CN113203867B - 一种适用于胰岛素检测试剂盒的缓冲液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及胰岛素检测领域,具体涉及一种适用于胰岛素检测试剂盒的缓冲液。所述缓冲液按重量份数计,包括以下成分,三羟甲基氨基甲烷3.5‑12份、氯化钠6.0‑9.0份、蔗糖1‑10份、牛血清白蛋白1‑50份、牛血清10‑100份、羊血清1‑20份和马血清1‑20份。所述缓冲液用于胰岛素检测时,检测结果稳定,重复性好,对胰岛素的检测灵敏度达到了0.5μIU/mL以下。
Description
技术领域
本发明涉及胰岛素检测领域,具体涉及一种适用于胰岛素检测试剂盒的缓冲液。
背景技术
胰岛素(Insulin,INS)来源于胰腺,由胰岛β细胞产生并释放入血。INS是含有51个氨基酸的小分子蛋白质,分子量为6KD,INS分子有靠两个二硫键结合的A链(21个氨基酸)与B链(30个氨基酸),如果二硫键被打开则失去活性。INS在体内的作用非常广泛,主要是降低血糖,是体内唯一降低血糖的激素,能够促进肌肉、脂肪组织糖摄取和促进糖原合成、抑制糖原分解;也是体内唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质的合成的激素。
血清INS浓度为35-145pmol/L。INS在血中的半衰期只有5min,主要在肝灭活,肌肉与肾等组织也能使INS失活。因此快速准确地检测血清中的胰岛素含量是困难且必要的。
中国专利申请CN102435737A公开了一种胰岛素(INS)定量测定试剂盒及其检测方法,该试剂盒包含INS磁分离试剂,酶反应物,反应增强剂,稀释液,INS校准品、INS质控品,清洗液浓缩液以及底物溶液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合,提供了一种接近均相的反应体系,与现有技术相比,本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性,并达到了较佳的性能参数,并且大大降低了产品成本。
中国专利申请CN106596524A公开了一种胰岛素抗体化学发光免疫检测试剂盒,所述试剂盒包括:纯化的胰岛素包被的磁微粒工作液、吖啶酯标记的抗人IgG工作液、胰岛素抗体定标品、预激发液、激发液。另外本发明还公开了一种胰岛素抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法。本发明所述试剂盒与现有试剂盒相比,具有操作简便,灵敏度高,检测范围广等特点。
中国专利申请CN106596524A公开了一种人胰岛素原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括胰岛素原抗试剂1、胰岛素原抗试剂2、磁分离试剂、胰岛素原校准品、化学发光底物、清洗液。本发明还提供了上述试剂盒的制备方法,包括抗体和生物素的偶联及抗试剂1的配制、酶和抗体的偶联及抗试剂2的配制、磁分离试剂的配制、校准品配制、发光底物配制等步骤。相比市场上现存人胰岛素原试剂盒,本发明的试剂盒具有检测灵敏度高、重复性好、成本低等特点。
但是,由于试剂盒一般是在开放环境中进行使用,而试剂盒的检测对灵敏度和抗干扰要求很高,因此需要合适缓冲溶液体系来为胰岛素试剂盒的使用一共稳定的检测环境,从而保证结果的稳定性和准确性。
发明内容
本发明的目的是针对胰岛素检测困难以及准确性较低,提供一种适用于胰岛素检测试剂盒的缓冲溶液。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种适用于胰岛素检测试剂盒的缓冲溶液,按重量份数计,包括以下成分,
三羟甲基氨基甲烷3.5-12份、氯化钠6.0-9.0份、蔗糖1-10份、牛血清白蛋白1-50份、牛血清10-100份、羊血清1-20份和马血清1-20份。
进一步地,所述缓冲溶液,按重量份数计,包括以下成分,
三羟甲基氨基甲烷3-12份、氯化钠6.0-9.0份、蔗糖5-10份、牛血清白蛋白30-50份、牛血清60-80份、羊血清10-20份和马血清10-20份。
进一步地,所述缓冲溶液,按体积1000mL计,包括以下成分,
三羟甲基氨基甲烷3-12g、氯化钠6.0-9.0g、蔗糖5-10g、牛血清白蛋白30-50g、牛血清60-80mL、羊血清10-20mL和马血清10-20mL,余量为水。
进一步地,所述缓冲溶液的pH=5.8-7.2。
进一步地,所述缓冲液的pH使用盐酸或氢氧化钠进行调节。
进一步地,所述缓冲溶液中还包括碱性磷酸酶-胰岛素抗体。
进一步地,所述碱性磷酸酶-胰岛素抗体的含量为0.4-2.2μg/mL。
进一步地,所述缓冲液中还包括生物素-胰岛素抗体。
进一步地,所述生物素-胰岛素抗体的含量为0.5-2.5μg/mL。
一种所述缓冲液的应用,所述应用为所述缓冲液在胰岛素检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种含有所述缓冲溶液的试剂盒,所述试剂盒包括以下试剂,
试剂A:所述包括碱性磷酸酶-胰岛素抗体的缓冲溶液;
试剂B:所述包括生物素-胰岛素抗体的缓冲溶液;
试剂C:链霉亲和素-磁微粒;
和三种不同浓度的胰岛素缓冲液。
进一步地,所述三种不同浓度的胰岛素缓冲液中胰岛素的浓度分别为标准品110-20μIU/mL、标准品230-50μIU/mL和质控品150-200μIU/mL。
进一步地,所述胰岛素缓冲液的具体组成包括,三羟甲基氨基甲烷12.0-18.0g、牛血清白蛋白30-50g、甘氨酸20-30g、海藻糖30-50g、酪蛋白20-30g和所述浓度的胰岛素。
进一步地,所述胰岛素缓冲液的pH=7.2-8.8。
进一步地,所述缓冲液的pH使用盐酸或氢氧化钠进行调节。
进一步地,所述试剂盒还包括清洗液和碱性磷酸酶特异性相应的反光底物;
进一步地,所述清洗液的具体组成为,以1000mL溶液计算,含有:0.5-5g三羟甲基氨基甲烷、2-20gNaCl、0.05-5g吐温20和0.005-5mL TritonX-100,余量为水。
进一步地,所述清洗液,以1000mL溶液计算,含有:3g三羟甲基氨基甲烷、10gNaCl、3g吐温20和2mL Triton-X100,余量为水。
进一步地,所述碱性磷酸酶特异性响应的发光底物为含二氧杂环乙烷类发光底物或二氢吖啶类发光底物的Tris溶液。
进一步地,所述二氢吖啶类发光底物9-[(对氯苯基硫代)-磷酰氧亚甲基]-10-甲基-9,10二氢吖啶,二钠盐。
本发明所使用的计量单位μIU/mL等价于10-6IU/mL。其中IU的含义是international unit,即国际单位,具有一定生物效能的最小效价单元就叫”单位”(U);经由国际协商规定出的标准单位,称为”国际单位”(IU)。
本发明是使用的术语“碱性磷酸酶-胰岛素抗体”即为本领域技术人员所知的碱性磷酸酶标记的胰岛素抗体。
本发明所述用的术语“生物素-胰岛素抗体”即为本领域技术人员所知的生物素标记的胰岛素抗体。
本发明所使用的术语“链霉亲和素-磁微粒”即为链霉亲和素标记的磁性微球。
本发明的优势在于:
1、本专利使用特殊的缓冲体系及物料使本项目的检测灵敏度达到0.5μIU/mL,达到国内领先水平。
2、本发明配合全自动仪器进行检测,只需加入该有样品的采血管,18分钟即可得到准确结果。远优于传统化学发光30分钟的反应时间或酶联免疫法1-2小时的反应时间。
具体实施方式
实施例1
一种适用于胰岛素检测试剂盒的缓冲溶液
三羟甲基氨基甲烷3g、氯化钠9.0g、蔗糖10g、牛血清白蛋白30g、牛血清80mL、羊血清10mL和马血清20mL,余量为水,总量为1000mL,使用4M HCl调节pH=5.8。
实施例2
一种适用于胰岛素检测试剂盒的缓冲溶液
三羟甲基氨基甲烷12g、氯化钠6.0g、蔗糖5g、牛血清白蛋白50g、牛血清60mL、羊血清20mL和马血清10mL,余量为水,总量为1000mL,使用4M HCl调节pH=7.2。
实施例3
试剂A:一种碱性磷酸酶-胰岛素抗体的缓冲溶液
三羟甲基氨基甲烷3g、氯化钠9.0g、蔗糖10g、牛血清白蛋白30g、牛血清80mL、羊血清10mL、马血清20mL和碱性磷酸酶-胰岛素抗体,余量为水,总量为1000mL,其中碱性磷酸酶-胰岛素抗体的含量为1.5μg/mL,使用4M HCl调节pH=5.8。
试剂B:一种生物素-胰岛素抗体的缓冲溶液
三羟甲基氨基甲烷3g、氯化钠9.0g、蔗糖10g、牛血清白蛋白30g、牛血清80mL、羊血清10mL、马血清20mL和生物素-胰岛素抗体,余量为水,总量为1000mL,其中生物素-胰岛素抗体的含量为1μg/mL,使用4M HCl调节pH=5.8。
实施例4
试剂A:一种碱性磷酸酶-胰岛素抗体的缓冲溶液
三羟甲基氨基甲烷3g、氯化钠9.0g、蔗糖10g、牛血清白蛋白30g、牛血清80mL、羊血清10mL、马血清20mL和碱性磷酸酶-胰岛素抗体,余量为水,总量为1000mL,其中碱性磷酸酶-胰岛素抗体的含量为0.5μg/mL,使用4M HCl调节pH=7.2。
试剂B:一种生物素-胰岛素抗体的缓冲溶液
三羟甲基氨基甲烷3g、氯化钠9.0g、蔗糖10g、牛血清白蛋白30g、牛血清80mL、羊血清10mL、马血清20mL和生物素-胰岛素抗体,余量为水,总量为1000mL,其中生物素-胰岛素抗体的含量为2μg/mL,使用4M HCl调节pH=7.2。
对比例1
和实施例3的区别在于,试剂A和试剂B的缓冲液使用4M HCl调节pH=8.5。
对比例2
和实施例3的区别在于,试剂A和试剂B的缓冲液中增加了Triton2030g。
对比例3
和实施例3的区别在于试剂A和试剂B的缓冲液中不含羊血清和马血清,牛血清用量为110mL。
本发明还提供试剂盒制备所需物料的制备方法
缓冲液1:乙醇胺15g/L和NaCl 6g/L水溶液;
缓冲液2:甘氨酸水溶液75g/L;
缓冲液3:六水合氯化镁水溶液,203.3g/L;
缓冲液4:吗啉乙磺酸钠盐水溶液,30g/L;
缓冲液5:三羟甲基氨基甲烷5g/L,氯化钠9g/L,牛血清白蛋白20g/L;
缓冲液6:三羟甲基氨基甲烷6g/L,氯化钠9g/L。
碱性磷酸酶-胰岛素抗体的制备例
称取8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT),用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2-IT与抗体摩尔比30:1的比例将2IT溶液加入抗体溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化,按1mg抗体加入20μl缓冲液2的比例,将缓冲液2加入抗体溶液中,室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT,收集活化后的抗体。
称取4mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC),用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mlL。按SMCC与ALP摩尔比50:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液。震荡混匀后,室温下反应30分钟。终止活化,按1mg ALP(碱性磷酸酶)加入30μl缓冲液2的比例,将缓冲液2加入ALP溶液中,室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC,收集活化后的ALP。
按活化后抗体与活化后ALP质量比1:1的比例在抗体溶液中的加入ALP溶液(即:1.0mg抗体加入1.0mg ALP。震荡混匀后,将混合物在2℃~8℃环境中反应12-18小时。
称取10mg马来酰亚胺,用DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例,用缓冲液1稀释,得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。按1mg抗体加入10μl 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液,在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺,用缓冲液1溶解至100mM。即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。按1mg抗体加入10~50μl 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液,震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体偶联物浓缩至1mg/mL。使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化,洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为碱性磷酸酶-胰岛素抗体溶液。
生物素-胰岛素抗体的制备例
用0.02M PBS配制10mM生物素溶液。按抗体与生物素摩尔比1:20的比例在抗体溶液中的加入10mM生物素溶液。震荡混匀后,将混合物在室温环境中反应1小时。
将反应后的溶液加入脱盐柱中。当溶液完全进入柱料前,使用0.02M PBS补足柱料体积。柱内液体完全进入柱料时,加入等体积的0.02M PBS缓冲液开始洗脱。收集等体积蛋白洗脱液并测试浓度。洗脱的溶液即为生物素-胰岛素抗体溶液。
链霉亲和素-磁微粒的制备例
将含有羧基的磁微粒用缓冲液4清洗后,重悬至10mg/mL。按磁微粒与链霉亲合素质量比10:1的比例在磁微粒溶液中加入链霉亲合素。充分混合后,在室温下混匀反应10分钟。按磁微粒与(3-二甲氨基丙基)乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)质量比100:10的比例在磁微粒溶液中加入EDC。充分混合后,在室温下混匀反应2小时。再对连接物进行磁性分离,使用缓冲液6将分离后的磁微粒重悬至10mg/mL,保存于2℃~8℃环境下。
试剂盒实施例1
实施例3的试剂A;
实施例3的试剂B;
试剂C:链霉亲和素-磁微粒,以1000mL总量计,具体组成为,十二水合磷酸氢二钠7.2g、磷酸二氢钠1.3g、氯化钠9g、牛血清白蛋白50g、蔗糖100g、纤维素5.0g和明胶30g,余量为水,使用4M HCl调节pH=8.0,其中链霉亲和素-磁微粒的含量为0.3mg/mL。
标准品1:以1000mL计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷15g、牛血清白蛋白40g、甘氨酸25g、海藻糖40g、酪蛋白25g和胰岛素,余量为水,使用4M HCl调节pH=8.0,其中胰岛素的含量为10μIU/mL。
标准品2:以1000mL计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷15g、牛血清白蛋白40g、甘氨酸25g、海藻糖40g、酪蛋白25g和胰岛素,余量为水,使用4M HCl调节pH=8.0,其中胰岛素的含量为150μIU/mL。
质控品:以1000mL计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷15g、牛血清白蛋白40g、甘氨酸25g、海藻糖40g、酪蛋白25g和胰岛素,余量为水,使用4M HCl调节pH=8.0,其中胰岛素的含量为30μIU/mL。
清洗液:以1000mL溶液计算,含有:3g三羟甲基氨基甲烷、10gNaCl、3g吐温20、2mLTriton-X 100。
碱性磷酸酶特异性响应的发光底物:9-[(对氯苯基硫代)-磷酰氧亚甲基]-10-甲基-9,10二氢吖啶,二钠盐的三羟甲基氨基甲烷溶液,浓度为0.3mg/mL。
试剂盒实施例2
实施例4的试剂A;
实施例4的试剂B;
试剂C:链霉亲和素-磁微粒,以1000mL总量计,具体组成为,十二水合磷酸氢二钠7.2g、磷酸二氢钠1.3g、氯化钠9g、牛血清白蛋白50g、蔗糖100g、纤维素5.0g和明胶30g,余量为水,使用4M HCl调节pH=8.0,其中链霉亲和素-磁微粒的含量为0.6mg/mL。
标准品1:以1000mL计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷15g、牛血清白蛋白40g、甘氨酸25g、海藻糖40g、酪蛋白25g和胰岛素,余量为水,使用4M HCl调节pH=8.0,其中胰岛素的含量为10μIU/mL。
标准品2:以1000mL计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷15g、牛血清白蛋白40g、甘氨酸25g、海藻糖40g、酪蛋白25g和胰岛素,余量为水,使用4M HCl调节pH=8.0,其中胰岛素的含量为150μIU/mL。
质控品:以1000mL计,具体组成为,三羟甲基氨基甲烷15g、牛血清白蛋白40g、甘氨酸25g、海藻糖40g、酪蛋白25g和胰岛素,余量为水,使用4M HCl调节pH=8.0,其中胰岛素的含量为30μIU/mL。
清洗液:以1000mL溶液计算,含有:3g三羟甲基氨基甲烷、10gNaCl、3g吐温20、2mLTritonX-100。
碱性磷酸酶特异性响应的发光底物:9-[(对氯苯基硫代)-磷酰氧亚甲基]-10-甲基-9,10二氢吖啶,二钠盐的三羟甲基氨基甲烷溶液,浓度为0.3mg/mL。
试剂盒对比例1
和试剂盒实施例1的区别在于,使用对比例1的试剂A和试剂B。
试剂盒对比例2
和试剂盒实施例1的区别在于,使用对比例2的试剂A和试剂B。
试剂盒对比例3
和试剂盒实施例1的区别在于,使用对比例3的试剂A和试剂B。
试剂盒性能测试指标
测试方法:
免疫反应:将30μL样本、50μL试剂A、50μL试剂B、50μL试剂C在离心管1中依次混合,在37℃条件下反应20min。
磁分离及清洗:加入300μL清洗液,清洗2min后,将含磁微粒的混合物用磁力吸出离心管1,在离心管2中脱磁。重复3次。
读值:在清洗后的磁微粒中加入150μL发光底物,ALP催化的发光底物发光后用自研仪器检测相对发光强度(RLU)。
根据检测的校准品数值可获得一条INS浓度-发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合。
样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应,从而实现对未知样本的浓度检测。
准确度分析方法:
将胰岛素国家标准品配制成10μIU/mL(允许浓度偏差为±20%)和100μIU/mL(允许浓度偏差为±20%)的2个浓度点,每个点平行测试2次,其实测值的均值与理论值之比应在0.85~1.15之间。
空白限分析方法:
线性区间分析方法:
将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成不少于5个稀释浓度,其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值,记录各样品的测量结果,并计算各样品3次测量值的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量,以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数(r),确定相关系数r≥0.990的线性区间。
式中:
r————相关系数;
xi————稀释比例;
yi————各个样本测定结果均值;
重复性分析方法
式中:s——样本测试值的标准差;
批间差分析方法:
使用上述方法对试剂盒实施例1-2以及试剂盒对比例1-3进行测试,结果见表1。
表1测试结果
可以看出,使用本发明的缓冲液组成的试剂盒,在胰岛素检测中具有较好的较低的空白限,较大的线性区间及线性关系,而且重复性更好。
最后应当说明的是,以上内容仅用以说明本发明的技术方案,而非对本发明保护范围的限制,本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换,均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (3)
1.一种试剂盒,所述试剂盒包括以下试剂,
试剂A:包括碱性磷酸酶-胰岛素抗体的缓冲溶液;
试剂B:包括生物素-胰岛素抗体的缓冲溶液;
试剂C:链霉亲和素-磁微粒;
和胰岛素缓冲液;
其中,试剂A:按体积1000 mL计,由以下成分制成,三羟甲基氨基甲烷 3-12 g、氯化钠6.0-9.0 g、蔗糖 5-10 g、牛血清白蛋白 30-50 g、牛血清 60-80 mL、羊血清 10-20 mL和马血清 10-20 mL,碱性磷酸酶-胰岛素抗体,其中碱性磷酸酶-胰岛素抗体的含量为0.4-2.2 μg/ mL,余量为水;
所述包括碱性磷酸酶-胰岛素抗体的缓冲溶液的pH=5.8-7.2;
试剂B:按体积1000 mL计,由以下成分制成,三羟甲基氨基甲烷 3-12 g、氯化钠 6.0-9.0 g、蔗糖 5-10 g、牛血清白蛋白 30-50 g、牛血清 60-80 mL、羊血清 10-20 mL和马血清 10-20 mL,生物素-胰岛素抗体,其中生物素-胰岛素抗体的含量为0.5-2.5 μg/mL,余量为水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述胰岛素缓冲液为三种不同浓度的胰岛素缓冲液,所述胰岛素缓冲液中胰岛素的浓度分别为标准品1 10-20 μIU/mL、标准品230-50 μIU/mL和质控品 150-200 μIU/mL;
所述胰岛素缓冲液的pH=7.2-8.8。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括清洗液和碱性磷酸酶特异性相应的反光底物。
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