EA043771B1 - Антитела к trkb - Google Patents
Антитела к trkb Download PDFInfo
- Publication number
- EA043771B1 EA043771B1 EA201992883 EA043771B1 EA 043771 B1 EA043771 B1 EA 043771B1 EA 201992883 EA201992883 EA 201992883 EA 043771 B1 EA043771 B1 EA 043771B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- seq
- antibody
- trkb
- Prior art date
Links
- 102100035080 BDNF/NT-3 growth factors receptor Human genes 0.000 title description 5
- 101000596896 Homo sapiens BDNF/NT-3 growth factors receptor Proteins 0.000 title description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 253
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 150
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 125
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 125
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 125
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 119
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 69
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 58
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 45
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 42
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 33
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 30
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 25
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 25
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims description 22
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 20
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 claims description 18
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 208000008069 Geographic Atrophy Diseases 0.000 claims description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 15
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 14
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 13
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 11
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 claims description 10
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 10
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 9
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 claims description 9
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 claims description 8
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 8
- 206010012688 Diabetic retinal oedema Diseases 0.000 claims description 7
- 201000011190 diabetic macular edema Diseases 0.000 claims description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 6
- 208000028017 Psychotic disease Diseases 0.000 claims description 6
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 claims description 6
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 claims description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 6
- 101000808006 Rattus norvegicus Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 claims description 5
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 claims description 4
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 claims description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 4
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 238000012898 one-sample t-test Methods 0.000 claims description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 4
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 claims description 3
- 206010058202 Cystoid macular oedema Diseases 0.000 claims description 3
- 206010019899 Hereditary retinal dystrophy Diseases 0.000 claims description 3
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001344 Macular Edema Diseases 0.000 claims description 3
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010064714 Radiation retinopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007527 Retinal artery occlusion Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038848 Retinal detachment Diseases 0.000 claims description 3
- 208000028552 Treatment-Resistant Depressive disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010206 cystoid macular edema Diseases 0.000 claims description 3
- 230000004340 degenerative myopia Effects 0.000 claims description 3
- 206010014801 endophthalmitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000017532 inherited retinal dystrophy Diseases 0.000 claims description 3
- 208000024714 major depressive disease Diseases 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims description 3
- 230000004264 retinal detachment Effects 0.000 claims description 3
- 208000004644 retinal vein occlusion Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 claims description 2
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 claims description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020911 optic nerve disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 claims description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims 2
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 claims 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 claims 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 claims 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 94
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 56
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 47
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 47
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 40
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 39
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 38
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 38
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 37
- 102000006261 human tropomyosin-related kinase-B Human genes 0.000 description 37
- 108010058135 human tropomyosin-related kinase-B Proteins 0.000 description 37
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 34
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 31
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 27
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 26
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 26
- 238000002571 electroretinography Methods 0.000 description 25
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 25
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 25
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 24
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 18
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 14
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 13
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 12
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 12
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000036211 photosensitivity Effects 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 10
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 206010034960 Photophobia Diseases 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 208000013469 light sensitivity Diseases 0.000 description 9
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 8
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 8
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 8
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 230000003956 synaptic plasticity Effects 0.000 description 8
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 7
- 230000004298 light response Effects 0.000 description 7
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000004243 retinal function Effects 0.000 description 6
- 210000001116 retinal neuron Anatomy 0.000 description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 125000001894 2,4,6-trinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C(C(*)=C(C([H])=C1[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 4
- 238000012815 AlphaLISA Methods 0.000 description 4
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 4
- 102100023226 Early growth response protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 4
- 101001049697 Homo sapiens Early growth response protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 4
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 4
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 4
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 4
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 4
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- -1 aspartyl Chemical group 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000008676 import Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 4
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 4
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 230000004382 visual function Effects 0.000 description 4
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 238000003016 alphascreen Methods 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 3
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 3
- 229940096384 chicken egg white lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 230000009760 functional impairment Effects 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 3
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 3
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 3
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 101710154825 Aminoglycoside 3'-phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 101710081722 Antitrypsin Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 101100322915 Caenorhabditis elegans akt-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 2
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 206010020710 Hyperphagia Diseases 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 229920003091 Methocel™ Polymers 0.000 description 2
- 101150111783 NTRK1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150117329 NTRK3 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 230000001130 anti-lysozyme effect Effects 0.000 description 2
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004637 cellular stress Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 238000001977 collision-induced dissociation tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000006764 neuronal dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000003955 neuronal function Effects 0.000 description 2
- 230000006576 neuronal survival Effects 0.000 description 2
- 230000003018 neuroregenerative effect Effects 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 230000003534 oscillatory effect Effects 0.000 description 2
- PRGUDWLMFLCODA-UHFFFAOYSA-N oxybuprocaine hydrochloride Chemical compound [Cl-].CCCCOC1=CC(C(=O)OCC[NH+](CC)CC)=CC=C1N PRGUDWLMFLCODA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000003566 phosphorylation assay Methods 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- DPVHGFAJLZWDOC-PVXXTIHASA-N (2r,3s,4s,5r,6r)-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-3,4,5-triol;dihydrate Chemical compound O.O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DPVHGFAJLZWDOC-PVXXTIHASA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGLPWQKSKUVKMJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione Chemical class C1=CC=C2C(=O)NNC(=O)C2=C1 KGLPWQKSKUVKMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OBWSOTREAMFOCQ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-amino-3,5-dimethylphenyl)-2,6-dimethylaniline;hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 OBWSOTREAMFOCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 241000256173 Aedes albopictus Species 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000270728 Alligator Species 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 208000031873 Animal Disease Models Diseases 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 241000713842 Avian sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108090000363 Bacterial Luciferases Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101000914103 Bos taurus Chymosin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 102220584675 Catechol O-methyltransferase_L233A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 208000010693 Charcot-Marie-Tooth Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 125000000030 D-alanine group Chemical class [H]N([H])[C@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 206010011903 Deafness traumatic Diseases 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012667 Diabetic glaucoma Diseases 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 108010015133 Galactose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101000998947 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-46 Proteins 0.000 description 1
- 101000604674 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 4-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000779418 Homo sapiens RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102100036888 Immunoglobulin heavy variable 1-46 Human genes 0.000 description 1
- 102100038198 Immunoglobulin kappa variable 4-1 Human genes 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000481961 Lachancea thermotolerans Species 0.000 description 1
- 241000235651 Lachancea waltii Species 0.000 description 1
- 102100038609 Lactoperoxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102220579328 Mitogen-activated protein kinase 1_L234A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102100029166 NT-3 growth factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710145851 NT-3 growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 208000002946 Noise-Induced Hearing Loss Diseases 0.000 description 1
- 101150056950 Ntrk2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100021079 Ornithine decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102220473261 Photoreceptor ankyrin repeat protein_L232A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 108091005682 Receptor kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 241000311088 Schwanniomyces Species 0.000 description 1
- 241001123650 Schwanniomyces occidentalis Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Natural products C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000005937 Tropomyosin Human genes 0.000 description 1
- 108010030743 Tropomyosin Proteins 0.000 description 1
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010047571 Visual impairment Diseases 0.000 description 1
- 102100038968 WAP four-disulfide core domain protein 1 Human genes 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229940126574 aminoglycoside antibiotic Drugs 0.000 description 1
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000011558 animal model by disease Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 201000007917 background diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000005460 biophysical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 230000004456 color vision Effects 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- SKYSRIRYMSLOIN-UHFFFAOYSA-N cyclopentolate Chemical compound C1CCCC1(O)C(C(=O)OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 SKYSRIRYMSLOIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001815 cyclopentolate Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 1
- 230000002999 depolarising effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002450 electron transfer dissociation tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N ketamine hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=1C=CC=C(Cl)C=1C1([NH2+]C)CCCCC1=O VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000018769 loss of vision Diseases 0.000 description 1
- 231100000864 loss of vision Toxicity 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000012976 mRNA stabilization Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029942 microperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008185 minitablet Substances 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 1
- 230000007996 neuronal plasticity Effects 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 230000035771 neuroregeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 201000005111 ocular hyperemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 description 1
- SONNWYBIRXJNDC-VIFPVBQESA-N phenylephrine Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=CC(O)=C1 SONNWYBIRXJNDC-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960001802 phenylephrine Drugs 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 201000007914 proliferative diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 239000012562 protein A resin Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004283 retinal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000880 retinal rod photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000007755 survival signaling Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229940074409 trehalose dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 102000015534 trkB Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010064880 trkB Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 108010002164 tyrosine receptor Proteins 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000006492 vascular dysfunction Effects 0.000 description 1
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N vinyl-ethylene Natural products C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в целом относится к агонистическим антителам к TrkB для диагностического и терапевтического применения и в особенности к гуманизированным агонистическим антителам к TrkB. Более специфически, описаны агонистические антитела к TrkB и способы применения для лечения различных заболеваний или нарушений. Также описаны фармацевтические композиции и наборы, содержащие агонистическое антитело к TrkB.
Предпосылки создания изобретения
Тропомиозин-рецепторная киназа В (TrkB), также известная как тирозин-рецепторная киназа В, или рецептор BDNF/NT-3 факторов роста или нейротрофическая тирозинкиназа, рецептор, типа 2, представляет собой белок, который у людей кодируется геном NTRK2 (Genbank ID: 4915). TrkB представляет собой рецептор для нейротрофического фактора из тканей головного мозга (BDNF).
Нейротрофический тирозин-киназный рецептор В (TrkB; символ гена: NTRK2) экспрессируется нейронами сетчатки и глиальными клетками. В нормальной сетчатке, передача сигналов TrkB противодействует клеточному стрессу и способствует выживанию клеток. При заболеваниях глаза, таких как при диабетической ретинопатии или географической атрофии, происходит потеря и функциональные нарушения нейронов сетчатки и глиальных клеток, что вызывает нарушения зрения и потерю зрения. Активация передачи сигналов TrkB выше базального уровня (что уменьшено при диабетической ретинопатии), может противодействовать потере и функциональным нарушениям нейронов и глиальных клеток, улучшая, таким образом, зрительную функцию. Кроме того, активация TrkB имеют потенциал регенерировать потерю синаптических связей в больном глазу, таким образом способствуя восстановлению зрительной функции. При связывании лиганда, TrkB подвергается гомодимеризации с последующим аутофосфорилированием. В зависимости от сайтов фосфорилирования (Y516, Y702, Y706, Y707 или Y817) активируются различные пути передачи сигналов, включая активность PLCy1 или различных подформ AKT и ERK, которые регулируют различные перекрывающиеся каскады передачи сигналов, включая рост аксонов/нейритов, увеличение синаптической пластичности или увеличение выживания клеток.
Агонистические антитела к TrkB были описаны в US 20100196390 и US 20100150914, а также предложено их применение для лечения, например, болезни Шарко-Мари-Тута или диабета.
Тем не менее, сохраняется значительная потребность в новых эффективных агонистических антителах к TrkB, которые можно применять для активирования TrkB пути и, таким образом, предоставляется возможность их применения для терапевтических вмешательств, например, при нейродегенеративных и психических расстройствах.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает моноклональные антитела, которые специфически связываться с TrkB человека. В одном аспекте, антитела согласно настоящему изобретению имеют агонистическую активность и индуцируют фосфорилирование и/или активацию TrkB. В другом аспекте, антитела согласно настоящему изобретению пригодны, например, для лечения заболеваний глаз и сетчатки, таких как, географическая атрофия, вызванная возрастной дегенерацией желтого пятна, диабетическая ретинопатия, глаукома и/или диабетический отек желтого пятна.
В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB, в особенности гуманизированное антитело к TrkB, имеющее одно или несколько свойств, описанных в настоящей заявке ниже.
В другом аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывается с высокой аффинностью с TrkB человека. В одном варианте осуществления, относящемуся к этому аспекту, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывается с TrkB человека при KD<10 нМ. В другом варианте осуществления, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывается с TrkB человека при KD<5 нМ.
В другом аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению активирует TrkB с высокой эффективностью. В одном варианте осуществления, относящемуся к этому аспекту, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению активирует TrkB человека с ЕС50<100 пМ. В дальнейшем варианте осуществления, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению активирует TrkB человека с ЕС50<50 пМ.
В другом аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению является более эффективным для индуцирования активации нижерасположенных TrkB путей передачи сигналов по сравнению с природным TrkB лигандом, BDNF. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению регулирует экспрессию гена посредством TrkB-опосредованного пути передачи сигналов сопоставимым образом относительно BDNF.
В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывает новый эпитоп во внеклеточном домене TrkB человека. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению перекрестно не реагирует с TrkB из других видов, в особенности перекрестно не реагирует с TrkB грызунов.
В одном аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению может быть приготовлено в виде препарата в высоких концентрациях для интравитреальных инъекций в глаза.
В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению имеет низкий риск иммуногенности, как измерено с помощью способа, описанного в примере 5.
- 1 043771
В другом аспекте, CDR последовательности антитела к TrkB согласно настоящему изобретению имеют низкие подверженности последовательностей, как определено с помощью способа, описанного в примере 4.
В еще одном аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению не уменьшает BDNF индуцированное ERK фосфорилирование.
В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению является специфическим для фосфорилирования и/или активации TrkB и неспецифически не фосфорилирует /не активирует TrkA или TrkC. В другом аспекте, антитело к TrkB не связывается неспецифически с VEGF человека.
Дальнейшие аспекты охватывают молекулу (ы) полинуклеотидов, кодирующие антитела согласно настоящему изобретению, экспрессионные векторы и вирусные векторы, а также клетки-хозяева, содержащие такую (ие) молекулу (ы) полинуклеотидов, и способы приготовления антител согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает терапевтические применения антител согласно настоящему изобретению, в особенности для заболеваний сетчатки/глаз.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее (содержащий):
вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48 (L-CDR1); аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 (L-CDR2); и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50 (L-CDR3); и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51 (H-CDR1); аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52 (H-CDR2); и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 (H-CDR3), или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55 (H-CDR1); аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56 (H-CDR2); и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57 (H-CDR3), или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 (H-CDR1); аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59 (H-CDR2); и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 (H-CDR3).
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее (содержащий):
вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 12, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 13, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 14, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 15, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 16, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 17, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 18, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 19, соответственно, или вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 20, соответственно.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее (содержащий):
легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 или 23, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 или 26, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28 или 29, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или 32, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 35, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 или 38, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и тяжелую цепь,
- 2 043771 содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 или 41, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43 или 44, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46 или 47.
В особенно предпочтительном варианте осуществления антитело к TrkB представляет собой гуманизированное антитело к TrkB.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в медицине.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент для применения для лечения заболеваний сетчатки/глаз.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент для применения для лечения заболеваний нейронного/неврального глаза или сетчатки.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент для применения для лечения географической атрофии.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент для применения для лечения возрастной дегенерации желтого пятна или диабетической ретинопатии.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент или фармацевтическую композицию, содержащую антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят с помощью парентерального пути, внутривенного пути, интравитреального пути или подкожного пути введения.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает выделенный(е) полинуклеотид или полинуклеотиды, содержащий(е) последовательность, кодирующую легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент и тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает экспрессионный вектор, содержащий выделенный(е) полинуклеотид или полинуклеотиды, кодирующий(е) легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент и тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает вирусный вектор, содержащий выделенный(е) полинуклеотид или полинуклеотиды, кодирующий(е) легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент и тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает клетку-хозяин, содержащую экспрессионный вектор или выделенный(е) полинуклеотид или полинуклеотиды, кодирующий(е) легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент и тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает способ получения антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий:
получение клетки-хозяина, содержащей экспрессионный вектор или выделенный(е) полинуклеотид или полинуклеотиды, кодирующий(е) легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент и тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент; и культивирование клетки-хозяина.
В одном варианте осуществления, способ получения антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента дополнительно включает восстановление и очистку антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112, 130-143 и/или 205-219 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112 и 130-143; или 92-112 и 205-219; или 130-143 и 205-219; или 92-112 и 130-143 и 205-219 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его
- 3 043771 антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах любой из вышеуказанных комбинаций и дополнительно также с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 313-330 и/или 348-367 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112, 130-143, 205-219, 313-330 и 348-367 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Картирование эпитопов BDNF, 277-антитела, С2 или С20 антител к внеклеточному домену TrkB человека.
Фиг. 2. Данные кПЦР экспрессии (ось Y) для регулируемых генов (ось X) по отношению к синаптической пластичности на SH-SY5Y клетках после обработки с применением BDNF, контроль IgG1 (анти-2,4,6-тринитрофенил, анти-TNP) или D003 антитело.
Фиг. 3. График концентрации 277-антитела в компартментах глаза, как указано, и плазме после ивт инъекции 1 мг 277-антитела в глаза кроликам в зависимости от времени.
Фиг. 4. Рассчитанная глазная ФК IgG1 антител. На оси Y показано витреальная концентрация и на оси X дни после ивт применения. Время после ивт инъекции для достижения витреальной концентрации, эквивалентной EC50, указано стрелками.
Фиг. 5. Общая схема исследования, включая группы животных и временную динамику. В неделю 5, осуществляли оценку исходной ЭРГ (до ивт применения) для определения степени индуцированной гипергликемией нейронной дисфункции в сетчатке. Группа 1 и Группа 2 получали ивт инъекции IgG1 контрольного антитела к 2,4,6-тринитрофенилу (анти-TNP), которое не вызывает каких-либо эффектов на функцию сетчатки. Глаза группы 3 лечили с применением С2 (анти-TrkB агонистическое суррогатное антитело). Функцию сетчатки снова оценивали в неделю 7 (после ивт).
Фиг. 6. Изменения латентности опосредованной палочками b-волны относительно средней латентности контрольной группы, на исходном уровне (до ивт) и через 1 неделю после ивт введения (см. фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=23 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (обозначенные точками, n=21 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=24 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).
Фиг. 7. Светочувствительности, S, опосредованых палочками b-волн, нормированные к средним светочувствительностям контрольной группы, S контроль, на исходном уровне (до ивт) или через 1 неделю после ивт введения (см. фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=23 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (красные, n=20 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=24 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).
Фиг. 8. Ответы опосредованной палочками а-волны, вызванные вспышкой света 0,1 кдс/м2, R, нормированные к среднему ответу контролей, на исходном уровне (до ивт) или через 1 неделю после ивт введения (см. фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=23 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (красные, n=20 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=24 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).
Фиг. 9. Изменения латентности УФ опосредованной колбочками b-волны относительно средней латентности контрольной группы, на исходном уровне (до ивт) и через 1 неделю после ивт введения (см. фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=24 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (красные, n=22 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=24 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).
Фиг. 10. Изменения латентности опосредованной колбочками М-типа b-волны относительно сред- 4 043771 ней латентности контрольной группы, на исходном уровне (до ивт) и через 1 неделю после ивт введения (см. фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=24 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (красные, n=22 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=24 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).
Фиг. 11. Светочувствительности, S, УФ опосредованных колбочками b-волн, нормированные к средним светочувствительностям контрольных групп, S контроль, на исходном уровне (до ивт) или через 1 неделю после ивт введения (см. Фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=22 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (красные, n=22 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=21 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).
Фиг. 12. Амплитуды насыщающих колебаний, Rmax, опосредованных колбочками М-типа b-волн, нормированные к средней амплитуда насыщающих колебаний контролей, Rmax, контроль, на исходном уровне (до ивт) или через 1 неделю после ивт введения (см. фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=24 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (красные, n=22 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=24 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).
Фиг. 13. ERK-фосфорилирование в СНО клетках, экспрессирующих рецептор TrkB человека после стимуляции с применением (A) BDNF, 277-антитела, или комбинации 1 нМ BDNF с возрастающими концентрациями 277-антитела или (В) BDNF, C2 антитела, или комбинации 1 нМ BDNF с возрастающими концентрациями С2-антитела. Данные (символы) представлены в виде средних значений ± СПС (для некоторых точек, усы погрешностей являются более короткими, чем высота символа); соединительные линии отображают нелинейную регрессию (лог(агонист) отн. ответа (три параметра)). Показан один из репрезентативных примеров из серии из трех экспериментов с независимыми клеточными партиями; н.д., недостоверное отличие между 1 нМ BDNF отдельно и 1 нМ BDNF с указанными концентрациями 277-антитела. #р<0,001 1 нМ BDNF отдельно отн. 1 нМ BDNF с указанными концентрациями С2антитела; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения.
Фиг. 14. Связывание 277-антитела или С2 антитела с VEGF человека или крысы в in vitro ELISA анализе. Данные (символы) представлены в виде средних значений ± СПС (примечание: усы погрешностей являются более короткими, чем высота символа); соединительные линии отображают нелинейную регрессию (лог(агонист) отн. ответа (три параметра)). Показан один из репрезентативных примеров из серии из пяти независимых экспериментов. #р<0,01 hVEGF-C2 отн. hVEGF-Изотип IgG1 при указанных концентрациях (критерий Стьюдента для одной выборки).
Подробное описание изобретения
Определения
Общая структура антител или иммуноглобулина хорошо известна специалистам в данной области, эти молекулы представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины, как правило с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь ковалентно связана с тяжелой цепью с помощью одной дисульфидной связи с образованием гетеродимера, и гетеротримерная молекула образуется посредством ковалентной дисульфидной связи между двумя идентичными тяжелыми цепями гетеродимеров. Хотя легкие и тяжелые цепи связаны с помощью одной дисульфидной связи, количество дисульфидных связей между двумя тяжелыми цепями варьируется в зависимости от изотипа иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь имеет также равномерно распределенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет аминоконцевую вариабельную область (VH=вариабельная тяжелая цепь), за которой расположены три или четыре константных домена (CH1, CH2, CH3 и CH4), а также шарнирный участок между CH1 и CH2. Каждая легкая цепь имеет две области, аминоконцевую вариабельную область (VL=вариабельная легкая цепь) и карбоксиконцевый константный домен (CL). VL-область нековалентно связана с VH-областью, а CL-домен, как правило, ковалентно связаний с CH1-доменом через дисульфидную связь. Вероятно, определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными областями легких и тяжелых цепей (Chothia и др., J. Mol. Biol. 186, 1985, cc. 651-663).
- 5 043771
Определенные участки в вариабельных областях значительно различаются у различных антител, т.е. они являются гипервариабельными. Эти гипервариабельные участки содержат остатки, которые непосредственно участвуют в связывании и определяют специфичность каждого конкретного антитела в отношении специфической для него антигенной детерминанты. Гипервариабельность в вариабельных областях, как легкой цепи, так и тяжелой цепи, концентрируется в трех сегментах, которые обозначают как определяющие комплементарность участки (гипервариабельные участки) (CDR) или гипервариабельные петли (HVL). CDR определяют путем сравнения последовательностей согласно методу, описанному у Kabat и др., в: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991, a HVL структурно определяют на основе трехмерной структуры вариабельной области согласно методу, описанному у Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917. Если эти два метода приводят к некоторым различиям при идентификации CDR, то предпочтительным является определение на основе структуре. Согласно номенклатуре Кэбота CDR-L1 расположен примерно на остатках 24-34, CDR-L2 примерно на остатках 50-56 и CDR-L3 примерно на остатках 89-97 в вариабельной области легкой цепи; CDR-H1 расположен примерно на остатках 31-35, CDR-H2 примерно на остатках 50-65 и CDR-H3 примерно на остатках 95-102 в вариабельной области тяжелой цепи. Таким образом, CDR1, CDR2, CDR3 тяжелых и легких цепей определяют уникальные и функциональные свойства, специфические для данного антитела.
Три CDR в каждой из тяжелых и легких цепей разделены каркасными участками (FR), которые содержат последовательности, в меньшей степени имеющие тенденцию к вариабельности. Начиная с аминоконца по направлению к карбоксиконцу вариабельных областей тяжелых и легких цепей FR и CDR упорядочены следующим образом: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В значительной степени βскладчатая конформация FR позволяет CDR в каждой из цепей находиться в непосредственной близости друг с другом, а также с CDR из другой цепи. Полученная конформация присуща антигенсвязывающему центру (см. Kabat и др., NIH Publ. № 91-3242, т. I, 1991, сс. 647-669), хотя не является необходимым условие, чтобы все остатки CDR непосредственно участвовали в связывании антигена.
Остатки FR и константные домены Ig не вовлечены непосредственно в связывание антигена, но участвуют в связанной с антигеном и/или опосредуемой антигеном эффекторной функции. Некоторые остатки FR, вероятно, оказывают выраженное воздействие на связывание антигена по меньшей мере тремя путями: путем нековалентного связывания непосредственно с эпитопом, путем взаимодействия с одним или несколькими остатками CDR и путем влияния на поверхность раздела между тяжелыми и легкими цепями. Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антигена, но опосредуют различные эффекторные функции Ig, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), комплементзависимой цитотоксичности (CDC) и антителозависимом клеточном фагоцитозе (ADCP).
Легкие цепи иммуноглобулинов позвоночных животных относят к одному или двух четко различимых классов, каппа (к) и лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности константного домена. Для сравнения, тяжелые цепи иммуноглобулинов млекопитающих относятся к одному из пяти основных классов с учетом последовательности константных доменов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. IgG и IgA дополнительно подразделяют на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2, соответственно. Константные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации классов нативных иммуноглобулинов хорошо известны.
В контексте настоящего описания понятия антитело, антитело к TrkB, гуманизированное антитело к TrkB и вариант гуманизированного антитела к TrkB применяют в наиболее широком смысле, и они относятся, в частности, к моноклональным антителам (включая полноразмерные моноклональные антитела), мультиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам), антителам с незначительными модификациями, такими как N- или С-концевые усечения, и фрагментам антител, таким как вариабельные области и другие участки антител, которые обладают требуемой биологической активностью, например, способностью связываться с TrkB.
Понятие моноклональное антитело (mAb) относится к антителу из популяции практически гомогенных антител; т.е. индивидуальные антитела в указанной популяции являются идентичными за исключением встречающихся в естественных условиях мутаций, которые могут присутствовать в очень небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, их мишенью является индивидуальная антигенная детерминанта, эпитоп. Таким образом, прилагательное моноклональные является отличительным признаком практически гомогенной популяции антител, мишенью которых является идентичный эпитоп, и понятие не ограничено требованием к получению антител с помощью какого-либо конкретного метода. Должно быть очевидно, что моноклональные антитела можно получать с помощью любой техники или методологии, известной в данной области; включая, например, метод гибридом (Kohler и др., Nature 256, 1975, с. 495), или методы рекомбинантной ДНК, известные в данной области (см., например, US 4816567), или методы выделения моноклональных полученных с помощью рекомбинантной ДНК антител с использованием фаговых библиотек антител, которые описаны у
- 6 043771
Clackson и др., Nature 352, 1991, сс. 624-628 и у Marks и др., J. Mol. Biol. 222, 1991, сс. 581-597.
Химерные антитела состоят из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антител из одного вида (например, из млекопитающего кроме человека, такого как мышь) и константных областей легкой и тяжелой цепи антитела из других видов (например, человека), и их можно получать путем соединения последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области антитела из первого вида (например, мыши), с последовательностями ДНК константных областей антитела из второго вида (например, человека), и трансформации хозяина экспрессионным вектором, содержащим связанные последовательности, что позволяет хозяину продуцировать химерное антитело. В альтернативном варианте химерное антитело может также представлять собой антитело, в котором одна или несколько областей или доменов тяжелой и/или легкой цепи идентичны, гомологичны или являются вариантом соответствующей последовательности в моноклональном антителе из другого класса или изотипа иммуноглобулина или из консенсусной последовательности или последовательности зародышевой линии. Химерные антитела могут включать фрагменты указанных антител при условии, что фрагмент антитела обладает требуемой биологической активностью родительского антитела, например способностью связываться с одним и тем же эпитопом (см., например, US 4816567; и Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc. 6851-6855).
Понятия фрагмент антитела, антигенсвязывающий фрагмент, фрагмент антитела к TrkB, фрагмент гуманизированного антитела к TrkB и фрагмент варианта гуманизированного антитела к TrkB относятся к части полноразмерного антитела к TrkB, в котором сохраняется вариабельная область или ее функциональная способность, например, специфичность связывания с эпитопом TrkB. Примерами фрагментов антител являются (но, не ограничиваясь только ими) Fab-, Fab'-, F(ab')2-, Fd-, Fv-, scFv- и scFv-Fc-фрагмент, димерное антитело (диабоди), линейное антитело, одноцепочечное антитело, минитело, димерное антитело, образованное из фрагментов антитела, и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
Полноразмерные антитела можно обрабатывать ферментами, такими как папаин или пепсин, с получением требуемых фрагментов антител. Расщепление папаином применяют для получения двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, которые называют Fab-фрагментами, каждый с одним антигенсвязывающим центром, при этом оставшуюся часть обозначают как Fc-фрагмент. Fab-фрагмент содержит также константный домен легкой цепи и CH1-домен тяжелой цепи. После обработки пепсином получают F(ab')2-фрагмент, который несет два антигенсвязывающих центра и все еще сохраняет способность к перекрестному сшиванию с антигеном.
Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов присутствием дополнительных остатков, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела на С-конце CH1-домена. F(ab')2фрагменты антител представляют собой пары Fab'-фрагментов, связанных с помощью остатков цистеина в шарнирной области. Известны другие химические сочетания фрагментов антител.
Fv-фрагмент содержит полный антиген-распознающий и антиген-связывающий центр, состоящий из димера, включающего вариабельную область одной тяжелой и одной легкой цепи в тесной нековалентной ассоциации. В этой конфигурации три CDR каждой вариабельной области взаимодействуют с определенным антигенсвязывающим центром на поверхности димера VH-VL. В целом, шесть CDR обусловливают специфичность антитела в отношении связывания антигена.
Одноцепочечный Fv или scFv-фрагмент антитела представляет собой одноцепочечный Fvвариант, содержащий VH- и VL-области антитела, при этом области присутствуют в одной полипептидной цепи. Одноцепочечный Fv обладает способностью распознавать антиген и связываться с ним. Полипептид scFv необязательно может содержать также полипептидный линкер, расположенный между VH- и VL-областями для облегчения образования трехмерной структуры, требуемой для связывания антигена с помощью scFv (см., например, Pluckthun, в: The Pharmacology of monoclonal Antibodies, т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, 1991, cc. 269-315).
Другие обладающие способностью к распознаванию фрагменты антител включают фрагменты, которые содержат пару расположенных в виде тандема Fd-сегментов (VH-CH1-VH-CH1), образующих пару антигенсвязывающих участков. Указанные линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими, что описано, например, у Zapata и др., Protein Eng. 8(10), 1995, cc. 1057-1062.
Гуманизированное антитело или фрагмент гуманизированного антитела представляет собой специфический тип химерного антитела, которое включает вариант аминокислотной последовательности иммуноглобулина или его фрагмента, который обладает способностью связываться с предварительно определенным антигеном и который содержит один или несколько FR, который(ые) имеет(ют) аминокислотную последовательность, практически соответствующую последовательности человеческого иммуноглобулина, и один или несколько CDR, который(ые) имеет(ют) аминокислотную последовательность, которая практически соответствует аминокислотной последовательности нечеловеческого иммуноглобулина. Указанную нечеловеческую аминокислотную последовательность, которую часто обозначают как импортная последовательность, как правило, получают из импортной области антитела, в частности, вариабельной области. В целом, гуманизированное антитело включает по меньшей мере CDR или HVL нечеловеческого антитела, встроенные между FR вариабельного домена человеческой тяжелой или легкой цепи.
- 7 043771
Настоящее изобретение описаны специфические гуманизированные антитела к TrkB, которые содержат CDR, полученные из мышиного лидерного D003, встроенные между FR последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепи человеческой зародышевой линии. Должно быть очевидно, что определенные остатки мышиного FR можно импортировать для обеспечения функции гуманизированных антител, и следовательно, определенные остатки последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепи человеческой зародышевой линии модифицируют для того, чтобы они были такими же как в соответствующей мышиной последовательности.
В одном аспекте, гуманизированное антитело к TrkB содержит практически все из по меньшей мере одной и, как правило, двух вариабельных областей (таких, например, как входящие в Fab-, Fab'-, F(ab')2-, Fabc- и Fv-фрагменты), в которых все или практически все CDR соответствуют CDR нечеловеческих иммуноглобулинов, и согласно настоящему изобретению CDR представляют собой мышиные последовательности лидерного D003, и FR представляют собой FR, которые имеют консенсусную последовательность или последовательность зародышевой линии человеческого иммуноглобулина. В другом объекте изобретения гуманизированное антитело к TrkB включает также по меньшей мере часть Fc-области иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина. Как правило, антитело должно содержать как легкую цепь, так и по меньшей мере вариабельную область тяжелой цепи. Антитело может включать также при необходимости один или несколько из следующих участков: CH1, шарнирная область, CH2, CH3 и/или CH4 тяжелой цепи.
Гуманизированное антитело к TrkB может быть выбрано из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Например, константный домен может представлять собой комплементсвязывающий константный домен, где является желательным, чтобы гуманизированное антитело проявляло цитотоксическую активность, и изотип типично представлял собой IgG1. В тех случаях, когда такая цитотоксическая активность не является желательной, то константный домен может представлять собой другой изотип, например, IgG2. Альтернативное гуманизированное антитело к TrkB может содержать последовательности из более чем одного класса или изотипа иммуноглобулинов, и выбор конкретных константных доменов для оптимизации требуемых эффекторных функций находится в компетенции обычного специалиста в данной области. Конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения являются антитела, которые представляют собой антитела изотипа IgG1 и более конкретно антитела изотипа IgG1, в которых выключены эффекторные функции.
FR и CDR или HVL гуманизированного антитела к TrkB не обязательно должны точно соответствовать родительским последовательностям. Например, один или несколько остатков в импортном CDR или HVL или в консенсусной последовательности или последовательности зародышевой линии FR можно изменять (например, посредством мутагенеза) путем замены, инсерции или делеции, в результате чего полученный аминокислотный остаток становится не идентичным исходному остатку в соответствующем положении любой родительской последовательности, но, тем не менее, антитело сохраняет функцию, такую как способность связываться с TrkB. Указанное изменение, как правило, не должно быть обширным и должно представлять собой консервативные изменения. Как правило, по меньшей мере 75% остатков, чаще по меньшей мере на 90% и наиболее часто более 95% или более 98% или более 99%, гуманизированного антитела должно соответствовать остаткам родительской консенсусной последовательности или последовательности зародышевой линии FR и импортных последовательностей CDR.
Остатки иммуноглобулина, которые влияют на поверхность раздела между вариабельными областями тяжелой и легкой цепи (поверхность раздела VL-VH), представляют собой остатки, которые влияют на близость или ориентацию двух цепей относительно друг друга. Конкретными остатками, которые могут участвовать во взаимодействиях между цепями, являются остатки VL 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 и 98 и остатки VH 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 и 103 (согласно системе нумерации, предложенной Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). В US 6407213 обсуждается также, что в указанном взаимодействии могут участвовать такие остатки как остатки VL 43 и 85 и остатки VH 43 и 60. Хотя указанные остатки указаны только для человеческого IgG, их можно рассматривать и для других видов. Важные остатки антитела, которые, как ожидается, могут участвовать во взаимодействиях между цепями, отбирают для замены в консенсусной последовательности.
Понятия консенсусная последовательность и консенсусное антитело относятся к аминокислотной последовательности, которая содержит наиболее часто встречающийся аминокислотный остаток в каждом положении во всех иммуноглобулинах любого класса, изотипа или в любой субъединичной структуре, например, вариабельной области человеческого иммуноглобулина. Консенсусная последовательность может базироваться на иммуноглобулинах конкретных видов или множества видов. Под консенсусной/консенсусным последовательностью, структурой или антителом подразумевают консенсусную человеческую последовательность, указанную в конкретных вариантах осуществления изобретения, и понятие относится к аминокислотной последовательности, которая содержит наиболее часто встречающиеся остатки в каждом положении во всех человеческих иммуноглобулинах конкретного класса, изотипа или субъединичной структуры. Таким образом, консенсусная последовательность содержит
- 8 043771 аминокислотную последовательность, которая имеет в каждом положении аминокислоту, которая присутствует в одном или нескольких известных иммуноглобулинах, но которая может не представлять собой точную копию полной аминокислотной последовательности любого индивидуального иммуноглобулина. Вариабельную область консенсусной последовательности не получают из какого-либо встречающегося в естественных условиях антитела или иммуноглобулина (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) и его вариантов. Консенсусные последовательности FR тяжелой и легкой цепи и их варианты представляют собой ценные последовательности для получения гуманизированных антител к TrkB (см., например, US 6037454 и 6054297).
Человеческие последовательности зародышевой линии присутствуют в естественных условиях в популяции человеческих антител. Комбинация этих генов зародышевой линии создает разнообразие антител. Последовательности зародышевой линии антитела легкой цепи антитела получают из консервативных человеческих v-генов и j-генов зародышевой линии каппа или лямбда. Аналогично этому последовательности тяжелой цепи получают из v-, d- и j-генов зародышевой линии (LeFranc М-Р и LeFranc G, The Immunoglobulin Facts Book, изд-во Academic Press, 2001).
Выделенное антитело представляет собой антитело, которое идентифицировано и отделено и/или очищено от компонента его естественного окружения. Загрязняющие компоненты естественного окружения антитела представляют собой субстанции, которые могут влиять на диагностическое или терапевтическое применение антитела и могут представлять собой ферменты, гормоны или другие белковые или небелковые растворенные вещества. В одном из объектов изобретения выделенное антитело должно представлять собой антитело, очищенное до степени, превышающей 95 мас.%.
Выделенное антитело представляет собой антитело in situ внутри рекомбинантных клеток, в которых оно продуцировано, если в нем не присутствует ни один компонент естественного окружения антитела. Однако, как правило, выделенное антитело получают с помощью по меньшей мере одной стадии очистки, во время которой удаляют рекомбинантный клеточный материал.
Понятие характеристика антитела относится к факторам/свойствам, которые описывают распознавание антителом антигена или эффективность антитела in vivo. Изменения в аминокислотной последовательности антитела могут влиять на свойства антитела, такие как фолдинг, и могут влиять на физические факторы, такие как начальная скорость связывания антитела с антигеном (ka), константа диссоциации антитела от антигена (kd), константа аффинности антитела к антигену (Kd), конформация антитела, стабильность белка и время полужизни антитела.
В контексте настоящего описания понятия идентичный или процент идентичности касательно двух или большего количества нуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к двум или большему количеству последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент одинаковых нуклеотидов или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия. Для определения процента идентичности последовательности выравнивают для оптимального сравнения (например, можно интродуцировать бреши в последовательность первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности для оптимального сравнительного анализа первичной структуры со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Когда в положении в первой последовательности находится такой же аминокислотный остаток или нуклеотид, что и в соответствующем положении во второй последовательности, то молекулы являются идентичными в указанном положении. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от количества идентичных положений в последовательностях (т.е. % идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающихся положений)х100). В некоторых вариантах осуществления изобретения две сравниваемые последовательности имеют одинаковую длину после интродукции при необходимости брешей в последовательности (например, исключая дополнительную последовательность, простирающуюся за последовательностями, подлежащими сравнению). Например, когда сравнивают последовательности вариабельных областей, то лидерные и/или последовательности константных доменов не рассматриваются. При сравнении последовательностей двух последовательностей, соответствующий CDR относится к CDR, расположенному в одинаковом положении в обеих последовательностях (например, CDR-H1 каждой последовательности).
Определение процента идентичности или процента сходства между двумя последовательностями можно осуществлять с помощью математического алгоритма. Предпочтительным примером математического алгоритма, который можно применять для сравнения двух последовательностей, является (но не ограничиваясь только ими) алгоритм Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1990, cc. 2264-2268, модифицированный согласно описанному у Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 5873-5877. Указанный алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST, описанные у Altschul и др., J. Mol. Biol. 215, 1990, cc. 403-410. Анализ нуклеотидов с помощью BLAST можно осуществлять с помощью программы NBLAST, в которой балл = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеиновой кислоте, кодирующей представляющей интерес белок.
- 9 043771
Анализ белков с помощью BLAST можно осуществлять с помощью программы XBLAST, в которой балл = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных представляющему интерес белку. Для осуществления сравнительных анализов первичной структуры, включающей бреши, можно применять программу Gapped BLAST, описанную у Altschul и др., Nucleic Acids, 25, 1997, cc. 3389-3402. В другом варианте можно применять PSI-Blast для осуществления итерационного поиска, позволяющего определять отдаленные взаимосвязи между молекулами (Id.). При применении программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast можно применять задаваемые по умолчанию параметры соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Другим предпочтительным примером (но, не ограничиваясь только им) математического алгоритма, который можно применять для сравнения последовательностей, является алгоритм, описанный у Myers и Miller, CABIOS, 1989. Указанный алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программ для сравнительного анализа первичной структуры последовательностей GCG. Когда программу ALIGN применяют для сравнения аминокислотных последовательностей, то можно применять таблицу взвешенных остатков РАМ120, штраф за длину бреши 12 и штраф за брешь 4. Дополнительные алгоритмы для анализа последовательностей известны в данной области и включают ADVANCE и ADAM, описанные у Torellis и Robotti, Comput. Appl. Biosci. 10, 1994, cc. 3-5; и FASTA, описанный у Pearson и Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, cc. 2444-2448. В программе FASTA параметр ktup обозначает контрольный параметр, который задает чувствительность и скорость поиска. Если ktup=2, то сходные области в двух подлежащих сравнению последовательностях выявляют путем просмотра пар выравненных остатков; если ktup=1, то оценивают индивидуальные выравненные аминокислоты. Для белковых последовательностей можно задавать значение ktup, равное 2 или 1, а для последовательностей ДНК значения в пределах от 1 до 6. В альтернативном варианте сравнительный анализ первичной структуры белковых последовательностей можно осуществлять с помощью алгоритма CLUSTAL W, описанного у HIiggins и др., Methods Enzymol. 266, 1996, cc. 383-402.
Последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана, если она расположена в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, предпоследовательность нуклеиновой кислоты или секреторная лидерная последовательность функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если она экспрессируется в виде белокпредшественник, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает влияние на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он позиционирован таким образом, что облегчает трансляцию. В целом, функционально связана обозначает, что последовательности ДНК, которые связаны, являются соприкасающимися, и, в случае секреторной лидерной последовательности, соприкасаются и в рамке считывания. Однако энхансеры не необязательно являются соприкасающимися. Связывание может осуществляться путем лигирования в подходящих сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, то можно использовать синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.
Как используется в настоящей заявке, выражения клетка, клеточная линия и культура клеток используются взаимозаменяемо и все такие обозначения охватывают их потомство. Таким образом, трансформанты и трансформированные клетки включают первичные рассматриваемые клетки и культуры, имеющие происхождение из них, независимо от количества переносов.
Понятие млекопитающее, подлежащее лечению, относится к любому животному, которое принадлежит к классу млекопитающих, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных, а также живущих в зоопарке животных, предназначенных для спорта или комнатных животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека.
Нарушение, как используется в настоящей заявке, представляет собой любое состояние, которое будет получать преимущество от лечения с применением гуманизированного антитела к TrkB, описанного в настоящей заявке. Оно включает хронические и острые нарушения или заболевания, включая те патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающего к указанному нарушению. Неограничивающие примеры или нарушения, подвергаемые лечению в соответствии с настоящей заявкой, включают глазные нарушения или нарушения сетчатки.
Как используется в настоящей заявке, термин нарушение, связанное с TrkB или заболевание, связанное с TrkB, относится к состоянию, при котором показана модификация или активация клеток, экспрессирующих TrkB. Нарушение, связанное с TrkB включает заболевания и нарушения, такие как возрастная дегенерация желтого пятна, географическая атрофия, диабетическая ретинопатия, диабетический отек желтого пятна, пигментная дистрофия сетчатки, наследственная дистрофия сетчатки, наследственная макулодистрофия, миопическая дегенерация, окклюзии вены сетчатки, окклюзии артерии сетчатки, эндофтальмит, увеит, кистозный макулярный отек, хороидальная неоваскулярная мембрана вследствие любого из заболеваний сетчатки, оптические нейропатии, глаукома, отслойка сетчатки, токсическая ретинопатия, лучевая ретинопатия, и травматическая ретинопатия, а также продромальная и от легкой до умеренной болезнь Альцгеймера, задержка прогрессирования заболевания у пациентов с болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, большое депрессивное расстройство, шизоф- 10 043771 рения, когнитивное нарушение, связанное с шизофренией, предотвращение первого приступа психоза у индивидуумов с ослабленным психозным синдромом, предотвращение повторения у пациентов с шизофренией, терапевтически резистентная депрессия, и метаболические заболевания, такие как гиперфагия, ожирение или метаболический синдром.
Термин интравитреальная инъекция имеет общепринятое значение в данной области техники и относится к интродукции антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента в стекловидное тело пациента.
Термин подкожное введение относится к интродукции антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента под кожу больного животного или человека, предпочтительно в карман между кожей и низлежащей тканью, путем относительно медленного пролонгированного введения из содержащего лекарственное средство резервуара. Пощипывание или оттягивание кожи вверх вниз от низлежащей ткани может создавать карман.
Понятие подкожная инфузия относится к интродукции лекарственного средства под кожу больного животного или человека, предпочтительно в карман между кожей и низлежащей тканью, путем относительно медленного пролонгированного введения из содержащего лекарственное средство резервуара в течение периода времени, составляющего (но, не ограничиваясь только указанным) 30 мин или менее или 90 мин или менее. Необязательно инфузию можно осуществлять путем подкожной имплантации насоса для введения лекарственного средства, имплантированного под кожу больного животного или человека, при этом насос обеспечивает введение лекарственного средства в предварительно определенном количестве в течение предварительно определенного периода времени, составляющего 30 мин, 90 мин или периода времени, соответствующего продолжительности схемы лечения.
Понятие подкожный болюс относится к введению лекарственного средства под кожу больного животного или человека, при этом продолжительность введения лекарственного средства в виде болюса составляет менее примерно 15 мин; в другом объекте изобретения менее 5 мин, а еще в одном объекте изобретения в течение менее 60 с. В следующем объекте изобретения введение осуществляют в карман между кожей и низлежащей тканью, где карман можно создавать путем пощипывания или оттягивания кожи вверх вниз от низлежащей ткани.
Термин терапевтически эффективное количество используется по отношению к количеству антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента, при использовании которого происходит ослабление или облегчение одного или нескольких симптомов нарушения, подлежащего лечению. Действующее вещество применяют таким образом, что в указанном количестве оно оказывало благоприятное действие на пациента. В одном аспекте, терапевтически эффективное количество имеет нейрозащитный или нейрорегенеративный эффект. В другом аспекте, терапевтически эффективное количество относится к целевой концентрации в сыворотке пациента, при которой оно проявляется как эффективное, например, в отношении замедления прогрессирования заболевания. Эффективность можно оценивать общепринятыми путями в зависимости от подлежащего лечению состояния. Например, при заболеваниях или нарушениях глаз/ сетчатки, которые характеризуются клетками, экспрессирующими TrkB, эффективность может быть измерена путем определения частоты ответов, например, восстановление зрения или путем оценки времени задержки до прогрессирования заболевания.
Термины лечение и терапия и подобные, как используются в настоящей заявке, относятся к терапевтическим, а также профилактическим или подавляющим мероприятиям в отношении заболевания или нарушения, которые приводят к любому клинически важному или благоприятному действию, включая (но, не ограничиваясь только ими) облегчение или ослабления одного или нескольких симптомов, регресс, замедление или прекращение развития заболевания или нарушения. Таким образом, например, под понятие лечение подпадает введение антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента до или после начала проявления симптома заболевания или нарушения, что приводит к предупреждению или устранению одного или нескольких признаков заболевания или нарушения. В другом примере понятие относится к введению антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента после клинического проявления болезни для борьбы с симптомами болезни. Кроме того, в контексте настоящего описания понятие лечение или терапия относятся к введению антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента после возникновения и после развития клинических симптомов, где введение оказывает воздействие на клинические параметры заболевания или нарушения, такие как степень повреждения ткани или количество и распространение метастазов, вне зависимости от того приводит или нет лечение к облегчению заболевания. Кроме того, если применение композиций, предлагаемых в изобретении, либо индивидуально, либо в сочетании с другим терапевтическим средством купирует или облегчает по меньшей мере один из симптомов подлежащего лечению нарушения по сравнению с указанным симптомом без применения содержащей композиции антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента, результат следует рассматривать как эффективное лечение требуемого нарушения вне зависимости от того, происходит или нет облегчение всех симптомов нарушения.
Термин листовка-вкладыш в упаковке относится к инструкциям, которые принято включать в предназначенные для продажи упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, методах применения, введения, противопоказаниях и/или мерах предосторожности при при
- 11 043771 менении указанных терапевтических продуктов.
Антитела
Описанные и раскрытые в настоящей заявке антитела представляют собой антитела к TrkB, в особенности гуманизированные антитела к TrkB, а также композиции и изделия, содержащие антитела к TrkB согласно настоящему изобретению. Также описаны антигенсвязывающие фрагменты антитела к TrkB. Антитела к TrkB и их антигенсвязывающие фрагменты можно применять для лечения различных заболеваний или нарушений, которые характеризуются уменьшенной активностью TrkB пути. Антитело к TrkB и его антигенсвязывающий фрагмент каждый включает по меньшей мере компонент, который специфически распознает TrkB эпитоп.
При исходной характеристике, выбран анти-TrkB мышиный лидерный D003 на основании его намного лучшей эффективности функционирования антитела. Создавали библиотеку вариантов путем помещения CDR мышиной лидерной последовательности в FR консеснусных вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи человека, а также, путем конструирования FR с различными изменениями.
Это приводило к получению различных гуманизированных вариабельных последовательностей тяжелой и легкой цепи, как показано ниже:
VL Последовательности.
D003 VL (мышиная лидерная), вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 1
DIVMSOSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOSPKLLI
YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCOQYYSYPYTFGGGT
KLEIK
- 12 043771
277-gr_VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 2 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGOGT KLEIK
277-33_VL: (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 3 DIVMTOSPDSLAVSLGERATISCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGGGTK LEIK
277-35 VL: (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 4 DIVMTOSPDSLAVSLGERATISCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGGGTK LEIK
277-42_VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 5 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGGGT KLEIK
277-44 VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 6 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOSPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGOGT KLEIK
277-48 VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 7 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGOGT KLEIK
277-51_VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 8 DIVMTOSPDSLAVSLGERATISCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGGGTK LEIK
- 13 043771
277-64 VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 9 DIVMTOSPDSLAVSLGERATISCKSSOSLLYSSNQKNYLAWYOOKPGOPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGOGTK LEIK
277-67_VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 10 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNQKNYLAWYOOKPGOSPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGOGT KLEIK
VH ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
D003 VH, (мышиная лидерная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: И OVOLOQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTGYWMHWVKORPGOGLEWIGYI NPSTDYTEYNOKFKDKATLTADK S S S Т A YMQL SSLTSEDSAVYYCARSRTGNY WGQGTTLTVSS
277-gr_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 12 OVOLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVROAPGOGLEWMGYI NPSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNY WGQGTLVTVSS
277-33 VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 13 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQRPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTLTRDTS T S T V YMEL S SLTSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
277-35 VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 14 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRORPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTLTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
277-42 VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 15 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQRPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTLTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
- 14 043771
277-44_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 16 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDT S T S T V YMEL S SLT SEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
277-48_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 17 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQRPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
277-51_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 18 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQRPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRATLTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
277-64_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 19
OVOLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVROAPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
277-67_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 20 OVOLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVROAPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
Подчеркнутые последовательности соответствовали CDR областям вариабельных областей легких и тяжелых цепей.
Гуманизированные антитела к TrkB согласно настоящему изобретению представляют собой антитела, которые имеют последовательности легких и тяжелых цепей, как представлено в таблице ниже. Были созданы IgG1-KO мутанты путем интродукции двух мутаций в Fc область, Leu232Ala и Leu233Ala для уменьшения эффекторной функции.
Таблица 1
Антитело | Последовательность | SEQ ID NO: |
277-gr (Легкая цепь, IgGl) | DIVMTQSPDS LAVS L GE RATINCKSSQSLLYSSNQK NYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN | 21 |
- 15 043771
RGEC | ||
277-gr (Тяжелая цепь, IgGl) | QVQLVQSGAEVKKРGASVKVSСKASGYTFTGYWMHW VRQAPGQGLE WMGYINPSTDYTEYNQKFKDRVTMTR DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 22 |
277-gr (Тяжелая цепь, IgGl-КО) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQAPGQGLE WMGYINPSTDYTEYNQKFKDRVTMTR DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 23 |
277-33 (Легкая цепь, IgGl) | DIVM T Q S P D S LAVS L GE RATIS CKSSQSLLYSSNQK NYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGGGT KLEIKRTVAAPSVEIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC | 24 |
277-33 (Тяжелая цепь, IgGl) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQRPGQGLEWIGYINPSTDYTEYNQKFKDRVTLT R DTSTSTVYMELSSLTSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 25 |
277-33 (Тяжелая цепь, IgGl-КО) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQRPGQGLEWIGYINPSTDYTEYNQKFKDRVTLT R DTSTSTVYMELSSLTSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG | 26 |
- 16 043771
ТTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | ||
277-35 (Легкая цепь, IgGl) | DIVMTQSPDS LAVS L GE RATIS CKSSQSLLYSSNQK NYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGGGT KLEIKRTVAAPSVEIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC | 27 |
277-35 (Тяжелая цепь, IgGl) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQRPGQGLEWIG YINPSTDYTEYNQKFKDRVT L T R DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 28 |
277-35 (Тяжелая цепь, IgGl-КО) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQRPGQGLEWIG YINPSTDYTEYNQKFKDRVT L T R DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 29 |
277-42 (Легкая цепь, IgGl) | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQK NYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGGGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC | 30 |
- 17 043771
277-42 (Тяжелая цепь, IgGl) | QVQLVQSGAEVKKРGASVKVSСKASGYTFTGYWMHW VRQRPGQGLEWIGYINPSTDYTEYNQKFKDRVTLТ R DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 31 |
277-42 (Тяжелая цепь, IgGl-КО) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQRPGQGLEWIGYINPSTDYTEYNQKFKDRVTLT R DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 32 |
277-44 (Легкая цепь, IgGl) | DIVMTQSPDS LAVS L GE RATINCKSSQSLLYSSNQK NYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGT KLEIKRTVAAPSVEIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC | 33 |
277-44 (Тяжелая цепь, IgGl) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQAPGQGLEWIGYINPSTDYTEYNQKFKDRVTMTR DTSTSTVYMELSSLTSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 34 |
277-44 (Тяжелая цепь, IgGl-КО) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQAPGQGLEWIGYINPSTDYTEYNQKFKDRVTMTR DTSTSTVYMELSSLTSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV | 35 |
- 18 043771
KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | ||
277-48 (Легкая цепь, IgGl) | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSLLYSSNQK NYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC | 36 |
277-48 (Тяжелая цепь, IgGl) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQRPGQGLEWIGYINPSTDYTEYNQKFKDRVTMTR DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 37 |
277-48 (Тяжелая цепь, IgGl-КО) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQRPGQGLEWIGYINPSТРУТЕYNQKFKDRVTMTR DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 38 |
277-51 (Легкая цепь, IgGl) | DIVM T Q S P D S LAVS L GE RATIS CKSSQSLLYSSNQK NYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGGGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC | 39 |
277-51 (Тяжелая | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW | 40 |
- 19 043771
цепь, IgGl) | VRQRPGQGLEWIGYINPSTDYTEYNQKFKDRATL Т R DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | |
277-51 (Тяжелая цепь, IgGl-КО) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQRPGQGLEWIGYINPSTDYTEYNQKFKDRATL T R DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 41 |
277-64 (Легкая цепь, IgGl) | DIVM T Q S P D S LAVS L GE RATIS CKSSQSLLYSSNQK NYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC | 42 |
277-64 (Тяжелая цепь, IgGl) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQAPGQGLEWIGYINPSTDYTEYNQKFKDRVTMTR DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 43 |
277-64 (Тяжелая цепь, IgGl-КО) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQAPGQGLEWIGYINPSTDYTEYNQKFKDRVTMTR DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV | 44 |
- 20 043771
KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | ||
277-67 (Легкая цепь, IgGl) | DIVM Т Q S Р D S LАVS L GЕ RАТINСKSSQSLLYSSNQK NYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSG SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGQGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC | 45 |
277-67 (Тяжелая цепь, IgGl) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQAPGQGLEWIGYINPSTDYTEYNQKFKDRVTMTR DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 46 |
277-67 (Тяжелая цепь, IgGl-КО) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHW VRQAPGQGLEWIGYINPSTDYTEYNQKFKDRVTMTR DTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNYWGQG TTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK SCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG | 47 |
277 L-CDR1 | KSSQSLLYSSNQKNYLA | 48 |
277 L-CDR2 | WASTRES | 49 |
277 L-CDR3 | QQYYSYPYT | 50 |
277 H-CDR1 (CCG) | GYTFTGYWMH | 51 |
277 H-CDR2 (CCG) | YINPSTDYTEYNQKFKD | 52 |
277 H-CDR3 (CCG) | SRTGNY | 53 |
277 H-CDR1 (Кэбот) | GYWMH | 55 |
277 H-CDR2 (Кэбот) | YINPSTDYTEYNQKFKD | 56 |
277 H-CDR3 (Кэбот) | SRTGNY | 57 |
277 H-CDR1 (Чотиа) | GYTFTGY | 58 |
277 H-CDR2 (Чотиа) | NPSTDY | 59 |
277 H-CDR3 (Чотиа) | SRTGNY | 60 |
Представленные выше CDR согласно нумерации Computing Group (CCG) подчеркнуты (Almagro и др., Proteins 2011; 79:3050-3066 и Maier и др., Proteins 2014; 82:1599-1610). Последовательности, определенные согласно номенклатуре Кэбота, выделенные жирным шрифтом, а определенные согласно системе
- 21 043771 нумерации Чотиа, выделены курсивом.
В одном аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывается с TrkB человека при KD<10 нМ. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывается с TrkB человека при KD<5 нМ. В еще дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывается с TrkB человека при KD приблизительно 1 нМ. Аффинности связывания антител к TrkB могут быть определены согласно способу, описанному в примере 6.
В другом аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению индуцирует фосфорилирование и/или активацию TrkB с высокой эффективностью. В одном аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению фосфорилирует TrkB человека с EC50<100 пМ. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению фосфорилирует TrkB человека с ЕС50<50 пМ. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению фосфорилирует TrkB человека с EC50<40 пМ. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению фосфорилирует TrkB человека с ЕС50<30 пМ. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению фосфорилирует TrkB человека с ЕС50 приблизительно 20 пМ.
В другом аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению является более эффективным для индуцирования активации нижерасположенных TrkB путей передачи сигналов по сравнению с природным TrkB лигандом BDNF. Эффективность антител к TrkB может быть определена в дифференцированных SH-SY5Y клетках согласно способу, описанному в примере 8.
В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению индуцирует экспрессию генов, сопоставимую с природным TrkB лигандом BDNF. Стимуляция с помощью агонистических антител к TrkB увеличивает экспрессию мРНК ARC, VGF, EGR1, которые являются маркерами для повышенной синаптической пластичности и, следовательно, индикаторами, что антитела к TrkB действуют подобно пригодному лиганду BDNF на модуляцию функции нейронов, то есть, повышение выживания нейронов и/или синаптическую пластичность. Картины экспрессии генов могут быть определены согласно способу, описанному в примере 10.
В еще дальнейшем аспекте антитело к TrkB согласно настоящему изобретению защищает нейроны, глиальные клетки и/или нейроваскулярную единицу в сетчатке пациентов, например, с возрастной дегенерацией желтого пятна, географической атрофией или диабетической ретинопатией путем стимуляции TrkB-зависимых путей передачи сигналов выживания и обеспечивая, таким образом, нейропротективное действие.
В другом аспекте антитело к TrkB согласно настоящему изобретению регенерирует аксоны/дендриты и/или синапсы в сетчатке после начала заболевания, например, при возрастной дегенерации желтого пятна, географической атрофии или диабетической ретинопатии и обеспечивая таким образом нейрорегенерацию.
В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению имеет низкий риск иммуногенности и низкую подверженность последовательностей по отношению к его CDR последовательностям. Иммуногенность и гетерогенность являются двумя важными аспектами терапевтического антитела. Измерения таких аспектов можно осуществить с помощью способов, как описано в примерах 4 и 5. Антитела согласно настоящему изобретению были осторожно сконструированы, что иметь минимальную или не иметь иммуногенности и/или гетерогенности.
В еще одном аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению не уменьшает BDNF индуцированное ERK фосфорилирование. Для этого, ERK фосфорилирование может быть измерено, например, в СНО клетках, экспрессирующих TrkB человека, как описано в примере 13. Это может обозначать, что ERK фосфорилирование, индуцированное эндогенно экспрессируемым BDNF, не уменьшается при введении антитела к TrkB согласно изобретению. Это также может обозначать, что антитело к TrkB согласно изобретению не уменьшает ERK фосфорилирование при введении перед, одновременно или впоследствии после экзогенно введенного BDNF. В некоторых случаях, антитело к TrkB не конкурирует с или снижает BDNF индуцированное ERK фосфорилирование по сравнении с индукцией BDNF отдельно.
В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению является специфическим для фосфорилирования и/или активации TrkB и неспецифически не фосфорилирует и/или не активирует TrkA или TrkC.
В другом аспекте, антитело к TrkB не связывается неспецифически с VEGF человека и/или VEGF крысы. Связывание неспецифически в настоящем контексте обозначает, что антитело к TrkB согласно изобретению не связывается с VEGF человека, как измерено, например, с помощью ELISA, как описано в Примере 14. В одном варианте осуществления, отсутствие неспецифического связывания антитела к TrkB может быть определено путем измерения статистически значимое различие (например, критерий Стьюдента для одной выборки, р<0,05) при связывании с VEGF человека между антителом к TrkB и подходящим IgG изотипным контрольным антителом. В особенности, отсутствие неспецифического связывания антитела к TrkB согласно изобретению может быть измерено путем определения любых отличий при связывании с VEGF человека между антителом к TrkB и IgG1 изотипным контрольным антителом. Антитело к TrkB согласно изобретению существенно не отличается относительно отсутствия связывания
- 22 043771 с VEGF человека по сравнению с аналогичной концентрацией IgGl изотипного контрольного антитела вплоть до концентрации приблизительно 0,3 нМ, 0,4 нМ, 0,5 нМ, 0,6 нМ, 0,7 нМ, 0,8 нМ, 0,9 нМ, 1 нМ, 5 нМ, 10 нМ, 20 нМ, 30 нМ, 40 нМ, 50 нМ, 60 нМ, 70 нМ, 80 нМ, 90 нМ, 100 нМ, 110 нМ, 120 нМ, 130 нМ, 140 нМ, 150 нМ, 160 нМ, 170 нМ, 180 нМ, 190 нМ или 200 нМ. В альтернативном варианте осуществления, отсутствие неспецифического связывания антитела к TrkB согласно изобретению может быть измерено путем определения значения IC50 связывания антитела к TrkB с любым одним из VEGF человека или крысы. В особенности, антитело к TrkB согласно изобретению будет проявлять значение IC50 связывания с VEGF человека или крысы приблизительно выше 0,9 мкМ, предпочтительно выше 1 мкМ, выше 2 мкМ, выше 3 мкМ, выше 5 мкМ, выше 10 мкМ, выше 20 мкМ, выше 30 мкМ, выше 40 мкМ, выше 50 мкМ, выше 100 мкМ, выше 150 мкМ, выше 200 мкМ, выше 250 мкМ, выше 300 мкМ, выше 350 мкМ, выше 400 мкМ, выше 450 мкМ, выше 500 мкМ, выше 550 мкМ, выше 600 мкМ, выше 650 мкМ, выше 700 мкМ, выше 750 мкМ, выше 800 мкМ, выше 850 мкМ, или выше 900 мкМ.
Гуманизация и варианты аминокислотной последовательности
Дальнейшие варианты антител к TrkB и фрагментов антител могут быть сконструированы на основе набора CDR, идентифицированных в мышином лидерном D003. Подразумевается, что в указанных вариантах аминокислотных последовательностей антител к TrkB и фрагментов антител CDR остаются неизмененными, но окружающие области, например, FR области, могут быть сконструированы. Варианты аминокислотной последовательности антитела к TrkB можно получать путем интродукции соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК антитела к TrkB или с помощью пептидного синтеза. Указанные варианты включают, например, делеции и/или инсерции и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антител к TrkB, представленных в качестве примера в настоящем описании. Для получения конечной конструкции применяют любую комбинацию делеций, инсерций и замен при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками. Аминокислотные изменения могут также изменять посттрансляционный процессинг гуманизированного антитела к TrkB или его варианта, например, изменение количества или положения сайтов гликозилирования.
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение включает антитела к TrkB или их фрагменты антител, имеющие вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, где аминокислотная последовательность вариабельной легкой цепи и аминокислотная последовательность вариабельной тяжелой цепи являются по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичны аминокислотным последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 2 и 12, или 3 и 13, или 4 и 14, или 5 и 15, или 6 и 16, или 7 и 17, или 8 и 18, или 9 и 19, или 10 и 20, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение включает антитела к TrkB или их фрагменты антитела, имеющие легкую цепь и тяжелую цепь, где аминокислотная последовательность легкой цепи и аминокислотная последовательность тяжелой цепи являются по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичны аминокислотным последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 21 и 22 или 23; 24 и 25 или 26; 27 и 28 или 29; 30 и 31 или 32; 33 и 34 или 35; 36 и 37 или 38; 39 и 40 или 41; 42 и 43 или 44; 45 и 46 или 47 соответственно.
В дальнейшем варианте осуществления, настоящее изобретение включает антитела к TrkB, которые конкурируют за связывание с TrkB с любым из следующих антител.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 или 23.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 или 26.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28 или 29.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или 32.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 35.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 или 38.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 или 41.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43 или 44.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46 или 47.
Другим типом получения аминокислотного варианта антитела является изменение исходной схемы гликозилирования антитела. Термин изменение в контексте настоящей заявки означает делецию одного или нескольких углеводных фрагментов, присутствующих в антителе, и/или добавление одного или
- 23 043771 нескольких сайтов гликозилирования, ранее не присутствующих в антителе.
В некоторых аспектах, настоящее изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют варианты аминокислотных последовательностей антител к TrkB, описанных в настоящей заявке. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей антитела к TrkB, приготавливают с помощью различных методов, известных в данной области техники. Эти методы включают, но не ограничиваясь только ими, выделение из природного источника (в случае встречающихся в природе вариантов аминокислотных последовательностей) или получение с помощью мутагенеза с использованием олигонуклеотидов (или сайтнаправленного мутагенеза), ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза полученного ранее варианта или не являющейся вариантом версии антитела к TrkB.
В определенных вариантах осуществления, антитело к TrkB представляет собой фрагмент антитела. Существуют техники, которые были разработаны для получения фрагментов антител. Фрагменты можно получать путем протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto и др., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 1992, cc. 107-117 и Brennan и др., Science 229, 1985, с. 81). В альтернативном варианте фрагменты можно получать непосредственно в рекомбинантных клетках-хозяевах. Например, Fab'-SH-фрагменты можно выделять непосредственно из Е. coli и химически сшивать с получением F(ab')2-фрагментов (см., например, Carter и др., Bio/Technology 10, 1992, cc. 163167). Согласно другому подходу F(ab')2-фрагменты можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантной клетки-хозяина. Другие методики получения фрагментов антител должны быть очевидны специалисту в данной области.
Антитела к TrkB и их антигенсвязывающие фрагменты могут включать модификации.
В определенных вариантах осуществления, может являться желательным применять фрагмент антитела к TrkB, а не интактное антитело. Может являться желательным модифицировать фрагмент антитела для повышения его времени полужизни в сыворотке крови. Это можно осуществлять, например, путем инкорпорования эпитопа связывания рецептора реутилизации в фрагмент антитела. В одном способе, подходящий участок фрагмента антитела может быть изменен (например, мутирован), или эпитоп может быть инкорпорирован в пептидную метку, которую затем сливают с фрагментом антитела на любом конце или в середине, например, путем синтеза ДНК или пептидного синтеза. См., например, WO 96/32478.
В других вариантах осуществления, настоящее изобретение включает ковалентные модификации антител к TrkB. Ковалентные модификации включают модификацию цистеинильных остатков, гистидильных остатков, лизинильных и аминоконцевых остатков, аргинильных остатков, тирозильных остатков, карбоксильных боковых групп (аспартил или глутамил), глутаминильных и аспарагинильных остатков, или серильных, или треонильных остатков. Другой тип ковалентной модификации включает химическое или ферментативное сшивание гликозидов с антителом. Указанные модификации можно осуществлять с помощью химического синтеза или путем ферментативного или химического расщепления антитела, если это возможно. Для интродукции других типов ковалентных модификаций в молекулу антитела можно применять взаимодействие меченых аминокислотных остатков антитела с органическим дериватизирующим агентом, который может взаимодействовать с выбранными боковыми цепями или аминоконцевыми или карбоксиконцевыми остатками.
Удаление любых углеводных фрагментов, присутствующих на антителе, можно осуществлять химическим или ферментативным путем. Химическое дегликозилирование описано у Hakimuddin и др., Arch. Biochem. Biophys. 259, 1987, с. 52 и у Edge и др., Anal. Biochem., 118, 1981, с. 131. Ферментативное отщепление углеводных фрагментов на антителах можно осуществлять с помощью эндо- и экзогликозидаз согласно методу, описанному у Thotakura и др., Meth. Enzymol., 138, 1987, с. 350.
Другой тип пригодной ковалентной модификации предусматривает связывание антитела с одним из многочисленных небелковых полимеров, таких, например, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, с помощью методов, описанных в одном или нескольких US 4640835, US 4496689, US 4301144, US 4670417, US 4791192 и US 4179337.
Связывание эпитопа
Антитела согласно изобретению специфически связывается с нативным или рекомбинантным TrkB человека. Антитела согласно настоящему изобретению распознают специфические эпитоп TrkB антигена и TrkB эпитоп. В особенности, антитела согласно изобретению связываются с эпитопом во внеклеточном домене TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.
Внеклеточный домен TrkB человека по существу включает следующую последовательность (SEQ ID NO. 54):
- 24 043771
CPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVE AYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSE LILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPS ANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLR ITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTV KGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYT LIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRS NEIPSTDVTDKTGREH
Как используется в настоящей заявке, термины эпитоп TrkB антигена и TrkB эпитоп относятся к молекуле (например, пептиду) или фрагменту молекулы, способной (ому) связываться с антителом к TrkB или его антигенсвязывающим фрагментом. Эти термины дополнительно включают, например, TrkB антигенную детерминанту, которая распознается любыми из антител или фрагментов антител согласно настоящему изобретению, которая имеет комбинацию CDR легкой и тяжелой цепей, выбранной из CDR легкой цепи, представленных в SEQ ID NO 48-50, и CDR тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 51-53.
Эпитопы TrkB антигена могут быть включены в белки, фрагменты белков, пептиды или подобные. Эпитопы наиболее часто представляют собой белки, короткие олигопептиды, олигопептидные имитаторы (то есть, органические соединения, которые имитируют антителосвязывающие свойства TrkB антигена), или их комбинации.
Было обнаружено, что антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению связываются с уникальными эпитопами во внеклеточном домене TrkB человека. Предпочтительно, антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112, 130-143 и/или 205-219 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112 и 130-143; или 92-112 и 205-219; или 130-143 и 205-219; или 92-112 и 130-143 и 205-219 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах любой из вышеуказанных комбинаций аминокислотных областей и дополнительно также с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 313-330 и/или 348-367 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112, 130-143, 205-219, 313-330 и 348-367 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.
Таким образом, в контексте связывания эпитопа, выражение связывается в пределах аминокислотных областей X-Y... обозначает, что антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотной области, указанной в последовательности.
Если, например, антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112 или 130-143, то это обозначает, что антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком либо в пределах аминокислотных областей 92-112 или 130-143.
В дальнейшем примере, если антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112 и 130143, то это обозначает, что антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотной области 92-112 и также связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотной области 130143 SEQ ID NO: 54.
В другом аспекте, антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотных областей 92-112, 130-143 и/или 205-219 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотных областей 92-112 и 130-143; или 92-112 и 205-219; или 130-143 и 205-219; или 92-112 и 130-143 и 205-219
- 25 043771 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах любой из вышеуказанных комбинаций аминокислотных областей и дополнительно также с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотных областей 313-330 и/или 348-367 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотных областей 92-112, 130-143, 205-219, 313-330 и 348-367 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.
Если, например, антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотных областей 92-112 или 130-143, то это обозначает, что антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотной области 92-112 или связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотной области 130-143.
В дальнейшем примере, если антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотных областей 92-112 и 130-143, то это обозначает, что антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотной области 92112 и также связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотной области 130-143.
Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что благодаря связыванию с новыми эпитопами TrkB антитело проявляет свои намного превосходящие свойства в активации TrkB.
Полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева и рекомбинантные методы
Другие варианты осуществления охватывают выделенные полинуклеотиды, которые включают последовательность, кодирующую антитело к TrkB, векторы и клетки-хозяева, содержащие полинуклеотиды, и рекомбинантные методики для получения антитела. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать любую желательную форму антитела к TrkB, включая, например, полноразмерные моноклональные антитела, Fab, Fab', F(ab')2, и Fv фрагменты, диатела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
Полинуклеотид(ы), который(е) содержит(ат) последовательность, кодирующую антитело к TrkB или его фрагмент или цепь, может(ут) быть сопряжен(ы) с одной или несколькими регуляторными или контролирующими последовательностями, как известно в данной области техники, и могут содержаться в подходящих экспрессионных векторах или клетках-хозяевах, как известно в данной области техники. Каждая из полинуклеотидных молекул, кодирующих вариабельные домены тяжелой или легкой цепи, может быть независимо сопряжена с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен, такой как константный домен человека, предоставляющий возможность продуцировать интактные антитела. Альтернативно, полинуклеотиды, или их части, могут быть сопряжены совместно, обеспечивая матрицу для получения одноцепочечного антитела.
Для рекомбинантного получения, полинуклеотид, кодирующий антитело, вставлен в реплицируемый вектор для клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии. Доступны различные подходящие векторы для экспрессии рекомбинантных антитело. Компоненты вектора обычно включают, но не ограничиваясь только ими, один или несколько следующих компонентов: сигнальная последовательность, начало репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор, и последовательность терминации транскрипции.
Антитела к TrkB также могут быть получены в виде слитых полипептидов, в которых антитело слито с гетерологичным полипептидом, таким как сигнальная последовательность или другой полипептид, имеющий специфический сайт расщепления на аминоконце зрелого белка или полипептида. Гетерологическую сигнальную последовательность типично выбирают из последовательности, которая распознается и процессируется (то есть, расщепляется сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не распознают и не процессируют сигнальную последовательность антитела к TrkB, сигнальная последовательность может быть заменена прокариотической сигнальной последовательностью. Сигнальная последовательность может представлять собой, например, щелочную фосфатазу, пенициллиназу, липопротеин, лидерные последовательности термостабильного энтеротоксина II и подобные. Для секреции дрожжами, нативная сигнальная последовательность может быть заменена, например, лидерной последовательностью, полученной из инвертазы альфа-фактора дрожжей (включая
- 26 043771 лидерные последовательности а-факторов Saccharomyces и Kluyveromyces), кислой фосфатазой, глюкоамилазой С. albicans или сигнальной последовательностью, описанной в WO 90/13646. В клетках млекопитающих, можно использовать сигнальные последовательности млекопитающих, а также вирусные секреторные лидерные последовательности, например, gD сигнальную последовательность простого герпеса. ДНК для такого участка-прекурсора лигируют в рамке считывания с ДНК, кодирующей гуманизированное антитело к TrkB.
Экспрессионные и клонирующие векторы содержат нуклеотидную последовательность, которая предоставляет возможность вектору реплицироваться в одной или нескольких выбранных клеткаххозяевах. В целом, в клонирующих векторах эта последовательность представляет собой последовательность, которая предоставляет возможность вектору реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина, и включает начала репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны для различных бактерий, дрожжей и вирусов. Начало репликации из плазмиды pBR322 является подходящим для большинства грамм-отрицательных бактерий, начало репликации 2-υ. Плазмиды являются подходящими для дрожжей, и различные вирусные начала репликации (SV40, полиома, аденовирус, VSV, и BPV) пригодны для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. В целом, компонент начала репликации не является необходимым для экспрессионных векторов млекопитающих (начало репликации SV40 типично можно использовать только потому, что он содержит ранний промотор).
Экспрессионные и клонирующие векторы могут содержать ген, который кодирует селектируемый маркер для облегчения идентификации экспрессии. Типичные селектируемые маркерные гены кодируют белки, которые придают резистентность к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, или альтернативно, являются комплементами аксотрофных дефицитов, или в других альтернативных вариантах, восполняют специфические питательные вещества, которые не присутствуют в комплексных питательных средах, например, ген, кодирующий D-аланин рацемат для Bacilli.
В одном из примеров схемы селекции используется лекарственное средство для остановки роста клетки-хозяина. Те клетки, которые успешно трансформированы гетерологичным геном, продуцируют белок, придающий резистентность к лекарственному средству, и, следовательно, выживают в схеме селекции. Примерами такой доминантной селекции является использование лекарственных средств неомицин, микофеноловая кислота и гигромицин. Общепринятыми селектируемыми маркерами для клеток млекопитающих являются те, которые предоставляют возможность идентификации клеток, компетентных за принятие нуклеиновой кислоты, кодирующей гуманизированное антитело к TrkB, такие как DHFR (дигидрофолатредуктаза), тимидинкиназа, металлотионеин-I и -II (такие как гены металлотионеина приматов), аденозиндеаминаза, орнитиндекарбоксилаза, и другие. Клетки, трансформируемые с помощью DHFR-селектируемого гена, сначала идентифицируют путем культивирования всех трансформантов в культуральной среде, которая содержит метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR. Применяемая подходящая клетка-хозяин, если используют DHFR дикого типа, представляет собой клеточную линию яичников китайского хомячка (СНО) с дефицитом активности DHFR (например, DG44).
Альтернативно, клетки-хозяева (предпочтительно хозяева дикого типа, которые содержат эндогенный DHFR), трансформированные или котрансформированные последовательностями ДНК, кодирующими антитело к TrkB, белок DHFR дикого типа, и другой селектируемый маркер, такой как аминогликозид 3'-фосфотрансфераза (АРН), могут быть селектированы путем роста клеток в среде, содержащей селектируемый агент для селектируемого маркера, такой как аминогликозидный антибиотик, например, канамицин, неомицин, или G418. см., например, патент US 4,965,199.
Когда рекомбинантное получение осуществляют в дрожжевой клетке в качестве клетки-хозяина, то в качестве селектируемого маркера можно использовать ген TRP1, присутствующий в дрожжевой плазмиде YRp7 (Stinchcomb и др., 1979, Nature 282: 39). Ген TRP1 обеспечивает селекционный маркер для мутантного штамма дрожжей, у которого отсутствует способность расти в триптофане, например, № АТСС 44076 или РЕР4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). Впоследствии присутствие trp1 поражения в геноме дрожжевой клетки-хозяина обеспечивает эффективное окружение для обнаружения трансформации путем роста при отсутствии триптофана. Аналогичным образом, штаммы дрожжей с дефицитом Leu2p, такие как АТСС 20,622 и 38,626 дополняются известными плазмидами, несущими ген LEU2.
Дополнительно, векторы, имеющие происхождение из кольцевой плазмиды 1,6 мкм pKD1, можно использовать для трансформации дрожжей Kluyveromyces. Альтернативно была описана экспрессионная система для промышленного получения рекомбинантного телячьего химозина для K. lactis (Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). Также были описаны стабильные многокопийные экспрессирующие векторы для секреции зрелого рекомбинантного сывороточного альбумина человека с помощью промышленных штаммов Kluyveromyces (Fleer и др., 1991, Bio/Technology 9:968-975).
Экспрессионные и клонирующие векторы обычно содержат промотор, который распознается организмом-хозяином и функционально связан с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело к TrkB или его полипептидную цепь. Промоторы, подходящие для применения с прокариотическими хо- 27 043771 зяевами, включают phoA промотор, β-лактамазную и лактозную промоторные системы, щелочную фосфатазу, триптофановую (trp) промоторную систему, и гибридные промоторы, такие как tac промотор.
Подходящими также являются другие известные бактериальные промоторы. Промоторы для применения в бактериальных системах также будут содержать последовательность Шайна-Дальгамо (Shine-Dalgamo,
S.D.), функционально связанную с ДНК, кодирующей гуманизированное антитело к TrkB.
Известны многие эукариотические промоторные последовательности. В действительности, все эукариотические гены имеют АТ-обогащенный участок, расположенный на приблизительно 25-30 пар против хода транскрипции от сайта инициации транскрипции. Другая последовательность, в которой 70-80 оснований против хода транскрипции от старта транскрипции многих генов, представляет собой CNCAAT участок, где N может представлять собой любой нуклеотид. На 3' конце большинства эукариотических генов присутствует ААТААА последовательность, которая может являться сигналом для добавления поли-А хвоста к 3' концу кодирующей последовательности. Все эти последовательности подходяще вставлены в экспрессионные векторы.
Примеры подходящих промоторных последовательностей для применения с дрожжами-хозяевами, включают промоторы для 3-фосфоглицерат киназы или других гидролитических ферментов, таких как енолаза, глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа, гексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицерат мутаза, пируват киназа, триозофосфат изомераза, фосфоглюкозоизомераза, и глюкокиназа.
Индуцибельные промоторы имеют дополнительные преимущества транскрипции под контролем условий роста. Они включают промоторные участки дрожжей для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, производных ферментов, связанных с метаболизмом азота, металлотионеина, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящие векторы и промоторы для применения для экспрессии в дрожжах дополнительно описаны в ЕР 73,657. Дрожжевые энхансеры также благоприятно используются с дрожжевыми промоторами.
Транскрипция антитела к TrkB из векторов в клетках-хозяевах млекопитающих контролируется, например, промоторами, полученными из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы кур, аденовирус (такой как Аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и вирус обезьян 40 (SV40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например, актиновый промотор или иммуноглобулиновый промотор, или из промоторов теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев.
Ранние и поздние промоторы вируса SV40 легко получают в виде рестрикционного фрагмента SV40, который также содержит начало репликации вируса SV40. Немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека легко получают в виде рестрикционного фрагмента HindIII E. Система для экспрессии ДНК в млекопитающих-хозяевах, используя вирус папилломы крупного рогатого скота в качестве вектора, описан в патенте US № 4,419,446. Модификация этой системы описана в патенте US № 4,601,978. См. также Reyes и др., 1982, Nature 297:598-601, где описана экспрессия кДНК п-интерферона человека в мышиных клетках под контролем тимидинкиназного промотора из вируса простого герпеса. Альтернативно, в качестве промотора можно использовать длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса.
Другим полезным элементом, который может использоваться в рекомбинантном экспрессионном векторе, является энхансерная последовательность, которую используют для усиления транскрипции ДНК, кодирующей антитело к TrkB, высшими эукариотами. В настоящее время известны много энхансерных последовательностей из генов млекопитающих (например, глобин, эластаза, альбумин, αфетопротеин и инсулин). Тем не менее, типично используют энхансер из вируса эукариотической клетки. Примеры включают SV40 энхансер на поздней стороне начала репликации (по 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне начала репликации и аденовирусные энхансеры. Также см. Yaniv, 1982, Nature 297:17-18 относительно описания энхансерных элементов для активации эукариотических промоторов. Энхансер может быть сплайсирован в вектор в положении 5' или 3' к антителу к TrkB-кодирующей последовательности, но предпочтительно он расположен на 5' сайте от промотора.
Экспрессионные векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (дрожжи, грибы, насекомые, растения, животные, люди или ядросодержащих клетках из других многоклеточных организмов) также могут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности являются общедоступными из 5' и, иногда 3', нетранслируемых участков эукариотических или вирусных ДНК или к ДНК. Эти участки содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслируемой части мРНК, кодирующей антитело к TrkB. Одним из пригодных компонентов терминации транскрипции является участок полиаденилирования бычьего гормона роста. См. WO94/11026 и экспрессионный вектор, описанный в этом документе. В некоторых вариантах осуществления, антитела к TrkB могут быть экспрессированы, используя CHEF систему. (См., например, патент US № 5888809; содержание которого включено в настоящую заявку в качестве ссылки.)
- 28 043771
Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессирования ДНК в векторах согласно настоящему изобретению представляют собой клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот, описанные выше. Подходящие прокариоты для этой цели включат эубактерии, такие как грамм-отрицательные или грамм-положительные организмы, например, Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например, Е. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigella, а также Bacilli, такие как В. subtilis и В. licheniformis (например, В. licheniformis 41 Р, раскрытые в DD 266,710, опубликованном 12 апреля 1989 г.), Pseudomonas, такие как P. aeruginosa, и Streptomyces. Одним из предпочтительных хозяев для клонирования Е. coli является Е. coli 294 (АТСС 31,446), хотя пригодны также другие штаммы, такие как Е. coli В, Е. coli X1776 (АТСС 31,537), и Е. coli W3110 (АТСС 27,325). Эти примеры являются иллюстративными, а не ограничительными.
Дополнительно к прокариотам, эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессирования векторов, кодирующих антитело к TrkB. Saccharomyces cerevisiae, или общераспространенные хлебопекарные дрожжи наиболее часто используются среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев. Тем не менее, различные другие рода, виды и штаммы является общедоступными и пригодными в настоящей заявке, такие как Schizosaccharomyces pombe; хозяева Kluyveromyces, такие как, например, K. lactis, K. fragilis (АТСС 12,424), K. bulgaricus (АТСС 16,045), K. wickeramii (АТСС 24,178), K. waltii (АТСС 56,500), K. drosophilarum (АТСС 36,906), K. thermotolerans, и K. marxianus; yarrowia (ЕР 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и нитчатые грибы, такие как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, и хозяева Aspergillus, такие как А. nidulans и A. niger.
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела к TrkB имеют происхождение из многоклеточных организмов. Примеры беспозвоночных клеток включают клетки растений и насекомых, включая, например, различные бакуловирусные штаммы и варианты и соответствующие разрешенные насекомые клетки-хозяева из таких организмов, как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая мушка), и Bombyx mori (шелковичный червь). Общедоступны различные вирусные штаммы для трансфекции, например, L-1 вариант Autographa californica NPV и Bm-5 штамм Bombyx mori NPV, и такие вирусы можно использовать, в особенности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
Также в качестве хозяев могут использоваться культуры растительных клеток хлопчатника, кукурузы, картофеля, сои, петунии, томата и табака.
Антитела к TrkB или их антигенсвязывающие фрагменты согласно изобретению также могут быть инкорпорированы в вирусные векторы, то есть, полинуклеотид, кодирующий антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, интродуцируют в вирусный вектор и затем экспрессируют в организме пациента после инфицирования вирусом.
В другом аспекте, экспрессию антител к TrkB осуществляют в клетках позвоночных. Размножение клеток позвоночных в культуре (тканевая культура) стало обычной процедурой и техники являются широкодоступными. Примерами пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия почек обезьян CV1, трансформированная с помощью SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), линий почки эмбриона человека (293 или 293 клетки, субклонированные для роста в суспензионной культуре, (Graham и др., 1977, J. Gen Virol. 36: 59), клетки почки новорожденного хомяка (ВНК, ATCC CCL 10), клетки яичника китайского хомячка/-DHFR1 (СНО, Urlaub и др., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; например, DG44), клетки Сертоли мышей (ТМ4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), клетки почки обезьян (CV1 ATCC CCL 70), клетки почки африканской зеленой обезьяны (VERO-76, ATCC CRL-1587), клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2), клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34), клетки почки крысы линии Buffalo (BRL 3А, АТСС CRL 1442), клетки легких человека (W138, АТСС CCL 75), клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065), опухоль молочной железы мышей (ММТ 060562, АТСС CCL51), TR1 клетки (Mather и др., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68), MRC 5 клетки, FS4 клетки, и линия гепатомы человека (Hep G2).
Клетки-хозяева трансформируют с помощью вышеописанных экспрессионных или клонирующих векторов для продукции антитела к TrkB и культивируют в подходящей питательной среде, модифицированной, если это является подходящим, для индуцирования промоторов, отбора трансформантов, или амплификации генов, кодирующих желательные последовательности.
Клетки-хозяева, используемые для продуцирования антитела к TrkB, описанные в настоящей заявке, могут культивироваться в различных питательных средах. Коммерчески доступные среды, такие как Ham F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), минимальная питательная среда ((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.), и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла ((DMEM), Sigma-Aldrich Co.) являются подходящими для культивирования клеток-хозяев. Дополнительно, любая из сред, описанных в одном или нескольких источниках: Ham и др., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes и др., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, патент US № 4,767,704, патент uS № 4,657,866, патент US № 4,927,762, патент US № 4,560,655, патент US № 5,122,469, WO 90/103430, и WO 87/00195, может использоваться в
- 29 043771 качестве культуральной среды для клеток-хозяев. Любые из этих сред могут быть дополнены, при необходимости, гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или фактор роста эпидермиса), солями (такими как хлорид натрия, кальция, магния, и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как гентамицин), микроэлементами (определяемые как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне), и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Другие добавки также можно включать в подходящих концентрациях, что является очевидным для квалифицированного специалиста в данной области техники. Условия культивирования, такие как температура, рН и другие, представляют собой условия, которые ранее использовались для клетки-хозяина, выбранной для экспрессии, и будут понятными квалифицированному специалисту в данной области техники.
При использовании рекомбинантных техник, антитело может продуцироваться внутриклеточно, в периплазматическое пространство, или непосредственно секретируется в питательную среду. Если антитело продуцируется внутриклеточно, то клетки могут быть разрушены для высвобождения белка в качестве первой стадии. Отходы в виде частичек, либо клетки-хозяева или лизированные фрагменты, могут быть удалены, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации. В Carter и др., 1992, Bio/Technology 10:163-167 описана процедура для выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство Е. coli. Вкратце, клеточную массу размораживают в присутствии ацетата натрия (рН 3,5), EDTA, и фенилметилсульфонилфторид (PMSF) приблизительно в течение 30 минут. Клеточный дебрис может быть удален путем центрифугирования. Если антитело секретируется в питательную среду, то супернатанты с таких экпрессирующих систем в целом сначала концентрируют, используя коммерчески доступный фильтр для концентрации белка, например, ультрафильтационный блок Amicon или Millipore Pellicon. Ингибитор протеазы, такой как PMSF, может быть включен в любую из вышеуказанных стадий для ингибирования протеолиза и антибиотики могут быть включены для предотвращения роста случайных загрязнителей. Для выделения антитела из клетки-хозяина можно использовать различные методы.
Композиция антитела, приготовленная из клеток, может быть очищена, например, путем хроматографии с гидроксиапатитом, гель-электрофореза, диализа и афинной хроматографии, где типичной техникой очистки является афинная хроматография. Пригодность белка А в качестве афинного лиганда зависит от видов и изотипа любого домена Fc иммуноглобулина, который присутствует в антителе. Белок А можно использовать для очистки антитела, которые основываются на тяжелых цепях гамма1, гамма2, или гамма4 человека (см., например, Lindmark и др., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13). Белок G рекомендуется для всех мышиных изотипов и для гамма3 человека (см., например, Guss и др., 1986 EMBO J. 5:1567-1575). Матрицей, к которой присоединен афинный лиганд, наиболее часто представляет собой агарозу, но доступны также другие матриксы. Механично стабильные матрицы, такие как стекло с заданным размером пор или поли(стиролдивинил)бензол предоставляют возможность более быстрых скоростей потоков и более короткого времени обработки, которого можно достичь с агарозой. Если антитело включает CH3 домен, то смола Bakerbond ABX™ (J. Т. Baker, Phillipsburg, N.J.) является подходящей для очистки. Также доступны других технологии для очистки белков, такие как фракционирование на ионо-обменной колонке, осаждение с этанолом, ВЭЖХ с обращенной фазой, хроматография на диоксиде кремния, хроматография на гепарин SEPHAROSE™ хроматография на анион- или катион-обменной смоле (такой как колонка с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE, и осаждение с сульфатом аммония, в зависимости от восстанавливаемого антитела.
После любой (любых) подготовительной (подготовительных) стадии (стадий) очистки, смесь, содержащую представляющее интерес антитело и загрязнители, можно подвергать хроматографии с гидрофобным взаимодействием при низких рН, используя элюирующий буфер при рН в диапазоне 2,5-4,5, типично осуществляют при низких концентрациях соли (например, от приблизительно 0-0,25 М соли).
Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются в расслабленных, умеренных или строгих условиях, как указано в настоящей заявке, со всей или частью (например, частью, которая кодирует вариабельную область) нуклеотидной последовательности, которая представляет собой выделенную(е) полинуклеотидную(е) последовательность(и), кодирующую(е) антитело к TrkB или фрагмент антитела. Гибридизующаяся область гибридизующейся нуклеиновой кислоты, как правило, состоит из по меньшей мере 15 (например, 20, 25, 30 или 50) нуклеотидов. Гибридизующаяся область гибридизующейся нуклеиновой кислоты идентична по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, последовательности участка или всей нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид к TrkB (например, вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи), или ее комплементу. Гибридизирующие нуклеиновые кислоты описанного в настоящей заявке типа можно использовать, например, в качестве зонда для клонирования, праймера, например, ПЦР-праймера или диагностического зонда.
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение включает выделенный(е) полинуклеотид(ы), включающий(е) последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющее/имеющий вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, где аминокислотная по- 30 043771 следовательность вариабельной легкой цепи и аминокислотная последовательность вариабельной тяжелой цепи являются по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичны аминокислотным последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 2 и 12, или 3 и 13, или 4 и 14, или 5 и 15, или 6 и 16, или 7 и 17, или 8 и
18, или 9 и 19, или 10 и 20, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение включает выделенный (е) полинуклеотид (ы), включая последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющее/имеющий легкую цепь и тяжелую цепь, где аминокислотная последовательность легкой цепи и аминокислотная последовательность тяжелой цепи являются по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичны аминокислотным последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 21 и 22 или 23; 24 и 25 или 26; 27 и 28 или 29; 30 и 31 или 32; 33 и 34 или 35; 36 и 37 или 38; 39 и 40 или 41; 42 и 43 или 44; 45 и 46 или 47, соответственно.
Подразумевается, что в указанных антителах к TrkB и фрагментах антител последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей CDR, остаются неизмененными (неизмененными по отношению к аминокислоте, которую они кодируют, возможны эквиваленты ДНК последовательности вследствие вырожденности генетического кода), но окружающие участки, например, FR участки, могут быть сконструированы.
Нетерапевтические применения
Антитела, представленные в настоящем описании, можно применять в качестве средств, используемых для очистки на основе аффинности. При осуществлении этого процесса антитела иммобилизуют на твердой фазе, такой как смола, содержащая белок А, с помощью методов, хорошо известных в данной области. Иммобилизованное антитело приводят в контакт с образцом, содержащим белок TrkB (или его фрагмент), который подлежит очистке, и затем подложку отмывают приемлемым растворителем, который должен удалять практически весь материал в образце, кроме белка TrkB, связанного с иммобилизованным антителом. И, наконец, подложку отмывают другим приемлемым растворителем, который должен отделять белок TrkB от антитела.
Антитела к TrkB можно применять также в диагностических анализах для выявления и/или количественной оценки белка TrkB, например, путем определения экспрессии TrkB в конкретных клетках, тканях или сыворотке.
Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения целесообразно, например, для диагностических целей, метить антитело с помощью выявляемого фрагмента. Известны и доступны многочисленные выявляемые метки, такие как радиоизотопы, флуоресцентные метки, метки, представляющие собой субстраты для ферментов и т.п. Метку можно опосредованно конъюгировать с антителом с помощью различных известных методик. Например, антитело можно конъюгировать с биотином, и любую из указанных выше меток, относящихся к трем широким категориям, можно конъюгировать с авидином, или наоборот. Биотин избирательно связывается с авидином и поэтому метку можно конъюгировать с антителом опосредованным образом. В альтернативном варианте для достижения опосредованной конъюгации метки с антителом антитело можно конъюгировать с небольшим гаптеном (таким как дигоксин) и одну из различных типов указанных выше меток конъюгировать с антителом к гаптену (например, антителом к дигоксину). Таким образом можно осуществлять опосредованную конъюгацию метки с антителом.
Примерами радиоизотопных меток являются 35S, 14C, 125I, 3Н и 131I. Антитело можно метить радиоизотопом с помощью методик, описанных, например, в Current Protocols in Immunology, т. 1 и 2, 1991, под ред. Coligen и др., изд-во Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1991. Радиоактивность можно измерять, например, с помощью сцинтилляционного счетчика.
Примерами флуоресцентных меток являются известные метки, полученные на основе хелатов редкоземельных металлов (хелаты европия), или метки на основе флуоресцеина и его производных, родамина и его производных, дансила, лиссамина, фикоэритрина и техасского красного. Флуоресцентные метки можно конъюгировать с антителом с помощью известных методик, например, описанных в Current Protocols in Immunology, выше. Флуоресценцию можно оценивать количественно с помощью флуориметра.
В данной области известны различные хорошо охарактеризованные фермент-субстратные метки (см., например, обзор, приведенный в US 4275149). Фермент, как правило, катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, которое можно оценивать с помощью различных методик. Например, изменение может представлять собой изменение цвета субстрата, которое можно оценивать спектрофотометрически. В другом варианте фермент может изменять флуоресценцию или хемилюминесценцию субстрата. Методики количественной оценки флуоресценции описаны выше. В результате химической реакции в хемилюминесцентном субстрате возникает электронно-возбужденное состояние, вследствие чего он может испускать свет, который можно оценивать, например, с помощью хемилюминометра, или он является донором энергии для флуоресцентного акцептора.
Примерами ферментативных меток являются люциферазы, такие как люцифераза светляка и бактериальная люцифераза (US 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназа, уреаза, пероксидаза, например, пероксидаза из хрена (HRPO), щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, оксидазы сахаридов (такие как оксидаза глюкозы, оксидаза галактозы и глюкозо-6- 31 043771 фосфатдегидрогеназа), оксидазы гетероциклических соединений (такие как уриказа и оксидаза ксантина), лактопероксидаза, микропероксидаза и т.п. Методики конъюгации ферментов с антителами описаны, например, у O'Sullivan и др., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme
Immunoassay, в: Methods in Enzym., под ред. J. Langone и Н. Van Vunakis, изд-во Academic press, N.Y., 73,
1981, cc. 147-166.
Примерами комбинаций фермент-субстрат являются, например: пероксидаза из хрена (HRPO) и гидрогенпероксидаза в качестве субстрата, при этом гидрогенпероксидаза окисляет красительпредшественник, такой как ортофенилендиамин (OPD) или гидрохлорид 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ); щелочная фосфатаза (АР) и пара -нитрофенилфосфонат в качестве хромогенного субстрата; и βD-галактозидаза (β-D-Gal) и хромогенный субстрат, такой, например, как пара-нитрофенил-в-Dгалактозидаза, или флуорогенный субстрат, такой как 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозидаза.
Специалистам в данной области известны многочисленные другие комбинации фермент-субстрат. Общий обзор представлен, например, в US 4275149 и US 4318980.
В других вариантах осуществления изобретения антитело к TrkB применяют в немеченом виде и выявляют с помощью меченого антитела, связанного с антителом к TrkB.
Антитела, представленные в настоящем описании, можно применять в любом известном методе анализа, таком как конкурентные анализы связывания, прямые и косвенные сэндвич-анализы и анализы на основе иммунопреципитации (см., например, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, изд-во CRC Press, Inc., 1987, cc. 147-158).
Диагностические наборы
Можно применять антитело к TrkB, входящее в состав диагностического набора, представляющего собой упаковку, которая содержит комбинацию реагентов, взятых в предварительно определенных количествах, в сочетании с инструкциями по осуществлению диагностического анализа. Если антитело мечено ферментом, то набор может включать необходимые для фермента субстраты и кофакторы, такие как субстрат-предшественник, образующий выявляемый хромофор или флуорофор. Кроме того, можно включать другие добавки, такие как стабилизаторы и буферы (например, блокирующий буфер или лизирующий буфер) и т.п. Относительные количества различных реагентов могут варьироваться в широких пределах, обеспечивая концентрации реагентов в растворе, которые в значительной степени оптимизируют чувствительность анализа. Реагенты могут представлять собой сухие порошки, как правило, лиофилизированные, включая эксципиенты, которые при растворении должны образовывать раствор реагента, имеющий соответствующую концентрацию.
Терапевтические применения и TrkB-связанные нарушения
В другом варианте осуществления, антитело к TrkB (или его функциональный фрагмент), описанные в настоящей заявке, пригодно для лечения различных нарушений, связанных с экспрессией TrkB, как описано в настоящей заявке.
Антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент вводят любыми приемлемыми путями, включая интравитреальный, пероральный, парентеральный, подкожный, внутрибрюшинный, внутрилегочный и внутриносовой. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дополнительно, антитело к TrkB подходяще вводят путем пульсирующей инфузии, прежде всего с понижающими дозами антитела. В одном аспекте, дозирование осуществляют путем инъекций, наиболее предпочтительно внутривенных или подкожных инъекций, в том числе в зависимости от того является ли обработка кратковременной или пролонгированной. Предпочтительно, антитело к TrkB вводят путем интравитреальной инъекции в глаза.
Для предотвращения или лечения заболевания соответствующая доза антитела должна зависеть от ряда факторов, таких как тип заболевания, подлежащего лечению, серьезность и процесс течения заболевания, вводят ли антитело для профилактических или терапевтических целей, предшествующая терапия, история болезни пациента и ответ на антитело, а также от предписания лечащего врача. Антитело можно вводить пациенту однократно или путем серий обработок.
В контексте настоящего описания понятие подавление имеет такое же значение, что и понятия облегчение и купирование, и относится к ослаблению или понижению одной или нескольких характеристик заболевания.
Композицию антитела можно включать в препаративную форму, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей клинической практикой. Важные в этом плане факторы включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину нарушения, область введения агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медикам. В этой связи терапевтически эффективное количество антитела, подлежащего введению, регулируют таким образом, чтобы оно представляло собой минимальное количество, необходимое для предупреждения, облегчения или лечения нарушения, ассоциированного с экспрессией TrkB.
Антитело необязательно, но в определенных случаях, включают в препаративную форму в сочетании с одним или несколькими агентами, применяемыми в настоящее время для предупреждения или лечения рассматриваемого нарушения. Эффективное количество указанных других агентов зависит от ко- 32 043771 личества антитела к TrkB, присутствующего в препаративной форме, типа нарушения или лечения и других указанных выше факторов. Их, как правило, применяют в таких же дозах и с использованием таких же путей введения, в которых их применяли ранее, или с использованием в дозе, составляющей примерно от 1 до 99% от их принятых для применения доз.
Агонистические антитела к TrkB согласно настоящему изобретению стимулируют передачу сигналов TrkB. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что передача сигналов TrkB благоприятна для защиты фоторецепторов, других нейронов сетчатки, включая ганглиозные клетки и клеток пигментного эпителия сетчатки от клеточной гибели в сетчатке. Следовательно, агонистические антитела к TrkB могут защищать нейроны сетчатки, такие как фоторецепторы от дегенерации, то есть, предотвращать нейро-дегенерацию, и также повышать выживание и/или пластичность нейронов, в конечном итоге противодействуя потере зрения, связанной либо с уменьшенной активностью TrkB и/или повышенному клеточному стрессу или апоптотической активности. Таким образом, антитела пригодны для лечения заболевания глаз или заболеваний сетчатки, в особенности нейродегенеративных заболеваний сетчатки или заболеваний глаз. Такие заболевания включают, но не ограничиваясь только ими, возрастную дегенерацию желтого пятна, географическую атрофию, диабетическую ретинопатию, диабетический отек желтого пятна, пигментную дистрофию сетчатки, наследственную дистрофию сетчатки, наследственную макулодистрофию, миопическую дегенерацию, окклюзии вены сетчатки, окклюзии артерии сетчатки, эндофтальмит, увеит, кистозный макулярный отек, хороидальную неоваскулярную мембрану вследствие любого из заболеваний сетчатки, оптические нейропатии, глаукому, отслойку сетчатки, токсическую ретинопатию, лучевую ретинопатию и травматическую ретинопатию.
Антитела также пригодны для лечения заболеваний центральной нервной системы, таких как продромальная и от легкой до умеренной болезнь Альцгеймера, задержка прогрессирования заболевания у пациентов с болезнью Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, большое депрессивное расстройство, шизофрения, когнитивное нарушение, связанное с шизофренией, предотвращение первого приступа психоза у индивидуумов с ослабленным психозным синдромом, предотвращение повторения у пациентов с шизофренией или терапевтически резистентная депрессия.
В другом варианте осуществления антитела могут применяться для лечения потери слуха, в особенности индуцированной цисплатином потери слуха, а также потери слуха от воздействия шума и возрастной потери слуха.
В особенности, агонистические антитела к TrkB согласно настоящему изобретению показаны для лечения непролиферативной и/или пролиферативной диабетической ретинопатии и/или диабетического отека желтого пятна дополнительно к стандартному лечению: Дисфункция нейронов сетчатки и нейродегенерация являются одним из серьезных патологических событий при диабетической ретинопатии и диабетическом отеке желтого пятна (на всех стадиях заболевания), которые в конечном итоге вызывают потерю зрения и зрительную дисфункцию. Активация TrkB будет противодействовать потере и функциональным нарушениям нейронов сетчатки и, таким образом, помогать поддерживать нормальное зрение, уменьшать потерю зрительной функции при заболевании и потенциально помогать восстанавливать зрительную функцию.
Кроме того, существует потенциальное применение активации TrkB в качестве дополнительного к анти-VEGF лечению, которое будет существенно усиливать терапевтические преимущества последнего, поскольку анти-VEGF нацелено только на сосудистую дисфункцию в глазе, но не на систему нейроны /глиальные клетки; дополнительно, длительное анти-VEGF лечение может вызывать нейродегенеративные побочные эффекты. Подход активации TrkB в качестве дополнения к анти-VEGF будет уменьшать такие нейродегенеративные побочные эффекты.
Антитела к TrkB или их антигенсвязывающие фрагменты в особенности пригодны для лечения или предотвращения нарушений сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия, диабетический отек желтого пятна, географическая атрофия и глаукома.
В дальнейшем аспекте, антитела к TrkB или их антигенсвязывающие фрагменты также пригодны для лечения метаболических заболеваний, таких как гиперфагия, ожирение и метаболический синдром.
В другом аспекте, антитела к TrkB согласно настоящему изобретению могут применяться в способе лечения и/или предотвращения нарушения, связанного с TrkB, в особенности географической атрофии, который включает введение терапевтически эффективного количества антитела к TrkB согласно изобретению индивидууму, страдающему от географической атрофии, таким образом ослабляя один или несколько симптомов географической атрофии.
В еще дальнейшем аспекте, агонистические антитела к TrkB могут применяться в способе лечения и/или предотвращения географической атрофии, который включает введение терапевтически эффективного количества агонистического антитела к TrkB индивидууму, страдающему от географической атрофии, таким образом ослабляя один или несколько симптомов географической атрофии.
Фармацевтические композиции и их введение
Композиция, содержащая антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, может вводиться субъекту, который страдает от или имеет риск развития заболевания глаз или сетчатки. Изобретение дополнительно обеспечивает применение антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента для
- 33 043771 приготовления лекарственного средства для предотвращения или лечения TrkB заболевания. Термин субъект, как используется в настоящей заявке, обозначает любого пациента-млекопитающего, которому можно вводить антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, включая, например, людей и млекопитающих, отличающихся от человека, таких как приматы, грызуны и собаки. Субъектов, включая людей, в частности, можно лечить с использованием способов, представленных в настоящем описании. Антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент можно вводить либо отдельно или в комбинации с другими композициями.
Предпочтительными антителами для применения в таких фармацевтических композиций являются антитела, представляющие собой гуманизированное антитело или фрагменты антител, имеющее (имеющие) вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2 и 12, или 3 и 13, или 4 и 14, или 5 и 15, или 6 и 16, или 7 и 17, или 8 и 18, или 9 и 19, или 10 и 20, соответственно.
Также охватываются антитела для применения в таких фармацевтических композициях, представляющие собой гуманизированное антитело или фрагменты антител, имеющее (ие) вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 и 12, или 3 и 13, или 4 и 14, или 5 и 15, или 6 и 16, или 7 и 17, или 8 и 18, или 9 и 19, или 10 и 20 соответственно.
Дальнейшими предпочтительными антителами для применения в таких фармацевтических композициях являются антитела, представляющие гуманизированное антитело или фрагменты антител, имеющее (имеющие) аминокислотную последовательность легкой цепи и тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и 22 или 23; 24 и 25 или 26; 27 и 28 или 29; 30 и 31 или 32; 33 и 34 или 35; 36 и 37 или 38; 39 и 40 или 41; 42 и 43 или 44; 45 и 46 или 47, соответственно.
Дальнейшие предпочтительные антитела для применения в таких фармацевтических композициях, которые представляют собой гуманизированное антитело или фрагменты антител, имеющее (ие) аминокислотную последовательность легкой цепи и тяжелой цепи по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21 и 22 или 23; 24 и 25 или 26; 27 и 28 или 29; 30 и 31 или 32; 33 и 34 или 35; 36 и 37 или 38; 39 и 40 или 41; 42 и 43 или 44; 45 и 46 или 47 соответственно.
Подразумевается, что в указанных антителах к TrkB и фрагментах антител, аминокислотная последовательность CDR остается неизмененной, но окружающие области, например, FR области, могут быть сконструированы.
Известны различные системы доставки и они могут использоваться для введения антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента. Способ введения включают, но не ограничиваясь только ими, интравитреальный, глазные капли, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, внутриносовой, эпидуральный и пероральный пути. Антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент могут вводиться, например, путем инфузии, болюса или инъекции, и могут вводиться совместно с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или местным. В предпочтительных вариантах осуществления, введение осуществляют путем интравитреальной инъекции. Препараты для таких инъекций могут быть приготовлены, например, в предварительно заполненных шприцах.
Антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент можно водить в виде фармацевтических композиций, содержащих терапевтически эффективное количество антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента и один или несколько фармацевтически совместимых ингредиентов.
Согласно типичным вариантам осуществления изобретения фармацевтическую композицию приготавливают согласно общепринятым процедурам с получением фармацевтической композиции, пригодной для внутривенного или подкожного введения человеку. Как правило, композиции для введения путем инъекции представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости фармацевтическое средство может содержать также солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лидокаин, для снятия боли в месте инъекции. Как правило, ингредиенты поставляются либо по отдельности, либо их смешивают с получением стандартной дозы лекарственного средства, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воду концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества действующего вещества. В тех случаях, когда фармацевтическое средство предназначено для введения путем инфузии, то его можно разливать по бутылям для инфузий, содержащим стерильную воду или физиологический раствор фармацевтической степени чистоты. В тех случаях, когда фармацевтическое средство вводят с помощью инъекции, то можно использовать ампулу со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором для того, чтобы ингредиенты можно было перемешивать перед введением.
Кроме того, фармацевтическую композицию можно включать в фармацевтический набор, который содержит (а) контейнер, содержащий антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент в лиофилизованной форме и (б) второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель (например, стерильную воду) для инъекций. Фармацевтически приемлемый разбавитель можно использо- 34 043771 вать для восстановления или разведения лиофилизованного антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента. Необязательно к указанному(ым) контейнеру(ам) может прилагаться уведомление в форме, утвержденной официальным агентством, разрешающим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, где в уведомлении отражено разрешение агентства на производство, применение или продажу с целью введения людям.
Количество антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента, которое эффективно для лечения или предотвращения нарушения, связанного с TrkB, можно определять обычными методами клинических исследований. Кроме того, необязательно можно использовать анализы in vitro, результаты которых могут способствовать определению оптимальных пределов доз. Точная доза для применения в препаративной форме также должна зависеть от пути введения и стадии нарушения, и она должна приниматься на основе рекомендаций лечащего врача и обстоятельств, характерных для каждого пациента. Эффективные дозы можно определять путем экстраполяции на основе кривых дозовой зависимости, полученных по результатам опытов in vitro или на модельных тест-системах с использованием животных.
Например, токсичность и терапевтическую эффективность антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента можно определить в клеточных культурах или на экспериментальных животных стандартными фармацевтическими методами, используемыми для определения ED50 (терапевтически эффективная доза для 50% популяции). Предпочтительным является антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) проявляет высокий терапевтический индекс.
Данные, полученные по результатам анализов на клеточных культурах и исследований на животных, можно использовать при определении предела доз, предназначенных для применения на человеке. Как правило, доза антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента находится в пределах концентраций в кровотоке, которые включают ED50, обладая при этом низкой токсичностью или не проявляя токсичности. Дозу можно варьировать в указанных пределах в зависимости от используемой лекарственной формы и применяемого пути введения. Для любого антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента, используемого согласно способу, терапевтически эффективную дозу можно первоначально устанавливать по результатам анализов на клеточных культурах. Дозу можно определить, исходя из данных, полученных на животных моделях, достигая пределов концентраций в плазме крови, которые включают IC50 (т.е. концентрацию тестируемого соединения, при которой достигается ингибирование симптомов, составляющее половину от максимального) по данным, полученным на культуре клеток. Такую информацию можно использовать для более точного определения пригодных доз для человека. Можно определять концентрации в плазме крови, например, с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения, ELISA и т.п.
Для интравитреальной инъекции антитела к TrkB, как правило, предпочтительными являются более длительные интервалы между лечениями. Благодаря их улучшенной эффективности, антитела к TrkB согласно настоящему изобретению могут вводиться с более длительными интервалами.
В одном варианте осуществления, антитело к TrkB вводят каждые 6 недель, предпочтительно каждые 7 недель, также предпочтительно каждые 8 недель, в дальнейшем предпочтительно каждые 9 недель, более предпочтительно каждые 10 недель, в дальнейшем предпочтительно каждые 11 недель, и более предпочтительно каждые 12 недель. В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления, антитело к TrkB вводят один раз каждые 3 месяца.
В одном варианте осуществления, антитело к TrkB вводят субъекту, который в этом нуждается, в начальной дозе 1-2000 мг. В другом варианте осуществления, необязательно вводят одну или несколько последующих доз, каждая из которых содержит 1-2000 мг антитела к TrkB.
В связи с тем, что объем, которые может вводиться в глаз, существенно ограничен, то чрезвычайно важным является то, что антитело к TrkB может быть приготовлено в виде препарата в высоких концентрациях. Кроме того, эффективность антитела к TrkB является чрезвычайно важной, поскольку эффективное антитело может проявлять свой эффект даже в очень низких дозах и, следовательно, пролонгирует активность, а также интервалы между лечениями.
Антитела согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде препаратов в чрезвычайно высоких дозах, которые включают, но не ограничиваясь только ими, 20 мг/мл, 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл или 100 мг/мл.
Типичная дозировка, которая может вводиться пациенту, составляет приблизительно 3 мг/глаз. Типичные буферные компоненты, которые можно применять для такого препарата, содержат, например, ацетат натрия, PS20 и дигидрат трегалозы.
В одном варианте осуществления, антитело к TrkB приготовлено в виде препарата с 10 мМ гистидиновым буфером, 240 мМ сахарозой, 0,02% мас./об. полисорбата 20 при рН 5,5 с конечной концентрацией белка 60 мг/мл.
В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции, содержащие антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент могут дополнительно включать терапевтическое средство, конъюгированное или неконъютированное со связывающим агентом. Антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент можно совместно вводить в комбинации с одним или несколькими терапевтическими средствами для лечения или предотвращения заболевания, связанного с TrkB. Например, комби- 35 043771 нированная терапия может включать анти-VEGF, анти-PDGF или анти-ANG2.
Такая комбинированная терапия может обладать аддитивным или синергетическим действием в отношении признаков заболевания (например, тяжести проявления симптома, количества симптомов или частоты рецидивов).
При применении схем лечения при комбинированном введении в конкретном варианте осуществления изобретения, антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент вводят одновременно с терапевтическим средством. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, терапевтическое средство вводят до или после введения антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента, в течение от 1 часа до нескольких месяцев, например, по меньшей мере, в течение 1 часа, 5 часов, 12 часов, суток, недели, месяца или трех месяцев до или после введения антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента.
Изделия
Другим объектом изобретения является изделие, содержащее вещества, пригодные для лечения нарушений, описанных выше. Изделие включает контейнер и этикетку. Приемлемыми контейнерами являются, например, бутыли, флаконы, шприцы и лабораторные пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая является эффективной для лечения конкретного состояния, и может иметь стерильное отверстие для доступа. Например, контейнер может представлять собой мешок или флакон для внутривенного раствора, имеющий запирающее устройство, проницаемое для инъекционной иглы для подкожного введения. Действующее вещество в композиции представляет собой антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент. На этикетке на контейнере или связанной с ним указывается, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Изделие может дополнительно включать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие вещества, присутствие которых желательно с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.
Изобретение описано ниже с помощью представленных примеров, которые не направлены на ограничение объема изобретения.
Примеры
1. Создание антитела (иммунизация).
В-клетки от мышей при осуществлении комплекса иммунизации подвергали скринингу, используя собственную разработанную технологию платформу единичных В-клеток. Анти-TrkB связыватели минимизировали после тестирования для определения активности, эффективность и действенности в исследовании фосфорилирования TrkB in-vitro.
2. Получение гуманизированных антител.
Мышиный лидерный D003 отбирали для дальнейшей оптимизации. Мышиный лидерный компонент имел вариабельную легкую цепь, соответствующую SEQ ID NO: 1 и вариабельную тяжелую цепь, соответствующий SEQ ID NO: 11. Для оптимизации последовательности TrkB мышиного лидерного D003, отбирали наиболее сходные последовательности антител зародышевой линии человека, IGKV41*01, KJ2 для легкой цепи и IGHV1-46*03, HJ6 для тяжелой цепи. Создавали библиотеку вариантов. Это приводило к получению гуманизированных вариабельных последовательностей легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 2-10, и вариабельных последовательностей тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 12-20.
Таблица 2
277-gr VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь | SEQ ID NO | 2 |
277-33 VL: (гуманизированная) вариабельная легкая цепь | SEQ ID NO | 3 |
277-35 VL: (гуманизированная) вариабельная легкая цепь | SEQ ID NO | 4 |
277-42 VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь | SEQ ID NO | 5 |
277-44 VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь | SEQ ID NO | 6 |
277-48 VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь | SEQ ID NO | 7 |
277-51 VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь | SEQ ID NO | 8 |
277-64 VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь | SEQ ID NO | 9 |
277-67 VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь | SEQ ID NO | 10 |
- 36 043771
277-gr_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь | SEQ ID NO: 12 |
277-33_VH: (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь | SEQ ID NO: 13 |
277-3 5_VH: (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь | SEQ ID NO: 14 |
277-42_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь | SEQ ID NO: 15 |
277-44_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь | SEQ ID NO: 16 |
277-48_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь | SEQ ID NO: 17 |
277-51 VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь | SEQ ID NO: 18 |
277-64_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь | SEQ ID NO: 19 |
277-67_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь | SEQ ID NO: 20 |
Типичные гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению представляют собой антитела, которые имеют последовательности легкой и тяжелой цепи, как указано в таблице ниже. IgG1KO имеет две мутации в Fc области, Leu234Ala и Leu235Ala для уменьшения эффекторной функции.
Таблица 3
277-gr (Легкая цепь, IgGl) | 21 |
277-gr (Тяжелая цепь, IgGl) | 22 |
277-gr (Тяжелая цепь, IgGl-КО) | 23 |
277-33 (Легкая цепь, IgGl) | 24 |
277-33 (Тяжелая цепь, IgGl) | 25 |
277-33 (Тяжелая цепь, IgGl-KO) | 26 |
277-35 (Легкая цепь, IgGl) | 27 |
277-35 (Тяжелая цепь, IgGl) | 28 |
277-35 (Тяжелая цепь, IgGl-KO) | 29 |
277-42 (Легкая цепь, IgGl) | 30 |
277-42 (Тяжелая цепь, IgGl) | 31 |
277-42 (Тяжелая цепь, IgGl-KO) | 32 |
277-44 (Легкая цепь, IgGl) | 33 |
277-44 (Тяжелая цепь, IgGl) | 34 |
277-44 (Тяжелая цепь, IgGl-KO) | 35 |
277-48 (Легкая цепь, IgGl) | 36 |
277-48 (Тяжелая цепь, IgGl) | 37 |
277-48 (Тяжелая цепь, IgGl-KO) | 38 |
277-51 (Легкая цепь, IgGl) | 39 |
277-51 (Тяжелая цепь, IgGl) | 40 |
277-51 (Тяжелая цепь, IgGl-KO) | 41 |
277-64 (Легкая цепь, IgGl) | 42 |
277-64 (Тяжелая цепь, IgGl) | 43 |
277-64 (Тяжелая цепь, IgGl-KO) | 44 |
277-67 (Легкая цепь, IgGl) | 45 |
277-67 (Тяжелая цепь, IgGl) | 46 |
277-67 (Тяжелая цепь, IgGl-KO) | 47 |
277 L-CDR1 | 48 |
277 L-CDR2 | 49 |
277 L-CDR3 | 50 |
277 H-CDR1 | 51 |
277 H-CDR2 | 52 |
277 H-CDR3 | 53 |
3. Информация об эпитопе.
Материалы.
Вода (Sigma Aldrich, номер по каталогу 37877-4L).
Ацетонитрил (Sigma Aldrich, номер по каталогу 34998-4L).
Муравьиная кислота (Fluka, номер по каталогу 94318).
Мочевина (Sigma Aldrich, номер по каталогу 51456-500G).
ТСЕР-HCl - 10 г (Thermo Scientific - Pierce, номер по каталогу 20491).
Двухосновный фосфат натрия (Sigma Aldrich, номер по каталогу S7907-100G).
Одноосновный фосфат натрия (Sigma Aldrich, номер по каталогу S8282-500G).
Предколонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 VanGuard, 130А, 1,7 мкм, 2,1 мм X 5 мм (Waters Technolo
- 37 043771 gies Corp, 186003975).
Картридж с иммобилизованным пепсином Poroszyme® I, 2,1 мм х 30 мм (Life Technologies Corp, 2313100).
Колонка Acquity UPLC ВЕН С18 1,7 мкм, 1 мм X 50 мм (Waters, 186002344).
Растворитель А: 0,1 % Муравьиная кислота /99% вода /1% ацетонитрил.
Растворитель В: 0,1 % Муравьиная кислота /5% вода /95% ацетонитрил.
Водный буфер: Н2О 10 мМ фосфат натрия рН 7,4.
Дейтериевый буфер: D2O 10 мМ фосфат натрия рН 7,4.
Закаливающий буфер: вода, 8М мочевина, 0,4М ТСЕР-HCl.
В контрольных образцах для картирования эпитопов, антиген прогоняли с антителом и без него. Для определения перечня антигенных пептидов, в этом проколе сначала осуществляли первый прогон, используя водный буфер вместо дейтериевого буфера. 4 мкл образца смешивали с 40 мкл дейтериевого буфера. Эту смесь инкубировали при 20°С для нескольких временных точек (1, 2 и 4 мин). После этого 40 мкл смеси переносили в 40 мкл 4°С закаливающего буфера (4М Мочевина, 0,4М Тсер-HCl) и смешивали. Инъецировали 60 мкл закаливающего белка, где он расщепляется на пепсиновой колонке в течение 2 минут путем промывания 200 мкл/мл растворителя А: 0,1 %Муравьиная кислота /99% вода /1% ацетонитрил. Последующие пептиды обессоливали на предколонке Vanguard в течение 3 минут. Расщепленные пепсином пептиды отправляли на колонку с обращенной фазой ВЕН С18 внутри колонки /клапана терморегулируемого компартмента. Использовали градиент системы растворителей, состоящей из: растворитель А: 0,1 %Муравьиная кислота /99% вода /1% ацетонитрил и растворитель В: 0,1 % Муравьиная кислота /5% вода /95% ацетонитрил. Процентное содержание растворителя В повышали от 10% до 15% через 5,1 минуты, до 50% через 11 минут, до 90% через 11,5 минуты, выдерживая до 12,5 минут, до 0% В через 13 минут, выдерживая до 14 минут. Хроматографическое разделение происходило при 4°С при скорости потока 180 мкл/мин. После хроматографического разделения образец поступал на Thermo Scientific Orbitrap Fusion масс-спектрометр, работающий в режиме положительной электрораспылительной ионизации. Используемый метод включал активационные типы CID и ETD при идентификации контрольных пептидов, используя разделение 120 тыс., минимальный сигнал 10 тыс., ширину выделения 1,0 и нормированную энергию столкновений 35,0 В. RF уровень S-линз устанавливали на 60%. Для контрольных пептидов тип сбора данных представлял собой профили для полного МС сканирования и центроид для CID МС/мС данных. Для дейтерированных образцов, не собирали МС /мС. Данные собирали для массового диапазона 280-1800 Да. Для анализа необработанных данных ЖХ-МС /мс фрагментации, контрольные образцы (с CID и ETD МС/мС) анализировали, используя Proteome Discover 1.4 (Thermo Scientific) и PMi Byonic (Protein Metrics) по отношению к заданной последовательности для создания перечня пептидов и времени удерживания. Файлы с необработанными данными предварительно обрабатывали и превращали в ASCII формат, используя собственное разработанное программное обеспечение SHARC. После этого отмечали идентифицированные пептиды и обобщали полученные данные, используя собственное разработанное программное обеспечение SHAFT. Эпитопы определяли на основании отличий сдвига средней массы, индуцированного связыванием после мечения дейтерием. На уровне пептида, защита больше 0,4 Да рассматривалась как достоверная.
Результаты картирования эпитопов показаны для BDNF, 277-антител, (С2) (US20100196390), и (С20) (US20100150914) на фиг. 1. Специфические связывающие сайты для каждой молекулы с внеклеточным доменом TrkB человека с SEQ ID NO: 54 выделены темно-серым цветом. По сравнению с природным лигандом BDNF, 277-антитела связываются с другими новыми эпитопами.
4. Подверженности последовательностей в CDR.
Последовательности CDR проверяли относительно наличия любых потенциальных подверженностей, таких как сайты N-гликозилирования, мотивы сильного дезамидирования (NG, NS, NH, NA, ND, NT, NN), мотивы изомеризации аспартата (DG), мотивы фрагментации (DG, DS), цистеин. Эти аминокислот или мотивы могут подвергаться химической реакции и придавать продукту нежелательную гетерогенность, также с возможностью отрицательного влияния на целевое связывание и функционирования. Из этих соображений, является предпочтительным удалять такие аминокислоты или мотивы (если они присутствуют) из CDR.
CDR мышиной лидерной и гуманизированных последовательностей не содержали таких потенциальных мотивов подверженности.
Таблица 4
Антитело | D003/277 | С2 | С20 | 29D7 или ТАМ-163 |
Подверженности | 0 | 2 | 3 | 6 |
5. Иммуногенность.
Иммуногенность последовательностей оценивали in silico с помощью алгоритма по лицензии от компании Epivax. Шкала EpiMatrix Treg-adj учитывает эпитопы Т-клеток и Treg эпитопы. Чем более низкая оценка иммуногенности, тем меньше вероятность того, что последовательность будет иммуногенной. В целом, отрицательная оценка рассматривается как низкий риск иммуногенности, в то время как поло- 38 043771 жительная оценка расценивается как указание на потенциальную иммуногенность. ______________________________________________________________Таблица 5
VL | Оценка Epivax | VH | Оценка Epivax |
277-gr VL | -24 | 277-gr VH | -46 |
277-33 VL | -31 | 277-33 VH | -32 |
277-35 VL | -31 | 277-35 VH | -26 |
277-42 VL | -27 | 277-42 VH | -26 |
277-44 VL | -14 | 277-44 VH | -49 |
277-48 VL | -24 | 277-48 VH | -29 |
277-51 VL | -31 | 277-51 VH | -22 |
277-64 VL | -28 | 277-64 VH | -44 |
277-67 VL | -14 | 277-67 VH | -44 |
C2 VL | -2 | C2 VH | -21 |
C20 VL | +9 | C20 VH | +20 |
TAM163VL | -51 | TAM163VH | -19 |
6. Аффинность.
Использовали технологию поверхностного плазмонного резонанса (SPR) для определения аффинности связывания 277-антител, С2 (US 20100196390), и С20 (US 20100150914) и ТАМ-163 (WO 2015173756) с Hu-TrkB-His. Эксперимент осуществляли на приборе ProteOn XPR36.
Метод: Подвижный буфер для этого эксперимента и все разведения (за исключением тех случаев, когда конкретно указано) осуществляли в PBS-T-EDTA с 0,01% Tween20 [100 мкл 100% Tween20 добавляли к 2 л PBS-T-EDTA для получения конечной концентрации Tween 20 0,01%]. Сенсорный чип GLM нормировали и устанавливали предварительные условиях согласно инструкциям производителя. Сенсорный чип активировали с применением уравновешенной смеси EDC/s-NHS в горизонтальном направлении в течение 300 с при скорости потока 30 мкл/мин и иммобилизовали с Рекомбинантным белком A/G (60 мкг/мл в 10 мМ ацетате рН 4,5) в горизонтальном направлении в течение 300 с при скорости потока 30 мкл/мин, что приводило к ~7100-7130 ЕО Белка A/G на поверхности. Сенсорный чип деактивировали с применением 1М этаноламина HCl в горизонтальном направлении в течение 300 с при скорости потока 30 мкл/мин. Сенсорный чип стабилизировали в течение 18 с с 0,85% фосфорной кислотой при скорости потока 100 мкл/мин 3 раза горизонтально и 3 раза вертикально. 277-антитело (0,6 мкг/мл), С2 (2,1 мкг/мл), С20 (1,2 мкг/мл), и ТАМ-163 (5 мкг/мл) захватывали на поверхность Белка A/G вертикально в течение 70 с при скорости потока 30 мкл/мин, что приводило к уровням захвата ~615, 1390, 780 и 3380 ЕО, соответственно. Исходный уровень стабилизировали путем инъецирования PBS-T-EDTA в течение 60 с при скорости потока 100 мкл/мин горизонтально и затем второй инъекции PBS-T-EDTA в течение 60 с при скорости потока 100 мкл/мин и диссоциации 120 с горизонтально. Аналит (Hu-TrkB-His) инъецировали горизонтально над захваченным антителом в течение 600 с при скорости потока 30 мкл/мин и диссоциации в течение 1800 с. Концентрации аналитов составляли 0 нМ, 1,23 нМ, 3,7 нМ, 11,11 нМ, 33,33 нМ и 100 нМ. Поверхность регенерировали путем инъецирования 0,85% фосфорной кислоты в течение 18 с при скорости потока 100 мкл/мин один раз горизонтально и один раз вертикально. PBS-TEDTA инъецировали в течение 60 с при скорости потока 100 мкл/мин один раз вертикально. Взаимные помехи (взаимодействия с поверхностью сенсора) и холостые данные (PBS-T-EDTA с 0,01% Tween20 или 0 нМ аналита) вычитали из необработанных данных. После этого сенсограммы подгоняли глобально к 1:1 связыванию Ленгмюра, получая значения ассоциации (ka), диссоциации (kd) и аффинности (KD).
277-антитела связываются с Hu-TrkB-His с ka 1,93 X 105 1/Мс, KD 3,51 X 10-4 1/с, и KD 1,2 нМ. С2 связывается с Hu-TrkB-His с ka 2,32 X 104 1/Мс, KD 3,39 X 10-4 1/с, и KD 10,5 нМ. С20 связывается с HuTrkB-His с ка 1,29 X 105 1/Мс, KD 6,13 X 10-3 1/с, и KD 47,7 нМ. ТАМ-163 не связывается с 100 нМ HuTrkB-His.
Таблица 6
TrkB человека
mAb | ka (l/мс) kd (1/c) | KD (нМ) | |
TAM-163 анти-TrkB | не связывается при 100 нМ | ||
С20_химерное анти-TrkB huIgGlKO EX00077781 | 1,29Е+05 | 6ДЗЕ-ОЗ | 47,7 |
анти-TrkB C2_HuIgGlko (EX00077780) | 2,32Е+04 | 3,39Е-04 | 10,5 |
Анти-TRKB 277 антитела | 1,93Е+05 | 3,51Е-04 | 1,19 |
7. Неспецифическое связывание.
Разрабатывали анализ неспецифического связывания, используя технологию биосенсора, для определения, будут ли кандидаты новых биологических соединений (NBE) иметь существенное связывание с неродственными заряженными белками. В этом анализе, антитела проходили над двумя SPR поверхностями, одна из них была покрыта неродственным отрицательно заряженным белком, а вторая покрыта
- 39 043771 неродственным положительно заряженным белком. Когда NBE кандидат демонстрирует существенное неспецифическое связывание с этими поверхностями, то, вероятно, что причиной связывания является присутствие положительно или отрицательно заряженных поверхностных участков на кандидате. Неспецифическое связывание NBE кандидатов могут приводить к плохим фармакокинетике (ФК) и биораспределению и также может отрицательно влиять на последующую производственную технологичность. Результаты этого анализа использовали в контексте оценки риска по данному проекту. Целью этого исследования являлось уменьшение риска плохой ФК, отсутствия распределения в целевой ткани и сложности последующей производственной технологичности.
Задачей являлось определение, будут ли 277-антитела проявлять неспецифическое связывание или не будут проявлять неспецифического связывания путем сбора сенсограмм связывания 277-антител и сравнения их с сенсограммами контролей для определения категории неспецифического связывания как благоприятное (зеленое), приемлемое (желтое) или неблагоприятное (красное).
Метод.
Эксперимент осуществляли на Biacore T200. Разведение, приготовление поверхности и эксперименты связывания осуществляли при 25°С в 1X HBS-EP буфере, приготовленном из 10Х HBS-EP. Скорость течения для обоих протоколов, как протокола иммобилизации, так и эксперимента связывания, составляла 5 мкл/мин.
Для приготовления поверхности для эксперимента неспецифического связывания, белый лизоцим куриных яиц и ингибитор трипсина типа 1-S из сои связывали вручную с сериями S CM5 чипа с плотностью поверхности 3000-5000 ЕО, используя набор для иммобилизации по амино-группе согласно инструкциям производителя. FC1 и FC2 активировали путем инъецирования 1:1 смеси EDC и NHS в течение 7 минут. Поверхностью белого лизоцима куриных яиц приготавливали на FC2 путем инъецирования 150 мкг/мл белого лизоцима куриных яиц в 10 мМ NaOAc, pH 5,5 в течение 5 минут. FC1 и FC2 дезактивировали путем инъецирования 1 М этаноламин-HCl в течение 7 минут. FC1 использовали в качестве эталонной поверхности. FC3 активировали путем инъецирования 1:1 смеси EDC и HNS в течение 7 минут. Поверхность ингибитора трипсина типа 1-S из сои приготавливали на FC3 путем инъецирования 300 мкг/мл ингибитора трипсина типа 1-S из сои в 10 мМ NaOAc, рН 4,0 буфера в течение 20 минут с последующей 7 мин. инъекцией 1 М этаноламин-HCl для дезактивации проточной ячейки. Поликлональное антитело к лизоциму, антитело к ингибитору трипсина, и BI отрицательный контроль использовали в качестве контролей в анализе. Контроли и антитела приготавливали в 1 мкМ в 1X HBS-EP буфере. Образцы инъецировали над FC1, FC2 и FC3 поверхностями с 10 мин. ассоциацией и 15 мин. диссоциацией. Поверхности регенерировали между каждым циклом связывания путем инъецирования 1 мин. 0,85% фосфорной кислоты и 30 с 50 мМ NaOH при скорости потока 50 мкл/мин с последующим периодом стабилизации 2 мин. с 1X HBS-EP буфером, текущим через все поверхности. Поликлональное антитело к лизоциму и антитело к ингибитору трипсина инъецировали над FC1, FC2 и FC3 в начале и конце эксперимента. Данные собирали, используя Biacore T200 Control Software версия 2.0.1, и анализировали, используя Biacore T200 Evaluation Software версия 3.0.
Сенсограммы связывания антител сравнивали с сенсограммами BI отрицательного контроля для определения уровня неспецифического связывания с поверхностями белого лизоцима куриных яиц и ингибитора трипсина типа 1-S из сои.
Полученные данные показали, что 277-антитело не связывается существенно с неродственными заряженными белками; специфически белым лизоцимом куриных яиц и ингибитором трипсина типа 1-S из сои. 277-антитело классифицировано как благоприятное (зеленое) по сравнению с ответом связывания и формой кривых по сравнению с контролями. Следовательно, можно предположить, что 277-антитело будет обладать незначительным риском относительно фармакокинетики, биораспределения и приготовления на основании нецелевых заряженных видов.
Таблица 7
Образец | Поверхность -4400 ЕО Лизоцим | Поверхность -2300 ЕО Ингибитор трипсина |
Анти-TRKB 277 антитела | Нет связывания | Нет связывания |
8. Активность (SY5Y) и эффективность.
Дифференциация SH-SY5Y клеток к нейронному фенотипу.
Клетки SH-SY5Y (АТСС® CRL-2266™) культивировали в DMEM:F12 (Lonza № BE12-719F) с 15% фетальной бычьей сывороткой в колбе для культивирования ткани 175 см2 (Corning №353112). Для высевания клеток колбу промывали один раз с помощью D-PBS (Lonza № 17-512Q) и клетки отсоединяли с применением 37°С предварительно нагретого раствора аккутазы (А6964 SIGMA). После инкубирования в течение 3 минут при комнатной температуре клетки присоединены с помощью пипетки 10 мл и перенесены в пробирку фирмы Falcon объемом 15 мл. Клетки подсчитывали и 6000 клеток в 100 мкл
- 40 043771
DMEM:F12 с 15% FBS на лунку высевали в покрытые коллагеном-I планшеты на 96 лунок (BD Biosciences № 354407). Клетки поддерживали во влажном инкубаторе при 37°С, 5% СО2. Через 8 часов, в каждую лунку добавляли 100 мкл 6 мкМ раствора ретиноевой кислоты (Sigma № R2625). Конечная концентрация ретиноевой кислоты составляла 3 мкМ. Через 48 часов и 96 часов, необходима стимуляция с дополнительным количеством ретиноевой кислоты. Для этого, удаляли 100 мкл среды на лунку и добавляли 100 мкл свежей среды с 6 мкМ ретиноевой кислоты. После дифференциации в течение 7 дней SHSY5Y клетки имели допаминергически-подобный фенотип и были готовы к использованию.
Стимуляция и лизис дифференцированных клеток SH-SY5Y.
Среду с лунок заменяли на 80 мкл предварительно нагретой DMEM-F12 с 0,2% BSA. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Пептиды и антитела разводили в DMEM-F12 с 0,2% BSA. Все разведения приготавливали с наконечниками, пробирками и планшетами с низким связыванием. Клетки стимулировали путем добавления 20 мкл соответствующего пептида/антитела в течение 45 мин при комнатной температуре. Во время инкубирования приготавливали буфер для лизиса клеток в пробирке фирмы Falcon объемом 15 мл на льду: 1 мл 10х Triton X-100 лизирующий буфер 8,7 мл Н2О 1 таблетка полная мини, ингибитор протеазы 100 мкл коктейль ингибиторов фосфатаз 2 100 мкл коктейль ингибиторов фосфатаз 3 100 мкл 1 мМ PMSF. После стимуляции клеток среду удаляли и на каждую лунку добавляли 30 мкл охлажденного на льду лизирующего буфера. Планшет покрывали верхним уплотнением и инкубировали на льду в течение 20 мин. После этого содержимое планшета перемешивали на встряхивателе для планшетов эппендорфа при 500 об/мин в течение 5 мин.
Для этой стадии все материалы и растворы хранили на льду. Планшет на 96 лунок с лизированными клетками центрифугировали при 235 g в течение 10 с и хранили на льду. Буфер для AlphaLISA иммуноанализа (PerkinElmer №AL000C) приготавливали путем разведения 260 мкл 10х маточного раствора в 2340 мкл Н2О. pNTRK2 акцепторные шарики (PerkinElmer № CUSM81822; шарики, покрытые Perkin Elmer с антителом от CellSignaling CST № 4621 клон C50F3) разводили в буфере для AlphaLISA иммуноанализа до конечной концентрации 10 мкг/мл. NTRK2 биотиновое антитело (PerkinElmer № CUSM81820; меченное с Perkin Elmer с антителом от CellSignaling CST=№4609 клон C17F1 ) разводили в буфере для AlphaLISA иммуноанализа до конечной концентрации 1 нМ и стрептавидин-донорные шарики (PerkinElmer № 6760002S) разводили в буфере для AlphaLISA иммуноанализа до конечной концентрации 20 мкг/мл. 5 мкл pNTRK2 акцепторных шариков и 2,5 мкл клеточного лизата на лунку переносили в белый планшет небольшого объема на 384 лунки (Greiner № 784075) с плоским дном и центрифугировали при 235 g в течение 10 с и хранили в течение 45 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубирования добавляли 2,5 мкл NTRK2 биотинового антитела на лунку и планшет центрифугировали при 235 g в течение 10 с и хранили в течение 45 минут при комнатной температуре в темноте. В завершение, добавляли 2,5 мкл стрептавидин-донорных шариков на лунку и планшет центрифугировали при 235 g в течение 10 с и хранили в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Сразу после этого планшет анализировали с помощью планшет-ридера EnVision, используя протокол AlphaScreen (фильтр 570 нМ № 244 и зеркало № 444).
Определение ERK1/2 фосфорилирования.
Измерение ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) фосфорилирования осуществляли с применением 8 кл клеточного лизата согласно инструкциям производителя (AlphaScreen SureFire p-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) набора (PerkinElmer №TGRES10k))
Определение АКТ 1/2/3 фосфорилирования.
Измерение Akt 1/2/3 (Thr308) фосфорилирования осуществляли с применением 8 кл клеточного лизата согласно инструкциям производителя ((AlphaScreen SureFire p-Akt 1/2/3 (Thr308) набора (PerkinElmer № TGRA3S10K)).
Несколько антител к TrkB согласно изобретению анализировали для определения их потенциальной активности активировать TrkB, а также инициировать нижерасположенные сигналы. Также в исследование включали природный лиганд BDNF и антитела С2 и С20. Антитела к TrkB согласно настоящему изобретению в среднем в десять раз более активны относительно активации TrkB по сравнению с природным лигандом BDNF. При сравнении с антителами С2 и С20, антитела к TrkB согласно изобретению в среднем в три раза - в пятнадцать раз более эффективными. Нижерасположенная передача сигналов pERK и AKT1/2/3 полностью согласуется с этими измерениями относительно активации TrkB и проявляет сходную улучшенную активность антител к TrkB согласно изобретению.
- 41 043771
Таблица 8
Соединение | EC50 пМ [среднее ± CO1 |
TrkB-P | |
BDNF | 430 [±254] |
277-gr (IgGl) | 39 [±18] |
277-gr (IgGl-КО) | 46 [±27] |
277-64 (IgGl) | 53 [±41] |
277-64 (IgGl-KO) | 44 [±23] |
C2 | 134 [±72] |
C20 | 654 [±180] |
p-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) | |
BDNF | 301 [±279] |
277-gr (IgGl) | 30 [±12] |
277-gr (IgGl-KO) | 47 [±42] |
277-64 (IgGl) | 38 [±11] |
277-64 (IgGl-KO) | 56 [±72] |
C2 | 103 [±56] |
C20 | 238 [±36] |
АКТ 1/2/3-P (T308) | |
BDNF | 255 [±179] |
277-gr (IgGl) | 23 [±0] |
277-gr (IgGl-KO) | 39 [±22] |
277-64 (IgGl) | 25 [±3] |
277-64 (IgGl-KO) | 22 [±1] |
C2 | 132 [±76] |
C20 | 430 [±111] |
9. Экспрессия генов.
Осуществляли анализ секвенирования следующего поколения (данные не показаны) для дифференцированных SH-SY5Y клеток после стимуляции с применением нескольких TrkB агонистов. Для подтверждения результатов, выбирали большинство регулируемых генов по отношению к синаптической пластичности и затем анализировали изменения с помощью кПЦР. ARC, VGF, EGR1 представляют собой известные маркеры для синаптической пластичности. Синаптическая пластичность представляет собой процесс, с помощью которого специфические паттерны синаптической активности приводят к изменениям синаптической силы. На фиг. 2 стимуляция дифференцированных SH-SY5Y клеток с помощью BDNF или агонистических антител повышает количество экспрессии мРНК ARC, VGF, EGR1, что может быть маркером для увеличенной синаптической пластичности. На экспрессию мРНК NTRK2 не влияет стимуляция с применением BDNF или агонистических антител. Изменения картин экспрессии, индуцированные BDNF и D003, в целом являются очень сходными. Эти результаты подтверждают данные, полученные при анализе секвенирования следующего поколения.
Специфически, SH-SY5Y клетки дифференцировали в течение 7 дней в культуральном планшете на 6 лунок (SIGMA № Corning CLS3516). После дифференциации, клетки стимулировали в бессывороточной DMEM:F12 с 0,2% BSA с контрольным IgG [10 нМ], BDNF [10 нМ] и D003 [10 нМ] в течение 6 часов во влажном инкубаторе при 37°С, 5% СО2. После этого клетки промывали один раз с помощью предварительно нагретой lx D-PBS и осуществляли выделение мРНК согласно инструкциям производителя (Qiagen № 74104 RNeasy Mini Kit). Транскрипцию мРНК до кДНК осуществляли согласно инструкциям производителя (Qiagen № 205310 QuantiTect Rev. Набор для транскрипции). кДНК использовали для анализов TaqMan ПЦР в режиме реального времени на основании 5' - нуклеазных зондов (ThermoFischer Scientific) на 7900НТ Fast системе ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems). Значения дельта СТ рассчитывали на основании значения СТ для АСТВ (СТ=18,18).
Анализы TaqMan экспрессии генов от ThermoFischer Scientific:
АСТВ-актин бета: Hs01060665_g1; № кат. 4331182,
NTRK2-нейротрофическая рецепторная тирозинкиназа 2: Hs0017881 1_ml; № кат. 4331182,
ARC-связанный с цитоскелетом белок с регулируемой активностью: Hs01045540_g1; № кат. 4331182,
VGF-индуцибельный фактор роста нервов: Hs00705044_s1, № кат. 4331182 EGR1 -ранний ростовой ответ 1: Hs00152928_m1; № кат. 4331182.
10. Фармакокинетическое исследование интравитреального введения (ивт) на кроликах.
Самки новозеландских белых кроликов (вес тела 1,7-2 кг) акклиматизировали >15 дней до начала исследования. Антитело 277 приготавливали стерильным в концентрации 20 мг/мл и 1 мг (в 50 мкл буфера: 60 мМ ацетат натрия, 150 мМ NaCl, pH 5,0) инъецировали билатерально в стекловидное тело анестезированных животных. В различные временные точки, 2 животных подвергали эвтаназии и собирали ткани глаза, состоящие из внутриглазной жидкости, стекловидного тела и сетчатки, и замораживали вплоть до проведения анализов. Образцы крови отбирали в различные временные точки (фиг. 3), центрифугировали и плазму замораживали вплоть до проведения анализов.
- 42 043771
Количественное определение антитела осуществляли с помощью ELISA. Для каждого типа ткани, приготавливали калибровочную кривую антитела (в трех повторах в диапазоне 0,5-100 нг/мл) в идентичном буфере в качестве образцов и включали в каждый планшет. Поглощение измеряли при 405 нм, используя фотометр SpectraMax 340PC-384 и анализ данных осуществления с помощью SoftMaxPro6.5.
Концентрация 277-антитела представлена на фиг. 3, демонстрируя концентрацию в различных компартментах глаза, как указано, и плазме после ивт инъекции 1 мг 277-антитела в глаза кроликам в зависимости от времени. Рассчитанное время полужизни в глазу и плазме представлены в таблице ниже.
Таблица 9
ti/2 (ДНИ) | |||
Стекловидное тело | Внутриглазная жидкость | Сетчатка | Плазма |
4,9 | 4,8 | 5,2 | 7,0 |
Рассчитанное время полужизни составляло 4,9, 4,8, 5,2 и 7,0 дней в стекловидном теле, внутриглазной жидкости, сетчатке и плазме, соответственно. Эти времени полужизни сходны с теми, которые описаны в литературе для клинически используемого рекомбинантного гуманизированного моноклонального IgG1 антитело Авастин (анти-VEGF, бевацизумаб, Bakri и др., Opthalmology, 2007), которые также были подтверждены экспериментально в собственных условиях. Эти результаты соответствовали предполагаемым, поскольку интравитреальный клиренс полноразмерных IgG главным образом зависит от их молекулярного размера, который сходен для нашего антитела 277 и Авастина. Таким образом, полагают, что ФК для человека, включая время полужизни в глазе антитела 277 и Авастина, является сходной. Описанное время полужизни в глазе человека для Авастина составляет 9,73±1,48 дня (Hutton-Smith, 2016).
11. Частота ивт инъекции IgG1 антитела.
На основании данных in vivo, полученных в фармакокинетическом исследовании (пример 10), а также данных активности, полученных в SH-SY5Y клетках, исследовали глазную ФК для человека (витреальную концентрацию в динамике) IgG1 антител и рассчитывали на основании хорошо зарекомендовавших себя однокамерных моделей кинетики относительно глазного клиренса биомолекул. Для расчетов, использовали следующие параметры: время полужизни в глазе человека t1/2 =10 дней, как описано для Авастина, а также подтверждается приведенными данными in vivo в примере 10; молекулярный вес 149 кДа как для полноразмерных IgG1 антител, и количество ивт инъецированного антитела 1 мг (см. фиг. 4). Поскольку глазная ФК главным образом зависит от молекулярного веса, то идентичный график глазной ФК получали для всех пяти антител.
Для оценки частоты ивт инъекции, следует принять во внимание, что эффективность in vivo может поддерживаться при витреальных концентрациях > клеточным ЕС50, как определено на основании анализов TrkB-фосфорилирования в SH-SY5Y клетках (Пример 8). Время после ивт инъекции для достижения витреальной концентрации, эквивалентной ЕС50, указано стрелками на фиг. 4. На основании этого анализа, время до достижения такой витреальной концентрации после инъекции 1 мг антитела обобщено в следующей таблице для каждого антитела.
Таблица 10
Соединение | Время ПОСЛе ИВТ ДО ДОСТИЖеНИЯ ССтекловидн. = ЕС50 [дни] |
277-gr (IgGl) | 154 |
277-gr (IgGl-КО) | 151 |
277-64 (IgGl) | 150 |
277-64 (IgGl-КО) | 152 |
C2 | 136 |
Например, после инъецирования 1 мг С2 в глаз человеку, витреальная концентрация, соответствующая EC50 для С2 (табл. 10), достигается через 136 дней (то есть, через 136 дней, необходима следующая ивт инъекция). Для сравнения, в случае с 277-64 (IgG1), это время будет удлинено до 150 дней после ивт инъекции. В этом случае, следующая ивт инъекция будет необходима на 14 дней позже по сравнению с С2. Принимая во внимание, что минимальная эффективная доза значений в 10 раз выше, чем ЕС50, будет снижать время между инъекциями, однако, временное отличие в частоте инъекции между С2 и другими антителами, перечисленными табл. 10 выше, будет оставаться идентичным.
Инъецируемый объем, который можно вводить в глаз, сильно ограничен. В то же время, повторные инъекции в глаза необходимы для лечения глазных состояний. Улучшение времени полужизни антитела является одним из способов увеличения времени между интервалами инъекций, но, как указано, главным образом зависит от молекулярного веса молекулы. Как было показано in vivo в примере 10 и на SH-SY5Y клетках в примере 8, путем обеспечения улучшенного и более эффективного антитела интервалы инъекций можно удлинить, что для пациентов представляет возможность менее часто получать инъекции в глаза.
12. Нейрозащитный и нейрорегенеративный эффекты агонистического антитела TrkB у STZиндуцированных диабетических крыс.
Ни одно из 277-антител не является перекрестно реактивным у грызунов, следовательно, исследо- 43 043771 вания для подтверждения концепции и эффективности in vivo осуществляли с применением TrkB активирующего антитела С2 в качестве антитела суррогатных средств для тестирования гипотезы о том, что TrkB активирующие подход I) обеспечивает нейропротективное действие ('нейрозащитный подход'), и II) обеспечивает реактивацию дисфункциональных нейронов/совокупностей ('регенерационный подход'). Оба подхода рассматриваются в нескольких исследованиях. В качестве моделей болезней животных, использовали модель диабета, индуцированного стрептозотоцином (STZ) у крыс, которая характеризуется потерей бета-клеток поджелудочной железы, низкими уровнями инсулина, стабильной гипергликемией и последующей нейронной дисфункцией в сетчатке.
Исследование на животных.
Самцов серых крыс (BN крысы) получали от Charles River (Германия). Животных содержали в группах по 2 в IVC в условиях контролируемой температуры и влажности, с 12-ти часовым циклом день /ночь (свет был выключен в период от 18 ч до 6 ч утра). Они получали питание ad libitum с гранулированным рационом № 3438 от Provimi Kliba (Швейцария) и имели свободный доступ к питьевой воде. Животных акклиматизировали к их окружающей среде в течение одной недели перед началом исследования. Возраст крыс составлял 6-8 недель на начало прижизненной фазы исследования. Гипергликемию индуцировали путем в/б инъекции STZ (65 мг/кг вес тела; Sigma № S0130-1G). Животных, которые не отвечают, или плохо отвечают, не включали в исследование, то есть, животных с концентрациями глюкозы в крови <20 мМ в день 5 после применения STZ. За весом тела и уровнями глюкозы в крови наблюдали регулярно. Животным вводили дозу путем однократной ивт инъекции С2 (50 мкг в 4,6 мкл) или контрольного антитела к 2,4,6-тринитрофенилу (анти-TNP) (50 мкг в 4,5 мкл) в день 36 после применения STZ. Функция сетчатки оценивали с помощью записей электроретинографии (ЭРГ), и животных умертвляли после последней записи с помощью смертельной дозы в/б введения фенобарбитала.
Дозирование и интравитреальные инъекции.
Общая схема исследования представлена на фиг. 5. Для ивт инъекции, крыс анестезировали с применением 2,5-3% изофлурана (Forene; Abbvie). Вводили каплю 4 мг/мл оксибупрокаингидрохлорида (Novesine; Omnivision) в качестве местной локальной анестезии. 4,6 мкл С2 маточного раствора (10,9 мг/мл; буфер: 20 мМ цитрат натрия, 115 мМ NaCl, pH 6,0) инъецировали ивт в каждый глаз гипергликемических крыс (группа 3, n=24 глаза, фиг. 5), что приводило к инъецируемой дозе ~50 мкг/глаз. В качестве контроля, 4,5 мкл анти- анти-2,4,6-тринитрофенильного маточного раствора (11,2 мг/мл; буфер 20 мМ цитрат натрия, 115 мМ NaCl, pH 6,0) инъецировали ивт в глаза недиабетических и диабетических контрольных крыс (группа 1, n=24 глаза, и группа 2, n=22 глаза, фиг. 5), что приводило к инъецируемой дозе ~50 мкг/глаз. Ивт инъекции осуществляли под препарировальной лупой. Раствор Антитела доставляли с помощью иглы 34 калибра (насаженной на стеклянный шприц Гамильтона объемом 10 мкл) в стекловидное тело сразу позади лимба, и общее качество инъекции контролировали с помощью фундоскопии (используя Micron IV Retinal Imaging Microscope, Phoenix Research Labs).
Электроретинография.
Электроретинография (ЭРГ) представляет собой неинвазивную электрофизиологическую технику для оценки индуцированной светом электрической активности различных нейронов сетчатки, и предоставляет возможность количественного определения различных аспектов функции сетчатки, таких как зрение при низком уровне освещенности или цветовое зрение. ЭРГ измеряли в качестве изменения потенциала между роговичным и эталонным электродом, используя систему записи Espion Е3 ЭРГ (Diagnosys LLC). Перед записями ЭРГ, животных адаптировали к темноте в течение по меньшей мере 2 часов, и анестезировали путем в/б инъекции кетамина (Ketanest, прибл. 100 мг/кг) и ксилазина (Rompun, прибл. 5 мг/кг). Животных помещали на столик с подогревом для поддержания постоянной температуры тела при 37°С. Зрачки расширяли с помощью 1% циклопентолат-HCl и 2,5% фенилэфрина. Каплю раствора Methocel 2% (OmniVision) капали на роговицу для предотвращения высушивания глаза и развития катаракты во время записей. Записи осуществляли одновременно для обоих глаз с помощью золотых петлевых электродов. Эталонный электрод представлял собой беззубый зажим типа крокодил, увлажненный Methocel, и прикрепленный к щеке животного. Для электрического заземления, зажим присоединяли к хвосту животного. ЭРГ сигналы замеряли при 1 кГц и записывали с граничными режимами 0,15 Гц низкой частоты и 500 Гц высокой частоты. Световые стимулы состояли из коротких вспышек с полным полем, доставляемых с помощью набора светоизлучающих диодов (продолжительность, <4 мс). Все вспышки продуцировали с помощью стимулятора Ganzfeld (ColorDome; Diagnosys), либо в темноте или на немигающем зеленом или красном фоновом свете.
ЭРГ протоколы.
ЭРГ ответы сначала записывали от адаптированных к темноте животных (для выделения опосредованных палочками ответов), после этого записывали от животных, адаптированных к красному фоновому свету (50 кд/м2, для выделения УФ опосредованных колбочками ЭРГ ответов) и затем адаптированных к зеленому фоновому свету (25,5 кд/м2, для выделения опосредованные колбочками М-типа ответы). В случае адаптированных к темноте ЭРГ, ответы вызвали сериями вспышек в диапазоне от 1-10’5 до 0,1 кд-с/м2. Для вспышек с люминесценцией 1-10’5 и 3-10’5 кд-с/м2, ответы 20 опытов были усреднены.
- 44 043771
Для вспышек в диапазоне от 1 -10-4 вплоть до 0,05 кд-с/м2, ответы 10 опытов были усреднены, и для конечной вспышки 0,1 кд-с/м2, 8 опытов были усреднены. Интервалы между индивидуальными вспышками выбирали таким образом, чтобы обеспечить полное восстановление сетчатки от каждой вспышки (нет признаков индуцированного вспышкой уменьшения амплитуд ответов или сокращения латентности). На основании этого критерия, интервалы между вспышками составляли 2 с для 1 -10-5 и 3-10-5 кд-с/м2 вспышки, 5 с для вспышек в диапазоне от 1 -10-4 вплоть до 0,05 кд-с/м2, и 10 с для вспышки 0,1 кд-с/м2.
Для записей УФ опосредованных колбочками ответов, животные были адаптированы к свету для красного фонового света в течение 2 мин. Световые ответы вызывали с помощью УФ вспышек 0,02, 0,04, 0,08, 0,17, 0,35, 0,83, 1,66, 2,90, и 4,15 мкВт/м2. Для записей опосредованных колбочками М-типа ответов, животные были адаптированы к свету для зеленого фонового света в течение 2 мин. Световые ответы вызывали с помощью зеленых вспышек 0,25, 0,1, 1,0, 5,0, 50, и 150 кд-с/м2. Для УФ и зеленых вспышек, ответы 10 опытов были усреднены с интервалами между вспышками 3 с.
Анализ данных.
Для определения ЭРГ амплитуд b-волн (положительная реакция деполяризации, имеющая происхождение главным образом из биполярных клеток), записывали данные ЭРГ и анализировали с использованием программного обеспечения MATLAB (версия R2014a; MathWorks). Осцилляторные потенциалы (небольшие высокочастотные волны, накладывающиеся на b-волну) удаляли от сигналов путем 55 Гц быстрого преобразования Фурье фильтрации низких частот, поскольку осцилляторные потенциалы могут оказывать влияние на амплитуду и положение пика b-волны, в особенности в адаптированных к свету условиях. Амплитуду b-волны вычисляли от нижнего уровня ответа а-волны (отрицательное отклонение, возникающее главным образом вследствие активности фоторецептора) к пику пика b-волны. Латентность b-волны измеряли как время после стимуляции вспышкой, необходимое для достижения пика b-волны.
Амплитуды b-волн в зависимости от интенсивности стимула подгоняли с помощью следующего уравнения, используя процедуру выравнивания методом наименьших квадратов (GraphPad Prism, версия 6.01): р тП R=7^} (Уравнение!) где R представляет собой амплитуду ответа, Rmax представляет собой амплитуду насыщающих колебаний, I интенсивность вспышки, Ih полунасыщающую интенсивность вспышки и п коэффициент Хилла.
Светочувствительность, S, определяли как соотношение между амплитудой насыщающих колебаний, Rmax, и полунасыщающей интенсивностью вспышки, Ih.
S и Rmax значения нормировали к средним значениям не-диабетических контролей, полученных для недели 5, до ивт, и для недели 7, после ивт лечения, соответственно.
Для анализа латентности опосредованной палочками b-волны, определяли среднюю латентность недиабетических контрольных животных для b-волны, вызываемых вспышками 1-10-5, 3-10-5, 1-10-4 и 2-10-4 кд-с/м2 (соответствующая латентность является очень похожей). Для каждой исследуемой группы, рассчитывали относительное изменение для среднего значения контролей для интенсивностей вспышек, указанных выше, и усредняли, получая среднее относительное изменение латентности b-волны.
Для анализа УФ опосредованной колбочками латентности b-волны, рассчитывали относительные изменения латентности к среднему значению контролей для b-волновых ответов, вызываемых интенсивностями вспышек 0,042, 0,083, 0,166 и 0,348 мкВт/см2, и усредняли.
Для анализа латентности опосредованной колбочками М-типа b-волны, рассчитывали относительные изменения латентности к среднему значению контролей для b-волновых ответов, вызываемых интенсивностями вспышек 1, 5, 50 и 150 кд-с/м2, и усредняли.
Ответ опосредованной палочками а-волны определяли на пике а-волны (отрицательное отклонение сигнала сразу после светового стимула), вызываемого вспышкой 0,1 кд-с/м2.
Результаты.
В неделю 5 после индукции диабета, осуществляли записи исходных ЭРГ для количественного определения степени нейронной дисфункции в сетчатке перед ивт лечением (см. также фиг. 5). На основании этих результатов ЭРГ, было установлено, что две диабетические (гипергликемические) группы проявляли сходное распределение дисфункции сетчатки (которые получали последующее ивт лечение либо с применением контрольного IgG1 к 2,4,6-тринитрофенилу - группа 2 - или TrkB агонистическое IgG1 C2 - группа 3). В целом, все ивт лечения хорошо переносились и не наблюдали побочных эффектов. Глюкоза в крови была стабильной на уровне ~5 мМ у недиабетических контрольных крыс (группа 1, n=12) в период осуществления исследования. В STZ-индуцированных диабетических животных (группа 2 и 3, каждая n=12), концентрации глюкозы в крови достигали уровней >20 мМ через ~4 дня после STZ обработки, и не снижались ниже 20 мМ в период осуществления исследования. Ивт лечение с применением С2 или контрольного IgG1 к 2,4,6-тринитрофенилу не оказывает каких-либо влияний на уровни глюкозы в крови.
- 45 043771
Латентность опосредованной палочками b-волны.
Латентность b-волны представляет собой критерий для скорости индуцированного светом электрического ответа в сетчатке (главным образом на уровне биполярных клеток и синаптической трансмиссии фоторецептор-на-биполярные клетки). Латентность определяется как время, необходимое для достижения амплитуды ответа после стимуляции вспышкой света. Влияния гипергликемии и ивт лечения обобщены на фиг. 6. Рассчитывали изменения латентности относительно средней латентности, измеренных от контрольных крыс, для данных, полученных до ивт лечения (оценка исходного состояния ЭРГ) и после ивт лечения. Существует сильное увеличение латентности на ~14 мс в двух гипергликемических группах до ивт лечения, указывая на индуцированное гипергликемией замедление кинетики ответа bволны, то есть, уменьшенная скорость опосредованного палочками процессинга в сетчатке. Ивт инъекция контрольного IgG1 к 2,4,6-тринитрофенилу не оказывала каких-либо существенных влияний на латентность у недиабетической контрольной группе и гипергликемической группе (группа 1, черные столбики, и группа 2, обозначенные точками столбики на фиг. 6, после ивт, соответственно). Однако, ивт лечение с применением TrkB активатора С2 очевидно приводит к уменьшенной задержке латентности (группа 3, серый столбик на фиг. 6, после ивт). В среднем, ивт лечение с применением С2 вызывает существенное ускорение ответов b-волны на ~9 мс (то есть задержка латентности сокращается от 14 мс вплоть до 5 мс).
Светочувствительность опосредованной палочками b-волны.
ЭРГ ответы светочувствительности опосредованной палочками b-волны являются показателем количества нейронов, принимающих участие в опосредованных палочками путях передачи сигналов в сетчатке, и их чувствительность к световым стимулам для образования деполяризующих световых ответов. Светочувствительности нормировали к средним светочувствительностям контрольных крыс (группа 1, до и после ивт лечения) и графически представляли на фиг. 7. Нормированные светочувствительности снижались на ~40-50% у гипергликемических животных (до ивт лечения, группа 2 и 3). Ивт инъекция контрольного IgG1 не оказывала каких-либо существенных влияний на светочувствительности контрольных крыс (группа 1) или гипергликемических крыс (группа 2). Чрезвычайно важным является тот факт, что ивт лечение с применением TrkB активатора С2 существенно повышало светочувствительность на ~30% (группа 3, серые, после ивт по сравнению с до ивт).
Ответы опосредованной палочками а-волны.
Ответ опосредованной палочками а-волны является показателем для размера световых ответов палочкового фоторецептора, вызванных вспышкой света. Ответы опосредованной палочками а-волны нормировали к средним значениям, полученным от контрольные крысы (группа 1, до и после ивт лечения) и графически представляли на фиг. 8. Нормированные амплитуды насыщающих колебаний снижались на ~17% у гипергликемических животных (группа 2 и 3, до ивт лечения). Ивт инъекция контрольного IgG1 не оказывала каких-либо существенных влияний на нормированные ответы а-волны у контрольных крыс (группа 1, черные) или гипергликемических крыс (группа 2, обозначенные точками), где у последней группы проявляется дальнейшее снижение ответа а-волны во время проведения исследования. Однако, ивт лечение с применением TrkB активатора С2 (группа 3, серые) может полностью предотвращать дальнейшее снижение ответов а-волны, что наблюдается для гипергликемической группы 2.
УФ и латентность опосредованной колбочками М-типа b-волны.
Рассчитывали изменения латентности относительно средней латентности, измеренной для контрольных крыс, для данных, полученных до ивт лечения (оценка исходного состояния ЭРГ) и после ивт лечения. Этот анализ осуществляли для УФ латентности опосредованной колбочками b-волны (фиг. 9) и латентности опосредованной колбочками М-типа b-волны (фиг. 10). В случае УФ опосредованных колбочками ответов, существует сильное увеличение латентности на ~8 мс в двух гипергликемических группах до ивт лечения, в то время как увеличение опосредованный колбочками М-типа латентности составляет ~5 мс для гипергликемических крыс. Эти статистически достоверные эффекты указывают на индуцированное гипергликемией замедление кинетики ответов b-волны и уменьшает скорость опосредованного колбочками процессинга в сетчатке. Ивт инъекции контрольного IgG1 не оказывал каких-либо существенных влияний на латентность у недиабетической контрольной группы (группа 1, черные) или гипергликемической группы (группа 2, обозначенные точками), для обоих УФ и латентности опосредованной колбочками М-типа b-волны. Ивт лечение с применением С2 (группа 3, серые) сокращает латентность на ~5 мс в случае УФ колбочек (что соответствует ~50% нормализации кинетики ответов bволны), и практически полное восстановление кинетики нормальных ответов b-волны в случае опосредованных колбочками М-типа b-волн.
Светочувствительность УФ опосредованной колбочками b-волны.
ЭРГ ответы светочувствительности УФ опосредованной колбочками b-волна оценивали, как описано для опосредованной палочками ЭРГ. Светочувствительности нормировали к средним светочувствительностям контрольных крыс (группа 1, до и после ивт лечения) и графически представляли на фиг. 11. Нормированные светочувствительности снижались на ~50% у гипергликемических животных на исходном уровне (до ивт). Ивт инъекция контрольного IgG1 не оказывала каких-либо существенных влияний на светочувствительности, в то время как ивт лечение с применением С2 существенно повышало свето
- 46 043771 чувствительность до уровня, наблюдаемого у здоровых контрольных крыс (группа 3, серые).
Амплитуда ответа опосредованной колбочками М-типа насыщающей b-волны.
Влияние гипергликемии на светочувствительность опосредованной колбочками М-типа b-волны является менее выраженным, чем для УФ опосредованной колбочками b-волны (в исследуемые временные точки). Тем не менее, можно наблюдать существенное ухудшение амплитуды насыщающих колебаний опосредованных колбочками М-типа b-волн в неделю 5 после начала гипергликемии (~15% уменьшение по сравнению с не-диабетическими контрольными крысами, фиг. 12). Ивт лечение с применением С2 может восстанавливать амплитуду насыщающих колебаний до уровня контролей (группа 3, серые), в то время как лечение с применением контрольного IgG1 не оказывало каких-либо существенных влияний (группа 2, обозначенные точками).
Основные результаты исследований обобщены ниже.
Активация TrkB вызывает нейропротективное действие и сохраняет функцию сетчатки. Нейропротективное действие было показано на модели STZ-индуцированного диабета у крыс, отображающей индуцированную гипергликемией нейронную дисфункцию. Было показано, что активация TrkB предотвращает дисфункцию фоторецепторов.
Активация TrkB индуцирует восстановление/улучшение функции нейронов в сетчатке на модели STZ-индуцированного диабета у крыс после пролонгированной гипергликемии, например, улучшенную латентность светового ответа (то есть, сокращение ЭРГ латентности b-волны), или улучшенные опосредованных палочками и колбочками светочувствительности.
Подводя итог, следует отметить, что фармакологические данные обеспечивают подтверждение терапевтической концепции о том, что активация TrkB может улучшать/восстанавливать функцию различных типов нейронных клеток в глазе при различных болезненных состояния.
Активация TrkB также защищает фоторецепторы и наружную сетчатку, как показано с помощью анализа ЭРГ а-волны, которая является показателем световых ответов фоторецепторов. Подобно результатам, полученным для ЭРГ а-волны, контрастная чувствительность глаз диабетических крыс снижается во время продолжающейся гипергликемии, в то время как ивт лечение с применением TrkB активатора С2 полностью сохраняет контрастную чувствительность. Кроме того, улучшение ЭРГ светочувствительности световых ответов опосредованных палочками и колбочками b-волны, как описано выше (отображающее светочувствительности синаптической трансмиссии фоторецепторов на биполярные клетки) дополнительно усиливает концепцию о том, что активация TrkB может улучшать/защищать функцию наружной сетчатки, включая фоторецепторы.
13. BDNF функция при комбинированных лечениях.
Культивирование СНО клеток, экспрессирующих TrkB рецептор человека.
СНО клетки, экспрессирующие TrkB рецептор человека (hTrkB) (ThermoFisher Scientific, № K1491) культивировали в DMEM (Lonza, № BE12-604F), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, глутамаксом, заменимыми аминокислотами, 20 мМ HEPES, 5 мкг/мл бластицидина и 200 мкг/мл зеоцина. За двадцать четыре часа до стимуляции, 5000 клеток (30 мкл) высевали в каждую полость прозрачного планшета для культивирования тканей на 384 лунки (BD Falcon, № 353963) и инкубировали в увлажненном инкубаторе при 37°С и 5% СО2.
Анализ ERK фосфорилирования в СНО клетках с помощью hTrkB рецептора.
Через двадцать четыре часа после высевания, супернатант CHO/hTrkB клеток заменяли на 40 мкл DMEM комнатной температуры с 0,1% BSA, но без других дополнительных компонентов. Через 15 мин, добавляли 10 мкл DMEM/0,1% BSA с возрастающими концентрациями BDNF (1E-13 до 3Е-8 моль/л), 277-антитела (1Е-13 до 2,025Е-8 моль/л), или С2-антитела (1Е-13 до 2,025Е-8 моль/л) отдельно или комбинации с 1 нМ BDNF с возрастающими концентрациями 277- или С2-антитела (оба 1Е-13 до 2,025Е-8 моль/л) в трех повторах для стимуляции ERK фосфорилирования. После инкубирования в течение 45 мин при комнатной температуре, супернатанты удаляли и клетки лизировали в течение 20 мин на жидком льду в 20 мкл лизирующего буфера на лунку (1x Tryton лизирующий буфер (CellSignaling № 9803-S), дополненным таблетками полного мини протеазного ингибитора (Roche № 04693124001) и коктейлями ингибиторов фосфатаз 2 (Sigma № Р5726) и 3 (Sigma № Р0044), и 1 мМ PMSF (Sigma № 93482)). Пять микролитров полученного лизата использовали для количественного определения ERK1/2 фосфорилирования в T202/Y204, используя коммерчески доступный анализ (Perkin Elmer № TGRES500), согласно инструкциям производителя. Излучение света акцепторных шариков, отображающее ERK фосфорилирование, записывали при 570 нм на микропланшет-ридере Perking Elmer EnVision и подготавливали для презентации с помощью GraphPad Prism (версия 7), включая необработанные данные (среднее ± СПС) и нелинейную регрессию (лог(агонист) отн. ответа (три параметра)).
Как показано на фиг. 13, 277-антитело не уменьшает BDNF индуцированное ERK фосфорилирование. Возрастающие концентрации С2 антитела приводят к уменьшению BDNF индуцированного ERK фосфорилирования вплоть до уровня С2 индуцированного ERK фосфорилирования. Это может оказывать существенное влияние на дозирование антитела к TrkB в глаза, где антитела вводятся в высоких насыщающих концентрациях для пролонгирования времени, необходимого до следующего введения.
-
Claims (23)
- 277-антитело может вводиться в высоких дозах без конфликтования с существующим BDNF индуцированным ERK фосфорилированием, в то время как С2 антитело уменьшает существующее BDNF индуцированное ERK фосфорилирование вплоть до уровня антитела.14. Связывание с VEGF человека in vitro анализ ELISA.Для анализа связывания in vitro, MaxiSorp планшеты на 96 лунок (Nunc № 437111) покрывали в течение ночи при 4°С с помощью 500 нг/мл VEGF человека (R&D Systems № 293-VE-050) или VEGF крысы (R&D Systems № 564-RV-050) в карбонатном/бикарбонатном буфере (3,03 г/л Na2CO3 и 6,00 г/л NaHCO3, pH 9,6). Планшеты промывали три раза с помощью PBS-T (фосфатно-солевой буферный раствор (Invitrogen № 70011-036) с 0,05% Tween20 (Sigma № P7949)) и затем инкубировали с 1% BSA (Sigma № А3059) в PBS-T в течение трех часов при комнатной температуре для блокирования неспецифичного связывания. Планшеты промывали три раза с помощью PBS-T и затем инкубировали с 1:4 серийным разведением 1 мкМ Авастина (Roche clinic package), С2-антитела, 277-антитела или человеческого IgG1 изотипного контрольного антитела в PBS-T в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали раза с помощью PBS-T и затем инкубировали с 1:2000 разведением Alexa fluor 647 козьего анти-человеческого IgG (Invitrogen № A21445) в течение двух часов при комнатной температуре. После трех дополнительных циклов промывания с помощью PBS-T, записывали излучение света при 647 нм (отображающее связывание антитела с VEGF) на микропланшет-ридере Perking Elmer EnVision. Данные приготавливали для презентации с помощью GraphPad Prism (версия 7), включая необработанные данные (среднее ± СПС) и нелинейную регрессию (лог(агонист) отн. ответа (три параметра)).Как показано на фиг. 14 отсутствует статистически значимое различие для связывания VEGF человека между 277 антителом к TrkB и IgG1 изотипным контрольным антителом при концентрациях антитела вплоть до 0,25 мкМ (критерий Стьюдента для одной выборки, р>0,05). В отличие от этого, статистически значимое различие для связывания VEGF человека между С2 и изотипным контрольным антителом уже наблюдается при концентрации антитела 0,24 нМ (критерий Стьюдента для одной выборки, **р<0,01).Такое неспецифическое связывание с VEGF может вызывать, например, нежелательные побочные эффекты, затруднять контроль дозирования для активации TrkB, или повышать количество антитела, необходимое для достижения желательного эффекта.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Антитело, которое специфически связывается с тирозинкиназным рецептором В (TrkB), или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее (содержащий):а) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48 (L-CDR1); аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 (L-CDR2); и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50 (L-CDR3); иб) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51 (H-CDR1); аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52 (H-CDR2); и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 (H-CDR3), илив) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55 (H-CDR1); аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56 (H-CDR2); и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57 (H-CDR3), илиг) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 (H-CDR1); аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59 (H-CDR2); и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 (H-CDR3).
- 2. Антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:а) вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12,б) вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13,в) вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и вариабельную тяжелую- 48 043771 цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14,г) вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15,д) вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16,е) вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17,ж) вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18,з) вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, илии) вариабельную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.
- 3. Антитело к TrkB по п.1, где антитело содержит:а) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22 или 23,б) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25 или 26,в) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28 или 29,г) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на- 49 04377195%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31 или 32,д) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 или 35,е) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37 или 38,ж) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 41,з) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 43 или 44,и) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46 или 47.
- 4. Антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:а) вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 12 соответственно,б) вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 13 соответственно,в) вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 14 соответственно,г) вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 15 соответственно,д) вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 16 соответственно,е) вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 17 соответственно,ж) вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 18 соответственно,з) вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 19 соответственно, илии) вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 20 соответственно.
- 5. Антитело к TrkB по п.1, где антитело содержит:а) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 или 23,б) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 или 26,в) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28 или 29,г) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или 32,д) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и тяжелую цепь,- 50 043771 содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 35,е) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 или 38,ж) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 или 41,з) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43 или 44, илии) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46 или 47 соответственно.
- 6. Антитело к TrkB по п.1, где антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 или 23.
- 7. Антитело к TrkB по п.1, где антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 или 26.
- 8. Антитело к TrkB по п.1, где антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28 или 29.
- 9. Антитело к TrkB по п.1, где антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или 32.
- 10. Антитело к TrkB по п.1, где антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 35.
- 11. Антитело к TrkB по п.1, где антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 или 38.
- 12. Антитело к TrkB по п.1, где антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 или 41.
- 13. Антитело к TrkB по п.1, где антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43 или 44.
- 14. Антитело к TrkB по п.1, где антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46 или 47.
- 15. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-14 в медицине для лечения заболеваний, которые характеризуются уменьшенной активностью TrkB пути.
- 16. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.15 для лечения заболеваний глаз или сетчатки.
- 17. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.16 для лечения нейронных/невральных заболеваний глаза или сетчатки.
- 18. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.16 для лечения географической атрофии.
- 19. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.16 для лечения возрастной дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, пигментной дистрофии сетчатки, наследственной дистрофии сетчатки, наследственной макулодистрофии, миопической дегенерации, окклюзий вены сетчатки, окклюзий артерии сетчатки, эндофтальмита, увеита, кистозного макулярного отека, хороидальной неоваскулярной мембраны вследствие любого из заболеваний сетчатки, оптических нейропатий, глаукомы, отслойки сетчатки, токсической ретинопатии, лучевой ретинопатии и травматической ретинопатии.
- 20. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.15 для лечения нейродегенеративных заболеваний.
- 21. Применение по п.20 для лечения продромальной и от легкой до умеренной болезни Альцгеймера, задержки прогрессирования заболевания у пациентов с болезнью Альцгеймера, болезнью Хантингтона, болезнью Паркинсона, большого депрессивного расстройства, шизофрении, когнитивного нарушения, связанного с шизофренией, предотвращения первого приступа психоза у индивидуумов с ослабленным психозным синдромом, предотвращения повторения у пациентов с шизофренией, терапевтически резистентной депрессии.
- 22. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
- 23. Способ лечения заболеваний, которые характеризуются уменьшенной активностью TrkB пути,-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP17175122.5 | 2017-06-09 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA043771B1 true EA043771B1 (ru) | 2023-06-21 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6053834B2 (ja) | スフィンゴシン−1−リン酸と結合させるための組成物および方法 | |
US20240101689A1 (en) | Anti-trkb antibodies | |
AU2019254934A1 (en) | Monoclonal antibody of nerve growth factor and encoding gene and use thereof | |
TW201722474A (zh) | 治療發炎性疾病之方法 | |
JP2022531698A (ja) | 眼又は眼疾患を処置するための抗セマフォリン3a抗体及びその使用 | |
AU2016285858A1 (en) | Multi-specific binding proteins | |
US8758754B2 (en) | Nogo-A binding molecules and pharmaceutical use thereof | |
US20220363743A1 (en) | Anti-angpt2 antibodies | |
EA043771B1 (ru) | Антитела к trkb | |
CN110719916B (zh) | 抗-trkb抗体 | |
JP2016537406A (ja) | システイニルロイコトリエン(cysLT)との結合のための疾病治療用組成物およびその方法 | |
US20210380696A1 (en) | Anti-pd-1 antibodies | |
TWI836069B (zh) | 抗-sema3a抗體及其用於治療眼或眼部疾病之用途 | |
CN114423788A (zh) | 抗nrp1a抗体及其用于治疗眼或眼部疾病的用途 | |
EA046375B1 (ru) | Способ лечения воспалительных заболеваний |