina estivesse no intervalo do LCE normal, rapidamente aumentou fortemente após 2 dias até um nível máximo de 370 pM de trombina, que foi alcançado 6 dias após o traumatismo. Mesmo até 12 dias após o traumatismo foi ainda medido um nível três vezes maior de trombina. As flutuações nos níveis de trombina foram facilmente aparentes, mesmo numa base diária, tal como um forte aumento observado entre os dias 2 e 3, e uma diminuição seguida novamente de um aumento entre os dias 5 e 8. Quando o mesmo ensaio foi efectuado na presença de hirudina, a libertação de β-galactosidase não foi detectável, identificando a actividade de protease como trombina.

Em resumo, medimos a concentração de trombina no LCE com concentrações em sangue normal ou LCE no intervalo 62 ΡΕ1238283 de 25 a 30 pM e em casos de LCE de pacientes após um traumatismo craniano grave a níveis tão elevados como 400 pM ou mais. Em todos os casos onde foi medido um maior nível de trombina, a concentração de trombina foi de pelo menos 100 pM. A elevada sensibilidade do ensaio permite a medição de pequenas quantidades de trombina em amostras biológicas ou clínicas, incluindo CSF. Assim, o ensaio facilita estudos para determinar se a trombina é um factor de risco em traumatismo craniano grave, para prever o resultado da lesão dependendo dos níveis da trombina, e para determinar se deve ser tido cuidado para bloquear especificamente actividades de trombina no LCE.

Exemplo 8 Medição da actividade de protease e da actividade inibidora de protease em homogenatos cerebrais de ratinhos sem função de PN-1 ("knockout") e irmãos heterozigóticos ou de tipo selvagem O inibidor das serina-proteases PN-1 mostra um padrão de expressão temporal e espacial distinto no desenvolvimento da cartilagem, do pulmão, da pele, do tracto urogenital e do sistema nervoso periférico (Mansuy et ai., 1993). O gene para PN-1 foi quebrado em ratinhos para melhor definir os papéis sugeridos para PN-1 durante o desenvolvimento e a fase adulta (Luthi et al., 1997). O presente exemplo demonstra a medição das quantidades de protease ou actividade inibidora de protease em homogenatos cerebrais obtidos a partir de ratinhos deficientes em PN-1 e de irmãos heterozigóticos e de tipo selvagem utilizando o 63 ΡΕ1238283 substrato S2238 e o ensaio de GPAR. Analisámos ratinhos "knockout" para PN-1 e os irmãos de 14 dias de idade descritos anteriormente (Líithi et al., 1997) que foram retro-cruzados com a linha de ratinho C57/BI6 (comercialmente disponível).

Preparação de homogenatos cerebrais

Três ratinhos de uma ninhada de ratinhos "knockout" para PN-1 retro-cruzados foram anestesiados e perfundidos com tampão de sacarose [HEPES 10 mM, pH 7,5, sacarose 320 mM, EDTA 1 mM, Tween 20 a 0,2%] . Os cérebros foram então excisados e homogeneizados durante 45 segundos em tampão de sacarose a uma razão de 2 ml por cérebro utilizando um homogeneizador Polytron (Kinematica, Luzern, Suiça). Os restos celulares foram separados através de centrifugação a 13000 rpm numa centrífuga de bancada

Heraeus à temperatura ambiente durante 15 minutos. O sobrenadante foi subsequentemente esterilizado através de filtração primeiro através de um filtro Millipore de 0,45 pm e depois através de um de 0,22 pm. Os homogenatos foram armazenados congelados a -80°C até à utilização.

Medição da protease e da actividade inibidora da trombina

Os sobrenadantes dos homogenatos cerebrais foram diluídos em série em tampão de enzima EBT 1χ [Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, PEG 6000 a 0,1%, Tween 20 a 0,02%] com diluições variando de 1/100 a 1/10000. As amostras 64 ΡΕ1238283 diluídas foram ensaiadas quanto à presença de actividade semelhante a trombina em triplicados sob as condições descritas no Exemplo 1. Para a medição da actividade inibidora da trombina os homogenatos foram diluídos em tampão de enzima contendo trombina 1 pM. As concentrações da actividade semelhante a trombina ou da actividade inibidora da trombina foram determinadas a partir dos declives da parte linear da curva de resposta à dose.

Os homogenatos cerebrais de ratinhos de tipo selvagem ou "knockout" para PN-1 de 14 dias de idade não libertaram quaisquer quantidades mensuráveis de actividade de β-galactosidase solúvel após incubação com GPAR1 imobilizada. Um excesso de actividade inibidora da trombina tornou-se aparente quando os homogenatos cerebrais foram ensaiados na presença de trombina 1 pM. De facto foi detectada uma redução da libertação da β-galactosidase na presença do homogenato cerebral. A quantidade de inibidor da trombina presente nos homogenatos cerebrais foi calculada a partir destas curvas. A maior concentração de inibidor foi de 817 ± 122 pM, presente no homogenato de cérebro de tipo selvagem, enquanto que a actividade inibidora da trombina foi reduzida até 79 ± 8 pM no cérebro de "knockout" para PN-1, equivalente a 9,7% do nível de tipo selvagem. No cérebro do ratinho heterozigótico "knockout" para PN-1, verificou-se uma concentração intermédia de 487 ± 65 pM de actividade inibidora da trombina. 0 inibidor detectado é muito provavelmente PN-1, devido ao reduzido nível que se verificou nos cérebros dos 65 ΡΕ1238283 ratinhos heterozigóticos. No entanto, mesmo no homogenato do ratinho "knockout" para PN-1 homozigótico, a actividade inibidora de trombina foi evidentemente mensurável, indicando a presença de um inibidor distinto de PN-1.

Em resumo, é proporcionada pelo presente método uma medição precisa e sensível da actividade de protease específica de PAR e da actividade inibidora da protease em amostras de tecido. A disrupção direccionada do gene de PN-1 conduz a uma forte redução, mas não à abolição da actividade inibidora da trombina em homogenatos cerebrais, demonstrando assim a presença de um segundo inibidor da trombina. A redução da actividade inibidora foi mensurável utilizando o substrato da trombina S2238, mas foi confirmada a um nível mais sensível utilizando o presente ensaio. Naqueles animais "knockout" não foi detectável qualquer actividade semelhante a trombina, que permitisse a identificação de uma putativa protease alvo para PN-1.

Exemplo 9 Medição da actividade de protease e da actividade inibidora da protease em fluidos do sistema reprodutor de murídeos machos

Após a criação de ratinhos "knockout" para PN-1, a subsequente produção da linha de ratinhos mutantes indicou que muitos machos "knockout" para PN-1 homozigóticos eram estéreis. Uma vez que PN-1 é expresso a elevados níveis de um modo dependente de androgénios no sistema reprodutor masculino de ratinhos de tipo selvagem 66 ΡΕ1238283 (Mansuy et al., 1993; Vassalli et al., 1993), a sua ausência pode ter graves consequências para a fertilidade do animal. Possíveis alvos para PN-1 são as serina-proteases uPA e plasmina, que podem ser geradas através de uPA a partir do plasminogénio. Analisámos ratinhos "knockout" para PN-1 com 14 dias de idade retro-cruzados com a linha de ratinhos C57/BI6 descrita no Exemplo 8.

Recolha de fluidos do sistema reprodutor masculino de ratinhos

Dois pares de ratinhos "knockout" para PN-1 retro-cruzados adultos foram anestesiados e mortos por decapitação. A vesícula seminal, a glândula coagulante e o canal deferente/epidídimo da cauda foram bissectados e o seu conteúdo foi empurrado com fórceps para tubos eppendorf e misturado com 100 μΐ de tampão de enzima [Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, PEG 6000 a 0,1%, Tween 20 a 0,02%]. As amostras foram armazenadas congeladas a -80°C até à utilização.

Determinação das proteínas A determinação de proteínas das diluições em série das amostras de fluidos foi realizada utilizando um estojo de determinação de proteínas de tipo Bradford de BioRad de acordo com as recomendações do fabricante (Bradford, 1976). 67 ΡΕ1238283

Medição da protease e da actividade inibidora da protease

Os fluidos foram diluídos em série em tampão de enzima com diluições variando de 1/200 a 1/600000. As amostras diluídas foram ensaiadas em triplicado quanto à presença de actividade semelhante a trombina sob as condições descritas no Exemplo 1, bem como quanto à actividade inibidora da trombina tal como descrito no Exemplo 7. Alternativamente, o ensaio foi efectuado na presença de tripsina 10 pM. As concentrações de actividade semelhante a trombina ou de actividade inibidora da trombina foram determinadas a partir dos declives da parte linear das curvas de resposta à dose.

Todos os fluidos examinados continham uma quantidade mensurável de actividade proteolítica ou de actividade inibidora da trombina. A vesícula seminal contém um excesso de actividade inibidora da trombina de cerca de 240 fmol por mg de proteína, que é reduzida para 19% no ratinho "knockout" para PN- 1. Na glândula coagulante do ratinho de tipo selvagem uma actividade inibidora da trombina está presente a uma concentração de aproximadamente 10 fmol por mg de proteína. No ratinho mutante que é incapaz de sintetizar PN-1, a actividade inibidora da trombina é abolida, desmascarando deste modo um excesso de actividade de protease. O fluido do canal deferente mostrou uma actividade de protease de cerca de 400 fmol por mg de proteína, que aumentou em 150% no 68 ΡΕ1238283 ratinho "knockout" para PN-1. Para um ratinho de tipo selvagem a medição foi efectuada na presença de tripsina 10 pM, mostrando que a actividade inibidora na vesícula seminal e na glândula coagulante era também capaz de inibir a tripsina. O ensaio sensível aqui descrito permitiu a detecção de trombina e de proteases semelhantes a tripsina e dos seus inibidores em fluidos do sistema reprodutor de ratinhos "knockout" para PN-1 e de tipo selvagem.

Em resumo, foi detectado um excesso de actividade inibidora da trombina na glândula coagulante dos ratinhos de tipo selvagem, que estava ausente nos ratinhos "knockout" para PN-1, resultando num excesso de uma actividade de protease semelhante à trombina não identificada. Uma segunda actividade inibidora da trombina foi detectada na vesícula seminal. No canal deferente e no epidídimo da cauda, a disrupção do gene de PN-1 conduz a um aumento na actividade de protease não identificada que também estava presente invento no ratinho de tipo selvagem a níveis menores. Assim, os métodos do presente invento podem ser utilizados para detectar proteases e inibidores de proteases até agora não identificados que proporcionem outros alvos biológicos para a regulação de PAR.

Exemplo 10 Análise de proteases solúveis ou associadas à superfície celular

Este exemplo descreve a preparação de uma 69 ΡΕ1238283 proteína de fusão expressa de um modo ligado à membrana à superfície de células de mamífero em cultura, permitindo deste modo a análise de proteases solúveis ou associadas à superfície celular. Utilizando este formato, fomos capazes de demonstrar a libertação mediada por trombina de uma enzima repórter para o meio de células em cultura. As células de neuroblastoma de ratinho em cultura (células Nb2a ou Cho-E) foram transfectadas com o ADNc de uma proteína de fusão ancorada na membrana da fosfatase alcalina de placenta humana e dos domínios extracelular e o primeiro transmembranar de PARI.

As intensidades do sinal podem ser facilmente optimizadas para cada construção de fusão de PAR, por exemplo, através da selecção de uma linha celular que permita elevados níveis de expressão e através da criação de uma linha celular expressando estavelmente a proteína de fusão receptora. 0 formato baseado em células do ensaio pode ser utilizado para a detecção sensível de proteases que são capazes de activar pro-enzimas, tais como a protrombina, ou de clivar e libertar directamente a enzima repórter.

Tal como é aparente para um vulgar perito na técnica, os Exemplos de cima podem ser facilmente modificados para incluir a utilização de várias moléculas repórter ou sequências PAR para detectar activadores, inactivadores, agonistas e antagonistas de PAR, em amostras 70 ΡΕ1238283 de várias origens. Adicionalmente, as proteínas de fusão de PAR aqui descritas são úteis para pesquisar qualquer proteína ou molécula de ligação a PAR, que possa ser identificada através de métodos conhecidos na técnica (e.g., proteómica). TABELA 1

Ensaios de GPAR: Velocidades de libertação de β-galactosidase através de potenciais activadores e inactivadores de PARs

Potenciais Activadores Potenciais Inactivadores Trombina Tripsina Proteína C act. Plasmina Uroci- nase tPA Elastase Quimo- tripsina GPARl 2,6*103 9,7*10° < l*10"2a 4,1*10° < 1*10"2 < 1*10"2 7,8*10° 5,8*10° GPAR1r45s 7*10'2 3,4*10° < 1*10“2 2,9*10'° < 1*10'2 < 1*10"2 1,4*102 7,8*10° GPAR2 1*10"2 3,7*102 < 1*10"2 6,7*10'° < 1*10'2 < 1*10"2 2,4*10° 5,6*10° GPAR2r34s < 1*10'2 4,2*10° < 1*10“2 3,5*10'° < 1*10'2 < 1*10"2 1,6*10° 4,3*10° GPAR3 4,1*102 3,6*10° < l*10"2a 3,4*10"° < 1*10"2 3*10'2 5,0*10° 4,7*10° GPAR3K37S 3,4*10° 3,0*10° < 1*10"2 1,6*10° < 1*10'2 < 1*10'2 9,3*10° 4,5*10° GPAR4 4,3*10° 1,5*10° < 1*10"2 4,8*10"° < 1*10'2 < 1*10"2 1,2*10° 3,4*10° GPARM7S 2*10"2 7,8*10° < 1*10-2 2,6*10"° < 1*10'2 < 1*10'2 1,1*10° 8,4*10° Nota. As proteínas de fusão GPAR imobilizadas foram incubadas com as protease acima listadas e a libertação da β-galactosidase foi detectada e avaliada tal como descrito. Os dados representam a média de pelo menos duas experiências com determinações em triplicado. Todos os valores estão em mmol de β-Galactosidase/ (molproteaSe *min) . a Determinado na presença de hirudina 71 ΡΕ1238283 LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Novartis Research Foundation <120> Ensaios de Moduladores de Receptores Activados por Proteases (PARs)

<130> Sequências do ensaio de PAR <140> <141> <160 > 18 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 46 <212> ADN <213> mus <400> 1 cacacagcgg cegcgtegac gatgagcgaa aaaiacatcg teacct 48 <210> 2 <211> 53 <212> ADN <213> mus <400> 2 cacac&aat· iaatcfagal fíglacagtt tttgacacca gaceaactgg taa <210> 3 <211> 76 <212> ADN <213> mus <4 00> 3 cacacaccat ggggitcgacg atgagcgigt acaglggagg ttcaggcgga Icaagccagc cagaatcaga gaggac 76 <210> 4 <211> 34 <212> ADN <213> mus <4 00> 4 gagagaacta gtggggc^g tcagatat.ee ggag 34 <210> 5 <211> 136 72 ΡΕ1238283 <212 > ADN <213> mus <4 00> 5 cacacâceat gggactcgag gaggtactag tggsggttea eaccatcatc accaccatgc 60 ageggefcctg aacgatattt tcgaagctcâ gaaaatcgaa fcggeaegagt agtetagacg 120 tccaggcacc agagag 136 <210> 6 <211> 45 <212> ADN <213> mus <4 00> 6 cacacatda gataaggatc eaígaaggaí aacaccgigc caclg: 45 <210> 7 <211> 41 <212> ADN <213> mus <4 00> 7 cacacaggía ccaagcM ttttdgcac tacgeaggga t 41 <210 > 8 <211> 42 <212> ADN <213> mus <4 00> 8 ctcatgiaca gtggaggllc aggaggctcg agccagccag aa 42 <210> 9 <211> 114 <212> ADN <213> mus <4 00> 9 cacacaígta cagtggaggt tcaggcggd cgagcgagaa cdtgcaccg ggacgcaaca 80 aeagíaaagg aagaagtdí atêggcagat tagaaaccca gcdtccaalc adg 114 <210> 10 <211> 112 <212> ADN <213> mus <4 0 0 > 10 cacacaacta gtgaccgtgg tcagctíccc ggtgaggatg gacgcagaga adcatcgat ggaaaagcd ggitctaccg gaaccccttt eccagtgatt ggaggdggg t 112 60 73 ΡΕ1238283 <210 > 11 <211> 135 <212 > ADN <213> mus <4 Ο Ο > 11

ígtacagtgg aggtícaggc ggciegagcg gcaiaaatyt tcagacaac ícagcaaagc taactílaactafeagagi tttaalgggg gtccccaaaa taccttgaa gaafícocac tftdgacat agagg 135 <210> 12 <211> 134 <212> ADN <213> humano <4 O O > 12 adagtadí aaggaadie icaggtatec tatggtagea iíaítcacgt ggagagítga 60 aaSadglcc ícgggacad ccgcMat agttgtggig gdcdgtcc agecddat 120 gtcagaaagtggga 134 <210> 13 <211> 115 <212> ADN <213> humano <400> 13 caeacactcg agcggicggca cecagacccc cagcgtctac gacgagagcg ggagcaccgg 80 aggtgg^at gacagcacgc cdcaaícd gcdgeccec cgeggdaec caggc 115 <210> 14 <211> 113 <212> ADN <213> humano <220> <4 0 0 > 14 ígtgtgada gleetggtgy gcacccagcc cagaagcagl gcccgfejagc tgtccggaag 80 decagggíg tcactgícat tggcacagac ttggcetggg tagccgeggg ggg 113

<210> 15 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de ratinho flanqueada por sequências não relacionadas <400> 15 74 ΡΕ1238283

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gin Pro Glu Ser Glu Arg Thr Aep Ala 1 5 10 15 Thr Vai Asn Pro Arg Ser Phe Phe Leu Arg Asn Pro Ser Glu Asn Thr 20 25 30 Phe Gltt Leu Vai Pro Leu Gly Asp Glu Glu Glu Glu Glu Lys Asn Glu 35 40 45 Ser Vai Leu Leu Glu Gly Arg Ala Vai Tyr Leu Asn Ile Ser Leu Pro 50 55 SO Pro HiS Thr Pro Pro Pro Pro Phe Ile Ser Glu Asp Ala Ser Gly Tyr €5 70 75 80 Leu Thr Ser Pro Thr Ser Gly Gly Ser Eis His His His His His Gly 85 SQ 95 Gly Ser Leu Asn Asp ile Phe Glu Ala Gin Lys Phe Glu Trp His Glu 100 105 110

<210 > 16 <211> 87 <212 > PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <2 2 3 > Descrição da Sequência Artificial: sequência de ratinho flanqueada por sequências não relacionadas <4 0 0 > 16 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Asn 1 5 Lys Gly Arg Ser Leu Ile Gly Arg 20 Gly Lys Gly Vai Pro Vai Glu Pro 35 40 Ala Ser Ile Leu Thr Gly Lys Leu 50 55 His HiS His His Hís Bis Gly Gly 65 70 Gin Lys Phe Glu Trp His Glu 85 <210> 17 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência Artificial

Leu Ala Pro Gly Arg Asn Asn Ser10 15 teu Glu Thr Gin Pro Pro Ile Thr 25 30 Gly Phe Ser Ile hsp Glu Phe Ser 45 thr Thr Vai Thr Ser Gly Gly Ser €0 Ser Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala 75 80 <220> sequência de ratinho <223> Descrição da Sequência Artificial: flanqueada por sequências não relacionadas 75 ΡΕ1238283 <4 0 0 > > 17 oiy ciy Ser Gly Gly sar Ser Gly Xle Mn Vai ser Asp Ase Ser Ala 1 5 10 15 LyS Pro ftr Leu Thr Xle Lys Ser Phe Asn Gly Gly Pro Gin Asn Thr 20 25 30 Phe Glu Glu Phe Pro Leu Ser Asp lie Glu Gly Trp Thr Gly Ala Thr 35 40 45 Thr Thr lie Lys Ala Glu Cys Pro Glu Asp Ser lie Ser Thr Leu His 50 55 60 Vai Asn Asn. Ala Thr Xle Gly Tyr Leu Arg Ser Ser Leu Ser Thr Ser §5 70 75 80 Gly Gly Ser His His His Hís Hís His Gly Gly Ser Leu Asn Asp Ile 85 9Õ $5 Phe Glu Ala Gin Lys Phe Glu Trp HÍS Glu 100 105

<210 > 18 <211> 96 <212 > PRT <213> Sequência Artificial <220> <2 2 3 > Descrição da Sequência Artificial: sequência de ratinho flanqueada por sequências não relacionadas <4 0 0 > 18

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Thr Gin Thr Pro Ser 'Vai Tyr 1 5 10 15 ASp Glu Ser Gly Ser Thr Gly Gly Gly Asp Asp Ser Thr Pro Ser lie 30 25 30 Leu Pro Ala Pro Arg Gly xyr Pro Gly Gin Vai Cys Ala Asn Asp Ser 35 40 45 Asp Thr Leu GlU Leu Pro Asp Ser Ser Arg Ala Leu Leu Leu Gly Trp 50 55 60 Vai ;pro· Thr Arg Thr Ser Gly Gly Ser His His His Eis His Hís Gly 65 70 75 80 Gly Ser Leu Asn Asp 11 e Phe Glu Ala Gin Lys Phe Glu Trp· His Glu 85 90 95

Lisboa, 21 de Março de 2007

Claims (13)

1. ΡΕ1238283 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de identificação ou detecção de uma molécula que cliva PAR, compreendendo o referido método os passos de: a) proporcionar um péptido de clivagem de PAR imobilizado ligado a uma molécula repórter; b) colocar o péptido de clivagem de PAR imobilizado em contacto com uma molécula que cliva PAR; e c) detectar a molécula repórter libertada.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que o referido péptido de clivagem de PAR compreende VNPR, SKGR, LTIK ou PAPR.
3. 3. Método da reivindicação 1 ou 2, em que o referido péptido de clivagem de PAR é ligado a uma porção de biotina e é imobilizado através de uma interacção biotina-avidina ou biotina-estreptavidina.
4. 4. Método da reivindicação 1, 2 ou 3 compreendendo ainda a determinação do local de clivagem do referido péptido de clivagem de PAR pela referida molécula que cliva PAR.
5. 5. Método da reivindicação 4, em que a referida molécula que cliva PAR é identificada como sendo um 2 ΡΕ1238283 activador de PAR se o referido local de clivagem estiver num local de clivagem biológica.
6. 6. Método da reivindicação 4, em que a referida molécula que cliva PAR é identificada como um inactivador de PAR se o referido local de clivagem não estiver num local de clivagem biológica.
7. 7. Método das reivindicações 1, 2, 3 ou 4 compreendendo ainda a colocação do péptido de clivagem de PAR imobilizado em contacto com um potencial modulador de PAR e a determinação de uma mudança ao nivel da molécula repórter libertada em comparação com quando o referido modulador de PAR está ausente.
8. 8. Método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida molécula repórter é uma enzima repórter.
9. 9. Método da reivindicação 8, em que a referida enzima repórter é seleccionada a partir do grupo que consiste em beta-galactosidase, glucosidases, cloranfe-nicol-acetil-transferase (CAT), glucoronidases, luciferase, peroxidases, fosfatases, oxido-redutases, desidrogenases, transferases, isomerases, cinases, redutases, desaminases, catalases e urease.
10. 10. Método da reivindicação 9, em que a referida enzima repórter é beta-galactosidase. 3 ΡΕ1238283
11. 11. Método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido péptido de clivagem de PAR é imobilizado numa placa de múltiplos poços, num gel, numa matriz, numa conta, numa membrana ou num tubo.
12. 12. Estojo compreendendo uma proteína de fusão de PAR, em que a proteína de fusão de PAR é uma proteína de fusão de PAR com um repórter enzimático, e em que a referida proteína de fusão de PAR é imobilizada num suporte sólido, para utilizar nos métodos das reivindicações 8 ou 9.
13. 13. Estojo da reivindicação 12, em que a referida proteína de fusão de PAR é uma proteína de fusão de PAR e beta-galactosidase. Lisboa, 21 de Março de 2007