KR20070012419A - 면역학적 정량법과 시약 - Google Patents

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Abstract

리간드를 고상 복합체로서 고정시키고 고상 복합체에 대하여 리간드의 농도를 면역학적 정량법에 의해 측정하는 방법. 이 방법은 하기 (1), (2) 의 공정 의 공정을 포함한다.
(1) 리간드, 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질 및 리간드에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질을 용매 중에서 접촉시켜서 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 리간드 - 제 2 표지 특이적 결합 물질 복합체를 생성시키고, 그리고
(2) 상기 복합체를, 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자와 접촉시켜서 상기 복합체와 상기 담지 고상 입자가 제 1 표지 물질을 통하여 결합된 고상 복합체를 생성시킨다.

Description

면역학적 정량법과 시약{IMMUNOLOGICAL ASSAY METHOD AND REAGENT}
본 발명은 면역학적 정량법 및 시약에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 짧은 반응 시간에 고감도화가 가능한 면역학적 정량법 및 시약에 관한 것이다.
종래 불균일계 면역학적 측정법으로서, 일본 공개특허공보 평7-306204호에는, 리간드가 결합된 미립자를 액체에 분산시켜서 다공성 매트릭스 상에 적하하여 포착하고, 측정 대상 물질을 함유한 검체를, 상기 미립자를 포착한 다공성 매트릭스 상에 적하하고, 또한 그 위에 표지물이 결합된 표지 리간드를 적하하여 면역 복합체를 형성하고, 이어서 그 면역 복합체에 대하여 그 표지물을 측정하는 방법, 면역 측정법이 개시되어 있다. 이 방법은, 상기한 바와 같이, 다공성 매트릭스 상에서 면역 복합체를 형성하는 불균일 반응을 2 번 행하는 순서를 포함하고, 면역 복합체의 형성이 충분하지 않기 때문에, 감도가 올라가지 않는 난점이 있다.
일본 공개특허공보 소60-250257호에는, 리간드에 대한 특이적 결합 물질을 고상에 고정시키고, 공시 시료와 반응시켜, 비오틴 - 표지 리간드 특이적 결합 물질과 반응시키고, 또한 표지 라벨의 안티비오틴과 반응시켜, 미반응 시약을 분리하고, 그리고 고상 또는 미반응 시약 중의 표지의 존재를 측정하여 공시 시료에 존재하는 리간드의 양을 검출하는 면역학적 측정법이 개시되어 있다.
상기 방법에서는, 리간드에 대한 특이적 결합 물질이 고상으로 고정되어 있기 때문에, 그 이후의 2 개의 반응 즉 비오틴 표지의 리간드에 대한 특이적 결합 물질과의 반응 및 표지 라벨의 안티비오틴과의 반응이 모두 불균일계에서 행해지기 때문에, 일본 공개특허공보 평7-306204호에 기재된 방법과 마찬가지로 면역 복합체의 형성이 충분하지 않고, 감도의 상승이 충분하지 않은 난점이 있다.
또한, 일본 공개특허공보 평4-318462호에는, 유리 섬유 필터에 피측정 물질과 특이적으로 반응하는 제 1 물질이 결합된 다공질 매트릭스를 준비하고, 그 위에, 순차적으로, 피측정 물질을 함유한 시료, 검출 가능한 시그널 발생 물질을 결합한, 피측정 물질 또는 제 1 물질과 특이적으로 반응하는 제 2 물질 및 세척액을 공급하여, 다공질 매트릭스 상에 잔존하는 면역 복합체에 대하여 시그널 발생 물질을 측정하여 피측정 물질의 양을 구하는 고상 생물학적 특이 반응 측정 방법이 개시되어 있다.
상기 방법도 또한, 유리 섬유 필터 상에서 면역 복합체를 형성하는 불균일 반응을 2 번 행하는 순서를 포함하는, 일본 공개특허공보 평7-306204호 방법과 동일한 난점을 수반한다.
또, 일본 공개특허공보 2001-235471호에도, 일본 공개특허공보 평4-318462호와 반응의 순서는 상이하지만, 면역 복합체를 형성하기 위한 불균일 반응을 다공성 필터 상에서 행하는 순서를 포함하는 면역학적 측정법이 개시되어 있다.
또한, 상기 방법에 있어서의 유리 섬유 필터 등의 다공질 매트릭스는 사용할 때, 비특이적 반응을 억제하기 위해서 미리 블록액으로 처리되지만, 종래 알려진 블록액은 인산 완충 생리 식염수를 베이스로 하기 때문에, 어떤 종류의 면역학적 정량법에는 비특이적 반응이 일어나기 쉽고, 또 그것에 기인하여 재현성도 떨어졌다.
한편, 유리 섬유 필터와 같은 필터에 면역 복합체를 포착하기 위해서, 필터의 하방으로부터 강제적으로 흡인하는 방법이 행해진다 (일본 공개특허공보 평6-148184호, 일본 공개특허공보 평6-258322호, 일본 특허 제2935965호 및 일본 특허 제3134231호 참조). 그러나, 종래의 흡인 방법에서는 액이 급격하게 필터를 통과하기 때문에, 면역 복합체의 필터에 확실하게 포착되기 어렵거나, 또는 그것을 막으려고 하면 압력 센서 등을 여분으로 형성하거나 할 필요가 있었다.
발명의 개시
본 발명의 목적은, 짧은 반응 시간에 고감도화가 가능한 면역학적 정량법을 제공하는 것에 있다.
본 발명 다른 목적은, 리간드와, 리간드에 대한 특이적 결합 물질과의 반응을 균일계에서 반응시켜서 리간드와 특이적 결합 물질의 반응 생성물인 복합체를 생성시키고, 그 후 특이적 결합 물질을 통하여 고상 입자에 고정시킴으로써, 상기 반응을 단시간에 충분히 진행시켜서 충분한 감도를 달성할 수 있는 면역학적 정량법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법에 의해 고상 입자에 고정된 리간드를 다공질 섬유 매트릭스로 포착함으로써, 포착을 확실하게, 또한 리간드의 존재량을 검출하기 쉬운 상태로 행할 수 있는 면역학적 정량법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 측정 대상의 리간드의 종류에 관계없이, 상기 복합체를 고정시키기 위한 고상 입자를 미리 준비해 둘 수 있고, 그 때문에 여러 가지 리간드의 정량에 적용 가능한 면역학적 정량법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 압력 센서 등의 복잡한 기구나 흡인 압력의 미(微)조정을 필요로 하지 않는 흡인 기구를 함유하는 면역학적 정량법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 액이 천천히 매트릭스를 여과하도록 하여 고상 면역 복합체를 확실하게 포착하는 것을 가능하게 하는 흡인 구조를 함유하는 면역학적 정량법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 여과 매트릭스의 하방에 흡수층을 형성하지 않아도 여과를 원활하게 행할 수 있고, 그 때문에 흡수층에 면역 반응 잔여물이 함유되기 때문에 일어나는 오(誤)검지를 방지하는 것을 가능하게 한 흡인 기구를 함유하는 면역학적 정량법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 여과 매트릭스 상에서 면역 반응을 행하지 않고, 그 때문에 여과 매트릭스에 대한 면역 반응 성분의 비특이적 흡착을 방지하는 것을 가능하게 하는 면역학적 정량법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명의 상기 면역학적 정량법에 사용되는 면역학적 정량 시약을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은, 본 발명의 면역학적 정량법에 바람직한 면역학적 블록액을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 이하의 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 상기 목적 및 이점은, 첫번째로,
리간드를 고상 복합체로서 고정시키고 그 고상 복합체에 대하여 리간드의 농도를 면역학적 정량법에 의해 측정하는 방법에 있어서,
(1) 리간드, 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질 및 리간드에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질을 용매 중에서 접촉시켜서 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 리간드 - 제 2 표지 특이적 결합 물질 복합체를 생성시키고,
(2) 상기 복합체를, 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자와 접촉시켜서 상기 복합체와 상기 담지 고상 입자가 제 1 표지 물질을 통하여 결합된 고상 복합체를 생성시키고,
그리고
(3) 상기 공정 (2) 에서 생성한 고상 복합체를 리간드의 농도 측정용으로 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 방법 (이하, 제 1 방법이라고 하는 경우가 있다.) 에 따라 달성된다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 상기 목적 및 이점은, 두번째로,
리간드의 측정을 위한 면역학적 정량법으로서,
(1) 리간드, 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질 및 리간드에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질을 용매 중에서 접촉시켜서 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 리간드 - 제 2 표지 특이적 결합 물질 복합체를 생성시키고,
(2) 상기 복합체를, 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자와 접촉시켜서 상기 복합체와 상기 담지 고상 입자가 제 1 표지 물질을 통하여 결합된 고상 복합체를 생성시키고,
그리고
(3) 상기 고상 복합체를 다공질 섬유 매트릭스에 포착하여 고상 복합체 포착 매트릭스를 생성하고, 그리고
(4) 상기 고상 복합체 포착 매트릭스에 대하여 제 2 표지 특이적 결합 물질의 그 제 2 표지 물질의 존재량을 측정하는 것을 특징으로 하는 면역학적 정량법 (이하, 제 2 방법이라고 하는 경우가 있다.) 에 따라 달성된다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 상기 목적 및 이점은, 세번째로,
리간드를 고상 복합체로서 고정시키고 그 고상 복합체에 대하여 리간드의 농도를 면역학적 정량법에 의해 측정하는 방법에 있어서,
(1) 리간드, 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질 및 제 1 표지 특이적 결합 물질에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질을 용매 중에서 접촉시켜서 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 리간드 복합체 및 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 제 2 표지 특이적 결합 물질 복합체의 혼합물을 생성시키고,
(2) 상기 복합체 혼합물을, 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자와 접촉시켜서 상기 복합체 각각과 상기 담지 고상 입자가 제 1 표지 물질을 통하여 결합된 고상 복합체 혼합물을 생성시키고,
그리고
(3) 상기 공정 (2) 에서 생성한 고상 복합체 혼합물을 리간드의 농도 측정용으로 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 방법 (이하, 제 3 방법이라고 하는 경우가 있다.) 에 따라 달성된다.
또, 본 발명에 의하면, 본 발명의 상기 목적 및 이점은, 네번째로,
리간드의 측정을 위한 면역학적 정량법으로서,
(1) 리간드, 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질 및 제 1 표지 특이적 결합 물질에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질을 용매 중에서 접촉시켜서 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 리간드 복합체 및 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 제 2 표지 특이적 결합 물질 복합체의 혼합물을 생성시키고,
(2) 상기 복합체 혼합물을, 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자와 접촉시켜서 상기 복합체의 각각과 상기 담지 고상 입자가 제 1 표지 물질을 통하여 결합된 고상 복합체 혼합물을 생성시키고,
그리고
(3) 상기 고상 복합체 혼합물을 다공질 섬유 매트릭스에 포착하여 고상 복합체 포착 매트릭스를 생성하고, 그리고
(4) 상기 고상 복합체 포착 매트릭스에 대하여 제 2 표지 특이적 결합 물질의 그 제 2 표지 물질의 존재량을 측정하는 것을 특징으로 하는 면역학적 정량법 (이하, 제 4 방법이라고 하는 경우가 있다.) 에 따라 달성된다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 상기 목적 및 이점은, 다섯번째로,
어떤 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질, 어떤 리간드에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질, 그 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자 및 다공질 섬유 매트릭스의 조합을 갖는 것을 특징으로 하는, 리간드의 측정을 위한 면역학적 정량 시약에 의해 달성된다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 상기 목적 및 이점은, 여섯번째로,
카세인, 비이온성 계면 활성제 및 칼슘 이온과 반응하여 수불용성 염을 형성하지 않는, pH7 ∼ 9 의 완충 능력을 갖는 완충제를 함유하고, 또한 pH7 ∼ 9 의 수용액으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 면역학적 블록액에 의해 달성된다.
발명의 바람직한 실시 형태
이하, 본 발명 방법을 상기 기술한다. 먼저, 제 1 방법에 대하여 설명한다. 제 1 방법에서는, 공정 (1) 에 있어서, 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 리간드 - 제 2 표지 특이적 결합 물질 복합체를 균일계에서 생성시킨다. 리간드는 항원 및 항체 중 어느 것이어도 된다. 예를 들어, AFP, CA19-9, CA125, PSA, 페리틴, CEA, CA15-3 등의 종양 마커; TSH, T3, T4, LH, FSH, hCG, 프로락틴, hGH, 가스트린, 소마토스타틴, 글루카곤, 인슐린 등의 호르몬; IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, TBG, CRP, β2-마이크로글로블린과 같은 단백질; 엘라스타아제, 알칼리포스파타아제, 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제, 리보뉴클레아제, 에놀라아제 등의 효소; 간염 바이러스, 에이즈 바이러스 등의 바이러스 및 바이러스에 대한 항체 등을 들 수 있다.
리간드를 함유하는 검체로서는, 예를 들어, 혈액 (혈청이나 혈장을 함유함), 림프액, 타액, 소변 등의 체액; 변이나 생체 유래의 조직의 추출액 등을 들 수 있다.
또, 제 1 표지 특이적 결합 물질 및 제 2 표지 특이적 결합 물질에 있어서의 당해 특이적 결합 물질은 동일해도 되고 상이한 물질이어도 되며, 모두 리간드에 대하여 특이적인 결합성을 갖는 것으로, 예를 들어, 항체, 항원, 렉틴, 프로테인 A등을 들 수 있다.
제 1 표지 특이적 결합 물질의 당해 표지로서는, 예를 들어, 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 당쇄 등을 들 수 있다.
또, 제 2 표지 특이적 결합 물질의 당해 표지로서는, 예를 들어, 아이소토프 (125I 등), 효소 (퍼옥시다아제, 알칼리포스파타아제, β-갈락토시다아제, 루시페라아제 등), 형광체 (플루오레세인, 유로퓸 유도체 등), 발광체 (아크리디늄에스테르, N-아미노부틸-N-에틸이소루미놀 등) 를 들 수 있다.
공정 (1) 의 반응은, 용매 중에서 행해진다. 용매로서는, 그 자체 공지된 완충액이나 그것에 추가로 소량의 계면 활성제 또는/및 단백질을 함유하는 것이 사용된다.
반응 시간은 리간드 및 특이적 결합 물질의 종류에 따라서도 상이하지만, 바람직하게는 1 ∼ 30 분, 보다 바람직하게는 2 ∼ 10 분이다.
공정 (1) 에서 생성된 상기 복합체는, 이어서 공정 (2) 에 있어서 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질, 예를 들어, 비오틴과 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어, 항비오틴 항체가 담지된 담지 고상 입자와 접촉시킬 수 있다. 실제의 조작은, 공정 (1) 이 종료된 반응액 중에 상기 담지 고상 입자를 첨가하고, 필요에 따라 교반하면서, 방치하면 된다.
고체 입자로서는, 예를 들어, 카올린이나 탄소 등의 무기물의 미립자; 천연 고무 라텍스 중의 고무 미립자; 폴리스티렌 등의 유기 고분자 화합물의 라텍스 중의 폴리머 미립자 등을 들 수 있다. 상기 폴리머 미립자의 소재로서는, 예를 들어, 폴리스티렌, 스티렌 등의 모노머와 아미노기, 티올기, 카르복실기, 활성 에스테르기, 알데히드기 등의 관능기를 갖는 모노머와의 공중합체, 폴리아크롤레인을 들 수 있다. 더욱 구체적으로는, 예를 들어, 활성 에스테르기를 갖는, 스티렌과 메타크릴산페닐메틸술포늄 황산염의 공중합체, 디에틸렌글리콜디메타크릴레이트와 N-아크릴로일옥시숙신이미드의 공중합체, 디에틸렌글리콜디메타크릴레이트와 1-메타크릴로일옥시벤조트리아졸의 공중합체 및 알데히드기를 갖는 폴리아크롤레인을 들 수 있다. 고상 입자는 단일 입자여도 되고, 응집 입자여도 된다. 고상 입자의 평균 입자 직경은, 0.3 ∼ 1.0㎛ 의 범위 내가 바람직하다. 또, 입자 직경의 분포는 좁은 것이 좋다. 고상 입자의 평균 입자 직경이 커지면, 수성 용액 중에서의 분산성이 저하되고, 입자 중량당 표면적이 저하되기 때문에, 측정 감도의 저하를 초래한다. 또, 평균 입자 직경이 너무 작은 경우, 필터에서의 포착 효율이 저하되고, 최종적인 측정 감도가 저하된다.
고상 입자에, 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질을 담지시키기 위해서는, 종래 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 물리 흡착에 의한 방법이나, 표면에 관능기를 갖는 고상 입자를 사용하여, 담지되는 상기 물질의 관능기와 가교성 시약으로 결합하는 방법 등이 있다.
공정 (2) 에 있어서의 반응에서, 상기 복합체가 담지 고상 입자에 당해 제 1 표지 물질을 통하여 결합된 고상 복합체가 생성된다.
이 고상 복합체에는, 리간드가 검체 중에 존재하는 농도에 의존하는 농도로 고정되어 있기 때문에, 공정 (3) 에 있어서, 고정된 리간드의 농도를 제 2 표지 특이적 결합 물질의 그 제 2 표지의 양을 측정함으로써, 검체 중인 리간드의 농도를 정량할 수 있다.
고상 복합체 중의 제 2 표지의 존재량을 측정하는 방법으로는, 표지에 따라 종래 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 표지가 효소로 이루어진 경우, (1) 발색 기질과 접촉시켜서, 발색을 적분구를 사용한 비색계로 측정하는 방법, (2) 형광 기질과 접촉시켜서, 반응형의 형광 측정기로 형광 강도를 측정하는 방법, (3) 발광 기질과 접촉시켜서, 발광 강도를 계측하는 방법 등을 들 수 있다. 표지물이 형광체인 경우, 매트릭스 상에, 적당한 여기광을 조사함으로써 발생하는 형광을 계측할 수 있다. 표지물이 발광체인 경우, 적당한 트리거를 첨가함으로써, 발생하는 발광을 계측할 수 있다.
상기 제 1 방법은, 보다 구체적으로, (i) 리간드가 항원이고, 제 1 표지 특이적 결합 물질이 그 항원에 대한 제 1 표지 항체이며, 그리고 제 2 표지 특이적 결합 물질이 그 항원에 대한 제 2 표지 항체일 수 있고, 또는 리간드가 항체이고, 제 1 표지 특이적 결합 물질이 그 항체에 대한 제 1 표지 항원이며, 그리고 제 2 표지 특이적 결합 물질이 그 항체에 대한 제 2 표지 항원 또는 제 2 표지 항체일 수 있다.
본 발명의 제 2 방법은, 상기 제 1 방법의 공정 (1), (2) 와 동일한 공정 (1), (2) 를 실시한 후, 공정 (2) 에서 생성된 고상 복합체를 다공질 섬유 매트릭스에 포착하여 고상 복합체 포착 매트릭스를 생성하는 공정 (3) 을 실시한다.
공정 (2) 에서 생성한 고상 복합체는, 리간드에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질, 리간드, 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질, 그 제 1 표지 특이적 결합 물질과 특이적으로 결합하는 물질을 담지한 고체 입자가 축차적으로 이 순서로 결합된 것이다.
다공질 섬유 매트릭스로서는, 예를 들어, 유리 섬유 필터, 석영 섬유 필터, 실리카 섬유 필터, 니트로셀룰로오스 필터, 폴리아세테이트 필터, 여과지 등을 들 수 있다.
이들 중, 유리 섬유 필터가 바람직하다. 비특이적인 흡착을 방지하기 위해, 다공질 섬유 매트릭스를 적당한 단백질, 당, 폴리머 등으로 코팅해 두어도 된다.
다공질 섬유 매트릭스는, 3 차원적으로 교차하는 다수의 섬유로 이루어지기 때문에, 그들의 섬유에 의해 형성되는 구멍 (공극) 은 여러 가지 크기의 입자를 포착할 수 있다. 이것은, 다공질 섬유 매트릭스는, 포착할 수 있는 크기의 입자를, 다공질 섬유 매트릭스의 내부에 있어서도 포착할 수 있는 것을 나타내고 있다. 고상 복합체가 다공질 섬유 매트릭스의 내부에도 분포하도록 포착되면, 고상 복합체의 검출이 용이하고, 또한 정확하게 행해진다. 본 발명에서 사용되는 다공질 섬유 매트릭스는, 입자 직경 0.2 ∼ 8.0㎛ 의 입자를 포착할 수 있는 포착 능력을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 바람직한 다공질 섬유 매트릭스는, 시판품으로서, 예를 들어, 모두 유리 섬유제의, 밀리포어사의 상품명 AP25, 와트만사의 상품명 GF/D 로서 입수할 수 있다.
이 다공질 섬유 매트릭스는, 공정 (3) 에 사용하기 전에는, 미리 카세인, 비이온성 계면 활성제 및 칼슘 이온과 반응하여 수불용성 염을 형성하지 않는, pH7 ∼ 9 의 완충 능력을 갖는 완충제를 함유하고, 또한 pH7 ∼ 9 의 수용액으로 이루어지는 면역학적 블록액으로 처리해 두는 것이 바람직하다. 비이온성 계면 활성제로서는, 예를 들어, Tween 20, Tween 80, Triton X-100, 노이겐 157, 옥틸글루코시드, 옥틸티오글루코시드, 헵틸티오글루코시드, MEGA-9, MEGA-10 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 상기 완충제로서는, 예를 들어, Tris-HCl, TES-NaOH, HEPES-NaOH, EPPS-NaOH, Tricine-NaOH, TAPS-NaOH 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 면역학적 블록액은, 카세인, 비이온 계면 활성제 및 완충제 외에, 예를 들어, NaN3, Micr-O-protect, procline, microcide 등의 방부제: 염화 나트륨, 염화 마그네슘, 황산나트륨, 4급 암모늄염 등의 중성염: 폴리에틸렌글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스, 피콜 등의 수용성 고분자 및 글루코오스, 수크로오스, 트레할로스 등의 당을 함유할 수 있다. 상기 면역 블록액의 pH 는 7 ∼ 9 이다.
다공질 섬유 매트릭스의 면역학적 블록액에 의한 처리는, 예를 들어, 다공질 섬유 매트릭스를 면역학적 블록액에 침지하는 방법, 다공질 섬유 매트릭스에 면역학적 블록액을 분무하거나 하여 침윤시키는 방법 등에 의해 행할 수 있다.
다공질 섬유 매트릭스에 고상 복합체를 포착하는 조작인 공정 (3) 은, 다공질 섬유 매트릭스의 여과 유량이 6 ∼ 48㎖/min/㎠ 가 되도록, 그 다공질 섬유 매트릭스에 대하여 하방으로부터 흡인하여 행하는 것이 바람직하다. 여과 유량은, 바람직하게는 9.5 ∼ 16㎖/min/㎠ 이다.
이러한 여과 유량은, 예를 들어, 상기 다공질 섬유 매트릭스의 흡인 방향 하방에 연속 공극 물질을 배치하고, 그리고 그 연속 공극 물질을 통하여, 예를 들어, 흡인 펌프에 의해 흡인하거나, 또는 상기 다공질 섬유 매트릭스의 흡인 방향 하방에 대기중에 열린 공간을 형성하고, 그리고 그 공간을 통하여 흡인함으로써 달성할 수 있다.
상기 연속 공극 물질로서는, 액체를 흡수할 수 있고, 통기성도 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 그 재질로서는, 예를 들어, 셀룰로오스, 유리, PVA, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 염화 비닐, 폴리에틸렌, 세라믹 등을 들 수 있다.
연속 공극 물질의 기공율은 50 ∼ 95％ 가 바람직하다. 보다 바람직하게는 80 ∼ 95％ 이다. 또, 공극의 기공 직경은 20 ∼ 2000㎛ 가 바람직하다. 보다 바람직하게는 100 ∼ 500㎛ 이다. 연속 공극 물질의 시판품의 바람직한 예로서는, 아이온 주식회사 제조 베르이타 D 시리즈 Y (D) 를 들 수 있다.
흡인을, 상기 연속 공극 물질을 통하여 행함으로써, 연속 공극 물질이 다공성 섬유 매트릭스와 접촉되어 있지 않은 측면에 개공되어 있는 기공을 통해서 공기가 흡인되기 때문에, 다공성 섬유 매트릭스와 접촉하는 면으로부터 다공성 섬유 매트릭스를 통해서 천천히 액체를 흡인할 수 있다. 흡인 강도는, 연속 공극 물질의 두께, 기공율, 기공 직경 또는 흡인 펌프의 흡인력 등에 의존하지만, 연속 공극 물질 및 흡인력이 동일한 상황에서는 연속 공극 물질의 두께, 즉 다공질 섬유 매트릭스와 흡인 펌프로부터 연장되는 흡인단 사이에 배치된 연속 공극 물질의 두께에 의해 조절하는 것이 많은 경우에서 가능하고, 바람직하다.
또, 다른 양태에서는, 흡인을 다공질 섬유 매트릭스의 흡인 방향 하방으로 대기 중에 열린 공간을 형성하고, 그 공간을 통하여 행할 수도 있다. 이 경우, 다공성 섬유 매트릭스와 흡인단을 멀리 위치시키고, 그 멀리하는 거리에 의해 흡인력을 조절하는 것이 가능하다. 이 때 멀리함으로써 발생하는 공간을 둘러싸도록 연속 공극 물질을 배치함으로써, 흡인력을 천천히 조절하는 것이 가능해진다. 이 경우의 연속 공극 물질은, 예를 들어, 다공성 섬유 매트릭스의 바로 아래에서 흡인단까지의 사이를 도려내어 통 형상 공간을 형성한 것으로 할 수 있다.
제 2 방법에서는, 이어서, 공정 (4) 에 있어서, 공정 (3) 에서 생성된 상기 고상 복합체 포착 매트릭스에 대하여, 제 2 표지 특이적 결합 물질의 그 제 2 표지 물질의 존재량을 측정한다. 측정은, 제 1 방법에 대하여 기재한 것과 동일한 방법에 의해 행할 수 있다. 실제로는, 고상 복합체 포착 매트릭스에 제 2 표지 물질에 의존하여, 발색 물질이나 형광 물질을 적하하여 발색 등을 행할 수 있다.
본 발명의 제 3 방법 및 제 4 방법은, 이른바 경합법이나 경합 저해법이라고 불리우는 그 자체 공지된 방법을 이용하는 것이다.
제 3 방법에서는, 공정 (1) 에 있어서, 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 리간드 복합체 및 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 제 2 표지 특이적 결합 물질 복합체의 혼합물을 균일계에서 생성시키는, 리간드, 리간드를 함유하는 검체로서는, 제 1 방법에 있어서 기재한 것과 동일한 것으로 할 수 있다. 제 2 표지 특이적 결합 물질은, 제 1 방법과는 상이하게, 리간드에 대한 것이 아니라, 제 1 표지 특이적 결합 물질에 대한 것이다. 제 1 표지 특이적 결합 물질로서는 제 1 방법에 기재한 것과 동일한 것을 사용할 수 있다. 제 2 표지 특이적 결합 물질로서는, 예를 들어, 효소 표지 리간드, 형광체 표지 리간드, 리간드가 콘쥬게이트한 효소 표지 KLH (키홀 삿갓 조개 헤모시아닌) 를 들 수 있다.
공정 (2) 에 있어서, 상기 복합체 혼합물을, 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지와 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자와 접촉시킨다. 제 1 방법과 상이한 것은, 복합체 혼합물을 사용하고 있기 때문에, 그 복합체 각각과 담지 고상 입자가 제 1 표지를 통하여 결합된 고상 복합체의 혼합물을 생성하는 점이다. 즉, 이들의 혼합물 각각에 있어서, 제 1 표지 특이적 결합 물질에 대하여 리간드가 결합된 복합체와, 제 2 표지 특이적 결합 물질이 결합된 복합체가 존재한다. 그들의 복합체의 비율은, 제 1 표지 특이적 결합 물질에 대한 리간드와 제 2 표지 특이적 물질과의 결합 강도 및 리간드와 제 2 표지 특이적 결합 물질의 존재량에 의존하여, 서로 경합한다.
이어서, 공정 (3) 에 있어서, 공정 (2) 에서 생성한 고상 복합체 혼합물 에 대하여, 리간드의 농도 즉 제 1 표지 특이적 결합 물질과 결합하여 고정된 리간드의 농도를 측정하여, 검체 중인 리간드의 양을 정량한다.
본 발명의 제 4 방법은, 상기 제 3 방법의 공정 (1), (2) 와 동일한 공정 (1), (2) 를 실시한 후, 공정 (2) 에서 생성한 고상 복합체 혼합물을 다공질 섬유 매트릭스에 포착하여 고상 복합체 포착 매트릭스를 생성하는 공정 (3) 을 실시한다. 공정 (3) 은 제 2 방법의 공정 (3) 과 동일하게 하여 행할 수 있다.
제 3 방법 및 제 4 방법의 공정 (3) 에서 생성한 고상 복합체 혼합물은, 리간드, 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질, 그 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지와 특이적으로 결합하는 물질을 담지한 담지 고상 입자가 축차적으로 이 순서로 결합된 제 1 고상 복합체, 그리고, 그 제 1 표지 특이적 결합 물질에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질, 제 1 표지 특이적 결합 물질, 그 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지와 특이적으로 결합하는 물질을 담지한 담체 고상 입자가 축차적으로 이 순서로 결합된 제 2 고상 복합체로 이루어진다.
또한, 본 발명의 제 3 방법 및 제 4 방법에 대하여, 기재가 없는 사항은 제 1 방법 및 제 2 방법에 기재된 사항이 그대로 또는 당업자에게 자명한 변경을 추가하여, 적용되는 것으로 이해할 수 있다.
본 발명의 제 1 ∼ 제 4 방법에서는, 각 공정 사이에, 필요에 따라, 세척 공정을 형성할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 설명으로부터 이해되는 바와 같이, 담지 고체 입자에 담지된 물질이 리간드와 특이적으로 결합하는 것이 아닌, 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이기 때문에, 리간드의 종류에 관계없이 담지 고체 입자를 준비할 수 있는 이점이 있다. 그러므로, 본 발명에 의하면, 이러한 이점을 이용하여, (i) 어떤 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질, 어떤 리간드에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질, 그 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자 및 다공질 섬유 매트릭스의 조합을 갖는 것을 특징으로 하는 리간드의 측정을 위한 면역학적 정량 시약, 및 (ii) 어떤 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질, 제 1 표지 특이적 결합 물질에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질, 그 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자 및 다공질 섬유 매트릭스의 조합을 갖는 것을 특징으로 하는, 리간드의 측정을 위한 면역학적 정량 시약이 제공된다.
또, 본 발명에 의하면, 본 발명을 실시하기 위해서 바람직하게 사용되는 면역학적 블록액으로서, 카세인, 비이온성 계면 활성제 및 칼슘 이온과 반응하여 수불용성 염을 형성하지 않는, pH7 ∼ 9 의 완충 능력을 갖는 완충제를 함유하고, 또한 pH7 ∼ 9 의 수용액으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 면역학적 블록액이 동일하게 제공된다.
본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해서, 이하 실시예를 들어, 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
1) 항비오틴 항체 담지 고상 입자 용액의 제작
50mM 인산 완충액 (pH7.4; 이하, 인산 완충액이라고 약기한다.) 으로 원심 세정한 1.0％ 라텍스 입자 (세키스이 화학 공업 주식회사 제조, N-500, 평균 입자 직경 0.5㎛) 용액 1㎖ 에, 0.7㎎/㎖ 가 되도록 인산 완충액으로 조제한 염소 유래의 항비오틴폴리크로날 항체를 1㎖ 첨가하고, 37℃ 에서 2 시간 진탕하였다. 이어서, 인산 완충액으로 조제한 1％ 의 소혈청 알부민 (BSA; 오리엔탈 효모 공업 주식회사 제조) 을 첨가하고, 추가로 37℃, 2 시간 진탕하였다. 상기 항비오틴폴리크로날 항체가 담지된 라텍스 입자를 원심 분리하여 상청을 제거한 후, 0.8％ 의 NaCl 과 1％ 의 BSA 를 함유한 HEPES 완충액 (pH8.0; 이하, HEPES-S 완충액이라고 약기한다.) 을 4㎖ 첨가하고, 그 라텍스 입자를 분산시켰다. 이어서, 재차, 그 라텍스 입자를 원심 분리하여 상청을 제거한 후, HEPES-S 완충액을 4㎖ 첨가하고, 그 라텍스 입자를 분산시켜, 항비오틴 항체 담지 고상 입자 용액으로 하였다.
2) 알칼리포스파타아제 표지 항인슐린 항체의 제작
1㎎/㎖ 가 되도록 인산 완충액으로 조제한 항인슐린 모노클로날 항체 (다코사 제조, OXI005, 마우스 유래) 용액 1㎖ 에, 1㎎/㎖ 의 2-이미노티오란 염산염 수용액 0.1㎖ 를 첨가하고, 25℃ 에서 1 시간 진탕하였다. 이어서, 겔 여과에 의해 상기 모노클로날 항체 용액으로부터 미반응의 2-이미노티오란을 제거하여, 티올기 도입 항인슐린 항체를 제작하였다. 상기 1㎎/㎖ 티올기 도입 항인슐린 항체 용액 1㎖ 에 알칼리포스파타아제 (키코만 주식회사 제조) 를 용해한 후, 5㎎/㎖ 가 되도록 디메틸포름아미드에 용해한 N-(γ-말레이미드부티릴옥시)숙신이미드 (주식회사 도진 화학 연구소 제조) 를 20㎕ 첨가하고, 25℃ 에서 하룻밤 진탕하였다. 그 후, 겔 여과에 의해, 항체 활성과 효소 활성의 양쪽 모두를 볼 수 있는 분획을 분취하여, 알칼리포스파타아제 표지 항인슐린 항체를 제작하였다.
3) 비오틴 표지 항인슐린 항체의 제작
1㎎/㎖ 가 되도록 10mM 의 HEPES 완충액 (pH8.5) 으로 조제한 항인슐린 모노클로날 항체 (다코사 제조, HUI018, 마우스 유래) 용액 1㎖ 에, 1mM 이 되도록 디메틸술폭사이드로 용해한 Biotin-AC5-OSu (주식회사 도진 화학 연구소 제조) 0.1㎖ 를 첨가하고, 25℃ 에서 4 시간 정치하였다. 이어서, 겔 여과에 의해 미반응의 Biotin-AC5-OSu 를 제거하여, 비오틴 표지 항인슐린 항체를 제작하였다.
4) 측정 대상 물질 (피검체)
측정에 사용한 피검체는, 시판되고 있는 인슐린 (와코쥰야쿠 공업 주식회사 제조)을 0, 0.1, 1, 10, 100μIU/㎖ 가 되도록, 인산 완충액으로 희석하여 제작하였다.
5) 입자의 포착 기구
원기둥 형상의 컵에 흡수재, 유리 필터 (밀리포어사 제조, AP-25) 가 아래로부터 순차 적층된 것을 제작하여, 라텍스 입자의 포착재로 하였다.
6) 측정 조작
1％ 의 카세인을 함유한 인산 완충액으로 5㎍/㎖ 가 되도록 희석한 비오틴 표지 항인슐린 항체 용액 18㎕, 1％ 의 카세인을 함유한 인산 완충액으로 0.2㎍/㎖ 가 되도록 희석한 알칼리포스파타아제 표지 항인슐린 항체 용액 18㎕, 및 피검체 24㎕ 를 혼합하여, 37℃ 에서 5 분간 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 1) 에서 제작한 항비오틴 항체 담지 고상 입자 용액을 20㎕ 첨가하고, 추가로 37℃ 에서 3 분간 인큐베이션하고, 비오틴 표지 항인슐린 항체와 인슐린을 통하여 알칼리포스파타아제 표지 항인슐린 항체가 고정화된 입자 (이하, 알칼리포스파타아제 고정 입자라고 기재한다.) 를 조제하였다. 조제한 알칼리포스파타아제 고정 입자 용액 50㎕ 를, 25％ 블록 에이스 (다이닛폰 제약 주식회사 제조) 50㎕ 에서 침윤시킨 포착재에 적하하고, 0.05％ Tween 20 (와코쥰야쿠 공업 주식회사 제조) 을 함유한 인산 완충액 0.1㎖ 를 2 회 포착재에 적하하여, 포착재 중의 유리 필터를 세정하였다. 계속해서, 이 포착재를 알칼리포스파타아제 활성의 측정에 제공하였다.
7) 알칼리포스파타아제 활성의 측정
포착재 중의 알칼리포스파타아제 활성의 측정은, 전자동 화학 발광 면역 측정 장치 MI02 (주식회사 에이앤드티 제조) 에 의해 행하였다. 화학 발광 기질로서 APS-5 (루미젠사 제조) 를 사용하여, 포착재 1 개에 대하여 30㎕ 의 APS-5 를 적하하였다.
8) 측정 결과
인슐린 농도와 상기 측정에 의해 얻어진 시그널 강도의 관계를 표 1 에 나타낸다.
인슐린 농도 (μIU/㎖) 시그널 강도
0 143
0.1 526
1 4052
10 39382
100 382656
실시예 2
실시예 1 에서, 알칼리포스파타아제 표지한 항인슐린 항체를 항PSA 모노클로날 항체 (피츠제럴드사 제조, 10-P20) 에, 비오틴 표지한 항인슐린 항체를 항프리 PSA 모노클로날 항체 (피츠제럴드사 제조, 10-P21) 로 바꾸어 각각의 표지를 행하고, 측정시의 비오틴 표지 항프리PSA 모노클로날 항체 용액 중의 항체 농도를 20㎍/㎖, 용액량을 10㎕ 로, 알칼리포스파타아제 표지 항PSA 모노클로날 항체 용액 중의 항체 농도를 2㎍/㎖, 용액량을 10㎕ 로, 피검체량을 50㎕ 로 변경하고, 피검체를 인산 완충액으로 희석하여 제작한 프리 PSA (농도: 0, 0.005, 0.05, 0.5, 5ng/㎖) 로 한 것 이외에는, 실시예 1 에 따라 측정을 행하였다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
프리PSA 농도 (ng/㎖) 시그널 강도
0 104
0.005 287
0.05 2992
0.5 27370
5 308974
실시예 3
실시예 1 에서, 알칼리포스파타아제 표지한 항인슐린 항체를 항N-ANP 모노클로날 항체 (메딕스바이오케미카사 제조, 7905) 에, 비오틴 표지한 항인슐린 항체를 항N-ANP 모노클로날 항체 (메딕스바이오케미카사 제조, 7801) 로 바꾸어 각각의 표지를 행하고, 측정시의 피오틴 표지 항N-ANP 모노클로날 항체 용액 중의 항체 농도를 10㎍/㎖, 용액량을 15㎕ 로, 알칼리포스파타아제 표지 항N-ANP 모노클로날 항체 용액 중의 항체 농도를 2㎍/㎖, 용액량을 15㎕ 로, 피검체량을 30㎕ 로 변경하고, 피검체를 인산 완충액으로 희석하여 제작한 N-ANP (농도: 0, 5, 50, 500, 5,000 pmol/L) 로 한 것 이외에는, 실시예 1 에 따라 측정을 행하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
N-ANP 농도 (pmol/L) 시그널 강도
0 107
5 307
50 3501
500 33089
5000 322465
실시예 4
실시예 1 에서, 알칼리포스파타아제 표지한 항인슐린 항체를 항C-펩티드 모노클로날 항체 (다코사 제조, PEP-001) 에, 비오틴 표지한 항인슐린 항체를 항C-펩티드 모노클로날 항체 (다코사 제조, CPT-3 F11) 로 바꾸어 각각의 표지를 행하고, 측정시의 비오틴 표지 항C-펩티드 모노클로날 항체 용액 중의 항체 농도를 5㎍/㎖, 용액량을 20㎕ 로, 알칼리포스파타아제 표지 항C-펩티드 모노클로날 항체 용액 중의 항체 농도를 0.2㎍/㎖, 용액량을 20㎕ 로, 피검체량을 20㎕ 로 변경하고, 피검체를 인산 완충액으로 희석하여 제작한 C-펩티드 (농도: 0, 0.01, 0.1, 1, 10ng/㎖) 로 한 것 이외에는, 실시예 1 에 따라 측정을 행하였다. 결과를 표 4 에 나타낸다.
C-펩티드 농도 (ng/㎖) 시그널 강도
0 160
0.01 293
0.1 2698
1 26086
10 255930
실시예 5
실시예 1 에서, 알칼리포스파타아제 표지한 항인슐린 항체를 항펩시노겐 I 모노클로날 항체 (메딕스바이오케미카사 제조, 8003) 에, 비오틴 표지한 항인슐린 항체를 항펩시노겐 I 모노클로날 항체 (메딕스바이오케미카사 제조, 8009) 로 바꾸어 각각의 표지를 행하고, 측정시의 비오틴 표지 항펩시노겐 I 모노클로날 항체 용액 중의 항체 농도를 10㎍/㎖, 용액량을 20㎕ 로, 알칼리포스파타아제 표지 항펩시노겐 I 모노클로날 항체 용액 중의 항체 농도를 0.4㎍/㎖, 용액량을 20㎕ 로, 피검체량을 20㎕ 로 변경하고, 피검체를 인산 완충액으로 희석하여 제작한 펩시노겐 I (농도: 0, 0.1, 2, 16, 160ng/㎖) 로 한 것 이외에는, 실시예 1 에 따라 측정을 행하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
펩시노겐 I 농도 (ng/㎖) 시그널 강도
0 98
0.1 263
2 6122
16 40129
160 434310
실시예 6
실시예 1 에서, 포착재 중의 유리 필터를 AP-25 에서 GF/D (와트만사 제조) 로 변경한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 방법으로 피검체를 측정하였다. 결과를 표 6 에 나타낸다.
인슐린 농도 (μIU/㎖) 시그널 강도
0 207
0.1 731
1 5997
10 55135
100 516586
실시예 7
실시예 1 에서, 항비오틴폴리크로날 항체를 담지하는 라텍스 입자를 N-300 (세키스이 화학 공업 주식회사 제조, 평균 입자 직경 0.3㎛) 으로 변경하고, 포착재 중의 유리 필터를 AP-25 에서 AP-15 (밀리포어사 제조) 로 변경한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일한 방법으로 피검체를 측정하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
인슐린 농도 (μIU/㎖) 시그널 강도
0 242
0.1 581
1 5081
10 52354
100 514871
실시예 8
1) 항비오틴 항체 담지 고상 입자 용액의 제작
50mM 인산 완충액 (pH7.4; 이하, 인산 완충액이라고 약기한다.) 으로 원심 세정한 1.0％ 라텍스 입자 (세키스이 화학 공업 주식회사 제조, N-500, 평균 입자 직경 0.5㎛) 용액 1㎖ 에, 0.7㎎/㎖ 가 되도록 인산 완충액으로 조제한 염소 유래의 항비오틴폴리크로날 항체를 1㎖ 첨가하고, 37℃ 에서 2 시간 진탕하였다. 이어서, 인산 완충액으로 조제한 1％ 의 소혈청 알부민 (BSA; 오리엔탈 효모 공업 주식회사 제조) 를 첨가하고, 추가로 37℃, 2 시간 진탕하였다. 상기 항비오틴폴리크로날 항체가 담지된 라텍스 입자를 원심 분리하여 상청을 제거한 후, 0.8％ 의 NaCl 과 1％ 의 BSA 를 함유한 HEPES 완충액 (pH8.0; 이하, HEPES-S 완충액이라고 약기한다.) 을 4㎖ 첨가하고, 그 라텍스 입자를 분산시켰다. 이어서, 재차, 그 라텍스 입자를 원심 분리하여 상청을 제거한 후, HEPES-S 완충액을 4㎖ 첨가하고, 그 라텍스 입자를 분산시켜, 항비오틴 항체 담지 고상 입자 용액으로 하였다.
2) 알칼리포스파타아제 표지 항C-펩티드 항체의 제작
1㎎/㎖ 가 되도록 인산 완충액으로 조제한 항C-펩티드모노클로날 항체 (다코사 제조, PEP001, 마우스 유래) 용액 1㎖ 에, 1㎎/㎖ 의 2-이미노티오란 염산염 수용액 0.1㎖ 를 첨가하고, 25℃ 에서 1 시간 진탕하였다. 이어서, 겔 여과에 의해 상기 모노클로날 항체 용액으로부터 미반응의 2-이미노테오란을 제거하여, 티올기 도입 항인슐린 항체를 제작하였다. 상기 1㎎/㎖ 티올기 도입 항인슐린 항체 용액 1㎖ 에 알칼리포스파타아제 (키코만 주식회사 제조) 를 용해한 후, 5㎎/㎖ 가 되도록 디메틸포름아미드에 용해한 N-(γ-말레이미드부티릴옥시)숙신이미드 (주식회사 도진 화학 연구소 제조) 를 20㎕ 첨가하고, 25℃ 에서 하룻밤 진탕하였다. 그 후, 겔 여과에 의해, 항체 활성과 효소 활성의 양쪽 모두를 볼 수 있는 분획을 분취하여, 알칼리포스파타아제 표지 항C-펩티드 항체를 제작하였다.
3) 비오틴 표지 항C-펩티드 항체의 제작
1㎎/㎖ 가 되도록 10mM 의 HEPES 완충액 (pH8.5) 으로 조제한 항C-펩티드 모노클로날 항체 (다코사 제조, CPT3F11, 마우스 유래) 용액 1㎖ 에, 1mM 이 되도록 디메틸술폭사이드에서 용해한 Biotin-AC5-OSu (주식회사 도진 화학 연구소 제조) 0.1㎖ 를 첨가하고, 25℃ 에서 4 시간 정치하였다. 이어서, 겔 여과에 의해 미반응의 Biotin-AC5-OSu 를 제거하여, 비오틴 표지 항C-펩티드 항체를 제작하였다.
4) 측정 대상 물질 (피검체)
측정에 사용한 피검체는, 시판되는 C-펩티드 (코스모바이오 주식회사 제조) 를 0, 0.1, 3ng/㎖ 가 되도록, 인산 완충액으로 희석하여 제작하였다.
5) 입자의 포착 기구
원기둥 형상의 컵에 흡수재, 유리 필터 (밀리포어사 제조, AP-25) 가 아래로부터 순차 적층된 것을 제작하고, 라텍스 입자의 포착재로 하였다.
6) 측정 조작
1％ 의 카세인을 함유한 인산 완충액으로 5㎍/㎖ 가 되도록 희석한 비오틴 표지 항C-펩티드 항체 용액 20㎕, 1％ 의 카세인을 함유한 인산 완충액으로 0.1㎍/㎖ 가 되도록 희석한 알칼리포스파타아제 표지 항C-펩티드 항체 용액 10㎕, 및 피검체 10㎕ 를 혼합하여, 37℃ 에서 10 분간 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 1) 에서 제작한 항비오틴 항체 담지 고상 입자 용액을 20㎕ 첨가하고, 추가로 37℃ 에서 3 분간 인큐베이션하여, 비오틴 표지 항C-펩티드 항체와 C-펩티드를 통하여 알칼리포스파타아제 표지 항C-펩티드 항체가 고정화된 입자 (이하, 알칼리포스파타아제 고정 입자라고 기재한다.) 를 조제하였다. 조제한 알칼리포스파타아제 고정 입자 용액 50㎕ 를, 1％ 카세인 (와코쥰야쿠 공업 주식회사 제조) 과 0.1％ Triton X-100, 0.8％ 의 NaCl 이 용해된 트리스 염산 완충액 (pH7.4) 으로 이루어진 블록액 50㎕ 로 침윤시킨 포착재에 적하하고, 0.05％ Tween 20 (와코쥰야쿠 공업 주식회사 제조) 을 함유한 인산 완충액 0.1㎖ 를 2 회 포착재에 적하하여, 포착재 중의 유리 필터를 세정하였다. 계속해서, 이 포착재를 알칼리포스파타아제 활성의 측정에 제공하였다. 동일 피검체에 대하여, 상기 측정 조작을 2 회 행하였다.
7) 알칼리포스파타아제 활성의 측정
포착재 중의 알칼리포스파타아제 활성의 측정은, 전자동 화학 발광 면역 측정 장치 MI02 (주식회사 에이앤드티 제조) 에 의해 행하였다. 화학 발광 기질로서 APS-5 (루미젠사 제조) 를 사용하여 포착재 1 개에 대하여 30㎕ 의 APS-5 를 적하하였다.
8) 측정 결과
C-펩티드 농도와 상기 측정에 의해 얻어진 시그널 강도의 관계를 표 8 에 나타낸다.
C-펩티드 농도 (ng/㎖) 시그널 강도
0 189
0 181
0.1 584
0.1 595
3 10923
3 10966
실시예 9
1) 항비오틴 항체 담지 고상 입자 용액의 제작
0.05moL/L 인산 완충액 (pH7.4; 이하, 인산 완충액이라고 약기한다.) 으로 원심 세정한 1.0％ 라텍스 입자 (세키스이 화학 공업 주식회사 제조, N-500, 평균 입자 직경 0.5㎛) 용액 1㎖ 에 0.7㎎/㎖ 가 되도록 인산 완충액으로 조제한 염소 유래의 항비오틴폴리크로날 항체를 1㎖ 첨가하고, 37℃ 에서 2 시간 진탕하였다. 이어서, 인산 완충액으로 조제한 1％ 의 소혈청 알부민 (BSA; 오리엔탈 효모 공업 주식회사 제조) 을 1㎖ 첨가하고, 추가로 37℃, 2 시간 진탕하였다. 상기 항비오틴폴리크로날 항체가 담지된 라텍스 입자를 원심 분리하여 상청을 제거한 후, 0.8％ 의 NaCl 과 1％ 의 BSA 를 함유한 HEPES 완충액 (pH8.0; 이하, HEPES-S 완충액이라고 약기한다.) 을 4㎖ 첨가하고, 그 라텍스 입자를 분산시켰다. 이어서, 재차, 그 라텍스 입자를 원심 분리하여 상청을 제거한 후, HEPES-S 완충액을 4㎖ 첨가하고, 그 라텍스 입자를 분산시켜, 항비오틴 항체 담지 고상 입자 용액으로 하였다.
2) 알칼리포스파타아제 표지 항C-펩티드 항체의 제작
1㎎/㎖ 가 되도록 인산 완충액으로 조제한 항C-펩티드 모노클로날 항체 (다코사 제조, PEP-001, 마우스 유래) 용액 1㎖ 에, 1㎎/㎖ 의 2-이미노티오란 염산염 수용액 0.1㎖ 를 첨가하고, 25℃ 에서 1 시간 진탕하였다. 이어서, 겔 여과에 의해 상기 모노클로날 항체 용액으로부터 미반응의 2-이미노테오란을 제거하여, 티올기 도입 항C 펩티드 항체를 제작하였다. 상기 1㎎/㎖ 티올기 도입 항C-펩티드 항체 용액 1㎖ 에 알칼리포스파타아제 (키코만 주식회사 제조) 를 용해한 후, 5㎎/㎖ 가 되도록 디메틸포름아미드에 용해한 N-(γ-말레이미드부티릴옥시)숙신이미드 (주식회사 도진 화학 연구소 제조) 를 20㎕ 첨가하고, 25℃ 에서 하룻밤 진탕하였다. 그 후, 겔 여과에 의해, 항체 활성과 효소 활성의 양쪽 모두를 볼 수 있는 분획을 분취하여, 알칼리포스파타아제 표지 항C-펩티드 항체를 제작하였다.
3) 비오틴 표지 항C-펩티드 항체의 제작
1㎎/㎖ 가 되도록 0.01mol/L 의 HEPES 완충액 (pH8.5) 으로 조제한 항C-펩티드모노클로날 항체 (다코사 제조, CPT-3-F11, 마우스 유래) 용액 1㎖ 에, 0.001mol/L 이 되도록 디메틸술폭사이드로 용해한 Biotin-AC5-OSu (주식회사 도진 화학연구소 제조) 0.1㎖ 를 첨가하고, 25℃ 에서 4 시간 정치하였다. 이어서, 겔 여과에 의해 미반응의 Biotin-AC5-OSu 를 제거하고, 비오틴 표지 항C-펩티드 항체를 제작하였다.
4) 측정 대상 물질 (피검체)
측정에 사용한 피검체는, 시판되는 C-펩티드 (코스모바이오 주식회사 제조) 를 0, 0.1, 3ng/㎖ 가 되도록, 인산 완충액으로 희석하여 제작하였다.
5) 입자의 포착 기구
바닥면에 직경 6㎜ 의 구멍이 뚫린 원기둥 형상 컵의 바닥에, 유리 필터 (밀리포어사 제조, AP-25) 를 설치한 것을 제작하여, 라텍스 입자의 포착재로 하였다.
6) 흡인 배액 장치
흡인 노즐 (내경 2.5㎜ 의 스테인리스 파이프) 의 일단에 PVA 스펀지 (아이온 주식회사 제조 베르이타 D 시리즈 Y(D)) 를 1 변이 1㎝ 인 입방체로 가공한 것을 부착하고, 그 스펀지가 상기 유리 필터를 설치한 원기둥 형상 컵의 구멍 아래에 위치하도록 배치하였다. 그 스테인리스 파이프의 다른 일단에는 내압 튜브를 부착하고, 배액 트랩을 통하여 진공 펌프 (메도 산업 주식회사 제조, VP0125, 토출 공기량: 7L/min) 에 접속하여, 흡인 배액 장치로 하였다. 그 장치를 사용했을 때의 상기 5) 의 포착재에 사용한 유리 필터에 있어서의 여과 유량은 12㎖/min/㎠ 이다.
7) 측정 조작
1％ 의 카세인을 함유한 인산 완충액으로 5㎍/㎖ 가 되도록 희석한 비오틴 표지 항C-펩티드 항체 용액 20㎕, 1％ 의 카세인을 함유한 인산 완충액으로 0.1㎍/㎖ 가 되도록 희석한 알칼리포스파타아제 표지 항C-페프나드 항체 용액 10㎕, 및 피검체 10㎕ 를 혼합하고, 37℃ 에서 10 분간 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 1) 에서 제작한 항피오틴 항체 담지 고상 입자 용액을 20㎕ 첨가하고, 추가로 37℃ 에서 3 분간 인큐베이션하고, 비오틴 표지 항C-펩티드 항체와 C-펩티드를 통하여 알칼리포스파타아제 표지 항C-펩티드 항체가 고정화된 입자 (이하, 알칼리포스파타아제 고정 입자라고 기재한다.) 를 조제하였다. 상기 5) 에서 제작한 포착재를 상기 6) 에서 제작한 흡인 배액 장치의 PVA 스펀지 상에 설치하였다. 조제한 알칼리포스파타아제 고정 입자 용액 30㎕ 를, 미리 1％ 카세인 (와코쥰야쿠 공업 주식회사 제조) 과 0.1％ Triton X-100, 0.8％ 의 NaCl 이 용해된 트리스 염산완충액 (pH7.4) 으로 이루어지는 블록액 50㎕ 로 침윤시킨 포착재에 적하하고, 0.05％ Tween 20 (와코쥰야쿠 공업 주식회사 제조) 을 함유한 인산 완충액 0.1㎖ 를 2 회 포착재에 적하하여, 포착재 중의 유리 필터를 세정하였다. 계속해서, 이 포착재를 알칼리포스파타아제 활성의 측정에 제공하였다. 동일 피검체에 대하여, 상기 측정 조작을 2 회 행하였다.
8) 알칼리포스파타아제 활성의 측정
포착재 중의 알칼리포스파타아제 활성의 측정은, 암소(暗所)에서, 광전자 증배관 모듈 (하마마츠 호토닉스 주식회사 제조, H7360-02) 을 사용하여 행하였다. 화학 발광 기질로서, APS-5 (루미젠사 제조) 를 사용하여, 포착재 1 개에 대하여 30㎕ 의 APS-5 를 적하하였다. 적하 1 분 후부터 0.1 초 마다 10 회 시그널 강도를 측정하여, 그 평균값을 측정값으로 하였다.
9) 측정 결과
C-펩티드 농도와 상기 측정에 의해 얻어진 시그널 강도를 표 9 에 나타낸다.
C-펩티드 농도 (ng/㎖) 시그널 강도
0 1038
0 1026
0.1 5079
0.1 5083
3 111293
3 111353
이상과 같이, 본 발명의 면역학적 정량법 및 시약에 의하면, 측정 대상의 리간드의 존재량을 재현성 좋게, 단시간에 또한 고감도로 정량할 수 있다.
또, 본 발명의 바람직한 면역학적 정량법에 의하면, 다공성 섬유 매트릭스에서 고상 복합체를 포착할 때, 압력 센서 등의 복잡한 기구나 흡인 압력의 미조정이 불필요하고, 액이 천천히 다공성 섬유 매트릭스를 통과하므로, 고상 복합체 입자를 확실하게 흡착할 수 있으며, 다공성 섬유 매트릭스의 하방에 반응 잔여물을 함유한 흡수층을 설치할 필요가 없기 때문에, 오검지를 막을 수 있고, 또한, 다공성 섬유 매트릭스 상에서 장시간의 면역 반응을 행하지 않기 때문에, 반응 성분의 그 매트릭스에 대한 비특이 흡착을 줄일 수 있으며, 그 때문에 측정 대상의 리간드의 존재량을 재현성 좋게, 단시간에 또한 고감도로 정량할 수 있다.

Claims (18)

  1. 리간드를 고상 복합체로서 고정시키고 그 고상 복합체에 대하여 리간드의 농도를 면역학적 정량법에 의해 측정하는 방법에 있어서,
    (1) 리간드, 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질 및 리간드에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질을 용매 중에서 접촉시켜서 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 리간드 - 제 2 표지 특이적 결합 물질 복합체를 생성시키고,
    (2) 상기 복합체를, 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자와 접촉시켜서 상기 복합체와 상기 담지 고상 입자가 제 1 표지 물질을 통하여 결합된 고상 복합체를 생성시키고,
    그리고
    (3) 상기 공정 (2) 에서 생성한 고상 복합체를 리간드의 농도 측정용으로 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  2. 리간드의 측정을 위한 면역학적 정량법으로서,
    (1) 리간드, 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질 및 리간드에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질을 용매 중에서 접촉시켜서 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 리간드 - 제 2 표지 특이적 결합 물질 복합체를 생성시키고,
    (2) 상기 복합체를, 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자와 접촉시켜서 상기 복합체와 상 기 담지 고상 입자가 제 1 표지 물질을 통하여 결합된 고상 복합체를 생성시키고,
    그리고
    (3) 상기 고상 복합체를 다공질 섬유 매트릭스에 포착하여 고상 복합체 포착 매트릭스를 생성하고, 그리고
    (4) 상기 고상 복합체 포착 매트릭스에 대하여 제 2 표지 특이적 결합 물질의 그 제 2 표지 물질의 존재량을 측정하는 것을 특징으로 하는 면역학적 정량법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    리간드가 항원이고, 제 1 표지 특이적 결합 물질이 그 항원에 대한 제 1 표지 항체이며, 그리고 제 2 표지 특이적 결합 물질이 그 항원에 대한 제 2 표지 항체인 면역학적 측정법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    리간드가 항체이고, 제 1 표지 특이적 결합 물질이 그 항체에 대한 제 1 표지 항원이며, 그리고 제 2 표지 특이적 결합 물질이 그 항체에 대한 제 2 표지 항원 또는 제 2 표지 항체인 면역학적 측정법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    고상 입자의 평균 입자 직경이 0.3 ∼ 1.0㎛ 인 면역학적 측정법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    다공질 섬유 매트릭스가 입자 직경 0.2 ∼ 8.0㎛ 의 입자를 포착할 수 있는 포착 능력을 갖는 면역학적 측정법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    다공질 섬유 매트릭스가 미리 하기 조성:
    카세인, 비이온성 계면 활성제 및 칼슘 이온과 반응하여 수불용성 염을 형성하지 않는, pH7 ∼ 9 의 완충 능력을 갖는 완충제를 함유하고, 또한 pH7 ∼ 9 의 수용액으로 이루어지는 블록액으로 처리되어 있는 면역학적 측정법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 고상 복합체 포착 매트릭스를 그 다공질 섬유 매트릭스의 여과 유량이 6 ∼ 48㎖/min/㎠ 가 되도록, 그 다공질 섬유 매트릭스에 대하여 하방으로부터 흡인하여 생성하는 면역학적 측정법.
  9. 리간드를 고상 복합체로서 고정시키고 그 고상 복합체에 대하여 리간드의 농도를 면역학적 정량법에 의해 측정하는 방법에 있어서,
    (1) 리간드, 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질 및 제 1 표지 특이적 결합 물질에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질을 용매 중에서 접촉시켜서 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 리간드 복합체 및 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 제 2 표 지 특이적 결합 물질 복합체의 혼합물을 생성시키고,
    (2) 상기 복합체 혼합물을, 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자와 접촉시켜서 상기 복합체 각각과 상기 담지 고상 입자가 제 1 표지 물질을 통하여 결합된 고상 복합체 혼합물을 생성시키고,
    그리고
    (3) 상기 공정 (2) 에서 생성한 고상 복합체 혼합물을 리간드의 농도 측정용으로 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  10. 리간드의 측정을 위한 면역학적 정량법으로서,
    (1) 리간드, 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질 및 제 1 표지 특이적 결합 물질에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질을 용매 중에서 접촉시켜서 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 리간드 복합체 및 제 1 표지 특이적 결합 물질 - 제 2 표지 특이적 결합 물질 복합체의 혼합물을 생성시키고,
    (2) 상기 복합체 혼합물을, 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자와 접촉시켜서 상기 복합체 각각과 상기 담지 고상 입자가 제 1 표지 물질을 통하여 결합된 고상 복합체 혼합물을 생성시키고,
    그리고
    (3) 상기 고상 복합체 혼합물을 다공질 섬유 매트릭스에 포착하여 고상 복합 체 포착 매트릭스를 생성하고, 그리고
    (4) 상기 고상 복합체 포착 매트릭스에 대하여 제 2 표지 특이적 결합 물질의 그 제 2 표지 물질의 존재량을 측정하는 것을 특징으로 하는 면역학적 정량법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    리간드가 항원이고, 제 1 표지 특이적 결합 물질이 그 항원에 대한 제 1 표지 항체이며, 그리고 제 2 표지 특이적 결합 물질이 표지된 그 항원인 면역학적 정량법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    리간드가 항체이고, 제 1 표지 특이적 결합 물질이 그 항체에 대한 제 1 표지 항원이며, 그리고 제 2 표지 특이적 결합 물질이 표지된 그 항체인 면역학적 정량법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    고상 입자의 평균 입자 직경이 0.3 ∼ 1.0㎛ 인 면역학적 측정법.
    제 10 항에 있어서,
    다공질 섬유 매트릭스가 입자 직경 0.2 ∼ 8.0㎛ 의 입자를 포착할 수 있는 포착 능력을 갖는 면역학적 정량법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    다공질 섬유 매트릭스가 미리 하기 조성:
    카세인, 비이온성 계면 활성제 및 칼슘 이온과 반응하여 수불용성 염을 형성하지 않는, pH7 ∼ 9 의 완충 능력을 갖는 완충제를 함유하고, 또한 pH7 ∼ 9 의 수용액으로 이루어지는 블록액으로 처리되어 있는 면역학적 정량법.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 고상 복합체 포착 매트릭스를 그 다공질 섬유 매트릭스의 여과 유량이 6 ∼ 48㎖/min/㎠ 가 되도록, 그 다공질 섬유 매트릭스에 대하여 하방으로부터 흡인하여 생성하는 면역학적 측정법.
  16. 어떤 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질, 어떤 리간드에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질, 그 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자 및 다공질 섬유 매트릭스의 조합을 갖는 것을 특징으로 하는 리간드의 측정을 위한 면역학적 정량 시약.
  17. 어떤 리간드에 대한 제 1 표지 특이적 결합 물질, 제 1 표지 특이적 결합 물질에 대한 제 2 표지 특이적 결합 물질, 그 제 1 표지 특이적 결합 물질의 그 제 1 표지 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지된 담지 고상 입자 및 다공질 섬유 매트릭스의 조합을 갖는 것을 특징으로 하는, 리간드의 측정을 위한 면역학적 정량 시약.
  18. 카세인, 비이온성 계면 활성제 및 칼슘 이온과 반응하여 수불용성 염을 형성하지 않는, pH7 ∼ 9 의 완충 능력을 갖는 완충제를 함유하고, 또한 pH7 ∼ 9 의 수용액으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역학적 블록액.
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