JPH04318462A - 固相生物学的特異反応測定法およびそのための器具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生物学的特異反応に基
づく物質の測定方法およびそのための器具に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】被測定物質と特異的に反応する物質を、
多孔質マトリックス固相化し、被測定物質を分析する方
法は、例えばＭｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙＶｏ１，７３，１９８１，ｐ６４６−６５６に
ＩｇＥの測定が示されているように、公知である。また
多孔質マトリックスの素材としてガラス、金属、ポリエ
チレン、多糖類等からなるフィルターを使用し得ること
が、特表昭６０−５００３８４号公報に記載されている
。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記公報においては、
多孔質マトリックスとして、種々の材料が例示されてい
るが、推奨されているのは、多糖類であり、また実施例
において具体的に使用されているのは、従来からブロッ
ティングで使用されていたセルロースである。しかし、
セルロースから成る多孔質マトリックスでは構造が緻密
過ぎて、液の流れが悪く、大量の検体を測定することは
困難であり、簡便性に欠けていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、多孔質マト
リックスを固相とする分析方法において、特定範囲の繊
維径を有するガラス繊維で構成されたフィルターを使用
することによって、簡便で安定性及び精度の優れた測定
ができることを見い出し本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明の要旨は、平均直径が０
．３〜２．０μｍの範囲のガラス繊維で構成されたフィ
ルターに被測定物質と特異的に反応する第一の物質を結
合した多孔質マトリックスを固相とし、その下部に多孔
質マトリックスを通過した溶液を吸収するための吸収層
を、逆流防止層を介してあるいは介さずに設けた固相生
物学的特異反応測定器具の多孔質マトリックスの上部か
ら、 Ａ．被測定物質を含む試料、 Ｂ．検出可能なシグナル発生物質を結合した、被測定物
質または該第一の物質と特異的に反応する第二の物質お
よび Ｃ．洗浄液 を順次供給し、シグナル発生物質を測定することによっ
て、多孔質マトリックス上に残った被測定物質の量を求
めることを特徴とする固相生物学的特異反応測定方法並
びに平均直径が０．３〜２．０μｍの範囲のガラス繊維
で構成されたフィルターに被測定物質と特異的に反応す
る物質を結合した多孔質マトリックスを固相とし、その
下部に多孔質マトリックスを通過した溶液を吸収するた
めの吸収層を、逆流防止層を介してあるいは介さずに設
けた固相生物学的特異反応測定器具に存する。

【０００６】一般にガラス繊維フィルターは蛋白成分を
吸着しにくいことが知られているが、上記範囲の平均直
径を有するガラス繊維で構成されたフィルターは充分蛋
白成分を吸着し、常に安定した分析結果をもたらすとい
うことは驚くべきことである。

【０００７】本発明において使用されるガラス繊維の長
さは特に限定されるものではないが、平均繊維長は０．
５〜２ｍｍの範囲が好ましい。

【０００８】本発明において使用される吸収層は、液体
を吸収するものであれば特に限定されないが、例えばセ
ルロースまたはセルロース誘導体を主成分とする紙の重
層物が使用される。

【０００９】本発明において逆流防止層は必須ではない
が、必要により多孔質マトリックスと吸収層の間に設け
てもよい。逆流防止層の材質としては、例えば疎水性の
不織布シート、ウェーブ材等が挙げられる。

【００１０】本発明の測定法は、生物学的特異反応に基
づくものであり、このような特異反応の例としては、（
１）　　抗原−抗体反応 （２）　　核酸のハイブリダイゼーション（３）　　糖
鎖−レクチン反応 （４）　　アビジン−ビオチン反応 等が挙げられる。

【００１１】また、本発明において使用する第一物質お
よび第二物質の組み合わせ例としては、抗原−抗体、Ｄ
ＮＡ（またはＲＮＡ）−相補的ＤＮＡ（またはＲＮＡ）
、糖−レクチン、アビジン−ビオジン等が挙げられる。

【００１２】フィルターに第一物質を結合させる方法と
しては、例えばフィルターに第一物質を含む溶液を通過
させてやればよい。該溶液が低濃度（１０μｇ／ｍｌ程
度）の場合は吸引濾過し、高濃度（１０００μｇ／ｍｌ
程度）の場合は、上から溶液を滴下して自然濾過するの
みでよい。

【００１３】本発明において使用する検出可能なシグナ
ル発生物質の例としては、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、リン
ゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン脱水素酵素、グ
ルコースオキシダーゼ、インベルターゼ等の酵素、１２
５　Ｉなどのラジオアイソトープ、フルオレセイン　　
イソチアネート（ＦＩＴＣ）、ウンベリフェロン、４−
メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）、テトラメチルロー
ダミン、テトラメチルローダミン　　イソチオシアナー
ト、ジメチルアミノナフタレン−５−スルフォニルクロ
ライド、フルオラム等の発光物質、アクリジニウムエス
テル、アクリジニウムスルホンアミド、ルミノール等の
発光物質、着色微粒子、金属等のその他の物質を挙げる
ことができる。

【００１４】シグナル発生物質を測定する方法は、公知
の方法に従って行えば良く、例えばシグナル発生物質が
酵素の場合は、基質と反応させた後、反射吸光度を測定
すればよい。また、シグナル発生物質がラジオアイソト
ープの場合は、スキャナーによりカウントすればよく、
シグナル発生物質が発光物質の場合は、蛍光をカウンタ
ーにより測定すればよい。

【００１５】本発明において使用する洗浄液は特に限定
されるものではないが、通常は生理食塩水、蒸溜水等が
使用される。

【００１６】本発明において、測定の対象となる物質と
しては、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝
炎ウィルス、Ｄ型肝炎ウィルス、Ｅ型肝炎ウィルス、Ｈ
ＩＶ、ＩＩＴＬＶ−Ｉ、ヘルペスウィルス、ロタウィル
ス、トキソプラズマ、ルベラ、クラミジア、ルピロヘー
タ等の感染症関係のマーカー、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１
９−９、ＣＡ１２５、フェリチン、ＤＵＰＡＮＩＩ、ヘ
モグロビン等の腫瘍マーカー、ＣＲＰ、ＡＳＯ、ＲＦ等
の炎症関係のマーカー、アポリポプロティン類、β２　
−マイクログロブリン等の血漿蛋白その他抗原特異Ｉｇ
Ｅ等を例示することができる。

【００１７】

【実施例】以下、具体的な例を挙げて本発明を説明する
。 実施例１ ＡＦＰ（α−フェトプロティン）の定量（反応器具の調
製）平均繊維径１．０μｍ、平均繊維長１ｍｍのガラス
繊維（日本板硝子株式会社製）からなるフィルターを蒸
留水に浸し、そのまま市販のドットブロット装置に挟ん
だ。ペリスタポンプにてドットブロット装置内部を減圧
にし、その注入口より Ａ．０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）１００μｌ Ｂ．抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ、０
．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０））　　１００μｌ
Ｃ．０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）　　１００
μｌ Ｄ．５％グリセロールおよび１％牛血清アルブミンを含
む緩衝化生理食塩水（以下５％グリセロール、１％ＢＳ
Ａ−ＰＢＳ）　　１００μｌ を、直前に供給された液が吸引されるのを待って、順次
供給した。その後、フィルターをドットブロット装置か
ら外し、濾紙上で余分な水分を除いたのち、５％グリセ
ロール、１％ＢＳＡ−ＰＢＳに１０分浸した。濾紙上で
余分な水分を除いたのち、減圧下フィルターを乾燥し、
使用時まで冷所に保存した。使用時、フィルターを円形
に切り放し、開口部を有する容器の開口部側にセットし
、さらに、オレフィン系の不織布、セルロースからなる
吸収層を順次積層し、最後に底板により積層物が落ちな
いよう固定し、反応器具とした。

【００１８】（標識抗体の調製）抗ＡＦＰモノクローナ
ル抗体１０ｍｇと西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ１０
ｍｇをナカネ法に従い結合させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　　
Ｇ−２００カラムを使用して分画し、抗ＡＦＰモノクロ
ーナル抗体と西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼが結合し
た部分を濃縮し冷所に保存した。

【００１９】（分析の実施）上記に記載したように調製
した反応器具の開口部から２５％ブロックエース（雪印
乳業製）を含む緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）１００
μｌを供給し、フィルターを含水状態とした。その後、
Ａ．ＡＦＰを含む試料５０μｌ、 Ｂ．２．で調製した標識抗体（１％ＢＳＡを含む緩衝化
生理食塩水（ｐＨ７．２）で適度に希釈）　　１００μ
ｌを直前に供給した溶液が完全に吸収されるのを待って
順次供給した。さらに０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）１００μｌを２回、直
前に供給した溶液が完全に吸収されるのを待って供給し
、フィルター内に残った過剰の標識抗体を洗浄、除去し
た。西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼの基質として、Ｍ
ＣＤＰ（協和メデックス製）溶液（ｐＨ５．０）５０μ
ｌを供給し１分間反応後、主波長６３０ｎｍ、副波長８
００ｎｍにて反射吸光度を読み取った。

【００２０】試料中のＡＦＰ濃度の増加にともない、反
射吸光度が増加し、定量性のあることが確認された。結
果を表１に示す。

【表１】 このことから繊維径１．０μｍという、繁用されるガラ
ス繊維フィルターに比べ細いガラス繊維からなるフィル
ターは分析に適していると言える。

【００２１】比較例１ バッテリーのセル間の隔壁用に繁用されている平均繊維
径４．０μｍ、平均繊維長２．５ｃｍのガラス繊維から
なるフィルターを使用し、実施例１と同様に反応容器の
調製、標識抗体の調製、分析を行った。試料中のＡＦＰ
濃度によらず全く反射吸光度の増加が見られなかった。 結果を表１に示す。 実施例１、比較例１の比較により、繁用されているバッ
テリー隔壁用のガラス繊維フィルターは、分析に使用す
ることができず、分析には繁用されている繊維径より細
い繊維径のガラス繊維からなるフィルターが必要なこと
がわかる。

【００２２】実施例２ 繊維長および繊維径が異なるガラス繊維から構成された
フィルターを使用し、実施例１と同様に反応容器、標識
抗体を調製し、分析を行った。なお、使用した長繊維長
フィルターは、平均繊維長が５ｍｍで平均繊維径が、各
０．６５、０．８、１．５０、２．００、４．００μｍ
で、短繊維長フィルターは、平均繊維長が１ｍｍで平均
繊維径が、各０．５０、０．６５、１．００、１．８０
、２．７０μｍである。分析結果は図１に示す如く、フ
ィルターを構成するガラス繊維の繊維径に大きく依存し
、また短繊維長のほうが好ましいことが明かとなった。

【００２３】実施例３ ＣＲＰ（Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ）の
定量 （反応器具の調製）エンゾ社製ガラス繊維フィルター（
平均繊維径０．６５μｍ、平均繊維長１ｍｍ）を開口部
を有する容器の開口部側に接着剤で接着した。開口部の
反対側から真空ラインにより減圧とした後、メタノール
　　１００μｌを開口部より添加し、フィルターを均一
に濡らし、さらに Ａ．０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）　　１００
μｌＢ．抗ＣＲＰポリクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ
、０．１Ｍクエン酸緩衝液　　　　（ｐＨ３．０））　
　１００μｌＣ．０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０
）　　１００μｌＤ．５％グリセロール、１％ＢＳＡ−
ＰＢＳ　　１００μｌを、直前に供給された液が吸引さ
れるのを待って、順次供給した。さらに、フィルターの
背後からオレフィン系の不織布、セルロース誘導体から
なる吸収層を順次積層し、最後に底板により、積層物が
落ちないよう固定して反応容器とした。

【００２４】（標識抗体の調製） アルカリフォスファターゼへのマレイミド基の導入牛小
腸由来アルカリフォスファターゼ（ベーリンガー製）４
ｍｇに対し、Ｎ−サクシニミジル　　４−（Ｎ−マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート１
．９ｍｇを添加し、室温で９０分間反応した。その後Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムクロマトグラフィーを実
施し、蛋白部分を集めた。 Ｆａｂ’の調製 抗ＣＲＰポリクローナル抗体１５ｍｇに豚胃由来ペプシ
ン１．０ｍｇを混合し、３７℃で２４時間反応を行い、
Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　　ＡｃＡ４４カラムクロマトグラフ
ィーでＦ（ａｂ’）２　部分を集めた。引続き、集めた
Ｆ（ａｂ’）２　３ｍｇに対し、０．１Ｍの２−メルカ
プトエチルアミン　　５０μｌを添加し、３７℃で９０
分間反応を行った。Ｓｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−２５カラ
ムクロマトグラフィーを実施し、Ｆａｂ’部分を集めた
。 アルカリフォスファターゼ−Ｆａｂ’複合体の調製調製
したマレイミド−アルカリフォスファターゼ１．０ｍｇ
と、調製した抗ＣＲＰ　　Ｆａｂ’４．８ｍｇを混合し
、４℃で２０時間反応を行った。Ｓｈｐｈａｄｅｘ　　
Ｇ−２００カラムクロマトグラフィーを実施し、アルカ
リフォスファターゼ−Ｆａｂ’複合体部分を集めて濃縮
し、終濃度１０％となるようＢＳＡを加え、保存した。

【００２５】（分析の実施）上記で調製した反応器具の
開口部から２５％ブロックエース（雪印乳業製）を含む
緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）１００μｌを供給し、
フィルターを含水状態とした。その後、Ａ．ＣＲＰを含
む試料　　５０μｌ Ｂ．２．で調製した標識抗体（１％ＢＳＡを含む緩衝化
生理食塩水（ｐＨ７．２）で適度に希釈）　　１００μ
ｌを直前に供給した溶液が完全に吸収されるのを待って
順次供給した。さらに０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）１００μｌを２回、直
前に供給した溶液が完全に吸収されるのを待って供給し
、フィルター内に残った過剰の標識抗体を洗浄、除去し
た。アルカリフォスファターゼの化学発光基質としてＬ
ｕｍｉｐｈｏｓ５３０（ルミジェン社製）溶液　　５０
μｌを供給し、３０秒から９０秒の間の発光強度の増加
をフォトンカウンター（浜松フォトニクス製）にて読み
取った。

【００２６】試料中のＣＲＰの濃度の増加に比例して、
発光強度が増加し、定量性のある事が確認できた。結果
を表２に示す。実施例１の結果と同様、繊維径０．６５
μｍの細いガラス繊維からなるフィルターは、やはり分
析に適している。

【表２】

【００２７】比較例２ バッテリーのセル間の隔壁用に繁用されている平均繊維
径４．０μｍ、平均繊維長２．５ｃｍのガラス繊維から
なるフィルターを使用し、実施例１と同様に反応容器の
調製、標識抗体の調製、分析を行った。試料中のＣＲＰ
濃度によらず全く発光強度の増加が見られなかった。結
果を表２に示す。

【００２８】

【発明の効果】本発明によれば、生物学的特異反応物質
を安定して精度良く測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】繊維長と繊維径の異なるガラス繊維で構成され
たフィルターについての相対感度の比較を示す。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　平均直径が０．３〜２．０μｍの範囲
   のガラス繊維で構成されたフィルターに被測定物質と特
   異的に反応する第一の物質を結合した多孔質マトリック
   スを固相とし、その下部に多孔質マトリックスを通過し
   た溶液を吸収するための吸収層を、逆流防止層を介して
   あるいは介さずに設けた固相生物学的特異反応測定器具
   の多孔質マトリックスの上部から、 Ａ．被測定物質を含む試料、 Ｂ．検出可能なシグナル発生物質を結合した、被測定物
   質または該第一の物質と特異的に反応する第二の物質お
   よび Ｃ．洗浄液 を順次供給し、シグナル発生物質を測定することによっ
   て、多孔質マトリックス上に残った被測定物質の量を求
   めることを特徴とする固相生物学的特異反応測定方法。
2. 【請求項２】　　ガラス繊維の平均繊維長が０．５〜２
   ｍｍである請求項１記載の固相生物学的特異反応測定方
   法。
3. 【請求項３】　　第一の物質および第二の物質が抗原ま
   たは抗体である請求項１記載の固相生物学的特異反応測
   定方法。
4. 【請求項４】　　検出可能なシグナル発生物質が酵素で
   ある請求項１記載の固相生物学的特異反応測定方法。
5. 【請求項５】　　平均直径が０．３〜２．０μｍの範囲
   のガラス繊維で構成されたフィルターに被測定物質と特
   異的に反応する物質を結合した多孔質マトリックスを固
   相とし、その下部に多孔質マトリックスを通過した溶液
   を吸収するための吸収層を、逆流防止層を介してあるい
   は介さずに設けた固相生物学的特異反応測定器具。
6. 【請求項６】　　ガラス繊維の平均繊維長が０．５〜２
   ｍｍである請求項５記載の固相生物学的特異反応測定器
   具。