JP7267208B2 - 抗ｔｒｋｂ抗体 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、一般的には、診断的及び治療的使用のためのアゴニスト性抗ＴｒｋＢ抗体に関し、特に、ヒト化アゴニスト性抗ＴｒｋＢ抗体に関する。より具体的には、アゴニスト性抗ＴｒｋＢ抗体及び種々の疾患又は障害の処置のための使用方法が開示される。アゴニスト性抗ＴｒｋＢ抗体を含む医薬組成物及びキットも開示される。
発明の背景
トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）（チロシンレセプターキナーゼＢ又はＢＤＮＦ／ＮＴ－３成長因子レセプター又は神経栄養チロシンキナーゼレセプター２型としても公知）は、ヒトにおいて、ＮＴＲＫ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：４９１５）によりコードされるタンパク質である。ＴｒｋＢは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）用のレセプターである。
神経栄養チロシンキナーゼレセプターＢ（ＴｒｋＢ；遺伝子記号：ＮＴＲＫ２）は、網膜ニューロン及びグリア細胞により発現される。正常な網膜では、ＴｒｋＢシグナル伝達は、細胞ストレスを打ち消し、細胞生存を促進する。罹患した眼、例えば、糖尿病性網膜症又は地図状萎縮では、視覚障害及び視力喪失を引き起こす網膜ニューロン及びグリア細胞の喪失及び機能障害が起こる。（糖尿病性網膜症において低下する）基底レベルを上回るＴｒｋＢシグナル伝達が活性化されることにより、ニューロン及びグリア細胞の喪失及び機能障害が打ち消されるため、視覚機能を改善することができる。さらに、ＴｒｋＢ活性化は、罹患した眼における失われたシナプス結合を再生することにより、視覚機能の回復を促進する可能性を有する。リガンドが結合すると、ＴｒｋＢは、ホモ二量体化を受け、続けて、自己リン酸化を受ける。リン酸化部位（Ｙ５１６、Ｙ７０２、Ｙ７０６、Ｙ７０７又はＹ８１７）に応じて、軸索／神経突起伸長を誘引し、シナプス可塑性を向上させ又は細胞生存を向上させる別個の重複シグナル伝達カスケードをレギュレーションするＰＬＣγ１又はＡＫＴ及びＥＲＫの異なるサブフォームの活性を含む、異なるシグナル伝達経路が活性化される。
アゴニスト性抗ＴｒｋＢ抗体は、ＵＳ第２０１００１９６３９０号及び同第２０１００１５０９１４号並びに、例えば、Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ病又は糖尿病の処置におけるそれらの提案された使用に記載されている。
しかしながら、ＴｒｋＢ経路を活性化することにより、例えば、神経変性障害及び精神障害の治療的介入におけるそれらの使用が可能であるように使用することができる、新規の強力なアゴニスト性抗ＴｒｋＢ抗体に対する顕著な必要性が依然として存在する。
発明の概要
本発明は、ヒトＴｒｋＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。一態様において、本発明の抗体は、アゴニスト活性を有し、ＴｒｋＢリン酸化及び／又は活性化を誘引する。別の態様では、本発明の抗体は、例えば、眼又は網膜疾患、例えば、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、緑内障及び／又は糖尿病性黄斑浮腫に続く地図状萎縮の処置に有用である。
別の態様では、本発明は、本明細書において以下に記載される１つ以上の特性を有する、抗ＴｒｋＢ抗体、特に、ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体を提供する。
別の態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ヒトＴｒｋＢに高い親和性で結合する。この態様に関連する実施態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＫＤ＜１０nMでヒトＴｒｋＢに結合する。別の実施態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＫＤ＜５nMでヒトＴｒｋＢに結合する。
別の態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、高い効力でＴｒｋＢを活性化する。この態様に関連する実施態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＥＣ５０＜１００pMでヒトＴｒｋＢを活性化する。更なる実施態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＥＣ５０＜５０pMでヒトＴｒｋＢを活性化する。
別の態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦより、ＴｒｋＢ下流シグナル伝達経路の活性化を誘引するのに強力である。更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＢＤＮＦのパターンに匹敵するパターンで、ＴｒｋＢ媒介シグナル伝達経路を介して遺伝子発現をレギュレーションする。
更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインにおける新規なエピトープに結合する。更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、他の種由来のＴｒｋＢと交差反応せず、特に、げっ歯類ＴｒｋＢと交差反応しない。
一態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、眼内への硝子体内注射のために高濃度に配合することができる。
更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、実施例５に記載される方法により測定された場合、低い免疫原性リスクを有する。
別の態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体のＣＤＲ配列は、実施例４に記載される方法により測定された場合、低い配列負担（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ）を有する。
更に別の態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＢＤＮＦ誘引ＥＲＫリン酸化を減少させない。
更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＴｒｋＢリン酸化及び／又は活性化に特異的であり、ＴｒｋＡ又はＴｒｋＣを非特異的にリン酸化／活性化しない。別の態様では、抗ＴｒｋＢ抗体は、ヒトＶＥＧＦに非特異的に結合しない。
更なる態様は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド分子、このようなポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター及びウイルスベクター並びに宿主細胞並びに本発明の抗体を製造する方法を包含する。更に、本発明は、特に、網膜／眼疾患のための、本発明の抗体についての治療的使用を提供する。
一実施態様において、本発明は、
配列番号：４８のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号：４９のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ２）及び配列番号：５０のアミノ酸配列（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域と、
配列番号：５１のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号：５２のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）及び配列番号：５３のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域又は
配列番号：５５のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号：５６のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）及び配列番号：５７のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域又は
配列番号：５８のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号：５９のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ２）及び配列番号：６０のアミノ酸配列（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域とを含む、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、
配列番号：２及び配列番号：１２それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
配列番号：３及び配列番号：１３それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
配列番号：４及び配列番号：１４それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
配列番号：５及び配列番号：１５それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
配列番号：６及び配列番号：１６それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
配列番号：７及び配列番号：１７それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
配列番号：８及び配列番号：１８それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
配列番号：９及び配列番号：１９それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖又は
配列番号：１０及び配列番号：２０それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖を含む、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、
配列番号：２１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：２２又は２３のアミノ酸配列を含む重鎖、
配列番号：２４のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：２５又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖、
配列番号：２７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：２８又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖、
配列番号：３０のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：３１又は３２のアミノ酸配列を含む重鎖、
配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：３４又は３５のアミノ酸配列を含む重鎖、
配列番号：３６のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：３７又は３８のアミノ酸配列を含む重鎖、
配列番号：３９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４０又は４１のアミノ酸配列を含む重鎖、
配列番号：４２のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４３又は４４のアミノ酸配列を含む重鎖又は
配列番号：４５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４６又は４７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
特に好ましい実施態様では、抗ＴｒｋＢ抗体は、ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体である。
一実施態様において、本発明は、薬剤において使用するための抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、網膜又は眼の疾患の処置における使用のための、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、神経／ニューロン眼疾患又は網膜疾患の処置における使用のための、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、地図状萎縮の処置における使用のための、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、加齢黄斑変性症又は糖尿病性網膜症の処置における使用のための、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物を提供する。
一実施態様において、本発明は、抗ＴｒｋＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメント又は抗ＴｒｋＢ抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供し、ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、非経口経路、静脈内経路、硝子体内経路又は皮下経路の投与により投与される。
一実施態様において、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖又は軽鎖可変領域及び抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖又は重鎖可変領域をコードする配列を含む、単離された１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。
一実施態様において、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖又は軽鎖可変領域及び抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖又は重鎖可変領域をコードする単離された１つ以上のポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを提供する。
一実施態様において、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖又は軽鎖可変領域及び抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖又は重鎖可変領域をコードする単離された１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ウイルスベクターを提供する。
一実施態様において、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖又は軽鎖可変領域及び抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖又は重鎖可変領域をコードする、発現ベクター又は単離された１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ホスト細胞を提供する。
一実施態様において、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖又は軽鎖可変領域及び抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖又は重鎖可変領域をコードする発現ベクター又は単離された１つ以上のポリヌクレオチドを含むホスト細胞を得ることと、ホスト細胞を培養することとを含む、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを製造するための方法を提供する。
一実施態様において、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを製造するための方法は、更に、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを回収し、精製することを含む。
一実施態様において、本発明は、配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインのアミノ酸領域９２～１１２、１３０～１４３及び／又は２０５～２１９内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインのアミノ酸領域９２～１１２及び１３０～１４３；又は９２～１１２及び２０５～２１９；又は１３０～１４３及び２０５～２１９；又は９２～１１２及び１３０～１４３及び２０５～２１９内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、前述の組み合わせいずれか内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合し、さらに、配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインのアミノ酸領域３１３～３３０及び／又は３４８～３６７内の少なくとも１つのアミノ酸残基にも結合する、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインのアミノ酸領域９２～１１２、１３０～１４３、２０５～２１９、３１３～３３０及び３４８～３６７内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
図１：ヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインに対するＢＤＮＦ、２７７抗体、Ｃ２又はＣ２０抗体のエピトープマッピング。 図２：ＢＤＮＦ、対照ＩｇＧ１（抗２，４，６－トリニトロフェニル、抗ＴＮＰ）又はＤ００３抗体で処理した後の、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるシナプス可塑性に関するレギュレーションされた遺伝子（ｘ軸）についてのｑＰＣＲ発現データ（ｙ軸）。 図３：ウサギの眼への１mg ２７７抗体のｉｖｔ注射後の、時間の関数としての示された眼の区画及び血漿における２７７抗体の濃度のプロット。 図４：ＩｇＧ１抗体の眼のＰＫ計算値。Ｙ軸に、硝子体濃度を示し、ｘ軸に、ｉｖｔ適用後の日数を示す。ＥＣ５０に相当する硝子体濃度に達するまでのｉｖｔ注射後の時間を、矢印により示す。 図５：動物群及びタイムコースを含む研究概要。５週目に、ベースラインＥＲＧ評価（ｉｖｔ適用前）を行って、網膜における高血糖誘引性ニューロン機能不全の程度を評価した。群１及び群２に、ＩｇＧ１対照抗体である抗２，４，６－トリニトロフェニル（抗ＴＮＰ）のｉｖｔ注射を受けさせた。同注射は、網膜機能に何ら影響を引き起こさなかった。群３の眼をＣ２（抗ＴｒｋＢアゴニスト性代用抗体）で処置した。網膜機能を７週目（ｉｖｔ後）に再度評価した。 図６：ベースライン（ｉｖｔ前）及びｉｖｔ適用後１週間での、対照群の平均潜時に対する桿体駆動ｂ波潜時の変化（研究の概要については図５を参照のこと）。非糖尿病対照群１（黒色、ｎ＝２３の眼を調査）及び高血糖群２（破線、ｎ＝２１の眼を調査）に、対照ＩｇＧ１をｉｖｔ注射した。群３に、Ｃ２をｉｖｔ処置した（ｎ＝２４の眼を調査）。データは、平均値＋ＳＥＭである。ｎｓ、有意ではない；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；高血糖群２及び３と対照群１との間のｉｖｔ前の差は有意である（明確性のために統計を省略；Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一方向ＡＮＯＶＡ）。 図７：ベースライン（ｉｖｔ前）又はｉｖｔ適用後１週間での、対照群の平均光感度Ｓ対照に対して正規化された桿体駆動ｂ波の光感度Ｓ（研究の概要については図５を参照のこと）。非糖尿病対照群１（黒色、ｎ＝２３の眼を調査）及び高血糖群２（赤色、ｎ＝２０の眼を調査）に、対照ＩｇＧ１をｉｖｔ注射した。群３に、Ｃ２をｉｖｔ処置した（ｎ＝２４の眼を調査）。データは、平均値＋ＳＥＭである。ｎｓ、有意ではない；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；高血糖群２及び３と対照群１との間のｉｖｔ前の差は有意である（明確性のために統計を省略；Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一方向ＡＮＯＶＡ）。 図８：ベースライン（ｉｖｔ前）又はｉｖｔ適用後１週間での、対照の平均応答に対して正規化された０．１cd・s/m2のフラッシュにより誘発された桿体駆動ａ波応答Ｒ（研究の概要については図５を参照のこと）。非糖尿病対照群１（黒色、ｎ＝２３の眼を調査）及び高血糖群２（赤色、ｎ＝２０の眼を調査）に、対照ＩｇＧ１をｉｖｔ注射した。群３に、Ｃ２をｉｖｔ処置した（ｎ＝２４の眼を調査）。データは、平均値＋ＳＥＭである。ｎｓ、有意ではない；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；高血糖群２及び３と対照群１との間のｉｖｔ前の差は有意である（明確性のために統計を省略；Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一方向ＡＮＯＶＡ）。 図９：ベースライン（ｉｖｔ前）及びｉｖｔ適用後１週間での、対照群の平均潜時に対するＵＶ錐体駆動ｂ波潜時の変化（研究の概要については図５を参照のこと）。非糖尿病対照群１（黒色、ｎ＝２４の眼を調査）及び高血糖群２（赤色、ｎ＝２２の眼を調査）に、対照ＩｇＧ１をｉｖｔ注射した。群３に、Ｃ２をｉｖｔ処置した（ｎ＝２４の眼を調査）。データは、平均値＋ＳＥＭである。ｎｓ、有意ではない；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；高血糖群２及び３と対照群１との間のｉｖｔ前の差は有意である（明確性のために統計を省略；Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一方向ＡＮＯＶＡ）。 図１０：ベースライン（ｉｖｔ前）及びｉｖｔ適用後１週間での、対照群の平均潜時に対するＭ錐体駆動ｂ波潜時の変化（研究の概要については図５を参照のこと）。非糖尿病対照群１（黒色、ｎ＝２４の眼を調査）及び高血糖群２（赤色、ｎ＝２２の眼を調査）に、対照ＩｇＧ１をｉｖｔ注射した。群３に、Ｃ２をｉｖｔ処置した（ｎ＝２４の眼を調査）。データは、平均値＋ＳＥＭである。ｎｓ、有意ではない；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；高血糖群２及び３と対照群１との間のｉｖｔ前の差は有意である（明確性のために統計を省略；Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一方向ＡＮＯＶＡ）。 図１１：ベースライン（ｉｖｔ前）又はｉｖｔ適用後１週間での、対照群の平均光感度Ｓ対照に対して正規化されたＵＶ錐体駆動ｂ波の光感度Ｓ（研究の概要については図５を参照のこと）。非糖尿病対照群１（黒色、ｎ＝２２の眼を調査）及び高血糖群２（赤色、ｎ＝２２の眼を調査）に、対照ＩｇＧ１をｉｖｔ注射した。群３に、Ｃ２をｉｖｔ処置した（ｎ＝２１の眼を調査）。データは、平均値＋ＳＥＭである。ｎｓ、有意ではない；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；高血糖群２及び３と対照群１との間のｉｖｔ前の差は有意である（明確性のために統計を省略；Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一方向ＡＮＯＶＡ）。 図１２：ベースライン（ｉｖｔ前）又はｉｖｔ適用後１週間での、対照の平均飽和応答振幅Ｒｍａｘ，対照に対して正規化されたＭ錐体駆動ｂ波の飽和応答振幅Ｒｍａｘ（研究の概要については図５を参照のこと）。非糖尿病対照群１（黒色、ｎ＝２４の眼を調査）及び高血糖群２（赤色、ｎ＝２２の眼を調査）に、対照ＩｇＧ１をｉｖｔ注射した。群３に、Ｃ２をｉｖｔ処置した（ｎ＝２４の眼を調査）。データは、平均値＋ＳＥＭである。ｎｓ、有意ではない；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；高血糖群２及び３と対照群１との間のｉｖｔ前の差は有意である（明確性のために統計を省略；Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一方向ＡＮＯＶＡ）。 図１３：（Ａ）ＢＤＮＦ、２７７抗体もしくは１nM ＢＤＮＦと増加する濃度の２７７抗体との組み合わせ又は（Ｂ）ＢＤＮＦ、Ｃ２抗体、もしくは１nM ＢＤＮＦと増加する濃度のＣ２抗体との組み合わせによる刺激後、ヒトＴｒｋＢレセプターを発現するＣＨＯ細胞におけるＥＲＫリン酸化。データ（記号）を平均±ＳＥＭ（一部のポイントについては、エラーバーは、記号の高さより短い）として表わす。連結線は、非線形回帰（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））を反映している。独立した細胞バッチによる一連の３つのうちの１つの代表的な実験を示す。ｎ．ｓ、１nM ＢＤＮＦ単独と示された濃度の２７７抗体を伴う１nM ＢＤＮＦとの間に有意差なし。＃ｐ＜０．００１ １nM ＢＤＮＦ単独対示された濃度のＣ２抗体を伴う１nM ＢＤＮＦ；多重比較検定による一方向ＡＮＯＶＡ。 図１４：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒト又はラットＶＥＧＦへの２７７抗体又はＣ２抗体の結合。データ（記号）を平均±ＳＥＭ（注：エラーバーは記号の高さより短い）として表わす。連結線は、非線形回帰（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））を反映している。一連の５つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験を示す。＃ｐ＜０．０１ 示された濃度でのｈＶＥＧＦ－Ｃ２対ｈＶＥＧＦ－アイソタイプＩｇＧ１（独立ｔ検定）。
発明の詳細な説明
定義
抗体又は免疫グロブリンの一般化された構造は、当業者に周知であり、これらの分子は、２つの同一の軽鎖（Ｌ）及び２つの同一の重鎖（Ｈ）から構成される、典型的には、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つのジスルフィド結合により重鎖に共有結合して、ヘテロ二量体を形成し、ヘテロ三量体分子は、ヘテロ二量体の２つの同一の重鎖間の共有ジスルフィド結合を介して形成される。軽鎖及び重鎖同士が、１つのジスルフィド結合により連結しているが、２つの重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプにより異なる。また、各重鎖及び軽鎖は、規則的に間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、アミノ末端に、可変ドメイン（ＶＨ＝可変重鎖）、続けて、３つ又は４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）及びＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域を有する。各軽鎖は、アミノ末端可変ドメイン（ＶＬ＝可変軽鎖）及びカルボキシ末端定常ドメイン（ＣＬ）の２つのドメインを有する。ＶＬドメインは、ＶＨドメインと非共有結合的に会合している。一方、ＣＬドメインは、一般的には、ジスルフィド結合を介して、ＣＨ１ドメインに共有結合的に連結している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成していると考えられる（Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663.）。
可変ドメイン内の特定のドメインは、異なる抗体間で広範に異なる、すなわち、「超可変」である。これらの超可変ドメインは、その特異的抗原決定基に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に直接関与する残基を含有する。軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方における過可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変ループ（ＨＶＬ）として公知の３つのセグメントに集中している。ＣＤＲは、Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.,における配列比較により定義される。一方、ＨＶＬは、Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917に記載されているように、可変ドメインの三次元構造に従って構造的に定義される。これらの２つの方法が、ＣＤＲのわずかに異なる特定をもたらす場合、構造的定義が好ましい。Ｋａｂａｔにより定義されるように、ＣＤＲ－Ｌ１は、軽鎖可変ドメインにおける、およそ残基２４～３４に位置し、ＣＤＲ－Ｌ２は、およそ残基５０～５６に位置し、ＣＤＲ－Ｌ３は、およそ残基８９～９７に位置する。ＣＤＲ－Ｈ１は、重鎖可変ドメインにおける、およそ残基３１～３５に位置し、ＣＤＲ－Ｈ２は、およそ残基５０～６５に位置し、ＣＤＲ－Ｈ３は、およそ残基９５～１０２に位置する。したがって、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、所定の抗体に特異的な固有かつ機能的特性を規定する。
重鎖及び軽鎖それぞれにおける３つのＣＤＲは、それほど可変でない傾向がある配列を含有するフレームワーク領域（ＦＲ）により分離される。重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのアミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ及びＣＤＲは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４の順に配置される。ＦＲの大部分のβシート構成により、鎖それぞれにおけるＣＤＲが、それら同士及び他の鎖からのＣＤＲに近接する。得られたコンホメーションは、抗原結合部位に寄与する（Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669を参照のこと）が、全てのＣＤＲ残基が必ずしも、抗原結合に直接関与するわけではない。
ＦＲ残基及びＩｇ定常ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、抗原結合に寄与し及び／又は抗体エフェクター機能を媒介する。一部のＦＲ残基は、エピトープに直接非共有結合させることによる、１つ以上のＣＤＲ残基と相互作用させることによる及び重鎖と軽鎖との間の界面に影響を及ぼすことによる、少なくとも３つの方法における抗原結合において顕著な効果を有すると考えられる。定常ドメインは、抗原結合には直接関与しないが、種々のＩｇエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）における抗体の関与を媒介する。
脊椎動物免疫グロブリンの軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明らかに異なるクラスであるカッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てられる。比較すると、ほ乳類免疫グロブリンの重鎖は、定常ドメインの配列に従って、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのうちの１つに割り当てられる。ＩｇＧ及びＩｇＡは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２それぞれに更に分割される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。ネイティブな免疫グロブリンのクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。
「抗体」、「抗ＴｒｋＢ抗体」、「ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体」及び「変異体ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体」という用語は、本明細書において、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、軽微な修飾、例えば、Ｎ末端切断又はＣ末端切断を有する抗体及び抗体フラグメント、例えば、可変ドメイン及び所望の生物学的活性、例えば、ＴｒｋＢ結合を示す抗体の他の部分を包含する。
「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均質な抗体の集団の抗体を指す。すなわち、その集団中の個々の抗体は、少量存在する場合がある天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原決定基である「エピトープ」に対して向けられている。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、同一のエピトープに対する抗体の実質的に均質な集団を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の任意の技術又は方法論（例えば、ハイブリドーマ法（Kohler et al., 1975, Nature 256:495）又は当技術分野において公知のリコンビナントＤＮＡ法（例えば、ＵＳ第４，８１６，５６７号を参照のこと）又はファージ抗体ライブラリを使用し、Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628及びMarks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597に記載されている技術を使用してリコンビナント産生されるモノクローナル抗体の単離法を含む）により産生することができると、理解されたい。
キメラ抗体は、１つの種（例えば、非ヒトほ乳類、例えば、マウス）由来の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と、別の種（例えば、ヒト）抗体の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域とからなり、第１の種（例えば、マウス）由来の抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を第２の種（例えば、ヒト）由来の抗体の定常領域のＤＮＡ配列に連結させ、連結した配列を含有する発現ベクターでホストをトランスフォーメーションして、キメラ抗体を産生させることにより得ることができる。代替的には、キメラ抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の１つ以上の領域又はドメインが別の免疫グロブリンクラスもしくはアイソタイプ由来又はコンセンサス配列もしくは生殖系列配列由来のモノクローナル抗体中の対応する配列と同一、相同又は変異体であることもできる。キメラ抗体は、このような抗体のフラグメントを含むことができる。ただし、抗体フラグメントが、その親抗体の所望の生物学的活性、例えば、同じエピトープへの結合性を示すという条件である（例えば、ＵＳ第４，８１６，５６７号及びMorrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855を参照のこと）。
「抗体フラグメント」、「抗原結合フラグメント」、「抗ＴｒｋＢ抗体フラグメント」、「ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体フラグメント」、「変異体ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体フラグメント」という用語は、可変領域又は機能的能力、例えば、特異的ＴｒｋＢエピトープ結合性が保持されている、全長抗ＴｒｋＢ抗体の一部を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体、ミニボディ、抗体フラグメントから形成されるダイアボディ及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
全長抗体を、有用な抗体フラグメントを生成するために、パパイン又はペプシン等の酵素で処理することができる。パパイン消化を使用して、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合抗体フラグメントを生成する。各Ｆａｂフラグメントは、単一の抗原結合部位及び残留「Ｆｃ」フラグメントを有する。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖のＣＨ１ドメインも含有する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、なおも抗原を架橋可能である、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。
Ｆａｂ’フラグメントは、ＣＨ１ドメインのＣ末端における抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む更なる残基の存在により、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、ヒンジ領域におけるシステイン残基により連結されたＦａｂ’フラグメントのペアである。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。
「Ｆｖ」フラグメントは、密接な非共有的会合にある１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる完全な抗原認識及び結合部位を含有する。この構成では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を画定する。まとめると、６個のＣＤＲにより、抗体に対する抗原結合特異性が付与される。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む一本鎖Ｆｖ変異体であり、ここで、該ドメインは、一本鎖ポリペプチド鎖中に存在する。一本鎖Ｆｖは、抗原を認識し、結合可能である。また、ｓｃＦｖポリペプチドは、場合により、ｓｃＦｖによる抗原結合のための所望の三次元構造の形成を容易にするために、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に位置するポリペプチドリンカーを含有することもできる（例えば、Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315を参照のこと）。
他の認識される抗体フラグメントは、抗原結合領域のペアを形成するためのタンデムＦｄセグメントのペア（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含むものを含む。これらの「線状抗体」は、例えば、Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062に記載されているように、二重特異性又は単特異性であることができる。
ヒト化抗体又はヒト化抗体フラグメントは、所定の抗原に結合可能であり、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有する１つ以上のＦＲと、非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有する１つ以上のＣＤＲとを含む、免疫グロブリンアミノ酸配列変異体又はそのフラグメントを含む、特定の種類のキメラ抗体である。多くの場合「インポート」配列と呼ばれるこの非ヒトアミノ酸配列は、典型的には、「インポート」抗体ドメイン、特に、可変ドメインから得られる。一般的には、ヒト化抗体は、ヒト重鎖可変ドメイン又はヒト軽鎖可変ドメインのＦＲ間に挿入された、少なくとも非ヒト抗体のＣＤＲ又はＨＶＬを含む。
本発明は、ヒト生殖系列配列の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのＦＲ間に挿入されたマウスリードＤ００３由来のＣＤＲを含有する、特定のヒト化抗ＴｒｋＢ抗体を記載する。特定のマウスＦＲ残基は、ヒト化抗体の機能に重要であるため、特定のヒト生殖系列配列の重鎖可変ドメイン残基及び軽鎖可変ドメイン残基は、対応するマウス配列のものと同じであるように改変されることが理解される。
一態様において、ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体は、少なくとも１つ、典型的には、２つの可変ドメイン（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ及びＦｖフラグメントに含まれるような）を実質的に全て含み、ここで、全て又は実質的に全てのＣＤＲは、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、本明細書において、具体的には、ＣＤＲは、リードＤ００３のマウス配列であり、ＦＲは、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列又は生殖系列配列のＦＲである。別の態様では、ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体は、免疫グロブリンＦｃ領域の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれも含む。通常、抗体は、軽鎖及び重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有するであろう。また、抗体は、必要に応じて、１つ以上の重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＨ４領域を含むことができる。
ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリン並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む任意のアイソタイプから選択することができる。例えば、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞傷害活性を示し、アイソタイプが典型的にはＩｇＧ１であることが望ましい場合、補体固定定常ドメインであることができる。このような細胞傷害活性が望ましくない場合、定常ドメインは、別のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ２のものであることができる。代替的なヒト化抗ＴｒｋＢ抗体は、２つ以上の免疫グロブリンクラス又はアイソタイプからの配列を含むことができ、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当業者の範囲内である。具体的な実施態様では、本発明は、ＩｇＧ１抗体である抗体、とりわけ、エフェクター機能のノックアウトがあるＩｇＧ１抗体である抗体を提供する。
ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体のＦＲ及びＣＤＲ又はＨＶＬは、親配列に正確に対応する必要はない。例えば、インポートＣＤＲ又はＨＶＬ又はコンセンサス配列もしくは生殖系列ＦＲ配列における１つ以上の残基は、置換、挿入又は欠失により改変（例えば、突然変異誘発）することができ、これにより、得られたアミノ酸残基は、いずれかの親配列における対応する位置における元の残基ともはや同一ではないが、それにもかかわらず、抗体は、ＴｒｋＢへの結合の機能を保持する。このような改変は、典型的には、広範ではなく、保存的改変であろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも７５％、より多くの場合、少なくとも９０％、最も多くの場合、９５％超又は９８％超又は９９％超が、親コンセンサス配列又は生殖系列ＦＲ配列及びインポートＣＤＲ配列の残基に対応するであろう。
重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の界面（「ＶＬ－ＶＨ界面」）に影響を及ぼす免疫グロブリン残基は、２つの鎖の互いに対する接近又は配向に影響を及ぼす残基である。鎖間相互作用に関与する場合がある特定の残基は、ＶＬ残基３４、３６、３８、４４、４６、８７、８９、９１、９６及び９８並びにＶＨ残基３５、３７、３９、４５、４７、９１、９３、９５、１００及び１０３（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987）で説明されているナンバリングシステムを利用）を含む。ＵＳ第６，４０７，２１３号にも、ＶＬ残基４３及び８５並びにＶＨ残基４３及び６０等の残基も、この相互作用に関与する場合があることが議論されている。これらの残基は、ヒトＩｇＧについてのみ示されるが、これらは、種を跨いで適用可能である。鎖間相互作用に関与すると合理的に予想される重要な抗体残基が、コンセンサス配列への置換に選択される。
「コンセンサス配列」及び「コンセンサス抗体」という用語は、任意の特定のクラス、アイソタイプ又はサブユニット構造、例えば、ヒト免疫グロブリン可変ドメインの全ての免疫グロブリンにおける各位置に最も頻繁に存在するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を指す。コンセンサス配列は、特定の種又は多くの種の免疫グロブリンに基づくことができる。「コンセンサス」配列、構造又は抗体は、特定の実施態様に記載されたコンセンサスヒト配列を包含し、任意の特定のクラス、アイソタイプ又はサブユニット構造の全てのヒト免疫グロブリンにおける各位置に最も頻繁に存在するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を指すと理解される。このため、コンセンサス配列は、１つ以上の公知の免疫グロブリンに存在するが、任意の単一の免疫グロブリンのアミノ酸配列全体を正確には複製しない場合がある、アミノ酸を各位置に有するアミノ酸配列を含有する。可変領域コンセンサス配列は、任意の天然に産生された抗体又は免疫グロブリンからは得られない。Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.,及びその異本。重鎖コンセンサス配列及び軽鎖コンセンサス配列のＦＲ並びにその変異体は、ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体の調製に有用な配列を提供する。例えば、ＵＳ第６，０３７，４５４号及び同第６，０５４，２９７号を参照のこと。
ヒト生殖系列配列は、ヒト集団において天然に見出される。これらの生殖系列遺伝子の組み合わせから、抗体多様性が生じる。抗体の軽鎖の生殖系列抗体配列は、保存されたヒト生殖系列カッパ又はラムダｖ遺伝子及びｊ遺伝子に由来する。同様に、重鎖配列は、生殖系列ｖ－、ｄ－及びｊ－遺伝子に由来する（LeFranc, M-P, and LeFranc, G, “The Immunoglobulin Facts Book” Academic Press, 2001）。
「単離された」抗体は、その本来の環境の成分から特定され、分離され及び／又は回収された抗体である。抗体の本来の環境の汚染成分は、抗体の診断的又は治療的使用を妨害する場合があるような物質であり、酵素、ホルモン又は他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質であることができる。一態様において、抗体は、抗体の少なくとも９５重量％超の単離まで精製されるであろう。
単離された抗体は、抗体の本来の環境の少なくとも１種の成分が存在しないであろうために、それが産生されるリコンビナント細胞内のｉｎ ｓｉｔｕでの抗体を含む。ただし、通常、単離された抗体は、リコンビナント細胞物質が除去される少なくとも１つの精製工程により調製されるであろう。
「抗体性能」という用語は、抗原の抗体認識又はｉｎ ｖｉｖｏでの抗体の有効性に寄与する要因／特性を指す。抗体のアミノ酸配列の変化は、フォールディング等の抗体特性に影響を及ぼす場合があり、物理的要因、例えば、抗原への抗体結合の初速度（ｋａ）、抗原からの抗体の解離定数（ｋｄ）、抗原に対する抗体の親和定数（Ｋｄ）、抗体のコンホメーション、タンパク質安定性及び抗体の半減期に影響を及ぼす場合がある。
本明細書で使用する場合、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一」又は「％同一性」という用語は、最大の対応のために比較され、アライメントされた場合、同じであるか又は特定の割合の同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。％同一性を決定するために、配列は、最適な比較目的でアライメントされる（例えば、ギャップを、第２のアミノ又は核酸配列との最適なアライメントのために、第１のアミノ酸又は核酸配列の配列に導入することができる）。ついで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められる場合には、分子は、その位置で同一である。２つの配列間の％同一性は、配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複位置）×１００）。一部の実施態様では、比較される２つの配列が、ギャップが配列内に適切に導入された後、同じ長さである（例えば、比較される配列を越えて伸びる追加の配列を除外する）。例えば、可変領域配列が比較される場合、リーダー及び／又は定常ドメイン配列は考慮されない。２つの配列間の配列比較のために、「対応する」ＣＤＲは、両方の配列において同じ位置にあるＣＤＲ（例えば、各配列のＣＤＲ－Ｈ１）を指す。
２つの配列間の％同一性又は％類似性の決定を、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムであり、このアルゴリズムは、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877において改良されている。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、目的のタンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２により行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、目的のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により行うことができる。比較の目的でギャップアラインメントを得るために、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。代替的には、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を行うことができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用することができる。配列分析のための更なるアルゴリズムは、当技術分野において公知であり、Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5に記載されているようなＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ；並びにPearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8記載されているＦＡＳＴＡを含む。ＦＡＳＴＡでは、ｋｔｕｐが、探索の感度及び速度を設定する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合、比較される２つの配列中の類似の領域は、アライメントされた残基のペアを見ることにより見出され、ｋｔｕｐ＝１の場合、単一のアライメントされたアミノ酸が試験される。ｋｔｕｐは、タンパク質配列については２もしくは１又はＤＮＡ配列については１～６に設定することができる。ｋｔｕｐが指定されていない場合のデフォルトは、タンパク質では２、ＤＮＡでは６である。代替的には、タンパク質配列アラインメントは、Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402に記載されているように、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して行うことができる。
核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「操作可能に連結している」。例えば、核酸プレ配列又は分泌リーダーは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードする核酸に操作可能に連結しており、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に操作可能に連結しており又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に操作可能に連結している。一般的には、「操作可能に連結している」は、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には連続しており、リーディングフレームにあることを意味する。一方、エンハンサーは、場合により連続している。連結は、便宜な制限部位におけるライゲーションにより達成することができる。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用することができる。
本明細書で使用する場合、「細胞」、「細胞系統」及び「細胞培養物」という表現は、互換的に使用され、全てのこのような名称は、その子孫を含む。このため、「トランスフォーマント」及び「トランスフォーメーションされた細胞」は、トランスファーの回数に関係なく、初代対象細胞及びそれに由来する培養物を含む。
処置の目的での「ほ乳類」という用語は、ヒト、家畜及び農場動物並びに動物園、スポーツ又はペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、ほ乳類として分類される任意の動物を指す。好ましくは、ほ乳類は、ヒトである。
本明細書で使用する場合、「障害」は、本明細書に記載されたヒト化抗ＴｒｋＢ抗体による処置から利益を得るであろう任意の状態である。これは、ほ乳類を対象となる障害にかかりやすくするような病的状態を含む慢性及び急性の障害又は疾患を含む。本明細書で処置される非限定的な例又は障害は、眼又は網膜の障害を含む。
本明細書で使用する場合、「ＴｒｋＢ関連障害」又は「ＴｒｋＢ関連疾患」という用語は、ＴｒｋＢを発現する細胞の修飾又は活性化が示される状態を指す。ＴｒｋＢ関連障害は、加齢黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜色素変性症、遺伝性網膜ジストロフィー、遺伝性黄斑ジストロフィー、近視性変性、網膜静脈閉塞、網膜動脈閉塞、眼内炎、ブドウ膜炎、嚢胞様黄斑浮腫、任意の網膜疾患に続く脈絡膜新生血管膜、視神経障害、緑内障、網膜剥離、中毒性網膜症、放射線網膜症及び外傷性網膜症並びに前駆及び軽度～中程度のアルツハイマー病、アルツハイマー病を患う患者の疾患進行の遅延、ハンチントン病、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、統合失調症に関連する認知障害、減弱精神病症候群を患う個体における初発精神病の予防、統合失調症を患う患者における再発の予防、処置抵抗性うつ病及び代謝性疾患、例えば、過食症、肥満又はメタボリックシンドローム等の疾患及び障害を含む。
「硝子体内注射」という用語は、当技術分野においてその通常の意味を有し、患者の硝子体への抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントの導入を指す。
「皮下投与」という用語は、動物又はヒト患者の皮膚下、好ましくは、皮膚と下にある組織との間のポケット内に、薬剤レセプタクルからの比較的ゆっくりとした持続送達により、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを導入することを指す。皮膚をつまんだり、引き上げたりして、下にある組織から離すと、ポケットを形成することができる。
「皮下注入」という用語は、動物又はヒト患者の皮膚下、好ましくは皮膚と下にある組織との間のポケット内に、薬剤レセプタクルからの比較的ゆっくりとした持続的送達により、３０分以内又は９０分以内を含むが、これらに限定されない期間、薬剤を導入することを指す。場合により、注入は、動物又はヒト患者の皮膚の下に埋め込まれた薬剤送達ポンプの皮下インプラントにより行うことができ、ここで、ポンプにより、所定の期間、例えば、３０分、９０分又は処置計画の長さにわたる期間、所定量の薬剤が送達される。
「皮下ボーラス」という用語は、動物又はヒト患者の皮膚の下での薬剤投与を指し、ここで、ボーラス薬剤送達は、約１５分未満、別の態様では、５分未満、更に別の態様では、６０秒未満である。更に別の態様では、投与は、皮膚と下にある組織との間のポケット内であり、ここで、このポケットは、皮膚をつまんだり、引き上げたりして、下にある組織から離すことにより形成することができる。
「治療上有効量」という用語は、処置される障害の１つ以上の症状を軽減し又は改善する、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントの量を指すのに使用される。そうすることで、有益な患者アウトカムを有する量となる。一態様において、治療上有効量は、神経保護効果又は神経再生効果を有する。別の態様では、治療上有効量は、例えば、疾患進行を遅らせるのに有効であることが示されているターゲット血清濃度を指す。有効性は、処置される状態に応じて、従来の方法で測定することができる。例えば、ＴｒｋＢを発現する細胞により特徴付けられる眼／網膜疾患又は障害において、有効性は、応答速度、例えば、視力の回復を決定することにより又は疾患進行までの遅延の時間を評価することにより測定することができる。
本明細書で使用する場合、「処置」及び「治療」等の用語は、１つ以上の症状の緩和又は軽減、退行、疾患又は障害の進行の遅延又は停止を含むが、これらに限定されない、任意の臨床的に望ましい又は有益な効果をもたらす疾患又は障害の治療的及び予防的又サプレッシブな尺度を含むことを意味する。このため、例えば、処置という用語は、疾患又は障害の症状の発症前又は発症後に、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することにより、疾患又は障害の１つ以上の徴候を予防し又は除去することを含む。別の例として、この用語は、疾患の症状と戦うための疾患の臨床的徴候後に、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを投与すること含む。更に、発症後及び臨床症状後の抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントの投与が開発された。この場合、この処置が疾患の改善をもたらし、本明細書で使用されるような「処置」又は「治療」を含むか否かにかかわらず、投与は、組織損傷の程度又は転移の量もしくは程度等の疾患又は障害の臨床パラメータに影響を及ぼす。更に、本発明の組成物が、単独で又は別の治療剤と組み合わせて、抗ＴｒｋＢ抗体成分又はその抗原結合フラグメントの使用の非存在下での症状と比較して、処置される障害の少なくとも１つの症状を軽減し又は改善する限り、その結果は、障害の全ての症状が軽減されるか否かにかかわらず、基礎障害の有効な処置とみなされるべきである。
「添付文書」という用語は、このような治療製品の使用に関する適応症、用法、投与、禁忌及び／又は警告についての情報を含有する、治療製品の市販パッケージに慣例的に含まれる指示書を指すのに使用される。
抗体
本明細書において、抗ＴｒｋＢ抗体、特に、ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体並びに本発明の抗ＴｒｋＢ抗体を含む組成物及び製品が記載され、開示される。抗ＴｒｋＢ抗体の抗原結合フラグメントも記載される。抗ＴｒｋＢ抗体及びその抗原結合フラグメントは、ＴｒｋＢ経路の活性の低下を特徴とする各種の疾患又は障害の処置に使用することができる。抗ＴｒｋＢ抗体及びその抗原結合フラグメントはそれぞれ、ＴｒｋＢエピトープを特異的に認識する少なくとも一部を含む。
最初の特徴決定において、抗ＴｒｋＢマウスリードＤ００３を、その優れた抗体性能に基づいて選択した。変異体のライブラリを、マウスリードのＣＤＲをヒトコンセンサス重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのＦＲに配置し、更に、異なる改変を有するＦＲを操作することにより生成した。
これにより、以下に示すような種々のヒト化重鎖可変配列及び軽鎖可変配列が得られた。
ＶＬ配列
Ｄ００３＿ＶＬ（マウスリード）、可変軽鎖、配列番号：１
Figure 0007267208000001
２７７－ｇｒ＿ＶＬ、（ヒト化）可変軽鎖、配列番号：２
Figure 0007267208000002
２７７－３３＿ＶＬ：（ヒト化）可変軽鎖、配列番号：３
Figure 0007267208000003
２７７－３５＿ＶＬ：（ヒト化）可変軽鎖、配列番号：４
Figure 0007267208000004
２７７－４２＿ＶＬ、（ヒト化）可変軽鎖、配列番号：５
Figure 0007267208000005
２７７－４４＿ＶＬ、（ヒト化）可変軽鎖、配列番号：６
Figure 0007267208000006
２７７－４８＿ＶＬ、（ヒト化）可変軽鎖、配列番号：７
Figure 0007267208000007
２７７－５１＿ＶＬ、（ヒト化）可変軽鎖、配列番号：８
Figure 0007267208000008
２７７－６４＿ＶＬ、（ヒト化）可変軽鎖、配列番号：９
Figure 0007267208000009
２７７－６７＿ＶＬ、（ヒト化）可変軽鎖、配列番号：１０
Figure 0007267208000010
ＶＨ配列
Ｄ００３＿ＶＨ、（ネズミリード）可変重鎖、配列番号：１１
Figure 0007267208000011
２７７－ｇｒ＿ＶＨ、（ヒト化）可変重鎖、配列番号：１２
Figure 0007267208000012
２７７－３３＿ＶＨ、（ヒト化）可変重鎖、配列番号：１３
Figure 0007267208000013
２７７－３５＿ＶＨ、（ヒト化）可変重鎖、配列番号：１４
Figure 0007267208000014
２７７－４２＿ＶＨ、（ヒト化）可変重鎖、配列番号：１５
Figure 0007267208000015
２７７－４４＿ＶＨ、（ヒト化）可変重鎖、配列番号：１６
Figure 0007267208000016
２７７－４８＿ＶＨ、（ヒト化）可変重鎖、配列番号：１７
Figure 0007267208000017
２７７－５１＿ＶＨ、（ヒト化）可変重鎖、配列番号：１８
Figure 0007267208000018
２７７－６４＿ＶＨ、（ヒト化）可変重鎖、配列番号：１９
Figure 0007267208000019
２７７－６７＿ＶＨ、（ヒト化）可変重鎖、配列番号：２０
Figure 0007267208000020
下線を引いた配列は、可変軽鎖領域及び可変重鎖領域のＣＤＲ領域に対応する。
本発明のヒト化抗ＴｒｋＢ抗体は、下記表に示される軽鎖及び重鎖の配列を有する抗体である。ＩｇＧ１－ＫＯ突然変異体を、エフェクター機能を低下させるために、Ｆｃ領域に２つの突然変異であるＬｅｕ２３２Ａｌａ及びＬｅｕ２３３Ａｌａを導入することにより作製した。
Figure 0007267208000021
Figure 0007267208000022

Figure 0007267208000023

Figure 0007267208000024

Figure 0007267208000025

Figure 0007267208000026

Figure 0007267208000027
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＣＣＧ）ナンバリングによる上記ＣＤＲには、下線が引かれている（Almagro et al., Proteins 2011; 79:3050-3066 and Maier et al, Proteins 2014; 82:1599-1610）。配列についてのＫａｂａｔナンバリングは、太字テキストで示され、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングシステムは、イタリック体のテキストで示される。
一態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＫＤ＜１０nMでヒトＴｒｋＢに結合する。更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＫＤ＜５nMでヒトＴｒｋＢに結合する。更に別の態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、約１nMのＫＤでヒトＴｒｋＢに結合する。抗ＴｒｋＢ抗体の結合親和性は、実施例６に記載される方法に従って決定することができる。
別の態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、高い活性でＴｒｋＢリン酸化及び／又は活性化を誘引する。一態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＥＣ５０＜１００pMでヒトＴｒｋＢをリン酸化する。更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＥＣ５０＜５０pMでヒトＴｒｋＢをリン酸化する。更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＥＣ５０＜４０pMでヒトＴｒｋＢをリン酸化する。更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＥＣ５０＜３０pMでヒトＴｒｋＢをリン酸化する。更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、約２０pMのＥＣ５０でヒトＴｒｋＢをリン酸化する。
別の態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＴｒｋＢ下流シグナル伝達経路の活性化を誘引することにおいて、天然のＴｒｋＢリガンドＢＤＮＦより強力である。抗ＴｒｋＢ抗体の活性は、実施例８に記載される方法に従って、分化したＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞において決定することができる。
更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、天然のＴｒｋＢリガンドＢＤＮＦと同等の遺伝子発現を誘引する。アゴニスト性抗ＴｒｋＢ抗体による刺激により、シナプス可塑性の増加のためのマーカーであるため、抗ＴｒｋＢ抗体がニューロン機能のモデュレーション、すなわち、ニューロン生存及び／又はシナプス可塑性の向上において天然のリガンドＢＤＮＦのように作用することの指標である、ＡＲＣ、ＶＧＦ、ＥＧＲ１のｍＲＮＡ発現が向上する。遺伝子発現パターンは、実施例１０に記載される方法に従って決定することができる。
更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＴｒｋＢ依存性生存シグナル伝達経路を刺激することにより、神経保護を提供することにより、例えば、加齢性黄斑変性、地図状萎縮又は糖尿病性網膜症を患う患者の網膜におけるニューロン、グリア細胞及び／又は神経血管単位を保護する。
別の態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、例えば、加齢黄斑変性、地図状萎縮又は糖尿病性網膜症における疾患発症後に網膜における軸索／樹状突起及び／又はシナプスを再生することにより、神経再生を生じさせる。
更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、そのＣＤＲ配列に関して低い免疫原性リスク及び低い配列負担を有する。免疫原性及び不均一性は、治療抗体の２つの重要な側面である。このような側面の測定は、実施例４及び５に記載される方法により行うことができる。本発明の抗体は、免疫原性及び／又は不均一性を最小限に有するか又はこれらを有さないように注意深く操作されている。
更に別の態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＢＤＮＦ誘引ＥＲＫリン酸化を減少させない。この目的で、ＥＲＫリン酸化は、例えば、実施例１３に記載されるように、ヒトＴｒｋＢを発現するＣＨＯ細胞において測定することができる。これは、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体を投与した場合、内因的に発現されたＢＤＮＦにより誘引されるＥＲＫリン酸化が減少しないことを意味する場合がある。また、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体が、ＢＤＮＦを外因的に投与する前、同時又は後に投与された場合に、ＥＲＫリン酸化を減少させないことも意味する場合がある。一部の例では、抗ＴｒｋＢ抗体は、ＢＤＮＦ誘引単独と比較して、ＢＤＮＦ誘引ＥＲＫリン酸化と競合しないか又はそれより低い。
更なる態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、ＴｒｋＢリン酸化及び／又は活性化に特異的であり、ＴｒｋＡ又はＴｒｋＣを非特異的にリン酸化せず及び／又は活性化しない。
別の態様では、抗ＴｒｋＢ抗体は、ヒトＶＥＧＦ及び／又はラットＶＥＧＦに非特異的に結合しない。この文脈において、非特異的に結合することは、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体が、例えば、実施例１４に記載されるＥＬＩＳＡにおいて測定されるように、ヒトＶＥＧＦに結合しないことを意味する。一実施態様において、抗ＴｒｋＢ抗体が非特異的に結合しないことは、抗ＴｒｋＢ抗体と適切なＩｇＧアイソタイプ対照抗体との間でのヒトＶＥＧＦへの結合における統計学的有意差（例えば、独立ｔ検定、ｐ＜０．０５）を測定することにより決定することができる。特に、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体が非特異的に結合しないことは、抗ＴｒｋＢ抗体とＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体との間でのヒトＶＥＧＦへの結合の任意の差異を決定することにより測定することができる。本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、約０．３nM、０．４nM、０．５nM、０．６nM、０．７nM、０．８nM、０．９nM、１nM、５nM、１０nM、２０nM、３０nM、４０nM、５０nM、６０nM、７０nM、８０nM、９０nM、１００nM、１１０nM、１２０nM、１３０nM、１４０nM、１５０nM、１６０nM、１７０nM、１８０nM、１９０nM又は２００nMの濃度まで、等しく濃縮されたＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較して、ヒトＶＥＧＦに結合しないことに顕著に異ならないであろう。代替的な実施態様では、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体が非特異的に結合しないことは、ヒト又はラットＶＥＧＦのいずれか一方に対する抗ＴｒｋＢ抗体のＩＣ５０結合価を測定することにより測定することができる。特に、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、約０．９μＭ超、好ましくは、１μM超、２μM超、３μM超、５μM超、１０μM超、２０μM超、３０μM超、４０μM超、５０μM超、１００μM超、１５０μM超、２００μM超、２５０μM超、３００μM超、３５０μM超、４００μM超、４５０μM超、５００μM超、５５０μM超、６００μM超、６５０μM超、７００μM超、７５０μM超、８００μM超、８５０μM超又は９００μM超のヒト又はラットＶＥＧＦに対するＩＣ５０結合価を示すであろう。
ヒト化及びアミノ酸配列変異体
更なる変異抗ＴｒｋＢ抗体及び抗体フラグメントは、マウスリードＤ００３において特定されたＣＤＲのセットに基づいて操作することができる。前記変異抗ＴｒｋＢ抗体及び抗体フラグメントにおいて、ＣＤＲのアミノ酸配列は変化しないままであるが、周囲の領域、例えば、ＦＲ領域を操作することができると理解されたい。抗ＴｒｋＢ抗体のアミノ酸配列変異体は、抗ＴｒｋＢ抗体ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することにより又はペプチド合成により調製することができる。このような変異体は、例えば、本明細書における実施例の抗ＴｒｋＢ抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又は同配列への挿入及び／又は同残基の置換を含む。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせは、最終構築物が所望の特徴を有することを条件として、最終構築物に到達するように行われる。また、アミノ酸変化は、ヒト化又は変異抗ＴｒｋＢ抗体の翻訳後プロセス、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させることも変化させる場合がある。
一部の実施態様では、本発明は、可変軽鎖及び可変重鎖を有する抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗体フラグメントであって、可変軽鎖アミノ酸配列及び可変重鎖アミノ酸配列が、配列番号：２及び１２又は３及び１３又は４及び１４又は５及び１５又は６及び１６又は７及び１７又は８及び１８又は９及び１９又は１０及び２０それぞれのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗体フラグメントを含む。
一部の実施態様では、本発明は、軽鎖及び重鎖を有する抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗体フラグメントであって、軽鎖アミノ酸配列及び重鎖アミノ酸配列が、配列番号：２１及び２２又は２３；２４及び２５又は２６；２７及び２８又は２９；３０及び３１又は３２；３３及び３４又は３５；３６及び３７又は３８；３９及び４０又は４１；４２及び４３又は４４；４５及び４６又は４７それぞれのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗体フラグメントを含む。
更なる実施態様では、本発明は、ＴｒｋＢへの結合について、下記抗体のいずれか１つと競合する抗ＴｒｋＢ抗体を含む。
配列番号：２１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：２２又は２３のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体、
配列番号：２４のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：２５又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体、
配列番号：２７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：２８又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体、
配列番号：３０のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：３１又は３２のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体、
配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：３４又は３５のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体、
配列番号：３６のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：３７又は３８のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体、
配列番号：３９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４０又は４１のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体、
配列番号：４２のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４３又は４４のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体又は
配列番号：４５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４６又は４７のアミノ酸配列を含む重鎖を有する抗体。
抗体の別のタイプのアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更することを含む。この文脈における「変更すること」という用語は、抗体中に見出される１つ以上の炭水化物部分を欠失させること及び／又は抗体中に元々存在していなかった１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。
一部の態様では、本発明は、本明細書に記載された抗ＴｒｋＢ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする、核酸分子を含む。抗ＴｒｋＢ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の各種の方法により調製される。これらの方法は、天然のソースからの単離（天然のアミノ酸配列変異体の場合）又は抗ＴｒｋＢ抗体の以前に調製された変異体又は非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及びカセット突然変異誘発による調製を含むが、これらに限定されない。
特定の実施態様では、抗ＴｒｋＢ抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントの産生のために開発された技術が存在する。フラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化により得ることができる（例えば、Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117及びBrennan et al., 1985, Science 229:81を参照のこと）。代替的には、フラグメントは、リコンビナントホスト細胞中で直接産生することができる。例えば、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントは、E. coliから直接回収することができ、化学的に連結させて、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（例えば、Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167を参照のこと）。別のアプローチにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、リコンビナントホスト細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者に明らかであろう。
抗ＴｒｋＢ抗体及びその抗原結合フラグメントは、改変を含むことができる。
特定の実施態様では、インタクトな抗体ではなく、抗ＴｒｋＢ抗体フラグメントを使用するのが望ましい場合がある。その血清半減期を伸ばすために、抗体フラグメントを改変することが望ましい場合がある。これは、例えば、サルベージレセプター結合エピトープを抗体フラグメントに組み込むことにより達成することができる。１つの方法において、抗体フラグメントの適切な領域を変化させる（例えば、突然変異させる）ことができ又はついで、エピトープを、例えば、ＤＮＡもしくはペプチド合成により、いずれかの末端もしくは中央において抗体フラグメントに融合されるペプチドタグに組み込むことができる。例えば、ＷＯ第９６／３２４７８号を参照のこと。
他の実施態様では、本発明は、抗ＴｒｋＢ抗体の共有結合改変を含む。共有結合改変は、システイニル残基、ヒスチジル残基、リシニル及びアミノ末端残基、アルギニル残基、チロシル残基、カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）、グルタミニル及びアスパラギニル残基又はセリルもしくはスレオニル残基の改変を含む。別のタイプの共有結合改変は、グリコシドを抗体に化学的又は酵素的に連結させることを含む。このような改変は、適用可能であれば、化学合成により又は抗体の酵素的もしくは化学的開裂により行うことができる。抗体の他のタイプの共有結合改変は、抗体のターゲットアミノ酸残基を、選択された側鎖又はアミノ末端残基もしくはカルボキシ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることにより、分子に導入することができる。
抗体に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的に又は酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52及びEdge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131に記載されている。抗体における炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350に記載されているような各種のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。
別のタイプの有用な共有結合改変は、ＵＳ第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号及び同第４，１７９，３３７号の１つ以上で説明されている様式で、各種の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンの１つに抗体を連結することを含む。
エピトープ結合
本発明の抗体は、ネイティブ又はリコンビナントヒトＴｒｋＢに特異的に結合する。本発明の抗体は、特定の「ＴｒｋＢ抗原エピトープ」及び「ＴｒｋＢエピトープ」を認識する。特に、本発明の抗体は、配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外ドメイン中のエピトープに結合する。
ヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインは、下記配列（配列番号：５４）を本質的に含む。
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本明細書で使用する場合、「ＴｒｋＢ抗原エピトープ」及び「ＴｒｋＢエピトープ」という用語は、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントに結合可能な分子（例えば、ペプチド）又は分子のフラグメントを指す。これらの用語は、例えば、配列番号：４８～５０の軽鎖ＣＤＲ及び配列番号：５１～５３の重鎖ＣＤＲから選択される軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲの組み合わせを有する、本発明の抗体又は抗体フラグメントのいずれかにより認識されるＴｒｋＢ抗原決定基を更に含む。
ＴｒｋＢ抗原エピトープは、タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド等に含まることができる。エピトープは、最も一般的には、タンパク質、短いオリゴペプチド、オリゴペプチド模倣物（すなわち、ＴｒｋＢ抗原の抗体結合特性を模倣する有機化合物）又はそれらの組み合わせである。
本発明の抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインにおける固有のエピトープに結合することが見出された。好ましくは、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインのアミノ酸領域９２～１１２、１３０～１４３及び／又は２０５～２１９内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する。
一実施態様において、本発明は、配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインのアミノ酸領域９２～１１２及び１３０～１４３；又は９２～１１２及び２０５～２１９；又は１３０～１４３及び２０５～２１９；又は９２～１１２及び１３０～１４３及び２０５～２１９内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、アミノ酸領域の前述の組み合わせのいずれかにおける少なくとも１つのアミノ酸残基に結合し、更に、配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインのアミノ酸領域３１３～３３０及び／又は３４８～３６７内の少なくとも１つのアミノ酸残基にも結合する、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインのアミノ酸領域９２～１１２、１３０～１４３、２０５～２１９、３１３～３３０及び３４８～３６７内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
このため、エピトープ結合の文脈において、「アミノ酸領域Ｘ～Ｙ．．．内で結合する」という語句は、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列中に特定されるアミノ酸領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合することを意味する。
例えば、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントが、アミノ酸領域９２～１１２又は１３０～１４３内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する場合、これは、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントが、アミノ酸領域９２～１１２又は１３０～１４３内のいずれかの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合することを意味する。
更なる例では、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸領域９２～１１２及び１３０～１４３内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する場合、これは、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントが、アミノ酸領域９２～１１２内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合し、配列番号：５４のアミノ酸領域１３０～１４３内の少なくとも１つのアミノ酸残基にも結合することを意味する。
別の態様では、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインのアミノ酸領域９２～１１２、１３０～１４３及び／又は２０５～２１９内の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％のアミノ酸残基に結合する。
一実施態様において、本発明は、配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインのアミノ酸領域９２～１１２及び１３０～１４３；又は９２～１１２及び２０５～２１９；又は１３０～１４３及び２０５～２１９；又は９２～１１２及び１３０～１４３及び２０５～２１９内の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％のアミノ酸残基に結合する、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、アミノ酸領域の前述の組み合わせのいずれかにおける少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％のアミノ酸残基に結合し、更に、配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインのアミノ酸領域３１３～３３０及び／又は３４８～３６７内の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％のアミノ酸残基にも結合する、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施態様において、本発明は、配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインのアミノ酸領域９２～１１２、１３０～１４３、２０５～２１９、３１３～３３０及び３４８～３６７内の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％のアミノ酸残基に結合する、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
例えば、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントが、アミノ酸領域９２～１１２又は１３０～１４３内の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％のアミノ酸残基に結合する場合、これは、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントが、アミノ酸領域９２～１１２内の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％のアミノ酸残基に結合するか又はアミノ酸領域１３０～１４３内の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％のアミノ酸残基に結合することを意味する。
更なる例では、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントが、アミノ酸領域９２～１１２及び１３０～１４３内の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％のアミノ酸残基に結合する場合、これは、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントが、アミノ酸領域９２～１１２内のアミノ酸残基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％のアミノ酸残基に結合し、アミノ酸領域１３０～１４３内の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％のアミノ酸残基に結合することを意味する。
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、新規なエピトープへの結合のために、ＴｒｋＢ抗体は、ＴｒｋＢを活性化する際にその優れた効果を発揮すると考えられる。
ポリヌクレオチド、ベクター、ホスト細胞及びリコンビナント法
他の実施態様は、抗ＴｒｋＢ抗体をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター及びホスト細胞並びに抗体の製造のためのリコンビナント技術を包含する。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、全長モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子並びに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含む、任意の所望の形態の抗ＴｒｋＢ抗体をコードすることができる。
抗ＴｒｋＢ抗体又はそのフラグメントもしくは鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドは、当技術分野において公知であるように、１つ以上のレギュラトリー配列又は制御配列に融合することができ、当技術分野において公知であるように、適切な発現ベクター又はホスト細胞に含有させることができる。重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチド分子はそれぞれ、定常ドメイン、例えば、ヒト定常ドメインをコードするポリヌクレオチド配列に独立して融合することができ、インタクトな抗体の産生が可能となる。代替的には、ポリヌクレオチド又はその一部同士が融合することができ、一本鎖抗体の産生のためのテンプレートを提供する。
リコンビナント産生のために、抗体をコードするポリヌクレオチドは、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために、複製可能なベクターに挿入される。リコンビナント抗体を発現するための多くの適切なベクターが利用可能である。ベクターコンポーネントは、一般的には、下記：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。
また、抗ＴｒｋＢ抗体は、融合ポリペプチドとして産生することもでき、ここで、この抗体は、異種ポリペプチド、例えば、シグナル配列又は成熟タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ末端において特異的切断部位を有する他のポリペプチドと融合される。選択される異種シグナル配列は、典型的には、ホスト細胞により認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより開裂される）配列である。抗ＴｒｋＢ抗体シグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物ホスト細胞については、シグナル配列は、原核生物シグナル配列により置き換えることができる。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、リポタンパク質、熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダー等であることができる。酵母分泌のために、ネイティブなシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼアルファ因子（Saccharomyces及びKluyveromycesのα因子リーダーを含む）、酸性ホスファターゼ、C.albicansのグルコアミラーゼ又はＷＯ第９０／１３６４６号に記載されているシグナルから得られるリーダー配列により置き換えることができる。ほ乳類細胞において、ほ乳類シグナル配列及びウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルを使用することができる。このような前駆領域のためのＤＮＡは、ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体をコードするＤＮＡにリーディングフレームにおいてライゲーションされる。
発現ベクター及びクローニングベクターは、そのベクターが１つ以上の選択されたホスト細胞において複製することが可能な核酸配列を含有する。一般的には、クローニングベクターにおいて、この配列は、そのベクターがホスト染色体ＤＮＡとは独立して複製することが可能な配列であり、複製起点又は自律複製配列を含む。このような配列は、各種の細菌、酵母及びウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２－νプラスミド起点は、酵母に適しており、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ及びＢＰＶ）は、ほ乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的には、複製起点コンポーネントは、ほ乳類発現ベクターには必要ない（典型的には、ＳＶ４０起点のみを使用することができる。ＳＶ４０が、初期プロモーターを含有するためである）。
発現ベクター及びクローニングベクターは、発現の特定を容易にするために、選択マーカーをコードする遺伝子を含有することができる。典型的な選択マーカー遺伝子は、抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードするかあるいは、補体栄養要求性欠損であるか又は他の代替例において、複合培地に存在しない特定の栄養素、例えば、BacilliのためのＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給する。
選択スキームの一例では、ホスト細胞の生育を阻止する薬剤を利用する。異種遺伝子でうまくトランスフォーメーションされた細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生するため、選択レジメンを生き残る。このような優性選択の例では、薬剤であるネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンが使用される。ほ乳類細胞のための一般的な選択マーカーは、ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体をコードする核酸を取り込んだ細胞コンピテントを特定可能なマーカー、例えば、ＤＨＦＲ（ジヒドロフォラートレダクターゼ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン－Ｉ及び－ＩＩ（例えば、霊長類メタロチオネイン遺伝子）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等である。ＤＨＦＲ選択遺伝子でトランスフォーメーションされた細胞は、最初に、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で全てのトランスフォーマントを培養することにより特定される。野生型ＤＨＦＲが利用される場合に適したホスト細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系統（例えば、ＤＧ４４）である。
代替的には、抗ＴｒｋＢ抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質及び別の選択マーカー、例えば、アミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列でトランスフォーメーションされ又は同時トランスフォーメーションされたホスト細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型ホスト）を、選択マーカーのための選択薬剤、例えば、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８を含有する培地中での細胞増殖により選択することができる。例えば、ＵＳ第４，９６５，１９９号を参照のこと。
リコンビナント産生が、ホスト細胞として酵母細胞中で行われる場合、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するＴＲＰ１遺伝子（Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39）を、選択マーカーとして使用することができる。ＴＲＰ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異系統、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６又はＰＥＰ４－１のための選択マーカーを提供する（Jones, 1977, Genetics 85:12）。ついで、酵母ホスト細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンの不存在下での増殖により、トランスフォーメーションを検出するのに効果的な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２ｐ欠損酵母株、例えば、ＡＴＣＣ ２０，６２２及び３８，６２６は、ＬＥＵ２遺伝子を有する公知のプラスミドにより補完される。
加えて、１．６μm 環状プラスミドｐＫＤ１から得られるベクターは、Kluyveromyces酵母のトランスフォーメーションに使用することができる。代替的には、リコンビナントウシキモシンの大規模産生のための発現系が、K. lactisについて報告された（Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135）。また、Kluyverycesの工業株による成熟リコンビナントヒト血清アルブミンの分泌のための安定したマルチコピー表現ベクターも開示されている（Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975）。
発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、ホスト生物により認識され、抗ＴｒｋＢ抗体又はそのポリペプチド鎖をコードする核酸分子に操作可能に連結されるプロモーターを含有する。原核生物ホストと共に使用するのに適したプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β－ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーターを含む。他の公知の細菌プロモーターも適切である。また、細菌系で使用するためのプロモーターは、ヒト化抗ＴｒｋＢ抗体をコードするＤＮＡに操作可能に連結しているＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｍｏ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有するであろう。
多くの真核生物プロモーター配列が公知である。実際には、全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０～８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであることができる）である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端は、コーディング配列の３’末端にポリＡテイルを付加するためのシグナルとなることができるＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列は全て、真核生物発現ベクターに適切に挿入される。
酵母ホストと共に使用するのに適したプロモーター配列の例は、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、３－ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのためのプロモーターを含む。
誘引性プロモーターは、増殖条件により制御される転写の更なる利点を有する。これらは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する誘導酵素（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ）、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のための酵母プロモーター領域を含む。酵母での発現に使用するのに適したベクター及びプロモーターは、ＥＰ第７３，６５７号に更に記載されている。また、酵母エンハンサーも、酵母プロモーターと共に有利に使用される。
ほ乳類ホスト細胞中のベクターからの抗ＴｒｋＢ抗体転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから、異種ほ乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから又はヒートショックプロモーターから得られるプロモーターにより制御される。ただし、このようなプロモーターは、ホスト細胞系と適合性であることが条件である。
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして適宜得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時型初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントとして適宜得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用してほ乳類ホスト中でＤＮＡを発現させるための系は、ＵＳ第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変は、ＵＳ第４，６０１，９７８号に記載されている。Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601も参照のこと。同文献には、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下におけるマウス細胞でのヒトｐ－インターフェロンｃＤＮＡの発現が開示されている。代替的には、ラウス肉腫ウイルス長末端反復を、プロモーターとして使用することができる。
リコンビナント発現ベクターにおいて使用することができる別の有用なエレメントは、高等真核生物により、抗ＴｒｋＢ抗体をコードするＤＮＡの転写を増大させるのに使用されるエンハンサー配列である。ほ乳類遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている。ただし、典型的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例は、複製起点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントの説明については、Yaniv, 1982, Nature 297:17-18も参照のこと。エンハンサーは、抗ＴｒｋＢ抗体コード配列に対して５’又は３’の位置でベクターにスプライシングすることができるが、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。
また、真核生物ホスト細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有することができる。このような配列は、一般的には、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’及び場合によりは３’非翻訳領域から入手できる。これらの領域は、抗ＴｒｋＢ抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結コンポーネントは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ第９４／１１０２６号及びそこに開示されている発現ベクターを参照のこと。一部の実施態様では、抗ＴｒｋＢ抗体は、ＣＨＥＦ系を使用して発現させることができる（例えば、ＵＳ第５，８８８，８０９号を参照のこと；その開示は、本明細書に参照により組み入れられる）。
本明細書におけるベクターにおいて、ＤＮＡをクローニングし又は発現させるのに適したホスト細胞は、上記された原核生物、酵母又は高等真核生物細胞である。この目的に適した原核生物は、真正細菌、例えば、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、Enterobacteriaceae、例えば、Escherichia、例えば、E. coli、Enterobacter、Erwinia、Klebsiella、Proteus、Salmonella、例えば、Salmonella typhimurium、Serratia、例えば、Serratia marcescans及びShigella並びにBacilli、例えば、B. subtilis及びB. licheniformis（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ ２６６，７１０に開示されるB. licheniformis 41 P）、Pseudomonas、例えば、P. aeruginosa及びStreptomycesを含む。１つの好ましいE. coliクローニングホストは、E. coli 294（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、他の系統、例えば、E. coli B、E. coli X1776（ＡＴＣＣ ３１，５３７）及びE. coli W3110（ＡＴＣＣ ２７，３２５）が適切である。これらの例は、限定ではなく、例示である。
原核生物に加えて、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、抗ＴｒｋＢ抗体コードベクターに適したクローニングホスト又は発現ホストである。Saccharomyces cerevisiae又は一般的なパン酵母は、下等真核生物ホスト微生物の中で最も一般的に使用される。ただし、数多くの他の属、種及び株、例えば、Schizosaccharomyces pombe；Kluyveromycesホスト、例えば、K. lactis、K. fragilis（ＡＴＣＣ １２，４２４）、K. bulgaricus（ＡＴＣＣ １６，０４５）、K. wickeramii（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、K. waltii（ＡＴＣＣ ５６，５００）、K. drosophilarum（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、K. thermotolerans及びK. marxianus等；yarrowia（ＥＰ第４０２，２２６号）；Pichia pastors（ＥＰ第１８３，０７０号）；Candida；Trichoderma reesia（ＥＰ第２４４，２３４号）；Neurospora crassa；Schwanniomyces、例えば、Schwanniomyces occidentalis並びに糸状菌、例えば、Neurospora、Penicillium、Tolypocladium等及びAspergillusホスト、例えば、A. nidulans及びA. niger等を、本明細書において、一般的に利用でき、有用である。
グリコシル化抗ＴｒｋＢ抗体の発現に適したホスト細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞、例えば、多くのバキュロウイルス株及び改変体並びにホスト、例えば、Spodoptera frugiperda（毛虫）、Aedes aegypti（蚊）、Aedes albopictus（蚊）、Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）及びBombyx mori（蚕）由来の対応する許容性昆虫ホスト細胞を含む。トランスフェクションのための各種のウイルス株、例えば、Autographa californica NPVのＬ－１変異体及びBombyx mori NPVのＢｍ－５株が公衆に利用可能であり、このようなウイルスは、特に、Spodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションに使用することができる。
綿花、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養物も、ホストとして利用することができる。
また、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントは、ウイルスベクター中に組み込むこともできる。すなわち、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクター中に導入され、ついで、ウイルスによる感染後に患者の体内で発現される。
別の態様では、抗ＴｒｋＢの発現は、脊椎動物細胞において行われる。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、ルーチンな手順になっており、技術は広く利用可能である。有用なほ乳類ホスト細胞株の例は、ＳＶ４０によりトランスフェクションされたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚性腎臓株（懸濁培養物中において増殖用にサブクローニングした２９３又は２９３細胞）（Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ１（ＣＨＯ、Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216；例えば、ＤＧ４４）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251）、サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカ緑サル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸ガン腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＬＣ５１）、ＴＲ１細胞（Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68）、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞及びヒト肝細胞ガン株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
ホスト細胞は、抗ＴｒｋＢ抗体産生のための上記された発現ベクター又はクローニングベクターによりトランスフェクションされ、プロモーターの誘引、トランスフォーマントの選択又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように修飾された従来の栄養培地中において培養される。
本明細書に記載された抗ＴｒｋＢ抗体を産生するのに使用されるホスト細胞は、各種の培地中において培養することができる。市販の培地、例えば、Ham’s F10（Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo)、最小必須培地（ＭＥＭ）（Sigma-Aldrich Co.）、RPMI-1640（Sigma-Aldrich Co.）及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma-Aldrich Co.）が、ホスト細胞を培養するのに適している。加えて、ホスト細胞のための培養培地として、Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44、Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255、ＵＳ第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、同第５，１２２，４６９、ＷＯ第９０／１０３４３０号及び同第８７／００１９５号の１つ以上に記載される培地のいずれかを使用することができる。これらの培地のいずれかに、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン又は上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びホスファート）、バッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）、微量元素（通常、マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充することができる。また、他のサプリメントも、当業者に公知であろう適切な濃度で含ませることができる。培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、発現のために選択されたホスト細胞で以前に使用されているものであり、当業者に明らかであろう。
リコンビナント技術を使用する場合、抗体は、細胞内、ペリプラズム空間において産生し又は培地中に直接分泌させることができる。抗体が細胞内で産生される場合、細胞は、第１の工程として、タンパク質を放出するために破壊される場合がある。ホスト細胞又は溶解されたフラグメントのいずれかである粒子状残屑は、例えば、遠心分離又は限外ろ過により除去することができる。Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167には、E. coliのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手法が記載されている。簡潔に、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分にわたって解凍する。細胞残屑を、遠心分離により除去することができる。抗体が、培地中に分泌される場合、このような発現系からの上清は、一般的にはまず、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon限外ろ過ユニット）を使用して濃縮される。プロテアーゼインヒビター、例えば、ＰＭＳＦを、タンパク質分解を阻害するために、前述の工程のいずれかで含ませることができ、抗生物質を、外来性汚染物の増殖を防止するために含ませることができる。ホスト細胞から抗体を単離するために、各種の方法を使用することができる。
細胞から調製された抗体成分は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができる。ここで、アフィニティークロマトグラフィーは、典型的な精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプにより決まる。プロテインＡを使用して、ヒトガンマ１、ガンマ２又はガンマ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（例えば、Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13を参照のこと）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトガンマ３に推奨される（例えば、Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575を参照のこと）。親和性リガンドが付着するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスを利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば、孔制御ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースで達成できるものより速い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体が、ＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX（商標）樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.）が、精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）におけるヘパリンSEPHAROSE（商標）クロマトグラフィーでのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備精製工程後に、目的の抗体及び汚染物質を含む混合物を、溶出バッファーを約２．５～４．５の間のｐＨで使用する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することができ、典型的には、低塩濃度（例えば、約０～０．２５M 塩）で行うことができる。
また、ＴｒｋＢ抗体又は抗体フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド配列により表わされるヌクレオチド配列の全部又は一部（例えば、可変領域をコードする部分）に、本明細書で定義たような、低、中及び高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、核酸も含まれる。ハイブリダイズ核酸のハイブリダイズ部分は、典型的には、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０又は５０）ヌクレオチド長である。ハイブリダイズ核酸のハイブリダイズ部分は、抗ＴｒｋＢポリペプチド（例えば、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域）をコードする核酸又はその相補鎖の一部又は全部の配列と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％同一である。本明細書に記載されたタイプのハイブリダイズ核酸は、例えば、クローニングプローブ、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー又は診断プローブとして使用することができる。
一部の実施態様では、本発明は、可変軽鎖及び可変重鎖を有する抗体又は抗体フラグメントをコードする配列を含み、ここで、可変軽鎖アミノ酸配列及び可変重鎖アミノ酸配列が、配列番号：２及び１２又は３及び１３又は４及び１４又は５及び１５又は６及び１６又は７及び１７又は８及び１８又は９及び１９又は１０及び２０それぞれのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である、単離されたポリヌクレオチドを含む。
一部の実施態様では、本発明は、軽鎖及び重鎖を有する抗体又は抗体フラグメントをコードする配列を含み、ここで、軽鎖アミノ酸配列及び重鎖アミノ酸配列が、配列番号：２１及び２２又は２３；２４及び２５又は２６；２７及び２８又は２９；３０及び３１又は３２；３３及び３４又は３５；３６及び３７又は３８；３９及び４０又は４１；４２及び４３又は４４；４５及び４６又は４７それぞれのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である、単離されたポリヌクレオチドを含む。
前記抗ＴｒｋＢ抗体及び抗体フラグメントにおいて、ＣＤＲをコードする核酸配列は変化しないままである（それらがコードするアミノ酸に関して変化せず、コドンの縮重によるＤＮＡ配列の同等物が可能である）が、周囲の領域、例えば、ＦＲ領域を操作することができることを理解されたい。
非治療的使用
本明細書に記載された抗体は、アフィニティー精製剤として有用である。このプロセスにおいて、抗体は、当技術分野において周知の方法を使用して、固相、例えば、プロテインＡ樹脂に固定化される。固定化された抗体を、精製されるＴｒｋＢタンパク質（又はそのフラグメント）を含有するサンプルと接触させ、その後、支持体を、固定化された抗体に結合しているＴｒｋＢタンパク質を除くサンプル中の実質的に全ての物質を除去するであろう適切な溶媒により洗浄する。最後に、支持体を、抗体からＴｒｋＢタンパク質を放出するのであろう別の適切な溶媒により洗浄する。
また、抗ＴｒｋＢ抗体は、ＴｒｋＢタンパク質を検出し及び／又は定量するための診断アッセイ、例えば、特定の細胞、組織又は血清におけるＴｒｋＢ発現を検出するのに有用である。
一部の実施態様では、例えば、診断目的のために、抗体を検出可能な部分でラベルするのが有利であろう。放射性同位体、蛍光ラベル、酵素基質ラベル等を含む、多くの検出可能なラベルが利用可能である。ラベルは、種々の公知の技術を使用して、抗体と間接的にコンジュゲーションさせることができる。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲーションさせることができ、上記言及された３種類の広範なカテゴリーのラベルのいずれかは、アビジンとコンジュゲーションさせることができ又はその逆であることもできる。ビオチンは、アビジンに選択的に結合するため、ラベルは、この間接的な様式で、抗体とコンジュゲーションすることができる。代替的には、ラベルと抗体との間接的なコンジュゲーションを達成するために、抗体は、小型ハプテン（例えば、ジゴキシン）とコンジュゲーションさせることができ、上記言及された異なるタイプのラベルの１つは、抗ハプテン抗体（例えば、抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲーションされる。このため、ラベルと抗体との間接的な結合を達成することができる。
例示的な放射性同位体ラベルは、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉを含む。抗体を、例えば、Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubsに記載されている技術を使用して、放射性同位体ラベルによりラベルすることができる。放射活性は、例えば、シンチレーション計数により測定することができる。
例示的な蛍光ラベルは、希土類キレート（ユーロピウムキレート）から得られるラベル又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリン並びにTexas Redを含み、これらを利用可能である。蛍光ラベルは、例えば、Current Protocols in Immunology（上記）等に開示されているような公知の技術により、抗体にコンジュゲーションさせることができる。蛍光を、蛍光計を使用して定量化することができる。
当技術分野において公知の種々のよく特徴付けられた酵素基質ラベルが存在する（例えば、レビューについては、ＵＳ第４，２７５，１４９号を参照のこと）。酵素は、一般的には、種々の技術を使用して測定することができる発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、変化は、分光光度的に測定することができる基質の色変化であることができる。代替的には、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変化させることができる。蛍光の変化を定量化するための技術は上記されている。化学発光基質は、化学反応により電子的に励起され、ついで、例えば、化学ルミノメーターを使用して測定することができる光を発することができ又は蛍光アクセプターにエネルギーを供与する。
酵素ラベルの例は、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼな（ＵＳ第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等を含む。酵素を抗体にコンジュゲーションさせるための技術は、例えば、O'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166に記載されている。
酵素－基質の組み合わせの例は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての過酸化水素（ここで、過酸化水素は、染料前駆体、例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ）を酸化する）；アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と発色基質としてのパラ－ニトロフェニルホスファート；及びβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ（β－Ｄ－Ｇａｌ）と発色基質、例えば、ｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトシダーゼ又は蛍光基質である４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトシダーゼを含む。
多くの他の酵素－基質の組み合わせが、当業者に利用可能である。これらの一般的なレビューについては、ＵＳ第４，２７５，１４９号及びＵＳ第４，３１８，９８０号を参照のこと。
別の実施態様では、抗ＴｒｋＢ抗体は、無ラベルで使用され、抗ＴｒｋＢ抗体に結合するラベル抗体により検出される。
本明細書に記載された抗体は、任意の公知のアッセイ法、例えば、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ並びに免疫沈降アッセイに使用することができる。例えば、Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)を参照のこと。
診断キット
抗ＴｒｋＢ抗体は、診断キット、すなわち、診断アッセイを行うための説明書と共に、所定量での試薬の包装された組み合わせにおいて使用することができる。抗体が、酵素でラベルされる場合、キットは、酵素により必要とされる基質及び補因子、例えば、検出可能な発色団又はフルオロフォアを提供する基質前駆体を含むことができる。加えて、他の添加剤、例えば、安定剤、バッファー（例えば、ブロックバッファー又は溶解バッファー）等を含ませることができる。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中での濃度を提供するために、広く変化させることができる。試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供するであろう賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができる。
治療的使用及びＴｒｋＢ関連障害
別の実施態様では、本明細書に開示された抗ＴｒｋＢ抗体（又はその機能的フラグメント）は、本明細書に記載されたＴｒｋＢの発現に関連する種々の障害の処置に有用である。
抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントは、硝子体内、経口、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内を含む、任意の適切な手段により投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。加えて、抗ＴｒｋＢ抗体は、特に、抗体の用量を減少させながらのパルス注入により適切に投与される。一態様において、投与は、短期間又は慢性であるかに部分的に依存して、注射、最も好ましくは、静脈内注射又は皮下注射により与えられる。好ましくは、抗ＴｒｋＢ抗体は、眼への硝子体内注射により与えられる。
疾患の予防又は治療のために、抗体の適切な用量は、各種の要因、例えば、上記定義された処置される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の既往歴及び抗体に対する応答並びに主治医の判断）により決まるであろう。抗体は、一度に又は一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。
「サプレッション」という用語は、本明細書において、「改善」及び「緩和」と同じ文脈で使用され、疾患の１つ以上の特徴の軽減又は減少を意味する。
抗体組成物は、良好な医療実務（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）と一致する様式で配合され、投与され、適用されるであろう。この文脈において考慮すべき要因は、処置される特定の障害、治療される特定のほ乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング及び医師に公知の他の要因を含む。投与される抗体の「治療上有効量」は、このような考慮事項により左右されるであろうし、ＴｒｋＢ発現に関連する障害を予防し、改善し又は治療するのに必要な最小量である。
抗体は、対象となる障害を予防し又は治療するのに現在使用されている１つ以上の薬剤と共に配合される必要はないが、場合により配合される。このような他の薬剤の有効量は、配合物に存在する抗ＴｒｋＢ抗体の量、障害又は処置の種類及び上記検討された他の要因により決まる。これらは、一般的には、先で使用されたのと同じ用量及び投与経路で又は従来から利用されている用量の約１～９９％で使用される。
本発明のアゴニスト性抗ＴｒｋＢ抗体は、ＴｒｋＢシグナル伝達を刺激する。理論に拘束されることを望まないが、ＴｒｋＢシグナル伝達は、光レセプター、神経節細胞及び網膜色素上皮細胞を含む他の網膜ニューロンを網膜における細胞死から保護するのに有益であると考えられる。したがって、アゴニスト性抗ＴｒｋＢ抗体は、網膜ニューロン、例えば、光レセプターを変性から保護する、すなわち、神経変性を防ぎ、また、ニューロンの生存及び／又は可塑性を向上させ、最終的に、ＴｒｋＢ活性の低下及び／又は細胞ストレスもしくはアポトーシス活性の向上のいずれかに関連する視力喪失を妨げることができる。このため、抗体は、眼又は網膜の疾患、特に、神経変性網膜又は眼疾患の治療に有用である。このような疾患は、加齢性黄斑変性、地図状萎縮、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜色素変性、遺伝性網膜ジストロフィー、遺伝性黄斑ジストロフィー、近視性変性、網膜静脈閉塞、網膜動脈閉塞、眼内炎、ブドウ膜炎、嚢胞様黄斑浮腫、任意の網膜疾患に続く脈絡膜新生血管膜、視神経障害、緑内障、網膜剥離、中毒性網膜症、放射線網膜症及び外傷性網膜症を含むが、これらに限定されない。
抗体は、中枢神経系の疾患、例えば、前駆及び軽度～中程度のアルツハイマー病、アルツハイマー病を患う患者の疾患進行の遅延、ハンチントン病、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、統合失調症に関連する認知障害、減弱精神病症候群を患う個体における初発精神病の予防、統合失調症を患う患者における再発の予防又は処置抵抗性うつ病の処置に更に有用である。
別の実施態様では、抗体は、難聴、特に、シスプラチン誘引性難聴並びに雑音及び加齢性難聴の処置に有用であることができる。
特に、本発明のアゴニスト性抗ＴｒｋＢ抗体は、標準治療に加えて、非増殖性及び／又は増殖性の糖尿病性網膜症及び／又は糖尿病性黄斑浮腫の処置に必要とされる。網膜ニューロンの機能不全及び神経変性は、糖尿病性網膜症及び糖尿病性黄斑浮腫（疾患の全ての段階）における主な病的イベントの１つであり、最終的に視力喪失及び視覚機能障害を引き起こす。ＴｒｋＢ活性化により、網膜ニューロンの喪失及び機能障害が打ち消されることにより、正常な視力を維持し、疾患の間の視覚機能の喪失を減少させ、視覚機能を回復するのを潜在的に助けるであろう。
更に、抗ＶＥＧＦは、眼における血管機能障害のみをターゲットとし、ニューロン／グリア細胞系をターゲットとしないため、後者の治療上の利益を大幅に増強するであろう抗ＶＥＧＦ処置へのアドオンとしての、ＴｒｋＢ活性化の可能性のある使用が存在する。加えて、長期の抗ＶＥＧＦ処置により、神経変性副作用が引き起こされる場合がある。抗ＶＥＧＦへのアドオンとしてのＴｒｋＢ活性化アプローチにより、このような神経変性副作用が低減されるであろう。
抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントは、特に、網膜障害、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、地図状萎縮及び緑内障を治療し又は予防するのに有用である。
更なる態様では、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントは、代謝疾患、例えば、過食症、肥満及びメタボリックシンドロームの処置にも有用である。
別の態様では、本発明のＴｒｋＢ抗体は、ＴｒｋＢ関連障害、特に、地図状萎縮を治療し及び／又は予防するための方法であって、治療上有効量の本発明のＴｒｋＢ抗体を、地図状萎縮を患っている個体に投与することにより、地図状萎縮の１つ以上の症状を改善することを含む、方法に使用することができる。
更なる態様では、アゴニスト性ＴｒｋＢ抗体は、地図状萎縮を治療し及び／又は予防するための方法であって、治療上有効量のＴｒｋＢ抗体を、地図状萎縮を患っている個体に投与することにより、地図状萎縮の１つ以上の症状を改善することを含む、方法に使用することができる。
医薬組成物及びその投与
抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物は、眼又は網膜の疾患を有するか又はこれらを有するリスクにある対象に投与することができる。更に、本発明は、ＴｒｋＢ疾患の予防又は治療のための医薬の製造における、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、例えば、ヒト及び非ヒトほ乳類、例えば、霊長類、げっ歯類及びイヌを含む、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することができる任意のほ乳類患者を意味する。本明細書に記載された方法を使用する処置のために特に意図される対象は、ヒトを含む。抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントは、単独で又は他の組成物と組み合わせてのいずれかで投与することができる。
このような医薬組成物での使用に好ましい抗体は、配列番号：２及び１２又は３及び１３又は４及び１４又は５及び１５又は６及び１６又は７及び１７又は８及び１８又は９及び１９又は１０及び２０それぞれの可変軽鎖及び可変重鎖のアミノ酸配列を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントを含むものである。
また、配列番号：２及び１２又は３及び１３又は４及び１４又は５及び１５又は６及び１６又は７及び１７又は８及び１８又は９及び１９又は１０及び２０それぞれのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である可変軽鎖及び可変重鎖のアミノ酸配列を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントを含む、このような医薬組成物における使用のための抗体も企図される。
このような医薬組成物における使用に更に好ましい抗体は、配列番号：２１及び２２又は２３；２４及び２５又は２６；２７及び２８又は２９；３０及び３１又は３２；３３及び３４又は３５；３６及び３７又は３８；３９及び４０又は４１；４２及び４３又は４４；４５及び４６又は４７それぞれの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントを含むものである。
このような医薬組成物における使用に更に好ましい抗体は、配列番号：２１及び２２又は２３；２４及び２５又は２６；２７及び２８又は２９；３０及び３１又は３２；３３及び３４又は３５；３６及び３７又は３８；３９及び４０又は４１；４２及び４３又は４４；４５及び４６又は４７それぞれのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を有する、ヒト化抗体又は抗体フラグメントを含むものである。
前記抗ＴｒｋＢ抗体及び抗体フラグメントにおいて、ＣＤＲのアミノ酸配列は変化しないままであるが、周囲の領域、例えば、ＦＲ領域を操作することができると理解されたい。
種々のデリバリーシステムが公知であり、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを投与するのに使用することができる。導入方法は、硝子体内、点眼、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路を含むが、これらに限定されない。抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、注入、ボーラス又は注射により投与することができ、他の生物活性剤と共に投与することができる。投与は、全身又は局所であることができる。好ましい実施態様では、投与は、硝子体内注射による。このような注射のための製剤は、例えば、プレフィルドシリンジに調製することができる。
抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントは、治療状有効量の抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントと、１つ以上の薬学的に適合し得る成分とを含む、医薬組成物として投与することができる。
典型的な実施態様では、医薬組成物は、ヒトへの静脈内投与又は皮下投与に適合した医薬組成物として、ルーチンな手法に従って製剤化される。典型的には、注射による投与のための組成物は、無菌等張性水性バッファー中の溶液である。必要に応じて、医薬品は、可溶化剤及び注射部位での疼痛を緩和するための局所麻酔剤、例えば、リグノカインを含むこともできる。一般的には、これらの成分は、単位投与形態において、例えば、活性剤の量を示す気密封入容器、例えば、アンプル又は小袋に凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、個別に供給されるか又は共に混合されて供給されるかのいずれかである。医薬品が注入により投与される場合、無菌医薬品グレードの水又は生理食塩水を含有する注入ボトルに分注することができる。医薬品が注射により投与される場合、注射用の滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供することにより、成分を投与前に混合することができる。
更に、医薬組成物は、（ａ）凍結乾燥形態にある抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する容器と、（ｂ）注射用の薬学的に許容し得る希釈剤（例えば、滅菌水）を含有する第２の容器とを含む、医薬キットとして提供することができる。薬学的に許容し得る希釈剤は、凍結乾燥された抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントの再構成又は希釈に使用することができる。場合により、このような容器に、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府当局が指示した形式で注意書きを添付することができる。この注意書きは、ヒト投与用の製造、使用又は販売の当局による認可を反映する。
ＴｒｋＢ関連障害の治療又は予防に有効な抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントの量は、標準的な臨床技術により決定することができる。加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、最適な用量範囲を特定するのを助けるために場合により利用することができる。また、製剤に利用される正確な用量は、投与経路及び障害の段階によっても決まるであろうし、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は動物モデル試験系から得られる用量応答曲線から外挿することができる。
例えば、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントの毒性及び治療効力は、ＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効用量）を決定するための標準的な医薬手法により、細胞培養物又は実験動物において決定することができる。大きな治療指数を示す抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントが好ましい。
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量の範囲を配合するのに使用することができる。抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントの用量は、典型的には、毒性がほとんどない又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、利用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動させることができる。本方法において使用される任意の抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントについて、治療上有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養において決定されるように、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて配合することができる。このような情報を、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に決定するのに使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡ等により測定することができる。
ＴｒｋＢ抗体の硝子体内注射のために、一般的には、処置間のより長い間隔が好ましい。その改善された効力のために、本発明のＴｒｋＢ抗体は、より長い間隔で投与することができる。
一実施態様において、ＴｒｋＢ抗体は、６週間毎、好ましくは、７週間毎、また好ましくは、８週間毎、更に好ましくは、９週間毎、より好ましくは、１０週間毎、更に好ましくは、１１週間毎、より好ましくは、１２週間毎に投与される。更に好ましい実施態様では、ＴｒｋＢ抗体は、３か月毎に１回投与される。
実施態様において、ＴｒｋＢ抗体は、１～２０００mg 初期用量で、それを必要とする対象に投与される。別の実施態様では、場合により、１回以上の後続の用量が投与される。同用量はそれぞれ、１～２０００mg ＴｒｋＢ抗体を含む。
眼に投与することができる容量は厳密に制限されているため、抗ＴｒｋＢ抗体を高濃度に製剤化することができることが非常に重要である。更に、抗ＴｒｋＢ抗体の効力は、強力な抗体がより低い用量でもその効果を発揮することにより、活性を延長し、また、処置間の間隔を広げることができることが、非常に重要である。
本発明の抗体は、２０mg/ml、３０mg/ml、４０mg/ml、５０mg/ml、６０mg/ml、７０mg/ml、８０mg/ml、９０mg/ml又は１００mg/mlを含むが、これらに限定されない、非常に高い用量に製剤化することができる。
患者に投与することができる典型的な用量は、約３mg/眼である。このような製剤に使用することができる典型的なバッファー成分は、例えば、酢酸ナトリウム、ＰＳ２０及びトレハロース二水和物を含む。
一実施態様において、抗ＴｒｋＢ抗体は、１０mM ヒスチジンバッファー、２４０mM スクロース、０．０２w/v％ ポリソルベート２０（ｐＨ５．５）と共に、６０mg/mLの最終タンパク質濃度で配合される。
一部の実施態様では、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物は、更に、結合剤にコンジュゲーションしていないか又はコンジュゲーションしているかのいずれかである治療剤を含むことができる。抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＴｒｋＢ関連疾患の治療又は予防のための１つ以上の治療剤と組み合わせて同時投与することができる。例えば、併用療法は、抗ＶＥＧＦ、抗ＰＤＧＦ又は抗ＡＮＧ２を含むことができる。
このような併用療法投与は、疾患パラメータ（例えば、症状の重症度、症状の数又は再発の頻度）に対して相加的又は相乗的効果を有することができる。
組み合わせ投与のための治療計画に関して、特定の実施態様では、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントは、治療剤と同時に投与される。別の特定の実施態様では、治療剤は、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントの投与の前又は後に、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントの投与の前又は後の少なくとも１時間～数か月まで、例えば、少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１か月又は３か月までに投与される。
製品
別の態様では、上記された障害の処置に有用な材料を含有する製品が含まれる。この製品は、容器及びラベルを含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ及び試験管を含む。この容器は、各種の材料、例えば、ガラス又はプラスチックで形成することができる。この容器は、状態を処置するのに有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有する場合がある。例えば、この容器は、皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであることができる。組成物中の活性剤は、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントである。容器上の又は容器に関連するラベルは、組成物が選択された状態を処置するのに使用されることを示す。製品は、更に、薬学的に許容し得るバッファー、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む第２の容器を含むことができる。この容器は、更に、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ及び使用説明を伴う添付文書を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を含むことができる。
本発明は、本発明の範囲を限定することを意図しない下記実施例において更に説明される。
実施例
１．抗体生成（免疫化）
免疫化キャンペーン（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｃａｍｐａｉｇｎ）によるマウスからのＢ細胞を、自社開発の単一Ｂ細胞プラットフォーム技術を使用してスクリーニングに供した。抗ＴｒｋＢバインダーをＴｒｋＢ ｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイにおける活性、有効性及び効力について試験した後、更に狭めた。
２．ヒト化抗体の産生
マウスリードＤ００３を更なる最適化のために選択した。マウスリードは、配列番号：１に対応する可変軽鎖及び配列番号：１１に対応する可変重鎖を有していた。
ＴｒｋＢマウスリードＤ００３を配列最適化するために、最も類似したヒト生殖系列抗体配列を選択した。軽鎖については、ＩＧＫＶ４－１＊０１、ＫＪ２、重鎖については、ＩＧＨＶ１－４６＊０３、ＨＪ６を選択した。変異体のライブラリを生成した。これにより、配列番号：２～１０のヒト化軽鎖可変配列及び配列番号：１２～２０の重鎖可変配列が得られた。
Figure 0007267208000029
本発明の例示的なヒト化抗体は、下記表に示されるような軽鎖配列及び重鎖配列を有する抗体である。ＩｇＧ１－ＫＯは、エフェクター機能を低下させるために、Ｆｃ領域に２つの突然変異であるＬｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａを有する。
Figure 0007267208000030
Figure 0007267208000031
３．エピトープ情報
材料
水（Sigma Aldrich, P/N 37877-4L）
アセトニトリル（Sigma Aldrich, P/N 34998-4L）
ギ酸（Fluka, P/N 94318）
尿素（Sigma Aldrich, P/N 51456-500G）
Ｔｃｅｐ－ＨＣｌ－１０ｇ（Thermo Scientific-Pierce, P/N 20491）
二塩基性リン酸ナトリウム（Sigma Aldrich, P/N S7907-100G）
一塩基性リン酸ナトリウム（Sigma Aldrich, P/N S8282 - 500G）
ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuardプレカラム、１３０Å、１．７μm、２．１mm×５mm（Waters Technologies Corp, 186003975）
Poroszyme（登録商標）固定化ペプシンカートリッジ、２．１mm×３０mm（Life Technologies Corp, 2313100）
Acquity UPLC BEH C18カラム １．７um、１mm×５０mm（Waters,186002344）
溶媒Ａ：０．１％ ギ酸／９９％ 水／１％ アセトニトリル
溶媒Ｂ：０．１％ ギ酸／５％ 水／９５％ アセトニトリル
水バッファー：Ｈ２Ｏ １０mM リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）
重水素バッファー：Ｄ２Ｏ １０mM リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）
クエンチバッファー：水 ８M 尿素、０．４M ＴＣＥＰ－ＨＣｌ
エピトープマッピング対照サンプル中において、抗原を抗体の有無にかかわらず行う。抗原ペプチドのリストを決定するために、まず、このプロトコールを重水素バッファーに代えて、水バッファーを使用して行う。サンプル ４uLを重水素バッファー ４０uLと混合する。この混合物を２０℃で、複数の時点（１、２及び４分間）でインキュベーションした。ついで、この混合物 ４０uLを４℃のクエンチバッファー（４M 尿素、０．４Ｍ ＴＣＥＰ－ＨＣｌ） ４０uLに移し、混合した。それを、クエンチしたタンパク質 ６０uLを注入し、２００uL/mL 溶媒Ａ：０．１％ ギ酸／９９％ 水／１％ アセトニトリルを流すことにより、ペプシンカラムにおいて２分間消化する。その後のペプチドをVanguardプレカラムにおいて３分間脱塩する。消化性ペプチドをカラム／バルブ温度制御区画内のBEH C18逆相カラムに送る。溶媒Ａ：０．１％ ギ酸／９９％ 水／１％ アセトニトリル及び溶媒Ｂ：０．１％ ギ酸／５％ 水／９５％ アセトニトリルを利用する。溶媒Ｂの割合を５．１分で１０％から１５％に、１１分で５０％に、１１．５分で９０％に向上させ、１２．５分まで保持し、１３分で０％ Ｂにし、１４分まで保持する。クロマトグラフィー分離を１８０μl/分の流速で４℃において行った。クロマトグラフィー分離後、サンプルを陽性エレクトロスプレーイオン化モードで操作されるThermo Scientific Orbitrap Fusion質量分光計に入れた。利用された方法は、１２０，０００の分解能、１０，０００の最小シグナル、１．０の単離幅及び３５．０Ｖの正規化衝突エネルギーを利用して対照ペプチドを特定する場合、活性化型のＣＩＤ及びＥＴＤを含んだ。ＳレンズＲＦレベルを６０％に設定した。対照ペプチドについては、データ収集タイプは、完全なＭＳスキャンについてのプロファイルであり、ＣＩＤ ＭＳ／ＭＳデータについての重心である。重水素化サンプルについては、ＭＳ／ＭＳを収集しない。２８０～１８００Daの質量範囲にわたってデータを収集する。生のＬＣ－ＭＳ／ＭＳフラグメント化データ分析のために、対照サンプル（ＣＩＤ及びＥＴＤ ＭＳ／ＭＳを有する）を、所定の配列に対して、Proteome Discover 1.4（Thermo Scientific）及びPMi Byonic（ProteinMetrics）を使用して分析して、ペプチドのリスト及び保持時間を生成した。生のデータファイルを、独自の社内SHARCソフトウェアを使用して前処理し、ＡＳＣＩＩフォーマットに変換した。ついで、特定されたペプチドを、独自の社内SHAFTソフトウェアを使用してマッチさせ、要約した。エピトープを重水素ラベル後の結合により誘引される平均質量シフトの差により決定した。ペプチドレベルでは、０．４Da超の保護が有意であると考えられた。
エピトープマッピングの結果から、図１において、ＢＤＮＦ、２７７抗体、（Ｃ２）（ＵＳ第２０１００１９６３９０号）及び（Ｃ２０）（ＵＳ第２０１００１５０９１４号）を示す。配列番号：５４を有するヒトＴｒｋＢの細胞外領域に対する各分子についての特異的結合部位を暗灰色で強調する。天然リガンドＢＤＮＦと比較して、２７７抗体は、異なる新たなエピトープに結合する。
４．ＣＤＲにおける配列負担
ＣＤＲの配列を任意の可能性のある負担、例えば、Ｎ－グリコシル化部位、強力な脱アミド化モチーフ（ＮＧ、ＮＳ、ＮＨ、ＮＡ、ＮＤ、ＮＴ、ＮＮ）、アスパラギン酸異性化モチーフ（ＤＧ）、フラグメント化モチーフ（ＤＧ、ＤＳ）、システインの存在について確認する。これらのアミノ酸又はモチーフは、化学反応を受ける場合があり、生成物に望ましくない不均一性を付与する場合がある。この不均一性は、ターゲット結合及び機能に負の影響を及ぼす可能性を有する。これらの理由で、このようなアミノ酸又はモチーフ（存在するのであれば）をＣＤＲから除去するのが好ましい。
マウスリードのＣＤＲ及びヒト化配列は、このような可能性のある負担モチーフを含まない。
Figure 0007267208000032
５．免疫原性
配列の免疫原性を、Epivax社によるライセンスを通じて提供されるアルゴリズムにより、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで評価する。EpiMatrix Treg-adjスコアは、Ｔ細胞エピトープ及びＴｒｅｇエピトープを考慮する。免疫原性スコアが低いほど、配列が免疫原性である可能性が低い。一般的には、負のスコアは、免疫原性のリスクが低いとみなされるが、正のスコアは、免疫原性の可能性を示すものとみなされる。
Figure 0007267208000033
６．親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して、Ｈｕ－ＴｒｋＢ－Ｈｉｓに対する２７７抗体、Ｃ２（ＵＳ第２０１００１９６３９０号）及びＣ２０（ＵＳ第２０１００１５０９１４号）並びにＴＡＭ－１６３（ＷＯ第２０１５１７３７５６号）の結合親和性を決定した。実験をProteOn XPR36機器において行った。
方法：この実験のためのランニングバッファー及び全ての希釈（規定されている場合を除く）を、０．０１％ Tween20を含むＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡ［１００％ Tween20 １００μlをＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡ ２Ｌに加えて、最終的にTween20の濃度を０．０１％にする］中において行った。ＧＬＭセンサチップは製造メーカーの推奨に従って正規化し、事前調整した。このセンサチップをＥＤＣ／ｓ－ＮＨＳの等しい混合物により、３０μl/分の流速で３００秒間水平方向において活性化し、リコンビナントプロテインＡ／Ｇ（１０mM アセタート ｐＨ４．５中の６０μg/ml）により、３０μl/分の流速で３００秒間水平方向において固定化して、表面上に約７１００～７１３０RU プロテインＡ／Ｇを得た。このセンサチップを、１M エタノールアミンＨＣｌにより、３０μl/分の流速で３００秒間水平方向において不活性化した。このセンサチップを１８秒の０．８５％ リン酸により、１００μl/分の流速で水平に３回及び垂直に３回安定化した。２７７抗体（０．６μg/ml）、Ｃ２（２．１μg/ml）、Ｃ２０（１．２μg/ml）及びＴＡＭ－１６３（５μg/ml）を３０μl/分の流速で７０秒間、プロテインＡ／Ｇ表面上に垂直に捕捉し、それぞれ約６１５、１３９０、７８０及び３３８０RUの捕捉レベルを得た。ベースラインを、ＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡを１００μl/分の流速で水平に６０秒間注入し、ついで、ＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡを１００μl/分の流速で６０秒間２回目の注入をし、１２０秒間水平に解離させることにより安定化させた。分析物（Ｈｕ－ＴｒｋＢ－Ｈｉｓ）を、捕捉された抗体上に、３０μl/分の流速で６００秒間水平に注入し、１８００秒間解離させた。分析物の濃度を０nM、１．２３nM、３．７nM、１１．１１nM、３３．３３nM及び１００nMとした。表面を、０．８５％ リン酸を１００μl/分の流速で１８秒間、水平に１回及び垂直に１回注入することにより再生した。ＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡを１００μl/分の流速で垂直に１回６０秒間注入した。スポット間（センサ表面との相互作用）及びブランク（０．０１％ Tween20又は０nM 分析物を含むＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡ）を生データから差し引いた。ついで、センサグラムを１：１ラングミュア結合に全体的に適合させて、オンレート（ｋａ）、オフレート（ｋｄ）及び親和性（ＫＤ）値を得た。
２７７抗体は、１．９３×１０５1/Mのｋａ、３．５１×１０－４1/sのｋｄ及び１．２nMのＫＤで、Ｈｕ－ＴｒｋＢ－Ｈｉｓに結合する。Ｃ２は、２．３２×１０４1/Mのｋａ、３．３９×１０－４1/sのｋｄ及び１０．５nMのＫＤで、Ｈｕ－ＴｒｋＢ－Ｈｉｓに結合する。Ｃ２０は、１．２９×１０５1/Mのｋａ、６．１３×１０－３1/sのｋｄ及び４７．７nMのＫＤで、Ｈｕ－ＴｒｋＢ－Ｈｉｓに結合する。ＴＡＭ－１６３は、１００nM Ｈｕ－ＴｒｋＢ－Ｈｉｓに結合しない。
Figure 0007267208000034
７．非特異的結合
非特異的結合アッセイを、新規な生物学的実体（ＮＢＥ）候補が無関係の荷電タンパク質に顕著な結合を有するかどうかを決定するために、バイオセンサ技術を使用して開発した。このアッセイでは、抗体を、２つのＳＰＲ表面上を通過させる。同表面の一方は、無関係の負に荷電したタンパク質で被覆されており、もう一方は、無関係の正に荷電したタンパク質で被覆されている。ＮＢＥ候補がこれらの表面への顕著な非特異的結合を示す場合、結合の原因は、候補における正又は負の荷電表面パッチの存在である可能性が高い。ＮＢＥ候補の非特異的結合は、薬物動態（ＰＫ）及び生体内分布の低下につながる場合があり、下流での製造可能性への影響も有する場合がある。このアッセイの結果をプロジェクト特異的リスク評価に関して使用する。このアッセイの目的は、低ＰＫ、組織ターゲット分布の欠如及び下流での製造の困難性のリスクを低減することである。
２７７抗体の結合センサグラムを収集し、それを対照のものと比較して、非特異的結合カテゴリーを好ましい（緑色）、許容可能（黄色）又は好ましくない（赤色）のいずれかとして割り当てることにより、２７７抗体が非特異的結合を示すかどうかを決定することが目的である。
方法
実験をBiacore T200で行った。希釈、表面準備及び結合実験を１０×ＨＢＳ－ＥＰから調製した１×ＨＢＳ－ＥＰバッファー中において、２５℃で行った。固定化プロトコール及び結合実験の両方についての流速を５μL/分とした。
非特異的結合実験のための表面を準備するために、ニワトリ卵白リゾチーム及び大豆由来のトリプシンインヒビター１－Ｓ型を製造説明書に従って、アミンカップリングキットを使用して、３０００～５０００RUの表面密度を有するシリーズＳ ＣＭ５チップに手作業でカップリングさせた。ＦＣ１及びＦＣ２を、ＥＤＣとＮＨＳとの１：１混合物を７分間注入することにより活性化させた。ニワトリ卵白リゾチームの表面を、１０mM ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）中の１５０μg/mL ニワトリ卵白リゾチームを５分間注入することにより、ＦＣ２上で準備した。ＦＣ１及びＦＣ２を、１M エタノールアミン－ＨＣｌを７分間注入することにより不活性化させた。ＦＣ１を基準面として使用した。ＦＣ２を、ＥＤＣとＮＨＳとの１：１混合物を７分間注入することにより活性化させた。大豆由来のトリプシンインヒビター１－Ｓ型の表面を、１０mM ＮａＯＡｃバッファー（ｐＨ４．０）中の３００μg/mL 大豆由来のトリプシンインヒビター１－Ｓ型を２０分間注入することにより、ＦＣ３上で準備し、続けて、１M エタノールアミン－ＨＣｌを７分間注入することにより、フローセルを不活性化させた。抗リゾチームポリクローナル抗体、抗トリプシンインヒビター抗体及びＢＩ陰性対照をアッセイにおける対照として使用した。対照及び抗体を１×ＨＢＳ－ＥＰバッファー中において、１μMで調製した。サンプルを１０分間の会合及び１５分間の解離で、ＦＣ１、ＦＣ２及びＦＣ３表面上に注入した。５０μL/分の流速で０．８５％ リン酸を１分及び５０mM ＮａＯＨを３０秒注入し、続けて、１×ＨＢＳ－ＥＰバッファーを全表面にわたって流すことによる２分間の安定化期間を行うことにより、表面を各結合サイクル間で再生した。抗リゾチームポリクローナル抗体及び抗トリプシンインヒビター抗体を実験の開始時及び終了時にＦＣ１、ＦＣ２及びＦＣ３上に注射した。データを、Biacore T200 Controlソフトウェアバージョン２．０．１を使用して収集し、Biacore T200 Evaluationソフトウェアバージョン３．０を使用して分析した。
抗体の結合センサグラムをＢＩ陰性対照センサグラムと比較して、ニワトリ卵白リゾチーム及び大豆由来のトリプシンインヒビター１－Ｓ型の表面への非特異的結合のレベルを決定した。
データから、２７７抗体は、無関係の荷電タンパク質、具体的には、ニワトリ卵白リゾチーム及び大豆由来のトリプシンインヒビター１－Ｓ型に顕著に結合しないことが示される。２７７抗体を、結合応答及び曲線の形状を対照と比較した場合、好ましい（緑色）と分類した。したがって、２７７抗体は、荷電種のオフターゲティングに基づく薬剤動態、生体内分布及び製造に関して、ほとんどリスクをもたらさないであろうと仮定される。
Figure 0007267208000035
８．効力（ＳＹ５Ｙ）及び有効性
SH-SY5Y細胞の神経表現型への分化
SH-SY5Y（ＡＴＣＣ（登録商標）CRL-2266（商標））細胞を、１７５cm2 組織培養フラスコ（Corning #353112）中での、１５％ ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２（Lonza #BE12-719F）中において培養する。細胞播種のために、フラスコをＤ－ＰＢＳ（Lonza #17-512Q）で１回洗浄し、細胞を３７℃に予め温めたAccutase溶液（A6964 SIGMA）で分離する。室温で３分間インキュベーションした後、細胞を１０mlのピペットを用いてとりあつかい、１５mlのファルコンチューブに移すことができる。細胞を計数し、ウェルあたりに１５％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２ １００μl中の６０００個 細胞をコラーゲン－Ｉ被覆９６ウェルプレート（BD Biosciences # 354407）に播種する。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２において、加湿インキュベーター中で維持する。８時間後、６μM レチノイン酸溶液（Sigma # R2625）１００μlを各ウェルに加える。最終的なレチノイン酸濃度を３μMとする。４８時間及び９６時間後、追加のレチノイン酸刺激が必要である。この目的で、ウェルあたりに培地 １００μlを除去し、６μM レチノイン酸を含む新たな培地 １００μlを加える。分化の７日後、SH-SY5Y細胞は、ドーパミン作動性様表現型を有し、使用の準備が整っている。
分化したSH-SY5Y細胞の刺激と溶解
ウェルからの培地を、０．２％ ＢＳＡを含む予め温めたＤＭＥＭ－Ｆ１２ ８０μlと交換した。プレートを室温で１５分間インキュベーションした。ペプチド及び抗体を、０．２％ ＢＳＡを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２中で希釈した。全ての希釈液を低結合チップ、チューブ及びプレートにより調製した。細胞を、対応するペプチド／抗体 ２０μlを室温で４５分間加えることにより刺激した。培養期間中、細胞溶解バッファーを氷上での１５mlのファルコンチューブ中において調製した：１０×Triton X-100溶解バッファー １ml、Ｈ２Ｏ ８．７ml、１錠 complete mini,プロテアーゼインヒビター１００μl、ホスファターゼインヒビターカクテル２ １００μl、ホスファターゼインヒビターカクテル３ １００μl、１mM ＰＭＳＦ。細胞刺激後、培地を除去し、氷冷溶解バッファー ３０μlをウェルあたりに加えた。プレートをトップシールで被覆し、氷上で２０分間インキュベーションした。その後、プレートをエッペンドルフプレートシェーカー上において、５００rpmで５分間混合した。
この工程のために、全ての材料及び溶液を氷上で保存する。溶解された細胞を含む９６ウェルプレートを２３５ｇで１０秒間遠心分離し、氷上で保存する。アルファＬＩＳＡ免疫アッセイバッファー（PerkinElmer # AL000C）を、Ｈ２Ｏ ２３４０μl中の１０×ストック溶液 ２６０μlの希釈により調製する。pNTRK2アクセプタービーズ（PerkinElmer # CUSM81822；CellSignaling CST#4621クローンＣ５０Ｆ３からの抗体を使用して、PerkinElmerにより被覆されたビーズ）をアルファＬＩＳＡ免疫アッセイバッファー中で１０μg/mlの最終濃度に希釈する。NTRK2ビオチン抗体（PerkinElmer # CUSM81820；CellSignaling CST=#4609クローンＣ１７Ｆ１からの抗体を使用して、PerkinElmerによりラベル）をアルファＬＩＳＡ免疫アッセイバッファー中で１nMの最終濃度に希釈する。ストレプトアビジンドナービーズ（PerkinElmer #6760002S）をアルファＬＩＳＡ免疫アッセイバッファー中で２０μg/mlの最終濃度に希釈する。ウェルあたりにpNTRK2アクセプタービーズ ５μl及び細胞ライゼート ２．５μlを平底の白色小容量３８４ウェルプレート（Greiner #784075）に移し、２３５ｇで１０秒間遠心し、暗所において室温で４５分間保存する。インキュベーション後、ウェルあたりにNTRK2ビオチン抗体 ２．５μlを加え、プレートを２３５ｇで１０秒間遠心分離し、暗所において室温で４５分間保存する。最後に、ウェルあたりにストレプトアビジンドナービーズ ２．５μlを加え、プレートを２３５ｇで１０秒間遠心分離し、暗所において室温で３０分間保存する。その直後に、プレートを、AlphaScreenプロトコールを使用するEnVisionプレートリーダー（フィルタ５７０nm ＃２４４及びミラー＃４４４）で測定する。
ＥＲＫ１／２リン酸化の測定
ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）リン酸化の測定を、細胞ライゼート ８μlを使用し、製造メーカーのプロトコールに従って行った（AlphaScreen SureFire p-ERK 1/2（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）キット（PerkinElmer #TGRES10k））。
ＡＫＴ１／２／３リン酸化の測定
Ａｋｔ １／２／３（Ｔｈｒ３０８）リン酸化の測定を、細胞ライゼート ８μlを使用し、製造メーカーのプロトコールに従って行った（AlphaScreen SureFire p-Akt 1/2/3（Ｔｈｒ３０８）キット（PerkinElmer #TGRA3S10K))。
本発明のいくつかのＴｒｋＢ抗体を、ＴｒｋＢを活性化し、下流シグナル伝達を開始するそれらの効力について分析した。天然リガンドＢＤＮＦ並びに抗体Ｃ２及びＣ２０も含まれた。本発明のＴｒｋＢ抗体は、天然リガンドＢＤＮＦよりＴｒｋＢを活性化するのに平均して１０倍強力であった。抗体Ｃ２及びＣ２０と比較して、本発明のＴｒｋＢ抗体は、平均して３倍～１５倍強力であった。下流のシグナル伝達ｐ－ＥＲＫ及びＡＫＴ１／２／３は、ＴｒｋＢ活性化についてのこれらの測定と完全に一致し、本発明のＴｒｋＢ抗体の同様の改善された効力が示された。
Figure 0007267208000036
９．遺伝子発現
次世代配列決定分析（データを示さず）をいくつかのＴｒｋＢアゴニストで刺激した後に分化したSH-SY5Y細胞について行った。結果を確認するために、最もレギュレーションされた遺伝子をシナプス可塑性に関して選択し、その後、変化をｑＰＣＲにより再度分析した。ＡＲＣ、ＶＧＦ、ＥＧＲ１は、シナプス可塑性のための公知のマーカーである。シナプス可塑性は、シナプス活性の特定のパターンがシナプス強度の変化をもたらすプロセスである。図２において、ＢＤＮＦ又はアゴニスト性抗体による分化されたSH-SY5Y細胞の刺激により、シナプス可塑性の向上についてのマーカーであることができるＡＲＣ、ＶＧＦ、ＥＧＲ１ ｍＲＮＡ発現の量が増加する。ＮＴＲＫ２のｍＲＮＡ発現は、ＢＤＮＦ又はアゴニスト性抗体による刺激により影響を受けない。ＢＤＮＦ及びＤ００３により誘引される発現パターンの変化は、全体的に非常に類似している。これらの結果から、次世代配列決定分析からのデータが確認された。
具体的には、SH-SY5Y細胞を６ウェル細胞培養プレート（SIGMA # Corning CLS3516）中で７日間分化させた。分化後、細胞を、０．２％ ＢＳＡを含み、対照ＩｇＧ［１０nM］、ＢＤＮＦ［１０nM］及びＤ００３［１０nM］を含む無血清ＤＭＥＭ：Ｆ１２中において、３７℃、５％ ＣＯ２での加湿インキュベーター中で６時間刺激した。その後、細胞を、予め温めた１×Ｄ－ＰＢＳで１回洗浄し、ｍＲＮＡ単離を製造メーカーの説明書に従って行った（Qiagen# 74104 RNeasy Mini Kit）。ｃＤＮＡへのｍＲＮＡの転写を製造メーカーの説明書に従って行った（Qiagen# 205310 QuantiTect Rev. Transcription Kit）。ｃＤＮＡを7900HT FastリアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems）における５’ヌクレアーゼプローブ（ThermoFischer Scientific）に基づくTaqManリアルタイムＰＣＲアッセイに使用した。デルタＣＴ値をＡＣＴＢのＣＴ値（ＣＴ＝１８．１８）に基づいて計算した。
ThermoFischer ScientificからのTaqMan遺伝子発現アッセイ
ＡＣＴＢ－アクチンベータ：Hs01060665_g1；Cat.#4331182
ＮＴＲＫ２－神経栄養レセプターチロシンキナーゼ２：Hs00178811_m1；Cat.# 4331182
ＡＲＣ－活性レギュレーション細胞骨格関連タンパク質：Hs01045540_g1；Cat.# 4331182
ＶＧＦ－誘引性神経成長因子Hs00705044_s1、Cat.# 4331182
ＥＧＲ１－早期成長応答１：Hs00152928_m1；Cat.# 4331182
１０．ウサギ硝子体内（ｉｖｔ）薬物動態研究
ニュージーランド白色雌ウサギ（体重１．７～２kg）を研究の開始前１５日より長く順応させた。抗体２７７を、２０mg/mLで無菌調製し、１mg（バッファー ５０μL中；６０mM 酢酸ナトリウム、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を麻酔下の動物の左右両側に硝子体内注射した。種々の時点で、２匹の動物を安楽死させ、房水、硝子体及び網膜からなる眼組織を収集し、分析まで凍結した。血液サンプルを種々の時点で採取し（図３）、遠心分離し、血漿を分析まで凍結した。
抗体の定量をＥＬＩＳＡにより行った。各組織種について、抗体の検量線（０．５～１００ng/mLの範囲でトリプリケート）をサンプルと同じバッファーにおいて作成し、全てのプレートに含めた。吸収を、SpectraMax 340PC-384光度計を使用して４０５nmで測定し、データ分析を、SoftMaxPro6.5を使用して行った。
２７７抗体の濃度を図３に示す。図３に、ウサギの眼に１mg ２７７抗体をｉｖｔ注射した後の、示されたような種々の眼の区画及び血漿における濃度を時間の関数として示す。計算された眼及び血漿半減期を以下の表に列記する。
Figure 0007267208000037
計算された半減期は、硝子体、房水、網膜及び血漿でそれぞれ、４．９、４．８、５．２及び７．０日であった。これらの半減期は、臨床的に使用されたリコンビナントヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗体であるAvastin（抗ＶＥＧＦ、ベバシズマブ、Bakri et al., Opthalmology, 2007）に関する文献に報告されている半減期と類似しており、同半減期も実験的に自社で確認した。全長ＩｇＧの硝子体内クリアランスは、主にそれらの分子サイズにより決まるため、これらの結果は予想どおりであった。分子サイズは、本発明者らの抗体２７７及びAvastinについて類似している。したがって、抗体２７７及びAvastinの眼半減期を含むヒトＰＫは類似すると予想される。Avastinのヒト眼半減期は、９．７３±１．４８日であると報告されている（Hutton-Smith, 2016）。
１１．ＩｇＧ１抗体のｉｖｔ注射頻度
薬物動態研究（実施例１０）で得られたｉｎ ｖｉｖｏデータ及びSH-SY5Y細胞で得られた効力データに基づいて、ＩｇＧ１抗体のヒト眼ＰＫ（経時的な硝子体濃度）を調査し、生体分子の眼クリアランスに関する十分に確立された１区画動態に基づいて計算した。計算には、下記パラメータ：Avastinについて報告されているｔ１／２＝１０日のヒト眼半減期を使用した。同パラメータは、実施例１０に示されたｉｎ ｖｉｖｏデータ、全長ＩｇＧ１抗体についてと同じ１４９KDaの分子量及び１mgのｉｖｔ注射抗体量によっても支持された（図４を参照のこと）。眼のＰＫは、主に分子量により駆動されるため、眼のＰＫの同じプロットが、５つの抗体全てについて得られる。
ｉｖｔ注射頻度を推定するために、SH-SY5Y細胞におけるＴｒｋＢリン酸化アッセイから決定されるように、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性は、硝子体濃度≧細胞内ＥＣ５０で維持されることができると仮定した（実施例８）。ＥＣ５０に等しい硝子体濃縮に到達するためのｉｖｔ注射後の時間を図４における矢印で示す。この考察に基づいて、１mgの抗体の注射後にこのような硝子体濃度に達するまでの時間を各抗体について下記表にまとめる。
Figure 0007267208000038
例えば、１mg Ｃ２をヒトの眼に注射した後１３６日で、Ｃ２のＥＣ５０（表１０）に対応する硝子体内濃度に達する（すなわち、１３６日後、次回のｉｖｔ注射が必要になるであろう）。比較のために、２７７－６４（ＩｇＧ１）の場合、この時間は、ｉｖｔ注射後１５０日まで伸びるであろう。この場合、次回のｉｖｔ注射は、Ｃ２についてと同様に１４日遅れで必要となるであろう。ＥＣ５０より１０倍高い値の最小有効量をターゲットとすることにより、ｉｖｔ注射間の時間が短縮されるであろうが、Ｃ２と上記表１０に列記された他の抗体との間の注射頻度の時間差は同じままであろう。
眼に投与することができる注射容量は、厳しく制限される。同時に、眼の状態の処置には、眼への反復注射が必要である。抗体の半減期を改善することは、注射間隔の間の時間を伸ばすための１つの方法であるが、言及されたように、分子の分子量により主に駆動される。実施例１０においてｉｎ ｖｉｖｏ及び実施例８においてSH-SY5Y細胞で示されたように、改善されたより強力な抗体を提供することにより、注射間隔を患者が眼への注射頻度をより少なくするのに役立つように伸ばすことができる。
１２．ＳＴＺ誘引糖尿病ラットにおけるアゴニスト性ＴｒｋＢ抗体の神経保護作用及び神経再生作用
２７７抗体はいずれも、げっ歯類交差反応性ではないため、ＴｒｋＢ活性化アプローチがｉ）神経保護を提供する（「神経保護アプローチ」）、ｉｉ）機能不全ニューロン／回路の再活性化を提供する（「再生アプローチ」）という仮説を試験するために、代理ツール抗体としてＴｒｋＢ活性化抗体Ｃ２により、ｉｎ ｖｉｖｏでの概念証明及び有効性研究を行った。どちらのアプローチもいくつかの研究で取り組んだ。動物疾患モデルとして、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘引糖尿病ラットモデルを利用した。同モデルは、膵臓ベータ細胞の喪失、低インスリンレベル、安定した高血糖及び結果として網膜におけるニューロン機能不全を特徴とする。
動物研究
雄のブラウンノルウェーラット（ＢＮラット）をCharles River（Germany）から入手した。動物を１２時間の明／暗サイクル（午後６時から午前６時の間に消灯）での、制御された温度及び湿度条件におけるＩＶＣに２匹の群で収容した。このラットには、Provimi Kliba（Switzerland）からのペレット化食餌ｎｏ．３４３８を自由に与え、水道水に自由にアクセスさせた。動物を研究開始前１週間、それらの環境に順応させた。ラットは、研究の生活段階の開始時に６～８週齢であった。高血糖をＳＴＺ（６５mg／kg 体重；Sigma #S0130-1G）のｉ．ｐ．注射により誘引した。無応答動物又は応答不良動物、すなわち、ＳＴＺ適用後５日目に２０mM未満の血中グルコース濃度を有する動物は、研究に含めなかった。体重及び血中グルコースレベルを定期的にモニタリングした。動物にＳＴＺ適用後３６日目に、Ｃ２（４．６μL中の５０μg）又は対照抗体である抗２，４，６－トリニトロフェニル（抗ＴＮＰ）（４．５μL中の５０μg）の単回ｉｖｔ注射により投与した。網膜機能を、網膜電図検査（ＥＲＧ）記録により評価し、そして動物を過剰用量のｉ．ｐ．投与されたペントバルビタールにより、最終記録後に殺処分した。
用量及び硝子体内注射
研究の概要を図５に示す。ｉｖｔ注射のために、ラットを２．５～３％ イソフルラン（Forene; Abbvie）により麻酔した。４mg/ml オキシブプロカイン塩酸（Novesine; Omnivision）を１滴、局所麻酔として投与した。Ｃ２ストック溶液（１０．９mg/ml；バッファー：２０mM クエン酸ナトリウム、１１５mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０） ４．６μLを高血糖ラットの各眼にｉｖｔ注射し（群３、ｎ＝２４の眼、図５）、約５０μg/眼の注射用量を得た。対照として、抗２，４，６－トリニトロフェニルストック溶液（１１．２mg/ml；バッファー２０mM クエン酸ナトリウム、１１５mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０） ４．５μLを非糖尿病ラット及び糖尿病対照ラットの眼にｉｖｔ注射し（群１、ｎ＝２４の眼及び群２、ｎ＝２２の眼、図５）、約５０μg/眼の注射用量を得た。ｉｖｔ注射を解剖顕微鏡下で行った。抗体溶液を３４ゲージ針（１０μlのハミルトンガラスシリンジに装着）により、角膜輪部のすぐ後ろの硝子体に送達し、注射の全体的な質を、眼底検査（Micron IV Retinal Imaging Microscope, Phoenix Research Labsを使用）により制御した。
網膜電図検査
網膜電図検査（ＥＲＧ）は、異なる網膜ニューロンの光誘引電気活性を評価するための非侵襲性電気生理学的技術であり、網膜機能の種々の態様、例えば、薄暗い光又は色覚を定量化することが可能である。ＥＲＧを、Espion E3 ERG記録システム（Diagnosys LLC）を使用して、角膜と参照電極との間の電位変化として測定した。ＥＲＧ記録の前に、動物を少なくとも２時間暗順応させ、ケタミン（Ketanest、約１００mg／kg）及びキシラジン（Rompun、約５mg／kg）のｉ．ｐ．注射により麻酔した。動物を、体温を３７℃で一定に維持するために加熱ステージ上に置いた。瞳孔を１％ シクロペントラート－ＨＣｌ及び２．５％ フェニレフリンで拡張した。２％ Methocel溶液（OmniVision）を１滴、角膜上にたらし、記録中の眼の乾燥及び白内障の発生を防止した。記録を金ループ電極により、両眼から同時に行った。参照電極は、Methocelで湿らせ、動物の頬に取り付けた歯のないワニ口クリップとした。電気接地のために、クリップを動物の尾に取り付けた。ＥＲＧシグナルを１kHzでサンプリングし、０．１５Hzの低周波及び５００Hzの高周波カットオフで記録した。光刺激は、１セットの発光ダイオード（持続時間＜４ms）により送達される短い全視野フラッシュからなった。全てのフラッシュを暗所又は定常緑色もしくは赤色バックグラウンド光のいずれかで、Ganzfeld刺激装置（ColorDome; Diagnosys）により生成した。
ＥＲＧプロトコール
ＥＲＧ応答を、最初に暗順応動物から記録し（桿体駆動応答を単離するため）、続けて、赤色バックグラウンド光に順応した動物から記録し（５０cd/m2、ＵＶ錐体駆動ＥＲＧ応答を単離するため）、続けて、緑色バックグラウンド光に順応させた（２５．５cd/m2、Ｍ錐体駆動応答を単離するため）。暗順応ＥＲＧの場合には、応答を１×１０－５～０．１cd・s/m2の範囲の一連のフラッシュにより応答を誘発した。１×１０－５及び３×１０－５cd・s/m2の輝度を有するフラッシュについて、２０回の試行の応答を平均した。１×１０－４から０．０５cd・s/m2までの間のフラッシュについて、１０回の試行の応答を平均し、０．１cd・s/m2の最後のフラッシュについて、８回の試行を平均した。個々のフラッシュ間の間隔を網膜が各フラッシュから完全に回復する（応答振幅のフラッシュ誘引減少又は潜時の短縮の兆候がない）ことを確実にするように選択した。これらの基準に基づいて、フラッシュ間隔は、１×１０－５及び３×１０－５cd・s/m2のフラッシュについて２秒、１×１０－４から０．０５cd・s/m2までの間のフラッシュについて５秒及び０．１cd・s/m2のフラッシュについて１０秒とした。
ＵＶ錐体駆動応答の記録のために、動物を赤色バックグラウンド光に２分間光順応させた。光応答を０．０２、０．０４、０．０８、０．１７、０．３５、０．８３、１．６６、２．９０及び４．１５μW/m2のＵＶフラッシュにより誘発させた。Ｍ錐体駆動応答の記録のために、動物を緑色バックグラウンド光に２分間光順応させた。明応答を０．２５、０．１、１．０、５．０、５０及び１５０cd・s/m2の緑色フラッシュにより誘発させた。ＵＶ及び緑色フラッシュについて、１０回の試行の応答を、３秒のフラッシュ間隔で平均した。
データ分析
ＥＲＧ ｂ波振幅（主に双極性細胞に由来する正の脱分極応答）を決定するために、ＥＲＧデータを、MATLABソフトウェア（バージョンＲ２０１４ａ；MathWorks）を使用して処理し、分析した。振動電位（ｂ波を重ね合わせる小さな高周波ウェーブレット）を、５５Hz高速フーリエ変換低域周波数フィルタリングによりシグナルから除去した。振動電位が、特に光順応条件下で、ｂ波ピークの振幅及び位置に影響を及ぼす場合があるためである。ｂ波振幅をａ波応答（主に光レセプター活性に由来する負の偏向）の底部からｂ波ピークのピークまで計算した。ｂ波潜時をｂ波のピークに達するのに必要なフラッシュ刺激後の時間として測定した。
刺激強度の関数としてのｂ波の振幅を、最小二乗当て嵌め手法（GraphPad Prism, Version 6.01）を使用して、下記等式により当て嵌めた。
Figure 0007267208000039
式中、Ｒは、応答振幅とし、Ｒｍａｘは、飽和応答振幅とし、Ｉは、フラッシュ強度とし、Ｉｎは、半飽和フラッシュ強度とし、ｎは、Ｈｉｌｌ係数とする。
光感度Ｓを飽和応答振幅Ｒｍａｘと半飽和フラッシュ強度Ｉｈとの間の比として定義した。
Ｓ及びＲｍａｘ値を５週目、ｉｖｔ前及び７週目、ｉｖｔ処置後それぞれに得られた非糖尿病対照の平均値に対して正規化した。
桿体駆動ｂ波潜時の分析のために、非糖尿病対照動物の平均潜時を１×１０－５、３×１０－５、１×１０－４及び２×１０－４cd・s/m2のフラッシュにより誘発されたｂ波について決定した（対応する潜時は非常に類似している）。各研究群について、対照の平均値に対する相対変化を上記フラッシュ強度について計算し、平均し、ｂ波潜時における平均相対変化を得た。
ＵＶ錐体駆動ｂ波潜時の分析のために、対照の平均値に対する潜時の相対変化を、０．０４２、０．０８３、０．１６６及び０．３４８μW/cm2の閃光強度により誘発されたｂ波応答について計算し、平均した。
Ｍ錐体駆動ｂ波潜時の分析のために、対照の平均値に対する潜時の相対的変化を１、５、５０及び１５０cd・s/m2のフラッシュ強度により誘発されたｂ波応答について計算し、平均した。
桿体駆動ａ波反応を０．１cd・s/m2のフラッシュにより誘発されたａ波（光刺激直後の負のシグナル偏向）のピークで測定した。
結果
糖尿病誘引後５週目に、ｉｖｔ処置前の網膜におけるニューロン機能不全の程度を定量化するために、ベースラインＥＲＧ記録を行った（図５も参照のこと）。これらのＥＲＧ結果に基づいて、（対照ＩｇＧ１である抗２，４，６－トリニトロフェニル－群２又はＴｒｋＢアゴニスト性ＩｇＧ１ Ｃ２－群３のいずれかによる追跡ｉｖｔ処置を受けた）２つの糖尿病（高血糖）群は、網膜機能不全の同様の分布を示すことが保証された。全体的には、全てのｉｖｔ処置は良好に耐容され、有害事象は観察されなかった。血中グルコースは、非糖尿病対照ラット（群１、ｎ＝１２）において、研究の経過にわたって約５mMで安定であった。ＳＴＺ誘引糖尿病動物（群２及び３、各ｎ＝１２）において、血糖グルコース濃度は、ＳＴＺ処置の約４日後に＞２０mMのレベルに達し、研究の経過にわたって２０mMを下回って低下しなかった。Ｃ２又は対照ＩｇＧ１である抗２，４，６－トリニトロフェニルによるｉｖｔ処理は、血中グルコースレベルに何ら影響を及ぼさなかった。
桿体駆動ｂ波潜時
ｂ波潜時は、網膜における光誘引電気応答の速度の尺度である（主に、双極性細胞及び光レセプターから双極性細胞へのシナプス伝達のレベルに基づく）。潜時は、光フラッシュ刺激後に応答振幅に到達するのに必要な時間として定義される。高血糖及びｉｖｔ処置の効果を図６にまとめる。対照ラットから測定された平均潜時に対する潜時の変化を、ｉｖｔ処置前（ベースラインＥＲＧ評価）及びｉｖｔ処置後に得られたデータについて計算した。ｉｖｔ処置前の２つの高血糖群において約１４msまでの潜時の堅牢な増加があった。このことは、高血糖が誘引するｂ波応答動態の減速、すなわち、桿体駆動網膜処理速度の低下を示している。対照ＩｇＧ１である抗２，４，６－トリニトロフェニルのｉｖｔ注射は、非糖尿病対照群及び高血糖群（群１、黒色バー及び群２、破線バー、図６中、それぞれｉｖｔ後）において、潜時に何ら有意な効果を有さなかった。一方、ＴｒｋＢアクチベーターＣ２でのｉｖｔ処置により、明らかに潜時の遅延の減少がもたらされた（群３、灰色バー、図６中、ｉｖｔ後）。平均して、Ｃ２によるｉｖｔ処置により、約９msまでのｂ波応答の有意な速度向上が引き起こされた（すなわち、潜時の遅延は、１４msから５msに短縮された）。
桿体駆動ｂ波光感度
桿体駆動ｂ波ＥＲＧ応答の光感度は、桿体駆動網膜経路に関与するニューロン数及び脱分極光応答を生成するための光刺激に対するそれらの感度の尺度である。光感度を対照ラット（群１、ｉｖｔ処置前及び同処置後）の平均光感度に対して正規化し、図７にプロットする。正規化された光感度は、高血糖動物（ｉｖｔ処置前、群２及び３）において約４０～５０％低下した。対照ＩｇＧ１のｉｖｔ注射は、対照ラット（群１）又は高血糖ラット（群２）の光感度に有意な影響を何ら及ぼさなかった。重要なことに、ＴｒｋＢアクチベーターＣ２によるｉｖｔ処置により、光感度が約３０％有意に向上した（群３、灰色、ｉｖｔ後、ｉｖｔ前と比較したｉｖｔ後）。
桿体駆動ａ波応答
桿体駆動ａ波応答は、光フラッシュにより引き起こされる桿体光レセプター光応答の大きさの尺度である。桿体駆動ａ波応答を対照ラット（群１、ｉｖｔ処置前及び同処置後）から得られた平均値に正規化し、図８にプロットする。正規化された飽和応答振幅は、高血糖動物（群２及び３、ｉｖｔ処置前）において約１７％減少した。対照ＩｇＧ１のｉｖｔ注射は、対照ラット（群１、黒色）又は高血糖ラット（群２、破線）の正規化ａ波応答に有意な影響を何ら及ぼさず、後者は、研究の経過においてａ波応答の更なる低下を示した。一方、ＴｒｋＢアクチベーターＣ２（群３、灰色）によるｉｖｔ処置により、高血糖群２について観察されたように、ａ波応答の更なる低下を完全に防止することができた。
ＵＶ及びＭ錐体駆動ｂ波潜時
対照ラットから測定された平均潜時に対する潜時の変化をｉｖｔ処置前（ベースラインＥＲＧ評価）及びｉｖｔ処置後に得られたデータについて計算した。この分析をＵＶ錐体駆動ｂ波潜時（図９）及びＭ錐体駆動ｂ波潜時（図１０）について行った。ＵＶ錐体駆動応答の場合、ｉｖｔ処置前の２つの高血糖群において約８msの潜時の堅牢な増加があった。一方、Ｍ錐体駆動潜時の増加は、高血糖において５msであった。これらの統計学的に有意な効果から、高血糖誘引性のｂ波応答動態の減速及び錐体駆動網膜処理の速度の低下が示される。対照ＩｇＧ１のｉｖｔ注射は、非糖尿病対照群（群１、黒色）又は高血糖群（群２、破線）において、ＵＶ及びＭ錐体駆動ｂ波潜時の両方について潜時に有意な影響を何ら及ぼさなかった。Ｃ２（群３、灰色）によるｉｖｔ処置により、ＵＶ錐体の場合に潜時が約５ms短縮され（ｂ波応答動態の約５０％正規化に対応）、Ｍ錐体駆動ｂ波の場合に正常ｂ波応答動態がほぼ完全に回復した。
ＵＶ錐体駆動ｂ波光感度
ＵＶ錐体駆動ｂ波ＥＲＧ応答の光感度を桿体駆動ＥＲＧについて記載されたように評価した。光感度を対照ラット（群１、ｉｖｔ処置前及び同処置後）の平均光感度に対して正規化し、図１１にプロットする。正規化された光感度は、ベースライン（ｉｖｔ前）での高血糖動物において約５０％低下した。対照ＩｇＧ１のｉｖｔ注射は、光感度に有意な影響を何ら及ぼさなかった。一方、Ｃ２によるｉｖｔ処置により、健康な対照ラットで観察されたレベルまで光感度が有意に向上した（群３、灰色）。
Ｍ錐体駆動飽和ｂ波応答振幅
Ｍ錐体駆動ｂ波光感度に対する高血糖の影響は、（調査した時点での）ＵＶ錐体駆動ｂ波に対するほどあまり顕著ではない。しかし、Ｍ錐体駆動ｂ波飽和応答振幅の有意な障害を高血糖の発症後５週目に観察することができた（非糖尿病対照ラットと比較して約１５％の減少、図１２）。Ｃ２によるｉｖｔ処置により、飽和応答振幅を対照のレベルに回復させることができた（群３、灰色）。一方、対照ＩｇＧ１による処置は、有意な影響を何ら及ぼさなかった（群２、破線）。
重要な知見を以下にまとめる。
ＴｒｋＢ活性化により、神経保護及び網膜機能の保存が引き起こされる。神経保護は、高血糖誘引性ニューロン機能不全を示すＳＴＺ誘引糖尿病ラットモデルにおいて示された。ＴｒｋＢ活性化により、光レセプターの機能不全が防止されることが示された。
ＴｒｋＢ活性化により、長期の高血糖後のＳＴＺ誘引糖尿病ラットモデルにおける網膜のニューロン機能の回復／改善、例えば、光応答潜時（すなわち、ＥＲＧ ｂ波潜時の短縮）の改善又は桿体及び錐体駆動光感度の改善が誘引される。
まとめると、薬理学データから、ＴｒｋＢ活性化により異なる疾患状態における眼内の異なるニューロン細胞種の機能を改善／回復することができるという治療概念の証拠が提供される。
また、ＴｒｋＢ活性化により、ＥＲＧ ａ波（これは、光レセプター光応答の反射である）の分析により実証されたように、光レセプター及び外側網膜が保護される。ＥＲＧ ａ波について得られた結果と同様に、糖尿病ラットの眼のコントラスト感度は、持続性高血糖の経過において低下している。一方、ＴｒｋＢアクチベーターＣ２によるｉｖｔ処置により、コントラスト感度が完全に保存される。更に、上記された桿体及び錐体駆動光応答のＥＲＧ ｂ波光感度の改善（光レセプター対双極性細胞シナプス伝達の光感度を反映）から、ＴｒｋＢ活性化により光レセプターを含む外側網膜の機能を改善／保護することができるという概念が更に強化される。
１３．併用処置におけるＢＤＮＦ機能
ヒトＴｒｋＢレセプターを発現するＣＨＯ細胞の培養
ヒトＴｒｋＢ（ｈＴｒｋＢ）レセプター（ThermoFisher Scientific, #K1491）を発現するＣＨＯ細胞を１０％ ウシ胎児血清、glutamax、非必須アミノ酸、２０mM ＨＥＰＥＳ、５μg/ml ブラスチシジン及び２００μg/ml ゼオシンが補充されたDMEM（Lonza, #BE12-604F）中において培養した。刺激の２４時間前に、５０００個 細胞（３０μl）を３８４ウェル透明組織培養プレート（BD Falcon, #353963）の各キャビティに播種し、３７℃及び５％ ＣＯ２の加湿インキュベーター中でインキュベーションした。
ｈＴｒｋＢレセプターを有するＣＨＯ細胞におけるＥＲＫリン酸化の分析
播種の２４時間後、ＣＨＯ／ｈＴｒｋＢ細胞の上清を、０．１％ ＢＳＡを含むが他のサプリメントを含まない室温のＤＭＥＭ ４０μlで置き換えた。１５分後、ＢＤＮＦ（１Ｅ－１３～３Ｅ－８mol/l）、２７７抗体（１Ｅ－１３～２．０２５Ｅ－８mol/l）又はＣ２抗体（１Ｅ－１３～２．０２５Ｅ－８mol/l）の濃度を増加させたDMEM／０．１％ ＢＳＡ １０μlを単独又は２７７抗体もしくはＣ２抗体（両方とも１Ｅ－１３～２．０２５Ｅ－８mol/l）の濃度を増加させた１nM ＢＤＮＦと組み合わせて、ＥＲＫリン酸化を刺激するためにトリプリケートで加えた。室温で４５分間インキュベーションした後、上清を除去し、細胞をウェルあたりに、complete mini protease inhibitor tablet（Roche # 04693124001）並びにホスファターゼインヒビターカクテル２（Sigma # P5726）及び３（Sigma # P0044）並びに１mM ＰＭＳＦ（Sigma # 93482）が補充された溶解バッファー（１×Tryton溶解バッファー（CellSignaling # 9803-S）） ２０μl中において氷上で２０分間溶解した。５マイクロリットルの得られたライゼートを製造メーカーの説明書に従って、市販のアッセイ（Perkin Elmer #TGRES500）を使用して、Ｔ２０２／Ｙ２０４でのＥＲＫ１／２リン酸化の定量に使用した。ＥＲＫリン酸化を反映するアクセプタービーズの発光をPerking Elmer EnVisionマイクロプレートリーダーにおいて、５７０nmで記録し、生データ（平均±ＳＥＭ）及び非線形回帰（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））を含む、GraphPad Prism（バージョン７）による提示のために生成した。
図１３に示されるように、２７７抗体により、ＢＤＮＦ誘引ＥＲＫリン酸化は低下しなかった。Ｃ２抗体の濃度上昇により、ＢＤＮＦ誘引ＥＲＫリン酸化が、Ｃ２誘引ＥＲＫリン酸化のレベルまで低下した。これは、次の投与が必要となるまでの時間を伸ばすために、抗体が高飽和濃度で投与される眼における抗Ｔｒｋｂ抗体の用量に顕著な影響を及ぼす場合がある。２７７抗体は、既存のＢＤＮＦ誘引ＥＲＫリン酸化を妨害することなく高用量で投与することができる。一方、Ｃ２抗体により、既存のＢＤＮＦ誘引ＥＲＫリン酸化は、この抗体のレベルまで低下する。
１４．ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒトＶＥＧＦへの結合
ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイのために、MaxiSorp９６ウェルプレート（Nunc #437111）を炭酸塩／重炭酸バッファー（３．０３g/l Ｎａ２ＣＯ３及び６．００g/l ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中の５００ng/ml ヒトＶＥＧＦ（R&D Systems #293-VE-050）又はラットＶＥＧＦ（R&D Systems #564-RV-050）により、４℃で一晩被覆した。プレートをＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Tween20（Sigma # P7949）を含むリン酸緩衝生理食塩水（Invitrogen # 70011-036））で３回洗浄し、ついで、ＰＢＳ－Ｔ中の１％ ＢＳＡ（Sigma # A3059）と共に室温で３時間インキュベーションして、非特異的結合をブロックした。プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ついで、ＰＢＳ－Ｔ中の１μM Avastin（Roche clinic package）、Ｃ２抗体、２７７抗体又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の１：４系列希釈液と共に４℃で一晩インキュベーションした。プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ついで、Alexa fluor 647ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Invitrogen # A21445）の１：２０００希釈液と共に室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳ－Ｔで更に３回洗浄した後、６４７nmでの発光（ＶＥＧＦへの抗体結合を反映）をPerking Elmer EnVisionマイクロプレートリーダーにおいて記録した。データを生データ（平均±ＳＥＭ）及び非線形回帰（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））を含む、GraphPad Prism（バージョン７）による提示のために生成した。
図１４に示されるように、０．２５μMまでの抗体濃度では、２７７抗ＴｒｋＢ抗体とＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体との間でヒトＶＥＧＦ結合に統計学的有意差はなかった（独立ｔ検定、ｐ＜０．０５）。対照的に、Ｃ２とアイソタイプ対照抗体との間のヒトＶＥＧＦ結合における統計学的有意差は、０．２４nMの抗体濃度ですでに観察された（独立ｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１）。
ＶＥＧＦへのこのような非特異的結合により、例えば、望ましくない副作用が引き起こされ、ＴｒｋＢ活性化のための用量の制御が困難となり又は所望の効果を達成するのに必要とされる抗体の量が増加する場合がある。

Claims (24)

  1. 抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    該抗体又はその抗原結合フラグメントが、
    ａ．配列番号：２及び配列番号：１２それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
    ｂ．配列番号：３及び配列番号：１３それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
    ｃ．配列番号：４及び配列番号：１４それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
    ｄ．配列番号：５及び配列番号：１５それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
    ｅ．配列番号：６及び配列番号：１６それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
    ｆ．配列番号：７及び配列番号：１７それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
    ｇ．配列番号：８及び配列番号：１８それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖、
    ｈ．配列番号：９及び配列番号：１９それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖又は
    ｉ．配列番号：１０及び配列番号：２０それぞれのアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び可変重鎖を含む、抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. 該抗体が、
    ａ．配列番号：２１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：２２又は２３のアミノ酸配列を含む重鎖、
    ｂ．配列番号：２４のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：２５又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖、
    ｃ．配列番号：２７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：２８又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖、
    ｄ．配列番号：３０のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：３１又は３２のアミノ酸配列を含む重鎖、
    ｅ．配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：３４又は３５のアミノ酸配列を含む重鎖、
    ｆ．配列番号：３６のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：３７又は３８のアミノ酸配列を含む重鎖、
    ｇ．配列番号：３９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４０又は４１のアミノ酸配列を含む重鎖、
    ｈ．配列番号：４２のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４３又は４４のアミノ酸配列を含む重鎖又は
    ｉ．配列番号：４５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４６又は４７それぞれのアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１記載の抗ＴｒｋＢ抗体。
  3. 該抗体が、配列番号：２１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：２２又は２３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１記載の抗ＴｒｋＢ抗体。
  4. 該抗体が、配列番号：２４のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：２５又は２６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１記載の抗ＴｒｋＢ抗体。
  5. 該抗体が、配列番号：２７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：２８又は２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１記載の抗ＴｒｋＢ抗体。
  6. 該抗体が、配列番号：３０のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：３１又は３２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１記載の抗ＴｒｋＢ抗体。
  7. 該抗体が、配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：３４又は３５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１記載の抗ＴｒｋＢ抗体。
  8. 該抗体が、配列番号：３６のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：３７又は３８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１記載の抗ＴｒｋＢ抗体。
  9. 該抗体が、配列番号：３９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４０又は４１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１記載の抗ＴｒｋＢ抗体。
  10. 該抗体が、配列番号：４２のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４３又は４４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１記載の抗ＴｒｋＢ抗体。
  11. 該抗体が、配列番号：４５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４６又は４７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１記載の抗ＴｒｋＢ抗体。
  12. 薬剤における使用のための、請求項１～１１のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  13. 該使用が、眼もしくは網膜又は神経変性疾患の処置である、請求項１２記載の使用のための抗体又は抗原結合フラグメント。
  14. 該使用が、神経／ニューロン眼疾患又は網膜疾患の処置のためのものである、請求項１３記載の使用のための抗体又は抗原結合フラグメント。
  15. 該使用が、地図状萎縮の処置のためのものである、請求項１３記載の使用のための抗体又は抗原結合フラグメント。
  16. 該使用が、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜色素変性症、遺伝性網膜ジストロフィー、遺伝性黄斑ジストロフィー、近視性変性、網膜静脈閉塞、網膜動脈閉塞、眼内炎、ブドウ膜炎、嚢胞様黄斑浮腫、任意の網膜疾患に続く脈絡膜新生血管膜、視神経障害、緑内障、網膜剥離、中毒性網膜症、放射線網膜症及び外傷性網膜症、前駆及び軽度～中程度のアルツハイマー病、アルツハイマー病を患う患者の疾患進行の遅延、ハンチントン病、パーキンソン病、大うつ病、統合失調症、統合失調症に関連する認知障害、減弱精神病症候群を患う個体における初発精神病の予防、統合失調症を患う患者における再発の予防、処置抵抗性うつ病、過食症、肥満又はメタボリックシンドロームの処置のためのものである、請求項１２記載の使用のための抗体又は抗原結合フラグメント。
  17. 請求項１～１１のいずれか一項記載の抗体又は抗原結合フラグメントと、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
  18. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、非経口経路、静脈内経路、硝子体内経路又は皮下経路の投与により投与される、請求項１～１１のいずれか一項記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント又は請求項１７記載の医薬組成物。
  19. 請求項１～１１のいずれか一項記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする、単離された１つ以上のポリヌクレオチド。
  20. 請求項１９記載の単離された１つ以上のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  21. 請求項１９記載の単離された１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ウイルスベクター。
  22. 請求項１９記載の単離された１つ以上のポリヌクレオチド又は請求項２０記載の発現ベクターを含む、ホスト細胞。
  23. ａ．請求項２２記載のホスト細胞を得ることと、
    ｂ．ホスト細胞を培養することとを含む、
    抗ＴｒｋＢ抗体又はその抗原結合フラグメントを製造するための方法。
  24. さらに、該抗体又はその抗原結合フラグメントを回収し、精製することを含む、請求項２３記載の方法。
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