CN110719916B - 抗-trkb抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的激动性抗TrkB抗体和使用该激动性抗TrkB抗体的治疗方法和诊断方法以及组合物。

Description

抗-TRKB抗体
技术领域
本发明大体上涉及用于诊断及治疗用途的激动性抗-TrkB抗体，且尤其涉及人源化激动性抗-TrkB抗体。更具体地，公开了用于治疗各种疾病或病症的激动性抗-TrkB抗体及使用方法。还公开包含激动性抗-TrkB抗体的药物组合物和套盒。
背景技术
原肌球蛋白受体激酶B(TrkB)也称为酪氨酸受体激酶B或BDNF/NT-3生长因子受体或2型神经营养酪氨酸激酶受体，是在人体内由NTRK2基因(Genbank ID：4915)编码的蛋白质。TrkB是脑衍生的神经营养因子(BDNF)的受体。
神经营养酪氨酸激酶受体B(TrkB；基因符号：NTRK2)由视网膜神经元及神经胶质细胞表达。在正常视网膜中，TrkB信号传导抵抗细胞应力且促进细胞存活。在患病眼睛中，诸如在糖尿病性视网膜病变或地图状萎缩中，出现引起视觉损伤及视觉损失的视网膜神经元及神经胶质细胞的损失及功能损伤。活化TrkB信号传导高于基础水准(其在糖尿病性视网膜病变中降低)可抵消神经元及神经胶质细胞的损失及功能损伤，因此改良视觉功能。此外，TrkB活化具有使患病眼睛中的损失的突触连接再生的潜能，由此促进视觉功能恢复。配体结合时，TrkB依序经历均二聚化、自体磷酸化。视磷酸化位点(Y516、Y702、Y706、Y707或Y817)而定，活化不同信号转导通路，包括调节不同的重叠信号传导级联从而诱导轴突/神经突长出、增加突触可塑性或增加细胞存活的PLCγ1或AKT及ERK的不同亚型的活性。
US20100196390及US20100150914中描述激动性抗-TrkB抗体以及其在治疗例如恰克-马利-杜斯氏症(Charcot-Marie-Tooth disease)或糖尿病中的提议用途。
然而，仍明显需要可用于活化TrkB通路且由此使其用于例如神经退行性及精神病症的治疗性干预中的新颖的有效激动性抗-TrkB抗体。
发明内容
本发明提供特异性结合至人类TrkB的单克隆抗体。在一个方面中，本发明的抗体具有激动性活性且诱导TrkB磷酸化和/或活化。在另一方面中，本发明抗体适用于例如治疗眼睛或视网膜疾病，诸如继发于年龄相关性黄斑变性的地图状萎缩、糖尿病性视网膜病变、青光眼和/或糖尿病性黄斑水肿。
在另一方面中，本发明提供一种具有下文中所述特性中的一个或多个的抗-TrkB抗体，尤其人源化抗-TrkB抗体。
在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体以高亲和力结合至人类TrkB。在一与此方面相关的实施方案中，本发明的抗-TrkB抗体结合至人类TrkB的KD<10nM。在另一实施方案中，本发明的抗-TrkB抗体结合至人类TrkB的KD<5nM。
在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体以高效力活化TrkB。在一与此方面相关的实施方案中，本发明的抗-TrkB抗体活化人类TrkB的EC50<100pM。在另一实施方案中，本发明的抗-TrkB抗体活化人类TrkB的EC50<50pm。
在另一方面中，与天然TrkB配体BDNF相比，本发明的抗-TrkB抗体更有效诱导TrkB下游信号传导通路的活化。在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体经由TrkB介导的信号传导通路以与BDNF相当的模式调节基因表达。
在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体结合人类TrkB的细胞外域中的新的表位。在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体不与来自其他物种的TrkB交叉反应，尤其不与啮齿动物TrkB交叉反应。
在一个方面中，本发明的抗-TrkB抗体可配制至高浓度以用于玻璃体内注射至眼睛中。
在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体具有低免疫原性风险，如通过实例5中所述的方法所测量。
在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体的CDR序列具有低序列可靠性，如通过实例4中所述的方法所测量。
在又一方面中，本发明的抗-TrkB抗体不减少BDNF诱导的ERK磷酸化。
在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体对TrkB磷酸化和/或活化具有特异性且不会非特异性磷酸化/活化TrkA或TrkC。在另一方面中，抗-TrkB抗体不会非特异性地结合至人类VEGF。
其他方面涵盖编码本发明抗体的多核苷酸分子、包含此类多核苷酸分子的表达载体及病毒载体以及宿主细胞，及制造本发明抗体的方法。本发明进一步提供用于本发明抗体的治疗性用途，尤其视网膜/眼睛疾病。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:49的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:50的氨基酸序列(L-CDR3)的轻链可变区；及
包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:52的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:53的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，或
包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:56的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:57的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区，或
包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:59的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:60的氨基酸序列(H-CDR3)的重链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，其包含：
分别包含SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:12的氨基酸序列的可变轻链及可变重链，
分别包含SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变轻链及可变重链，
分别包含SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变轻链及可变重链，
分别包含SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变轻链及可变重链，
分别包含SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:16的氨基酸序列的可变轻链及可变重链，
分别包含SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:17的氨基酸序列的可变轻链及可变重链，
分别包含SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:18的氨基酸序列的可变轻链及可变重链，
分别包含SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:19的氨基酸序列的可变轻链及可变重链，或
分别包含SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:20的氨基酸序列的可变轻链及可变重链。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:22或23的氨基酸序列的重链，
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列的重链，
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:28或29的氨基酸序列的重链，
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:31或32的氨基酸序列的重链，
包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:34或35的氨基酸序列的重链，
包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:37或38的氨基酸序列的重链，
包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:40或41的氨基酸序列的重链，
包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:43或44的氨基酸序列的重链，或
包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:46或47的氨基酸序列的重链。
在一尤其优选实施方案中，抗-TrkB抗体是人源化抗-TrkB抗体。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于药物的抗-TrkB抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗视网膜或眼睛疾病的抗-TrkB抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗神经/神经元眼睛或视网膜疾病的抗-TrkB抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗地图状萎缩的抗-TrkB抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗年龄相关性黄斑变性或糖尿病性视网膜病变的抗-TrkB抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含抗-TrkB抗体或其抗原结合片段及药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段或包含抗-TrkB抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中该抗体或其抗原结合片段通过胃肠外途径、静脉内途径、玻璃体内途径或皮下施用途径施用。
在一个实施方案中，本发明提供一种或多种分离的多核苷酸，其包含编码抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区及抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种表达载体，其包含编码抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区及抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的一个或多个分离的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供一种病毒载体，其包含编码抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区及抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的一个或多个分离的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含表达载体或编码抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区及抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的一个或多个分离的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于产生抗-TrkB抗体或其抗原结合片段的方法，其包含：
获得包含表达载体或编码抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区及抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的一个或多个分离的多核苷酸的宿主细胞；及培养该宿主细胞。
在一个实施方案中，产生抗-TrkB抗体或其抗原结合片段的方法进一步包含回收且纯化抗-TrkB抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，其结合至具有SEQ ID NO:54的人类TrkB的细胞外域的氨基酸区92-112、130-143和/或205-219内的至少一个氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，其结合至具有SEQ ID NO:54的人类TrkB的细胞外域的氨基酸区92-112及130-143；或92-112及205-219；或130-143及205-219；或92-112及130-143及205-219内的至少一个氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，其结合至前述组合中的任一者内的至少一个氨基酸残基且进一步还结合至具有SEQ ID NO:54的人类TrkB的细胞外域的氨基酸区313-330和/或348-367内的至少一个氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，其结合至具有SEQ ID NO:54的人类TrkB的细胞外域的氨基酸区92-112、130-143、205-219、313-330及348-367内的至少一个氨基酸残基。
附图说明
图1：BDNF、277-抗体、C2或C20抗体与人类TrkB的细胞外域的表位定位。
图2：在SH-SY5Y细胞中，在用BDNF、对照IgG1(抗-2,4,6-三硝基苯基，抗-TNP)或D003抗体治疗之后，关于突触可塑性的经调节基因(x轴)的qPCR表达数据(y轴)。
图3：在将1mg 277-抗体玻璃体内注射至兔眼中之后，如所指示的眼室及血浆中277-抗体的浓度随时间而变的绘图。
图4：IgG1抗体的计算眼部PK。Y轴展示玻璃体浓度且x轴是玻璃体内施用后的天数。玻璃体内注射后达到玻璃体浓度等于EC50的时间通过箭头指示。
图5：研究概述包括动物组及时程。在第5周，进行基线ERG评定(玻璃体内施用前)以评估视网膜中高血糖症诱发的神经元功能障碍的程度。第1组及第2组接受IgG1对照抗体抗-2,4,6-三硝基苯基(抗-TNP)的玻璃体内注射，其不对视网膜功能产生任何影响。第3组的眼用C2(抗-TrkB激动性替代抗体)治疗。在第7周(玻璃体内施用后)再次评估视网膜功能。
图6：基线(玻璃体内施用前)处及玻璃体内施用后1周时，相对于对照组的平均隐含时间的视杆驱动b波隐含时间变化(对于研究概述参见图5)。非糖尿病性对照组1(黑色，n＝23个所研究眼)及高血糖组2(点线，n＝21个所研究眼)接受玻璃体内注射对照IgG1。第3组接受用C2(n＝24个所研究眼)玻璃体内治疗。数据是平均值+SEM。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；高血糖组2及3与对照组1之间的玻璃体内施用前差异显著(为了清楚起见省略统计资料；使用杜凯氏多重比较测试(Tukey's multiple comparisonstest)的单向ANOVA)。
图7：在基线处(玻璃体内施用前)或玻璃体内施用后第1周时，视杆驱动b波的光敏感性S以对照组的平均光敏感性S对照标准化(对于研究概述参见图5)。非糖尿病性对照组1(黑色，n＝23个所研究眼)及高血糖组2(红色，n＝20个所研究眼)接受玻璃体内注射对照IgG1。第3组接受用C2(n＝24个所研究眼)玻璃体内治疗。数据是平均值+SEM。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；高血糖组2及3与对照组1之间的玻璃体内施用前差异显著(为了清楚起见省略统计资料；使用杜凯氏多重比较测试的单向ANOVA)。
图8：在基线处(玻璃体内施用前)或玻璃体内施用后第1周时，通过0.1cd·s/m2光闪诱发的视杆驱动a波反应R以对照的平均反应标准化(对于研究概述参见图5)。非糖尿病性对照组1(黑色，n＝23个所研究眼)及高血糖组2(红色，n＝20个所研究眼)接受玻璃体内注射对照IgG1。第3组接受用C2(n＝24个所研究眼)玻璃体内治疗。数据是平均值+SEM。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；高血糖组2及3与对照组1之间的玻璃体内施用前差异显著(为了清楚起见省略统计资料；使用杜凯氏多重比较测试的单向ANOVA)。
图9：基线(玻璃体内施用前)处及玻璃体内施用后1周时，相对于对照组的平均隐含时间的UV视锥驱动b波隐含时间变化(对于研究概述参见图5)。非糖尿病性对照组1(黑色，n＝24个所研究眼)及高血糖组2(红色，n＝22个所研究眼)接受玻璃体内注射对照IgG1。第3组接受用C2(n＝24个所研究眼)玻璃体内治疗。数据是平均值+SEM。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；高血糖组2及3与对照组1之间的玻璃体内施用前差异显著(为了清楚起见省略统计资料；使用杜凯氏多重比较测试的单向ANOVA)。
图10：基线(玻璃体内施用前)处及玻璃体内施用后1周时，相对于对照组的平均隐含时间的M视锥驱动b波隐含时间变化(对于研究概述参见图5)。非糖尿病性对照组1(黑色，n＝24个所研究眼)及高血糖组2(红色，n＝22个所研究眼)接受玻璃体内注射对照IgG1。第3组接受用C2(n＝24个所研究眼)玻璃体内治疗。数据是平均值+SEM。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；高血糖组2及3与对照组1之间的玻璃体内施用前差异显著(为了清楚起见省略统计资料；使用杜凯氏多重比较测试的单向ANOVA)。
图11：在基线处(玻璃体内施用前)或玻璃体内施用后第1周时，UV视锥驱动b波的光敏感性S以对照组的平均光敏感性S对照标准化(对于研究概述参见图5)。非糖尿病性对照组1(黑色，n＝22个所研究眼)及高血糖组2(红色，n＝22个所研究眼)接受玻璃体内注射对照IgG1。第3组接受用C2(n＝21个所研究眼)玻璃体内治疗。数据是平均值+SEM。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；高血糖组2及3与对照组1之间的玻璃体内施用前差异显著(为了清楚起见省略统计资料；使用杜凯氏多重比较测试的单向ANOVA)。
图12：在基线处(玻璃体内施用前)或玻璃体内施用后第1周时，M视锥驱动b波的饱和反应幅度Rmax以对照组的平均饱和反应幅度Rmax,control标准化(对于研究概述参见图5)。非糖尿病性对照组1(黑色，n＝24个所研究眼)及高血糖组2(红色，n＝22个所研究眼)接受玻璃体内注射对照IgG1。第3组接受用C2(n＝24个所研究眼)玻璃体内治疗。数据是平均值+SEM。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；高血糖组2及3与对照组1之间的玻璃体内施用前差异显著(为了清楚起见省略统计资料；使用杜凯氏多重比较测试的单向ANOVA)。
图13：表达人类TrkB受体的CHO细胞中用(A)BDNF、277-抗体或1nM BDNF与递增浓度的277-抗体的组合或(B)BDNF、C2抗体或1nM BDNF与递增浓度的C2抗体的组合刺激后的ERK磷酸化。数据(符号)表示为平均值±SEM(对于一些点，误差条比符号的高度短)；连接线反映非线性回归(log(激动剂)相对于反应(三个参数))。展示了一系列三个具有独立细胞批料的一个代表性实验；n.s.，单独1nMBDNF与具有指定277-抗体浓度的1nM BDNF之间的差异不显著。#p<0.001，单独1nMBDNF相对于具有指定C2抗体浓度的1nM BDNF；使用多重比较测试的单向ANOVA。
图14：体外ELISA分析中277-抗体或C2抗体与人类或大鼠VEGF的结合。数据(符号)表示为平均值±SEM(注意：误差条比符号的高度短)；连接线反映非线性回归(log(激动性剂)相对于反应(三个参数))。展示了一系列五个独立实验的一个代表性实验。#p<0.01，指定浓度的hVEGF-C2相对于hVEGF-同型IgG1(非配对t测试)。
发明详述
定义
抗体或免疫球蛋白的通用结构为本领域技术人员所熟知，这些分子是通常约150,000道尔顿的由两个相同轻(L)链及两个相同重(H)链构成的异四聚糖蛋白。各轻链通过一个二硫键共价连接至重链以形成异二聚体，且异三聚分子经由异二聚体的两个相同重链之间的共价二硫键形成。尽管该轻链及重链通过一个二硫键连接于一起，但两个重链之间的二硫键数目因免疫球蛋白同种型而不同。各重链及轻链还具有有规律间隔的链内二硫桥键。各重链在氨基端具有可变域(VH＝可变重链)，之后为三个或四个恒定域(CH1、CH2、CH3及CH4)以及CH1与CH2之间的铰链区。各轻链具有两个域，氨基端可变域(VL＝可变轻链)及羧基端恒定域(CL)。VL域非共价缔合VH域，而CL域通常经由二硫键共价连接至CH1域。认为特定氨基酸残基在轻链可变域与重链可变域之间形成界面(Chothia等人,1985,J.Mol.Biol.186:651-663)。
在不同抗体之间，可变域内的某些结构域极为不同，即为“高变的”。这些高变域含有直接参与各特定抗体与其特异性抗原决定簇的结合及特异性的残基。轻链与重链可变域中的高变性集中于三个称为互补决定区(CDR)或高变环(HVL)的区段中。CDR通过序列比较定义，Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,公共卫生处(Public Health Service),美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth),Bethesda,Md.，而HVL在结构上根据可变域的三维结构定义，如Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917所描述。在这类两种方法产生CDR的略不同标识的情况下，结构性定义优选。如Kabat所定义，在轻链可变域中CDR-L1位于约残基24-34处，CDR-L2位于约残基50-56处，且CDR-L3位于约残基89-97处；在重链可变域中，CDR-H1位于约残基31-35处，CDR-H2位于约残基50-65处，且CDR-H3位于约残基95-102处。因此，重链及轻链的CDR1、CDR2、CDR3界定对给定抗体具有特异性的独特及功能特性。
重链及轻链中的各者内的三个CDR通过构架区(FR)分隔开，该框架区含有趋向于较不可变的序列。从重链及轻链可变域的氨基端至羧基端，FR及CDR按以下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。FR的主要β片层结构使链中的各者内的CDR彼此紧密靠近以及紧密靠近来自其他链的CDR。所得构型有助于抗原结合位点(参见Kabat等人,1991,NIH公开案第91-3242号,第I卷,第647-669页)，但并非所有CDR残基必需直接参与抗原结合。
FR残基及Ig恒定域不直接参与抗原结合，但有助于抗原结合和/或介导抗体效应功能。认为一些FR残基以至少三种方式对抗原结合产生显著作用：直接非共价结合至抗表位、与一或多个CDR残基相互作用及影响重链与轻链之间的界面。恒定域不直接参与抗原结合，但介导各种Ig效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)及抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。
脊椎动物免疫球蛋白的轻链基于恒定域的氨基酸序列而归属于两个明确不同的类别κ及λ中的一种。通过比较，哺乳动物免疫球蛋白的重链根据恒定域的序列而归属于五个主要类别中的一种：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgG及IgA进一步分别分成子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ及μ。该等类别的天然免疫球蛋白的亚单位结构及三维构型已熟知。
术语“抗体”、“抗TrkB抗体”、“人源化抗TrkB抗体”及“变异型人源化抗TrkB抗体”在本文中以最广泛意义使用，且特定涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、具有微小修饰(诸如N或C端截短)的抗体及抗体片段(诸如抗体的展现所需生物活性，例如TrkB结合的可变域及其他部分)。
术语“单克隆抗体”(mAb)是指实质上同源的抗体群体中的抗体；即，此群体中的个别抗体相同，但其中可能存在少量天然产生的突变。单克隆抗体针对单一抗原决定簇(“表位”)具有高度特异性。因此，修饰语“单克隆的”指示针对相同抗表位的实质上同源的抗体群，且不应视为需要通过任何特定方法来产生该抗体。应了解单克隆抗体可通过本领域中已知的任何技术或方法制得；包括例如杂交瘤方法(Kohler等人,1975,Nature 256:495)、或本领域中已知的重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)、或使用Clackson等人,1991,Nature 352:624-628及Marks等人,1991,J.Mol.Biol.222:581-597中所述的技术，使用噬菌体抗体文库分离以重组方式产生的单克隆的方法。
嵌合抗体由来自一个物种(例如非人类哺乳动物，诸如小鼠)的抗体的重链及轻链可变区及另一物种(例如人类)抗体的重链及轻链恒定区组成，且可通过如下获得：使编码来自第一物种(例如小鼠)的抗体的可变区的DNA序列连接至来自第二(例如人类)物种的抗体的恒定区的DNA序列，且用含有连接序列的表达载体转型宿主使其产生嵌合抗体。或者，嵌合抗体还可为重链和/或轻链的一或多个区或域与单克隆抗体中来自另一免疫球蛋白类别或同种型或来自共同或生殖系序列的对应序列相同、同源或为其变异体的抗体。嵌合抗体可包括此类抗体的片段，其限制条件为抗体片段展现其亲本抗体的所需生物活性，例如结合至相同抗表位(参见例如美国专利号4,816,567；及Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。
术语“抗体片段”、“抗原结合片段”、“抗-TrkB抗体片段”、“人源化抗-TrkB抗体片段”、“变异型人源化抗-TrkB抗体片段”是指全长抗-TrkB抗体的一部分，其中保持可变区或功能性能力，例如TrkB抗表位结合。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、scFv及scFv-Fc片段、双体抗体、线性抗体、单链抗体、微型抗体、由抗体片段形成的双体抗体及由抗体片段形成的多特异性抗体。
全长抗体可用诸如木瓜酶或胃蛋白酶的酶处理，以产生有用的抗体片段。使用木瓜酶消化以产生两种相同的各具有单一抗原结合位点的称为“Fab”片段的抗原结合抗体片段，及残余“Fc”片段。Fab片段还含有轻链的恒定域及重链的CH1域。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
Fab'片段与Fab片段的不同的处在于在CH1域的C端存在额外残基，其包括一或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。F(ab')2抗体片段是通过铰链区中的半胱氨酸残基连接的Fab'片段对。抗体片段的其他化学偶合也是已知的。
“Fv”片段含有由一个重链可变域及一个轻链可变域的紧密非共价缔合的二聚体的组成的完整抗原识别及结合位点。在此构型中，各可变域的三个CDR相互作用以界定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR共同地赋予抗体以抗原结合特异性。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段是包含抗体的VH及VL域的单链Fv变体，其中该域存在于单一多肽链中。单链Fv能够识别且结合抗原。scFv多肽还可任选地含有位于VH与VL域之间的多肽接头以便有助于通过scFv形成抗原结合所需的三维结构(参见例如Pluckthun,1994,The Pharmacology of monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页)。
其他识别的抗体片段包括包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)以形成一对抗原结合区的抗体片段。这些“线性抗体”可以是双特异性或单特异性的，如例如Zapata等人,1995,Protein Eng.8(10):1057-1062中所述。
人源化抗体或人源化抗体片段是特定类型的嵌合抗体，其包括免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，其能够结合至预定抗原且包含一或多个实质上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的FR及一或多个实质上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列的CDR。通常称为“导入”序列的此非人氨基酸序列通常获自“导入”抗体域，尤其可变域。一般而言，人源化抗体至少包括插入人重链或轻链可变域的FR之间的非人抗体的CDR或HVL。
本发明描述特异性人源化抗-TrkB抗体，其含有插入在人生殖系序列重链及轻链可变域的FR之间的源自鼠类前导D003的CDR。应了解，某些鼠类FR残基对于人源化抗体的功能可为重要的，且因此，某些人生殖系序列重链及轻链可变域残基经修饰与对应鼠类序列的那些残基相同。
在一个方面中，人源化抗-TrkB抗体包含至少一个及通常两个可变域的实质上所有(诸如例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc及Fv片段中含有的)，其中所有或实质上所有CDR与非人免疫球蛋白的那些CDR对应，且具体地，在本文中，CDR是前导D003的鼠类序列，且FR是人免疫球蛋白共同或生殖系序列的那些FR。在另一方面中，人源化抗-TrkB抗体还包括免疫球蛋白Fc区，通常人免疫球蛋白Fc区的至少一部分。通常，抗体将含有轻链以及至少重链的可变域。适当时，抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和/或CH4区中的一个或多个。
人源化抗-TrkB抗体可选自免疫球蛋白的任何类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，及任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。举例而言，恒定域可为补体固定恒定域，其中人源化抗体需要展现细胞毒活性且同种型通常为IgG1。在不需要此类细胞毒活性的情况下，恒定域可具有另一同种型，例如IgG2。替代人源化抗-TrkB抗体可包含来自超过一个免疫球蛋白类别或同种型的序列，且选择特定恒定域以使所需效应功能达最佳在本领域普通技术人员的能力内。在特定实施方案中，本发明提供作为IgG1抗体，且更特定的是敲除效应功能的IgG1抗体的抗体。
人源化抗-TrkB抗体的FR及CDR或HVL无需与亲本序列精确对应。举例而言，导入CDR、或HVL、或共同或生殖系FR序列中的一或多个残基可通过替代、插入或缺失改变(例如突变诱发)，使得所得氨基酸残基不再与任一亲本序列中对应位置中的原始残基一致，然而抗体仍保留与TrkB结合的功能。此类改变通常并非大范围的且将为保守性变化。通常，至少75％的人源化抗体残基将与亲本共同或生殖系FR及导入CDR序列的那些残基对应，更通常至少90％，且最通常大于95％、或大于98％或大于99％。
影响重链及轻链可变区之间的界面(“VL-VH界面”)的免疫球蛋白残基是影响两个链相对于彼此的接近度或取向的残基。可参与链间相互作用的某些残基包括VL残基34、36、38、44、46、87、89、91、96及98，及VH残基35、37、39、45、47、91、93、95、100及103(利用Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(美国国家卫生研究院,Bethesda,Md.,1987)中所示的编号系统)。美国专利号6,407,213还论述了，诸如VL残基43及85及VH残基43及60的残基还可参与此相互作用。尽管这类残基仅针对于人类IgG指示，但其在物种间均适用。选择用于替代成共同序列中的合理预期参与链间相互作用的重要抗体残基。
术语“共同序列”及“共同抗体”是指在任何特定类别、同种型或亚单位结构的所有免疫球蛋白中的各位置，例如人类免疫球蛋白可变域包含最通常出现的氨基酸残基的氨基酸序列。共同序列可基于特定物种或许多物种的免疫球蛋白。应了解，“共同”序列、结构或抗体涵盖如某些实施方案中所述的共同人序列，且是指在任何特定类别、同种型或亚单位结构的所有人免疫球蛋白中的各位置包含最通常出现的氨基酸残基的氨基酸序列。因此，共同序列含有在各位置具有存在于一或多个已知免疫球蛋白中的氨基酸的氨基酸序列，但其不可精确重复任何单一免疫球蛋白的整个氨基酸序列。可变区共同序列不获自任何天然产生的抗体或免疫球蛋白。Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版公共卫生处,美国国家卫生研究院,Bethesda,Md，及其变体。重链及轻链共同序列的FR及其变体提供有用于制备人源化抗-TrkB抗体的序列。参见例如美国专利号6,037,454及号6,054,297。
人生殖系序列天然见于人类群体中。那些生殖系基因的组合产生抗体多样性。抗体轻链的生殖系抗体序列来自保守的人生殖系κ或λv基因及j基因。类似地，重链序列来自生殖系v基因、d基因及j基因(LeFranc,M-P及LeFranc,G,“The Immunoglobulin FactsBook”Academic Press,2001)。
“分离的”抗体是已自其天然环境的组分中鉴别出且分离和/或回收的抗体。抗体的天然环境的污染物组分是可干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，且可为酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一个方面中，将抗体纯化至按抗体的重量计至少大于95％分离。
分离的抗体包括在其中产生它的重组细胞内的原位抗体，其是因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤制备，在该步骤中去除重组细胞物质。
术语“抗体效能”是指有助于抗原的抗体识别的因素/特性或抗体的体内效用。抗体的氨基酸序列的变化可影响诸如折叠的抗体特性，且可影响物理因素，诸如抗体与抗原结合的初始速率(ka)、抗体自抗原的解离常数(kd)、抗体对于抗原的亲和力常数(Kd)、抗体的构象、蛋白质稳定性及抗体的半衰期。
如本文所使用，术语“一致”或“一致性百分比”在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下是指针对最大对应性比较及比对时两个或更多个序列或子序列相同或有指定百分比的核苷酸或氨基酸残基相同。为确定一致性百分比，出于最佳比较目的进行序列比对(例如为与第二氨基酸或核酸序列最佳比对，可在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。若第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据，则分子在该位置处一致。两个序列之间的一致性百分比是该等序列共有的一致位置数的函数(即，一致性％＝一致位置数/位置总数(即重叠位置)×100)。在一些实施方案中，适当时，在序列内引入空位之后，进行比较的两个序列长度相同(例如不包括延长超过比较序列的额外序列)。举例而言，当比较可变区序列时，不考虑前导序列和/或恒定域序列。对于两个序列之间的序列比较，“对应的”CDR是指两个序列中相同位置的CDR(例如各序列的CDR-H1)。
可使用数学算法实现确定两个序列之间的一致性百分比或相似性百分比。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实例是Karlin及Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法，如Karlin及Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中所修改的。将此类算法并入至Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST及XBLAST程式中。BLAST核苷酸检索可用NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)执行以获得与编码感兴趣的蛋白质的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)执行以获得与感兴趣的蛋白质同源的氨基酸序列。为了获得空位用于比较目的，可如Altschul等人,1997,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中所述使用空位BLAST。或者，PSI-Blast可用于执行迭代检索，其检测分子间的远距离关系(同上)。当利用BLAST、空位BLAST及PSI-Blast程序时，可使用对应程序(例如XBLAST及NBLAST)的预设参数。用于比较序列的数学算法的另一个优选非限制性实例是Myers及Miller,CABIOS(1989)的算法。将此类算法并入至ALIGN程序(2.0版)中，该ALIGN程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12及空位罚分4。用于序列分析的额外算法在本领域中已知且包括如Torellis及Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3-5中所述的ADVANCE及ADAM；及Pearson及Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-8中所述的FASTA。在FASTA内，ktup是设定检索的敏感性及速度的对照选项。若ktup＝2，则通过观察比对残基对得到比较的两个序列中的类似区；若ktup＝1，则检查单一比对氨基酸。对于蛋白质序列，ktup可设定为2或1，或对于DNA序列设定为1至6。若ktup未得以指定，则对于蛋白质预设值是2，且对于DNA是6。或者，可使用CLUSTAL W算法进行蛋白质序列比对，如Higgins等人,1996,Methods Enzymol.266:383-402所描述的。
核酸序列在其置放至与另一核酸序列具有功能关系时“可操作地连接”。举例而言，若核酸前序列或分泌性前导序列表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与编码该多肽的核酸可操作地连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与该序列可操作地连接；或若核糖体结合位点经定位以便有助于翻译，则其与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”意指连接的DNA序列为连续的，且在分泌前导子的情况下，为连续的且在阅读框架内。然而，增强子任选地是连续的。连接可通过在适宜限制性位点处接合来实现。若此类位点不存在，则可使用合成寡核苷酸适配子或接头。
如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”及“细胞培养物”可互换使用且所有此类名称均包括其子代。因此，“转化子”及“转化的细胞”包括主要个体细胞及来源于其的培养物，与转移数目无关。
出于治疗的目的，术语“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家畜与农畜及动物园、竞技或宠物动物，诸如狗、马、猫、奶牛及其类似动物。哺乳动物优选为人类。
如本文所用，“病症”是受益于用本文所述的人源化抗-TrkB抗体治疗的任何病状。此病状包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论的病症的那些病理病状。在本文中待治疗的非限制性实例或病症包括眼睛或视网膜病症。
如本文所用，术语“TrkB相关病症”或“TrkB相关疾病”是指表明表达TrkB的细胞的修饰或活化的病状。TrkB相关病症包括诸如以下的疾病及病症：年龄相关性黄斑变性、地图状萎缩、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、色素性视网膜炎、遗传性视网膜萎缩、遗传性黄斑萎缩、近视性变性、视网膜静脉闭塞、视网膜动脉闭塞、内眼炎、葡萄膜炎、囊样黄斑部水肿、继发于任何视网膜疾病的脉络膜新生血管性膜、视神经病、青光眼、视网膜剥离、中毒性视网膜病、辐射性视网膜病及创伤性视网膜病以及前驱症状性及轻度至中度阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)，延缓患有阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病(Huntington'sdisease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、重度抑郁症、精神分裂症、与精神分裂症相关的认知障碍的患者的疾病进程，预防精神病综合征减弱的个体的首次发作性精神病，预防患有精神分裂症、耐治疗性抑郁症及如摄食过量、肥胖症或代谢综合征的代谢疾病的患者复发。
术语“玻璃体内注射”具有其在本领域中的正常意义且是指将抗-TrkB抗体或其抗原结合片段引入至患者的玻璃体中。
术语“皮下施用”是指将抗-TrkB抗体或其抗原结合片段通过自药物容器相对缓慢的持续递送而引入至动物或人类患者的皮肤下，优选皮肤与下层组织之间的袋内。捏起或拉起皮肤且远离下层组织可产生袋。
术语“皮下输注”是指将药物通过自药物容器相对缓慢的持续递送而引入至动物或人类患者的皮肤下，优选皮肤与下层组织之间的袋内，维持包括(但不限于)30分钟或更小、或90分钟或更小的一段时间。输注任选地可通过皮下植入植入动物或人类患者的皮肤下的药物递送泵制得，其中该泵吸递送预定量的药物维持预定时段，诸如30分钟、90分钟或跨越治疗方案长度的时段。
术语“皮下推注”是指在动物或人类患者的皮肤下方施用药物，其中推注药物递送小于大约15分钟；在另一方面中，小于5分钟，且在又一方面中，小于60秒。在另一方面中，施用是在皮肤与下层组织之间的袋内，其中袋可通过捏起或拉起皮肤且远离下层组织而产生。
术语“治疗有效量”用以指抗-TrkB抗体或其抗原结合片段的减轻或改善所治疗病症的症状中的一或多种的量。由此，其是具有有益患者结果的量。在一个方面中，治疗有效量具有神经保护性或神经再生性作用。在另一方面中，治疗有效量是指显示为有效例如减缓疾病进程的目标血清浓度。功效可根据待治疗的病状以常规方式测量。举例而言，在特征为表达TrkB的细胞的眼睛/视网膜疾病或病症中，功效可通过测定反应率，例如视觉的恢复，或通过评定直至疾病进展的延迟时间来测量。
如本文所用，术语“治疗”及“疗法”及其类似术语意指包括疾病或病症的治疗以及预防，或遏制措施，从而产生任何临床上需要或有益的作用，包括(但不限于)缓解或减轻一或多种症状、消退、减缓或停止疾病或病症的进展。因此，举例而言，术语治疗包括在疾病或病症的症状发作之前或之后施用抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，由此预防或去除疾病或病症的一或多种病征。作为另一实例，该术语包括在临床表达出疾病之后施用抗-TrkB抗体或其抗原结合片段以对抗疾病的症状。此外，在发作之后及在出现临床症状之后施用抗-TrkB抗体或其抗原结合片段包含如本文所用的“治疗”或“疗法”，其中施用会影响疾病或病症的临床参数，诸如组织损伤程度或转移的量或程度，而无论治疗是否导致疾病的缓解。而且，只要本发明的组合物单独或与另一治疗剂组合对于所治疗病症的至少一种症状相比于不存在使用抗-TrkB抗体组合物或其抗原结合片段下的该症状有缓解或改善，结果即应视为有效治疗潜在病症，而与病症的所有症状是否缓解无关。
术语“包装插页”用以指通常包括于治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于与使用此类治疗产品有关的适应症、用法、施用、禁忌症和/或警告的信息。
抗体
本文描述且公开抗-TrkB抗体，尤其人源化抗-TrkB抗体，以及包含本发明的抗-TrkB抗体的组合物及制品。还描述抗-TrkB抗体的抗原结合片段。抗-TrkB抗体及其抗原结合片段可用于治疗特征为TrkB通路的活性降低的各种疾病或病症。抗-TrkB抗体及其抗原结合片段各自包含特异性识别TrkB表位的至少一部分。
在初始表征中，基于其优良抗体效能选择了抗-TrkB鼠类前导D003。通过将鼠类前导的CDR置放至人共同重链及轻链可变域的FR中且此外通过工程改造具有不同变化的FR产生变体文库。
由此产生如下文所示的各种人源化重链及轻链可变序列：
VL序列
D003_VL(鼠类前导)，可变轻链，SEQ ID NO:1
277-gr_VL，(人源化)可变轻链，SEQ ID NO:2
277-33_VL：(人源化)可变轻链，SEQ ID NO:3
277-35_VL：(人源化)可变轻链，SEQ ID NO:4
/>
277-42_VL，(人源化)可变轻链，SEQ ID NO:5
277-44_VL，(人源化)可变轻链，SEQ ID NO:6
277-48_VL，(人源化)可变轻链，SEQ ID NO:7
277-51_VL，(人源化)可变轻链，SEQ ID NO:8
277-64_VL，(人源化)可变轻链，SEQ ID NO:9
277-67_VL，(人源化)可变轻链，SEQ ID NO:10
VH序列
D003_VH，(鼠类前导)可变重链，SEQ ID NO:11
277-gr_VH，(人源化)可变重链，SEQ ID NO:12
277-33_VH，(人源化)可变重链，SEQ ID NO:13
277-35_VH，(人源化)可变重链，SEQ ID NO:14
277-42_VH，(人源化)可变重链，SEQ ID NO:15
277-44_VH，(人源化)可变重链，SEQ ID NO:16
277-48_VH，(人源化)可变重链，SEQ ID NO:17
277-51_VH，(人源化)可变重链，SEQ ID NO:18
277-64_VH，(人源化)可变重链，SEQ ID NO:19
277-67_VH，(人源化)可变重链，SEQ ID NO:20
加划底线的序列与可变轻链及重链区的CDR区对应。
本发明的人源化抗-TrkB抗体是如下表中所示的具有轻链及重链序列的抗体。IgG1-KO突变体已通过在Fc区中引入两个突变Leu232Ala及Leu233Ala以降低效应功能而制得。
表1：
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将以上根据Chemical Computing Group(CCG)编号的CDR加划底线(Almagro等人,Proteins 2011；79:3050-3066及Maier等人,Proteins 2014；82:1599-1610)。序列的Kabat编号通过粗体字表示且Chothia编号系统通过斜体字表示。
在一个方面中，本发明的抗-TrkB抗体以KD<10nM与人TrkB结合。在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体以KD<5nM与人TrkB结合。在又一方面中，本发明的抗-TrkB抗体以约1nM的KD与人TrkB结合。抗-TrkB抗体的结合亲和力可根据实施例6中所述的方法测定。
在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体以高效力诱导TrkB磷酸化和/或活化。在一个方面中，本发明的抗-TrkB抗体以EC50<100pm磷酸化人类TrkB。在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体以EC50<50pm磷酸化人类TrkB。在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体以EC50<40pm磷酸化人类TrkB。在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体以EC50<30pm磷酸化人类TrkB。在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体以约20pm的EC50磷酸化人类TrkB。
在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体比天然TrkB配体BDNF更有效诱导TrkB下游信号传导通路的活化。抗-TrkB抗体的效力可根据实施例8中所述的方法，在分化的SH-SY5Y细胞中测定。
在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体所诱导的基因表达相当于天然TrkB配体BDNF。使用激动性抗-TrkB抗体刺激来提高ARC、VGF、EGR1的mRNA表达，该ARC、VGF、EGR1是突触可塑性提高的标志物，且因此是表示抗-TrkB抗体的作用如同天然配体BDNF用于调节神经元功能(即，提高神经元存活率和/或突触可塑性)的指示剂。基因表达模式可根据实施例10中所述的方法来测定。
在又一方面中，本发明的抗-TrkB抗体通过刺激TrkB依赖性存活信号传导通路且由此提供神经保护而保护患有例如年龄相关性黄斑变性、地图状萎缩或糖尿病性视网膜病变的患者的视网膜中的神经元、神经胶质细胞和/或神经血管单元。
在另一方面中，在例如年龄相关性黄斑变性、地图状萎缩或糖尿病性视网膜病变中，本发明的抗-TrkB抗体使视网膜中的轴突/树突和/或突触在疾病发作之后再生，且由此使得神经再生。
在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体相对于其CDR序列具有低免疫原性风险及低序列可靠性。免疫原性及异源性是治疗性抗体的两个重要方面。此类方面的测量可通过如实施例4及5所描述的方法实现。本发明抗体已经谨慎地工程改造以具有最小或无免疫原性和/或异源性。
在又一方面中，本发明的抗-TrkB抗体不减少BDNF诱导的ERK磷酸化。出于此目的，ERK磷酸化可如实施例13中所述例如在表达人TrkB的CHO细胞中测量。这可意指谓当施用本发明的抗-TrkB抗体时通过内源性表达的BDNF所诱导的ERK磷酸化不减少。还可意指本发明的抗-TrkB抗体当在外源性施用BDNF之前、同时或之后施用时均不减少ERK磷酸化。在一些情况下，抗-TrkB抗体不与单独BDNF诱导竞争，或与单独BDNF诱导相比不减少BDNF诱导的ERK磷酸化。
在另一方面中，本发明的抗-TrkB抗体对TrkB磷酸化和/或活化具有特异性且不会非特异性磷酸化和/或活化TrkA或TrkC。
在另一方面中，抗-TrkB抗体不非特异性结合至人VEGF和/或大鼠VEGF。在此情形下，非特异性结合意指本发明的抗-TrkB抗体不结合至人VEGF，如例如在如实施例14中所述的ELISA中所测量。在一个实施方案中，抗-TrkB抗体不非特异性结合可通过测量抗-TrkB抗体与适当IgG同种型对照抗体之间与人VEGF结合的统计学上显著的差异(例如不成对t测试，p<0.05)来测定。特别地，本发明的抗-TrkB抗体不非特异性结合可通过测定抗-TrkB抗体与IgG1同种型对照抗体之间与人VEGF结合的任何差异来测量。本发明的抗-TrkB抗体与浓度达至如下的同等浓缩的IgG1同种型对照抗体相比不与人VEGF结合并无明显不同：约0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、110nM、120nM、130nM、140nM、150nM、160nM、170nM、180nM、190nM或200nM。在一替代实施方案中，本发明的抗-TrkB抗体的不非特异性结合可通过测定抗-TrkB抗体与人或大鼠VEGF中的一者的IC50结合值来测量。特别地，本发明的抗-TrkB抗体将展现与人或大鼠VEGF的IC50结合值是约大于0.9μM，优选大于1μM、大于2μM、大于3μM、大于5μM、大于10μM、大于20μM、大于30μM、大于40μM、大于50μM、大于100μM、大于150μM、大于200μM、大于250μM、大于300μM、大于350μM、大于400μM、大于450μM、大于500μM、大于550μM、大于600μM、大于650μM、大于700μM、大于750μM、大于800μM、大于850μM或大于900μM。
人源化及氨基酸序列变体
其他变异型抗-TrkB抗体及抗体片段可基于鼠类前导D003中所鉴别的CDR组进行工程化。应了解，在所述变异型抗-TrkB抗体及抗体片段中，CDR的氨基酸序列保持不变，但例如FR区的周围区域可经工程化。抗-TrkB抗体的氨基酸序列变体可通过将适当核苷酸变化引入至抗-TrkB抗体DNA中或通过肽合成来制备。此类变体包括例如自本文实施例的抗-TrkB抗体的氨基酸序列内的残基缺失和/或插入其中和/或取代其。进行缺失、插入及取代的任何组合以获得最终构建体，其限制条件为该最终构建体具有所需特征。氨基酸变化还可改变人源化或变异型抗-TrkB抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
在一些实施方案中，本发明包括具有可变轻链及可变重链的抗-TrkB抗体或其抗体片段，其中可变轻链氨基酸序列及可变重链氨基酸序列分别与SEQ ID NO:2及12、或3及13、或4及14、或5及15、或6及16、或7及17、或8及18、或9及19、或10及20的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致。
在一些实施方案中，本发明包括具有轻链及重链的抗-TrkB抗体或其抗体片段，其中轻链氨基酸序列及重链氨基酸序列分别与SEQ ID NO:21及22或23；24及25或26；27及28或29；30及31或32；33及34或35；36及37或38；39及40或41；42及43或44；45及46或47的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％一致。
在另一实施方案中，本发明包括抗-TrkB抗体与以下抗体中的任一者竞争以结合至TrkB：
具有包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:22或23的氨基酸序列的重链的抗体，
具有包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列的重链的抗体，
具有包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:28或29的氨基酸序列的重链的抗体，
具有包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:31或32的氨基酸序列的重链的抗体，
具有包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:34或35的氨基酸序列的重链的抗体，
具有包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:37或38的氨基酸序列的重链的抗体，
具有包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:40或41的氨基酸序列的重链的抗体，
具有包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:43或44的氨基酸序列的重链的抗体，或
具有包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链及包含SEQ ID NO:46或47的氨基酸序列的重链的抗体。
抗体的另一类型的氨基酸变体涉及改变抗体的原始糖基化模式。在此情形下，术语“改变”意指缺失一或多个见于抗体中的碳水化合物部分，和/或添加一或多个先前不存在于抗体中的糖基化位点。
在一些方面中，本发明包括编码本文所述的抗-TrkB抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。编码抗-TrkB抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域中已知的各种方法制备。这类方法包括(但不限于)自天然来源分离(在天然产生的氨基酸序列变体的情况下)或通过对抗-TrkB抗体的早期制备变体或非变异型进行寡核苷酸介导(或定点)突变诱发、PCR突变诱发及盒突变诱发来制备。
【1】在某些实施方案中，抗-TrkB抗体是抗体片段。存在已开发用于产生抗体片段的技术。片段可经由完整抗体的蛋白水解消化得到(参见例如Morimoto等人,1992,Journalof Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117；及Brennan等人,1985,Science229:81)。或者，片段可在重组宿主细胞中直接产生。举例而言，Fab'-SH片段可自大肠杆菌中直接回收且以化学方式偶合以形成F(ab')2片段(参见例如Carter等人,1992,Bio/Technology10:163-167)。通过另一方法，F(ab')2片段可自重组宿主细胞培养物直接分离。用于产生抗体片段的其他技术对本领域技术人员将是显而易见的。
抗-TrkB抗体及其抗原结合片段可包括修饰。
在某些实施方案中，可能需要使用抗-TrkB抗体片段，而非完整抗体。可能需要修饰抗体片段以增加其血清半衰期。此情况可例如通过将补救受体结合抗表位并入至抗体片段中实现。在一种方法中，抗体片段的适当区域可改变(例如突变)，或可将抗表位并入至肽标签中，接着例如通过DNA或肽合成在任一末端或在中间中融合至抗体片段。参见例如WO96/32478。
在其他实施方案中，本发明包括抗-TrkB抗体的共价修饰。共价修饰包括半胱氨酰基残基、组氨酰基残基、赖氨酰基及氨基端残基、精氨酰基残基、酪氨酰基残基、羧基侧基(天冬氨酰基或麸氨酰基)、谷氨酰胺酰基及天冬酰氨酰基残基、或丝氨酰基、或羟丁氨酰基残基的修饰。另一类型的共价修饰涉及以化学方式或酶促方式将糖苷偶合至抗体。若适用，则此类修饰可通过抗体的化学合成或通过酶促或化学裂解进行。抗体的其他类型的共价修饰通过使抗体的靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或氨基端或羧基端残基反应的有机衍生剂反应而引入至分子中。
存在于抗体上的任何碳水化合物部分的去除可以通过化学方式或酶促方式实现。化学去糖基化由Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52及Edge等人,1981,Anal.Biochem.118:131描述。抗体上碳水化合物部分的酶促裂解可通过使用如由Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol 138:350所述的各种内醣苷酶及外醣苷酶实现。
另一类型的有用的共价修饰包含以美国专利号4,640,835、美国专利号4,496,689、美国专利号4,301,144、美国专利号4,670,417、美国专利号4,791,192及美国专利号4,179,337中的一或多者中所示的方式使抗体连接至各种非蛋白质聚合物中的一者，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
抗表位结合
本发明的抗体特异性结合至天然或重组人TrkB。本发明的抗体识别特异性“TrkB抗原表位”及“TrkB表位”。特别地，本发明的抗体结合至具有SEQ ID NO:54的人TrkB的细胞外域中的抗表位。
人TrkB的细胞外域基本上包含以下序列(SEQ ID NO.54)：
如本文所用，术语“TrkB抗原表位”及“TrkB表位”是指能够结合至抗-TrkB抗体或其抗原结合片段的分子(例如肽)或分子的片段。这些术语进一步包括例如通过本发明的抗体或抗体片段中的任一者识别的TrkB抗原决定簇，其具有选自SEQ ID NO 48至50的轻链CDR及SEQ ID NO:51至53的重链CDR的轻链及重链CDR组合。
TrkB表位可包括于蛋白质、蛋白质片段、肽或其类似物中。表位最常是蛋白质、短寡肽、寡肽模拟物(即，模拟TrkB抗原的抗体结合特性的有机化合物)或其组合。
已发现，本发明的抗体或抗体片段结合至人TrkB的细胞外域中的特有抗表位。优选地，抗-TrkB抗体或其抗原结合片段结合至具有SEQ ID NO:54的人TrkB的细胞外域的氨基酸区92-112、130-143和/或205-219内的至少一个氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，其结合至具有SEQ ID NO:54的人TrkB的细胞外域的氨基酸区92-112及130-143；或92-112及205-219；或130-143及205-219；或92-112及130-143及205-219内的至少一个氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，其结合至氨基酸区的前述组合中任一者内的至少一个氨基酸残基，且进一步还结合至具有SEQ ID NO:54的人TrkB的细胞外域的氨基酸区313-330和/或348-367内的至少一个氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，其结合至具有SEQ ID NO:54的人TrkB的细胞外域的氨基酸区92-112、130-143、205-219、313-330及348-367内的至少一个氨基酸残基。
因此，在表位结合的情况下，短语“结合至氨基酸区X-Y……内”意指抗-TrkB抗体或其抗原结合片段结合至序列所示氨基酸区内的至少一个氨基酸残基。
若举例而言抗-TrkB抗体或其抗原结合片段结合至氨基酸区92-112或130-143内的至少一个氨基酸残基，则此情况意指抗-TrkB抗体或其抗原结合片段结合至氨基酸区92-112或130-143内的至少一个氨基酸残基。
在另一实施例中，若抗-TrkB抗体或其抗原结合片段结合至氨基酸区92-112及130-143内的至少一个氨基酸残基，则此情况意谓抗-TrkB抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:54的氨基酸区92-112内的至少一个氨基酸残基，且还结合至氨基酸区130-143内的至少一个氨基酸残基。
在另一方面中，抗-TrkB抗体或其抗原结合片段结合至具有SEQ ID NO:54的人TrkB的细胞外域的氨基酸区92-112、130-143和/或205-219内的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，其结合至具有SEQ ID NO:54的人TrkB的细胞外域的氨基酸区92-112及130-143；或92-112及205-219；或130-143及205-219；或92-112及130-143及205-219内的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，其结合至氨基酸区的前述组合中任一者内的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸残基，且还进一步结合至具有SEQ ID NO:54的人TrkB的细胞外域的氨基酸区313-330和/或348-367内的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，其结合至具有SEQ ID NO:54的人TrkB的细胞外域的氨基酸区92-112、130-143、205-219、313-330及348-367内的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸残基。
若举例而言抗-TrkB抗体或其抗原结合片段结合至氨基酸区92-112或130-143内的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸残基，则此情况意指抗-TrkB抗体或其抗原结合片段结合至氨基酸区92-112内的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸残基或结合至氨基酸区130-143内的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸残基。
在另一实施例中，若抗-TrkB抗体或其抗原结合片段结合至氨基酸区92-112及130-143内的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸残基，则此情况意指抗-TrkB抗体或其抗原结合片段结合至氨基酸区92-112内的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸残基且还结合至氨基酸区130-143内的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸残基。
不希望受任何理论束缚，认为由于结合至新颖抗表位，故TrkB抗体在活化TrkB上发挥其优良作用。
多核苷酸、载体、宿主细胞及重组方法
其他实施方案涵盖包含编码抗-TrkB抗体的序列的分离的多核苷酸、包含多核苷酸的载体及宿主细胞、及用于产生该抗体的重组技术。分离的多核苷酸可编码任何所需形式的抗-TrkB抗体，包括例如全长单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、双功能抗体、线性抗体、单链抗体分子及由抗体片段形成的多特异性抗体。
包含编码抗-TrkB抗体或其片段或链的序列的多核苷酸可如本领域中已知融合至一或多个调控或控制序列，且可如本领域中所已知含于适合的表达载体或宿主细胞中。编码重链或轻链可变域的多核苷酸分子中的各者可独立地融合至编码恒定域(诸如人恒定域)的多核苷酸序列，从而使得能够产生完整抗体。或者，多核苷酸或其部分可融合于一起，提供用于产生单链抗体的模板。
对于重组产生，将编码抗体的多核苷酸插入至用于克隆(DNA扩增)或表达的可复制载体中。可获得许多适用于表达重组抗体的载体。载体组分一般包括(但不限于)以下中的一或多者：信号序列、复制起点、一或多个标记基因、增强子元件、启动子及转录终止序列。
抗-TrkB抗体还可以以融合多肽形式产生，其中抗体与异源多肽融合，诸如信号序列或在成熟蛋白或多肽的氨基端具有特异性裂解位点的其他多肽。所选异源信号序列通常为经宿主细胞识别且处理(即，通过信号肽酶裂解)的信号序列。对于不识别且处理抗-TrkB抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列可被原核信号序列替代。信号序列可为例如碱性磷酸酶、青霉素酶、脂蛋白、热稳定肠毒素II前导序列及其类似信号序列。对于酵母分泌，天然信号序列可被例如获自酵母转化酶α因子(包括酵母(Saccharomyces)及克鲁维酵母(Kluyveromyces)α-因子前导子)、酸性磷酸酶、白色念珠菌(C.albicans)淀粉酶的前导序列或WO90/13646中所述的信号替代。在哺乳动物细胞中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导子，例如单纯疱疹病毒gD信号。此类前体区的DNA在阅读框架中接合至编码人源化抗-TrkB抗体的DNA。
表达载体及克隆载体含有使得载体能够在一或多个所选宿主细胞中复制的核酸序列。一般而言，在克隆载体中，此序列是使得载体能够独立于宿主染色体DNA而复制的序列，且包括复制起点或自主复制序列。此类序列对于各种细菌、酵母及病毒而言是熟知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacteria)，2-υ。质粒起点适用于酵母，且各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(SV40起点可通常仅因其含有早期启动子而被使用)。
表达载体及克隆载体可含有编码可选标记的基因以有助于鉴别表达。典型可选标记基因编码蛋白质，该蛋白质可赋予抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素(ampicillin)、新霉素(neomycin)、甲氨喋呤(methotrexate)或四环素(tetracycline))以抗性，或者补充营养缺陷，或在其他替代方案中，提供不存在于复合培养基中的特定营养物，例如编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞生长。经异源基因成功转化的那些细胞产生赋予耐药性的蛋白质且因此在选择方案中存活下来。此类显性选择的实例使用药物新霉素(neomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)及潮霉素(hygromycin)。哺乳动物细胞的常见可选标记是使得能够鉴别可摄取编码人源化抗-TrkB抗体的核酸的细胞的标记，诸如DHFR(二氢叶酸还原酶)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I及金属硫蛋白-II(诸如灵长类动物金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶及其类似物。首先通过将所有转化子在含有甲氨喋呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养来鉴别经DHFR选择基因转化的细胞。当使用野生型DHFR时合适的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株(例如DG44)。
或者，经编码抗-TrkB抗体、野生型DHFR蛋白质及另一种可选标记(诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(尤其含有内源性DHFR的野生型宿主)可通过在含有针对可选标记(诸如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素(kanamycin)、新霉素或G418)的选择剂的培养基中进行细胞生长来选择。参见例如美国专利号4,965,199。
在酵母细胞作为宿主细胞执行重组生产的情况下，存在于酵母质粒YRp7中的TRP1基因可用作可选标记(Stinchcomb等人,1979,Nature 282:39)。TRP1基因为在色氨酸中不具有生长能力的酵母突变菌株(例如ATCC编号44076或PEP4-1)提供选择标记(Jones,1977,Genetics 85:12)。然后，酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在提供通过在不存在色氨酸下生长检测转化的有效环境。类似地，Leu2p缺乏酵母菌株(诸如ATCC 20,622及38,626)由带有LEU2基因的已知质粒来补充。
另外，源自1.6微米环形质粒pKD1的载体可用于克鲁维酵母酵母的转化。或者，针对克鲁维乳球菌报导了用于大规模产生重组小牛凝乳酶的表达系统(Van den Berg,1990,Bio/Technology 8:135)。还公开用于通过工业克鲁维酵母菌株分泌成熟重组人类血清白蛋白的稳定多拷贝表达载体(Fleer等人,1991,Bio/Technology 9:968-975)。
表达载体及克隆载体通常含有通过宿主生物体识别且可操作地连接于编码抗-TrkB抗体或其多肽链的核酸分子的启动子。适于与原核宿主一起使用的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶及乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统及杂交启动子，诸如tac启动子。其他已知细菌启动子也是适合的。用于细菌系统中的启动子还将含有可操作地连接于编码人源化抗-TrkB抗体的DNA的夏因-达尔加莫(Shine-Dalgamo，S.D.)序列。
已知许多真核启动子序列。几乎所有的真核基因均具有富AT区，其位于转录起始位点上游大致25至30个碱基处。在许多基因转录起点上游70至80个碱基处发现的另一序列是CNCAAT区，其中N可为任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，其可为将聚A尾添加至编码序列的3'端的信号。所有这类序列均适合插入至真核表达载体中。
适合与酵母宿主一起使用的启动序列的实例包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶的启动子，这些糖酵解酶是诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙醣磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶及葡糖激酶。
诱导性启动子具有通过生长条件控制的额外转录优势。这些启动子包括用于醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的衍生酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及负责麦芽糖及半乳糖利用的酶的酵母启动子区。适合用于酵母表达的载体及启动子进一步描述于EP 73,657中。酵母增强子还宜与酵母启动子一起使用。
控制哺乳动物宿主细胞中自载体的抗-TrkB抗体转录，例如通过获自诸如以下的病毒的基因组的启动子实现：多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽鸟肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒及猿猴病毒40(SV40)；异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；或热休克启动子，限制条件为此类启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期及晚期启动子宜以还含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段形式获得。人巨细胞病毒的即刻早期启动子宜以HindIII E限制性片段形式获得。在哺乳动物宿主中使用牛乳头瘤病毒作为载体表达DNA的系统公开于美国专利号4,419,446中。此系统的修饰描述于美国专利号4,601,978中。还参见Reyes等人,1982,Nature 297:598-601，其公开人p-干扰素cDNA在来自单纯性疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中的表达。或者，可使用劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复序列作为启动子。
可用于重组表达载体中另一适用要素是增强子序列，其用以增加高级真核生物的编码抗-TrkB抗体的DNA的转录。现已知来自哺乳动物基因(例如血球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点(bp 100-270)后方的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后方的多瘤病毒增强子，及腺病毒增强子。关于增强真核启动子活化的要素的描述还参见Yaniv,1982,Nature 297:17-18。增强子可在抗-TrkB抗体编码序列的5'或3'位处剪接至载体中，但优选位于始于启动子的5'位点处。
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体还可含有转录终止及稳定mRNA必需的序列。此类序列通常获自真核或病毒DNA或cDNA的5'及偶尔3'非翻译区。这类区域在编码抗-TrkB抗体的mRNA的未翻译部分中含有以聚腺苷酸化片段形式转录的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区域。参见WO94/11026及其中所公开的表达载体。在一些实施方案中，抗-TrkB抗体可使用CHEF系统表达。(参见例如美国专利号5,888,809；其公开内容以引用的方式并入本文中。)
本文中适用于在载体中克隆或表达DNA的宿主细胞是上文所述的原核生物、酵母或高级真核生物细胞。适用于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如鼠伤寒沙门杆菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷菌属(Serratia)(例如黏质沙雷氏菌(Serratia marcescans))及志贺杆菌属(Shigella)；以及杆菌属(Bacilli)(诸如枯草杆菌(B.subtilis)及地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中所公开的地衣芽孢杆菌41P))、假单胞菌属(Pseudomonas)(诸如绿脓杆菌(P.aeruginosa))及链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)及大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)的其他菌株是适合的。这些实例是说明性的而非限制性的。
除原核生物的外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物是适用于编码抗-TrkB抗体的载体的克隆或表达宿主。在低级真核宿主微生物中最常使用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母。然而，多种其他属、种及菌株通常可用且适用于本文，诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyce)宿主，诸如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、沃尔第克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果妮克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)及马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗厚神经胞子菌(Neurosporacrassa)；施氏酵母属(Schwanniomyce)，诸如许旺施氏酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；及丝状真菌，诸如红霉菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)及曲菌属(Aspergillus)宿主，诸如构巢曲霉(A.nidulans)及黑曲霉(A.niger)。
适用于表达经糖基化抗-TrkB抗体的宿主细胞源自多细胞生物体。无脊椎细胞的实例包括植物及昆虫细胞，包括例如许多杆状病毒菌株及变体及来自诸如以下宿主的对应容许昆虫宿主细胞：草地黏虫(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊虫)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊虫)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)及家蚕(Bombyx mori)(桑蚕(silk worm))。用于转染的各种病毒株可公开获得，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体及家蚕NPV的Bm-5菌株，且此类病毒可尤其用于转染草地黏虫细胞。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄及烟草的植物细胞培养物还可用作宿主。
本发明的抗-TrkB抗体或其抗原结合片段还可并入至病毒载体中，即，将编码抗-TrkB抗体或其抗原结合片段的多核苷酸引入至病毒载体中且然后在用病毒感染之后表达于患者体内。
在另一方面中，抗-TrkB的表达在脊椎动物细胞中实现。脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规程序及广泛可用的技术。适用哺乳动物宿主细胞株的实例是经SV40转化的猴肾脏CV1株(COS-7，ATCC CRL1651)、人类胚胎肾株(经亚克隆以便在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人,1977,J.Gen Virol.36:59)、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO，Urlaub等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216；例如DG44)、小鼠塞特利氏细胞(mouse sertoli cell)(TM4，Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人子宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、布法罗大鼠肝细胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather等人,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC 5细胞、FS4细胞、及人类肝肿瘤株(Hep G2)。
宿主细胞经用于产生抗-TrkB抗体的上述表达载体或克隆载体转化且在适当时经调节的常规营养物培养基中培养以便诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。
用于产生本文所述的抗-TrkB抗体的宿主细胞可在各种培养基中培养。诸如汉姆氏F10(Ham's F10)(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,Mo.)、基本必需培养基((MEM)，(Sigma-Aldrich Co.)、RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.)及达尔伯克氏改良的伊格氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM)，Sigma-Aldrich Co.)的市售培养基适用于培养宿主细胞。另外，Ham等人,1979,Meth.Enz.58:44；Barnes等人,1980,Anal.Biochem.102:255；美国专利号4,767,704、美国专利号4,657,866、美国专利号4,927,762、美国专利号4,560,655、美国专利号5,122,469、WO 90/103430及WO 87/00195中的一或多者中所述培养基中的任一者可用作用于宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一者可视需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙盐、镁盐及磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷及胸苷)、抗生素(诸如庆大霉素)、痕量元素(定义为通常以微摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)及葡萄糖或等效能量来源。还可以本领域技术人员已知的适当浓度包括其他补充剂。培养条件(诸如温度、pH及类似条件)是先前用于经选择用于表达的宿主细胞的培养条件，且对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可于细胞内、周质间隙中产生或直接分泌于培养基中。如果抗体于细胞内产生，则第一步可将细胞破坏以释放蛋白质。可例如通过离心或超滤去除微粒碎片，即，宿主细胞或溶解片段。Carter等人,1992,Bio/Technology 10:163-167描述分离分泌至大肠杆菌的周质间隙的抗体的程序。简言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺酰基氟(PMSF)存在下经约30min融化细胞浆料。可通过离心去除细胞碎片。在抗体分泌至培养基中的情形下，一般首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元)浓缩此类表达系统的上清液。在任何先前步骤中可包括诸如PMSF的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外来污染物生长。可使用各种方法从宿主细胞分离抗体。
自细胞制备的抗体组合物可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析及亲和层析进行纯化，其中亲和层析是典型纯化技术。蛋白质A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的物种及同种型。可使用蛋白质A纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(参见例如Lindmark等人,1983J.Immunol.Meth.62:1-13)。对于所有小鼠同种型及人γ3，均推荐用蛋白质G(参见例如Guss等人,1986EMBO J.5:1567-1575)。连接亲和配体的基质最常见的是琼脂糖，但其他基质是可用的。与琼脂糖可实现的相比，机械稳定性基质(诸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允许较快流动速率及较短处理时间。在抗体包含CH3域的情况下，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)适用于纯化。还可利用其他蛋白质纯化技术，诸如离子交换管柱上的部分分离、乙醇沈淀、逆相HPLC、二氧化硅层析、肝素SEPHAROSETM层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸管柱)层析、层析聚焦、SDS-PAGE及硫酸铵沈淀，这却取决于待回收的抗体而定。
在任何初步纯化步骤之后，包含感兴趣的抗体及污染物的混合物可经历使用2.5与4.5之间的pH下的洗脱缓冲液的低pH值疏水性相互作用层析，其通常在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下执行。
还包括在如本文所定义的低度、中度及高度严格条件下与所有或一部分(例如编码可变区的部分)由分离的多核苷酸序列表示的核苷酸序列杂交的核酸，所述分离的多核苷酸序列编码TrkB-抗体或抗体片段。杂交核酸的杂交部分的长度通常是至少15(例如20、25、30或50)个核苷酸。杂交核酸的杂交部分与编码抗-TrkB多肽(例如重链或轻链可变区)的一部分或所有核酸的序列或其互补序列至少80％，例如至少90％、至少95％或至少98％一致。可使用本文所述的类型的杂交核酸，例如作为克隆探针、引物，例如PCR引物或诊断探针。
在一些实施方案中，本发明包括有包括编码具有可变轻链及可变重链的抗体或抗体片段的序列的分离的多核苷酸，其中可变轻链氨基酸序列及可变重链氨基酸序列分别与SEQ ID NO:2及12、或3及13、或4及14、或5及15、或6及16、或7及17、或8及18、或9及19、或10及20的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致。
在一些实施方案中，本发明包括有包括编码具有可变轻链及可变重链的抗体或抗体片段的序列的分离的多核苷酸，其中可变轻链氨基酸序列及可变重链氨基酸序列分别与SEQ ID NO:21及22或23；24及25或26；27及28或29；30及31或32；33及34或35；36及37或38；39及40或41；42及43或44；45及46或47的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致。
应了解，在所述抗-TrkB抗体及抗体片段中，编码CDR的核酸序列保持不变(相对于其所编码的氨基酸不变，由于密码子的简并故DNA序列的等效物是可能的)，但周围区域(例如FR区)可经工程化。
非治疗用途
本文所述的抗体可用作亲和纯化剂。在此过程中，使用本领域中熟知的方法将抗体固定于诸如蛋白质A树脂的固相上。使固定的抗体与含有待纯化的TrkB蛋白质(或其片段)的样品接触，且此后用将去除样品中除TrkB蛋白质外的实质上所有物质的适合溶剂洗涤支撑物，该TrkB蛋白质结合至固定的抗体。最终，用将从抗体释放TrkB蛋白质的另一适合溶剂洗涤支撑物。
抗-TrkB抗体还适用于诊断分析中以检测和/或定量TrkB蛋白质，例如检测特定细胞、组织或血清中的TrkB表达。
在一些实施方案中，有利的是例如出于诊断性目的用可检测部分标记抗体。许多可检测标签均可获得，包括放射性同位素、荧光标签、酶底物标签等。可使用各种已知技术将标签与抗体间接缀合。举例而言，抗体可与生物素结合，且上文所提及的三大类别标签中的任一者可与抗生素蛋白缀合，反之亦然。生物素选择性结合至抗生素蛋白，且因此标识可以此间接方式与抗体结合。或者，为实现标签与抗体之间接缀合，可使抗体与小半抗原(诸如地高辛)缀合，且不同类型的上文所提及标签中的一者与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)结合。因此，可实现标签与抗体之间接缀合。
示例性放射性同位素标识包括35S、14C、125I、3H及131I。抗体可使用例如CurrentProtocols in Immunology,第1及2卷,1991,Coligen等人编,Wiley-Interscience,NewYork,N.Y.,Pubs.中所述的技术用放射性同位素标记。放射性可例如通过闪烁计数来测量。
示例性荧光标识包括衍生自稀土螯合物(铕螯合物)的标签，或可获得荧光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰基(dansyl)、丽丝氨(Lissamine)、藻红素(phycoerythrin)及德克萨斯红(Texas Red)。荧光标签可经由例如已知技术(诸如CurrentProtocols in Immunology,同上中所公开的技术)与抗体结合。荧光可使用荧光计定量。
存在本领域中已知的各种充分表征的酶底物标签(参见例如美国专利号4,275,149的综述)。酶一般催化显色底物的化学改变，该化学改变可使用各种技术测量。举例而言，改变可为可以分光光度法测量的底物的颜色变化。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。上文描述定量荧光变化的技术。化学发光底物通过化学反应以电子方式激发且然后可发射可使用例如化学发光仪测量的光，或为荧光受体供给能量。
酶标签的实例包括荧光素酶(诸如萤火虫荧光素酶及细菌荧光素酶)(美国专利号4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸盐脱氢酶、尿素酶、过氧化酶(诸如辣根过氧化酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖、淀粉酶、溶菌酶、醣氧化酶(诸如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶及黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化酶及其类似物。使酶与抗体缀合的技术描述于例如O'Sullivan等人,1981,Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use inEnzyme Immunoassay,Methods in Enzym.(J.Langone及H.Van Vunakis编),Academicpress,N.Y.,73:147-166中。
酶-底物组合的实例包括例如：辣根过氧化酶(HRPO)与作为底物的氢过氧化酶，其中氢过氧化酶氧化染料前体，诸如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)；碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯磷酸酯；及β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物(诸如对硝苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基香豆素基-β-D-半乳糖苷酶。
本领域技术人员可获得许多其他酶-底物组合。关于这类组合的一般综述，参见美国专利号4,275,149及美国专利号4,318,980。
在另一实施方案中，抗-TrkB抗体未标记地使用且用结合抗-TrkB抗体的经标记的抗体检测。
本文所述的抗体可用于任何已知分析方法，诸如竞争性结合分析、直接及间接夹心分析，及免疫沈淀分析。参见例如Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques,第147-158页(CRC Press,Inc.1987)。
诊断试剂盒
抗-TrkB抗体可用于诊断试剂盒中，即，预定量的试剂与用于进行诊断分析的说明书的封装组合。如果抗体用酶标记，则试剂盒可包括酶所需的底物及辅因子，诸如提供可检测的发色团或荧光团的底物前体。另外，可包括其他添加剂，诸如稳定剂、缓冲液(例如阻断缓冲液或裂解缓冲液)及其类似物。各种试剂的相对量可广泛变化以提供实质上使分析敏感性最佳的试剂溶液中的浓度。试剂可以干燥粉末(通常冻干)形式提供，包括在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。
治疗用途及TrkB相关病症
在另一实施方案中，本文公开的抗-TrkB抗体(或其功能片段)适用于治疗与表达如本文所述的TrkB相关的各种病症。
抗-TrkB抗体或其抗原结合片段通过任何适合手段施用，包括玻璃体内、经口、胃肠外、皮下、腹膜内、肺内及鼻内。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。另外，抗-TrkB抗体宜通过脉冲输注施用，尤其在抗体剂量递减的情况下施用。在一个方面中，可通过注射、最优选静脉内或皮下注射给药，这部分地取决于施用是短暂的还是长期的。优选地，抗-TrkB抗体经由玻璃体内注射至眼睛中给药。
对于疾病的预防或治疗，抗体的适当剂量将取决于各种因素，所述因素是诸如如上文所定义的待治疗的疾病的类型、疾病的严重度及疗程、是否出于预防或治疗目的而施用该抗体、先前疗法、患者的临床病史及对抗体的反应及主治医师的判断。一次性或历经一系列治疗向患者适当地施用抗体。
术语“抑制”在本文中在与“改善”及“缓解”相同的情形下使用，意指减轻或减少疾病的一或多个特征。
抗体组合物将以与良好医学实践一致的方式配制、给药及施用。在此情形中考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病状、病症起因、药剂递送部位、施用方法、施用时程及执业医师已知的其他因素。待施用抗体的“治疗有效量”将通过此类考虑因素控管，且是预防、改善或治疗与TrkB表达相关的病症所需的最少量。
抗体并非必须，而是任选地与一或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于存在于配制剂中的抗-TrkB抗体的量、病症或治疗的类型及如上文所述的其他因素。这类药剂一般以如上文所用的相同剂量及施用途径或迄今使用的剂量的约1％至99％使用。
本发明的激动性抗-TrkB抗体刺激TrkB信号传导。不希望受理论限制，认为TrkB信号传导有益于在视网膜中保护感光体、包括神经节细胞及视网膜色素上皮细胞的其他视网膜神经元以免细胞死亡。因此，激动性抗-TrkB抗体可保护视网膜神经元(诸如感光体)以免变性，即，预防神经变性，且还增加神经元存活率和/或可塑性，最终抵抗与TrkB活性降低和/或细胞应力或细胞凋亡活性增加相关的视觉损失。因此，抗体适用于治疗眼睛疾病或视网膜疾病，尤其神经退行性视网膜或眼睛疾病。此类疾病包含(但不限于)年龄相关性黄斑变性、地图状萎缩、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、色素性视网膜炎、遗传性视网膜萎缩、遗传性黄斑萎缩、近视性变性、视网膜静脉闭塞、视网膜动脉闭塞、内眼炎、葡萄膜炎、囊样黄斑部水肿、继发于任何视网膜疾病的脉络膜新生血管性膜、视神经病、青光眼、视网膜剥离、中毒性视网膜病、辐射性视网膜病及创伤性视网膜病。
此外，抗体适用于治疗中枢神经系统疾病，诸如前驱症状性及轻度至中度阿尔茨海默氏病，延缓患有阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、重度抑郁症、精神分裂症、与精神分裂症相关的认知障碍的患者的疾病进程，预防精神病综合征减弱的个体的首次发作性精神病，预防患有精神分裂症或耐治疗性抑郁症的患者复发。
在另一实施方案中，抗体可适用于治疗听力损失，尤其顺铂诱发的听力损失以及噪音及年龄相关性听力损失。
特别地，指示本发明的激动性抗-TrkB抗体用于治疗除标准护理以外的非增生性和/或增生性糖尿病性视网膜病变和/或糖尿病性黄斑水肿：视网膜神经元的功能障碍及神经退化是最终产生视觉损失及视觉功能障碍的糖尿病性视网膜病变及糖尿病性黄斑水肿中的主要病理性事件之一(在疾病的所有阶段)。TrkB活化将抵抗视网膜神经元的损失及功能损伤，且由此有助于维持正常视觉，以减少疾病期间视觉功能的损失且可有助于恢复视觉功能。
此外，可使用TrkB活化作为抗VEGF治疗的附加物，其将大大增强抗VEGF治疗的治疗益处，这是因为抗VEGF仅标靶眼睛中的血管功能障碍，而非神经元/神经胶质细胞系统；另外，长期抗VEGF治疗可产生神经退行性副作用。作为抗VEGF的附加物的TrkB活化方法将减少此类神经退行性副作用。
抗-TrkB抗体或其抗原结合片段尤其适用于治疗或预防视网膜病症，诸如糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、地图状萎缩及青光眼。
在另一方面中，抗-TrkB抗体或其抗原结合片段还有用于治疗代谢疾病，诸如摄食过量、肥胖症及代谢综合征。
在另一方面中，本发明的TrkB抗体可用于治疗和/或预防TrkB相关病症、尤其地图状萎缩的方法中，其包括向罹患地图状萎缩的个体施用治疗有效量的本发明的TrkB抗体，由此改善地图状萎缩的一或多种症状。
在又一方面中，激动性TrkB抗体可用于治疗和/或预防地图状萎缩的方法中，其包括向罹患地图状萎缩的个体施用治疗有效量的激动性TrkB抗体，由此改善地图状萎缩的一或多种症状。
药物组合物及其施用
可向患有眼睛或视网膜疾病或有患眼睛或视网膜疾病风险的个体施用包含抗-TrkB抗体或其抗原结合片段的组合物。本发明进一步提供抗-TrkB抗体或其抗原结合片段在用于制造用以预防或治疗TrkB疾病的药剂中的用途。如本文所用，术语“个体”意指可施用抗-TrkB抗体或其抗原结合片段的任何哺乳动物患者，包括例如人类及非人类哺乳动物，诸如灵长类动物、啮齿动物及犬。特定意欲使用本文所述方法治疗的个体包括人。抗-TrkB抗体或其抗原结合片段可单独或与其他组合物组合施用。
用于此类药物组合物的优选抗体是包含分别具有SEQ ID NO:2及12、或3及13、或4及14、或5及15、或6及16、或7及17、或8及18、或9及19、或10及20的可变轻链及可变重链氨基酸序列的人源化抗体或抗体片段的抗体。
还涵盖用于此类药物组合物的抗体，该抗体包含可变轻链及可变重链氨基酸序列分别与SEQ ID NO:2及12、或3及13、或4及14、或5及15、或6及16、或7及17、或8及18、或9及19、或10及20的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的人源化抗体或抗体片段。
用于此类药物组合物中的进一步优选的抗体是包含分别具有SEQ ID NO:21及22或23；24及25或26；27及28或29；30及31或32；33及34或35；36及37或38；39及40或41；42及43或44；45及46或47的轻链及重链氨基酸序列的人源化抗体或抗体片段的抗体。
用于此类药物组合物中的进一步优选的抗体包含人源化抗体或抗体片段，该人源化抗体或抗体片段具有分别与SEQ ID NO:21及22或23；24及25或26；27及28或29；30及31或32；33及34或35；36及37或38；39及40或41；42及43或44；45及46或47的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％一致的轻链及重链氨基酸序列。
应了解，在所述抗-TrkB抗体及抗体片段中，CDR的氨基酸序列保持不变，但周围区域(例如FR区)可经工程化。
已知各种递送系统且可用于施用抗-TrkB抗体或其抗原结合片段。引入方法包括(但不限于)玻璃体内、滴眼剂、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外及经口途径。抗-TrkB抗体或其抗原结合片段可例如通过输注、推注或注射施用，且可与其他生物活性剂一起施用。可全身或局部施用。在优选的实施方案中，通过玻璃体内注射施用。用于此类注射的配制物可以例如预填充注射器制备。
抗-TrkB抗体或其抗原结合片段可以包含治疗有效量的抗-TrkB抗体或其抗原结合片段及一或多种药学上可相容的成分的药物组合物施用。
在典型的实施方案中，根据常规程序将药物组合物配制成适用于向人类静脉内或皮下施用的药物组合物。通常，通过注射施用的组合物是含于无菌等张水性缓冲液中的溶液。必要时，药物还可包括助溶剂及局部麻醉剂(诸如利多卡因)以减轻注射部位的疼痛。一般而言，该成分是单独提供或混合形成单位剂型，例如在指示活性剂量的气密密封式容器(诸如安瓿或药囊)中的干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。当通过输注施用药物时，其可使用含有无菌医药级水或生理食盐水的输注瓶来配药。当通过注射施用医药物时，可提供注射用无菌水或生理食盐水的安瓿，以便于施用前先混合成分。
此外，药物组合物可作为药物试剂盒提供，该药物试剂盒包含(a)含有以冻干形式的抗-TrkB抗体或其抗原结合片段的容器及(b)含有注射用药学上可接受的稀释剂(例如无菌水)的第二容器。可使用药学上可接受的稀释剂复水或稀释冻干抗-TrkB抗体或其抗原结合片段。此类容器可任选地与注意事项说明组合，其是以政府机构所规定管理药物或生物产品的制造、使用或销售的形式，该注意事项说明反映已由该机构批准制造、使用或销售用于人施用药。
有效治疗或预防TrkB相关病症的抗-TrkB抗体或其抗原结合片段的量可通过标准临床技术测定。另外，可任选地采用活体外分析来帮助鉴别最佳剂量范围。配制剂中所采用的精确剂量还将取决于施用途径及病症的阶段，且应根据执业医生的诊断及各患者的情况决定。可从来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线外推出有效剂量。
举例而言，抗-TrkB抗体或其抗原结合片段的毒性及治疗功效可通过标准药物程序，在细胞培养物或实验动物中测定，用于确定ED50(有效治疗50％群体时的剂量)。展现高治疗指数的抗-TrkB抗体或其抗原结合片段是优选的。
自细胞培养物分析及动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。抗-TrkB抗体或其抗原结合片段的剂量通常处于包括具有极小或不具有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可根据所采用剂型及所用施用途径而在此范围内变化。对于方法中所用的任何抗-TrkB抗体或其抗原结合片段，治疗有效剂量最初可由细胞培养物分析估计。可在动物模型中配制剂量以达成包括如在细胞培养物中所测定的IC50(即，达成症状的一半最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用以更准确地确定适用于人的剂量。可例如通过高效液相层析、ELISA及其类似方法测量血浆中的水平。
对于TrkB抗体的玻璃体内注射，优选的是治疗之间的时间间隔一般较长。由于其效力改良，故本发明的TrkB抗体可以以较长时间间隔施用。
在一个实施方案中，每6周，优选每7周，还优选每8周，进一步优选每9周，更优选每10周，进一步优选每11周，且更优选每12周施用TrkB抗体。在另一优选实施方案中，每3个月一次施用TrkB抗体。
在一实施方案中，向有需要个体施用初始剂量是1-2000mg的TrkB抗体。在另一实施方案中，施用任选地存在的一或多种后续剂量，其各自包含1-2000mg TrkB抗体。
因为严格限制可向眼睛施用的体积，其极重要的是可将抗-TrkB抗体配制至高浓度。此外，抗-TrkB抗体的效力极其重要，因为有效抗体在甚至更低的剂量下仍可发挥其作用，且由此延长活性以及治疗之间的时间间隔。
可将本发明的抗体配制至极高剂量，其包括(但不限于)20mg/ml、30mg/ml,、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。
可施用至患者的典型剂量是每个眼睛约3mg。可用于此类配制剂的典型缓冲液组分包含例如乙酸钠、PS20及二水合海藻糖。
在一个实施方案中，抗-TrkB抗体用10mM组氨酸缓冲液、240mM蔗糖、0.02w/v％聚山梨醇酯20(pH 5.5)配制，其中最终蛋白质浓度是60mg/mL。
在一些实施方案中，包含抗-TrkB抗体或其抗原结合片段的药物组合物可进一步包含缀合或未缀合至结合剂的治疗剂。抗-TrkB抗体或其抗原结合片段可组合一或多种治疗剂共同施用以用于治疗或预防TrkB相关的疾病。举例而言，组合疗法可包括抗-VEGF、抗-PDGF或抗-ANG2。
此类组合疗法施用对疾病参数(例如症状的严重程度、症状数目或复发频率)可具有累加或协同作用。
关于用于组合施用的治疗方案，在一特定实施方案中，将抗-TrkB抗体或其抗原结合片段与治疗剂同时施用。在另一特定实施方案中，治疗剂在施用抗-TrkB抗体或其抗原结合片段之前或之后至少一小时及至多若干个月施用，例如在施用抗-TrkB抗体或其抗原结合片段之前或之后至少一小时、五小时、12小时、一天、一周、一个月或三个月。
制品
在另一方面中，包括含有适用于治疗上文所述病症的物质的制品。制品包含容器及标签。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器及试管。容器可由各种材料形成，诸如玻璃或塑胶。容器保存有效治疗病状的组合物且可具有无菌接取口。举例而言，容器可为具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。组合物中的活性剂是抗-TrkB抗体或其抗原结合片段。容器上或与容器相关联的标签指示该组合物用于治疗所选病状。制品可进一步包含第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可以进一步包括从商业及使用者的观点来看所需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器及带有使用说明书的包装插页。
在以下实施例中进一步描述了本发明，其并不旨在限制本发明的范畴。
实施例
1.抗体产生(免疫接种)
使用内部研发的单一B细胞平台技术使来自经由免疫接种操作的小鼠的B细胞经历筛选。抗-TrkB结合子在TrkB体外磷酸化分析中测试活性、功效及效力之后进一步变窄。
2.产生人源化抗体
选择鼠类前导D003以进一步优化。鼠类前导具有与SEQ ID NO:1对应的可变轻链及与SEQ ID NO:11对应的可变重链。
为使TrkB鼠类前导D003序列最佳化，选择最类似的人种系抗体序列，对于轻链是IGKV4-1*01,KJ2，且对于重链是IGHV1-46*03,HJ6。产生变体文库。由此产生SEQ ID NO:2-10的人源化轻链可变序列及SEQ ID NO:12-20的重链可变序列。
表2：
277-gr_VL，(人源化)可变轻链 SEQ ID NO:2
277-33_VL：(人源化)可变轻链 SEQ ID NO:3
277-35_VL：(人源化)可变轻链 SEQ ID NO:4
277-42_VL，(人源化)可变轻链 SEQ ID NO:5
277-44_VL，(人源化)可变轻链 SEQ ID NO:6
277-48_VL，(人源化)可变轻链 SEQ ID NO:7
277-51_VL，(人源化)可变轻链 SEQ ID NO:8
277-64_VL，(人源化)可变轻链 SEQ ID NO:9
277-67_VL，(人源化)可变轻链 SEQ ID NO:10
277-gr_VH，(人源化)可变重链 SEQ ID NO:12
277-33_VH：(人源化)可变重链 SEQ ID NO:13
277-35_VH：(人源化)可变重链 SEQ ID NO:14
277-42_VH，(人源化)可变重链 SEQ ID NO:15
277-44_VH，(人源化)可变重链 SEQ ID NO:16
277-48_VH，(人源化)可变重链 SEQ ID NO:17
277-51_VH，(人源化)可变重链 SEQ ID NO:18
277-64_VH，(人源化)可变重链 SEQ ID NO:19
277-67_VH，(人源化)可变重链 SEQ ID NO:20
本发明的示例性人源化抗体是具有如下表中所示的轻链及重链序列的人源化抗体。IgG1-KO在Fc区中具有两个突变Leu234Ala及Leu235Ala以降低效应功能。
表3：
/>
3.抗表位资讯
物质
水(Sigma Aldrich，P/N 37877-4L)
乙腈(Sigma Aldrich，P/N 34998-4L)
甲酸(Fluka，P/N 94318)
脲(Sigma Aldrich，P/N 51456-500G)
TCEP-HCl-10g(Thermo Scientific-Pierce，P/N 20491)
磷酸氢二钠(Sigma Aldrich，P/N S7907-100G)
磷酸二氢钠(Sigma Aldrich，P/N S8282-500G)
ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard前置管柱，1.7μm，2.1mm×5mm(WatersTechnologies Corp，186003975)
固定胃蛋白酶柱，2.1mm×30mm(Life Technologies Corp，2313100)
Acquity UPLC BEH C18管柱，1.7μm，1mm×50mm(Waters，186002344)
溶剂A：0.1％甲酸/99％水/1％乙腈
溶剂B：0.1％甲酸/5％水/95％乙腈
水缓冲液：H2O 10mM磷酸钠，pH 7.4
氘缓冲液：D2O 10mM磷酸钠，pH 7.4
淬灭缓冲液：8M脲水溶液，0.4M TCEP-HCl
在表位定位对照样品中，抗原在有及无抗体下运作。为确定抗原肽的清单，首先使用水缓冲液取代氘缓冲液运作此方案。将4μL样品与40μL氘缓冲液混合。在20℃下孵育此混合物多个时间点(1、2及4分钟)。然后将40μL混合物转移至40μL 4℃淬灭缓冲液(4M脲，0.4MTcep-HCl)中且混合。注射60μL淬灭的蛋白质，其中其经胃蛋白酶管柱通过流动200μL/mL的溶剂A：0.1％甲酸/99％水/1％乙腈消化2分钟。后续肽经Vanguard前置管柱去盐3分钟。将胃蛋白酶肽递送至管柱/阀门温度控制的腔室内的BEH C18反相管柱。利用由溶剂A：0.1％甲酸/99％水/1％乙腈及溶剂B：0.1％甲酸/5％水/95％乙腈组成的梯度溶剂系统。溶剂B的百分比在5.1分钟由10％增至15％，在11分钟增至50％，在11.5分钟增至90％，保持至12.5分钟，在13分钟达至0％B，保持至14分钟。层析分离在4℃下在180μl/min的流动速率下进行。在层析分离之后，样品进入以阳性电喷雾电离模式操作的Thermo ScientificOrbitrap Fusion质谱仪中。所用方法包括鉴别对照肽时CID及ETD的活化类型，利用120,000的解析度、10,000的最小信号、1.0的分离宽度及35.0V的标准化碰撞能量。S型透镜RF水平设定为60％。对于对照肽，数据收集类型是全MS扫描的特征曲线及CID MS/MS数据的形心曲线。对于氘化样品，不收集MS/MS。收集280-1800Da的质量范围上的数据。对于原始LC-MS/MS片段数据分析，使用Proteome Discover 1.4(Thermo Scientific)及PMi Byonic(Protein Metrics)相对于既定序列分析对照样品(在CID及ETD MS/MS下)，以产生一系列肽及保留时间。使用专用内部SHARC软体预处理原始数据文件且转换为ASCII形式。然后，使用专用内部SHAFT软体匹配鉴别的肽并概述。通过在氘标记之后由结合诱导的平均质量变换差确定表位。在肽水平上，大于0.4Da的保护视为显著。
BDNF、277-抗体、(C2)(US20100196390)及(C20)(US20100150914)的表位定位的结果示于图1中。各分子与具有SEQ ID NO:54的人TrkB的细胞外域的特异性结合位点以暗灰色突出显示。与天然配体BDNF相比，277-抗体结合至不同新颖表位。
4.CDR中的序列可靠性
检验CDR的序列存在任何可能的可靠性，诸如N-糖基化位点、强脱酰胺化基序(NG、NS、NH、NA、ND、NT、NN)、天冬氨酸异构化基序(DG)、片段基序(DG、DS)、半胱氨酸。这些氨基酸或基序可经历化学反应且赋予产物以不合需要的异源性，还存在不利地影响标靶结合及功能的可能性。出于这些原因，优选从CDR移除此类氨基酸或基序(若存在的话)。
小鼠前导及人源化序列的CDR不含此类潜在的可靠性基序。
表4
抗体 D003/277 C2 C20 29D7或TAM-163
可靠性 0 2 3 6
5.免疫原性
用经由公司Epivax的许可提供的算法以电脑模拟方式评估序列的免疫原性。EpiMatrix Treg-adj评分考虑T细胞表位及Treg表位。免疫原性评分越低，序列越不可能具有免疫原性。一般而言，负评分视为免疫原性风险低，而正评分视为潜在的免疫原性的指示。
表5：
6.亲和力：
使用表面等离子共振(SPR)技术测定277-抗体、C2(US20100196390)及C20(US20100150914)及TAM-163(WO2015173756)与Hu-TrkB-His的结合亲和力。在ProteOnXPR36仪器上进行实验。
方法：此实验的运作缓冲液及所有稀释液(除所陈述外)由具有0.01％Tween20的PBS-T-EDTA[将100μl 100％Tween20添加至2L PBS-T-EDTA中得到最终0.01％的Tween 20浓度]实现。GLM传感器芯片根据制造商的建议标准化及预调节。传感器芯片在水平方向用30μl/min的流动速率的EDC/s-NHS的等量混合物活化300秒，且在水平方向用30μl/min的流动速率的重组蛋白A/G(于10mM乙酸盐(pH 4.5)中的60μg/ml)固定300秒，在表面上产生约7100-7130RU的蛋白质A/G。传感器芯片在水平方向用30μl/min的流动速率的1M乙醇氨盐酸盐去活化300秒。传感器芯片用100μl/min的流动速率的0.85％磷酸稳定18秒，水平方向3次及竖直方向3次。277-抗体(0.6μg/ml)、C2(2.1μg/ml)、C20(1.2μg/ml)及TAM-163(5μg/ml)在30μl/min的流动速率下在蛋白质A/G表面上竖直地捕捉70秒，分别产生约615、1390、780及3380RU的捕捉水准。基线如下进行稳定：通过以100μl/min的流动速率水平注射PBS-T-EDTA 60秒，且然后水平方向上第二次注射流动速率100μl/min的PBS-T-EDTA 60秒及解离120秒。将分析物(Hu-TrkB-His)以30μl/min的流动速率水平注射于捕捉的抗体上600秒且解离1800秒。分析物的浓度是0nM、1.23nM、3.7nM、11.11nM、33.33nM及100nM。通过以100μl/min的流动速率注射0.85％磷酸18秒，水平方向一次及竖直方向一次而再生表面。以100μl/min的流动速率注射PBS-T-EDTA 60秒，竖直方向一次。从原始数据减去点间(与感测器表面的相互作用)及空白(具有0.01％Tween20或0nM分析物的PBS-T-EDTA)。然后将感测器图谱全部拟合1:1朗格缪尔结合，以提供缔合速率(ka)、解离速率(kd)及亲和力(KD)数值。
277-抗体结合至Hu-TrkB-His的ka是1.93×105 1/Ms、kd是3.51×10-4 1/s且KD是1.2nM。C2结合至Hu-TrkB-His的ka是2.32×104 1/Ms，kd是3.39×10-4 1/s，且KD是10.5nM。C20结合至Hu-TrkB-His的ka是1.29×105 1/Ms，kd是6.13×10-3 1/s，且KD是47.7nM。TAM-163不结合至100nM Hu-TrkB-His。
表6：
7.非特异性结合：
使用生物感测器技术研发非特异性结合分析以测定新生物性实体(NBE)候选者是否显著结合至不相关带电蛋白质。在此分析中，将抗体传递于两个SPR表面上，一个表面涂布有不相关带负电蛋白质且一个表面涂布有不相关带正电蛋白质。当NBE候选者展示显著非特异性结合至这些表面时，结合的原因可为候选者上存在带正电或带负电表面补片。NBE候选者的非特异性结合可转变为不佳药物动力学(PK)及生物分布，且还可在下游可制造性上有影响。此分析的结果用于项目特别风险评定的情况下。分析的目的是为了降低不佳PK的风险、缺少组织目标分布及下游制造困难。
目标是测定通过收集277-抗体的结合传感器图谱及将其与对照的结合传感器图谱比较277-抗体是否展现非特异性结合，以使非特异性结合类别归属于有利(绿色)、可接受(黄色)不利(红色)的。
方法：
在Biacore T200上进行实验。在25℃下，在由10×HBS-EP制备的1×HBS-EP缓冲液中执行稀释、表面制备及结合实验。固定化方案及结合实验的流动速率为5μL/min。
为制备用于非特异性结合实验的表面，使用氨偶合试剂盒根据制造说明书将鸡蛋白溶菌酶及来自大豆的1-S型胰蛋白酶抑制剂手动偶合至S系列CM5芯片，其中表面密度是3000-5000RU。通过注射EDC及NHS的1:1混合物7min来活化FC1及FC2。在FC2上通过注射于10mM NaOAc(pH 5.5)中的150μg/mL鸡蛋白溶菌酶5min来制备鸡蛋白溶菌酶表面。通过注射1M乙醇胺盐酸盐7min去活化FC1及FC2。FC1用作参考表面。FC3通过注射EDC及NHS的1:1混合物7min来活化。在FC3上通过注射于10mM NaOAc(pH 4.0)缓冲液中的300μg/mL来自大豆的1-S型胰蛋白酶抑制剂20min，之后注射1M乙醇氨盐酸盐7min以去活化流通槽来制备来自大豆的1-S型胰蛋白酶抑制剂表面。将抗-溶菌酶多克隆抗体、抗-胰蛋白酶抑制剂抗体及BI阴性对照用作分析中的对照。用1×HBS-EP缓冲液制备1μM的对照及抗体。将样品注射于FC1、FC2及FC3表面上，其中缔合10min且解离15min。在各结合循环之间表面如下被再生：以50μL/min的流动速率注射0.85％磷酸1min及50mM NaOH 30s，之后是使1×HBS-EP缓冲液流动于所有表面之上的2min稳定期。在实验开始及结束时，将抗-溶菌酶多株抗体及抗-胰蛋白酶抑制剂抗体注射于FC1、FC2及FC3之上。使用2.0.1版Biacore T200控制软件收集数据，使用3.0版Biacore T200评估软件分析数据。
使抗体的结合传感器图谱与BI阴性对照传感器图谱相比以确定与鸡蛋白溶菌酶及来自大豆的1-S型胰蛋白酶抑制剂表面的非特异性结合的程度。
数据显示277-抗体不显著结合至不相关带电蛋白质；具体是鸡蛋白溶菌酶及来自大豆的1-S型胰蛋白酶抑制剂。当相对于对照比较结合反应及曲线形状时，277-抗体被归类为有利的(绿色)。因此，基于带电物种的脱靶效应，假定277-抗体在药物动力学、生物分布及制造上风险极小。
表7：
样品 约4400RU溶菌酶表面 约2300RU胰蛋白酶抑制剂表面
抗-TRKB 277抗体 不结合 不结合
8.效力(SY5Y)及功效
SH-SY5Y细胞分化成神经元表达型
SH-SY5Y(CRL-2266TM)细胞在175cm2组织培养烧瓶(Corning编号353112)中用具有15％胎牛血清的DMEM:F12(Lonza编号BE12-719F)培养。对于细胞接种，烧瓶用D-PBS(Lonza编号17-512Q)洗涤一次且用37℃预温热的Accutase溶液(A6964 SIGMA)分离细胞。在室温下孵育3min之后，细胞可用10ml移液管分出且转移至15ml Falcon管道中。对细胞计数，且将在100μl具有15％FBS的DMEM:F12中的6000个细胞接种于经胶原蛋白-I涂布的96孔盘(BD Biosciences编号354407)中。在增湿孵育箱中在37℃、5％CO2下维持细胞。在8小时之后，将100μl的6μM视黄酸的溶液(Sigma编号R2625)添加至各孔中。最终视黄酸浓度是3μM。在48小时及96小时之后，需要额外视黄酸刺激。为此目的，区除每孔100μl培养基且添加100μl具有6μM视黄酸的新鲜培养基。在分化7天之后，SH-SY5Y细胞具有多巴胺能样表型且准备使用。/>
分化的SH-SY5Y细胞的刺激及裂解
来自孔的培养基用80μl具有0.2％BSA的预温热的DMEM-F12交换。在室温下孵育该板15min。用具有0.2％BSA的DMEM-F12稀释肽及抗体。所有稀释液用低结合尖端、管及板制备。通过在室温下添加20μl对应肽/抗体维持45min来刺激细胞。在孵育时间期间，在15mlFalcon管中在冰上制备细胞裂解缓冲液：1ml 10×Triton X-100溶解缓冲液、8.7ml H2O、1个完全小蛋白酶抑制剂片剂、100μl磷酸酶抑制剂混合液2、100μl磷酸酶抑制剂混合液3、100μl 1mM PMSF。在细胞刺激之后，去除培养基且每孔添加30μl冰冷溶解缓冲液。该板覆有顶部密封件且于冰上孵育20min。之后，该板在Eppendorf盘振荡器上在500rpm下混合5min。
对于此步骤，所有物质及溶液储存于冰上。具有裂解的细胞的96孔板以235g离心10s，且储存于冰上。AlphaLISA免疫分析缓冲液(PerkinElmer编号AL000C)通过用2340μlH2O稀释260μl 10×储备溶液来制备。pNTRK2受体珠粒(PerkinElmer编号CUSM81822；通过Perkin Elmer经来自CellSignaling CST编号4621克隆C50F3的抗体涂布的珠粒)用AlphaLISA免疫分析缓冲液稀释至10μg/ml的最终浓度。NTRK2生物素抗体(PerkinElmer编号CUSM81820；通过Perkin Elmer用来自CellSignaling CST编号4609克隆C17F1的抗体标记)用AlphaLISA免疫分析缓冲液稀释至1nM的最终浓度，且抗生蛋白链菌素供者珠粒(PerkinElmer编号6760002S)用AlphaLISA免疫分析缓冲液稀释至20μg/ml的最终浓度。将每孔5μl pNTRK2受体珠粒及2.5μl细胞裂解物转移至白色小体积384孔板(Greiner编号784075)中，且以235g离心10s，且在室温下在黑暗中储存45min。在孵育之后，每孔添加2.5μl NTRK2生物素抗体，且以235g离心板10s，且在室温下在黑暗中储存45min。最终，每孔添加2.5μl抗生蛋白链菌素供体珠粒，且以235g离心板10s，且在室温下在黑暗中储存30min。之后即刻，用EnVision盘读取器使用AlphaScreen方案(滤波器，570nm，编号244，及光镜，编号444)测量板。
ERK1/2磷酸化的测定
根据制造商方案(AlphaScreen SureFire p-ERK 1/2(Thr202/Tyr204)试剂盒(PerkinElmer编号TGRES10k))用8μl细胞溶解物执行ERK 1/2(Thr202/Tyr204)磷酸化的测量
AKT1/2/3磷酸化的测定
根据制造商方案((AlphaScreen SureFire p-Akt 1/2/3(Thr308)试剂盒(PerkinElmer编号TGRA3S10K))用8μl细胞溶解物执行AKT1/2/3(Thr308)磷酸化的测量。
分析本发明的若干TrkB抗体的活化TrkB以及起始下游信号传导的效力。还包括天然配体BDNF及抗体C2及C20。本发明的TrkB抗体活化TrkB的效力是天然配体BDNF的平均十倍。与抗体C2及C20相比，本发明的TrkB抗体的效力是平均三倍至十五倍。下游信号传导p-ERK及AKT1/2/3与TrkB活化的这些测量值完全一致，且显示本发明的TrkB抗体的类似改良效力。
表8:
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9.基因表达
分化的SH-SY5Y细胞在用若干TrkB激动性剂刺激之后执行下一代测序分析(数据未示出)。为了验证结果，根据突触可塑性选择大多数经调节的基因，且之后再经由qPCR分析变化。ARC、VGF、EGR1是突触可塑性的已知标记。突触可塑性是特定模式的突触活性引起突触强度变化的过程。在图2中，用BDNF或激动性抗体刺激分化SH-SY5Y细胞增加ARC、VGF、EGR1mRNA表达量，其可为突触可塑性增加的标记。NTRK2的mRNA表达不受用BDNF或激动性抗体刺激影响。通过BDNF及D003诱导的表达模式的变化总体上极类似。这些结果证实来自下一代定序分析的数据。
具体地，使SH-SY5Y细胞在6孔细胞培养板(SIGMA编号Corning CLS3516)中分化7天。在分化之后，在增湿孵育箱中，在37℃、5％CO2下，细胞在具有0.2％BSA的无血清DMEM:F12中用对照IgG[10nM]、BDNF[10nM]及D003[10nM]刺激6小时。之后，细胞用预温热的1×D-PBS洗涤一次，且遵循制造商说明书(Qiagen编号74104RNeasy微型试剂盒)执行mRNA分离。遵循制造商说明书(Qiagen编号205310QuantiTect Rev.转录试剂盒)执行mRNA至cDNA的转录。将cDNA用于经7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)基于5'核酸酶探针(ThermoFischer Scientific)的TaqMan实时PCR分析。根据ACTB的CT值(CT＝18.18)计算ΔCT值。
来自ThermoFischer Scientific的TaqMan基因表达分析：
ACTB-肌动蛋白β：Hs01060665_g1；目录号4331182
NTRK2-神经营养受体酪氨酸激酶2：Hs00178811_m1；目录号4331182
ARC-活性调节的细胞骨架相关蛋白质：Hs01045540_g1；目录号4331182
VGF-诱导性神经生长因子：Hs00705044_s1，目录号4331182
EGR1-早期生长反应1：Hs00152928_m1；目录号4331182
10.兔玻璃体内(ivt)药物动力学研究
使新西兰白色雌性兔(New Zealand White female rabbit)(体重1.7-2公斤)在研究开始之前适应>15天。制备20mg/mL的无菌抗体277且将1mg(在50μL缓冲液(60mM乙酸钠、150mM NaCl，pH 5.0)中)两侧注射至麻醉的动物的玻璃体中。在各个时间点，将2个动物安乐死且收集由眼房水、玻璃体及视网膜组成的眼部组织且冷冻待分析。在各个时间点获取血液样品(图3)，离心且冷冻血浆待分析。
通过ELISA执行抗体的量化。对于各组织类型，用与样品相同的缓冲液制备抗体(一式三份，在0.5-100ng/mL的范围内)的校准曲线且包括于各板中。使用SpectraMax340PC-384光度计测量405nm的吸收且使用SoftMaxPro6.5执行数据分析。
277-抗体的浓度描绘于图3中，其显示在将1mg 277-抗体玻璃体内注射至兔眼中之后随时间而变的所示各眼室及血浆中的浓度。计算的眼部及血浆半衰期列于下表中。
表9：
玻璃体、眼房水、视网膜及血浆中的计算的半衰期分别是4.9、4.8、5.2及7.0天。这些半衰期与文献中针对临床所用重组人源化单株IgG1抗体阿瓦斯汀(Avastin)(抗VEGF，贝伐单抗(bevacizumab)，Bakri等人,Opthalmology,2007)所报导的半衰期类似，此情况还以内部实验方式证实。这些结果是如所预期的，因为全长IgG的玻璃体内消除率主要取决于其分子大小，我们的抗体277及阿瓦斯汀的消除率类似。因此，预期抗体277及阿瓦斯汀的人PK(包括眼部半衰期)是类似的。阿瓦斯汀的报导的人眼部半衰期是9.73±1.48天(Hutton-Smith,2016)。
11.IgG1抗体的玻璃体内注射频率
基于药物动力学研究中所获得的活体内数据(实施例10)以及SH-SY5Y细胞中所获得的效力数据，根据关于生物分子的眼部消除率的公认一腔室动力学研究且计算了IgG1抗体的人眼部PK(随时间推移的玻璃体浓度)。对于计算，使用以下参数：如针对阿瓦斯汀所报导的以及通过实施例10中所示的体内数据支持的人眼部半衰期t1/2＝10天；全长IgG1抗体的分子量149KDa；及玻璃体内注射的抗体的量1mg(参见图4)。由于眼部PK主要由分子量驱动，所以对于所有五种抗体获得相同的眼部PK绘图。
为估计玻璃体内注射频率，假定在玻璃体浓度≥细胞EC50下可维持体内功效，如在SH-SY5Y细胞中由TrkB磷酸化分析所测定的(实施例8)。在图4中，玻璃体内注射后达到玻璃体浓度等于EC50的时间通过箭头指示。基于此考虑因素，对于各抗体，在注射1mg抗体之后达到此类玻璃体浓度的时间概述于下表中：
表10：
举例而言，在将1mg C2注射至人眼中之后，与C2的EC50对应的玻璃体浓度(表10)在136天之后达到(即，在136天之后，将需要下一次玻璃体内注射)。为进行比较，在277-64(IgG1)的情况下，此时间将延伸至玻璃体内注射后150天。在此情况下，在对于C2后14天需要下一次玻璃体内注射。达到最小有效剂量值高达EC50的10倍的目标将减少玻璃体内注射之间的时间，然而，C2与以上表10中所列的其他抗体之间的注射频率的时间差将保持相同。
严格限制可向眼睛施用的注射量。同时，在眼睛中需要重复注射以治疗眼睛病状。改良抗体的半衰期是一种延长注射时间间隔之间的时间的方式，但如所提及，主要通过分子的分子量驱动。如实施例10中体内及实施例8中的SH-SY5Y细胞中所示，通过提供改良且更有效的抗体注射，可延长时间间隔，从而服务于眼睛中需要接受较不频繁注射的患者。
12.STZ诱发的糖尿病性大鼠中激动性TrkB抗体的神经保护性及神经再生性作用
277-抗体均不具有啮齿动物交叉反应性，因此用TrkB活化抗体C2作为替代工具抗体执行体内概念验证及功效研究，以验证如下假定：TrkB活化方法i)提供神经保护(‘神经保护性方法’)，和ii)使功能异常神经元/电路再活化(‘再生方法’)。两种方法阐述于若干研究中。作为动物疾病模型，利用链脲霉素(STZ)诱发的糖尿病性大鼠模型，其特征在于胰脏β细胞的损失、低胰岛素含量、稳定高血糖症及因此的视网膜中的神经元功能障碍。
动物研究
从Charles River(德国)获得雄性棕色挪威大鼠(Male Brown Norway rat，BN大鼠)。动物以2个一组圈养于控制温度及湿度条件下的具有12小时光/暗循环(在下午6点与上午6点之间灯熄灭)的IVC中。其任意喂食来自Provimi Kliba(Switzerland)的3438号粒状膳食且自由接近自来水。在研究开始之前，使动物适应其环境一周。在研究的一生阶段开始时，大鼠年龄是6-8周。通过腹膜内注射STZ(65毫克/公斤体重；Sigma编号S0130-1G)诱发高血糖症。在STZ施用后第5天，无反应或反应不良的动物不包括于研究中，即，血糖浓度<20mM的动物。有规律地监测体重及血糖含量。在STZ施用后第36天，通过单次玻璃体内注射C2(50μg，4.6μL)或对照抗体抗-2,4,6-三硝基苯基(抗-TNP)(50μg，4.5μL)给药动物。经由视网膜电图描记(ERG)记录评定视网膜功能，且在最终记录之后通过过度剂量的腹膜内施用的戊巴比妥(pentobarbital)处死动物。
给药及玻璃体内注射
研究概述描绘于图5中。对于玻璃体内注射，用2.5-3％异氟醚(Forene；Abbvie)麻醉大鼠。一滴4mg/ml盐酸奥布卡因(oxybuprocainhydrochlorid)(Novesine；Omnivision)作为表面局部麻醉施用。将4.6μL C2储备溶液(10.9mg/mL；缓冲液：20mM柠檬酸钠、115mMNaCl，pH 6.0)玻璃体内注射至高血糖大鼠的各眼睛中(第3组，n＝24个眼睛，图5)，产生约50微克/眼睛的注射剂量。作为对照，将4.5μL抗-抗-2,4,6-三硝基苯基储备溶液(11.2mg/mL；缓冲液20mM柠檬酸钠、115mM NaCl，pH 6.0)玻璃体内注射至非糖尿病性及糖尿病性对照大鼠的眼睛中(第1组，n＝24个眼睛，及第2组，n＝22个眼睛，图5)，产生约50微克/眼睛的注射剂量。在解剖显微镜下执行玻璃体内注射。用34号针刚好在角膜缘之后将抗体溶液递送(安装于10μl Hamilton玻璃注射器上)至玻璃体中，且注射的通用质量通过眼底检查法(使用Micron IV视网膜成像显微镜，Phoenix Research Labs)控制。
视网膜电图描记
视网膜电图描记(ERG)是评定不同视网膜神经元的光诱导的电活动的非侵袭性电生理技术，且允许定量视网膜功能的不同方面，诸如弱光或色觉。使用Espion E3 ERG记录系统(Diagnosys LLC)将ERG测量为角膜与参考电极之间的电势变化。在ERG记录的前，使动物暗适应至少2小时，且通过腹膜内注射氯胺酮(Ketanest，约100mg/kg)及赛拉嗪(xylazin)(Rompun，约5mg/kg)来麻醉。将动物置放于加热台上以维持体温恒定于37℃。用1％环戊通-HCl(cyclopentolate-HCl)及2.5％苯肾上腺素使光瞳扩张。在记录期间将一滴2％美多秀(Methocel)2％溶液(OmniVision)置于角膜上以预防眼睛干燥及白内障显现。两个具有金环形电极的眼睛同时执行记录。参考电极是用美多秀润湿且连接于动物颊部的无齿鳄鱼夹。对于电接地，将夹子连接于动物尾部。在1kHz下取样ERG信号且在0.15Hz低频及500Hz高频截止下进行记录。光刺激由通过一组发光二极体递送的短暂全视野闪光组成(持续时间<4ms)。所有闪光通过Ganzfeld刺激器(ColorDome；Diagnosys)在黑暗中或在稳定绿色或红色本底光上产生。
ERG方案
ERG反应首先自暗适应动物记录(以分离视杆驱动的反应)，之后自适应红色本底光(50cd/m2，以分离UV视锥驱动的ERG反应)及之后适应绿色本底光(25.5cd/m2，以分离M视锥驱动反应)的动物记录。在暗适应ERG的情况下，反应通过1×10-5至0.1cd·s/m2范围内的一系列闪光诱发。对于亮度是1×10-5及3×10-5cd·s/m2的闪光，将20个试验的反应平均。对于1×10-4至0.05cd·s/m2之间的闪光，将10个试验的反应平均，且对于0.1cd·s/m2的最终闪烁，将8个试验平均。个别闪光之间的时间间隔经选择以确保视网膜从各次闪光完全恢复(无闪光诱发的反应幅度减小或隐含时间缩短的迹象)。基于这些准则，对于1×10-5及3×10-5cd·s/m2闪光，闪光间时间间隔是2秒，对于1×10-4至0.05cd·s/m2之间的闪光是5秒，且对于0.1cd·s/m2的闪光是10秒。
对于UV视锥驱动的反应的记录，使动物光适应红色本底光2分钟。光反应通过0.02、0.04、0.08、0.17、0.35、0.83、1.66、2.90及4.15μW/m2的UV闪光诱发。对于M视锥驱动的反应的记录，使动物光适应绿色本底光2分钟。光反应通过0.25、0.1、1.0、5.0、50及150cd·s/m2的绿色闪光诱发。对于UV及绿色闪光，将10个试验的反应平均，其中闪光间时间间隔是3秒。
数据分析
为确定ERG b波幅度(主要源自双极性细胞的阳性去极化反应)，使用MATLAB软体(R2014a版；MathWorks)处理及分析ERG数据。通过55Hz快速傅立叶变换低通频率过滤自信号去除振荡电势(小高频小波迭加b波)，因为振荡电势可影响b波峰的幅度及位置，在光适应条件下尤其如此。自a波反应的底部(大部分源自感光体活动的阴性偏转)至b波浪峰的峰值计算b波幅度。b波隐含时间测量为在闪光刺激之后达到b波浪峰值所需的时间。
随刺激强度而变的b波的幅度使用最小二乘拟合程序(GraphPad Prism，6.01版)通过以下等式拟合：
其中R是反应幅度，Rmax是饱和反应幅度，I是闪光强度，Ih是半饱和闪光强度且n是希尔系数(Hill coefficient)。
光敏感性S定义为饱和反应幅度Rmax与半饱和闪光强度Ih之间的比率。
以分别在玻璃体内治疗前5周及玻璃体内治疗后7周获得的非糖尿病性对照的平均值标准化S及Rmax值。
为分析视杆驱动的b波隐含时间，确定非糖尿病性对照动物的通过1×10-5、3×10-5、1×10-4及2×10-4cd·s/m2的闪光诱发的b波的平均隐含时间(对应隐含时间极类似)。对于各研究群组，针对以上闪光强度计算相对于对照的平均值的变化且取平均，产生b波隐含时间的平均相对变化。
为分析UV视锥驱动的b波隐含时间，针对通过0.042、0.083、0.166及0.348μW/cm2的闪光强度诱发的b波反应，计算相对于对照的平均值的隐含时间变化，且取平均。
为分析M视锥驱动的b波隐含时间，针对通过1、5、50及150cd·s/m2的闪光强度诱发的b波反应，计算相对于对照的平均值的隐含时间变化，且取平均。
在通过0.1cd·s/m2的闪光诱发的a波的峰值(光刺激后即刻的阴性信号偏转)处确定视杆驱动的a波反应。
结果
在糖尿病诱发后第5周，执行基线ERG记录以定量在玻璃体内治疗之前视网膜中的神经元功能障碍的程度(还参见图5)。基于这些ERG结果，确保两个糖尿病性(高血糖)组展示类似的视网膜功能障碍分布(其接受对照IgG1抗-2,4,6-三硝基苯基(第2组)或TrkB激动性IgG1 C2(第3组)的后续玻璃体内治疗)。一般而言，所有玻璃体内治疗均具有良好耐受性且未观察到不良事件。在非糖尿病性对照大鼠(第1组，n＝12)中，在研究过程中，血糖稳定在约5mM。在STZ诱发的糖尿病性动物(第2及3组，各自n＝12)中，血糖浓度在STZ治疗后约4天之后达到>20mM的水平，且在研究过程中不下降至低于20mM。用C2或对照IgG1抗-2,4,6-三硝基苯基玻璃体内治疗对血糖水平不起任何作用。
视杆驱动的b波隐含时间：
b波隐含时间是视网膜中光诱导的电反应(主要关于双极性细胞水平及感光体与双极性细胞的突触传输)的速度的量度。隐含时间定义为在光闪刺激之后达到反应幅度所需的时间。高血糖症及玻璃体内治疗的作用概述于图6中。针对玻璃体内治疗前(基线ERG评定)及玻璃体内治疗后获得的数据，计算相对于从对照大鼠测量的平均隐含时间的隐含时间的变化。在两个高血糖组中在玻璃体内治疗前隐含时间稳固增加约14ms，指示高血糖症诱发b波反应动力学减慢，即，视杆驱动的视网膜处理的速度降低。在非糖尿病性对照组及高血糖组中(在图6中分别是第1组，黑色条柱；及第2组，点线条柱，在玻璃体内治疗后)，对照IgG1抗-2,4,6-三硝基苯基的玻璃体内注射对隐含时间不起任何显著作用。然而，用TrkB活化剂C2玻璃体内治疗明确导致隐含时间的延迟减少(图6中的第3组，灰色条柱，玻璃体内治疗后)。用C2玻璃体内治疗致使b波反应平均显著增速约9ms(即，隐含时间的延迟由14ms缩短至5ms)。
视杆驱动的b波光敏感性：
视杆驱动的b波ERG反应的光敏感性是参与视杆驱动视网膜通路的神经元数目，及其对产生去极化光反应的光刺激的敏感性的量度。以对照大鼠的平均光敏感性(第1组，玻璃体内治疗前及后)标准化光敏感性，且绘制于图7中。在高血糖动物中(玻璃体内治疗前，第2及3组)，标准化的光敏感性降低约40-50％。对照IgG1的玻璃体内注射对对照大鼠(第1组)或高血糖大鼠(第2组)的光敏感性不起任何显著作用。重要的是，用TrkB活化剂C2玻璃体内治疗显著增加光敏感性约30％(第3组，灰色，玻璃体内治疗后与玻璃体内治疗前相比)。
视杆驱动a波反应：
视杆驱动a波反应是通过光闪诱发的视杆感光体光反应的大小的量度。视杆驱动a波反应以获自对照大鼠的平均数值(第1组，玻璃体内治疗前及后)标准化，且绘制于图8中。在高血糖动物(第2及3组，玻璃体内治疗前)中，标准化的饱和反应幅度降低约17％。对照IgG1的玻璃体内注射对对照大鼠(第1组，黑色)或高血糖大鼠(第2组，点线)的标准化a波反应不起任何显著作用，后者展示在研究过程中a波反应进一步减小。然而，用TrkB活化剂C2(第3组，灰色)玻璃体内治疗可完全预防如第2高血糖组所观察到的a波反应的进一步减小。
UV及M视锥驱动b波隐含时间：
针对玻璃体内治疗前(基线ERG评定)及玻璃体内治疗后获得的数据，计算相对于从对照大鼠测量的平均隐含时间的隐含时间的变化。对UV视锥驱动的b波隐含时间(图9)及M视锥驱动的b波隐含时间(图10)执行此分析。在UV视锥驱动的反应的情况下，在两个高血糖组中在玻璃体内治疗前隐含时间稳固增加约8ms，然而在高血糖中M视锥驱动的隐含时间增加约5ms。这些统计学上显著的作用指示高血糖症诱导b波反应动力学减慢及视锥驱动的视网膜处理速度降低。在非糖尿病性对照组(第1组，黑色)或高血糖组(第2组，点线)中，玻璃体内注射对照IgG1对隐含时间，即UV与M视锥驱动b波隐含时间不起任何显著作用。在UV视锥的情况下，用C2玻璃体内治疗(第3组，灰色)缩短隐含时间约5ms(与b波反应动力学标准化约50％对应)，且在M锥形驱动b波的情况下，几乎完全恢复正常b波反应动力学。
UV视锥驱动的b波光敏感性：
如对于视杆驱动的ERG所描述的评定UV视锥驱动的b波ERG反应的光敏感性。光敏感性以对照大鼠的平均光敏感性(第1组，玻璃体内治疗前及后)标准化，且绘制于图11中。在高血糖动物中在基线处(玻璃体内治疗前)，标准化光敏感性降低约50％。玻璃体内注射对照IgG1不对光敏感性起任何显著作用，然而用C2玻璃体内治疗使光敏感性显著增至健康对照大鼠中所观察到的水平(第3组，灰色)。
M视锥驱动的饱和b波反应幅度
高血糖症对M视锥驱动的b波光敏感性的作用与UV视锥驱动的b波相比不明显(在所研究时间点)。然而，在高血糖症发作之后第5周可观察到M视锥驱动的b波饱和反应幅度显著削弱(与非糖尿病性对照大鼠相比减小约15％，图12)。用C2玻璃体内治疗可使饱和反应幅度恢复至对照的水平(第3组，灰色)，而用对照IgG1治疗不起任何显著作用(第2组，点线)。
关键研究结果概述如下：
TrkB活化导致神经保护作用及视网膜功能的保全。神经保护显示于STZ诱发的糖尿病性大鼠模型中，该模型展示高血糖症诱发的神经元功能障碍。显示了TrkB活化预防感光体的功能障碍。
在STZ诱发的糖尿病性大鼠模型中，在长期高血糖症之后，TrkB活化诱导视网膜中的神经元功能恢复/改良，诸如光反应潜伏期改良(即ERG b波隐含时间缩短)或视杆及视锥驱动的光敏感性改良。
总的，药理学数据证明以下治疗概念：在不同疾病病状中，TrkB活化可改良/恢复眼睛内不同神经元细胞类型的功能。
如通过对ERG a波的分析所表明，TrkB活化还保护感光体及外部视网膜，该ERG a波是感光体光反应的反映。与ERG a波获得的结果类似，在持续高血糖症过程中，糖尿病性大鼠的眼睛的对比敏感性下降，然而用TrkB活化剂C2玻璃体内治疗则完全保全对比敏感性。此外，上文所述的视杆及视锥驱动的光反应的ERG b波光敏感性的改良(反映感光体与双极性细胞的突触传输的光敏感性)进一步强化以下概念：TrkB活化可改良/保护外部视网膜功能，包括感光体。
13.组合治疗中的BDNF功能
表达人TrkB受体的CHO细胞的培养
用补充有10％胎牛血清、格鲁塔玛(glutamax)、非必需氨基酸、20mM HEPES、5μg/ml杀稻瘟菌素(blasticidin)及200μg/ml博来霉素(zeocin)的DMEM(Lonza，编号BE12-604F)培养表达人TrkB(hTrkB)受体的CHO细胞(ThermoFisher Scientific，编号K1491)。在刺激之前二十四小时，将5000个细胞(30μl)接种于384孔澄清组织培养板(BD Falcon，编号353963)的各空腔中且在增湿孵育箱中在37℃及5％CO2下孵育。
对具有hTrkB受体的CHO细胞中ERK磷酸化的分析
在接种之后二十四小时，用40μl具有0.1％BSA而无其他补充剂的室温DMEM置换CHO/hTrkB细胞的上清液。在15分钟之后，一式三份添加单独地具有增加浓度的BDNF(1E-13至3E-8mol/l)、277-抗体(1E-13至2.025E-8mol/l)或C2-抗体(1E-13至2.025E-8mol/l)，或具有1nM BDNF与增加浓度的277抗体或C2抗体(两者皆为1E-13至2.025E-8mol/l)的组合的10μl DMEM/0.1％BSA，以刺激ERK磷酸化。在室温下孵育45分钟之后，去除上清液且在湿冰上用每孔20μl溶解缓冲液(1×Tryton溶解缓冲液(CellSignaling编号9803-S)，补充有全小蛋白酶抑制剂片剂(Roche编号04693124001)及磷酸酶抑制剂混合液2(Sigma编号P5726)及3(Sigma编号P0044)及1mM PMSF(Sigma编号93482))裂解细胞20分钟。使用市售分析物(Perkin Elmer编号TGRES500)，根据制造商说明书，使用五微升所得溶解物来定量T202/Y204下的ERK1/2磷酸化。反映ERK磷酸化的受体珠粒的光发射经Perking Elmer EnVision酶标仪在570nm下记录，且经制备以用GraphPad Prism(7版)呈现，包括原始数据(平均值±SEM)及非线性回归(log(激动性剂)相对于反应(三个参数))。
如图13中所示，277-抗体不减少BDNF诱导的ERK磷酸化。升高浓度的C2抗体使得BDNF诱导的ERK磷酸化减少至C2诱导的ERK磷酸化的水平。此情况可显著影响眼睛中抗-Trkb抗体的给药，其中抗体按高饱和浓度施用以延长直至需要下一次施用的时间。277-抗体可以以高剂量施用而不会干扰现有的BDNF诱导的ERK磷酸化，而C2抗体则使现有BDNF诱导的ERK磷酸化减少至抗体的水平。
14.体外ELISA分析中与人VEGF的结合
对于体外结合分析，在4℃下将MaxiSorp 96孔板(Nunc编号437111)用在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(3.03g/l Na2CO3及6.00g/l NaHCO3，pH 9.6)中的500ng/ml人VEGF(R&DSystems编号293-VE-050)或大鼠VEGF(R&D Systems编号564-RV-050)涂布过夜。用PBS-T(具有0.05％Tween20(Sigma#P7949)的磷酸盐缓冲盐水(Invitrogen编号70011-036))洗涤板三次，且然后在室温下与于PBS-T中的1％BSA(Sigma编号A3059)一起孵育三小时以阻断非特异性结合。用PBS-T洗涤板三次且然后在4℃下与1μM阿瓦斯汀(Roche临床包装)、C2-抗体、277-抗体或人IgG1同种型对照抗体在PBS-T中的1:4连续稀释液一起孵育过夜。用PBS-T洗涤板三次且然后在室温下与Alexa fluor 647山羊抗人IgG(Invitrogen编号A21445)的1:2000稀释液一起孵育两小时。再用PBS-T洗涤三轮之后，经Perking Elmer EnVision酶标仪记录647nm的光发射(反映VEGF抗体与VEGF的结合)。数据经制备以用GraphPad Prism(7版)呈现，包括原始数据(平均值±SEM)及非线性回归(log(激动性剂)相对于反应(三个参数))。
如图14中所示，抗体浓度至多0.25μM的277抗-TrkB抗体与IgG1同种型对照抗体之间不存在统计学上显著的人VEGF结合差异(不成对t检验，p>0.05)。相反，已观察到抗体浓度为0.24nM的C2与同种型对照抗体之间的人VEGF结合的统计学上显著的差异(不成对t检验，**p<0.01)。
此类与VEGF的非特异性结合可产生例如不需要的副作用，使得难以控制用于TrkB活化的剂量或增加实现所需作用所需的抗体的量。
序列表
<110> 勃林格殷格翰国际有限公司
<120> 抗-TRKB抗体
<130> 01-3274
<160> 60
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 鼠属<小鼠，属>
<220>
<223> D003_VL (鼠前导)，可变轻链
<400> 1
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-gr_VL，(人源化的)可变轻链
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
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50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-33_VL：(人源化的)可变轻链
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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<220>
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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<211> 113
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<220>
<223> 277-42_VL，(人源化的)可变轻链
<400> 5
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Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-44_VL，(人源化的)可变轻链
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-48_VL，(人源化的)可变轻链
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-51_VL，(人源化的)可变轻链
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-64_VL，(人源化的)可变轻链
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 10
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-67_VL，(人源化的)可变轻链
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 11
<211> 115
<212> PRT
<213> 鼠属<小鼠，属>
<220>
<223> D003_VH，(鼠前导)可变重链
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-gr_VH，(人源化的)可变重链
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-33_VH，(人源化的)可变重链
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-35_VH，(人源化的)可变重链
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-42_VH，(人源化的)可变重链
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-44_VH，(人源化的)可变重链
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-48_VH，(人源化的)可变重链
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-51_VH，(人源化的)可变重链
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-64_VH，(人源化的)可变重链
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-67_VH，(人源化的)可变重链
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-gr (轻链，IgG1)
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 22
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-gr (重链，IgG1)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 23
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-gr (重链，IgG1-KO)
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 24
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-33 (轻链，IgG1)
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 25
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-33 (重链，IgG1)
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
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Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
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Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
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180 185 190
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435 440
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<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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100 105 110
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130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
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Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
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Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
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Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
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Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-44 (轻链，IgG1)
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
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Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
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Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
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Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
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195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 34
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-44 (重链，IgG1)
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
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Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
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Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
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<223> 277-44 (重链，IgG1-KO)
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Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 46
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-67 (重链，IgG1)
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 47
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 277-67 (重链，IgG1-KO)
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Thr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠属<小鼠，属>
<220>
<223> 277 L-CDR1
<400> 48
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠属<小鼠，属>
<220>
<223> 277 L-CDR2
<400> 49
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠属<小鼠，属>
<220>
<223> 277 L-CDR3
<400> 50
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 鼠属<小鼠，属>
<220>
<223> 277 H-CDR1
<400> 51
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠属<小鼠，属>
<220>
<223> 277 H-CDR2
<400> 52
Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 鼠属<小鼠，属>
<220>
<223> 277 H-CDR3
<400> 53
Ser Arg Thr Gly Asn Tyr
1 5
<210> 54
<211> 399
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人TrkB的细胞外域
<400> 54
Cys Pro Thr Ser Cys Lys Cys Ser Ala Ser Arg Ile Trp Cys Ser Asp
1 5 10 15
Pro Ser Pro Gly Ile Val Ala Phe Pro Arg Leu Glu Pro Asn Ser Val
20 25 30
Asp Pro Glu Asn Ile Thr Glu Ile Phe Ile Ala Asn Gln Lys Arg Leu
35 40 45
Glu Ile Ile Asn Glu Asp Asp Val Glu Ala Tyr Val Gly Leu Arg Asn
50 55 60
Leu Thr Ile Val Asp Ser Gly Leu Lys Phe Val Ala His Lys Ala Phe
65 70 75 80
Leu Lys Asn Ser Asn Leu Gln His Ile Asn Phe Thr Arg Asn Lys Leu
85 90 95
Thr Ser Leu Ser Arg Lys His Phe Arg His Leu Asp Leu Ser Glu Leu
100 105 110
Ile Leu Val Gly Asn Pro Phe Thr Cys Ser Cys Asp Ile Met Trp Ile
115 120 125
Lys Thr Leu Gln Glu Ala Lys Ser Ser Pro Asp Thr Gln Asp Leu Tyr
130 135 140
Cys Leu Asn Glu Ser Ser Lys Asn Ile Pro Leu Ala Asn Leu Gln Ile
145 150 155 160
Pro Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ala Ala Pro Asn Leu Thr
165 170 175
Val Glu Glu Gly Lys Ser Ile Thr Leu Ser Cys Ser Val Ala Gly Asp
180 185 190
Pro Val Pro Asn Met Tyr Trp Asp Val Gly Asn Leu Val Ser Lys His
195 200 205
Met Asn Glu Thr Ser His Thr Gln Gly Ser Leu Arg Ile Thr Asn Ile
210 215 220
Ser Ser Asp Asp Ser Gly Lys Gln Ile Ser Cys Val Ala Glu Asn Leu
225 230 235 240
Val Gly Glu Asp Gln Asp Ser Val Asn Leu Thr Val His Phe Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Thr Phe Leu Glu Ser Pro Thr Ser Asp His His Trp Cys Ile
260 265 270
Pro Phe Thr Val Lys Gly Asn Pro Lys Pro Ala Leu Gln Trp Phe Tyr
275 280 285
Asn Gly Ala Ile Leu Asn Glu Ser Lys Tyr Ile Cys Thr Lys Ile His
290 295 300
Val Thr Asn His Thr Glu Tyr His Gly Cys Leu Gln Leu Asp Asn Pro
305 310 315 320
Thr His Met Asn Asn Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Glu Tyr
325 330 335
Gly Lys Asp Glu Lys Gln Ile Ser Ala His Phe Met Gly Trp Pro Gly
340 345 350
Ile Asp Asp Gly Ala Asn Pro Asn Tyr Pro Asp Val Ile Tyr Glu Asp
355 360 365
Tyr Gly Thr Ala Ala Asn Asp Ile Gly Asp Thr Thr Asn Arg Ser Asn
370 375 380
Glu Ile Pro Ser Thr Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Arg Glu His
385 390 395
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Gly Tyr Trp Met His
1 5
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠属<小鼠，属>
<220>
<223> 277 H-CDR2
<400> 56
Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 鼠属<小鼠，属>
<220>
<223> 277 H-CDR3
<400> 57
Ser Arg Thr Gly Asn Tyr
1 5
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠属<小鼠，属>
<220>
<223> 277 H-CDR1
<400> 58
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
1 5
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 鼠属<小鼠，属>
<220>
<223> 277 H-CDR2
<400> 59
Asn Pro Ser Thr Asp Tyr
1 5
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 鼠属<小鼠，属>
<220>
<223> 277 H-CDR3 Chothia
<400> 60
Ser Arg Thr Gly Asn Tyr
1 5

Claims (21)

1.一种抗-TrkB抗体，其包含：
a.包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的轻链可变区，其中L-CDR1由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成；L-CDR2由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成；和L-CDR3由SEQ ID NO:50的氨基酸序列组成；和
包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的重链可变区，其中H-CDR1由SEQ ID NO:51的氨基酸序列组成；H-CDR2由SEQ ID NO:52的氨基酸序列组成；和H-CDR3由SEQ ID NO:53的氨基酸序列组成，
b.包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的轻链可变区，其中L-CDR1由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成；L-CDR2由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成；和L-CDR3由SEQ ID NO:50的氨基酸序列组成；和
包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的重链可变区，其中H-CDR1由SEQ ID NO:55的氨基酸序列组成；H-CDR2由SEQ ID NO:56的氨基酸序列组成；和H-CDR3由SEQ ID NO:57的氨基酸序列组成，或
c.包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的轻链可变区，其中L-CDR1由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成；L-CDR2由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成；和L-CDR3由SEQ ID NO:50的氨基酸序列组成；和
包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的重链可变区，其中H-CDR1由SEQ ID NO:58的氨基酸序列组成；H-CDR2由SEQ ID NO:59的氨基酸序列组成；和H-CDR3由SEQ ID NO:60的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1的抗-TrkB抗体，其中该抗体包含：
a.由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的可变轻链和由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的可变重链，
b.由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的可变轻链和由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成的可变重链，
c.由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的可变轻链和由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的可变重链，
d.由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成的可变轻链和由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成的可变重链，
e.由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的可变轻链和由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的可变重链，
f.由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成的可变轻链和由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的可变重链，
g.由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的可变轻链和由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的可变重链，
h.由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成的可变轻链和由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成的可变重链，或
i.由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成的可变轻链和由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成的可变重链。
3.如权利要求1的抗-TrkB抗体，其中该抗体包含：
a.由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:22或23的氨基酸序列组成的重链，
b.由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列组成的重链，
c.由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:28或29的氨基酸序列组成的重链，
d.由SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:31或32的氨基酸序列组成的重链，
e.由SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:34或35的氨基酸序列组成的重链，
f.由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:37或38的氨基酸序列组成的重链，
g.由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:40或41的氨基酸序列组成的重链，
h.由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:43或44的氨基酸序列组成的重链，或
i.由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:46或47的氨基酸序列组成的重链。
4.如权利要求1的抗-TrkB抗体，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:22或23的氨基酸序列组成的重链。
5.如权利要求1的抗-TrkB抗体，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列组成的重链。
6.如权利要求1的抗-TrkB抗体，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:28或29的氨基酸序列组成的重链。
7.如权利要求1的抗-TrkB抗体，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:31或32的氨基酸序列组成的重链。
8.如权利要求1的抗-TrkB抗体，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:34或35的氨基酸序列组成的重链。
9.如权利要求1的抗-TrkB抗体，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:37或38的氨基酸序列组成的重链。
10.如权利要求1的抗-TrkB抗体，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:40或41的氨基酸序列组成的重链。
11.如权利要求1的抗-TrkB抗体，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:43或44的氨基酸序列组成的重链。
12.如权利要求1的抗-TrkB抗体，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:46或47的氨基酸序列组成的重链。
13.权利要求1-12中任一项的抗体在制备用于治疗糖尿病性视网膜病变的药物中的用途。
14.一种药物组合物，其包含如权利要求1-12中任一项的抗体以及药学上可接受的载体。
15.如权利要求1-12中任一项的抗体或如权利要求14的药物组合物，其中该抗体是通过玻璃体内施用途径施用的。
16.一种分离的多核苷酸，其包含编码如权利要求1-12中任一项的抗体的轻链或轻链可变区和抗体的重链或重链可变区的序列。
17.一种表达载体，其包含如权利要求16的分离的多核苷酸。
18.一种病毒载体，其包含如权利要求16的分离的多核苷酸。
19.一种宿主细胞，其包含如权利要求16的分离的多核苷酸或如权利要求17的表达载体。
20.一种产生抗-TrkB抗体的方法，其包含：
a.获得如权利要求19的宿主细胞；和
b.培养该宿主细胞。
21.如权利要求20的方法，其进一步包含回收和纯化该抗体。
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