JP2002207039A - Ｈｉｖプロテアーゼインヒビターの免疫測定法 - Google Patents
Ｈｉｖプロテアーゼインヒビターの免疫測定法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤検出用非アイソトー
プ性免疫測定法及びその測定法を実施するためのキット
を提供する。 【解決手段】（ａ）ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤を含有試
料を、該阻害剤に特異的なレセプター、並びに該阻害剤
のリガンド及び非アイソトープ性シグナル生成部分を含
有するコンジュゲートと合わせる工程、（ｂ）該シグナ
ル生成部分で生じるシグナル生成をモニターして、該コ
ンジュゲートに結合した該レセプターの量を測定する工
程、並びに（ｃ）該シグナル生成を試料中の該阻害剤の
存在又は量と相関させる工程、を含む、試料中のＨＩＶ
プロテアーゼ阻害剤の免疫測定法、並びに（ａ）ＨＩＶ
プロテアーゼ阻害剤に特異的なレセプター、及び（ｂ）
該阻害剤のリガンド及び非アイソトープ性シグナル生成
部分を含有するコンジュゲートをパッケージした組み合
せで含有する、試料中のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の測
定テストキット。
プ性免疫測定法及びその測定法を実施するためのキット
を提供する。 【解決手段】（ａ）ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤を含有試
料を、該阻害剤に特異的なレセプター、並びに該阻害剤
のリガンド及び非アイソトープ性シグナル生成部分を含
有するコンジュゲートと合わせる工程、（ｂ）該シグナ
ル生成部分で生じるシグナル生成をモニターして、該コ
ンジュゲートに結合した該レセプターの量を測定する工
程、並びに（ｃ）該シグナル生成を試料中の該阻害剤の
存在又は量と相関させる工程、を含む、試料中のＨＩＶ
プロテアーゼ阻害剤の免疫測定法、並びに（ａ）ＨＩＶ
プロテアーゼ阻害剤に特異的なレセプター、及び（ｂ）
該阻害剤のリガンド及び非アイソトープ性シグナル生成
部分を含有するコンジュゲートをパッケージした組み合
せで含有する、試料中のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の測
定テストキット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、液体媒体
中の解析物を測定する技術分野に関する。より詳細に
は、生物学的試料中の治療薬を測定するための免疫測定
法に関する。特に、本発明は、生物学的試料中のプロテ
アーゼインヒビター、特にＨＩＶプロテアーゼインヒビ
ターを検出するための非アイソトープ性免疫測定法に関
する。
中の解析物を測定する技術分野に関する。より詳細に
は、生物学的試料中の治療薬を測定するための免疫測定
法に関する。特に、本発明は、生物学的試料中のプロテ
アーゼインヒビター、特にＨＩＶプロテアーゼインヒビ
ターを検出するための非アイソトープ性免疫測定法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＩＶプロテアーゼインヒビターは、１
９９５年に第１号のサキナビルが市場に導入されて以
来、ＡＩＤＳ患者の健康管理に対して意義のある効果を
与えてきた重要な新薬である。他のプロテアーゼインヒ
ビターの例には、アンプレナビル（amprenavir）、イン
ジナビル（indinavir ）、ネルフィナビル（nelfinavi
r）およびリトナビル（ritonavir ）がある。これら
は、逆転写酵素インヒビターなどの他の抗ＨＩＶ薬や、
他のＨＩＶプロテアーゼインヒビターと併用すると特に
有効である。これらの新しい治療法が顕著な成功を収め
ているにもかかわらず、プロテアーゼインヒビターをモ
ニターするための治療薬試験法があれば、治療成績はも
っと改善されるであろうという強い示唆がある。すべて
の患者がプロテアーゼインヒビター併用療法に最適に応
答するわけではない。最初は応答を示した患者でさえ、
ＨＩＶウイルスの変異率が非常に高いことから薬剤耐性
を発現しうる。しかしながら、プロテアーゼインヒビタ
ーの血漿レベルと、ウイルス量の低下およびＣＤ４細胞
数の増加に基づく治療有効性との間に明白な関係がある
ことが示されている。薬剤には、広範に代謝され、複雑
な薬剤間相互作用を行うという問題がある。その結果、
極めて複雑な薬剤動態が生じ、用量と、任意の特定患者
における任意の特定時間での残留薬剤レベルとの間に予
測不可能な強い要因がもたらされる。治療薬のモニタリ
ングにより、薬剤の用量は、個々の患者毎に決定するこ
とができ、ウイルスが抑制される可能性がずっと高くな
る。しかしながら、プロテアーゼインヒビターの常套的
治療薬モニタリングには、高処理臨床解析装置に適合し
うる簡単な自動化試験法が利用できることが必要であ
る。現在、プロテアーゼインヒビターの治療薬モニタリ
ングに関する報告のほとんどは、ＨＰＬＣ法を使用した
ものであるが、これは、時間、労力および費用がかか
る。最近、サキナビルに関する放射免疫測定（ＲＩＡ）
法が報告された。しかしながら、この方法は、高処理治
療薬モニタリングに適合しえないことがあり、すべての
ＲＩＡ法と同様に、アッセイで使用したラジオアイソト
ープ標識に関する安全性や廃棄物処理の管理の問題があ
る。したがって、治療薬モニタリングの最も望ましいア
ッセイの形態は、非アイソトープ性免疫測定法であり、
このような形態の方法は、ＨＩＶプロテアーゼインヒビ
ターのモニタリングに関して、これまでに知られていな
い。
９９５年に第１号のサキナビルが市場に導入されて以
来、ＡＩＤＳ患者の健康管理に対して意義のある効果を
与えてきた重要な新薬である。他のプロテアーゼインヒ
ビターの例には、アンプレナビル（amprenavir）、イン
ジナビル（indinavir ）、ネルフィナビル（nelfinavi
r）およびリトナビル（ritonavir ）がある。これら
は、逆転写酵素インヒビターなどの他の抗ＨＩＶ薬や、
他のＨＩＶプロテアーゼインヒビターと併用すると特に
有効である。これらの新しい治療法が顕著な成功を収め
ているにもかかわらず、プロテアーゼインヒビターをモ
ニターするための治療薬試験法があれば、治療成績はも
っと改善されるであろうという強い示唆がある。すべて
の患者がプロテアーゼインヒビター併用療法に最適に応
答するわけではない。最初は応答を示した患者でさえ、
ＨＩＶウイルスの変異率が非常に高いことから薬剤耐性
を発現しうる。しかしながら、プロテアーゼインヒビタ
ーの血漿レベルと、ウイルス量の低下およびＣＤ４細胞
数の増加に基づく治療有効性との間に明白な関係がある
ことが示されている。薬剤には、広範に代謝され、複雑
な薬剤間相互作用を行うという問題がある。その結果、
極めて複雑な薬剤動態が生じ、用量と、任意の特定患者
における任意の特定時間での残留薬剤レベルとの間に予
測不可能な強い要因がもたらされる。治療薬のモニタリ
ングにより、薬剤の用量は、個々の患者毎に決定するこ
とができ、ウイルスが抑制される可能性がずっと高くな
る。しかしながら、プロテアーゼインヒビターの常套的
治療薬モニタリングには、高処理臨床解析装置に適合し
うる簡単な自動化試験法が利用できることが必要であ
る。現在、プロテアーゼインヒビターの治療薬モニタリ
ングに関する報告のほとんどは、ＨＰＬＣ法を使用した
ものであるが、これは、時間、労力および費用がかか
る。最近、サキナビルに関する放射免疫測定（ＲＩＡ）
法が報告された。しかしながら、この方法は、高処理治
療薬モニタリングに適合しえないことがあり、すべての
ＲＩＡ法と同様に、アッセイで使用したラジオアイソト
ープ標識に関する安全性や廃棄物処理の管理の問題があ
る。したがって、治療薬モニタリングの最も望ましいア
ッセイの形態は、非アイソトープ性免疫測定法であり、
このような形態の方法は、ＨＩＶプロテアーゼインヒビ
ターのモニタリングに関して、これまでに知られていな
い。
【０００３】ＨＰＬＣは、ＨＩＶプロテアーゼインヒビ
ターのモニタリング方法の１つとして使用されてきた。
最近の文献において、Poirier ら、Therapeutic Drug M
onitoring 22, 465-473, 2000 およびRemmelら、Clinic
al Chemistry 46, 73-81, 2000の２件の報告には、ヒト
血漿中において数種類のプロテアーゼインヒビターを同
時測定するためのＨＰＬＣアッセイが記載されている。
あらゆる免疫測定法の中でＨＩＶプロテアーゼインヒビ
ター関する公知文献はたった１件しかない。今年より前
では、サキナビルのためのＲＩＡ、その患者サンプルで
の使用およびＨＰＬＣ法との比較が、Wiltshire ら、An
alytical Biochemistry 281, 105-114,2000 に記載され
ている。しかしながら、非アイソトープ性代替法の教示
も示唆もなかった。
ターのモニタリング方法の１つとして使用されてきた。
最近の文献において、Poirier ら、Therapeutic Drug M
onitoring 22, 465-473, 2000 およびRemmelら、Clinic
al Chemistry 46, 73-81, 2000の２件の報告には、ヒト
血漿中において数種類のプロテアーゼインヒビターを同
時測定するためのＨＰＬＣアッセイが記載されている。
あらゆる免疫測定法の中でＨＩＶプロテアーゼインヒビ
ター関する公知文献はたった１件しかない。今年より前
では、サキナビルのためのＲＩＡ、その患者サンプルで
の使用およびＨＰＬＣ法との比較が、Wiltshire ら、An
alytical Biochemistry 281, 105-114,2000 に記載され
ている。しかしながら、非アイソトープ性代替法の教示
も示唆もなかった。
【０００４】化学的アッセイおよび生物学的アッセイ
は、通常、目的の解析物を、所定の非限定的な量の１種
以上のアッセイ試薬と接触させる工程、得られた生成物
（検出産物）の１種以上の物性を測定する工程、および
典型的には被検試料に期待される範囲の既知量の目的解
析物を含有する標品試料または較正試料から求められる
関係を用い、測定値を元の試料中に存在する解析物の量
と相関させる工程を含む。典型的には、検出産物は、１
種以上のアッセイ試薬により供給される１種以上の検出
可能な標識を含有する。一般的に使用される標識の例と
しては、125 Ｉおよび32Ｐなどのラジオアイソトープ標
識、ペルオキシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼなど
の酵素ならびに酵素基質標識、フルオレセインおよびロ
ーダミンなどの蛍光標識、ニトロキシド遊離ラジカルな
どの電子スピン共鳴標識、抗体および抗原などの免疫反
応性標識、ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレ
プトアビジンなどの結合ペアの一方の構成物である標
識、ならびにルテニウムビピリジル部を含有するものな
どの電子化学発光標識が挙げられる。サンドイッチアッ
セイは、典型的には、最終的に分離に使用する第一アッ
セイ試薬、例えば、抗体、抗原または結合ペアの一方の
構成物と、検出可能な標識を供給する第二アッセイ試薬
との間に目的解析物がサンドイッチされた複合体を形成
する工程を含む。競合アッセイは、典型的には、目的解
析物とこの解析物の類似体の両方が別の試薬、例えば抗
体の結合部位に関して競合する系を含み、このとき、解
析物、類似物または結合試薬のうち１つは、検出可能な
標識を有する。
は、通常、目的の解析物を、所定の非限定的な量の１種
以上のアッセイ試薬と接触させる工程、得られた生成物
（検出産物）の１種以上の物性を測定する工程、および
典型的には被検試料に期待される範囲の既知量の目的解
析物を含有する標品試料または較正試料から求められる
関係を用い、測定値を元の試料中に存在する解析物の量
と相関させる工程を含む。典型的には、検出産物は、１
種以上のアッセイ試薬により供給される１種以上の検出
可能な標識を含有する。一般的に使用される標識の例と
しては、125 Ｉおよび32Ｐなどのラジオアイソトープ標
識、ペルオキシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼなど
の酵素ならびに酵素基質標識、フルオレセインおよびロ
ーダミンなどの蛍光標識、ニトロキシド遊離ラジカルな
どの電子スピン共鳴標識、抗体および抗原などの免疫反
応性標識、ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレ
プトアビジンなどの結合ペアの一方の構成物である標
識、ならびにルテニウムビピリジル部を含有するものな
どの電子化学発光標識が挙げられる。サンドイッチアッ
セイは、典型的には、最終的に分離に使用する第一アッ
セイ試薬、例えば、抗体、抗原または結合ペアの一方の
構成物と、検出可能な標識を供給する第二アッセイ試薬
との間に目的解析物がサンドイッチされた複合体を形成
する工程を含む。競合アッセイは、典型的には、目的解
析物とこの解析物の類似体の両方が別の試薬、例えば抗
体の結合部位に関して競合する系を含み、このとき、解
析物、類似物または結合試薬のうち１つは、検出可能な
標識を有する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、高処理量の
治療薬モニタリングに適合し、安全であり、廃棄物処理
の管理を必要としない、ＨＩＶプロテアーゼインヒビタ
ーの検出のための非アイソトープ性免疫測定法および該
方法を実施するためのキットを提供することを目的とす
る。
治療薬モニタリングに適合し、安全であり、廃棄物処理
の管理を必要としない、ＨＩＶプロテアーゼインヒビタ
ーの検出のための非アイソトープ性免疫測定法および該
方法を実施するためのキットを提供することを目的とす
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
（１） （ａ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビターを含有
すると思われる試料を、該インヒビターに特異的なレセ
プター、ならびに該インヒビターのリガンドおよび非ア
イソトープ性シグナル生成部分を含有してなるコンジュ
ゲートと合わせる工程、（ｂ）該シグナル生成部分によ
り生じるシグナル生成をモニターすることにより、該コ
ンジュゲートに結合した該レセプターの量を測定する工
程、ならびに（ｃ）該シグナル生成を試料中の該インヒ
ビターの存在または量と相関させる工程、を含む、試料
中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを測定するための
免疫測定法、（２） 該レセプターが、抗体、抗体フラ
グメントおよび抗体誘導体からなる群より選ばれる前記
（１）記載の方法、（３） 該プロテアーゼインヒビタ
ーが、サキナビル、アンプレナビル、インジナビル、ネ
ルフィナビルおよびリトナビルからなる群より選ばれる
前記（１）記載の方法、（４） 該レセプターが、直接
または間接的に固相に結合している前記（１）記載の方
法、（５） 該シグナル生成部分が、酵素、蛍光発生化
合物、化学発光物質、電気化学的メディエーター、粒
子、レポーター基、酵素インヒビターおよびポリペプチ
ドキャリアからなる群より選ばれる前記（１）記載の方
法、（６） （ａ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビターを
含有すると思われる試料を、該プロテアーゼインヒビタ
ーのリガンドおよびミコフェノール酸を含有するコンジ
ュゲート、該プロテアーゼインヒビターに特異的なレセ
プター、ＩＭＰ、ＮＡＤならびにＩＭＰＤＨと合わせる
工程、（ｂ）ＮＡＤＨの生成をモニターする工程、なら
びに（ｃ）ＮＡＤＨの生成を試料中の該プロテアーゼイ
ンヒビターの存在または量と相関させる工程、を含む、
試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを測定するた
めの非アイソトープ性免疫測定法、（７） （ａ）ＨＩ
Ｖプロテアーゼインヒビターに特異的なレセプター、お
よび（ｂ）該インヒビターのリガンドおよび非アイソト
ープ性シグナル生成部分を含有してなるコンジュゲート
をパッケージした組み合せで含有する、試料中のＨＩＶ
プロテアーゼインヒビターを測定するためのテストキッ
ト、（８） 該レセプターが、抗体、抗体フラグメント
および抗体誘導体からなる群より選ばれてなる前記
（７）記載のテストキット、（９） 該プロテアーゼイ
ンヒビターが、サキナビル、アンプレナビル、インジナ
ビル、ネルフィナビルおよびリトナビルからなる群より
選ばれてなる前記（７）記載のテストキット、（１０）
該レセプターが、直接または間接的に固相に結合して
いる前記（７）記載のテストキット、（１１） 該シグ
ナル生成部分が、酵素、蛍光発生化合物、化学発光物
質、電気化学的メディエーター、粒子、レポーター基、
酵素インヒビターおよびポリペプチドキャリアからなる
群より選ばれてなる前記（７）記載のテストキット、に
関する。
（１） （ａ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビターを含有
すると思われる試料を、該インヒビターに特異的なレセ
プター、ならびに該インヒビターのリガンドおよび非ア
イソトープ性シグナル生成部分を含有してなるコンジュ
ゲートと合わせる工程、（ｂ）該シグナル生成部分によ
り生じるシグナル生成をモニターすることにより、該コ
ンジュゲートに結合した該レセプターの量を測定する工
程、ならびに（ｃ）該シグナル生成を試料中の該インヒ
ビターの存在または量と相関させる工程、を含む、試料
中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを測定するための
免疫測定法、（２） 該レセプターが、抗体、抗体フラ
グメントおよび抗体誘導体からなる群より選ばれる前記
（１）記載の方法、（３） 該プロテアーゼインヒビタ
ーが、サキナビル、アンプレナビル、インジナビル、ネ
ルフィナビルおよびリトナビルからなる群より選ばれる
前記（１）記載の方法、（４） 該レセプターが、直接
または間接的に固相に結合している前記（１）記載の方
法、（５） 該シグナル生成部分が、酵素、蛍光発生化
合物、化学発光物質、電気化学的メディエーター、粒
子、レポーター基、酵素インヒビターおよびポリペプチ
ドキャリアからなる群より選ばれる前記（１）記載の方
法、（６） （ａ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビターを
含有すると思われる試料を、該プロテアーゼインヒビタ
ーのリガンドおよびミコフェノール酸を含有するコンジ
ュゲート、該プロテアーゼインヒビターに特異的なレセ
プター、ＩＭＰ、ＮＡＤならびにＩＭＰＤＨと合わせる
工程、（ｂ）ＮＡＤＨの生成をモニターする工程、なら
びに（ｃ）ＮＡＤＨの生成を試料中の該プロテアーゼイ
ンヒビターの存在または量と相関させる工程、を含む、
試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを測定するた
めの非アイソトープ性免疫測定法、（７） （ａ）ＨＩ
Ｖプロテアーゼインヒビターに特異的なレセプター、お
よび（ｂ）該インヒビターのリガンドおよび非アイソト
ープ性シグナル生成部分を含有してなるコンジュゲート
をパッケージした組み合せで含有する、試料中のＨＩＶ
プロテアーゼインヒビターを測定するためのテストキッ
ト、（８） 該レセプターが、抗体、抗体フラグメント
および抗体誘導体からなる群より選ばれてなる前記
（７）記載のテストキット、（９） 該プロテアーゼイ
ンヒビターが、サキナビル、アンプレナビル、インジナ
ビル、ネルフィナビルおよびリトナビルからなる群より
選ばれてなる前記（７）記載のテストキット、（１０）
該レセプターが、直接または間接的に固相に結合して
いる前記（７）記載のテストキット、（１１） 該シグ
ナル生成部分が、酵素、蛍光発生化合物、化学発光物
質、電気化学的メディエーター、粒子、レポーター基、
酵素インヒビターおよびポリペプチドキャリアからなる
群より選ばれてなる前記（７）記載のテストキット、に
関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明は、ＨＩＶプロテアーゼイ
ンヒビターの免疫測定法を包含し、該方法は、該プロテ
アーゼインヒビターを含有すると思われる試料を、該イ
ンヒビターに特異的なレセプター、および該インヒビタ
ーのリガンドまたは類似体と非アイソトープ性標識とか
らなる非アイソトープ性コンジュゲートとともにインキ
ュベートする工程、該コンジュゲートに結合するレセプ
ターの量を測定する工程、ならびに結合したパートナー
の量を試料中のプロテアーゼインヒビターの量と相関さ
せる工程を含む。レセプターおよびコンジュゲートとの
試料のインキュベーションは逐次的または同時に行いう
る。試料は、好ましくは全血、血清、血漿、尿、唾液、
脳脊髄液または涙などの体液である。レセプターまたは
結合パートナーは、他のプロテアーゼインヒビター、プ
ロテアーゼインヒビター代謝物または同時投与された非
プロテアーゼインヒビター薬剤から特定のプロテアーゼ
インヒビターを選択しうる（selective ）抗体でありう
る。あるいはまた、本発明の別の局面では、レセプター
は、構造的に関連するプロテアーゼインヒビターおよび
／またはプロテアーゼインヒビター代謝物の一群と反応
しうる抗体である。非アイソトープ性コンジュゲート
は、非アイソトープ性標識とリガンドとの共有結合複合
体または非共有結合複合体であり、リガンドは、プロテ
アーゼインヒビター、プロテアーゼインヒビター誘導体
およびプロテアーゼインヒビター類似体からなる群より
選ばれる。非アイソトープ性標識の例としては、酵素、
蛍光発生化合物、化学発光物質、電気化学的メディエー
ター、粒子、ビオチンなどのレポーター群、ミコフェノ
ール酸などの酵素インヒビター、およびタンパク質、糖
タンパク質、多糖と核酸との複合体などの巨大分子担体
が挙げられる。本発明の免疫測定法は、固相を用いた不
均一形態で行ってもよく、溶液または懸濁液を用いた均
一形態で行ってもよく、どちらのアッセイ形態も当該技
術分野において周知である。好ましい不均一系形態の１
つにマイクロタイタープレートＥＬＩＳＡ（固相酵素免
疫測定法）がある。好ましい均一系形態には、微粒子凝
集、および非競合阻害免疫測定法、例えば２０００年６
月２６日に出願された、Dornらの米国特許出願第０９／
６０３，６４６号明細書に記載されたミコフェノール酸
／イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ法が挙げられる。
ンヒビターの免疫測定法を包含し、該方法は、該プロテ
アーゼインヒビターを含有すると思われる試料を、該イ
ンヒビターに特異的なレセプター、および該インヒビタ
ーのリガンドまたは類似体と非アイソトープ性標識とか
らなる非アイソトープ性コンジュゲートとともにインキ
ュベートする工程、該コンジュゲートに結合するレセプ
ターの量を測定する工程、ならびに結合したパートナー
の量を試料中のプロテアーゼインヒビターの量と相関さ
せる工程を含む。レセプターおよびコンジュゲートとの
試料のインキュベーションは逐次的または同時に行いう
る。試料は、好ましくは全血、血清、血漿、尿、唾液、
脳脊髄液または涙などの体液である。レセプターまたは
結合パートナーは、他のプロテアーゼインヒビター、プ
ロテアーゼインヒビター代謝物または同時投与された非
プロテアーゼインヒビター薬剤から特定のプロテアーゼ
インヒビターを選択しうる（selective ）抗体でありう
る。あるいはまた、本発明の別の局面では、レセプター
は、構造的に関連するプロテアーゼインヒビターおよび
／またはプロテアーゼインヒビター代謝物の一群と反応
しうる抗体である。非アイソトープ性コンジュゲート
は、非アイソトープ性標識とリガンドとの共有結合複合
体または非共有結合複合体であり、リガンドは、プロテ
アーゼインヒビター、プロテアーゼインヒビター誘導体
およびプロテアーゼインヒビター類似体からなる群より
選ばれる。非アイソトープ性標識の例としては、酵素、
蛍光発生化合物、化学発光物質、電気化学的メディエー
ター、粒子、ビオチンなどのレポーター群、ミコフェノ
ール酸などの酵素インヒビター、およびタンパク質、糖
タンパク質、多糖と核酸との複合体などの巨大分子担体
が挙げられる。本発明の免疫測定法は、固相を用いた不
均一形態で行ってもよく、溶液または懸濁液を用いた均
一形態で行ってもよく、どちらのアッセイ形態も当該技
術分野において周知である。好ましい不均一系形態の１
つにマイクロタイタープレートＥＬＩＳＡ（固相酵素免
疫測定法）がある。好ましい均一系形態には、微粒子凝
集、および非競合阻害免疫測定法、例えば２０００年６
月２６日に出願された、Dornらの米国特許出願第０９／
６０３，６４６号明細書に記載されたミコフェノール酸
／イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ法が挙げられる。
【０００８】ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの非アイ
ソトープ性免疫測定法は、不均一形態でも均一形態でも
構築しうる。不均一系免疫測定法は、結合した解析物を
遊離の解析物から、または結合した標識を遊離の標識か
ら固相分離することが特徴である。固相は、チューブ、
プレート、ビーズまたは細片などの当該技術分野におい
て周知の種々の形態をとりうるが、これらには限定され
ない。特に好ましい形態の１つにマイクロタイタープレ
ートがある。固相材料は、様々なガラス、ポリマー、プ
ラスチック、紙または膜から構成されうる。特に好まし
くは、ポリスチレンなどのプラスチックである。不均一
系免疫測定法は、競合形態であってもよく、非競合形
態、すなわちサンドイッチ形態であってもよい。
ソトープ性免疫測定法は、不均一形態でも均一形態でも
構築しうる。不均一系免疫測定法は、結合した解析物を
遊離の解析物から、または結合した標識を遊離の標識か
ら固相分離することが特徴である。固相は、チューブ、
プレート、ビーズまたは細片などの当該技術分野におい
て周知の種々の形態をとりうるが、これらには限定され
ない。特に好ましい形態の１つにマイクロタイタープレ
ートがある。固相材料は、様々なガラス、ポリマー、プ
ラスチック、紙または膜から構成されうる。特に好まし
くは、ポリスチレンなどのプラスチックである。不均一
系免疫測定法は、競合形態であってもよく、非競合形
態、すなわちサンドイッチ形態であってもよい。
【０００９】ＨＩＶプロテアーゼインヒビターなどの低
分子量解析物には、競合形態が好ましい。ＨＩＶプロテ
アーゼインヒビター用の競合不均一系免疫測定は様々な
方法で行いうる。例えば、一形態では、プロテアーゼイ
ンヒビターに対する抗体を固相に固定した後、ある一定
数のレセプター結合部位に関して競合する試料およびコ
ンジュゲートとともにインキュベートする。次いで、結
合しなかった解析物およびコンジュゲートを除き、結合
したコンジュゲートの量を測定する。結合したコンジュ
ゲートの量は、試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビタ
ー量に反比例する。当該技術分野において周知の方法に
より、既知量のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを用い
て用量応答較正曲線を作成する。
分子量解析物には、競合形態が好ましい。ＨＩＶプロテ
アーゼインヒビター用の競合不均一系免疫測定は様々な
方法で行いうる。例えば、一形態では、プロテアーゼイ
ンヒビターに対する抗体を固相に固定した後、ある一定
数のレセプター結合部位に関して競合する試料およびコ
ンジュゲートとともにインキュベートする。次いで、結
合しなかった解析物およびコンジュゲートを除き、結合
したコンジュゲートの量を測定する。結合したコンジュ
ゲートの量は、試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビタ
ー量に反比例する。当該技術分野において周知の方法に
より、既知量のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを用い
て用量応答較正曲線を作成する。
【００１０】本発明の別の好ましい形態は、ＨＩＶプロ
テアーゼインヒビター誘導体とタンパク質などの巨大分
子担体物質とのコンジュゲートを最初に調製する工程を
含む。このようなコンジュゲートの調製は、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）輸送タンパク質とサキナビル誘導体
とのコンジュゲートに関して本明細書の実施例１〜３に
記載している。このタイプのコンジュゲートは、共有結
合固定化または受動固定化（passive immobilization）
を用いて任意の固相に固定しうる。実施例４には、マイ
クロタイタープレート上への受動固定化について記載し
ている。コンジュゲートでコートしたプレートの調製
後、レセプターを所定の至適希釈度で、ＨＩＶプロテア
ーゼインヒビター含有試料とともに添加する。その結
果、固相に結合したコンジュゲートと溶液中のＨＩＶプ
ロテアーゼインヒビターとが、ある限られた数のレセプ
ター結合部位に関して競合する。インキュベーション
後、固相を洗浄して未結合レセプターを除去する。最後
に、標識を加え、結合した抗体の存在を検出するのに使
用する。実施例６に記載したようなＥＬＩＳＡアッセイ
の場合、標識として特定の結合レセプター種に対する二
次抗体または二次レセプター、例えばウサギ抗ヒツジ抗
体が挙げられ、これは酵素標識、例えば、ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートす
る。他の酵素標識および二次結合物質は、マイクロタイ
タープレートＥＬＩＳＡの技術分野の当業者とって自明
である。最初に記載したアッセイ形態と同様、結合した
酵素コンジュゲートの量は、試料中のＨＩＶプロテアー
ゼインヒビター量に反比例する。標準的な方法を用い、
既知量のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを用いて用量
応答較正曲線を作成し、次いで、未知試料中のＨＩＶプ
ロテアーゼインヒビター量を該較正曲線と相関させる。
テアーゼインヒビター誘導体とタンパク質などの巨大分
子担体物質とのコンジュゲートを最初に調製する工程を
含む。このようなコンジュゲートの調製は、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）輸送タンパク質とサキナビル誘導体
とのコンジュゲートに関して本明細書の実施例１〜３に
記載している。このタイプのコンジュゲートは、共有結
合固定化または受動固定化（passive immobilization）
を用いて任意の固相に固定しうる。実施例４には、マイ
クロタイタープレート上への受動固定化について記載し
ている。コンジュゲートでコートしたプレートの調製
後、レセプターを所定の至適希釈度で、ＨＩＶプロテア
ーゼインヒビター含有試料とともに添加する。その結
果、固相に結合したコンジュゲートと溶液中のＨＩＶプ
ロテアーゼインヒビターとが、ある限られた数のレセプ
ター結合部位に関して競合する。インキュベーション
後、固相を洗浄して未結合レセプターを除去する。最後
に、標識を加え、結合した抗体の存在を検出するのに使
用する。実施例６に記載したようなＥＬＩＳＡアッセイ
の場合、標識として特定の結合レセプター種に対する二
次抗体または二次レセプター、例えばウサギ抗ヒツジ抗
体が挙げられ、これは酵素標識、例えば、ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートす
る。他の酵素標識および二次結合物質は、マイクロタイ
タープレートＥＬＩＳＡの技術分野の当業者とって自明
である。最初に記載したアッセイ形態と同様、結合した
酵素コンジュゲートの量は、試料中のＨＩＶプロテアー
ゼインヒビター量に反比例する。標準的な方法を用い、
既知量のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを用いて用量
応答較正曲線を作成し、次いで、未知試料中のＨＩＶプ
ロテアーゼインヒビター量を該較正曲線と相関させる。
【００１１】本発明の好ましい均一系微粒子免疫測定法
およびテストキットは、血清、血漿、全血、尿および唾
液中のＨＩＶプロテアーゼインヒビター検出のための既
製の（ready-to-use）液体試薬を含有する二試薬系を含
む。溶液中の微粒子の動力学的相互作用は、自動解析装
置を用いて簡便に測定される。この特定のアッセイ形態
では、特定のプロテアーゼインヒビターに対する抗体
を、共有結合固定化または受動固定化を用いて微粒子上
に負荷し、このプロテアーゼインヒビターの誘導体をア
ミノデキストランなどの任意の巨大分子に結合させる。
以下、これを薬剤コンジュゲートという。薬剤コンジュ
ゲートと血清試料中の任意の薬剤との間には、微粒子上
のある限られた量の特異的抗体結合部位への結合に関し
て競合反応が起こる。溶液中の微粒子の動力学的相互作
用は、薬剤コンジュゲートの微粒子上の抗体への結合に
より誘導され、試料中の薬剤の存在により阻害される。
微粒子の相互作用は、溶液の吸光度により測定され、そ
れは溶液の濁度と関連している。粒子と薬剤コンジュゲ
ートが架橋すると濁度が高くなる（吸光度が高くな
る）。遊離の薬剤が粒子上の抗体に結合すると、濁度は
低くなる（吸光度が低くなる）。
およびテストキットは、血清、血漿、全血、尿および唾
液中のＨＩＶプロテアーゼインヒビター検出のための既
製の（ready-to-use）液体試薬を含有する二試薬系を含
む。溶液中の微粒子の動力学的相互作用は、自動解析装
置を用いて簡便に測定される。この特定のアッセイ形態
では、特定のプロテアーゼインヒビターに対する抗体
を、共有結合固定化または受動固定化を用いて微粒子上
に負荷し、このプロテアーゼインヒビターの誘導体をア
ミノデキストランなどの任意の巨大分子に結合させる。
以下、これを薬剤コンジュゲートという。薬剤コンジュ
ゲートと血清試料中の任意の薬剤との間には、微粒子上
のある限られた量の特異的抗体結合部位への結合に関し
て競合反応が起こる。溶液中の微粒子の動力学的相互作
用は、薬剤コンジュゲートの微粒子上の抗体への結合に
より誘導され、試料中の薬剤の存在により阻害される。
微粒子の相互作用は、溶液の吸光度により測定され、そ
れは溶液の濁度と関連している。粒子と薬剤コンジュゲ
ートが架橋すると濁度が高くなる（吸光度が高くな
る）。遊離の薬剤が粒子上の抗体に結合すると、濁度は
低くなる（吸光度が低くなる）。
【００１２】均一系微粒子免疫測定法およびテストキッ
トの別の形態は、血清、血漿、全血、尿および唾液中の
ＨＩＶプロテアーゼインヒビター検出のための既製液体
試薬を含む。溶液中の微粒子の動力学的相互作用は、自
動解析装置を用いて簡便に測定される。このアッセイ形
態では、ウシ血清アルブミンなどの任意の巨大分子に結
合した薬剤誘導体を、共有結合固定化または受動固定化
を用いて微粒子上に負荷する。この特定のプロテアーゼ
インヒビターに対する抗体をバッファー系に配合する。
微粒子上の薬剤コンジュゲートと血清試料中に存在する
任意の薬剤との間には、反応溶液中のある一定量の特異
的抗体への結合に関して競合反応が起こる。溶液中の微
粒子の動力学的相互作用は、薬剤コンジュゲートの抗体
への結合により誘導され、試料中の薬剤の存在により阻
害される。微粒子の相互作用は、溶液の吸光度により測
定され、それは溶液の濁度と関連している。粒子と薬剤
コンジュゲートが架橋すると濁度が高くなる（吸光度が
高くなる）。遊離の薬剤が粒子上の抗体に結合すると、
濁度は低くなる（吸光度が低くなる）。
トの別の形態は、血清、血漿、全血、尿および唾液中の
ＨＩＶプロテアーゼインヒビター検出のための既製液体
試薬を含む。溶液中の微粒子の動力学的相互作用は、自
動解析装置を用いて簡便に測定される。このアッセイ形
態では、ウシ血清アルブミンなどの任意の巨大分子に結
合した薬剤誘導体を、共有結合固定化または受動固定化
を用いて微粒子上に負荷する。この特定のプロテアーゼ
インヒビターに対する抗体をバッファー系に配合する。
微粒子上の薬剤コンジュゲートと血清試料中に存在する
任意の薬剤との間には、反応溶液中のある一定量の特異
的抗体への結合に関して競合反応が起こる。溶液中の微
粒子の動力学的相互作用は、薬剤コンジュゲートの抗体
への結合により誘導され、試料中の薬剤の存在により阻
害される。微粒子の相互作用は、溶液の吸光度により測
定され、それは溶液の濁度と関連している。粒子と薬剤
コンジュゲートが架橋すると濁度が高くなる（吸光度が
高くなる）。遊離の薬剤が粒子上の抗体に結合すると、
濁度は低くなる（吸光度が低くなる）。
【００１３】本発明の別の免疫測定形態では、蛍光偏光
免疫測定法およびテストキットは、蛍光偏光の原理を用
いる血清、血漿、全血、尿および唾液中のＨＩＶプロテ
アーゼインヒビター検出のための既製液体試薬を含む。
このアッセイ形態では、薬剤誘導体を発蛍光団でタグ化
または標識し、この特定のプロテアーゼインヒビターに
対する抗体をバッファー系に配合する。蛍光トレーサー
を有する薬剤と血清試料中の任意の薬剤との間には、反
応溶液中のある一定量の特異的抗体への結合に関して競
合反応が起こる。
免疫測定法およびテストキットは、蛍光偏光の原理を用
いる血清、血漿、全血、尿および唾液中のＨＩＶプロテ
アーゼインヒビター検出のための既製液体試薬を含む。
このアッセイ形態では、薬剤誘導体を発蛍光団でタグ化
または標識し、この特定のプロテアーゼインヒビターに
対する抗体をバッファー系に配合する。蛍光トレーサー
を有する薬剤と血清試料中の任意の薬剤との間には、反
応溶液中のある一定量の特異的抗体への結合に関して競
合反応が起こる。
【００１４】蛍光分子または発蛍光団に適切な波長（励
起波長）の光を照射すると、長波長（発光波長）でいく
らかの発光が見られる。発光が偏光しているか否かは、
溶液中での発蛍光団の回転自由度に依存する。フルオレ
セインなどの小さな分子は、発光前に迅速に回転し得、
これにより発光の偏光解消が生じる。これに対し、フル
オレセイン標識タンパク質などの蛍光巨大分子の回転は
ずっと遅い。したがって、巨大分子は、励起と発光の間
にごくわずかしか回転せず、発光は偏光する。蛍光偏光
は、薬剤濃度の再現可能な相関的要素であり、試料中の
薬剤濃度の定量に好適である。
起波長）の光を照射すると、長波長（発光波長）でいく
らかの発光が見られる。発光が偏光しているか否かは、
溶液中での発蛍光団の回転自由度に依存する。フルオレ
セインなどの小さな分子は、発光前に迅速に回転し得、
これにより発光の偏光解消が生じる。これに対し、フル
オレセイン標識タンパク質などの蛍光巨大分子の回転は
ずっと遅い。したがって、巨大分子は、励起と発光の間
にごくわずかしか回転せず、発光は偏光する。蛍光偏光
は、薬剤濃度の再現可能な相関的要素であり、試料中の
薬剤濃度の定量に好適である。
【００１５】本発明により意図される別の免疫測定形態
は、抗体または別の結合レセプターに結合すると阻害さ
れる電気的活性な標識の使用に基づく均一系電気化学的
免疫測定法である。好ましい電気的活性標識は、ビピリ
ジルオスミウム複合体などの可逆的酸化還元標識であ
る。シグナルの増幅は、酸化還元酵素やインターデジタ
ル・アレイ（interdigitated array）（ＩＤＡ）電極を
用い、これらのメディエーターを生体電気触媒的に（bi
oelectrocatalytically ）に酸化還元サイクルを行うこ
とにより達成しうる。均一系アッセイに使用する形態
は、逐次的結合阻害である。アッセイ対象の試料は、抗
体または他の結合レセプターと混合される。抗原が存在
する場合、結合が生じる。未結合の抗体／結合レセプタ
ーが残っていれば、それを電気的活性標識で標識した抗
原と混合する。次いで、電気的活性化合物で標識された
未結合の抗原を電極表面で測定する。
は、抗体または別の結合レセプターに結合すると阻害さ
れる電気的活性な標識の使用に基づく均一系電気化学的
免疫測定法である。好ましい電気的活性標識は、ビピリ
ジルオスミウム複合体などの可逆的酸化還元標識であ
る。シグナルの増幅は、酸化還元酵素やインターデジタ
ル・アレイ（interdigitated array）（ＩＤＡ）電極を
用い、これらのメディエーターを生体電気触媒的に（bi
oelectrocatalytically ）に酸化還元サイクルを行うこ
とにより達成しうる。均一系アッセイに使用する形態
は、逐次的結合阻害である。アッセイ対象の試料は、抗
体または他の結合レセプターと混合される。抗原が存在
する場合、結合が生じる。未結合の抗体／結合レセプタ
ーが残っていれば、それを電気的活性標識で標識した抗
原と混合する。次いで、電気的活性化合物で標識された
未結合の抗原を電極表面で測定する。
【００１６】試料中に解析物が存在しない場合、より多
量の抗体または結合レセプターが、抗原標識電気的活性
化合物と結合する。これにより、電気的活性化合物の阻
害が最大となる。試料中の解析物濃度が高いと、電気的
活性化合物の阻害はほとんどないか、あるいは全くな
い。したがって、電気化学的応答と解析物濃度との間に
は明確な関連性がある。
量の抗体または結合レセプターが、抗原標識電気的活性
化合物と結合する。これにより、電気的活性化合物の阻
害が最大となる。試料中の解析物濃度が高いと、電気的
活性化合物の阻害はほとんどないか、あるいは全くな
い。したがって、電気化学的応答と解析物濃度との間に
は明確な関連性がある。
【００１７】本発明のさらにまた別の免疫測定形態にお
いて、試料中に存在する解析物は、キャピラリー表面上
に固定された抗体の結合部位に関して、解析物−酵素コ
ンジュゲートと競合する。未結合解析物−酵素コンジュ
ゲートは検出ゾーンに向かって流れ、そこで該酵素は基
質を電気的活性産物に変換する。次いで、該産物を電極
で電気化学的に検出する。試料中の解析物濃度が高い
と、未結合のまま検出ゾーンに向かって流れる解析物−
酵素コンジュゲートが多くなる。これにより、酵素コン
ジュゲートにより生成される電気的活性産物の濃度は高
くなり、電極で検知される電流は高くなる。したがっ
て、検知される電流と解析物濃度との間には明確な関連
性がある。
いて、試料中に存在する解析物は、キャピラリー表面上
に固定された抗体の結合部位に関して、解析物−酵素コ
ンジュゲートと競合する。未結合解析物−酵素コンジュ
ゲートは検出ゾーンに向かって流れ、そこで該酵素は基
質を電気的活性産物に変換する。次いで、該産物を電極
で電気化学的に検出する。試料中の解析物濃度が高い
と、未結合のまま検出ゾーンに向かって流れる解析物−
酵素コンジュゲートが多くなる。これにより、酵素コン
ジュゲートにより生成される電気的活性産物の濃度は高
くなり、電極で検知される電流は高くなる。したがっ
て、検知される電流と解析物濃度との間には明確な関連
性がある。
【００１８】本発明の別の局面は、ＨＩＶプロテアーゼ
インヒビターの測定のために本発明のアッセイ法を簡便
に行うのに有用なキットに関する。本発明の多様性を高
めるため、本発明の方法に有用な試薬は、同じ容器また
は別個の容器内にパッケージした組み合せで、液体また
は凍結乾燥の形態で提供され、それにより該方法および
アッセイを実質的に最適化することができる。該試薬
は、その架橋反応性および安定性に応じて、それぞれ別
個の容器に入れてもよく、種々の試薬を１個以上の容器
内に合わせて入れることもできる。
インヒビターの測定のために本発明のアッセイ法を簡便
に行うのに有用なキットに関する。本発明の多様性を高
めるため、本発明の方法に有用な試薬は、同じ容器また
は別個の容器内にパッケージした組み合せで、液体また
は凍結乾燥の形態で提供され、それにより該方法および
アッセイを実質的に最適化することができる。該試薬
は、その架橋反応性および安定性に応じて、それぞれ別
個の容器に入れてもよく、種々の試薬を１個以上の容器
内に合わせて入れることもできる。
【００１９】本発明の試薬キットは、ＨＩＶプロテアー
ゼインヒビターに特異的なレセプター、およびこのイン
ヒビターのリガンドと非アイソトープ性シグナル生成部
分とを含有してなるコンジュゲートを含む。試薬は液体
のままであってもよく、凍結乾燥してもよい。このキッ
トは、本発明のアッセイを行うのに有用な較正物質およ
び対照物質をさらに含みうる。レセプターまたはコンジ
ュゲートは、固体支持体に固定されていてもよい。
ゼインヒビターに特異的なレセプター、およびこのイン
ヒビターのリガンドと非アイソトープ性シグナル生成部
分とを含有してなるコンジュゲートを含む。試薬は液体
のままであってもよく、凍結乾燥してもよい。このキッ
トは、本発明のアッセイを行うのに有用な較正物質およ
び対照物質をさらに含みうる。レセプターまたはコンジ
ュゲートは、固体支持体に固定されていてもよい。
【００２０】解析物、すなわちＨＩＶプロテアーゼイン
ヒビターまたは代謝物を適当量含有すると思われる試料
はいずれも本発明の方法により解析することができる。
試料は、典型的には、例えば尿、全血、血漿、血清、唾
液、精液、糞便、喀痰、脳脊髄液、涙、粘液などの、宿
主由来の体液などの水性溶液であるが、好ましくは血漿
または血清である。試料は、所望により前処理すること
ができ、該アッセイを妨げない簡便な任意の媒体中で調
製することができる。水性媒体が好ましい。
ヒビターまたは代謝物を適当量含有すると思われる試料
はいずれも本発明の方法により解析することができる。
試料は、典型的には、例えば尿、全血、血漿、血清、唾
液、精液、糞便、喀痰、脳脊髄液、涙、粘液などの、宿
主由来の体液などの水性溶液であるが、好ましくは血漿
または血清である。試料は、所望により前処理すること
ができ、該アッセイを妨げない簡便な任意の媒体中で調
製することができる。水性媒体が好ましい。
【００２１】抗体（または好ましくはレセプター）と
は、解析物の特異的結合パートナーを意味し、リガンド
に対し、他の物質を除外する程度の特異的結合親和性を
有する任意の物質または物質群である。
は、解析物の特異的結合パートナーを意味し、リガンド
に対し、他の物質を除外する程度の特異的結合親和性を
有する任意の物質または物質群である。
【００２２】リガンドとは、解析物に対する抗体の結合
親和性に関して、解析物と本質的に同じ挙動を示す任意
の物質または物質群を意味し、任意のＨＩＶプロテアー
ゼインヒビターもしくはその誘導体および異性体を含む
ものとする。
親和性に関して、解析物と本質的に同じ挙動を示す任意
の物質または物質群を意味し、任意のＨＩＶプロテアー
ゼインヒビターもしくはその誘導体および異性体を含む
ものとする。
【００２３】較正物質とは、既知量の測定対象解析物を
含有する任意の標準物質または参照物質を意味する。解
析物を含むと思われる試料および較正物質を同様の条件
下でアッセイする。次いで、未知試料について得られた
結果を標品について得られた結果と比較することにより
解析物濃度を算出する。これは、較正曲線や図２に示す
ような用量応答曲線を作成することによってよく用いら
れる手段である。
含有する任意の標準物質または参照物質を意味する。解
析物を含むと思われる試料および較正物質を同様の条件
下でアッセイする。次いで、未知試料について得られた
結果を標品について得られた結果と比較することにより
解析物濃度を算出する。これは、較正曲線や図２に示す
ような用量応答曲線を作成することによってよく用いら
れる手段である。
【００２４】本発明のアッセイでは、種々の補助物質を
使用することが多い。例えば、通常、アッセイ媒体には
バッファーとともにアッセイ媒体の安定化剤およびアッ
セイ成分が存在する。これらの添加剤に加えて、アルブ
ミンなどの追加のタンパク質や界面活性剤、特に非イオ
ン性界面活性剤等が含まれる場合も多い。
使用することが多い。例えば、通常、アッセイ媒体には
バッファーとともにアッセイ媒体の安定化剤およびアッ
セイ成分が存在する。これらの添加剤に加えて、アルブ
ミンなどの追加のタンパク質や界面活性剤、特に非イオ
ン性界面活性剤等が含まれる場合も多い。
【００２５】ＨＩＶプロテアーゼインヒビターに関する
明細書および特許請求の範囲における記載はいずれも、
該インヒビターに加え、生物学的な意味において該イン
ヒビターとしての挙動を示すその生物学的活性代謝物お
よび治療上活性な代謝物ならびに生物学的活性誘導体お
よび治療上活性な誘導体を含むことが意図されることを
理解されたい。
明細書および特許請求の範囲における記載はいずれも、
該インヒビターに加え、生物学的な意味において該イン
ヒビターとしての挙動を示すその生物学的活性代謝物お
よび治療上活性な代謝物ならびに生物学的活性誘導体お
よび治療上活性な誘導体を含むことが意図されることを
理解されたい。
【００２６】誘導体という用語は、１つ以上の化学反応
により親化合物または親分子から作製される化合物また
は分子をいう。
により親化合物または親分子から作製される化合物また
は分子をいう。
【００２７】本明細書に記載のように、検出用分子、標
識またはトレーサーは、非放射活性の同定タグであり、
担体物質または担体分子と結合させて解析物を検出する
のに使用しうる。標識は、連結部または架橋部により担
体分子に直接または間接的に結合しうる。標識の例とし
ては、β−ガラクトシダーゼおよびペルオキシダーゼな
どの酵素、ローダミンおよびフルオレセインイソチオシ
アネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光化合物、ならびにジオ
キセタンおよびルシフェリンなどの発光化合物が挙げら
れる。
識またはトレーサーは、非放射活性の同定タグであり、
担体物質または担体分子と結合させて解析物を検出する
のに使用しうる。標識は、連結部または架橋部により担
体分子に直接または間接的に結合しうる。標識の例とし
ては、β−ガラクトシダーゼおよびペルオキシダーゼな
どの酵素、ローダミンおよびフルオレセインイソチオシ
アネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光化合物、ならびにジオ
キセタンおよびルシフェリンなどの発光化合物が挙げら
れる。
【００２８】
【実施例】実施例１ ２−［３（Ｓ）−［（Ｌ−アスパラギニル）アミノ］−
２（Ｒ）−ヒドロキシ−４−フェニルブチル］−Ｎ−ｔ
ｅｒｔ−ブチル−デカヒドロ−（４ａＳ，８ａＳ）−イ
ソキノリン−３（Ｓ）−カルボキサミド（ＩＩ）の調製 ５４８ｍｇのシス−２−［３（Ｓ）−［［Ｎ−（ベンジ
ルオキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギニル］アミノ］
−２（Ｒ）−ヒドロキシ−４−フェニルブチル］−Ｎ−
ｔｅｒｔ−ブチル−デカヒドロ−（４ａＳ，８ａＳ）−
イソキノリン−３（Ｓ）−カルボキサミド（Ｉ、米国特
許第５，１９６，４３８号明細書）を含有する５０ｍｌ
のメタノール溶液を含むフラスコに、５８ｍｇの１０％
パラジウム／カーボンを加えた。フラスコおよび内容物
を水素雰囲気下に置き（パージ／排気サイクル５回）、
次いで、内容物を攪拌下、水素圧１〜２気圧、室温で一
晩放置した。薄層クロマトグラフィー解析（シリカゲル
プレート、１０％メタノール／クロロホルムで溶出）の
後、ヨウ素チャンバにてプレートの染色を行うと、出発
物質の消失が示され、より極性の高い新たなスポットが
現れた。反応物をセライトパッドで濾過し、メタノール
で洗浄した。濾液を回収し、減圧下で液体を蒸発させ
た。残渣を少量のメタノールに再度溶解し、濾過（０．
２μ、Gelman Acrodisc ）し、蒸発乾固した。残渣を蒸
留塩化メチレンに再度溶解させ、再度液体を蒸発させ
（反復５回）、残渣を高真空下で２日間乾燥させ、白色
／オフホワイト固体の生成物（ＩＩ）４５１ｍｇを得
た。1 Ｈ−ＮＭＲ：一致。ＦＡＢ（＋）ＭＳ：５１６
（Ｍ＋Ｈ）。
２（Ｒ）−ヒドロキシ−４−フェニルブチル］−Ｎ−ｔ
ｅｒｔ−ブチル−デカヒドロ−（４ａＳ，８ａＳ）−イ
ソキノリン−３（Ｓ）−カルボキサミド（ＩＩ）の調製 ５４８ｍｇのシス−２−［３（Ｓ）−［［Ｎ−（ベンジ
ルオキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギニル］アミノ］
−２（Ｒ）−ヒドロキシ−４−フェニルブチル］−Ｎ−
ｔｅｒｔ−ブチル−デカヒドロ−（４ａＳ，８ａＳ）−
イソキノリン−３（Ｓ）−カルボキサミド（Ｉ、米国特
許第５，１９６，４３８号明細書）を含有する５０ｍｌ
のメタノール溶液を含むフラスコに、５８ｍｇの１０％
パラジウム／カーボンを加えた。フラスコおよび内容物
を水素雰囲気下に置き（パージ／排気サイクル５回）、
次いで、内容物を攪拌下、水素圧１〜２気圧、室温で一
晩放置した。薄層クロマトグラフィー解析（シリカゲル
プレート、１０％メタノール／クロロホルムで溶出）の
後、ヨウ素チャンバにてプレートの染色を行うと、出発
物質の消失が示され、より極性の高い新たなスポットが
現れた。反応物をセライトパッドで濾過し、メタノール
で洗浄した。濾液を回収し、減圧下で液体を蒸発させ
た。残渣を少量のメタノールに再度溶解し、濾過（０．
２μ、Gelman Acrodisc ）し、蒸発乾固した。残渣を蒸
留塩化メチレンに再度溶解させ、再度液体を蒸発させ
（反復５回）、残渣を高真空下で２日間乾燥させ、白色
／オフホワイト固体の生成物（ＩＩ）４５１ｍｇを得
た。1 Ｈ−ＮＭＲ：一致。ＦＡＢ（＋）ＭＳ：５１６
（Ｍ＋Ｈ）。
【００２９】実施例２ シス−４−｛１（Ｓ）−［１（Ｓ）−ベンジル−３−
［３（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル−デカヒド
ロ−（４ａＳ，８ａＳ）−イソキノリン−２−イル］−
２（Ｒ）−ヒドロキシ−プロピルカルバモイル］−２−
カルバモイル−エチルカルバモイル｝−酪酸２，５−ジ
オキソ−ピロリジン−１−イルエステル（ＩＶ）の調製 アルゴン雰囲気下、氷水浴中で冷却した、５０ｍｇの生
成物（ＩＩ）を含有する１０ｍｌの乾燥塩化メチレン
（アルゴン雰囲気下、水素化カルシウムで蒸留）の攪拌
溶液に、２４ｍｇ（１モル当量）の５−［（２，５−ジ
オキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−５−オキソ−ペ
ンタノイルクロリド（ＩＩＩ、欧州特許出願第ＥＰ ５
０３４５４号および米国特許第５，２４８，６１１号明
細書の記載と同様にして調製）を固体で一度に添加し
た。冷却しながら反応物を２時間攪拌した。薄層クロマ
トグラフィー解析（シリカゲルプレート、１０％メタノ
ール／塩化メチレンで溶出）により、反応の完結が示さ
れた。反応物を塩化メチレンで希釈し、０．１Ｎ塩酸水
溶液中に注入し、１０％炭酸ナトリウムでｐＨを約５に
調整した。混合液を充分に振盪し、相分離させた。水相
をさらに１０％炭酸ナトリウムでｐＨ約７まで塩基性化
し、塩化メチレンで再度抽出した。有機性抽出物を合わ
せ、水（１回）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３
回）、飽和塩化ナトリウム水溶液（１回）で洗浄し、硫
酸ナトリウムでの乾燥、濾過および液体の蒸発を行っ
た。ゲル様残渣を高真空下、室温で数時間乾燥し、白色
固体および一部塩化メチレンとの溶媒和物として生成物
（ＩＶ）５７ｍｇを得た。1 Ｈ−ＮＭＲ：一致。ＦＡＢ
（＋）ＭＳ：７２７（Ｍ＋Ｈ）。ＨＲ（＋）ＦＡＢ Ｍ
Ｓ：計算（Ｍ＋Ｈ）値７２７．４０３１、測定値７２
７．４０１３。
［３（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル−デカヒド
ロ−（４ａＳ，８ａＳ）−イソキノリン−２−イル］−
２（Ｒ）−ヒドロキシ−プロピルカルバモイル］−２−
カルバモイル−エチルカルバモイル｝−酪酸２，５−ジ
オキソ−ピロリジン−１−イルエステル（ＩＶ）の調製 アルゴン雰囲気下、氷水浴中で冷却した、５０ｍｇの生
成物（ＩＩ）を含有する１０ｍｌの乾燥塩化メチレン
（アルゴン雰囲気下、水素化カルシウムで蒸留）の攪拌
溶液に、２４ｍｇ（１モル当量）の５−［（２，５−ジ
オキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−５−オキソ−ペ
ンタノイルクロリド（ＩＩＩ、欧州特許出願第ＥＰ ５
０３４５４号および米国特許第５，２４８，６１１号明
細書の記載と同様にして調製）を固体で一度に添加し
た。冷却しながら反応物を２時間攪拌した。薄層クロマ
トグラフィー解析（シリカゲルプレート、１０％メタノ
ール／塩化メチレンで溶出）により、反応の完結が示さ
れた。反応物を塩化メチレンで希釈し、０．１Ｎ塩酸水
溶液中に注入し、１０％炭酸ナトリウムでｐＨを約５に
調整した。混合液を充分に振盪し、相分離させた。水相
をさらに１０％炭酸ナトリウムでｐＨ約７まで塩基性化
し、塩化メチレンで再度抽出した。有機性抽出物を合わ
せ、水（１回）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３
回）、飽和塩化ナトリウム水溶液（１回）で洗浄し、硫
酸ナトリウムでの乾燥、濾過および液体の蒸発を行っ
た。ゲル様残渣を高真空下、室温で数時間乾燥し、白色
固体および一部塩化メチレンとの溶媒和物として生成物
（ＩＶ）５７ｍｇを得た。1 Ｈ−ＮＭＲ：一致。ＦＡＢ
（＋）ＭＳ：７２７（Ｍ＋Ｈ）。ＨＲ（＋）ＦＡＢ Ｍ
Ｓ：計算（Ｍ＋Ｈ）値７２７．４０３１、測定値７２
７．４０１３。
【００３０】実施例３ ［シス−１−オキソ−４−｛１（Ｓ）−［１（Ｓ）−ベ
ンジル−３−［３（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイ
ル−デカヒドロ−（４ａＳ，８ａＳ）−イソキノリン−
２−イル］−２（Ｒ）−ヒドロキシ−プロピルカルバモ
イル］−２−カルバモイル−エチルカルバモイル｝−ブ
チル］−ＢＳＡ（Ｖ）の調製 氷水浴中で冷却した、３８０ｍｇのウシ血清アルブミン
（Miles-Pentex, Fraction V）を含有する７．６ｍｌの
５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）、ｐＨ７．５の攪拌
溶液に、１．９ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）を５〜１０分かけて滴下した。得られた透明な溶液
のうち１ｍｌを取り出し、ＢＳＡを対照とした。約３４
０ｍｇのＢＳＡを含有する２０％ＤＭＳＯ／５０ｍＭ
ＫＰｉ（ｐＨ７．５）からなる残りの溶液に、全量約
１．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解した７．８ｍｇ（約２．１
モル当量）の生成物（ＩＶ）を添加し、生成物（ＩＶ）
と、ＢＳＡを含有する３２％ＤＭＳＯ／５０ｍＭ ＫＰ
ｉ、ｐＨ７．５とを反応させた。反応物を一晩攪拌し、
温度を室温にした。得られた溶液を３〜１５ｍｌ容透析
カセット（Pierce Chemical Co., Slide-A-Lyzer（登録
商標）、分子量１０Ｋカットオフ）に移し、順に３０
％、２０％、１０％のＤＭＳＯ／５０ｍＭ ＫＰｉ、ｐ
Ｈ７．５（各１Ｌ）に対して室温でそれぞれ約２時間、
次いで５０ｍＭ ＫＰｉ、ｐＨ７．５に対して室温で一
晩、さらに５０ｍＭ ＫＰｉ、ｐＨ７．５（５回交換）
に対して３日間かけて逐次的に透析した。保持物質をカ
セットから取り出し、実質的に無色透明の溶液のコンジ
ュゲート（Ｖ）１９ｍｌを得た。ＢＳＡ対照を標準とし
て使用し、タンパク質濃度を測定すると（クーマシーブ
ルー、Bradford変法）、１８．６ｍｇ／ｍｌであった。
ンジル−３−［３（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイ
ル−デカヒドロ−（４ａＳ，８ａＳ）−イソキノリン−
２−イル］−２（Ｒ）−ヒドロキシ−プロピルカルバモ
イル］−２−カルバモイル−エチルカルバモイル｝−ブ
チル］−ＢＳＡ（Ｖ）の調製 氷水浴中で冷却した、３８０ｍｇのウシ血清アルブミン
（Miles-Pentex, Fraction V）を含有する７．６ｍｌの
５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）、ｐＨ７．５の攪拌
溶液に、１．９ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）を５〜１０分かけて滴下した。得られた透明な溶液
のうち１ｍｌを取り出し、ＢＳＡを対照とした。約３４
０ｍｇのＢＳＡを含有する２０％ＤＭＳＯ／５０ｍＭ
ＫＰｉ（ｐＨ７．５）からなる残りの溶液に、全量約
１．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解した７．８ｍｇ（約２．１
モル当量）の生成物（ＩＶ）を添加し、生成物（ＩＶ）
と、ＢＳＡを含有する３２％ＤＭＳＯ／５０ｍＭ ＫＰ
ｉ、ｐＨ７．５とを反応させた。反応物を一晩攪拌し、
温度を室温にした。得られた溶液を３〜１５ｍｌ容透析
カセット（Pierce Chemical Co., Slide-A-Lyzer（登録
商標）、分子量１０Ｋカットオフ）に移し、順に３０
％、２０％、１０％のＤＭＳＯ／５０ｍＭ ＫＰｉ、ｐ
Ｈ７．５（各１Ｌ）に対して室温でそれぞれ約２時間、
次いで５０ｍＭ ＫＰｉ、ｐＨ７．５に対して室温で一
晩、さらに５０ｍＭ ＫＰｉ、ｐＨ７．５（５回交換）
に対して３日間かけて逐次的に透析した。保持物質をカ
セットから取り出し、実質的に無色透明の溶液のコンジ
ュゲート（Ｖ）１９ｍｌを得た。ＢＳＡ対照を標準とし
て使用し、タンパク質濃度を測定すると（クーマシーブ
ルー、Bradford変法）、１８．６ｍｇ／ｍｌであった。
【００３１】実施例４ 抗血清およびサキナビル−ＢＳＡコンジュゲート濃度範
囲 本実験ではCorning マイクロＥＬＩＳＡプレート（９６
穴）を使用した。サキナビル−ＢＳＡコンジュゲートを
０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ９．５中で２
μｇ／ｍｌに希釈した。１００μｌのバッファーを、プ
レートの第１列以外の各列のウェルに入れた。第１列に
は、２００μｌの２μｇ／ｍｌサキナビル／ＢＳＡ溶液
を入れ、１２チップマイクロピペッターを用いて第１列
から１００μｌを全てのカラムの第２列に同時に移し
た。ピペッティングを３回繰り返すことにより第２列の
内容物を混合した。第２列から１００μｌを第３列に移
し、混合した。この操作をプレートの最終列まで繰り返
した。混合後、最終列から１００μｌを取り出し、廃棄
した。プレートを加湿したＺｉｐ−Ｌｏｃ袋に入れ、１
時間３７℃でインキュベートした。
囲 本実験ではCorning マイクロＥＬＩＳＡプレート（９６
穴）を使用した。サキナビル−ＢＳＡコンジュゲートを
０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ９．５中で２
μｇ／ｍｌに希釈した。１００μｌのバッファーを、プ
レートの第１列以外の各列のウェルに入れた。第１列に
は、２００μｌの２μｇ／ｍｌサキナビル／ＢＳＡ溶液
を入れ、１２チップマイクロピペッターを用いて第１列
から１００μｌを全てのカラムの第２列に同時に移し
た。ピペッティングを３回繰り返すことにより第２列の
内容物を混合した。第２列から１００μｌを第３列に移
し、混合した。この操作をプレートの最終列まで繰り返
した。混合後、最終列から１００μｌを取り出し、廃棄
した。プレートを加湿したＺｉｐ−Ｌｏｃ袋に入れ、１
時間３７℃でインキュベートした。
【００３２】インキュベーション後、インキュベーター
と袋からプレートを取り出し、空にして廃棄用容器に入
れた。２００μｌのＰｏｓｔＣｏａｔ溶液を各ウェルに
加えた。この溶液は、１％ゼラチン水解物、２％スクロ
ース、０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．１７
％Ｔｗｅｅｎ ２０および０．０２％チメロサール保存
料から構成され、すべての試薬はSigma Chemicals 社製
である。プレートを加湿した袋に戻し、インキュベータ
ー内に１時間放置した。
と袋からプレートを取り出し、空にして廃棄用容器に入
れた。２００μｌのＰｏｓｔＣｏａｔ溶液を各ウェルに
加えた。この溶液は、１％ゼラチン水解物、２％スクロ
ース、０．１５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．１７
％Ｔｗｅｅｎ ２０および０．０２％チメロサール保存
料から構成され、すべての試薬はSigma Chemicals 社製
である。プレートを加湿した袋に戻し、インキュベータ
ー内に１時間放置した。
【００３３】インキュベーションの間、サキナビル抗血
清希釈液（H.R. Wiltshire、Anal.Biochem. 281, 105-1
14, 2000 参照のこと）を以下のようにして調製した。
血清バイアルを温水中で解凍し、２μｌの１０％チメロ
サールを保存料として添加した。これを気泡が生じない
ように静かに混合した。Falconフレキシブルマイクロタ
イタープレートを用い、１１０μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅ
ｎ（０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝生理食塩
水）を第１列のウェル以外の各ウェルに添加することに
より血清希釈物を調製した。第１列のウェルには１１０
μｌの希釈度１：１００の血清含有ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ
を添加した。第２列には、８口マイクロピペッター（8
place micropipettor ）を用いて１００μｌの希釈度
１：１００の血清含有ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを添加し、ピ
ペッティングを３回繰り返すことにより混合した。次い
で、第２列から１１０μｌを第３列に移し、混合を繰り
返した。この操作をプレートの各列について繰り返し
た。
清希釈液（H.R. Wiltshire、Anal.Biochem. 281, 105-1
14, 2000 参照のこと）を以下のようにして調製した。
血清バイアルを温水中で解凍し、２μｌの１０％チメロ
サールを保存料として添加した。これを気泡が生じない
ように静かに混合した。Falconフレキシブルマイクロタ
イタープレートを用い、１１０μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅ
ｎ（０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸緩衝生理食塩
水）を第１列のウェル以外の各ウェルに添加することに
より血清希釈物を調製した。第１列のウェルには１１０
μｌの希釈度１：１００の血清含有ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ
を添加した。第２列には、８口マイクロピペッター（8
place micropipettor ）を用いて１００μｌの希釈度
１：１００の血清含有ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを添加し、ピ
ペッティングを３回繰り返すことにより混合した。次い
で、第２列から１１０μｌを第３列に移し、混合を繰り
返した。この操作をプレートの各列について繰り返し
た。
【００３４】コートしたプレートのインキュベーション
終了後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、最後に吸引する
ことによりコートしたプレートを空にした。８口マイク
ロピペッターを用い、希釈プレートの第１２カラムから
１００μｌをコートしたプレートの第１２カラムに移し
た。次いで、第１１カラムから１００μｌを移した（以
下同様）。希釈抗体を移し終えた後、コートしたプレー
トを再度袋に入れて３７℃で１時間インキュベートし
た。
終了後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、最後に吸引する
ことによりコートしたプレートを空にした。８口マイク
ロピペッターを用い、希釈プレートの第１２カラムから
１００μｌをコートしたプレートの第１２カラムに移し
た。次いで、第１１カラムから１００μｌを移した（以
下同様）。希釈抗体を移し終えた後、コートしたプレー
トを再度袋に入れて３７℃で１時間インキュベートし
た。
【００３５】インキュベーション完了の５分前に、Zyme
d ウサギ抗ヒツジＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートをＰＢ
Ｓ／Ｔｗｅｅｎ中で１：２０００に希釈し、静かに攪拌
して充分に混合した。インキュベーション時間終了時、
Bio Tek Instruments, Inc.社製 EL 404 プレート洗浄
器を用い３００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎでプレートを
４回洗浄した。次いで、１００μｌの希釈ウサギ抗ヒツ
ジＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートを各ウェルにピペッテ
ィングし、プレートを再度袋に入れて１時間インキュベ
ートした。
d ウサギ抗ヒツジＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートをＰＢ
Ｓ／Ｔｗｅｅｎ中で１：２０００に希釈し、静かに攪拌
して充分に混合した。インキュベーション時間終了時、
Bio Tek Instruments, Inc.社製 EL 404 プレート洗浄
器を用い３００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎでプレートを
４回洗浄した。次いで、１００μｌの希釈ウサギ抗ヒツ
ジＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートを各ウェルにピペッテ
ィングし、プレートを再度袋に入れて１時間インキュベ
ートした。
【００３６】１時間後、プレートをインキュベーターと
袋から取り出し、プレート洗浄器で６回洗浄した。次い
で、１００μｌのＫ−ＢＬＵＥ酵素基質（Neogen, In
c.）を各ウェルに添加し、暗所で５分間、発色させた。
１００μｌの１Ｎ塩酸を各ウェルに添加することにより
発色を止めた。Molecular Devices, Inc, 社製 ThermoM
axプレートリーダーを用い、各ウェルの光学密度を２つ
の波長、４０５ｎｍおよび４５０ｎｍで測定した。４５
０ｎｍでの目盛りにより、このリーダーの測定能は、高
濃度のコンジュゲートおよび抗血清では目盛りが振り切
れた（exceed）。したがって、ＯＤ405 測定値を用い、
両波長での目盛りの線形最小二乗法回帰を用いる周知の
方法により外挿ＯＤ450 を算出した。
袋から取り出し、プレート洗浄器で６回洗浄した。次い
で、１００μｌのＫ−ＢＬＵＥ酵素基質（Neogen, In
c.）を各ウェルに添加し、暗所で５分間、発色させた。
１００μｌの１Ｎ塩酸を各ウェルに添加することにより
発色を止めた。Molecular Devices, Inc, 社製 ThermoM
axプレートリーダーを用い、各ウェルの光学密度を２つ
の波長、４０５ｎｍおよび４５０ｎｍで測定した。４５
０ｎｍでの目盛りにより、このリーダーの測定能は、高
濃度のコンジュゲートおよび抗血清では目盛りが振り切
れた（exceed）。したがって、ＯＤ405 測定値を用い、
両波長での目盛りの線形最小二乗法回帰を用いる周知の
方法により外挿ＯＤ450 を算出した。
【００３７】各希釈度の抗血清について、光学密度を各
サキナビル／ＢＳＡ濃度に対して、それぞれＹ軸、Ｘ軸
にプロットすることにより得られたデータを解析した。
これにより、１２個の曲線が得られた。次に、光学密度
対血清希釈度を各サキナビル／ＢＳＡ濃度に対してプロ
ットし、８つの曲線を含むグラフを得た。後者のグラフ
により、サキナビル／ＢＳＡは、１：１０００以下の抗
サキナビル血清希釈物と併用した場合、０．１２５μｇ
／ｍｌ以下の濃度で顕著なプロゾーン効果を示すことが
わかった。これらの２つのグラフから、６２．５ｎｇ／
ｍｌのコンジュゲートおよび１：１２，８００希釈度の
抗血清を併用することにした。
サキナビル／ＢＳＡ濃度に対して、それぞれＹ軸、Ｘ軸
にプロットすることにより得られたデータを解析した。
これにより、１２個の曲線が得られた。次に、光学密度
対血清希釈度を各サキナビル／ＢＳＡ濃度に対してプロ
ットし、８つの曲線を含むグラフを得た。後者のグラフ
により、サキナビル／ＢＳＡは、１：１０００以下の抗
サキナビル血清希釈物と併用した場合、０．１２５μｇ
／ｍｌ以下の濃度で顕著なプロゾーン効果を示すことが
わかった。これらの２つのグラフから、６２．５ｎｇ／
ｍｌのコンジュゲートおよび１：１２，８００希釈度の
抗血清を併用することにした。
【００３８】実施例５ アッセイ特異性の測定 上記と同じ条件下で、ＥＬＩＳＡプレートを上記濃度の
サキナビル−ＢＳＡでコートした。プレートをポストコ
ート（ＰｏｓｔＣｏａｔ）溶液でコートしている間に、
１ｍｌ容９６穴プレート中でサキナビル、リトナビル、
インジナビルおよびネルフィナビルの段階３倍希釈物を
調製した。すべての薬剤は、絶対メタノールで１ｍｇ／
ｍｌとし、使用時まで４℃で保存した。簡単には、まず
各薬剤１μｌをプレートの第１列のウェルに移した。な
お、第１列の各ウェルは５００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅ
ｎを含み、他の列のウェルはすべて２００μｌの同バッ
ファーを含んだ。混合後、４つのカラムのそれぞれの第
１列から１００μｌを第２列に移し、混合した。この操
作を、各列について第７列が完了するまで繰り返した。
第８列はバッファーのみを含み、各薬剤のゼロ濃度とし
た。
サキナビル−ＢＳＡでコートした。プレートをポストコ
ート（ＰｏｓｔＣｏａｔ）溶液でコートしている間に、
１ｍｌ容９６穴プレート中でサキナビル、リトナビル、
インジナビルおよびネルフィナビルの段階３倍希釈物を
調製した。すべての薬剤は、絶対メタノールで１ｍｇ／
ｍｌとし、使用時まで４℃で保存した。簡単には、まず
各薬剤１μｌをプレートの第１列のウェルに移した。な
お、第１列の各ウェルは５００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅ
ｎを含み、他の列のウェルはすべて２００μｌの同バッ
ファーを含んだ。混合後、４つのカラムのそれぞれの第
１列から１００μｌを第２列に移し、混合した。この操
作を、各列について第７列が完了するまで繰り返した。
第８列はバッファーのみを含み、各薬剤のゼロ濃度とし
た。
【００３９】ポストコートインキュベーションの終了
時、コートしたプレートを洗浄し、５０μｌの溶液を希
釈プレートのＨ列からコートしたプレートのＨ列に移
し、この操作を４チップマイクロピペッターを用いてＧ
列からＡ列まで繰り返した。この操作の終了後、ＰＢＳ
／Ｔｗｅｅｎで１：１２，８００に希釈した５０μｌの
サキナビル抗血清を、コートしたプレートの各ウェルに
添加した。プレートを上述のようにしてインキュベート
した。１時間後、プレートを４回洗浄し、ＰＢＳ／Ｔｗ
ｅｅｎで１：２，０００に希釈した１００μｌのZymed
ウサギ抗ヒツジＩｇＧ／ＨＲＰを添加し、上述のように
してインキュベートした。さらにプレートを上述のよう
にして処理した。４５０ｎｍでの光学密度の読み取りに
より、サキナビルでは用量応答曲線が得られ、ネルフィ
ナビルでは応答が少なく、その他の薬剤では用量応答曲
線は観察されなかった。これらのデータから、ネルフィ
ナビルと交差反応した抗血清は０．４％程度と算出され
た。
時、コートしたプレートを洗浄し、５０μｌの溶液を希
釈プレートのＨ列からコートしたプレートのＨ列に移
し、この操作を４チップマイクロピペッターを用いてＧ
列からＡ列まで繰り返した。この操作の終了後、ＰＢＳ
／Ｔｗｅｅｎで１：１２，８００に希釈した５０μｌの
サキナビル抗血清を、コートしたプレートの各ウェルに
添加した。プレートを上述のようにしてインキュベート
した。１時間後、プレートを４回洗浄し、ＰＢＳ／Ｔｗ
ｅｅｎで１：２，０００に希釈した１００μｌのZymed
ウサギ抗ヒツジＩｇＧ／ＨＲＰを添加し、上述のように
してインキュベートした。さらにプレートを上述のよう
にして処理した。４５０ｎｍでの光学密度の読み取りに
より、サキナビルでは用量応答曲線が得られ、ネルフィ
ナビルでは応答が少なく、その他の薬剤では用量応答曲
線は観察されなかった。これらのデータから、ネルフィ
ナビルと交差反応した抗血清は０．４％程度と算出され
た。
【００４０】実施例６ 血清環境でのアッセイ性能 本実施例は、いくつかの変更を行った以外は実施例５と
同様にして行う。評価した薬剤はサキナビルであり、薬
剤の希釈剤は、１００％正常ヒト血清とした。したがっ
て、最後のアッセイは、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで希釈した
抗血清を半量（容積比）を加えた５０％ヒト血清におい
て行った。さらに、先の実施例で７段階の希釈を行った
ようにして、本実施例では１５段階の希釈を行った。実
施例５においてゼロ濃度でない最低濃度の薬剤ではゼロ
濃度の約５０％の阻害を示したため、完全な阻害曲線を
得るために希釈工程を増やす必要があった。すべての薬
剤濃度について３連の実験を行った。各薬剤濃度での３
つのウェルの平均およびエラーバーを用いてデータを図
式化し、図２に示す用量応答曲線を得た。グラフに示す
ように、アッセイは、１ｍｌあたり１ｎｇ未満から１μ
ｇの範囲で行った。最低検出可能レベルは０．５ｎｇ／
ｍｌと推定される。
同様にして行う。評価した薬剤はサキナビルであり、薬
剤の希釈剤は、１００％正常ヒト血清とした。したがっ
て、最後のアッセイは、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで希釈した
抗血清を半量（容積比）を加えた５０％ヒト血清におい
て行った。さらに、先の実施例で７段階の希釈を行った
ようにして、本実施例では１５段階の希釈を行った。実
施例５においてゼロ濃度でない最低濃度の薬剤ではゼロ
濃度の約５０％の阻害を示したため、完全な阻害曲線を
得るために希釈工程を増やす必要があった。すべての薬
剤濃度について３連の実験を行った。各薬剤濃度での３
つのウェルの平均およびエラーバーを用いてデータを図
式化し、図２に示す用量応答曲線を得た。グラフに示す
ように、アッセイは、１ｍｌあたり１ｎｇ未満から１μ
ｇの範囲で行った。最低検出可能レベルは０．５ｎｇ／
ｍｌと推定される。
【００４１】本実施例は、酵素結合免疫測定法によるヒ
ト血清中の薬剤量の測定における、サキナビル−ＫＬＨ
に対する抗血清の使用法を示すものである。
ト血清中の薬剤量の測定における、サキナビル−ＫＬＨ
に対する抗血清の使用法を示すものである。
【００４２】
【発明の効果】本発明によれば、高処理量の治療薬モニ
タリングに適合し、安全であり、廃棄物処理の管理を必
要としない、新規なＨＩＶプロテアーゼインヒビターの
検出のための非アイソトープ性免疫測定法および該方法
を実施するためのキットが提供される。
タリングに適合し、安全であり、廃棄物処理の管理を必
要としない、新規なＨＩＶプロテアーゼインヒビターの
検出のための非アイソトープ性免疫測定法および該方法
を実施するためのキットが提供される。
【図１】図１は、実施例１〜３に記載の［シス−１−オ
キソ−４−｛１（Ｓ）−［１（Ｓ）−ベンジル−３−
［３（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル−デカヒド
ロ−（４ａＳ，８ａＳ）−イソキノリン−２−イル］−
２（Ｒ）−ヒドロキシ−プロピルカルバモイル］−２−
カルバモイル−エチルカルバモイル｝−ブチル］−ＢＳ
Ａの合成を示す概略図である。
キソ−４−｛１（Ｓ）−［１（Ｓ）−ベンジル−３−
［３（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル−デカヒド
ロ−（４ａＳ，８ａＳ）−イソキノリン−２−イル］−
２（Ｒ）−ヒドロキシ−プロピルカルバモイル］−２−
カルバモイル−エチルカルバモイル｝−ブチル］−ＢＳ
Ａの合成を示す概略図である。
【図２】図２は、種々の濃度のサキナビルを含む試料を
本発明に従ってアッセイした実施例６において得られた
結果をプロットすることにより得られたグラフを示す図
である。Ｘ軸はサキナビルの濃度であり、Ｙ軸は４５０
ｎｍでの吸光度である。
本発明に従ってアッセイした実施例６において得られた
結果をプロットすることにより得られたグラフを示す図
である。Ｘ軸はサキナビルの濃度であり、Ｙ軸は４５０
ｎｍでの吸光度である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１１月１４日（２００１．１１．
１４）
１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ79 QR02 QR48 QS15 QS26 QS36 QX02
Claims (11)
- 【請求項１】 （ａ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビター
を含有すると思われる試料を、該インヒビターに特異的
なレセプター、ならびに該インヒビターのリガンドおよ
び非アイソトープ性シグナル生成部分を含有してなるコ
ンジュゲートと合わせる工程、（ｂ）該シグナル生成部
分により生じるシグナル生成をモニターすることによ
り、該コンジュゲートに結合した該レセプターの量を測
定する工程、ならびに（ｃ）該シグナル生成を試料中の
該インヒビターの存在または量と相関させる工程、を含
む、試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを測定す
るための免疫測定法。 - 【請求項２】 該レセプターが、抗体、抗体フラグメン
トおよび抗体誘導体からなる群より選ばれる請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】 該プロテアーゼインヒビターが、サキナ
ビル、アンプレナビル、インジナビル、ネルフィナビル
およびリトナビルからなる群より選ばれる請求項１記載
の方法。 - 【請求項４】 該レセプターが、直接または間接的に固
相に結合している請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 該シグナル生成部分が、酵素、蛍光発生
化合物、化学発光物質、電気化学的メディエーター、粒
子、レポーター基、酵素インヒビターおよびポリペプチ
ドキャリアからなる群より選ばれる請求項１記載の方
法。 - 【請求項６】 （ａ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビター
を含有すると思われる試料を、該プロテアーゼインヒビ
ターのリガンドおよびミコフェノール酸を含有するコン
ジュゲート、該プロテアーゼインヒビターに特異的なレ
セプター、ＩＭＰ、ＮＡＤならびにＩＭＰＤＨと合わせ
る工程、（ｂ）ＮＡＤＨの生成をモニターする工程、な
らびに（ｃ）ＮＡＤＨの生成を試料中の該プロテアーゼ
インヒビターの存在または量と相関させる工程、を含
む、試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを測定す
るための非アイソトープ性免疫測定法。 - 【請求項７】 （ａ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビター
に特異的なレセプター、および（ｂ）該インヒビターの
リガンドおよび非アイソトープ性シグナル生成部分を含
有してなるコンジュゲートをパッケージした組み合せで
含有する、試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを
測定するためのテストキット。 - 【請求項８】 該レセプターが、抗体、抗体フラグメン
トおよび抗体誘導体からなる群より選ばれてなる請求項
７記載のテストキット。 - 【請求項９】 該プロテアーゼインヒビターが、サキナ
ビル、アンプレナビル、インジナビル、ネルフィナビル
およびリトナビルからなる群より選ばれてなる請求項７
記載のテストキット。 - 【請求項１０】 該レセプターが、直接または間接的に
固相に結合している請求項７記載のテストキット。 - 【請求項１１】 該シグナル生成部分が、酵素、蛍光発
生化合物、化学発光物質、電気化学的メディエーター、
粒子、レポーター基、酵素インヒビターおよびポリペプ
チドキャリアからなる群より選ばれてなる請求項７記載
のテストキット。
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|---|---|---|---|
| US71252500A | 2000-11-14 | 2000-11-14 | |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP2001347898A Pending JP2002207039A (ja) | 2000-11-14 | 2001-11-13 | Ｈｉｖプロテアーゼインヒビターの免疫測定法 |
| JP2004130248A Pending JP2004294443A (ja) | 2000-11-14 | 2004-04-26 | Ｈｉｖプロテアーゼインヒビターの免疫測定法 |
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|---|---|---|---|
| JP2004130248A Pending JP2004294443A (ja) | 2000-11-14 | 2004-04-26 | Ｈｉｖプロテアーゼインヒビターの免疫測定法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP1207394B1 (ja) |
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| DE (1) | DE60140929D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012240983A (ja) * | 2011-05-23 | 2012-12-10 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | タンパク質固定化表面修飾材料 |
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|---|---|---|---|---|
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| US7193065B2 (en) | 2001-07-13 | 2007-03-20 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Protease inhibitor conjugates and antibodies useful in immunoassay |
| US20030100088A1 (en) * | 2001-07-13 | 2003-05-29 | Sigler Gerald F. | Protease inhibitor conjugates and antibodies useful in immunoassay |
| US7202092B2 (en) | 2001-07-13 | 2007-04-10 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Indinavir derivatives useful in immunoassay |
| US7157561B2 (en) * | 2001-07-13 | 2007-01-02 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Methods of inhibiting transmission of a costimulatory signal of lymphocytes |
| EP1428018B1 (en) | 2001-09-06 | 2010-06-09 | Straus Holdings Inc. | Rapid and sensitive detection of molecules |
| US6821744B2 (en) * | 2002-10-29 | 2004-11-23 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method, assay, and kit for quantifying HIV protease inhibitors |
| US20040142405A1 (en) * | 2003-01-22 | 2004-07-22 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Method of detecting drug resistance |
| EP1700122A4 (en) * | 2003-12-19 | 2008-05-21 | Ark Diagnostics Inc | IMMUNOASSAYS, HAPTENE, IMMUNOGENES AND ANTIBODIES FOR ANTI-HIV THERAPEUTICS |
| US7276362B2 (en) | 2004-01-30 | 2007-10-02 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Recombinant histidine-tagged inosine monophosphate dehydrogenase polypeptides |
| US6992177B1 (en) | 2004-12-10 | 2006-01-31 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Saquinavir derivatives useful in immunoassay |
| EP1937829A4 (en) | 2005-09-26 | 2011-08-03 | Rapid Micro Biosystems Inc | CASSETTE CONTAINING A GROWTH MEDIUM |
| CN102224260B (zh) | 2008-09-24 | 2015-11-25 | 施特劳斯控股公司 | 用于检测分析物的试剂盒和装置 |
| US10295539B2 (en) * | 2010-04-19 | 2019-05-21 | Meso Scale Technologies, Llc. | Serology assays |
| HUE036509T2 (hu) | 2011-11-07 | 2018-07-30 | Rapid Micro Biosystems Inc | Kazetta sterilitási vizsgálathoz |
| US10407707B2 (en) | 2012-04-16 | 2019-09-10 | Rapid Micro Biosystems, Inc. | Cell culturing device |
| WO2019204784A1 (en) | 2018-04-19 | 2019-10-24 | First Light Biosciences, Inc. | Detection of targets |
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|---|---|---|---|---|
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| US5248611A (en) * | 1987-05-28 | 1993-09-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | Stereoisomer separation method using antibody combing site-containing molecules |
| GB9326238D0 (en) * | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Sinvent As | Method of assay |
| WO1995029395A1 (en) * | 1994-04-26 | 1995-11-02 | The Regents Of University Of Michigan | Unitary sandwich enzyme immunoassay cassette, device and method of use |
| US6773878B1 (en) * | 1999-11-09 | 2004-08-10 | Eos Biotechnology, Inc. | Methods of diagnosing of colorectal cancer, compositions, and methods of screening for colorectal cancer modulators |
| US6107052A (en) * | 1999-06-09 | 2000-08-22 | Roche Diagnostics Corporation | Enzymatic measurement of mycophenolic acid |
| US6524808B1 (en) * | 1999-06-25 | 2003-02-25 | Roche Diagnostics Corporation | Enzyme inhibition immunoassay |
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-
2001
- 2001-11-10 EP EP01126829A patent/EP1207394B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-10 DE DE60140929T patent/DE60140929D1/de not_active Expired - Lifetime
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-
2003
- 2003-03-07 US US10/314,642 patent/US20060040257A9/en not_active Abandoned
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- 2004-04-26 JP JP2004130248A patent/JP2004294443A/ja active Pending
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2006
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-
2007
- 2007-02-09 US US11/673,031 patent/US20070148684A1/en not_active Abandoned
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