EA043771B1 - ANTIBODIES TO TRKB - Google Patents
ANTIBODIES TO TRKB Download PDFInfo
- Publication number
- EA043771B1 EA043771B1 EA201992883 EA043771B1 EA 043771 B1 EA043771 B1 EA 043771B1 EA 201992883 EA201992883 EA 201992883 EA 043771 B1 EA043771 B1 EA 043771B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- seq
- antibody
- trkb
- Prior art date
Links
- 102100035080 BDNF/NT-3 growth factors receptor Human genes 0.000 title description 5
- 101000596896 Homo sapiens BDNF/NT-3 growth factors receptor Proteins 0.000 title description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 253
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 150
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 125
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 125
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 125
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 119
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 69
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 58
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 45
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 42
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 33
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 30
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 25
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 25
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims description 22
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 20
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 claims description 18
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 208000008069 Geographic Atrophy Diseases 0.000 claims description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 15
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 14
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 13
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 11
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 claims description 10
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 10
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 9
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 claims description 9
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 claims description 8
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 8
- 206010012688 Diabetic retinal oedema Diseases 0.000 claims description 7
- 201000011190 diabetic macular edema Diseases 0.000 claims description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 6
- 208000028017 Psychotic disease Diseases 0.000 claims description 6
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 claims description 6
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 claims description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 6
- 101000808006 Rattus norvegicus Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 claims description 5
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 claims description 4
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 claims description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 4
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 238000012898 one-sample t-test Methods 0.000 claims description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 4
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 claims description 3
- 206010058202 Cystoid macular oedema Diseases 0.000 claims description 3
- 206010019899 Hereditary retinal dystrophy Diseases 0.000 claims description 3
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001344 Macular Edema Diseases 0.000 claims description 3
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010064714 Radiation retinopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007527 Retinal artery occlusion Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038848 Retinal detachment Diseases 0.000 claims description 3
- 208000028552 Treatment-Resistant Depressive disease Diseases 0.000 claims description 3
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010206 cystoid macular edema Diseases 0.000 claims description 3
- 230000004340 degenerative myopia Effects 0.000 claims description 3
- 206010014801 endophthalmitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000017532 inherited retinal dystrophy Diseases 0.000 claims description 3
- 208000024714 major depressive disease Diseases 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims description 3
- 230000004264 retinal detachment Effects 0.000 claims description 3
- 208000004644 retinal vein occlusion Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 claims description 2
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 claims description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020911 optic nerve disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 claims description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims 2
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 claims 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 claims 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 claims 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 94
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 56
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 47
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 47
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 40
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 39
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 38
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 38
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 37
- 102000006261 human tropomyosin-related kinase-B Human genes 0.000 description 37
- 108010058135 human tropomyosin-related kinase-B Proteins 0.000 description 37
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 34
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 31
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 27
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 26
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 26
- 238000002571 electroretinography Methods 0.000 description 25
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 25
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 25
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 24
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 18
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 14
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 13
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 12
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 12
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000036211 photosensitivity Effects 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 10
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 206010034960 Photophobia Diseases 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 208000013469 light sensitivity Diseases 0.000 description 9
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 8
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 8
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 8
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 230000003956 synaptic plasticity Effects 0.000 description 8
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 7
- 230000004298 light response Effects 0.000 description 7
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000004243 retinal function Effects 0.000 description 6
- 210000001116 retinal neuron Anatomy 0.000 description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 125000001894 2,4,6-trinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C(C(*)=C(C([H])=C1[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 4
- 238000012815 AlphaLISA Methods 0.000 description 4
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 4
- 102100023226 Early growth response protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 4
- 101001049697 Homo sapiens Early growth response protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 4
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 4
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 4
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 4
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 4
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- -1 aspartyl Chemical group 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000008676 import Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 4
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 4
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 230000004382 visual function Effects 0.000 description 4
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 238000003016 alphascreen Methods 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 3
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 3
- 229940096384 chicken egg white lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 230000009760 functional impairment Effects 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 3
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 3
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 3
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 101710154825 Aminoglycoside 3'-phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 101710081722 Antitrypsin Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 101100322915 Caenorhabditis elegans akt-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 2
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 206010020710 Hyperphagia Diseases 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 229920003091 Methocel™ Polymers 0.000 description 2
- 101150111783 NTRK1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150117329 NTRK3 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 230000001130 anti-lysozyme effect Effects 0.000 description 2
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004637 cellular stress Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 238000001977 collision-induced dissociation tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000006764 neuronal dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000003955 neuronal function Effects 0.000 description 2
- 230000006576 neuronal survival Effects 0.000 description 2
- 230000003018 neuroregenerative effect Effects 0.000 description 2
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 230000003534 oscillatory effect Effects 0.000 description 2
- PRGUDWLMFLCODA-UHFFFAOYSA-N oxybuprocaine hydrochloride Chemical compound [Cl-].CCCCOC1=CC(C(=O)OCC[NH+](CC)CC)=CC=C1N PRGUDWLMFLCODA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000003566 phosphorylation assay Methods 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- DPVHGFAJLZWDOC-PVXXTIHASA-N (2r,3s,4s,5r,6r)-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-3,4,5-triol;dihydrate Chemical compound O.O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DPVHGFAJLZWDOC-PVXXTIHASA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGLPWQKSKUVKMJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione Chemical class C1=CC=C2C(=O)NNC(=O)C2=C1 KGLPWQKSKUVKMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OBWSOTREAMFOCQ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-amino-3,5-dimethylphenyl)-2,6-dimethylaniline;hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 OBWSOTREAMFOCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 241000256173 Aedes albopictus Species 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000270728 Alligator Species 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 208000031873 Animal Disease Models Diseases 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 241000713842 Avian sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108090000363 Bacterial Luciferases Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101000914103 Bos taurus Chymosin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 102220584675 Catechol O-methyltransferase_L233A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 208000010693 Charcot-Marie-Tooth Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 125000000030 D-alanine group Chemical class [H]N([H])[C@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 206010011903 Deafness traumatic Diseases 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012667 Diabetic glaucoma Diseases 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 108010015133 Galactose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101000998947 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-46 Proteins 0.000 description 1
- 101000604674 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 4-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000779418 Homo sapiens RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102100036888 Immunoglobulin heavy variable 1-46 Human genes 0.000 description 1
- 102100038198 Immunoglobulin kappa variable 4-1 Human genes 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000481961 Lachancea thermotolerans Species 0.000 description 1
- 241000235651 Lachancea waltii Species 0.000 description 1
- 102100038609 Lactoperoxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102220579328 Mitogen-activated protein kinase 1_L234A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102100029166 NT-3 growth factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710145851 NT-3 growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 208000002946 Noise-Induced Hearing Loss Diseases 0.000 description 1
- 101150056950 Ntrk2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100021079 Ornithine decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102220473261 Photoreceptor ankyrin repeat protein_L232A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 108091005682 Receptor kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 241000311088 Schwanniomyces Species 0.000 description 1
- 241001123650 Schwanniomyces occidentalis Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Natural products C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000005937 Tropomyosin Human genes 0.000 description 1
- 108010030743 Tropomyosin Proteins 0.000 description 1
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010047571 Visual impairment Diseases 0.000 description 1
- 102100038968 WAP four-disulfide core domain protein 1 Human genes 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229940126574 aminoglycoside antibiotic Drugs 0.000 description 1
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000011558 animal model by disease Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 201000007917 background diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000005460 biophysical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 230000004456 color vision Effects 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- SKYSRIRYMSLOIN-UHFFFAOYSA-N cyclopentolate Chemical compound C1CCCC1(O)C(C(=O)OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 SKYSRIRYMSLOIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001815 cyclopentolate Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 1
- 230000002999 depolarising effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002450 electron transfer dissociation tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N ketamine hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=1C=CC=C(Cl)C=1C1([NH2+]C)CCCCC1=O VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000018769 loss of vision Diseases 0.000 description 1
- 231100000864 loss of vision Toxicity 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000012976 mRNA stabilization Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029942 microperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008185 minitablet Substances 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 1
- 230000007996 neuronal plasticity Effects 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 230000035771 neuroregeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 201000005111 ocular hyperemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 description 1
- SONNWYBIRXJNDC-VIFPVBQESA-N phenylephrine Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=CC(O)=C1 SONNWYBIRXJNDC-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960001802 phenylephrine Drugs 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 201000007914 proliferative diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 239000012562 protein A resin Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004283 retinal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000880 retinal rod photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000007755 survival signaling Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229940074409 trehalose dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 102000015534 trkB Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010064880 trkB Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 108010002164 tyrosine receptor Proteins 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000006492 vascular dysfunction Effects 0.000 description 1
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N vinyl-ethylene Natural products C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Настоящее изобретение в целом относится к агонистическим антителам к TrkB для диагностического и терапевтического применения и в особенности к гуманизированным агонистическим антителам к TrkB. Более специфически, описаны агонистические антитела к TrkB и способы применения для лечения различных заболеваний или нарушений. Также описаны фармацевтические композиции и наборы, содержащие агонистическое антитело к TrkB.The present invention generally relates to anti-TrkB agonistic antibodies for diagnostic and therapeutic use, and in particular to humanized anti-TrkB agonistic antibodies. More specifically, anti-TrkB agonistic antibodies and methods of use for the treatment of various diseases or disorders are described. Pharmaceutical compositions and kits containing an anti-TrkB agonist antibody are also described.
Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for creating the invention
Тропомиозин-рецепторная киназа В (TrkB), также известная как тирозин-рецепторная киназа В, или рецептор BDNF/NT-3 факторов роста или нейротрофическая тирозинкиназа, рецептор, типа 2, представляет собой белок, который у людей кодируется геном NTRK2 (Genbank ID: 4915). TrkB представляет собой рецептор для нейротрофического фактора из тканей головного мозга (BDNF).Tropomyosin receptor kinase B (TrkB), also known as tyrosine receptor kinase B, or BDNF/NT-3 growth factor receptor or neurotrophic tyrosine kinase receptor type 2, is a protein that in humans is encoded by the NTRK2 gene (Genbank ID: 4915). TrkB is a receptor for brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
Нейротрофический тирозин-киназный рецептор В (TrkB; символ гена: NTRK2) экспрессируется нейронами сетчатки и глиальными клетками. В нормальной сетчатке, передача сигналов TrkB противодействует клеточному стрессу и способствует выживанию клеток. При заболеваниях глаза, таких как при диабетической ретинопатии или географической атрофии, происходит потеря и функциональные нарушения нейронов сетчатки и глиальных клеток, что вызывает нарушения зрения и потерю зрения. Активация передачи сигналов TrkB выше базального уровня (что уменьшено при диабетической ретинопатии), может противодействовать потере и функциональным нарушениям нейронов и глиальных клеток, улучшая, таким образом, зрительную функцию. Кроме того, активация TrkB имеют потенциал регенерировать потерю синаптических связей в больном глазу, таким образом способствуя восстановлению зрительной функции. При связывании лиганда, TrkB подвергается гомодимеризации с последующим аутофосфорилированием. В зависимости от сайтов фосфорилирования (Y516, Y702, Y706, Y707 или Y817) активируются различные пути передачи сигналов, включая активность PLCy1 или различных подформ AKT и ERK, которые регулируют различные перекрывающиеся каскады передачи сигналов, включая рост аксонов/нейритов, увеличение синаптической пластичности или увеличение выживания клеток.Neurotrophic tyrosine kinase receptor B (TrkB; gene symbol: NTRK2) is expressed by retinal neurons and glial cells. In the normal retina, TrkB signaling counteracts cellular stress and promotes cell survival. In eye diseases such as diabetic retinopathy or geographic atrophy, there is loss and functional impairment of retinal neurons and glial cells, causing visual disturbances and loss of vision. Activation of TrkB signaling above basal levels (which is reduced in diabetic retinopathy) may counteract the loss and functional impairment of neurons and glial cells, thereby improving visual function. In addition, activation of TrkB has the potential to regenerate lost synaptic connections in the diseased eye, thereby promoting the restoration of visual function. Upon ligand binding, TrkB undergoes homodimerization followed by autophosphorylation. Depending on the phosphorylation sites (Y516, Y702, Y706, Y707, or Y817), different signaling pathways are activated, including the activity of PLCy1 or different subforms of AKT and ERK, which regulate various overlapping signaling cascades, including axonal/neurite growth, increased synaptic plasticity, or increased cell survival.
Агонистические антитела к TrkB были описаны в US 20100196390 и US 20100150914, а также предложено их применение для лечения, например, болезни Шарко-Мари-Тута или диабета.Agonistic antibodies to TrkB have been described in US 20100196390 and US 20100150914, and their use has also been proposed for the treatment of, for example, Charcot-Marie-Tooth disease or diabetes.
Тем не менее, сохраняется значительная потребность в новых эффективных агонистических антителах к TrkB, которые можно применять для активирования TrkB пути и, таким образом, предоставляется возможность их применения для терапевтических вмешательств, например, при нейродегенеративных и психических расстройствах.However, there remains a significant need for new effective agonistic antibodies to TrkB that can be used to activate the TrkB pathway and thus offer the possibility of their application for therapeutic interventions, for example, in neurodegenerative and psychiatric disorders.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Настоящее изобретение обеспечивает моноклональные антитела, которые специфически связываться с TrkB человека. В одном аспекте, антитела согласно настоящему изобретению имеют агонистическую активность и индуцируют фосфорилирование и/или активацию TrkB. В другом аспекте, антитела согласно настоящему изобретению пригодны, например, для лечения заболеваний глаз и сетчатки, таких как, географическая атрофия, вызванная возрастной дегенерацией желтого пятна, диабетическая ретинопатия, глаукома и/или диабетический отек желтого пятна.The present invention provides monoclonal antibodies that specifically bind to human TrkB. In one aspect, the antibodies of the present invention have agonist activity and induce phosphorylation and/or activation of TrkB. In another aspect, the antibodies of the present invention are useful, for example, in the treatment of diseases of the eye and retina, such as geographic atrophy caused by age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, glaucoma and/or diabetic macular edema.
В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB, в особенности гуманизированное антитело к TrkB, имеющее одно или несколько свойств, описанных в настоящей заявке ниже.In another aspect, the present invention provides an anti-TrkB antibody, particularly a humanized anti-TrkB antibody, having one or more of the properties described herein below.
В другом аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывается с высокой аффинностью с TrkB человека. В одном варианте осуществления, относящемуся к этому аспекту, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывается с TrkB человека при KD<10 нМ. В другом варианте осуществления, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывается с TrkB человека при KD<5 нМ.In another aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention binds with high affinity to human TrkB. In one embodiment related to this aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention binds to human TrkB at a K D <10 nM. In another embodiment, the anti-TrkB antibody of the present invention binds to human TrkB with a KD <5 nM.
В другом аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению активирует TrkB с высокой эффективностью. В одном варианте осуществления, относящемуся к этому аспекту, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению активирует TrkB человека с ЕС50<100 пМ. В дальнейшем варианте осуществления, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению активирует TrkB человека с ЕС50<50 пМ.In another aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention activates TrkB with high efficiency. In one embodiment related to this aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention activates human TrkB with an EC 50 <100 pM. In a further embodiment, the anti-TrkB antibody of the present invention activates human TrkB with an EC 50 <50 pM.
В другом аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению является более эффективным для индуцирования активации нижерасположенных TrkB путей передачи сигналов по сравнению с природным TrkB лигандом, BDNF. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению регулирует экспрессию гена посредством TrkB-опосредованного пути передачи сигналов сопоставимым образом относительно BDNF.In another aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention is more effective at inducing activation of downstream TrkB signaling pathways compared to the natural TrkB ligand, BDNF. In a further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention regulates gene expression through the TrkB-mediated signaling pathway in a comparable manner to BDNF.
В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывает новый эпитоп во внеклеточном домене TrkB человека. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению перекрестно не реагирует с TrkB из других видов, в особенности перекрестно не реагирует с TrkB грызунов.In a further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention binds a novel epitope in the extracellular domain of human TrkB. In a further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention does not cross-react with TrkB from other species, and in particular does not cross-react with rodent TrkB.
В одном аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению может быть приготовлено в виде препарата в высоких концентрациях для интравитреальных инъекций в глаза.In one aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention can be formulated at high concentrations for intravitreal injection into the eye.
В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению имеет низкий риск иммуногенности, как измерено с помощью способа, описанного в примере 5.In a further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention has a low risk of immunogenicity as measured by the method described in Example 5.
- 1 043771- 1 043771
В другом аспекте, CDR последовательности антитела к TrkB согласно настоящему изобретению имеют низкие подверженности последовательностей, как определено с помощью способа, описанного в примере 4.In another aspect, the CDR sequences of the anti-TrkB antibody of the present invention have low sequence affinities as determined by the method described in Example 4.
В еще одном аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению не уменьшает BDNF индуцированное ERK фосфорилирование.In yet another aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention does not reduce BDNF-induced ERK phosphorylation.
В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению является специфическим для фосфорилирования и/или активации TrkB и неспецифически не фосфорилирует /не активирует TrkA или TrkC. В другом аспекте, антитело к TrkB не связывается неспецифически с VEGF человека.In a further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention is specific for phosphorylation and/or activation of TrkB and does not non-specifically phosphorylate/activate TrkA or TrkC. In another aspect, the anti-TrkB antibody does not bind nonspecifically to human VEGF.
Дальнейшие аспекты охватывают молекулу (ы) полинуклеотидов, кодирующие антитела согласно настоящему изобретению, экспрессионные векторы и вирусные векторы, а также клетки-хозяева, содержащие такую (ие) молекулу (ы) полинуклеотидов, и способы приготовления антител согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает терапевтические применения антител согласно настоящему изобретению, в особенности для заболеваний сетчатки/глаз.Further aspects include polynucleotide molecule(s) encoding antibodies of the present invention, expression vectors and viral vectors, as well as host cells containing such polynucleotide molecule(s), and methods for preparing antibodies of the present invention. The present invention further provides therapeutic applications of the antibodies of the present invention, particularly for retinal/eye diseases.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее (содержащий):In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:
вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48 (L-CDR1); аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 (L-CDR2); и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50 (L-CDR3); и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51 (H-CDR1); аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52 (H-CDR2); и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 (H-CDR3), или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55 (H-CDR1); аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56 (H-CDR2); и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57 (H-CDR3), или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 (H-CDR1); аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59 (H-CDR2); и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 (H-CDR3).a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 (L-CDR1); amino acid sequence SEQ ID NO: 49 (L-CDR2); and amino acid sequence SEQ ID NO: 50 (L-CDR3); and a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 (H-CDR1); amino acid sequence SEQ ID NO: 52 (H-CDR2); and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 (H-CDR3), or a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55 (H-CDR1); amino acid sequence SEQ ID NO: 56 (H-CDR2); and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57 (H-CDR3), or a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58 (H-CDR1); amino acid sequence SEQ ID NO: 59 (H-CDR2); and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 (H-CDR3).
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее (содержащий):In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:
вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 12, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 13, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 14, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 15, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 16, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 17, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 18, соответственно, вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 19, соответственно, или вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 20, соответственно.a variable light chain and a variable heavy chain comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 12, respectively, a variable light chain and a variable heavy chain comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 13, respectively, a variable light chain and a variable heavy chain comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 14, respectively, a variable light chain and a variable heavy chain comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 15, respectively, a variable light chain and a variable heavy chain comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 16, respectively, a variable light chain and a variable heavy chain comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 17, respectively, a variable light chain and a variable heavy chain comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 18, respectively, a variable light chain and a variable heavy chain comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 19, respectively, or a variable light chain and a variable heavy chain comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 20, respectively.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее (содержащий):In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:
легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 или 23, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 или 26, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28 или 29, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или 32, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 35, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 или 38, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и тяжелую цепь,a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or 23, a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 25 or 26, a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 or 29, a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and a heavy chain containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 31 or 32, a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 or 35, a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 or 38, a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, and a heavy chain,
- 2 043771 содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 или 41, легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43 или 44, или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46 или 47.- 2 043771 containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 40 or 41, a light chain containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 42, and a heavy chain containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 43 or 44, or a light chain containing the amino acid sequence SEQ ID NO: 45, and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 or 47.
В особенно предпочтительном варианте осуществления антитело к TrkB представляет собой гуманизированное антитело к TrkB.In a particularly preferred embodiment, the anti-TrkB antibody is a humanized anti-TrkB antibody.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в медицине.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof for medical use.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент для применения для лечения заболеваний сетчатки/глаз.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof for use in the treatment of retinal/ocular diseases.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент для применения для лечения заболеваний нейронного/неврального глаза или сетчатки.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof for use in the treatment of neuronal/neural eye or retinal diseases.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент для применения для лечения географической атрофии.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof for use in the treatment of geographic atrophy.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент для применения для лечения возрастной дегенерации желтого пятна или диабетической ретинопатии.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof for use in the treatment of age-related macular degeneration or diabetic retinopathy.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.In one embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент или фармацевтическую композицию, содержащую антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят с помощью парентерального пути, внутривенного пути, интравитреального пути или подкожного пути введения.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof, or a pharmaceutical composition comprising an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein said antibody or antigen-binding fragment thereof is administered via the parenteral route, intravenous route, intravitreal route, or subcutaneous route. .
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает выделенный(е) полинуклеотид или полинуклеотиды, содержащий(е) последовательность, кодирующую легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент и тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент.In one embodiment, the present invention provides isolated polynucleotide or polynucleotides comprising a sequence encoding a light chain or light chain variable region of an antibody or an antigen binding fragment thereof and a heavy chain or variable region of an antibody heavy chain or an antigen binding fragment thereof.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает экспрессионный вектор, содержащий выделенный(е) полинуклеотид или полинуклеотиды, кодирующий(е) легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент и тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент.In one embodiment, the present invention provides an expression vector containing isolated polynucleotide or polynucleotides encoding a light chain or light chain variable region of an antibody or an antigen binding fragment thereof and a heavy chain or variable region of an antibody heavy chain or an antigen binding fragment thereof.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает вирусный вектор, содержащий выделенный(е) полинуклеотид или полинуклеотиды, кодирующий(е) легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент и тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент.In one embodiment, the present invention provides a viral vector containing isolated polynucleotide or polynucleotides encoding a light chain or light chain variable region of an antibody or an antigen binding fragment thereof and a heavy chain or variable region of an antibody heavy chain or an antigen binding fragment thereof.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает клетку-хозяин, содержащую экспрессионный вектор или выделенный(е) полинуклеотид или полинуклеотиды, кодирующий(е) легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент и тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент.In one embodiment, the present invention provides a host cell containing an expression vector or isolated polynucleotide or polynucleotides encoding a light chain or light chain variable region of an antibody or an antigen binding fragment thereof and a heavy chain or heavy chain variable region of an antibody or its antigen-binding fragment.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает способ получения антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий:In one embodiment, the present invention provides a method for producing an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising:
получение клетки-хозяина, содержащей экспрессионный вектор или выделенный(е) полинуклеотид или полинуклеотиды, кодирующий(е) легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент и тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент; и культивирование клетки-хозяина.obtaining a host cell containing an expression vector or isolated polynucleotide or polynucleotides encoding a light chain or light chain variable region of an antibody or an antigen binding fragment thereof and a heavy chain or variable region of an antibody heavy chain or an antigen binding fragment thereof; and culturing the host cell.
В одном варианте осуществления, способ получения антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента дополнительно включает восстановление и очистку антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента.In one embodiment, a method of producing an anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof further comprises reconstituting and purifying the anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112, 130-143 и/или 205-219 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to at least one amino acid residue within amino acid regions 92-112, 130-143 and/or 205-219 of the extracellular domain of human TrkB with sequence SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112 и 130-143; или 92-112 и 205-219; или 130-143 и 205-219; или 92-112 и 130-143 и 205-219 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to at least one amino acid residue within the amino acid regions 92-112 and 130-143; or 92-112 and 205-219; or 130-143 and 205-219; or 92-112 and 130-143 and 205-219 of the extracellular domain of human TrkB with the sequence SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или егоIn one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or
- 3 043771 антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах любой из вышеуказанных комбинаций и дополнительно также с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 313-330 и/или 348-367 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.- 3 043771 antigen-binding fragment, which binds to at least one amino acid residue within any of the above combinations and additionally also to at least one amino acid residue within amino acid regions 313-330 and/or 348-367 of the TrkB extracellular domain human with the sequence SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112, 130-143, 205-219, 313-330 и 348-367 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to at least one amino acid residue within the amino acid regions 92-112, 130-143, 205-219, 313-330, and 348- 367 extracellular domain of human TrkB with the sequence SEQ ID NO: 54.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
Фиг. 1. Картирование эпитопов BDNF, 277-антитела, С2 или С20 антител к внеклеточному домену TrkB человека.Fig. 1. Epitope mapping of BDNF, 277 antibody, C2 or C20 antibodies to the extracellular domain of human TrkB.
Фиг. 2. Данные кПЦР экспрессии (ось Y) для регулируемых генов (ось X) по отношению к синаптической пластичности на SH-SY5Y клетках после обработки с применением BDNF, контроль IgG1 (анти-2,4,6-тринитрофенил, анти-TNP) или D003 антитело.Fig. 2. qPCR expression data (Y-axis) for regulated genes (X-axis) in relation to synaptic plasticity on SH-SY5Y cells after treatment with BDNF, IgG1 control (anti-2,4,6-trinitrophenyl, anti-TNP) or D003 antibody.
Фиг. 3. График концентрации 277-антитела в компартментах глаза, как указано, и плазме после ивт инъекции 1 мг 277-антитела в глаза кроликам в зависимости от времени.Fig. 3. Graph of the concentration of 277-antibody in the eye compartments, as indicated, and plasma after intravenous injection of 1 mg of 277-antibody into the eyes of rabbits depending on time.
Фиг. 4. Рассчитанная глазная ФК IgG1 антител. На оси Y показано витреальная концентрация и на оси X дни после ивт применения. Время после ивт инъекции для достижения витреальной концентрации, эквивалентной EC50, указано стрелками.Fig. 4. Calculated ocular PK of IgG1 antibodies. The Y-axis shows the vitreal concentration and the X-axis shows the days after IVT application. The time after intravenous injection to achieve a vitreal concentration equivalent to EC 50 is indicated by arrows.
Фиг. 5. Общая схема исследования, включая группы животных и временную динамику. В неделю 5, осуществляли оценку исходной ЭРГ (до ивт применения) для определения степени индуцированной гипергликемией нейронной дисфункции в сетчатке. Группа 1 и Группа 2 получали ивт инъекции IgG1 контрольного антитела к 2,4,6-тринитрофенилу (анти-TNP), которое не вызывает каких-либо эффектов на функцию сетчатки. Глаза группы 3 лечили с применением С2 (анти-TrkB агонистическое суррогатное антитело). Функцию сетчатки снова оценивали в неделю 7 (после ивт).Fig. 5. General design of the study, including groups of animals and time dynamics. At week 5, a baseline ERG (before IVT administration) was assessed to determine the extent of hyperglycemia-induced neural dysfunction in the retina. Group 1 and Group 2 received intravenous injections of an IgG1 control antibody to 2,4,6-trinitrophenyl (anti-TNP), which does not cause any effects on retinal function. Group 3 eyes were treated with C2 (an anti-TrkB agonist surrogate antibody). Retinal function was assessed again at week 7 (post-IRT).
Фиг. 6. Изменения латентности опосредованной палочками b-волны относительно средней латентности контрольной группы, на исходном уровне (до ивт) и через 1 неделю после ивт введения (см. фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=23 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (обозначенные точками, n=21 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=24 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).Fig. 6. Changes in rod-mediated b-wave latency relative to the average latency of the control group, at baseline (before IVT) and 1 week after IVT administration (see Fig. 5 for the general study design). Nondiabetic control group 1 (black, n=23 eyes studied) and hyperglycemic group 2 (indicated by dots, n=21 eyes studied) received IVT injections using control IgG1. Group 3 received IVT treatment using C2 (n=24 eyes studied). Data are mean + ATP. nd, unreliable; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; the differences before IVT between hyperglycemic groups 2 and 3 and control group 1 are significant (statistical data are not shown conventionally; one-way analysis of variance with Tukey’s multiple comparison test).
Фиг. 7. Светочувствительности, S, опосредованых палочками b-волн, нормированные к средним светочувствительностям контрольной группы, S контроль, на исходном уровне (до ивт) или через 1 неделю после ивт введения (см. фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=23 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (красные, n=20 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=24 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).Fig. 7. Photosensitivity, S, mediated by rod b-waves, normalized to the average photosensitive sensitivity of the control group, S control , at baseline (before IVT) or 1 week after IVT administration (see Fig. 5 regarding the general study design). Nondiabetic control group 1 (black, n=23 eyes studied) and hyperglycemic group 2 (red, n=20 eyes studied) received IVT injections using control IgG1. Group 3 received IVT treatment using C2 (n=24 eyes studied). Data are mean + ATP. nd, unreliable; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; the differences before IVT between hyperglycemic groups 2 and 3 and control group 1 are significant (statistical data are not shown conventionally; one-way analysis of variance with Tukey’s multiple comparison test).
Фиг. 8. Ответы опосредованной палочками а-волны, вызванные вспышкой света 0,1 кдс/м2, R, нормированные к среднему ответу контролей, на исходном уровне (до ивт) или через 1 неделю после ивт введения (см. фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=23 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (красные, n=20 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=24 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).Fig. 8. Rod-mediated a-wave responses evoked by a light flash of 0.1 cds/m 2 , R, normalized to the average response of controls, at baseline (before IVT) or 1 week after IVT administration (see Fig. 5 for overall research design). Nondiabetic control group 1 (black, n=23 eyes studied) and hyperglycemic group 2 (red, n=20 eyes studied) received IVT injections using control IgG1. Group 3 received IVT treatment using C2 (n=24 eyes studied). Data are mean + ATP. nd, unreliable; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; the differences before IVT between hyperglycemic groups 2 and 3 and control group 1 are significant (statistical data are not shown conventionally; one-way analysis of variance with Tukey’s multiple comparison test).
Фиг. 9. Изменения латентности УФ опосредованной колбочками b-волны относительно средней латентности контрольной группы, на исходном уровне (до ивт) и через 1 неделю после ивт введения (см. фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=24 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (красные, n=22 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=24 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).Fig. 9. Changes in the latency of the UV cone-mediated b-wave relative to the average latency of the control group, at baseline (before IVT) and 1 week after IVT administration (see Fig. 5 for the general design of the study). Nondiabetic control group 1 (black, n=24 eyes studied) and hyperglycemic group 2 (red, n=22 eyes studied) received IVT injections using control IgG1. Group 3 received IVT treatment using C2 (n=24 eyes studied). Data are mean + ATP. nd, unreliable; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; the differences before IVT between hyperglycemic groups 2 and 3 and control group 1 are significant (statistical data are not shown conventionally; one-way analysis of variance with Tukey’s multiple comparison test).
Фиг. 10. Изменения латентности опосредованной колбочками М-типа b-волны относительно сред- 4 043771 ней латентности контрольной группы, на исходном уровне (до ивт) и через 1 неделю после ивт введения (см. фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=24 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (красные, n=22 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=24 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).Fig. 10. Changes in the latency of the M-type cone-mediated b-wave relative to the average latency of the control group, at baseline (before IVT) and 1 week after IVT administration (see Fig. 5 for the general study design). Nondiabetic control group 1 (black, n=24 eyes studied) and hyperglycemic group 2 (red, n=22 eyes studied) received IVT injections using control IgG1. Group 3 received IVT treatment using C2 (n=24 eyes studied). Data are mean + ATP. nd, unreliable; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; the differences before IVT between hyperglycemic groups 2 and 3 and control group 1 are significant (statistical data are not shown conventionally; one-way analysis of variance with Tukey’s multiple comparison test).
Фиг. 11. Светочувствительности, S, УФ опосредованных колбочками b-волн, нормированные к средним светочувствительностям контрольных групп, S контроль, на исходном уровне (до ивт) или через 1 неделю после ивт введения (см. Фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=22 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (красные, n=22 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=21 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).Fig. 11. Photosensitivities, S, UV of cone-mediated b-waves, normalized to the average photosensitive sensitivities of the control groups, S control , at baseline (before IVT) or 1 week after IVT administration (see Fig. 5 for the general study design). Nondiabetic control group 1 (black, n=22 eyes studied) and hyperglycemic group 2 (red, n=22 eyes studied) received IVT injections using control IgG1. Group 3 received IVT treatment using C2 (n=21 eyes studied). Data are mean + ATP. nd, unreliable; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; the differences before IVT between hyperglycemic groups 2 and 3 and control group 1 are significant (statistical data are not shown conventionally; one-way analysis of variance with Tukey’s multiple comparison test).
Фиг. 12. Амплитуды насыщающих колебаний, Rmax, опосредованных колбочками М-типа b-волн, нормированные к средней амплитуда насыщающих колебаний контролей, Rmax, контроль, на исходном уровне (до ивт) или через 1 неделю после ивт введения (см. фиг. 5 относительно общей схемы исследования). Недиабетическая контрольная группа 1 (черные, n=24 исследованных глаз) и гипергликемическая группа 2 (красные, n=22 исследованных глаз) получали ивт инъекции с применением контрольного IgG1. Группа 3 получала ивт лечение с применением С2 (n=24 исследованных глаз). Данные представляют собой среднее значение + СПС. нд, недостоверно; *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; отличия до ивт между гипергликемическими группами 2 и 3 и контрольной группой 1 являются достоверными (статистические данные условно не показаны; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения Тьюки).Fig. 12. Amplitudes of saturating oscillations, Rmax , mediated by M-type cone b-waves, normalized to the average amplitude of saturating oscillations of controls, Rmax , control , at baseline (before IVT) or 1 week after IVT administration (see Fig. 5 regarding the general design of the study). Nondiabetic control group 1 (black, n=24 eyes studied) and hyperglycemic group 2 (red, n=22 eyes studied) received IVT injections using control IgG1. Group 3 received IVT treatment using C2 (n=24 eyes studied). Data are mean + ATP. nd, unreliable; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; the differences before IVT between hyperglycemic groups 2 and 3 and control group 1 are significant (statistical data are not shown conventionally; one-way analysis of variance with Tukey’s multiple comparison test).
Фиг. 13. ERK-фосфорилирование в СНО клетках, экспрессирующих рецептор TrkB человека после стимуляции с применением (A) BDNF, 277-антитела, или комбинации 1 нМ BDNF с возрастающими концентрациями 277-антитела или (В) BDNF, C2 антитела, или комбинации 1 нМ BDNF с возрастающими концентрациями С2-антитела. Данные (символы) представлены в виде средних значений ± СПС (для некоторых точек, усы погрешностей являются более короткими, чем высота символа); соединительные линии отображают нелинейную регрессию (лог(агонист) отн. ответа (три параметра)). Показан один из репрезентативных примеров из серии из трех экспериментов с независимыми клеточными партиями; н.д., недостоверное отличие между 1 нМ BDNF отдельно и 1 нМ BDNF с указанными концентрациями 277-антитела. #р<0,001 1 нМ BDNF отдельно отн. 1 нМ BDNF с указанными концентрациями С2антитела; однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественного сравнения.Fig. 13. ERK phosphorylation in CHO cells expressing the human TrkB receptor after stimulation with (A) BDNF, 277 antibody, or a combination of 1 nM BDNF with increasing concentrations of 277 antibody or (B) BDNF, C2 antibody, or a combination of 1 nM BDNF with increasing concentrations of C2 antibody. Data (symbols) are presented as means ± SES (for some points, the error bars are shorter than the height of the symbol); connecting lines represent nonlinear regression (log(agonist) vs. response (three parameters)). One representative example from a series of three experiments with independent cell batches is shown; n.d., non-significant difference between 1 nM BDNF alone and 1 nM BDNF with the indicated concentrations of 277 antibody. #p<0.001 1 nM BDNF separately rel. 1 nM BDNF with the indicated concentrations of C2 antibody; one-way analysis of variance with multiple comparison test.
Фиг. 14. Связывание 277-антитела или С2 антитела с VEGF человека или крысы в in vitro ELISA анализе. Данные (символы) представлены в виде средних значений ± СПС (примечание: усы погрешностей являются более короткими, чем высота символа); соединительные линии отображают нелинейную регрессию (лог(агонист) отн. ответа (три параметра)). Показан один из репрезентативных примеров из серии из пяти независимых экспериментов. #р<0,01 hVEGF-C2 отн. hVEGF-Изотип IgG1 при указанных концентрациях (критерий Стьюдента для одной выборки).Fig. 14. Binding of 277 antibody or C2 antibody to human or rat VEGF in an in vitro ELISA assay. Data (symbols) are presented as means ± SAR (note: error bars are shorter than symbol height); connecting lines represent nonlinear regression (log(agonist) vs. response (three parameters)). One representative example from a series of five independent experiments is shown. #p<0.01 hVEGF-C2 rel. hVEGF-IgG1 isotype at the indicated concentrations (one-sample t test).
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
ОпределенияDefinitions
Общая структура антител или иммуноглобулина хорошо известна специалистам в данной области, эти молекулы представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины, как правило с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь ковалентно связана с тяжелой цепью с помощью одной дисульфидной связи с образованием гетеродимера, и гетеротримерная молекула образуется посредством ковалентной дисульфидной связи между двумя идентичными тяжелыми цепями гетеродимеров. Хотя легкие и тяжелые цепи связаны с помощью одной дисульфидной связи, количество дисульфидных связей между двумя тяжелыми цепями варьируется в зависимости от изотипа иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь имеет также равномерно распределенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет аминоконцевую вариабельную область (VH=вариабельная тяжелая цепь), за которой расположены три или четыре константных домена (CH1, CH2, CH3 и CH4), а также шарнирный участок между CH1 и CH2. Каждая легкая цепь имеет две области, аминоконцевую вариабельную область (VL=вариабельная легкая цепь) и карбоксиконцевый константный домен (CL). VL-область нековалентно связана с VH-областью, а CL-домен, как правило, ковалентно связаний с CH1-доменом через дисульфидную связь. Вероятно, определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными областями легких и тяжелых цепей (Chothia и др., J. Mol. Biol. 186, 1985, cc. 651-663).The general structure of antibodies or immunoglobulins is well known to those skilled in the art; these molecules are heterotetrameric glycoproteins, typically with a molecular weight of approximately 150,000 Daltons, consisting of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Each light chain is covalently linked to a heavy chain by a single disulfide bond to form a heterodimer, and a heterotrimeric molecule is formed by a covalent disulfide bond between two identical heterodimer heavy chains. Although the light and heavy chains are linked by a single disulfide bond, the number of disulfide bonds between the two heavy chains varies depending on the immunoglobulin isotype. Each heavy and light chain also has evenly distributed intrachain disulfide bridges. Each heavy chain has an amino-terminal variable region ( VH =variable heavy chain), followed by three or four constant domains ( CH1 , CH2 , CH3 and CH4 ), as well as a hinge region between CH1 and CH2 . Each light chain has two regions, an amino-terminal variable region (V L =variable light chain) and a carboxy-terminal constant domain ( CL ). The V L region is non-covalently linked to the VH region, and the CL domain is usually covalently linked to the C H1 domain through a disulfide bond. It is likely that certain amino acid residues form the interface between the variable regions of the light and heavy chains (Chothia et al., J. Mol. Biol. 186, 1985, pp. 651-663).
- 5 043771- 5 043771
Определенные участки в вариабельных областях значительно различаются у различных антител, т.е. они являются гипервариабельными. Эти гипервариабельные участки содержат остатки, которые непосредственно участвуют в связывании и определяют специфичность каждого конкретного антитела в отношении специфической для него антигенной детерминанты. Гипервариабельность в вариабельных областях, как легкой цепи, так и тяжелой цепи, концентрируется в трех сегментах, которые обозначают как определяющие комплементарность участки (гипервариабельные участки) (CDR) или гипервариабельные петли (HVL). CDR определяют путем сравнения последовательностей согласно методу, описанному у Kabat и др., в: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991, a HVL структурно определяют на основе трехмерной структуры вариабельной области согласно методу, описанному у Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917. Если эти два метода приводят к некоторым различиям при идентификации CDR, то предпочтительным является определение на основе структуре. Согласно номенклатуре Кэбота CDR-L1 расположен примерно на остатках 24-34, CDR-L2 примерно на остатках 50-56 и CDR-L3 примерно на остатках 89-97 в вариабельной области легкой цепи; CDR-H1 расположен примерно на остатках 31-35, CDR-H2 примерно на остатках 50-65 и CDR-H3 примерно на остатках 95-102 в вариабельной области тяжелой цепи. Таким образом, CDR1, CDR2, CDR3 тяжелых и легких цепей определяют уникальные и функциональные свойства, специфические для данного антитела.Certain regions in the variable regions vary significantly among different antibodies, i.e. they are hypervariable. These hypervariable regions contain residues that are directly involved in binding and determine the specificity of each particular antibody with respect to its specific antigenic determinant. Hypervariability in the variable regions, both light chain and heavy chain, is concentrated in three segments, which are designated as complementarity determining regions (hypervariable regions) (CDR) or hypervariable loops (HVL). CDRs are determined by sequence comparison according to the method described by Kabat et al., in: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991, a HVL is structurally determined based on the three-dimensional structure of the variable region according to the method described by Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917. If the two methods result in some differences in identifying CDRs, then structure-based identification is preferred. According to Cabot nomenclature, CDR-L1 is located at approximately residues 24-34, CDR-L2 at approximately residues 50-56, and CDR-L3 at approximately residues 89-97 in the light chain variable region; CDR-H1 is located at approximately residues 31-35, CDR-H2 at approximately residues 50-65, and CDR-H3 at approximately residues 95-102 in the heavy chain variable region. Thus, CDR1, CDR2, CDR3 of the heavy and light chains determine unique and functional properties specific to a given antibody.
Три CDR в каждой из тяжелых и легких цепей разделены каркасными участками (FR), которые содержат последовательности, в меньшей степени имеющие тенденцию к вариабельности. Начиная с аминоконца по направлению к карбоксиконцу вариабельных областей тяжелых и легких цепей FR и CDR упорядочены следующим образом: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В значительной степени βскладчатая конформация FR позволяет CDR в каждой из цепей находиться в непосредственной близости друг с другом, а также с CDR из другой цепи. Полученная конформация присуща антигенсвязывающему центру (см. Kabat и др., NIH Publ. № 91-3242, т. I, 1991, сс. 647-669), хотя не является необходимым условие, чтобы все остатки CDR непосредственно участвовали в связывании антигена.The three CDRs in each of the heavy and light chains are separated by framework regions (FRs) that contain sequences that are less prone to variability. Starting from the amino terminus towards the carboxy terminus, the variable regions of the heavy and light chains of the FRs and CDRs are ordered as follows: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4. The largely β-sheet conformation of FR allows the CDRs on each strand to be in close proximity to each other, as well as to the CDRs from the other strand. The resulting conformation is inherent to the antigen-binding site (see Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, vol. I, 1991, pp. 647-669), although it is not necessary that all CDR residues directly participate in antigen binding.
Остатки FR и константные домены Ig не вовлечены непосредственно в связывание антигена, но участвуют в связанной с антигеном и/или опосредуемой антигеном эффекторной функции. Некоторые остатки FR, вероятно, оказывают выраженное воздействие на связывание антигена по меньшей мере тремя путями: путем нековалентного связывания непосредственно с эпитопом, путем взаимодействия с одним или несколькими остатками CDR и путем влияния на поверхность раздела между тяжелыми и легкими цепями. Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антигена, но опосредуют различные эффекторные функции Ig, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), комплементзависимой цитотоксичности (CDC) и антителозависимом клеточном фагоцитозе (ADCP).The FR residues and Ig constant domains are not directly involved in antigen binding, but are involved in antigen-associated and/or antigen-mediated effector function. Some FR residues are likely to have a profound effect on antigen binding in at least three ways: by noncovalently binding directly to the epitope, by interacting with one or more CDR residues, and by influencing the interface between the heavy and light chains. Constant domains are not directly involved in antigen binding, but mediate various Ig effector functions, such as antibody involvement in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), complement-dependent cytotoxicity (CDC), and antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP).
Легкие цепи иммуноглобулинов позвоночных животных относят к одному или двух четко различимых классов, каппа (к) и лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности константного домена. Для сравнения, тяжелые цепи иммуноглобулинов млекопитающих относятся к одному из пяти основных классов с учетом последовательности константных доменов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. IgG и IgA дополнительно подразделяют на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2, соответственно. Константные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации классов нативных иммуноглобулинов хорошо известны.The light chains of vertebrate immunoglobulins are classified into one or two distinct classes, kappa (k) and lambda (λ), based on the amino acid sequence of the constant domain. By comparison, mammalian immunoglobulin heavy chains fall into one of five major classes based on the sequence of constant domains: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM. IgG and IgA are further divided into subclasses (isotypes), for example, IgG1, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgA1 and IgA2 , respectively. The heavy chain constant domains that correspond to different classes of immunoglobulins are designated α, δ, ε, γ, and μ, respectively. The subunit structures and three-dimensional configurations of native immunoglobulin classes are well known.
В контексте настоящего описания понятия антитело, антитело к TrkB, гуманизированное антитело к TrkB и вариант гуманизированного антитела к TrkB применяют в наиболее широком смысле, и они относятся, в частности, к моноклональным антителам (включая полноразмерные моноклональные антитела), мультиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам), антителам с незначительными модификациями, такими как N- или С-концевые усечения, и фрагментам антител, таким как вариабельные области и другие участки антител, которые обладают требуемой биологической активностью, например, способностью связываться с TrkB.As used herein, the terms antibody, anti-TrkB antibody, humanized anti-TrkB antibody, and humanized anti-TrkB antibody variant are used in their broadest sense and refer, in particular, to monoclonal antibodies (including full-length monoclonal antibodies), multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies), antibodies with minor modifications, such as N- or C-terminal truncations, and antibody fragments, such as variable regions and other regions of antibodies, that have the desired biological activity, such as the ability to bind to TrkB.
Понятие моноклональное антитело (mAb) относится к антителу из популяции практически гомогенных антител; т.е. индивидуальные антитела в указанной популяции являются идентичными за исключением встречающихся в естественных условиях мутаций, которые могут присутствовать в очень небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, их мишенью является индивидуальная антигенная детерминанта, эпитоп. Таким образом, прилагательное моноклональные является отличительным признаком практически гомогенной популяции антител, мишенью которых является идентичный эпитоп, и понятие не ограничено требованием к получению антител с помощью какого-либо конкретного метода. Должно быть очевидно, что моноклональные антитела можно получать с помощью любой техники или методологии, известной в данной области; включая, например, метод гибридом (Kohler и др., Nature 256, 1975, с. 495), или методы рекомбинантной ДНК, известные в данной области (см., например, US 4816567), или методы выделения моноклональных полученных с помощью рекомбинантной ДНК антител с использованием фаговых библиотек антител, которые описаны уThe term monoclonal antibody (mAb) refers to an antibody from a population of essentially homogeneous antibodies; those. Individual antibodies in a given population are identical except for naturally occurring mutations, which may be present in very small quantities. Monoclonal antibodies are highly specific; their target is an individual antigenic determinant, an epitope. Thus, the adjective monoclonal is a distinctive feature of a substantially homogeneous population of antibodies that are targeted by an identical epitope, and the concept is not limited to the requirement that the antibodies be produced by any particular method. It should be obvious that monoclonal antibodies can be obtained using any technique or methodology known in the art; including, for example, the hybridoma method (Kohler et al., Nature 256, 1975, p. 495), or recombinant DNA methods known in the art (see, for example, US 4816567), or methods for isolating monoclonal ones obtained using recombinant DNA antibodies using phage antibody libraries that are described in
- 6 043771- 6 043771
Clackson и др., Nature 352, 1991, сс. 624-628 и у Marks и др., J. Mol. Biol. 222, 1991, сс. 581-597.Clackson et al., Nature 352, 1991, pp. 624-628 and Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 1991, pp. 581-597.
Химерные антитела состоят из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антител из одного вида (например, из млекопитающего кроме человека, такого как мышь) и константных областей легкой и тяжелой цепи антитела из других видов (например, человека), и их можно получать путем соединения последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области антитела из первого вида (например, мыши), с последовательностями ДНК константных областей антитела из второго вида (например, человека), и трансформации хозяина экспрессионным вектором, содержащим связанные последовательности, что позволяет хозяину продуцировать химерное антитело. В альтернативном варианте химерное антитело может также представлять собой антитело, в котором одна или несколько областей или доменов тяжелой и/или легкой цепи идентичны, гомологичны или являются вариантом соответствующей последовательности в моноклональном антителе из другого класса или изотипа иммуноглобулина или из консенсусной последовательности или последовательности зародышевой линии. Химерные антитела могут включать фрагменты указанных антител при условии, что фрагмент антитела обладает требуемой биологической активностью родительского антитела, например способностью связываться с одним и тем же эпитопом (см., например, US 4816567; и Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc. 6851-6855).Chimeric antibodies consist of the heavy and light chain variable regions of antibodies from one species (eg, from a non-human mammal, such as a mouse) and the light and heavy chain constant regions of antibodies from another species (eg, human), and can be made by joining sequences DNA encoding antibody variable regions from a first species (eg, mouse), with DNA sequences of antibody constant regions from a second species (eg, human), and transforming the host with an expression vector containing the related sequences, allowing the host to produce the chimeric antibody. Alternatively, a chimeric antibody may also be an antibody in which one or more heavy and/or light chain regions or domains are identical to, homologous to, or a variant of the corresponding sequence in a monoclonal antibody from another immunoglobulin class or isotype or from a consensus or germline sequence . Chimeric antibodies can include fragments of these antibodies, provided that the antibody fragment has the desired biological activity of the parent antibody, such as the ability to bind to the same epitope (see, for example, US 4816567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, pp. 6851-6855).
Понятия фрагмент антитела, антигенсвязывающий фрагмент, фрагмент антитела к TrkB, фрагмент гуманизированного антитела к TrkB и фрагмент варианта гуманизированного антитела к TrkB относятся к части полноразмерного антитела к TrkB, в котором сохраняется вариабельная область или ее функциональная способность, например, специфичность связывания с эпитопом TrkB. Примерами фрагментов антител являются (но, не ограничиваясь только ими) Fab-, Fab'-, F(ab')2-, Fd-, Fv-, scFv- и scFv-Fc-фрагмент, димерное антитело (диабоди), линейное антитело, одноцепочечное антитело, минитело, димерное антитело, образованное из фрагментов антитела, и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.The terms antibody fragment, antigen-binding fragment, anti-TrkB antibody fragment, humanized anti-TrkB antibody fragment, and humanized anti-TrkB antibody variant fragment refer to the portion of a full-length anti-TrkB antibody that retains the variable region or its functional ability, e.g., binding specificity to a TrkB epitope. Examples of antibody fragments include (but are not limited to) Fab-, Fab'-, F(ab')2-, Fd-, Fv-, scFv- and scFv-Fc fragment, dimeric antibody (diabody), linear antibody , single chain antibody, minibody, dimeric antibody formed from antibody fragments, and multispecific antibodies formed from antibody fragments.
Полноразмерные антитела можно обрабатывать ферментами, такими как папаин или пепсин, с получением требуемых фрагментов антител. Расщепление папаином применяют для получения двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, которые называют Fab-фрагментами, каждый с одним антигенсвязывающим центром, при этом оставшуюся часть обозначают как Fc-фрагмент. Fab-фрагмент содержит также константный домен легкой цепи и CH1-домен тяжелой цепи. После обработки пепсином получают F(ab')2-фрагмент, который несет два антигенсвязывающих центра и все еще сохраняет способность к перекрестному сшиванию с антигеном.Full-length antibodies can be treated with enzymes such as papain or pepsin to produce the desired antibody fragments. Papain digestion is used to produce two identical antigen-binding fragments, called Fab fragments, each with one antigen-binding site, with the remainder designated the Fc fragment. The Fab fragment also contains a light chain constant domain and a heavy chain C H1 domain. After treatment with pepsin, an F(ab') 2 fragment is obtained, which carries two antigen-binding centers and still retains the ability to cross-link with antigen.
Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов присутствием дополнительных остатков, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела на С-конце CH1-домена. F(ab')2фрагменты антител представляют собой пары Fab'-фрагментов, связанных с помощью остатков цистеина в шарнирной области. Известны другие химические сочетания фрагментов антител.Fab' fragments differ from Fab fragments by the presence of additional residues, including one or more cysteine residues from the antibody hinge region at the C-terminus of the C H1 domain. F(ab') 2 antibody fragments are pairs of Fab' fragments linked via cysteine residues in the hinge region. Other chemical combinations of antibody fragments are known.
Fv-фрагмент содержит полный антиген-распознающий и антиген-связывающий центр, состоящий из димера, включающего вариабельную область одной тяжелой и одной легкой цепи в тесной нековалентной ассоциации. В этой конфигурации три CDR каждой вариабельной области взаимодействуют с определенным антигенсвязывающим центром на поверхности димера VH-VL. В целом, шесть CDR обусловливают специфичность антитела в отношении связывания антигена.The Fv fragment contains a complete antigen recognition and antigen binding center, consisting of a dimer including the variable region of one heavy and one light chain in close non-covalent association. In this configuration, the three CDRs of each variable region interact with a specific antigen binding site on the surface of the VH-V L dimer. In general, six CDRs determine the specificity of an antibody for antigen binding.
Одноцепочечный Fv или scFv-фрагмент антитела представляет собой одноцепочечный Fvвариант, содержащий VH- и VL-области антитела, при этом области присутствуют в одной полипептидной цепи. Одноцепочечный Fv обладает способностью распознавать антиген и связываться с ним. Полипептид scFv необязательно может содержать также полипептидный линкер, расположенный между VH- и VL-областями для облегчения образования трехмерной структуры, требуемой для связывания антигена с помощью scFv (см., например, Pluckthun, в: The Pharmacology of monoclonal Antibodies, т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, 1991, cc. 269-315).A single chain Fv or scFv antibody fragment is a single chain Fv variant containing the VH and VL regions of the antibody, the regions being present on the same polypeptide chain. Single-chain Fv has the ability to recognize and bind to antigen. The scFv polypeptide may optionally also contain a polypeptide linker located between the VH and VL regions to facilitate the formation of the three-dimensional structure required for antigen binding by the scFv (see, for example, Pluckthun, in: The Pharmacology of monoclonal Antibodies, vol. 113, edited by Rosenburg and Moore, Springer-Verlag, New York, 1991, pp. 269-315).
Другие обладающие способностью к распознаванию фрагменты антител включают фрагменты, которые содержат пару расположенных в виде тандема Fd-сегментов (VH-CH1-VH-CH1), образующих пару антигенсвязывающих участков. Указанные линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими, что описано, например, у Zapata и др., Protein Eng. 8(10), 1995, cc. 1057-1062.Other recognition capable antibody fragments include fragments that contain a pair of tandem Fd segments (V H -C H1 -V H -C H1 ) forming a pair of antigen binding sites. These linear antibodies can be bispecific or monospecific, as described, for example, in Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1995, cc. 1057-1062.
Гуманизированное антитело или фрагмент гуманизированного антитела представляет собой специфический тип химерного антитела, которое включает вариант аминокислотной последовательности иммуноглобулина или его фрагмента, который обладает способностью связываться с предварительно определенным антигеном и который содержит один или несколько FR, который(ые) имеет(ют) аминокислотную последовательность, практически соответствующую последовательности человеческого иммуноглобулина, и один или несколько CDR, который(ые) имеет(ют) аминокислотную последовательность, которая практически соответствует аминокислотной последовательности нечеловеческого иммуноглобулина. Указанную нечеловеческую аминокислотную последовательность, которую часто обозначают как импортная последовательность, как правило, получают из импортной области антитела, в частности, вариабельной области. В целом, гуманизированное антитело включает по меньшей мере CDR или HVL нечеловеческого антитела, встроенные между FR вариабельного домена человеческой тяжелой или легкой цепи.A humanized antibody or humanized antibody fragment is a specific type of chimeric antibody that includes a variant amino acid sequence of an immunoglobulin or fragment thereof that has the ability to bind to a predetermined antigen and that contains one or more FRs that have the amino acid sequence substantially corresponding to the sequence of a human immunoglobulin, and one or more CDRs that have(s) an amino acid sequence that substantially matches the amino acid sequence of a non-human immunoglobulin. Said non-human amino acid sequence, often referred to as an import sequence, is typically derived from the import region of an antibody, in particular the variable region. In general, a humanized antibody includes at least a CDR or HVL of a non-human antibody inserted between the FRs of a human heavy or light chain variable domain.
- 7 043771- 7 043771
Настоящее изобретение описаны специфические гуманизированные антитела к TrkB, которые содержат CDR, полученные из мышиного лидерного D003, встроенные между FR последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепи человеческой зародышевой линии. Должно быть очевидно, что определенные остатки мышиного FR можно импортировать для обеспечения функции гуманизированных антител, и следовательно, определенные остатки последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепи человеческой зародышевой линии модифицируют для того, чтобы они были такими же как в соответствующей мышиной последовательности.The present invention describes specific humanized antibodies to TrkB that contain CDRs derived from the murine leader D003 inserted between the FR sequences of the human germline heavy and light chain variable regions. It will be apparent that certain residues of the murine FR can be imported to provide the function of humanized antibodies, and therefore certain residues of the human germline heavy and light chain variable region sequences are modified to be the same as in the corresponding murine sequence.
В одном аспекте, гуманизированное антитело к TrkB содержит практически все из по меньшей мере одной и, как правило, двух вариабельных областей (таких, например, как входящие в Fab-, Fab'-, F(ab')2-, Fabc- и Fv-фрагменты), в которых все или практически все CDR соответствуют CDR нечеловеческих иммуноглобулинов, и согласно настоящему изобретению CDR представляют собой мышиные последовательности лидерного D003, и FR представляют собой FR, которые имеют консенсусную последовательность или последовательность зародышевой линии человеческого иммуноглобулина. В другом объекте изобретения гуманизированное антитело к TrkB включает также по меньшей мере часть Fc-области иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина. Как правило, антитело должно содержать как легкую цепь, так и по меньшей мере вариабельную область тяжелой цепи. Антитело может включать также при необходимости один или несколько из следующих участков: CH1, шарнирная область, CH2, CH3 и/или CH4 тяжелой цепи.In one aspect, a humanized anti-TrkB antibody comprises substantially all of at least one and typically two variable regions (such as those included in Fab-, Fab'-, F(ab') 2- , Fabc- and Fv fragments) in which all or substantially all of the CDRs correspond to the CDRs of non-human immunoglobulins, and according to the present invention, the CDRs are murine D003 leader sequences, and the FRs are FRs that have a consensus or germline sequence of a human immunoglobulin. In another aspect of the invention, the humanized anti-TrkB antibody also includes at least a portion of the Fc region of an immunoglobulin, typically a human immunoglobulin. Typically, the antibody must contain both a light chain and at least a heavy chain variable region. The antibody may also optionally include one or more of the following regions: CH1 , hinge region, CH2 , CH3 and/or CH4 heavy chain.
Гуманизированное антитело к TrkB может быть выбрано из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Например, константный домен может представлять собой комплементсвязывающий константный домен, где является желательным, чтобы гуманизированное антитело проявляло цитотоксическую активность, и изотип типично представлял собой IgG1. В тех случаях, когда такая цитотоксическая активность не является желательной, то константный домен может представлять собой другой изотип, например, IgG2. Альтернативное гуманизированное антитело к TrkB может содержать последовательности из более чем одного класса или изотипа иммуноглобулинов, и выбор конкретных константных доменов для оптимизации требуемых эффекторных функций находится в компетенции обычного специалиста в данной области. Конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения являются антитела, которые представляют собой антитела изотипа IgG1 и более конкретно антитела изотипа IgG1, в которых выключены эффекторные функции.The humanized anti-TrkB antibody may be selected from any class of immunoglobulins, including IgM, IgG, IgD, IgA and IgE, and any isotype, including IgG1, IgG2, IgG3 , IgG4 , IgA1 and IgA2. For example, the constant domain may be a complement-fixing constant domain, where it is desired that the humanized antibody exhibit cytotoxic activity and the isotype is typically IgG1. In cases where such cytotoxic activity is not desired, the constant domain may be another isotype, for example IgG2. An alternative humanized anti-TrkB antibody may contain sequences from more than one class or isotype of immunoglobulins, and the selection of specific constant domains to optimize the desired effector functions is within the skill of ordinary skill in the art. Specific embodiments of the present invention are antibodies that are IgG1 isotype antibodies, and more particularly IgG1 isotype antibodies in which effector functions are disabled.
FR и CDR или HVL гуманизированного антитела к TrkB не обязательно должны точно соответствовать родительским последовательностям. Например, один или несколько остатков в импортном CDR или HVL или в консенсусной последовательности или последовательности зародышевой линии FR можно изменять (например, посредством мутагенеза) путем замены, инсерции или делеции, в результате чего полученный аминокислотный остаток становится не идентичным исходному остатку в соответствующем положении любой родительской последовательности, но, тем не менее, антитело сохраняет функцию, такую как способность связываться с TrkB. Указанное изменение, как правило, не должно быть обширным и должно представлять собой консервативные изменения. Как правило, по меньшей мере 75% остатков, чаще по меньшей мере на 90% и наиболее часто более 95% или более 98% или более 99%, гуманизированного антитела должно соответствовать остаткам родительской консенсусной последовательности или последовательности зародышевой линии FR и импортных последовательностей CDR.The FR and CDR or HVL of a humanized anti-TrkB antibody do not need to exactly match the parent sequences. For example, one or more residues in an import CDR or HVL or in a consensus or germline FR sequence may be altered (eg, by mutagenesis) by substitution, insertion, or deletion such that the resulting amino acid residue is not identical to the original residue at the corresponding position of any parental sequence, but the antibody nevertheless retains function, such as the ability to bind TrkB. The change generally should not be extensive and should be a conservative change. Typically, at least 75% of the residues, more often at least 90% and most often more than 95% or more than 98% or more than 99%, of the humanized antibody must match the residues of the parent consensus sequence or germline FR sequence and import CDR sequences.
Остатки иммуноглобулина, которые влияют на поверхность раздела между вариабельными областями тяжелой и легкой цепи (поверхность раздела VL-VH), представляют собой остатки, которые влияют на близость или ориентацию двух цепей относительно друг друга. Конкретными остатками, которые могут участвовать во взаимодействиях между цепями, являются остатки VL 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 и 98 и остатки VH 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 и 103 (согласно системе нумерации, предложенной Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). В US 6407213 обсуждается также, что в указанном взаимодействии могут участвовать такие остатки как остатки VL 43 и 85 и остатки VH 43 и 60. Хотя указанные остатки указаны только для человеческого IgG, их можно рассматривать и для других видов. Важные остатки антитела, которые, как ожидается, могут участвовать во взаимодействиях между цепями, отбирают для замены в консенсусной последовательности.Immunoglobulin residues that affect the interface between the heavy and light chain variable regions (VL-VH interface) are residues that affect the proximity or orientation of the two chains relative to each other. Specific residues that may be involved in interchain interactions are VL residues 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96, and 98 and VH residues 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93. 95, 100 and 103 (according to the numbering system proposed by Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). US 6,407,213 also discusses that residues such as VL residues 43 and 85 and VH residues 43 and 60 may be involved in this interaction. Although these residues are specific to human IgG, they may be considered for other species. Important residues of the antibody that are expected to be involved in interchain interactions are selected for replacement in the consensus sequence.
Понятия консенсусная последовательность и консенсусное антитело относятся к аминокислотной последовательности, которая содержит наиболее часто встречающийся аминокислотный остаток в каждом положении во всех иммуноглобулинах любого класса, изотипа или в любой субъединичной структуре, например, вариабельной области человеческого иммуноглобулина. Консенсусная последовательность может базироваться на иммуноглобулинах конкретных видов или множества видов. Под консенсусной/консенсусным последовательностью, структурой или антителом подразумевают консенсусную человеческую последовательность, указанную в конкретных вариантах осуществления изобретения, и понятие относится к аминокислотной последовательности, которая содержит наиболее часто встречающиеся остатки в каждом положении во всех человеческих иммуноглобулинах конкретного класса, изотипа или субъединичной структуры. Таким образом, консенсусная последовательность содержитThe terms consensus sequence and consensus antibody refer to an amino acid sequence that contains the most frequently occurring amino acid residue at each position in all immunoglobulins of any class, isotype or subunit structure, for example, the variable region of a human immunoglobulin. The consensus sequence may be based on immunoglobulins of a specific species or multiple species. By consensus sequence, structure, or antibody is meant the human consensus sequence specified in particular embodiments of the invention and refers to the amino acid sequence that contains the most frequently occurring residues at each position in all human immunoglobulins of a particular class, isotype, or subunit structure. Thus the consensus sequence contains
- 8 043771 аминокислотную последовательность, которая имеет в каждом положении аминокислоту, которая присутствует в одном или нескольких известных иммуноглобулинах, но которая может не представлять собой точную копию полной аминокислотной последовательности любого индивидуального иммуноглобулина. Вариабельную область консенсусной последовательности не получают из какого-либо встречающегося в естественных условиях антитела или иммуноглобулина (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) и его вариантов. Консенсусные последовательности FR тяжелой и легкой цепи и их варианты представляют собой ценные последовательности для получения гуманизированных антител к TrkB (см., например, US 6037454 и 6054297).- 8 043771 amino acid sequence that has at each position an amino acid that is present in one or more known immunoglobulins, but which may not be an exact copy of the complete amino acid sequence of any individual immunoglobulin. The consensus sequence variable region is not derived from any naturally occurring antibody or immunoglobulin (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) and its variants. The heavy and light chain FR consensus sequences and variants thereof are valuable sequences for the production of humanized antibodies to TrkB (see, for example, US 6037454 and 6054297).
Человеческие последовательности зародышевой линии присутствуют в естественных условиях в популяции человеческих антител. Комбинация этих генов зародышевой линии создает разнообразие антител. Последовательности зародышевой линии антитела легкой цепи антитела получают из консервативных человеческих v-генов и j-генов зародышевой линии каппа или лямбда. Аналогично этому последовательности тяжелой цепи получают из v-, d- и j-генов зародышевой линии (LeFranc М-Р и LeFranc G, The Immunoglobulin Facts Book, изд-во Academic Press, 2001).Human germline sequences are naturally present in the human antibody population. The combination of these germline genes creates antibody diversity. Antibody light chain germline sequences are derived from conserved human kappa or lambda germline v and j genes. Likewise, heavy chain sequences are derived from the germline v, d, and j genes (LeFranc M-P and LeFranc G, The Immunoglobulin Facts Book, Academic Press, 2001).
Выделенное антитело представляет собой антитело, которое идентифицировано и отделено и/или очищено от компонента его естественного окружения. Загрязняющие компоненты естественного окружения антитела представляют собой субстанции, которые могут влиять на диагностическое или терапевтическое применение антитела и могут представлять собой ферменты, гормоны или другие белковые или небелковые растворенные вещества. В одном из объектов изобретения выделенное антитело должно представлять собой антитело, очищенное до степени, превышающей 95 мас.%.An isolated antibody is an antibody that has been identified and separated and/or purified from a component of its natural environment. Contaminants in the natural environment of an antibody are substances that may interfere with the diagnostic or therapeutic use of the antibody and may be enzymes, hormones, or other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. In one aspect of the invention, the isolated antibody must be an antibody purified to a degree greater than 95% by weight.
Выделенное антитело представляет собой антитело in situ внутри рекомбинантных клеток, в которых оно продуцировано, если в нем не присутствует ни один компонент естественного окружения антитела. Однако, как правило, выделенное антитело получают с помощью по меньшей мере одной стадии очистки, во время которой удаляют рекомбинантный клеточный материал.An isolated antibody is an antibody in situ within the recombinant cells in which it is produced if no component of the antibody's natural environment is present. However, typically, the isolated antibody is obtained through at least one purification step during which the recombinant cellular material is removed.
Понятие характеристика антитела относится к факторам/свойствам, которые описывают распознавание антителом антигена или эффективность антитела in vivo. Изменения в аминокислотной последовательности антитела могут влиять на свойства антитела, такие как фолдинг, и могут влиять на физические факторы, такие как начальная скорость связывания антитела с антигеном (ka), константа диссоциации антитела от антигена (kd), константа аффинности антитела к антигену (Kd), конформация антитела, стабильность белка и время полужизни антитела.The term antibody performance refers to factors/properties that describe an antibody's recognition of an antigen or the effectiveness of an antibody in vivo. Changes in the amino acid sequence of an antibody can affect properties of the antibody, such as folding, and can affect physical factors such as the initial rate of binding of the antibody to the antigen ( ka ), the dissociation constant of the antibody from the antigen ( kd ), the affinity constant of the antibody for the antigen (Kd), antibody conformation, protein stability and antibody half-life.
В контексте настоящего описания понятия идентичный или процент идентичности касательно двух или большего количества нуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к двум или большему количеству последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент одинаковых нуклеотидов или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия. Для определения процента идентичности последовательности выравнивают для оптимального сравнения (например, можно интродуцировать бреши в последовательность первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности для оптимального сравнительного анализа первичной структуры со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Когда в положении в первой последовательности находится такой же аминокислотный остаток или нуклеотид, что и в соответствующем положении во второй последовательности, то молекулы являются идентичными в указанном положении. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от количества идентичных положений в последовательностях (т.е. % идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающихся положений)х100). В некоторых вариантах осуществления изобретения две сравниваемые последовательности имеют одинаковую длину после интродукции при необходимости брешей в последовательности (например, исключая дополнительную последовательность, простирающуюся за последовательностями, подлежащими сравнению). Например, когда сравнивают последовательности вариабельных областей, то лидерные и/или последовательности константных доменов не рассматриваются. При сравнении последовательностей двух последовательностей, соответствующий CDR относится к CDR, расположенному в одинаковом положении в обеих последовательностях (например, CDR-H1 каждой последовательности).As used herein, identical or percent identical to two or more nucleotide or polypeptide sequences refers to two or more sequences or subsequences that are the same or have a certain percentage of the same nucleotide or amino acid residue when compared and aligned for maximum consistency. To determine percent identity, sequences are aligned for optimal comparison (eg, gaps can be introduced into the sequence of a first amino acid or nucleotide sequence for optimal comparative analysis of the primary structure with a second amino acid or nucleotide sequence). The amino acid residues or nucleotides at the corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence contains the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, the molecules are identical at that position. The percent identity between two sequences is a function of the number of identical positions in the sequences (ie, % identity = number of identical positions/total number of positions (eg, overlapping positions) x 100). In some embodiments, the two sequences being compared are the same length after introducing, if necessary, gaps in the sequence (eg, excluding additional sequence extending beyond the sequences being compared). For example, when variable region sequences are compared, leader and/or constant domain sequences are not considered. When comparing the sequences of two sequences, the corresponding CDR refers to the CDR located at the same position in both sequences (eg, CDR-H1 of each sequence).
Определение процента идентичности или процента сходства между двумя последовательностями можно осуществлять с помощью математического алгоритма. Предпочтительным примером математического алгоритма, который можно применять для сравнения двух последовательностей, является (но не ограничиваясь только ими) алгоритм Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1990, cc. 2264-2268, модифицированный согласно описанному у Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 5873-5877. Указанный алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST, описанные у Altschul и др., J. Mol. Biol. 215, 1990, cc. 403-410. Анализ нуклеотидов с помощью BLAST можно осуществлять с помощью программы NBLAST, в которой балл = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеиновой кислоте, кодирующей представляющей интерес белок.Determining the percent identity or percent similarity between two sequences can be done using a mathematical algorithm. A preferred example of a mathematical algorithm that can be used to compare two sequences is, but is not limited to, the algorithm of Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1990, cc. 2264-2268, modified as described in Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 5873-5877. This algorithm is included in the NBLAST and XBLAST programs described in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 1990, cc. 403-410. Nucleotide BLAST analysis can be performed using the NBLAST program, score = 100, word length = 12, to obtain nucleotide sequences homologous to the nucleic acid encoding the protein of interest.
- 9 043771- 9 043771
Анализ белков с помощью BLAST можно осуществлять с помощью программы XBLAST, в которой балл = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных представляющему интерес белку. Для осуществления сравнительных анализов первичной структуры, включающей бреши, можно применять программу Gapped BLAST, описанную у Altschul и др., Nucleic Acids, 25, 1997, cc. 3389-3402. В другом варианте можно применять PSI-Blast для осуществления итерационного поиска, позволяющего определять отдаленные взаимосвязи между молекулами (Id.). При применении программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast можно применять задаваемые по умолчанию параметры соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Другим предпочтительным примером (но, не ограничиваясь только им) математического алгоритма, который можно применять для сравнения последовательностей, является алгоритм, описанный у Myers и Miller, CABIOS, 1989. Указанный алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программ для сравнительного анализа первичной структуры последовательностей GCG. Когда программу ALIGN применяют для сравнения аминокислотных последовательностей, то можно применять таблицу взвешенных остатков РАМ120, штраф за длину бреши 12 и штраф за брешь 4. Дополнительные алгоритмы для анализа последовательностей известны в данной области и включают ADVANCE и ADAM, описанные у Torellis и Robotti, Comput. Appl. Biosci. 10, 1994, cc. 3-5; и FASTA, описанный у Pearson и Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, cc. 2444-2448. В программе FASTA параметр ktup обозначает контрольный параметр, который задает чувствительность и скорость поиска. Если ktup=2, то сходные области в двух подлежащих сравнению последовательностях выявляют путем просмотра пар выравненных остатков; если ktup=1, то оценивают индивидуальные выравненные аминокислоты. Для белковых последовательностей можно задавать значение ktup, равное 2 или 1, а для последовательностей ДНК значения в пределах от 1 до 6. В альтернативном варианте сравнительный анализ первичной структуры белковых последовательностей можно осуществлять с помощью алгоритма CLUSTAL W, описанного у HIiggins и др., Methods Enzymol. 266, 1996, cc. 383-402.Protein BLAST analysis can be performed using the XBLAST program, score = 50, word length = 3, to obtain amino acid sequences homologous to the protein of interest. To perform comparative analyzes of the primary structure including gaps, the Gapped BLAST program described in Altschul et al., Nucleic Acids, 25, 1997, cc. 3389-3402. Alternatively, PSI-Blast can be used to perform an iterative search to determine distant relationships between molecules (Id.). When using the BLAST, Gapped BLAST, and PSI-Blast programs, you can use the default settings of the corresponding programs (for example, XBLAST and NBLAST). Another preferred example, but not limited to, of a mathematical algorithm that can be used for sequence comparison is the algorithm described in Myers and Miller, CABIOS, 1989. This algorithm is included in the ALIGN program (version 2.0), which is part of the software package for comparative analysis of the primary structure of GCG sequences. When ALIGN is used to compare amino acid sequences, the PAM120 weighted residue table, gap length penalty of 12, and gap penalty of 4 can be used. Additional algorithms for sequence analysis are known in the art and include ADVANCE and ADAM, described in Torellis and Robotti, Comput. . Appl. Biosci. 10, 1994, cc. 3-5; and FASTA, described in Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, cc. 2444-2448. In the FASTA program, the ktup parameter denotes a control parameter that specifies the sensitivity and speed of the search. If ktup=2, then similar regions in the two sequences to be compared are identified by looking at pairs of aligned residues; if ktup=1, then the individual aligned amino acids are evaluated. Protein sequences can have a ktup value of 2 or 1, and DNA sequences can have values ranging from 1 to 6. Alternatively, comparative primary structure analysis of protein sequences can be performed using the CLUSTAL W algorithm described in HIiggins et al., Methods Enzymol. 266, 1996, cc. 383-402.
Последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана, если она расположена в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, предпоследовательность нуклеиновой кислоты или секреторная лидерная последовательность функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если она экспрессируется в виде белокпредшественник, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает влияние на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он позиционирован таким образом, что облегчает трансляцию. В целом, функционально связана обозначает, что последовательности ДНК, которые связаны, являются соприкасающимися, и, в случае секреторной лидерной последовательности, соприкасаются и в рамке считывания. Однако энхансеры не необязательно являются соприкасающимися. Связывание может осуществляться путем лигирования в подходящих сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, то можно использовать синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.A nucleic acid sequence is operably linked if it is located in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, a nucleic acid presequence or secretory leader sequence is operably linked to a nucleic acid encoding a polypeptide if it is expressed as a precursor protein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects transcription of the sequence; or the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence if it is positioned in such a way as to facilitate translation. In general, operably linked means that the DNA sequences that are linked are contiguous and, in the case of a secretory leader sequence, contiguous and in reading frame. However, enhancers are not necessarily contiguous. Linking can be accomplished by ligation at suitable restriction sites. If such sites do not exist, then synthetic oligonucleotide adapters or linkers can be used.
Как используется в настоящей заявке, выражения клетка, клеточная линия и культура клеток используются взаимозаменяемо и все такие обозначения охватывают их потомство. Таким образом, трансформанты и трансформированные клетки включают первичные рассматриваемые клетки и культуры, имеющие происхождение из них, независимо от количества переносов.As used herein, the expressions cell, cell line and cell culture are used interchangeably and all such designations include their progeny. Thus, transformants and transformed cells include the primary cells in question and the cultures derived from them, regardless of the number of transfers.
Понятие млекопитающее, подлежащее лечению, относится к любому животному, которое принадлежит к классу млекопитающих, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных, а также живущих в зоопарке животных, предназначенных для спорта или комнатных животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека.The term "mammal to be treated" refers to any animal that belongs to the class of mammals, including humans, domestic and farm animals, as well as zoo, sporting or pet animals such as dogs, horses, cats, cows, etc. .d. Preferably the mammal is a human.
Нарушение, как используется в настоящей заявке, представляет собой любое состояние, которое будет получать преимущество от лечения с применением гуманизированного антитела к TrkB, описанного в настоящей заявке. Оно включает хронические и острые нарушения или заболевания, включая те патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающего к указанному нарушению. Неограничивающие примеры или нарушения, подвергаемые лечению в соответствии с настоящей заявкой, включают глазные нарушения или нарушения сетчатки.A disorder, as used herein, is any condition that would benefit from treatment with the humanized anti-TrkB antibody described herein. It includes chronic and acute disorders or diseases, including those pathological conditions that predispose a mammal to the disorder. Non-limiting examples or disorders treated herein include ocular or retinal disorders.
Как используется в настоящей заявке, термин нарушение, связанное с TrkB или заболевание, связанное с TrkB, относится к состоянию, при котором показана модификация или активация клеток, экспрессирующих TrkB. Нарушение, связанное с TrkB включает заболевания и нарушения, такие как возрастная дегенерация желтого пятна, географическая атрофия, диабетическая ретинопатия, диабетический отек желтого пятна, пигментная дистрофия сетчатки, наследственная дистрофия сетчатки, наследственная макулодистрофия, миопическая дегенерация, окклюзии вены сетчатки, окклюзии артерии сетчатки, эндофтальмит, увеит, кистозный макулярный отек, хороидальная неоваскулярная мембрана вследствие любого из заболеваний сетчатки, оптические нейропатии, глаукома, отслойка сетчатки, токсическая ретинопатия, лучевая ретинопатия, и травматическая ретинопатия, а также продромальная и от легкой до умеренной болезнь Альцгеймера, задержка прогрессирования заболевания у пациентов с болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, большое депрессивное расстройство, шизоф- 10 043771 рения, когнитивное нарушение, связанное с шизофренией, предотвращение первого приступа психоза у индивидуумов с ослабленным психозным синдромом, предотвращение повторения у пациентов с шизофренией, терапевтически резистентная депрессия, и метаболические заболевания, такие как гиперфагия, ожирение или метаболический синдром.As used herein, the term TrkB-related disorder or TrkB-related disease refers to a condition in which modification or activation of cells expressing TrkB is indicated. Disorders associated with TrkB include diseases and disorders such as age-related macular degeneration, geographic atrophy, diabetic retinopathy, diabetic macular edema, retinal pigmentary degeneration, hereditary retinal dystrophy, hereditary macular degeneration, myopic degeneration, retinal vein occlusions, retinal artery occlusions, endophthalmitis, uveitis, cystoid macular edema, choroidal neovascular membrane due to any retinal disease, optical neuropathies, glaucoma, retinal detachment, toxic retinopathy, radiation retinopathy, and traumatic retinopathy, as well as prodromal and mild to moderate Alzheimer's disease, delayed disease progression in patients with Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, major depressive disorder, schizophrenia, cognitive impairment associated with schizophrenia, prevention of first episode of psychosis in individuals with attenuated psychosis, prevention of recurrence in patients with schizophrenia, treatment-resistant depression, and metabolic diseases such as hyperphagia, obesity or metabolic syndrome.
Термин интравитреальная инъекция имеет общепринятое значение в данной области техники и относится к интродукции антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента в стекловидное тело пациента.The term intravitreal injection has a common meaning in the art and refers to the introduction of an antibody to TrkB or an antigen-binding fragment thereof into the vitreous body of a patient.
Термин подкожное введение относится к интродукции антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента под кожу больного животного или человека, предпочтительно в карман между кожей и низлежащей тканью, путем относительно медленного пролонгированного введения из содержащего лекарственное средство резервуара. Пощипывание или оттягивание кожи вверх вниз от низлежащей ткани может создавать карман.The term subcutaneous administration refers to the introduction of an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof under the skin of a diseased animal or human, preferably into a pocket between the skin and underlying tissue, by a relatively slow, sustained injection from a drug-containing reservoir. Pinching or pulling the skin upward and away from the underlying tissue can create a pocket.
Понятие подкожная инфузия относится к интродукции лекарственного средства под кожу больного животного или человека, предпочтительно в карман между кожей и низлежащей тканью, путем относительно медленного пролонгированного введения из содержащего лекарственное средство резервуара в течение периода времени, составляющего (но, не ограничиваясь только указанным) 30 мин или менее или 90 мин или менее. Необязательно инфузию можно осуществлять путем подкожной имплантации насоса для введения лекарственного средства, имплантированного под кожу больного животного или человека, при этом насос обеспечивает введение лекарственного средства в предварительно определенном количестве в течение предварительно определенного периода времени, составляющего 30 мин, 90 мин или периода времени, соответствующего продолжительности схемы лечения.The term subcutaneous infusion refers to the introduction of a drug into the skin of a diseased animal or human, preferably into a pocket between the skin and the underlying tissue, by a relatively slow, sustained injection from a drug-containing reservoir over a period of time of, but not limited to, 30 minutes. or less or 90 minutes or less. Optionally, the infusion can be accomplished by subcutaneously implanting a drug delivery pump implanted under the skin of a diseased animal or human, wherein the pump delivers the drug in a predetermined amount over a predetermined period of time of 30 minutes, 90 minutes, or a period of time corresponding duration of the treatment regimen.
Понятие подкожный болюс относится к введению лекарственного средства под кожу больного животного или человека, при этом продолжительность введения лекарственного средства в виде болюса составляет менее примерно 15 мин; в другом объекте изобретения менее 5 мин, а еще в одном объекте изобретения в течение менее 60 с. В следующем объекте изобретения введение осуществляют в карман между кожей и низлежащей тканью, где карман можно создавать путем пощипывания или оттягивания кожи вверх вниз от низлежащей ткани.The term subcutaneous bolus refers to the administration of a drug under the skin of a diseased animal or human, wherein the duration of administration of the drug as a bolus is less than about 15 minutes; in another object of the invention, less than 5 minutes, and in another object of the invention, for less than 60 s. In a further aspect of the invention, administration is carried out into a pocket between the skin and the underlying tissue, where the pocket can be created by pinching or pulling the skin up and down from the underlying tissue.
Термин терапевтически эффективное количество используется по отношению к количеству антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента, при использовании которого происходит ослабление или облегчение одного или нескольких симптомов нарушения, подлежащего лечению. Действующее вещество применяют таким образом, что в указанном количестве оно оказывало благоприятное действие на пациента. В одном аспекте, терапевтически эффективное количество имеет нейрозащитный или нейрорегенеративный эффект. В другом аспекте, терапевтически эффективное количество относится к целевой концентрации в сыворотке пациента, при которой оно проявляется как эффективное, например, в отношении замедления прогрессирования заболевания. Эффективность можно оценивать общепринятыми путями в зависимости от подлежащего лечению состояния. Например, при заболеваниях или нарушениях глаз/ сетчатки, которые характеризуются клетками, экспрессирующими TrkB, эффективность может быть измерена путем определения частоты ответов, например, восстановление зрения или путем оценки времени задержки до прогрессирования заболевания.The term therapeutically effective amount is used to refer to the amount of an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof that reduces or alleviates one or more symptoms of the disorder being treated. The active substance is used in such a way that in the specified amount it has a beneficial effect on the patient. In one aspect, the therapeutically effective amount has a neuroprotective or neuroregenerative effect. In another aspect, a therapeutically effective amount refers to the target concentration in the patient's serum at which it appears effective, for example, in slowing the progression of a disease. Efficacy can be assessed in conventional ways depending on the condition being treated. For example, in eye/retinal diseases or disorders that are characterized by cells expressing TrkB, efficacy can be measured by determining the response rate, such as vision recovery, or by assessing the latency to disease progression.
Термины лечение и терапия и подобные, как используются в настоящей заявке, относятся к терапевтическим, а также профилактическим или подавляющим мероприятиям в отношении заболевания или нарушения, которые приводят к любому клинически важному или благоприятному действию, включая (но, не ограничиваясь только ими) облегчение или ослабления одного или нескольких симптомов, регресс, замедление или прекращение развития заболевания или нарушения. Таким образом, например, под понятие лечение подпадает введение антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента до или после начала проявления симптома заболевания или нарушения, что приводит к предупреждению или устранению одного или нескольких признаков заболевания или нарушения. В другом примере понятие относится к введению антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента после клинического проявления болезни для борьбы с симптомами болезни. Кроме того, в контексте настоящего описания понятие лечение или терапия относятся к введению антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента после возникновения и после развития клинических симптомов, где введение оказывает воздействие на клинические параметры заболевания или нарушения, такие как степень повреждения ткани или количество и распространение метастазов, вне зависимости от того приводит или нет лечение к облегчению заболевания. Кроме того, если применение композиций, предлагаемых в изобретении, либо индивидуально, либо в сочетании с другим терапевтическим средством купирует или облегчает по меньшей мере один из симптомов подлежащего лечению нарушения по сравнению с указанным симптомом без применения содержащей композиции антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента, результат следует рассматривать как эффективное лечение требуемого нарушения вне зависимости от того, происходит или нет облегчение всех симптомов нарушения.The terms treatment and therapy and the like, as used herein, refer to therapeutic, as well as prophylactic or suppressive measures for a disease or disorder that result in any clinically important or beneficial effect, including (but not limited to) relief or weakening of one or more symptoms, regression, slowing or cessation of the development of a disease or disorder. Thus, for example, treatment includes administration of an anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof before or after the onset of a symptom of a disease or disorder, resulting in the prevention or elimination of one or more symptoms of the disease or disorder. In another example, the concept refers to the administration of an anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof after the clinical manifestation of a disease to combat symptoms of the disease. Moreover, as used herein, the term treatment or therapy refers to the administration of an anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof after the onset and development of clinical symptoms, where the administration has an effect on clinical parameters of the disease or disorder, such as the degree of tissue damage or the number and distribution of metastases , regardless of whether treatment leads to relief of the disease or not. In addition, if the use of the compositions of the invention, either alone or in combination with another therapeutic agent, relieves or alleviates at least one of the symptoms of the disorder being treated compared with the specified symptom without the use of the composition containing an anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof, the result should be considered as effective treatment of the required disorder, whether or not all symptoms of the disorder are relieved.
Термин листовка-вкладыш в упаковке относится к инструкциям, которые принято включать в предназначенные для продажи упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, методах применения, введения, противопоказаниях и/или мерах предосторожности при приThe term package insert refers to instructions typically included in commercial packaging of therapeutic products that contain information regarding indications, methods of use, administration, contraindications, and/or precautions for use.
- 11 043771 менении указанных терапевтических продуктов.- 11 043771 changes in these therapeutic products.
АнтителаAntibodies
Описанные и раскрытые в настоящей заявке антитела представляют собой антитела к TrkB, в особенности гуманизированные антитела к TrkB, а также композиции и изделия, содержащие антитела к TrkB согласно настоящему изобретению. Также описаны антигенсвязывающие фрагменты антитела к TrkB. Антитела к TrkB и их антигенсвязывающие фрагменты можно применять для лечения различных заболеваний или нарушений, которые характеризуются уменьшенной активностью TrkB пути. Антитело к TrkB и его антигенсвязывающий фрагмент каждый включает по меньшей мере компонент, который специфически распознает TrkB эпитоп.The antibodies described and disclosed herein are anti-TrkB antibodies, particularly humanized anti-TrkB antibodies, as well as compositions and articles containing anti-TrkB antibodies according to the present invention. Antigen-binding antibody fragments to TrkB have also been described. Antibodies to TrkB and antigen-binding fragments thereof can be used to treat various diseases or disorders that are characterized by reduced activity of the TrkB pathway. The anti-TrkB antibody and an antigen-binding fragment thereof each include at least a component that specifically recognizes a TrkB epitope.
При исходной характеристике, выбран анти-TrkB мышиный лидерный D003 на основании его намного лучшей эффективности функционирования антитела. Создавали библиотеку вариантов путем помещения CDR мышиной лидерной последовательности в FR консеснусных вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи человека, а также, путем конструирования FR с различными изменениями.For initial characterization, the mouse anti-TrkB leader D003 was selected based on its much better antibody performance. A library of variants was created by placing the mouse CDR leader sequence into the FR of the human heavy and light chain consensus variable domains, and by constructing the FR with various changes.
Это приводило к получению различных гуманизированных вариабельных последовательностей тяжелой и легкой цепи, как показано ниже:This resulted in various humanized heavy and light chain variable sequences as shown below:
VL Последовательности.VL Sequences.
D003 VL (мышиная лидерная), вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 1D003 VL (mouse leader), variable light chain, SEQ ID NO: 1
DIVMSOSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOSPKLLIDIVMSOSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOSPKLLI
YWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCOQYYSYPYTFGGGTYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCOQYYSYPYTFGGGT
KLEIKKLEIK
- 12 043771- 12 043771
277-gr_VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 2 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGOGT KLEIK277-gr_VL, (humanized) variable light chain, SEQ ID NO: 2 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGOGT KLEIK
277-33_VL: (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 3 DIVMTOSPDSLAVSLGERATISCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGGGTK LEIK277-33_VL: (humanized) variable light chain, SEQ ID NO: 3 DIVMTOSPDSLAVSLGERATISCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGGGTK LEIK
277-35 VL: (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 4 DIVMTOSPDSLAVSLGERATISCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGGGTK LEIK277-35 VL: (humanized) variable light chain, SEQ ID NO: 4 DIVMTOSPDSLAVSLGERATISCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGGGTK LEIK
277-42_VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 5 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGGGT KLEIK277-42_VL, (humanized) variable light chain, SEQ ID NO: 5 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGGGT KLEIK
277-44 VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 6 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOSPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGOGT KLEIK277-44 VL, (humanized) variable light chain, SEQ ID NO: 6 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOSPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGOGT KLEIK
277-48 VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 7 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGOGT KLEIK277-48 VL, (humanized) variable light chain, SEQ ID NO: 7 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGOGT KLEIK
277-51_VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 8 DIVMTOSPDSLAVSLGERATISCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGGGTK LEIK277-51_VL, (humanized) variable light chain, SEQ ID NO: 8 DIVMTOSPDSLAVSLGERATISCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOQKPGOPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGGGTK LEIK
- 13 043771- 13 043771
277-64 VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 9 DIVMTOSPDSLAVSLGERATISCKSSOSLLYSSNQKNYLAWYOOKPGOPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGOGTK LEIK277-64 VL, (humanized) variable light chain, SEQ ID NO: 9 DIVMTOSPDSLAVSLGERATISCKSSOSLLYSSNQKNYLAWYOOKPGOPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGOGTK LEIK
277-67_VL, (гуманизированная) вариабельная легкая цепь, SEQ ID NO: 10 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNQKNYLAWYOOKPGOSPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGOGT KLEIK277-67_VL, (humanized) variable light chain, SEQ ID NO: 10 DIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSOSLLYSSNQKNYLAWYOOKPGOSPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCOQYYSYPYTFGOGT KLEIK
VH ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИVH SEQUENCES
D003 VH, (мышиная лидерная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: И OVOLOQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTGYWMHWVKORPGOGLEWIGYI NPSTDYTEYNOKFKDKATLTADK S S S Т A YMQL SSLTSEDSAVYYCARSRTGNY WGQGTTLTVSSD003 VH, (mouse leader) variable heavy chain, SEQ ID NO: AND OVOLOQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTGYWMHWVKORPGOGLEWIGYI NPSTDYTEYNOKFKDKATLTADK S S S T A YMQL SSLTSEDSAVYYCARSRTGNY WGQGTTLTVSS
277-gr_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 12 OVOLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVROAPGOGLEWMGYI NPSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNY WGQGTLVTVSS277-gr_VH, (humanized) variable heavy chain, SEQ ID NO: 12 OVOLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVROAPGOGLEWMGYI NPSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSRTGNY WGQGTLVTVSS
277-33 VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 13 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQRPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTLTRDTS T S T V YMEL S SLTSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS277-33 VH, (humanized) variable heavy chain, SEQ ID NO: 13 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQRPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTLTRDTS T S T V YMEL S SLTSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
277-35 VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 14 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRORPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTLTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS277-35 VH, (humanized) variable heavy chain, SEQ ID NO: 14 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRORPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTLTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
277-42 VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 15 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQRPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTLTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS277-42 VH, (humanized) variable heavy chain, SEQ ID NO: 15 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQRPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTLTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
- 14 043771- 14 043771
277-44_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 16 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDT S T S T V YMEL S SLT SEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS277-44_VH, (humanized) variable heavy chain, SEQ ID NO: 16 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQAPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDT S T S T V YMEL S SLT SEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
277-48_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 17 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQRPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS277-48_VH, (humanized) variable heavy chain, SEQ ID NO: 17 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQRPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
277-51_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 18 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQRPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRATLTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS277-51_VH, (humanized) variable heavy chain, SEQ ID NO: 18 OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVRQRPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRATLTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
277-64_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 19277-64_VH, (humanized) variable heavy chain, SEQ ID NO: 19
OVOLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVROAPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSSOVOLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVROAPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
277-67_VH, (гуманизированная) вариабельная тяжелая цепь, SEQ ID NO: 20 OVOLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVROAPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS277-67_VH, (humanized) variable heavy chain, SEQ ID NO: 20 OVOLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYWMHWVROAPGOGLEWIGYIN PSTDYTEYNQKFKDRVTMTRDTS T S TV YMEL S SLRSEDTAVYYCARSRTGNYW GQGTTVTVSS
Подчеркнутые последовательности соответствовали CDR областям вариабельных областей легких и тяжелых цепей.The underlined sequences correspond to the CDR regions of the light and heavy chain variable regions.
Гуманизированные антитела к TrkB согласно настоящему изобретению представляют собой антитела, которые имеют последовательности легких и тяжелых цепей, как представлено в таблице ниже. Были созданы IgG1-KO мутанты путем интродукции двух мутаций в Fc область, Leu232Ala и Leu233Ala для уменьшения эффекторной функции.The humanized anti-TrkB antibodies of the present invention are antibodies that have light and heavy chain sequences as shown in the table below. IgG1-KO mutants were created by introducing two mutations into the Fc region, Leu232Ala and Leu233Ala, to reduce effector function.
Таблица 1Table 1
- 15 043771- 15 043771
- 16 043771- 16 043771
- 17 043771- 17 043771
- 18 043771- 18 043771
- 19 043771- 19 043771
- 20 043771- 20 043771
Представленные выше CDR согласно нумерации Computing Group (CCG) подчеркнуты (Almagro и др., Proteins 2011; 79:3050-3066 и Maier и др., Proteins 2014; 82:1599-1610). Последовательности, определенные согласно номенклатуре Кэбота, выделенные жирным шрифтом, а определенные согласно системеThe CDRs presented above, as assigned by the Computing Group (CCG), are underlined (Almagro et al., Proteins 2011; 79:3050-3066 and Maier et al., Proteins 2014; 82:1599-1610). Sequences defined according to Cabot's nomenclature are in bold and those defined according to the system
- 21 043771 нумерации Чотиа, выделены курсивом.- 21 043771 Chotia numbering, in italics.
В одном аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывается с TrkB человека при KD<10 нМ. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывается с TrkB человека при KD<5 нМ. В еще дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению связывается с TrkB человека при KD приблизительно 1 нМ. Аффинности связывания антител к TrkB могут быть определены согласно способу, описанному в примере 6.In one aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention binds to human TrkB at a K D <10 nM. In a further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention binds to human TrkB at a K D <5 nM. In a still further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention binds to human TrkB at a K D of approximately 1 nM. The binding affinities of antibodies to TrkB can be determined according to the method described in Example 6.
В другом аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению индуцирует фосфорилирование и/или активацию TrkB с высокой эффективностью. В одном аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению фосфорилирует TrkB человека с EC50<100 пМ. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению фосфорилирует TrkB человека с ЕС50<50 пМ. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению фосфорилирует TrkB человека с EC50<40 пМ. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению фосфорилирует TrkB человека с ЕС50<30 пМ. В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению фосфорилирует TrkB человека с ЕС50 приблизительно 20 пМ.In another aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention induces phosphorylation and/or activation of TrkB with high efficiency. In one aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention phosphorylates human TrkB with an EC 50 of <100 pM. In a further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention phosphorylates human TrkB with an EC 50 of <50 pM. In a further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention phosphorylates human TrkB with an EC 50 <40 pM. In a further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention phosphorylates human TrkB with an EC 50 <30 pM. In a further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention phosphorylates human TrkB with an EC 50 of approximately 20 pM.
В другом аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению является более эффективным для индуцирования активации нижерасположенных TrkB путей передачи сигналов по сравнению с природным TrkB лигандом BDNF. Эффективность антител к TrkB может быть определена в дифференцированных SH-SY5Y клетках согласно способу, описанному в примере 8.In another aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention is more effective at inducing activation of downstream TrkB signaling pathways compared to the native TrkB ligand BDNF. The effectiveness of anti-TrkB antibodies can be determined in differentiated SH-SY5Y cells according to the method described in Example 8.
В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению индуцирует экспрессию генов, сопоставимую с природным TrkB лигандом BDNF. Стимуляция с помощью агонистических антител к TrkB увеличивает экспрессию мРНК ARC, VGF, EGR1, которые являются маркерами для повышенной синаптической пластичности и, следовательно, индикаторами, что антитела к TrkB действуют подобно пригодному лиганду BDNF на модуляцию функции нейронов, то есть, повышение выживания нейронов и/или синаптическую пластичность. Картины экспрессии генов могут быть определены согласно способу, описанному в примере 10.In a further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention induces gene expression comparable to the natural TrkB ligand BDNF. Stimulation with agonistic antibodies to TrkB increases the expression of ARC, VGF, EGR1 mRNA, which are markers for increased synaptic plasticity and therefore indicators that antibodies to TrkB act like a suitable BDNF ligand to modulate neuronal function, i.e., increase neuronal survival and /or synaptic plasticity. Gene expression patterns can be determined according to the method described in Example 10.
В еще дальнейшем аспекте антитело к TrkB согласно настоящему изобретению защищает нейроны, глиальные клетки и/или нейроваскулярную единицу в сетчатке пациентов, например, с возрастной дегенерацией желтого пятна, географической атрофией или диабетической ретинопатией путем стимуляции TrkB-зависимых путей передачи сигналов выживания и обеспечивая, таким образом, нейропротективное действие.In a still further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention protects neurons, glial cells and/or neurovascular unit in the retina of patients, for example, with age-related macular degeneration, geographic atrophy or diabetic retinopathy by stimulating TrkB-dependent survival signaling pathways and thereby providing thus, a neuroprotective effect.
В другом аспекте антитело к TrkB согласно настоящему изобретению регенерирует аксоны/дендриты и/или синапсы в сетчатке после начала заболевания, например, при возрастной дегенерации желтого пятна, географической атрофии или диабетической ретинопатии и обеспечивая таким образом нейрорегенерацию.In another aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention regenerates axons/dendrites and/or synapses in the retina after the onset of disease, such as age-related macular degeneration, geographic atrophy, or diabetic retinopathy, thereby providing neuroregeneration.
В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению имеет низкий риск иммуногенности и низкую подверженность последовательностей по отношению к его CDR последовательностям. Иммуногенность и гетерогенность являются двумя важными аспектами терапевтического антитела. Измерения таких аспектов можно осуществить с помощью способов, как описано в примерах 4 и 5. Антитела согласно настоящему изобретению были осторожно сконструированы, что иметь минимальную или не иметь иммуногенности и/или гетерогенности.In a further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention has a low risk of immunogenicity and low sequence affinity relative to its CDR sequences. Immunogenicity and heterogeneity are two important aspects of a therapeutic antibody. Measurements of such aspects can be accomplished using methods as described in Examples 4 and 5. Antibodies of the present invention have been carefully designed to have minimal or no immunogenicity and/or heterogeneity.
В еще одном аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению не уменьшает BDNF индуцированное ERK фосфорилирование. Для этого, ERK фосфорилирование может быть измерено, например, в СНО клетках, экспрессирующих TrkB человека, как описано в примере 13. Это может обозначать, что ERK фосфорилирование, индуцированное эндогенно экспрессируемым BDNF, не уменьшается при введении антитела к TrkB согласно изобретению. Это также может обозначать, что антитело к TrkB согласно изобретению не уменьшает ERK фосфорилирование при введении перед, одновременно или впоследствии после экзогенно введенного BDNF. В некоторых случаях, антитело к TrkB не конкурирует с или снижает BDNF индуцированное ERK фосфорилирование по сравнении с индукцией BDNF отдельно.In yet another aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention does not reduce BDNF-induced ERK phosphorylation. To this end, ERK phosphorylation can be measured, for example, in CHO cells expressing human TrkB, as described in Example 13. This may indicate that ERK phosphorylation induced by endogenously expressed BDNF is not reduced by administration of the anti-TrkB antibody of the invention. This may also mean that the anti-TrkB antibody of the invention does not reduce ERK phosphorylation when administered before, simultaneously or subsequently after exogenously administered BDNF. In some cases, anti-TrkB antibody does not compete with or reduce BDNF-induced ERK phosphorylation compared to BDNF induction alone.
В дальнейшем аспекте, антитело к TrkB согласно настоящему изобретению является специфическим для фосфорилирования и/или активации TrkB и неспецифически не фосфорилирует и/или не активирует TrkA или TrkC.In a further aspect, the anti-TrkB antibody of the present invention is specific for phosphorylation and/or activation of TrkB and does not non-specifically phosphorylate and/or activate TrkA or TrkC.
В другом аспекте, антитело к TrkB не связывается неспецифически с VEGF человека и/или VEGF крысы. Связывание неспецифически в настоящем контексте обозначает, что антитело к TrkB согласно изобретению не связывается с VEGF человека, как измерено, например, с помощью ELISA, как описано в Примере 14. В одном варианте осуществления, отсутствие неспецифического связывания антитела к TrkB может быть определено путем измерения статистически значимое различие (например, критерий Стьюдента для одной выборки, р<0,05) при связывании с VEGF человека между антителом к TrkB и подходящим IgG изотипным контрольным антителом. В особенности, отсутствие неспецифического связывания антитела к TrkB согласно изобретению может быть измерено путем определения любых отличий при связывании с VEGF человека между антителом к TrkB и IgG1 изотипным контрольным антителом. Антитело к TrkB согласно изобретению существенно не отличается относительно отсутствия связыванияIn another aspect, the anti-TrkB antibody does not bind nonspecifically to human VEGF and/or rat VEGF. Binding nonspecifically in the present context means that the anti-TrkB antibody of the invention does not bind to human VEGF as measured, for example, by ELISA as described in Example 14. In one embodiment, the absence of nonspecific binding of the anti-TrkB antibody can be determined by measuring statistically significant difference (eg, one-sample t test, p<0.05) in binding to human VEGF between the anti-TrkB antibody and the appropriate IgG isotype control antibody. In particular, the lack of nonspecific binding of the anti-TrkB antibody of the invention can be measured by determining any differences in binding to human VEGF between the anti-TrkB antibody and an IgG1 isotype control antibody. The anti-TrkB antibody of the invention does not differ significantly in terms of lack of binding
- 22 043771 с VEGF человека по сравнению с аналогичной концентрацией IgGl изотипного контрольного антитела вплоть до концентрации приблизительно 0,3 нМ, 0,4 нМ, 0,5 нМ, 0,6 нМ, 0,7 нМ, 0,8 нМ, 0,9 нМ, 1 нМ, 5 нМ, 10 нМ, 20 нМ, 30 нМ, 40 нМ, 50 нМ, 60 нМ, 70 нМ, 80 нМ, 90 нМ, 100 нМ, 110 нМ, 120 нМ, 130 нМ, 140 нМ, 150 нМ, 160 нМ, 170 нМ, 180 нМ, 190 нМ или 200 нМ. В альтернативном варианте осуществления, отсутствие неспецифического связывания антитела к TrkB согласно изобретению может быть измерено путем определения значения IC50 связывания антитела к TrkB с любым одним из VEGF человека или крысы. В особенности, антитело к TrkB согласно изобретению будет проявлять значение IC50 связывания с VEGF человека или крысы приблизительно выше 0,9 мкМ, предпочтительно выше 1 мкМ, выше 2 мкМ, выше 3 мкМ, выше 5 мкМ, выше 10 мкМ, выше 20 мкМ, выше 30 мкМ, выше 40 мкМ, выше 50 мкМ, выше 100 мкМ, выше 150 мкМ, выше 200 мкМ, выше 250 мкМ, выше 300 мкМ, выше 350 мкМ, выше 400 мкМ, выше 450 мкМ, выше 500 мкМ, выше 550 мкМ, выше 600 мкМ, выше 650 мкМ, выше 700 мкМ, выше 750 мкМ, выше 800 мкМ, выше 850 мкМ, или выше 900 мкМ.- 22 043771 with human VEGF compared to a similar concentration of IgGl isotype control antibody up to a concentration of approximately 0.3 nM, 0.4 nM, 0.5 nM, 0.6 nM, 0.7 nM, 0.8 nM, 0 ,9 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 110 nM, 120 nM, 130 nM, 140 nM, 150 nM, 160 nM, 170 nM, 180 nM, 190 nM or 200 nM. In an alternative embodiment, the absence of non-specific binding of the anti-TrkB antibody of the invention can be measured by determining the IC 50 value of binding of the anti-TrkB antibody to any one of the human or rat VEGFs. In particular, the anti-TrkB antibody of the invention will exhibit a human or rat VEGF binding IC50 value greater than about 0.9 μM, preferably greater than 1 μM, greater than 2 μM, greater than 3 μM, greater than 5 μM, greater than 10 μM, greater than 20 μM , above 30 µM, above 40 µM, above 50 µM, above 100 µM, above 150 µM, above 200 µM, above 250 µM, above 300 µM, above 350 µM, above 400 µM, above 450 µM, above 500 µM, above 550 µM, above 600 µM, above 650 µM, above 700 µM, above 750 µM, above 800 µM, above 850 µM, or above 900 µM.
Гуманизация и варианты аминокислотной последовательностиHumanization and amino acid sequence variants
Дальнейшие варианты антител к TrkB и фрагментов антител могут быть сконструированы на основе набора CDR, идентифицированных в мышином лидерном D003. Подразумевается, что в указанных вариантах аминокислотных последовательностей антител к TrkB и фрагментов антител CDR остаются неизмененными, но окружающие области, например, FR области, могут быть сконструированы. Варианты аминокислотной последовательности антитела к TrkB можно получать путем интродукции соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК антитела к TrkB или с помощью пептидного синтеза. Указанные варианты включают, например, делеции и/или инсерции и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антител к TrkB, представленных в качестве примера в настоящем описании. Для получения конечной конструкции применяют любую комбинацию делеций, инсерций и замен при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками. Аминокислотные изменения могут также изменять посттрансляционный процессинг гуманизированного антитела к TrkB или его варианта, например, изменение количества или положения сайтов гликозилирования.Further variants of anti-TrkB antibodies and antibody fragments can be designed based on the set of CDRs identified in the mouse leader D003. In these variant amino acid sequences of anti-TrkB antibodies and antibody fragments, the CDRs are understood to remain unchanged, but the surrounding regions, such as the FR regions, can be engineered. Anti-TrkB antibody amino acid sequence variants can be generated by introducing appropriate nucleotide changes into the anti-TrkB antibody DNA or by peptide synthesis. These variants include, for example, deletions and/or insertions and/or substitutions of residues in the amino acid sequences of the anti-TrkB antibodies exemplified herein. Any combination of deletions, insertions and substitutions is used to obtain the final construct, provided that the final construct has the required characteristics. Amino acid changes may also alter post-translational processing of the humanized anti-TrkB antibody or variant thereof, such as changing the number or position of glycosylation sites.
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение включает антитела к TrkB или их фрагменты антител, имеющие вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, где аминокислотная последовательность вариабельной легкой цепи и аминокислотная последовательность вариабельной тяжелой цепи являются по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичны аминокислотным последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 2 и 12, или 3 и 13, или 4 и 14, или 5 и 15, или 6 и 16, или 7 и 17, или 8 и 18, или 9 и 19, или 10 и 20, соответственно.In some embodiments, the present invention includes anti-TrkB antibodies or antibody fragments thereof having a variable light chain and a variable heavy chain, wherein the amino acid sequence of the variable light chain and the amino acid sequence of the variable heavy chain are at least 80%, at least 90% the same %, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequences presented in SEQ ID NO: 2 and 12, or 3 and 13, or 4 and 14, or 5 and 15, or 6 and 16, or 7 and 17, or 8 and 18, or 9 and 19, or 10 and 20, respectively.
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение включает антитела к TrkB или их фрагменты антитела, имеющие легкую цепь и тяжелую цепь, где аминокислотная последовательность легкой цепи и аминокислотная последовательность тяжелой цепи являются по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичны аминокислотным последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 21 и 22 или 23; 24 и 25 или 26; 27 и 28 или 29; 30 и 31 или 32; 33 и 34 или 35; 36 и 37 или 38; 39 и 40 или 41; 42 и 43 или 44; 45 и 46 или 47 соответственно.In some embodiments, the present invention includes anti-TrkB antibodies or antibody fragments thereof having a light chain and a heavy chain, wherein the amino acid sequence of the light chain and the amino acid sequence of the heavy chain are at least 80%, at least 90%, at least at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequences presented in SEQ ID NO: 21 and 22 or 23; 24 and 25 or 26; 27 and 28 or 29; 30 and 31 or 32; 33 and 34 or 35; 36 and 37 or 38; 39 and 40 or 41; 42 and 43 or 44; 45 and 46 or 47 respectively.
В дальнейшем варианте осуществления, настоящее изобретение включает антитела к TrkB, которые конкурируют за связывание с TrkB с любым из следующих антител.In a further embodiment, the present invention includes anti-TrkB antibodies that compete for binding to TrkB with any of the following antibodies.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 или 23.An antibody having a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or 23.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 или 26.An antibody having a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 or 26.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28 или 29.An antibody having a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 or 29.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 или 32.An antibody having a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 or 32.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 35.An antibody having a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 or 35.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 или 38.An antibody having a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 or 38.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 или 41.An antibody having a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 or 41.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43 или 44.An antibody having a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 or 44.
Антитело, имеющее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46 или 47.An antibody having a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 and a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 or 47.
Другим типом получения аминокислотного варианта антитела является изменение исходной схемы гликозилирования антитела. Термин изменение в контексте настоящей заявки означает делецию одного или нескольких углеводных фрагментов, присутствующих в антителе, и/или добавление одного илиAnother type of producing an amino acid variant of an antibody is to change the original glycosylation pattern of the antibody. The term change in the context of this application means the deletion of one or more carbohydrate moieties present in the antibody and/or the addition of one or more
- 23 043771 нескольких сайтов гликозилирования, ранее не присутствующих в антителе.- 23 043771 several glycosylation sites not previously present in the antibody.
В некоторых аспектах, настоящее изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют варианты аминокислотных последовательностей антител к TrkB, описанных в настоящей заявке. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей антитела к TrkB, приготавливают с помощью различных методов, известных в данной области техники. Эти методы включают, но не ограничиваясь только ими, выделение из природного источника (в случае встречающихся в природе вариантов аминокислотных последовательностей) или получение с помощью мутагенеза с использованием олигонуклеотидов (или сайтнаправленного мутагенеза), ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза полученного ранее варианта или не являющейся вариантом версии антитела к TrkB.In some aspects, the present invention includes nucleic acid molecules that encode amino acid sequence variants of the anti-TrkB antibodies described herein. Nucleic acid molecules encoding variant amino acid sequences of the anti-TrkB antibody are prepared using various methods known in the art. These methods include, but are not limited to, isolation from a natural source (in the case of naturally occurring amino acid sequence variants) or production by oligonucleotide mutagenesis (or site-directed mutagenesis), PCR mutagenesis, and cassette mutagenesis of a previously obtained variant or non-variant. variant version of the anti-TrkB antibody.
В определенных вариантах осуществления, антитело к TrkB представляет собой фрагмент антитела. Существуют техники, которые были разработаны для получения фрагментов антител. Фрагменты можно получать путем протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto и др., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 1992, cc. 107-117 и Brennan и др., Science 229, 1985, с. 81). В альтернативном варианте фрагменты можно получать непосредственно в рекомбинантных клетках-хозяевах. Например, Fab'-SH-фрагменты можно выделять непосредственно из Е. coli и химически сшивать с получением F(ab')2-фрагментов (см., например, Carter и др., Bio/Technology 10, 1992, cc. 163167). Согласно другому подходу F(ab')2-фрагменты можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантной клетки-хозяина. Другие методики получения фрагментов антител должны быть очевидны специалисту в данной области.In certain embodiments, the anti-TrkB antibody is an antibody fragment. There are techniques that have been developed to obtain antibody fragments. Fragments can be obtained by proteolytic cleavage of intact antibodies (see, for example, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 1992, pp. 107-117 and Brennan et al., Science 229, 1985, p. 81). Alternatively, fragments can be produced directly in recombinant host cells. For example, Fab'-SH fragments can be isolated directly from E. coli and chemically cross-linked to produce F(ab') 2 fragments (see, for example, Carter et al., Bio/Technology 10, 1992, cc. 163167) . According to another approach, F(ab') 2 fragments can be isolated directly from a recombinant host cell culture. Other techniques for preparing antibody fragments will be apparent to one skilled in the art.
Антитела к TrkB и их антигенсвязывающие фрагменты могут включать модификации.Antibodies to TrkB and their antigen-binding fragments may include modifications.
В определенных вариантах осуществления, может являться желательным применять фрагмент антитела к TrkB, а не интактное антитело. Может являться желательным модифицировать фрагмент антитела для повышения его времени полужизни в сыворотке крови. Это можно осуществлять, например, путем инкорпорования эпитопа связывания рецептора реутилизации в фрагмент антитела. В одном способе, подходящий участок фрагмента антитела может быть изменен (например, мутирован), или эпитоп может быть инкорпорирован в пептидную метку, которую затем сливают с фрагментом антитела на любом конце или в середине, например, путем синтеза ДНК или пептидного синтеза. См., например, WO 96/32478.In certain embodiments, it may be desirable to use an anti-TrkB antibody fragment rather than an intact antibody. It may be desirable to modify an antibody fragment to increase its serum half-life. This can be accomplished, for example, by incorporating a salvage receptor binding epitope into an antibody fragment. In one method, a suitable region of the antibody fragment can be changed (eg, mutated), or the epitope can be incorporated into a peptide tag, which is then fused to the antibody fragment at either end or in the middle, for example, by DNA synthesis or peptide synthesis. See, for example, WO 96/32478.
В других вариантах осуществления, настоящее изобретение включает ковалентные модификации антител к TrkB. Ковалентные модификации включают модификацию цистеинильных остатков, гистидильных остатков, лизинильных и аминоконцевых остатков, аргинильных остатков, тирозильных остатков, карбоксильных боковых групп (аспартил или глутамил), глутаминильных и аспарагинильных остатков, или серильных, или треонильных остатков. Другой тип ковалентной модификации включает химическое или ферментативное сшивание гликозидов с антителом. Указанные модификации можно осуществлять с помощью химического синтеза или путем ферментативного или химического расщепления антитела, если это возможно. Для интродукции других типов ковалентных модификаций в молекулу антитела можно применять взаимодействие меченых аминокислотных остатков антитела с органическим дериватизирующим агентом, который может взаимодействовать с выбранными боковыми цепями или аминоконцевыми или карбоксиконцевыми остатками.In other embodiments, the present invention includes covalent modifications of anti-TrkB antibodies. Covalent modifications include modification of cysteinyl residues, histidyl residues, lysinyl and amino-terminal residues, arginyl residues, tyrosyl residues, carboxyl side groups (aspartyl or glutamyl), glutaminyl and asparaginyl residues, or seryl or threonyl residues. Another type of covalent modification involves chemical or enzymatic cross-linking of glycosides to the antibody. These modifications can be accomplished by chemical synthesis or by enzymatic or chemical cleavage of the antibody, if possible. To introduce other types of covalent modifications into the antibody molecule, interaction of labeled amino acid residues of the antibody with an organic derivatizing agent that can react with selected side chains or amino-terminal or carboxy-terminal residues can be used.
Удаление любых углеводных фрагментов, присутствующих на антителе, можно осуществлять химическим или ферментативным путем. Химическое дегликозилирование описано у Hakimuddin и др., Arch. Biochem. Biophys. 259, 1987, с. 52 и у Edge и др., Anal. Biochem., 118, 1981, с. 131. Ферментативное отщепление углеводных фрагментов на антителах можно осуществлять с помощью эндо- и экзогликозидаз согласно методу, описанному у Thotakura и др., Meth. Enzymol., 138, 1987, с. 350.Removal of any carbohydrate moieties present on the antibody can be accomplished chemically or enzymatically. Chemical deglycosylation is described in Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 1987, p. 52 and in Edge et al., Anal. Biochem., 118, 1981, p. 131. Enzymatic cleavage of carbohydrate moieties on antibodies can be accomplished using endo- and exoglycosidases according to the method described in Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138, 1987, p. 350.
Другой тип пригодной ковалентной модификации предусматривает связывание антитела с одним из многочисленных небелковых полимеров, таких, например, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, с помощью методов, описанных в одном или нескольких US 4640835, US 4496689, US 4301144, US 4670417, US 4791192 и US 4179337.Another type of suitable covalent modification involves coupling the antibody to one of a variety of non-protein polymers, such as, for example, polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol, or polyoxyalkylenes, using the methods described in one or more of US 4,640,835, US 4,496,689, US 4,301,144, US 4,670,417. US 4791192 and US 4179337.
Связывание эпитопаEpitope binding
Антитела согласно изобретению специфически связывается с нативным или рекомбинантным TrkB человека. Антитела согласно настоящему изобретению распознают специфические эпитоп TrkB антигена и TrkB эпитоп. В особенности, антитела согласно изобретению связываются с эпитопом во внеклеточном домене TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.The antibodies of the invention specifically bind to native or recombinant human TrkB. Antibodies of the present invention recognize a specific epitope of the TrkB antigen and a TrkB epitope. In particular, the antibodies of the invention bind to an epitope in the extracellular domain of human TrkB with the sequence SEQ ID NO: 54.
Внеклеточный домен TrkB человека по существу включает следующую последовательность (SEQ ID NO. 54):The extracellular domain of human TrkB essentially includes the following sequence (SEQ ID NO. 54):
- 24 043771- 24 043771
CPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVE AYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSE LILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPS ANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLR ITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTV KGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYT LIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRS NEIPSTDVTDKTGREHCPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVE AYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSE LILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPS ANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSH TQGSLR ITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIFTV KGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYT LIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRS NEIPSTDVTDKTGREH
Как используется в настоящей заявке, термины эпитоп TrkB антигена и TrkB эпитоп относятся к молекуле (например, пептиду) или фрагменту молекулы, способной (ому) связываться с антителом к TrkB или его антигенсвязывающим фрагментом. Эти термины дополнительно включают, например, TrkB антигенную детерминанту, которая распознается любыми из антител или фрагментов антител согласно настоящему изобретению, которая имеет комбинацию CDR легкой и тяжелой цепей, выбранной из CDR легкой цепи, представленных в SEQ ID NO 48-50, и CDR тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 51-53.As used herein, the terms TrkB antigen epitope and TrkB epitope refer to a molecule (eg, peptide) or fragment of a molecule capable of binding to an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof. These terms further include, for example, a TrkB antigenic determinant that is recognized by any of the antibodies or antibody fragments of the present invention that has a combination of light and heavy chain CDRs selected from the light chain CDRs set forth in SEQ ID NOs 48-50 and the heavy chain CDRs. chains presented in SEQ ID NO: 51-53.
Эпитопы TrkB антигена могут быть включены в белки, фрагменты белков, пептиды или подобные. Эпитопы наиболее часто представляют собой белки, короткие олигопептиды, олигопептидные имитаторы (то есть, органические соединения, которые имитируют антителосвязывающие свойства TrkB антигена), или их комбинации.TrkB antigen epitopes may be included in proteins, protein fragments, peptides or the like. Epitopes are most often proteins, short oligopeptides, oligopeptide mimics (ie, organic compounds that mimic the antibody-binding properties of the TrkB antigen), or combinations thereof.
Было обнаружено, что антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению связываются с уникальными эпитопами во внеклеточном домене TrkB человека. Предпочтительно, антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112, 130-143 и/или 205-219 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.Antibodies or antibody fragments of the present invention have been found to bind to unique epitopes in the extracellular domain of human TrkB. Preferably, the anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof binds to at least one amino acid residue within amino acid regions 92-112, 130-143 and/or 205-219 of the human TrkB extracellular domain of SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112 и 130-143; или 92-112 и 205-219; или 130-143 и 205-219; или 92-112 и 130-143 и 205-219 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to at least one amino acid residue within the amino acid regions 92-112 and 130-143; or 92-112 and 205-219; or 130-143 and 205-219; or 92-112 and 130-143 and 205-219 of the extracellular domain of human TrkB with the sequence SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах любой из вышеуказанных комбинаций аминокислотных областей и дополнительно также с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 313-330 и/или 348-367 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to at least one amino acid residue within any of the above combinations of amino acid regions and additionally also to at least one amino acid residue within the amino acid regions 313-330 and/or 348-367 of the extracellular domain of human TrkB with the sequence SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112, 130-143, 205-219, 313-330 и 348-367 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to at least one amino acid residue within the amino acid regions 92-112, 130-143, 205-219, 313-330, and 348- 367 extracellular domain of human TrkB with the sequence SEQ ID NO: 54.
Таким образом, в контексте связывания эпитопа, выражение связывается в пределах аминокислотных областей X-Y... обозначает, что антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотной области, указанной в последовательности.Thus, in the context of epitope binding, the expression binds within the amino acid regions X-Y... means that the anti-TrkB antibody or antigen binding fragment thereof binds to at least one amino acid residue within the amino acid region specified in the sequence.
Если, например, антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112 или 130-143, то это обозначает, что антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком либо в пределах аминокислотных областей 92-112 или 130-143.If, for example, an anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof binds to at least one amino acid residue within the amino acid regions 92-112 or 130-143, then this means that the anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof binds to at least one amino acid residue residue either within amino acid regions 92-112 or 130-143.
В дальнейшем примере, если антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотных областей 92-112 и 130143, то это обозначает, что антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотной области 92-112 и также связывается с по меньшей мере одним аминокислотным остатком в пределах аминокислотной области 130143 SEQ ID NO: 54.In a further example, if the anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof binds to at least one amino acid residue within the amino acid regions 92-112 and 130143, then the anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof binds to at least one amino acid residue within amino acid region 92-112 and also binds to at least one amino acid residue within amino acid region 130143 SEQ ID NO: 54.
В другом аспекте, антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотных областей 92-112, 130-143 и/или 205-219 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.In another aspect, the anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof binds to at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 100% of the amino acid residues within the amino acid regions 92-112, 130-143 and/or 205-219 of the extracellular domain of human TrkB with the sequence SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотных областей 92-112 и 130-143; или 92-112 и 205-219; или 130-143 и 205-219; или 92-112 и 130-143 и 205-219In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85 %, 90%, 95%, or 100% of amino acid residues within amino acid regions 92-112 and 130-143; or 92-112 and 205-219; or 130-143 and 205-219; or 92-112 and 130-143 and 205-219
- 25 043771 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.- 25 043771 extracellular domain of human TrkB with the sequence SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах любой из вышеуказанных комбинаций аминокислотных областей и дополнительно также с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотных областей 313-330 и/или 348-367 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85 %, 90%, 95%, or 100% of amino acid residues within any of the above combinations of amino acid regions and additionally also with at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 %, 85%, 90%, 95%, or 100% of the amino acid residues within amino acid regions 313-330 and/or 348-367 of the human TrkB extracellular domain of SEQ ID NO: 54.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотных областей 92-112, 130-143, 205-219, 313-330 и 348-367 внеклеточного домена TrkB человека с последовательностью SEQ ID NO: 54.In one embodiment, the present invention provides an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85 %, 90%, 95%, or 100% of the amino acid residues within the amino acid regions 92-112, 130-143, 205-219, 313-330, and 348-367 of the human TrkB extracellular domain of SEQ ID NO: 54.
Если, например, антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотных областей 92-112 или 130-143, то это обозначает, что антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотной области 92-112 или связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотной области 130-143.If, for example, an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof binds to at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 100% of amino acid residues within amino acid regions 92-112 or 130-143, this means that the anti-TrkB antibody or antigen binding fragment thereof binds to at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% , 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 100% of amino acid residues within the amino acid region 92-112 or binds to at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 100% of amino acid residues within the amino acid region 130-143.
В дальнейшем примере, если антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотных областей 92-112 и 130-143, то это обозначает, что антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотной области 92112 и также связывается с по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% аминокислотных остатков в пределах аминокислотной области 130-143.In a further example, if the anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof binds to at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 100% of the amino acid residues within the amino acid regions 92-112 and 130-143, this means that the anti-TrkB antibody or antigen binding fragment thereof binds to at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 100% of amino acid residues within amino acid region 92112 and also binds to at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 100% of amino acid residues within the amino acid region 130-143.
Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что благодаря связыванию с новыми эпитопами TrkB антитело проявляет свои намного превосходящие свойства в активации TrkB.Without wishing to be bound by theory, it is believed that by binding to novel TrkB epitopes, the antibody exhibits its far superior properties in activating TrkB.
Полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева и рекомбинантные методыPolynucleotides, vectors, host cells and recombinant methods
Другие варианты осуществления охватывают выделенные полинуклеотиды, которые включают последовательность, кодирующую антитело к TrkB, векторы и клетки-хозяева, содержащие полинуклеотиды, и рекомбинантные методики для получения антитела. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать любую желательную форму антитела к TrkB, включая, например, полноразмерные моноклональные антитела, Fab, Fab', F(ab')2, и Fv фрагменты, диатела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.Other embodiments include isolated polynucleotides, which include an anti-TrkB antibody coding sequence, vectors and host cells containing the polynucleotides, and recombinant techniques for producing the antibody. The isolated polynucleotides may encode any desired form of anti-TrkB antibody, including, for example, full-length monoclonal antibodies, Fab, Fab', F(ab') 2 , and Fv fragments, diabodies, linear antibodies, single-chain antibody molecules, and multispecific antibodies formed from fragments antibodies.
Полинуклеотид(ы), который(е) содержит(ат) последовательность, кодирующую антитело к TrkB или его фрагмент или цепь, может(ут) быть сопряжен(ы) с одной или несколькими регуляторными или контролирующими последовательностями, как известно в данной области техники, и могут содержаться в подходящих экспрессионных векторах или клетках-хозяевах, как известно в данной области техники. Каждая из полинуклеотидных молекул, кодирующих вариабельные домены тяжелой или легкой цепи, может быть независимо сопряжена с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен, такой как константный домен человека, предоставляющий возможность продуцировать интактные антитела. Альтернативно, полинуклеотиды, или их части, могут быть сопряжены совместно, обеспечивая матрицу для получения одноцепочечного антитела.The polynucleotide(s) that contain a sequence encoding an anti-TrkB antibody, or a fragment or chain thereof, may be coupled to one or more regulatory or control sequences, as known in the art, and can be contained in suitable expression vectors or host cells, as known in the art. Each of the polynucleotide molecules encoding the heavy or light chain variable domains can be independently paired with a polynucleotide sequence encoding a constant domain, such as a human constant domain, enabling the production of intact antibodies. Alternatively, the polynucleotides, or portions thereof, may be conjugated together to provide a template for the production of a single chain antibody.
Для рекомбинантного получения, полинуклеотид, кодирующий антитело, вставлен в реплицируемый вектор для клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии. Доступны различные подходящие векторы для экспрессии рекомбинантных антитело. Компоненты вектора обычно включают, но не ограничиваясь только ими, один или несколько следующих компонентов: сигнальная последовательность, начало репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор, и последовательность терминации транскрипции.For recombinant production, a polynucleotide encoding an antibody is inserted into a replicable vector for cloning (DNA amplification) or expression. Various suitable vectors for expression of recombinant antibodies are available. Vector components typically include, but are not limited to, one or more of the following components: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence.
Антитела к TrkB также могут быть получены в виде слитых полипептидов, в которых антитело слито с гетерологичным полипептидом, таким как сигнальная последовательность или другой полипептид, имеющий специфический сайт расщепления на аминоконце зрелого белка или полипептида. Гетерологическую сигнальную последовательность типично выбирают из последовательности, которая распознается и процессируется (то есть, расщепляется сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не распознают и не процессируют сигнальную последовательность антитела к TrkB, сигнальная последовательность может быть заменена прокариотической сигнальной последовательностью. Сигнальная последовательность может представлять собой, например, щелочную фосфатазу, пенициллиназу, липопротеин, лидерные последовательности термостабильного энтеротоксина II и подобные. Для секреции дрожжами, нативная сигнальная последовательность может быть заменена, например, лидерной последовательностью, полученной из инвертазы альфа-фактора дрожжей (включаяAntibodies to TrkB can also be prepared as fusion polypeptides in which the antibody is fused to a heterologous polypeptide, such as a signal sequence or other polypeptide having a specific cleavage site at the amino terminus of the mature protein or polypeptide. The heterologous signal sequence is typically selected from a sequence that is recognized and processed (ie, cleaved by a signal peptidase) by the host cell. For prokaryotic host cells that do not recognize or process the anti-TrkB antibody signal sequence, the signal sequence can be replaced with a prokaryotic signal sequence. The signal sequence may be, for example, alkaline phosphatase, penicillinase, lipoprotein, thermostable enterotoxin II leader sequences, and the like. For secretion by yeast, the native signal sequence may be replaced, for example, by a leader sequence derived from yeast alpha factor invertase (including
- 26 043771 лидерные последовательности а-факторов Saccharomyces и Kluyveromyces), кислой фосфатазой, глюкоамилазой С. albicans или сигнальной последовательностью, описанной в WO 90/13646. В клетках млекопитающих, можно использовать сигнальные последовательности млекопитающих, а также вирусные секреторные лидерные последовательности, например, gD сигнальную последовательность простого герпеса. ДНК для такого участка-прекурсора лигируют в рамке считывания с ДНК, кодирующей гуманизированное антитело к TrkB.- 26 043771 leader sequences of the a-factors of Saccharomyces and Kluyveromyces), acid phosphatase, glucoamylase of C. albicans or the signal sequence described in WO 90/13646. In mammalian cells, mammalian signal sequences as well as viral secretory leader sequences, for example the herpes simplex gD signal sequence, can be used. The DNA for such a precursor region is ligated in frame to DNA encoding a humanized anti-TrkB antibody.
Экспрессионные и клонирующие векторы содержат нуклеотидную последовательность, которая предоставляет возможность вектору реплицироваться в одной или нескольких выбранных клеткаххозяевах. В целом, в клонирующих векторах эта последовательность представляет собой последовательность, которая предоставляет возможность вектору реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина, и включает начала репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны для различных бактерий, дрожжей и вирусов. Начало репликации из плазмиды pBR322 является подходящим для большинства грамм-отрицательных бактерий, начало репликации 2-υ. Плазмиды являются подходящими для дрожжей, и различные вирусные начала репликации (SV40, полиома, аденовирус, VSV, и BPV) пригодны для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. В целом, компонент начала репликации не является необходимым для экспрессионных векторов млекопитающих (начало репликации SV40 типично можно использовать только потому, что он содержит ранний промотор).Expression and cloning vectors contain a nucleotide sequence that enables the vector to replicate in one or more selected host cells. In general, in cloning vectors, this sequence is the sequence that enables the vector to replicate independently of host chromosomal DNA, and includes origins of replication or autonomously replicating sequences. Such sequences are well known for various bacteria, yeasts and viruses. The origin of replication from plasmid pBR322 is suitable for most gram-negative bacteria, the origin of replication is 2-υ. Plasmids are suitable for yeast, and various viral origins of replication (SV40, polyoma, adenovirus, VSV, and BPV) are suitable as cloning vectors in mammalian cells. In general, the origin of replication component is not necessary for mammalian expression vectors (the SV40 origin of replication can typically be used only because it contains an early promoter).
Экспрессионные и клонирующие векторы могут содержать ген, который кодирует селектируемый маркер для облегчения идентификации экспрессии. Типичные селектируемые маркерные гены кодируют белки, которые придают резистентность к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, или альтернативно, являются комплементами аксотрофных дефицитов, или в других альтернативных вариантах, восполняют специфические питательные вещества, которые не присутствуют в комплексных питательных средах, например, ген, кодирующий D-аланин рацемат для Bacilli.Expression and cloning vectors may contain a gene that encodes a selectable marker to facilitate identification of expression. Typical selectable marker genes encode proteins that confer resistance to antibiotics or other toxins, such as ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, or alternatively, complement axotrophic deficiencies, or in other alternatives, supplement specific nutrients that are not present in complex culture media, for example, the gene encoding the D-alanine racemate for Bacilli.
В одном из примеров схемы селекции используется лекарственное средство для остановки роста клетки-хозяина. Те клетки, которые успешно трансформированы гетерологичным геном, продуцируют белок, придающий резистентность к лекарственному средству, и, следовательно, выживают в схеме селекции. Примерами такой доминантной селекции является использование лекарственных средств неомицин, микофеноловая кислота и гигромицин. Общепринятыми селектируемыми маркерами для клеток млекопитающих являются те, которые предоставляют возможность идентификации клеток, компетентных за принятие нуклеиновой кислоты, кодирующей гуманизированное антитело к TrkB, такие как DHFR (дигидрофолатредуктаза), тимидинкиназа, металлотионеин-I и -II (такие как гены металлотионеина приматов), аденозиндеаминаза, орнитиндекарбоксилаза, и другие. Клетки, трансформируемые с помощью DHFR-селектируемого гена, сначала идентифицируют путем культивирования всех трансформантов в культуральной среде, которая содержит метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR. Применяемая подходящая клетка-хозяин, если используют DHFR дикого типа, представляет собой клеточную линию яичников китайского хомячка (СНО) с дефицитом активности DHFR (например, DG44).One example of a selection scheme uses a drug to stop the growth of a host cell. Those cells that are successfully transformed with the heterologous gene produce the drug resistance protein and therefore survive the selection scheme. Examples of such dominant selection are the use of the drugs neomycin, mycophenolic acid and hygromycin. Common selectable markers for mammalian cells are those that provide the ability to identify cells competent to accept a nucleic acid encoding a humanized anti-TrkB antibody, such as DHFR (dihydrofolate reductase), thymidine kinase, metallothionein-I and -II (such as the primate metallothionein genes), adenosine deaminase, ornithine decarboxylase, and others. Cells transformed by the DHFR-selectable gene are first identified by culturing all transformants in a culture medium that contains methotrexate (Mtx), a competitive antagonist of DHFR. A suitable host cell used, if wild-type DHFR is used, is a Chinese hamster ovary (CHO) cell line deficient in DHFR activity (eg, DG44).
Альтернативно, клетки-хозяева (предпочтительно хозяева дикого типа, которые содержат эндогенный DHFR), трансформированные или котрансформированные последовательностями ДНК, кодирующими антитело к TrkB, белок DHFR дикого типа, и другой селектируемый маркер, такой как аминогликозид 3'-фосфотрансфераза (АРН), могут быть селектированы путем роста клеток в среде, содержащей селектируемый агент для селектируемого маркера, такой как аминогликозидный антибиотик, например, канамицин, неомицин, или G418. см., например, патент US 4,965,199.Alternatively, host cells (preferably wild-type hosts that contain endogenous DHFR) transformed or cotransformed with DNA sequences encoding an anti-TrkB antibody, wild-type DHFR protein, and another selectable marker such as aminoglycoside 3'-phosphotransferase (APH) can be selected by growing the cells in a medium containing a selectable agent for the selectable marker, such as an aminoglycoside antibiotic, eg kanamycin, neomycin, or G418. see, for example, US patent 4,965,199.
Когда рекомбинантное получение осуществляют в дрожжевой клетке в качестве клетки-хозяина, то в качестве селектируемого маркера можно использовать ген TRP1, присутствующий в дрожжевой плазмиде YRp7 (Stinchcomb и др., 1979, Nature 282: 39). Ген TRP1 обеспечивает селекционный маркер для мутантного штамма дрожжей, у которого отсутствует способность расти в триптофане, например, № АТСС 44076 или РЕР4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). Впоследствии присутствие trp1 поражения в геноме дрожжевой клетки-хозяина обеспечивает эффективное окружение для обнаружения трансформации путем роста при отсутствии триптофана. Аналогичным образом, штаммы дрожжей с дефицитом Leu2p, такие как АТСС 20,622 и 38,626 дополняются известными плазмидами, несущими ген LEU2.When recombinant production is carried out in a yeast cell as a host cell, the TRP1 gene present in the yeast plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39) can be used as a selectable marker. The TRP1 gene provides a selection marker for a mutant yeast strain that lacks the ability to grow on tryptophan, such as ATCC No. 44076 or PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). Subsequently, the presence of the trp1 lesion in the host yeast cell genome provides an efficient environment for detecting transformation by growth in the absence of tryptophan. Likewise, Leu2p-deficient yeast strains such as ATCC 20,622 and 38,626 are complemented with known plasmids carrying the LEU2 gene.
Дополнительно, векторы, имеющие происхождение из кольцевой плазмиды 1,6 мкм pKD1, можно использовать для трансформации дрожжей Kluyveromyces. Альтернативно была описана экспрессионная система для промышленного получения рекомбинантного телячьего химозина для K. lactis (Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). Также были описаны стабильные многокопийные экспрессирующие векторы для секреции зрелого рекомбинантного сывороточного альбумина человека с помощью промышленных штаммов Kluyveromyces (Fleer и др., 1991, Bio/Technology 9:968-975).Additionally, vectors derived from the 1.6 μm circular plasmid pKD1 can be used to transform Kluyveromyces yeast. Alternatively, an expression system for the industrial production of recombinant bovine chymosin for K. lactis has been described (Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). Stable multicopy expression vectors for the secretion of mature recombinant human serum albumin using commercial Kluyveromyces strains have also been described (Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975).
Экспрессионные и клонирующие векторы обычно содержат промотор, который распознается организмом-хозяином и функционально связан с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело к TrkB или его полипептидную цепь. Промоторы, подходящие для применения с прокариотическими хо- 27 043771 зяевами, включают phoA промотор, β-лактамазную и лактозную промоторные системы, щелочную фосфатазу, триптофановую (trp) промоторную систему, и гибридные промоторы, такие как tac промотор.Expression and cloning vectors typically contain a promoter that is recognized by the host and is operably linked to a nucleic acid molecule encoding an anti-TrkB antibody or polypeptide chain thereof. Promoters suitable for use with prokaryotic hosts include the phoA promoter, the β-lactamase and lactose promoter systems, the alkaline phosphatase, the tryptophan (trp) promoter system, and hybrid promoters such as the tac promoter.
Подходящими также являются другие известные бактериальные промоторы. Промоторы для применения в бактериальных системах также будут содержать последовательность Шайна-Дальгамо (Shine-Dalgamo,Other known bacterial promoters are also suitable. Promoters for use in bacterial systems will also contain a Shine-Dalgamo sequence.
S.D.), функционально связанную с ДНК, кодирующей гуманизированное антитело к TrkB.S.D.), functionally linked to DNA encoding a humanized antibody to TrkB.
Известны многие эукариотические промоторные последовательности. В действительности, все эукариотические гены имеют АТ-обогащенный участок, расположенный на приблизительно 25-30 пар против хода транскрипции от сайта инициации транскрипции. Другая последовательность, в которой 70-80 оснований против хода транскрипции от старта транскрипции многих генов, представляет собой CNCAAT участок, где N может представлять собой любой нуклеотид. На 3' конце большинства эукариотических генов присутствует ААТААА последовательность, которая может являться сигналом для добавления поли-А хвоста к 3' концу кодирующей последовательности. Все эти последовательности подходяще вставлены в экспрессионные векторы.Many eukaryotic promoter sequences are known. In fact, all eukaryotic genes have an AT-rich region located approximately 25-30 bp upstream of the transcription start site. Another sequence, 70-80 bases upstream from the start of transcription of many genes, is the CNCAAT region, where N can be any nucleotide. At the 3' end of most eukaryotic genes there is an AATAAAA sequence, which can be a signal for the addition of a poly-A tail to the 3' end of the coding sequence. All of these sequences are suitably inserted into expression vectors.
Примеры подходящих промоторных последовательностей для применения с дрожжами-хозяевами, включают промоторы для 3-фосфоглицерат киназы или других гидролитических ферментов, таких как енолаза, глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа, гексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицерат мутаза, пируват киназа, триозофосфат изомераза, фосфоглюкозоизомераза, и глюкокиназа.Examples of suitable promoter sequences for use with yeast hosts include promoters for 3-phosphoglycerate kinase or other hydrolytic enzymes such as enolase, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, triosephosphate isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase.
Индуцибельные промоторы имеют дополнительные преимущества транскрипции под контролем условий роста. Они включают промоторные участки дрожжей для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, производных ферментов, связанных с метаболизмом азота, металлотионеина, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящие векторы и промоторы для применения для экспрессии в дрожжах дополнительно описаны в ЕР 73,657. Дрожжевые энхансеры также благоприятно используются с дрожжевыми промоторами.Inducible promoters have the added benefit of transcription under the control of growth conditions. These include the yeast promoter regions for alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, derivative enzymes associated with nitrogen metabolism, metallothionein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and enzymes responsible for the utilization of maltose and galactose. Suitable vectors and promoters for use for expression in yeast are further described in EP 73,657. Yeast enhancers are also advantageously used with yeast promoters.
Транскрипция антитела к TrkB из векторов в клетках-хозяевах млекопитающих контролируется, например, промоторами, полученными из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы кур, аденовирус (такой как Аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и вирус обезьян 40 (SV40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например, актиновый промотор или иммуноглобулиновый промотор, или из промоторов теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев.Transcription of anti-TrkB antibody from vectors in mammalian host cells is controlled, for example, by promoters derived from the genomes of viruses such as polyoma virus, fowlpox virus, adenovirus (such as Adenovirus 2), bovine papillomavirus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus , retrovirus, hepatitis B virus and simian virus 40 (SV40), from heterologous mammalian promoters, for example, actin promoter or immunoglobulin promoter, or from heat shock promoters, provided that such promoters are compatible with host cell systems.
Ранние и поздние промоторы вируса SV40 легко получают в виде рестрикционного фрагмента SV40, который также содержит начало репликации вируса SV40. Немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека легко получают в виде рестрикционного фрагмента HindIII E. Система для экспрессии ДНК в млекопитающих-хозяевах, используя вирус папилломы крупного рогатого скота в качестве вектора, описан в патенте US № 4,419,446. Модификация этой системы описана в патенте US № 4,601,978. См. также Reyes и др., 1982, Nature 297:598-601, где описана экспрессия кДНК п-интерферона человека в мышиных клетках под контролем тимидинкиназного промотора из вируса простого герпеса. Альтернативно, в качестве промотора можно использовать длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса.The SV40 early and late promoters are readily obtained as an SV40 restriction fragment, which also contains the SV40 origin of replication. The immediate early promoter of human cytomegalovirus is readily obtained as a HindIII E restriction fragment. A system for expressing DNA in mammalian hosts using bovine papillomavirus as a vector is described in US Pat. No. 4,419,446. A modification of this system is described in US Patent No. 4,601,978. See also Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601, which describes the expression of human p-interferon cDNA in mouse cells under the control of the thymidine kinase promoter from herpes simplex virus. Alternatively, the Rous sarcoma virus long terminal repeat can be used as a promoter.
Другим полезным элементом, который может использоваться в рекомбинантном экспрессионном векторе, является энхансерная последовательность, которую используют для усиления транскрипции ДНК, кодирующей антитело к TrkB, высшими эукариотами. В настоящее время известны много энхансерных последовательностей из генов млекопитающих (например, глобин, эластаза, альбумин, αфетопротеин и инсулин). Тем не менее, типично используют энхансер из вируса эукариотической клетки. Примеры включают SV40 энхансер на поздней стороне начала репликации (по 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне начала репликации и аденовирусные энхансеры. Также см. Yaniv, 1982, Nature 297:17-18 относительно описания энхансерных элементов для активации эукариотических промоторов. Энхансер может быть сплайсирован в вектор в положении 5' или 3' к антителу к TrkB-кодирующей последовательности, но предпочтительно он расположен на 5' сайте от промотора.Another useful element that can be used in a recombinant expression vector is an enhancer sequence, which is used to enhance transcription of DNA encoding an anti-TrkB antibody by higher eukaryotes. Currently, many enhancer sequences are known from mammalian genes (eg, globin, elastase, albumin, α-fetoprotein, and insulin). However, typically an enhancer from a eukaryotic cell virus is used. Examples include the SV40 late origin enhancer (100-270), cytomegalovirus early promoter enhancer, late polyoma enhancer, and adenoviral enhancers. Also see Yaniv, 1982, Nature 297:17-18 for a description of enhancer elements for activation of eukaryotic promoters. The enhancer can be spliced into the vector at a position 5' or 3' to the anti-TrkB antibody coding sequence, but is preferably located at a site 5' from the promoter.
Экспрессионные векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (дрожжи, грибы, насекомые, растения, животные, люди или ядросодержащих клетках из других многоклеточных организмов) также могут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности являются общедоступными из 5' и, иногда 3', нетранслируемых участков эукариотических или вирусных ДНК или к ДНК. Эти участки содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслируемой части мРНК, кодирующей антитело к TrkB. Одним из пригодных компонентов терминации транскрипции является участок полиаденилирования бычьего гормона роста. См. WO94/11026 и экспрессионный вектор, описанный в этом документе. В некоторых вариантах осуществления, антитела к TrkB могут быть экспрессированы, используя CHEF систему. (См., например, патент US № 5888809; содержание которого включено в настоящую заявку в качестве ссылки.)Expression vectors used in eukaryotic host cells (yeast, fungi, insects, plants, animals, humans or nucleated cells from other multicellular organisms) may also contain sequences necessary for transcription termination and for mRNA stabilization. Such sequences are publicly available from the 5' and sometimes 3' untranslated regions of eukaryotic or viral DNA or to DNA. These regions contain nucleotide segments transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding the anti-TrkB antibody. One useful transcription termination component is the bovine growth hormone polyadenylation site. See WO94/11026 and the expression vector described therein. In some embodiments, anti-TrkB antibodies can be expressed using the CHEF system. (See, for example, US Pat. No. 5,888,809; the contents of which are incorporated herein by reference.)
- 28 043771- 28 043771
Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессирования ДНК в векторах согласно настоящему изобретению представляют собой клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот, описанные выше. Подходящие прокариоты для этой цели включат эубактерии, такие как грамм-отрицательные или грамм-положительные организмы, например, Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например, Е. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigella, а также Bacilli, такие как В. subtilis и В. licheniformis (например, В. licheniformis 41 Р, раскрытые в DD 266,710, опубликованном 12 апреля 1989 г.), Pseudomonas, такие как P. aeruginosa, и Streptomyces. Одним из предпочтительных хозяев для клонирования Е. coli является Е. coli 294 (АТСС 31,446), хотя пригодны также другие штаммы, такие как Е. coli В, Е. coli X1776 (АТСС 31,537), и Е. coli W3110 (АТСС 27,325). Эти примеры являются иллюстративными, а не ограничительными.Suitable host cells for cloning or expressing DNA in the vectors of the present invention are prokaryotic, yeast or higher eukaryotic cells as described above. Suitable prokaryotes for this purpose include eubacteria, such as gram-negative or gram-positive organisms, e.g. Enterobacteriaceae, such as Escherichia, e.g. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g. Salmonella typhimurium, Serratia, for example, Serratia marcescans, and Shigella, as well as Bacilli, such as B. subtilis and B. licheniformis (for example, B. licheniformis 41 P, disclosed in DD 266,710, published April 12, 1989), Pseudomonas, such as P. aeruginosa , and Streptomyces. One of the preferred hosts for cloning E. coli is E. coli 294 (ATCC 31,446), although other strains such as E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), and E. coli W3110 (ATCC 27,325) are also suitable. . These examples are illustrative and not restrictive.
Дополнительно к прокариотам, эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессирования векторов, кодирующих антитело к TrkB. Saccharomyces cerevisiae, или общераспространенные хлебопекарные дрожжи наиболее часто используются среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев. Тем не менее, различные другие рода, виды и штаммы является общедоступными и пригодными в настоящей заявке, такие как Schizosaccharomyces pombe; хозяева Kluyveromyces, такие как, например, K. lactis, K. fragilis (АТСС 12,424), K. bulgaricus (АТСС 16,045), K. wickeramii (АТСС 24,178), K. waltii (АТСС 56,500), K. drosophilarum (АТСС 36,906), K. thermotolerans, и K. marxianus; yarrowia (ЕР 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и нитчатые грибы, такие как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, и хозяева Aspergillus, такие как А. nidulans и A. niger.In addition to prokaryotes, eukaryotic microorganisms such as filamentous fungi or yeast are suitable hosts for cloning or expressing vectors encoding an anti-TrkB antibody. Saccharomyces cerevisiae, or the common baker's yeast, is the most commonly used lower eukaryotic microorganism host. However, various other genera, species and strains are publicly available and useful herein, such as Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces hosts, such as, for example, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906 ), K. thermotolerans, and K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces such as Schwanniomyces occidentalis; and filamentous fungi such as, for example, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, and Aspergillus hosts such as A. nidulans and A. niger.
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела к TrkB имеют происхождение из многоклеточных организмов. Примеры беспозвоночных клеток включают клетки растений и насекомых, включая, например, различные бакуловирусные штаммы и варианты и соответствующие разрешенные насекомые клетки-хозяева из таких организмов, как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая мушка), и Bombyx mori (шелковичный червь). Общедоступны различные вирусные штаммы для трансфекции, например, L-1 вариант Autographa californica NPV и Bm-5 штамм Bombyx mori NPV, и такие вирусы можно использовать, в особенности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.Suitable host cells for expressing glycosylated anti-TrkB antibodies are derived from multicellular organisms. Examples of invertebrate cells include plant and insect cells, including, for example, various baculovirus strains and variants and corresponding insect-permitted host cells from organisms such as Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (fruit fly), and Bombyx mori (silkworm). Various viral strains are publicly available for transfection, such as the L-1 variant of Autographa californica NPV and the Bm-5 strain of Bombyx mori NPV, and such viruses can be used particularly for transfection of Spodoptera frugiperda cells.
Также в качестве хозяев могут использоваться культуры растительных клеток хлопчатника, кукурузы, картофеля, сои, петунии, томата и табака.Plant cell cultures of cotton, corn, potatoes, soybeans, petunia, tomato and tobacco can also be used as hosts.
Антитела к TrkB или их антигенсвязывающие фрагменты согласно изобретению также могут быть инкорпорированы в вирусные векторы, то есть, полинуклеотид, кодирующий антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, интродуцируют в вирусный вектор и затем экспрессируют в организме пациента после инфицирования вирусом.Anti-TrkB antibodies or antigen-binding fragments thereof according to the invention can also be incorporated into viral vectors, that is, a polynucleotide encoding an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof is introduced into a viral vector and then expressed in the patient after infection with the virus.
В другом аспекте, экспрессию антител к TrkB осуществляют в клетках позвоночных. Размножение клеток позвоночных в культуре (тканевая культура) стало обычной процедурой и техники являются широкодоступными. Примерами пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия почек обезьян CV1, трансформированная с помощью SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), линий почки эмбриона человека (293 или 293 клетки, субклонированные для роста в суспензионной культуре, (Graham и др., 1977, J. Gen Virol. 36: 59), клетки почки новорожденного хомяка (ВНК, ATCC CCL 10), клетки яичника китайского хомячка/-DHFR1 (СНО, Urlaub и др., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; например, DG44), клетки Сертоли мышей (ТМ4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), клетки почки обезьян (CV1 ATCC CCL 70), клетки почки африканской зеленой обезьяны (VERO-76, ATCC CRL-1587), клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2), клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34), клетки почки крысы линии Buffalo (BRL 3А, АТСС CRL 1442), клетки легких человека (W138, АТСС CCL 75), клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065), опухоль молочной железы мышей (ММТ 060562, АТСС CCL51), TR1 клетки (Mather и др., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68), MRC 5 клетки, FS4 клетки, и линия гепатомы человека (Hep G2).In another aspect, the expression of antibodies to TrkB is carried out in vertebrate cells. Propagating vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a common procedure and techniques are widely available. Examples of suitable mammalian host cell lines include the monkey kidney line CV1 transformed with SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), human embryonic kidney lines (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, (Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59), newborn hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10), Chinese hamster ovary cells/-DHFR1 (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; e.g. DG44), mouse Sertoli cells (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70), African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587), human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2), dog kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34), Buffalo rat kidney cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442), human lung cells (W138, ATCC CCL 75), human liver cells (Hep G2, HB 8065), mouse mammary tumor (MMT 060562, ATCC CCL51), TR1 cells (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68) , MRC 5 cells, FS4 cells, and a human hepatoma line (Hep G2).
Клетки-хозяева трансформируют с помощью вышеописанных экспрессионных или клонирующих векторов для продукции антитела к TrkB и культивируют в подходящей питательной среде, модифицированной, если это является подходящим, для индуцирования промоторов, отбора трансформантов, или амплификации генов, кодирующих желательные последовательности.Host cells are transformed with the expression or cloning vectors described above to produce anti-TrkB antibodies and cultured in a suitable growth medium modified, if appropriate, to induce promoters, select transformants, or amplify genes encoding the desired sequences.
Клетки-хозяева, используемые для продуцирования антитела к TrkB, описанные в настоящей заявке, могут культивироваться в различных питательных средах. Коммерчески доступные среды, такие как Ham F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), минимальная питательная среда ((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.), и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла ((DMEM), Sigma-Aldrich Co.) являются подходящими для культивирования клеток-хозяев. Дополнительно, любая из сред, описанных в одном или нескольких источниках: Ham и др., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes и др., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, патент US № 4,767,704, патент uS № 4,657,866, патент US № 4,927,762, патент US № 4,560,655, патент US № 5,122,469, WO 90/103430, и WO 87/00195, может использоваться вThe host cells used to produce the anti-TrkB antibodies described herein can be cultured in a variety of culture media. Commercially available media such as Ham F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), Minimal Essential Medium (MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.), and Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma-Aldrich Co.) are suitable for culturing host cells. Additionally, any of the media described in one or more of the following: Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal Biochem 102: 255, US Patent No. 4,767,704, US Patent No. 4,657,866, US Patent No. 4,927,762, US Patent No. 4,560,655, US Patent No. 5,122,469, WO 90/103430, and WO 87/00195, can be used in
- 29 043771 качестве культуральной среды для клеток-хозяев. Любые из этих сред могут быть дополнены, при необходимости, гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или фактор роста эпидермиса), солями (такими как хлорид натрия, кальция, магния, и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как гентамицин), микроэлементами (определяемые как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне), и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Другие добавки также можно включать в подходящих концентрациях, что является очевидным для квалифицированного специалиста в данной области техники. Условия культивирования, такие как температура, рН и другие, представляют собой условия, которые ранее использовались для клетки-хозяина, выбранной для экспрессии, и будут понятными квалифицированному специалисту в данной области техники.- 29 043771 as a culture medium for host cells. Any of these media may be supplemented, if necessary, with hormones and/or other growth factors (such as insulin, transferrin or epidermal growth factor), salts (such as sodium chloride, calcium, magnesium, and phosphate), buffers (such as HEPES ), nucleotides (such as adenosine and thymidine), antibiotics (such as gentamicin), trace minerals (defined as inorganic compounds typically present in final concentrations in the micromolar range), and glucose or an equivalent energy source. Other additives may also be included in suitable concentrations as will be apparent to one skilled in the art. Culture conditions, such as temperature, pH, and others, are conditions that have previously been used for the host cell selected for expression and will be understood by one skilled in the art.
При использовании рекомбинантных техник, антитело может продуцироваться внутриклеточно, в периплазматическое пространство, или непосредственно секретируется в питательную среду. Если антитело продуцируется внутриклеточно, то клетки могут быть разрушены для высвобождения белка в качестве первой стадии. Отходы в виде частичек, либо клетки-хозяева или лизированные фрагменты, могут быть удалены, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации. В Carter и др., 1992, Bio/Technology 10:163-167 описана процедура для выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство Е. coli. Вкратце, клеточную массу размораживают в присутствии ацетата натрия (рН 3,5), EDTA, и фенилметилсульфонилфторид (PMSF) приблизительно в течение 30 минут. Клеточный дебрис может быть удален путем центрифугирования. Если антитело секретируется в питательную среду, то супернатанты с таких экпрессирующих систем в целом сначала концентрируют, используя коммерчески доступный фильтр для концентрации белка, например, ультрафильтационный блок Amicon или Millipore Pellicon. Ингибитор протеазы, такой как PMSF, может быть включен в любую из вышеуказанных стадий для ингибирования протеолиза и антибиотики могут быть включены для предотвращения роста случайных загрязнителей. Для выделения антитела из клетки-хозяина можно использовать различные методы.Using recombinant techniques, the antibody can be produced intracellularly, into the periplasmic space, or directly secreted into the culture medium. If the antibody is produced intracellularly, the cells can be disrupted to release the protein as a first step. Particulate waste, either host cells or lysed fragments, can be removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration. Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167 describes a procedure for isolating antibodies that are secreted into the periplasmic space of E. coli. Briefly, the cell mass is thawed in the presence of sodium acetate (pH 3.5), EDTA, and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) for approximately 30 minutes. Cellular debris can be removed by centrifugation. If the antibody is secreted into the culture medium, the supernatants from such expression systems are generally first concentrated using a commercially available protein concentration filter, such as an Amicon or Millipore Pellicon ultrafiltration unit. A protease inhibitor such as PMSF may be included in any of the above steps to inhibit proteolysis and antibiotics may be included to prevent the growth of incidental contaminants. Various methods can be used to isolate an antibody from a host cell.
Композиция антитела, приготовленная из клеток, может быть очищена, например, путем хроматографии с гидроксиапатитом, гель-электрофореза, диализа и афинной хроматографии, где типичной техникой очистки является афинная хроматография. Пригодность белка А в качестве афинного лиганда зависит от видов и изотипа любого домена Fc иммуноглобулина, который присутствует в антителе. Белок А можно использовать для очистки антитела, которые основываются на тяжелых цепях гамма1, гамма2, или гамма4 человека (см., например, Lindmark и др., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13). Белок G рекомендуется для всех мышиных изотипов и для гамма3 человека (см., например, Guss и др., 1986 EMBO J. 5:1567-1575). Матрицей, к которой присоединен афинный лиганд, наиболее часто представляет собой агарозу, но доступны также другие матриксы. Механично стабильные матрицы, такие как стекло с заданным размером пор или поли(стиролдивинил)бензол предоставляют возможность более быстрых скоростей потоков и более короткого времени обработки, которого можно достичь с агарозой. Если антитело включает CH3 домен, то смола Bakerbond ABX™ (J. Т. Baker, Phillipsburg, N.J.) является подходящей для очистки. Также доступны других технологии для очистки белков, такие как фракционирование на ионо-обменной колонке, осаждение с этанолом, ВЭЖХ с обращенной фазой, хроматография на диоксиде кремния, хроматография на гепарин SEPHAROSE™ хроматография на анион- или катион-обменной смоле (такой как колонка с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE, и осаждение с сульфатом аммония, в зависимости от восстанавливаемого антитела.The antibody composition prepared from cells can be purified, for example, by hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis and affinity chromatography, where a typical purification technique is affinity chromatography. The suitability of protein A as an affinity ligand depends on the species and isotype of any immunoglobulin Fc domain that is present in the antibody. Protein A can be used to purify antibodies that are based on human gamma1, gamma2, or gamma4 heavy chains (see, eg, Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13). Protein G is recommended for all murine isotypes and for human gamma3 (see, eg, Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575). The matrix to which the affinity ligand is attached is most often agarose, but other matrices are also available. Mechanically stable matrices such as controlled pore glass or poly(styrene divinyl)benzene offer the possibility of faster flow rates and shorter processing times, which can be achieved with agarose. If the antibody includes a C H3 domain, then Bakerbond ABX™ resin (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) is suitable for purification. Other technologies for protein purification are also available, such as ion exchange column fractionation, ethanol precipitation, reverse phase HPLC, silica chromatography, heparin chromatography SEPHAROSE™ chromatography on anion or cation exchange resin (such as a polyaspartic acid), chromatofocusing, SDS-PAGE, and ammonium sulfate precipitation, depending on the antibody being reduced.
После любой (любых) подготовительной (подготовительных) стадии (стадий) очистки, смесь, содержащую представляющее интерес антитело и загрязнители, можно подвергать хроматографии с гидрофобным взаимодействием при низких рН, используя элюирующий буфер при рН в диапазоне 2,5-4,5, типично осуществляют при низких концентрациях соли (например, от приблизительно 0-0,25 М соли).After any preparatory purification step(s), the mixture containing the antibody of interest and contaminants can be subjected to hydrophobic interaction chromatography at low pH using an elution buffer at a pH in the range of 2.5-4.5, typically carried out at low salt concentrations (eg, from about 0-0.25 M salt).
Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются в расслабленных, умеренных или строгих условиях, как указано в настоящей заявке, со всей или частью (например, частью, которая кодирует вариабельную область) нуклеотидной последовательности, которая представляет собой выделенную(е) полинуклеотидную(е) последовательность(и), кодирующую(е) антитело к TrkB или фрагмент антитела. Гибридизующаяся область гибридизующейся нуклеиновой кислоты, как правило, состоит из по меньшей мере 15 (например, 20, 25, 30 или 50) нуклеотидов. Гибридизующаяся область гибридизующейся нуклеиновой кислоты идентична по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, последовательности участка или всей нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид к TrkB (например, вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи), или ее комплементу. Гибридизирующие нуклеиновые кислоты описанного в настоящей заявке типа можно использовать, например, в качестве зонда для клонирования, праймера, например, ПЦР-праймера или диагностического зонда.The invention also relates to nucleic acids that hybridize under relaxed, mild or stringent conditions, as defined herein, with all or part (for example, a part that encodes a variable region) of a nucleotide sequence that represents the isolated polynucleotide(s). ) sequence(s) encoding an anti-TrkB antibody or antibody fragment. The hybridizing region of the hybridizing nucleic acid typically consists of at least 15 (eg, 20, 25, 30, or 50) nucleotides. The hybridizing region of the hybridizing nucleic acid is at least 80% identical, such as at least 90%, at least 95%, or at least 98% identical to the sequence of the region or all of the nucleic acid encoding an anti-TrkB polypeptide (e.g. , heavy chain or light chain variable region), or its complement. Hybridizing nucleic acids of the type described herein can be used, for example, as a cloning probe, a primer, for example a PCR primer, or a diagnostic probe.
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение включает выделенный(е) полинуклеотид(ы), включающий(е) последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющее/имеющий вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь, где аминокислотная по- 30 043771 следовательность вариабельной легкой цепи и аминокислотная последовательность вариабельной тяжелой цепи являются по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичны аминокислотным последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 2 и 12, или 3 и 13, или 4 и 14, или 5 и 15, или 6 и 16, или 7 и 17, или 8 иIn some embodiments, the present invention includes isolated polynucleotide(s) comprising sequences that encode an antibody or antibody fragment having/having a variable light chain and a variable heavy chain, wherein the amino acid sequence of the variable light chain chains and amino acid sequence of the variable heavy chain are at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 2 and 12, or 3 and 13, or 4 and 14, or 5 and 15, or 6 and 16, or 7 and 17, or 8 and
18, или 9 и 19, или 10 и 20, соответственно.18, or 9 and 19, or 10 and 20, respectively.
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение включает выделенный (е) полинуклеотид (ы), включая последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющее/имеющий легкую цепь и тяжелую цепь, где аминокислотная последовательность легкой цепи и аминокислотная последовательность тяжелой цепи являются по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичны аминокислотным последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 21 и 22 или 23; 24 и 25 или 26; 27 и 28 или 29; 30 и 31 или 32; 33 и 34 или 35; 36 и 37 или 38; 39 и 40 или 41; 42 и 43 или 44; 45 и 46 или 47, соответственно.In some embodiments, the present invention includes isolated polynucleotide(s), including sequences that encode an antibody or antibody fragment having/having a light chain and a heavy chain, wherein the light chain amino acid sequence and the heavy chain amino acid sequence are at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequences presented in SEQ ID NO: 21 and 22 or 23; 24 and 25 or 26; 27 and 28 or 29; 30 and 31 or 32; 33 and 34 or 35; 36 and 37 or 38; 39 and 40 or 41; 42 and 43 or 44; 45 and 46 or 47, respectively.
Подразумевается, что в указанных антителах к TrkB и фрагментах антител последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей CDR, остаются неизмененными (неизмененными по отношению к аминокислоте, которую они кодируют, возможны эквиваленты ДНК последовательности вследствие вырожденности генетического кода), но окружающие участки, например, FR участки, могут быть сконструированы.In these anti-TrkB antibodies and antibody fragments, it is intended that the nucleic acid sequence encoding the CDRs remain unchanged (unchanged with respect to the amino acid they encode, possible DNA sequence equivalents due to the degeneracy of the genetic code), but the surrounding regions, e.g., FR regions, can be designed.
Нетерапевтические примененияNon-therapeutic uses
Антитела, представленные в настоящем описании, можно применять в качестве средств, используемых для очистки на основе аффинности. При осуществлении этого процесса антитела иммобилизуют на твердой фазе, такой как смола, содержащая белок А, с помощью методов, хорошо известных в данной области. Иммобилизованное антитело приводят в контакт с образцом, содержащим белок TrkB (или его фрагмент), который подлежит очистке, и затем подложку отмывают приемлемым растворителем, который должен удалять практически весь материал в образце, кроме белка TrkB, связанного с иммобилизованным антителом. И, наконец, подложку отмывают другим приемлемым растворителем, который должен отделять белок TrkB от антитела.The antibodies presented herein can be used as affinity-based purification agents. In this process, antibodies are immobilized on a solid phase, such as a Protein A resin, using methods well known in the art. The immobilized antibody is contacted with a sample containing the TrkB protein (or fragment thereof) to be purified, and the support is then washed with a suitable solvent which should remove substantially all of the material in the sample except the TrkB protein bound to the immobilized antibody. Finally, the support is washed with another suitable solvent, which should separate the TrkB protein from the antibody.
Антитела к TrkB можно применять также в диагностических анализах для выявления и/или количественной оценки белка TrkB, например, путем определения экспрессии TrkB в конкретных клетках, тканях или сыворотке.Antibodies to TrkB can also be used in diagnostic assays to detect and/or quantify TrkB protein, for example, by determining the expression of TrkB in specific cells, tissues or serum.
Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения целесообразно, например, для диагностических целей, метить антитело с помощью выявляемого фрагмента. Известны и доступны многочисленные выявляемые метки, такие как радиоизотопы, флуоресцентные метки, метки, представляющие собой субстраты для ферментов и т.п. Метку можно опосредованно конъюгировать с антителом с помощью различных известных методик. Например, антитело можно конъюгировать с биотином, и любую из указанных выше меток, относящихся к трем широким категориям, можно конъюгировать с авидином, или наоборот. Биотин избирательно связывается с авидином и поэтому метку можно конъюгировать с антителом опосредованным образом. В альтернативном варианте для достижения опосредованной конъюгации метки с антителом антитело можно конъюгировать с небольшим гаптеном (таким как дигоксин) и одну из различных типов указанных выше меток конъюгировать с антителом к гаптену (например, антителом к дигоксину). Таким образом можно осуществлять опосредованную конъюгацию метки с антителом.In some embodiments, it is advantageous, for example for diagnostic purposes, to label an antibody with a detectable moiety. Numerous detectable tags are known and available, such as radioisotopes, fluorescent tags, enzyme substrate tags, and the like. The label can be indirectly conjugated to the antibody using various known techniques. For example, an antibody can be conjugated to biotin, and any of the above three broad categories of labels can be conjugated to avidin, or vice versa. Biotin selectively binds to avidin and therefore the label can be conjugated to the antibody indirectly. Alternatively, to achieve label-antibody indirect conjugation, the antibody can be conjugated to a small hapten (such as digoxin) and one of the various types of labels above conjugated to an anti-hapten antibody (for example, an anti-digoxin antibody). In this way, indirect conjugation of the label with the antibody can be achieved.
Примерами радиоизотопных меток являются 35S, 14C, 125I, 3Н и 131I. Антитело можно метить радиоизотопом с помощью методик, описанных, например, в Current Protocols in Immunology, т. 1 и 2, 1991, под ред. Coligen и др., изд-во Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1991. Радиоактивность можно измерять, например, с помощью сцинтилляционного счетчика.Examples of radioisotope labels are 35 S, 14 C, 125 I, 3 H and 131 I. An antibody can be labeled with a radioisotope using techniques described, for example, in Current Protocols in Immunology, vols. 1 and 2, 1991, ed. Coligen et al., Wiley-Interscience, New York, NY, 1991. Radioactivity can be measured, for example, using a scintillation counter.
Примерами флуоресцентных меток являются известные метки, полученные на основе хелатов редкоземельных металлов (хелаты европия), или метки на основе флуоресцеина и его производных, родамина и его производных, дансила, лиссамина, фикоэритрина и техасского красного. Флуоресцентные метки можно конъюгировать с антителом с помощью известных методик, например, описанных в Current Protocols in Immunology, выше. Флуоресценцию можно оценивать количественно с помощью флуориметра.Examples of fluorescent tags are known tags based on rare earth metal chelates (europium chelates), or tags based on fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, dansyl, lissamine, phycoerythrin and Texas red. Fluorescent tags can be conjugated to the antibody using known techniques, for example, those described in Current Protocols in Immunology, supra. Fluorescence can be quantified using a fluorimeter.
В данной области известны различные хорошо охарактеризованные фермент-субстратные метки (см., например, обзор, приведенный в US 4275149). Фермент, как правило, катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, которое можно оценивать с помощью различных методик. Например, изменение может представлять собой изменение цвета субстрата, которое можно оценивать спектрофотометрически. В другом варианте фермент может изменять флуоресценцию или хемилюминесценцию субстрата. Методики количественной оценки флуоресценции описаны выше. В результате химической реакции в хемилюминесцентном субстрате возникает электронно-возбужденное состояние, вследствие чего он может испускать свет, который можно оценивать, например, с помощью хемилюминометра, или он является донором энергии для флуоресцентного акцептора.Various well-characterized enzyme-substrate tags are known in the art (see, for example, the review given in US 4,275,149). The enzyme typically catalyzes a chemical change in a chromogenic substrate, which can be assessed using a variety of techniques. For example, the change may be a change in the color of the substrate, which can be assessed spectrophotometrically. Alternatively, the enzyme can change the fluorescence or chemiluminescence of the substrate. Fluorescence quantification techniques are described above. As a result of a chemical reaction, an electronically excited state arises in the chemiluminescent substrate, as a result of which it can emit light, which can be assessed, for example, using a chemiluminometer, or it can act as an energy donor for a fluorescent acceptor.
Примерами ферментативных меток являются люциферазы, такие как люцифераза светляка и бактериальная люцифераза (US 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназа, уреаза, пероксидаза, например, пероксидаза из хрена (HRPO), щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, оксидазы сахаридов (такие как оксидаза глюкозы, оксидаза галактозы и глюкозо-6- 31 043771 фосфатдегидрогеназа), оксидазы гетероциклических соединений (такие как уриказа и оксидаза ксантина), лактопероксидаза, микропероксидаза и т.п. Методики конъюгации ферментов с антителами описаны, например, у O'Sullivan и др., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in EnzymeExamples of enzymatic tags are luciferases such as firefly luciferase and bacterial luciferase (US 4737456), luciferin, 2,3-dihydrophthalazinediones, malate dehydrogenase, urease, peroxidase such as horseradish peroxidase (HRPO), alkaline phosphatase, β-galactosidase, glucoamylase, lysozyme, saccharide oxidases (such as glucose oxidase, galactose oxidase and glucose-6-phosphate dehydrogenase), heterocyclic oxidases (such as uricase and xanthine oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, etc. Methods for conjugating enzymes with antibodies are described, for example, in O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme
Immunoassay, в: Methods in Enzym., под ред. J. Langone и Н. Van Vunakis, изд-во Academic press, N.Y., 73,Immunoassay, in: Methods in Enzym., ed. J. Langone and N. Van Vunakis, Academic press, N.Y., 73,
1981, cc. 147-166.1981, cc. 147-166.
Примерами комбинаций фермент-субстрат являются, например: пероксидаза из хрена (HRPO) и гидрогенпероксидаза в качестве субстрата, при этом гидрогенпероксидаза окисляет красительпредшественник, такой как ортофенилендиамин (OPD) или гидрохлорид 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ); щелочная фосфатаза (АР) и пара -нитрофенилфосфонат в качестве хромогенного субстрата; и βD-галактозидаза (β-D-Gal) и хромогенный субстрат, такой, например, как пара-нитрофенил-в-Dгалактозидаза, или флуорогенный субстрат, такой как 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозидаза.Examples of enzyme-substrate combinations are, for example: horseradish peroxidase (HRPO) and hydrogen peroxidase as substrate, wherein the hydrogen peroxidase oxidizes a dye precursor such as orthophenylenediamine (OPD) or 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine hydrochloride (TMB); alkaline phosphatase (AP) and para-nitrophenylphosphonate as a chromogenic substrate; and βD-galactosidase (β-D-Gal) and a chromogenic substrate, such as para-nitrophenyl-β-D-galactosidase, or a fluorogenic substrate, such as 4-methylumbelliferyl-β-D-galactosidase.
Специалистам в данной области известны многочисленные другие комбинации фермент-субстрат. Общий обзор представлен, например, в US 4275149 и US 4318980.Numerous other enzyme-substrate combinations are known to those skilled in the art. A general overview is presented, for example, in US 4275149 and US 4318980.
В других вариантах осуществления изобретения антитело к TrkB применяют в немеченом виде и выявляют с помощью меченого антитела, связанного с антителом к TrkB.In other embodiments, the anti-TrkB antibody is used unlabeled and detected using a labeled antibody coupled to the anti-TrkB antibody.
Антитела, представленные в настоящем описании, можно применять в любом известном методе анализа, таком как конкурентные анализы связывания, прямые и косвенные сэндвич-анализы и анализы на основе иммунопреципитации (см., например, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, изд-во CRC Press, Inc., 1987, cc. 147-158).The antibodies provided herein can be used in any known assay, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays (see, for example, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, ed. in CRC Press, Inc., 1987, pp. 147-158).
Диагностические наборыDiagnostic kits
Можно применять антитело к TrkB, входящее в состав диагностического набора, представляющего собой упаковку, которая содержит комбинацию реагентов, взятых в предварительно определенных количествах, в сочетании с инструкциями по осуществлению диагностического анализа. Если антитело мечено ферментом, то набор может включать необходимые для фермента субстраты и кофакторы, такие как субстрат-предшественник, образующий выявляемый хромофор или флуорофор. Кроме того, можно включать другие добавки, такие как стабилизаторы и буферы (например, блокирующий буфер или лизирующий буфер) и т.п. Относительные количества различных реагентов могут варьироваться в широких пределах, обеспечивая концентрации реагентов в растворе, которые в значительной степени оптимизируют чувствительность анализа. Реагенты могут представлять собой сухие порошки, как правило, лиофилизированные, включая эксципиенты, которые при растворении должны образовывать раствор реагента, имеющий соответствующую концентрацию.An anti-TrkB antibody may be used as part of a diagnostic kit, which is a package that contains a combination of reagents in predetermined quantities, in combination with instructions for performing the diagnostic assay. If the antibody is labeled with an enzyme, the kit may include substrates and cofactors required by the enzyme, such as a precursor substrate that forms a detectable chromophore or fluorophore. In addition, other additives such as stabilizers and buffers (eg, blocking buffer or lysis buffer) and the like may be included. The relative amounts of the various reagents can vary widely, providing concentrations of reagents in solution that greatly optimize the sensitivity of the assay. The reagents may be dry powders, typically lyophilized, including excipients which, when dissolved, should form a reagent solution having the appropriate concentration.
Терапевтические применения и TrkB-связанные нарушенияTherapeutic applications and TrkB-related disorders
В другом варианте осуществления, антитело к TrkB (или его функциональный фрагмент), описанные в настоящей заявке, пригодно для лечения различных нарушений, связанных с экспрессией TrkB, как описано в настоящей заявке.In another embodiment, an anti-TrkB antibody (or a functional fragment thereof) described herein is useful for treating various disorders associated with TrkB expression as described herein.
Антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент вводят любыми приемлемыми путями, включая интравитреальный, пероральный, парентеральный, подкожный, внутрибрюшинный, внутрилегочный и внутриносовой. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дополнительно, антитело к TrkB подходяще вводят путем пульсирующей инфузии, прежде всего с понижающими дозами антитела. В одном аспекте, дозирование осуществляют путем инъекций, наиболее предпочтительно внутривенных или подкожных инъекций, в том числе в зависимости от того является ли обработка кратковременной или пролонгированной. Предпочтительно, антитело к TrkB вводят путем интравитреальной инъекции в глаза.The anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof is administered by any suitable route, including intravitreal, oral, parenteral, subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary, and intranasal. Parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration. Additionally, the anti-TrkB antibody is suitably administered by pulsatile infusion, primarily with decreasing doses of the antibody. In one aspect, dosing is carried out by injection, most preferably intravenous or subcutaneous injection, including whether the treatment is short-term or long-term. Preferably, the anti-TrkB antibody is administered by intravitreal injection into the eye.
Для предотвращения или лечения заболевания соответствующая доза антитела должна зависеть от ряда факторов, таких как тип заболевания, подлежащего лечению, серьезность и процесс течения заболевания, вводят ли антитело для профилактических или терапевтических целей, предшествующая терапия, история болезни пациента и ответ на антитело, а также от предписания лечащего врача. Антитело можно вводить пациенту однократно или путем серий обработок.To prevent or treat a disease, the appropriate dose of antibody will depend on a number of factors, such as the type of disease being treated, the severity and progression of the disease, whether the antibody is being administered for prophylactic or therapeutic purposes, prior therapy, the patient's medical history and response to the antibody, and from the order of the attending physician. The antibody can be administered to the patient once or through a series of treatments.
В контексте настоящего описания понятие подавление имеет такое же значение, что и понятия облегчение и купирование, и относится к ослаблению или понижению одной или нескольких характеристик заболевания.As used herein, the term suppression has the same meaning as the terms alleviation and relief, and refers to the attenuation or reduction of one or more characteristics of a disease.
Композицию антитела можно включать в препаративную форму, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей клинической практикой. Важные в этом плане факторы включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину нарушения, область введения агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медикам. В этой связи терапевтически эффективное количество антитела, подлежащего введению, регулируют таким образом, чтобы оно представляло собой минимальное количество, необходимое для предупреждения, облегчения или лечения нарушения, ассоциированного с экспрессией TrkB.The antibody composition can be formulated, dosed and administered in accordance with good clinical practice. Important factors in this regard include the specific disorder being treated, the clinical condition of the individual patient, the cause of the disorder, the site of administration of the agent, the method of administration, the schedule of administration, and other factors known to medical practitioners. In this regard, the therapeutically effective amount of antibody to be administered is adjusted to be the minimum amount necessary to prevent, alleviate, or treat a disorder associated with TrkB expression.
Антитело необязательно, но в определенных случаях, включают в препаративную форму в сочетании с одним или несколькими агентами, применяемыми в настоящее время для предупреждения или лечения рассматриваемого нарушения. Эффективное количество указанных других агентов зависит от ко- 32 043771 личества антитела к TrkB, присутствующего в препаративной форме, типа нарушения или лечения и других указанных выше факторов. Их, как правило, применяют в таких же дозах и с использованием таких же путей введения, в которых их применяли ранее, или с использованием в дозе, составляющей примерно от 1 до 99% от их принятых для применения доз.The antibody is optionally, but in certain cases, formulated in combination with one or more agents currently used to prevent or treat the disorder in question. The effective amount of these other agents depends on the amount of anti-TrkB antibody present in the formulation, the type of disorder or treatment, and other factors noted above. They are typically administered at the same dosages and routes of administration in which they were previously administered, or at a dose that is from about 1% to about 99% of their intended dosage.
Агонистические антитела к TrkB согласно настоящему изобретению стимулируют передачу сигналов TrkB. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что передача сигналов TrkB благоприятна для защиты фоторецепторов, других нейронов сетчатки, включая ганглиозные клетки и клеток пигментного эпителия сетчатки от клеточной гибели в сетчатке. Следовательно, агонистические антитела к TrkB могут защищать нейроны сетчатки, такие как фоторецепторы от дегенерации, то есть, предотвращать нейро-дегенерацию, и также повышать выживание и/или пластичность нейронов, в конечном итоге противодействуя потере зрения, связанной либо с уменьшенной активностью TrkB и/или повышенному клеточному стрессу или апоптотической активности. Таким образом, антитела пригодны для лечения заболевания глаз или заболеваний сетчатки, в особенности нейродегенеративных заболеваний сетчатки или заболеваний глаз. Такие заболевания включают, но не ограничиваясь только ими, возрастную дегенерацию желтого пятна, географическую атрофию, диабетическую ретинопатию, диабетический отек желтого пятна, пигментную дистрофию сетчатки, наследственную дистрофию сетчатки, наследственную макулодистрофию, миопическую дегенерацию, окклюзии вены сетчатки, окклюзии артерии сетчатки, эндофтальмит, увеит, кистозный макулярный отек, хороидальную неоваскулярную мембрану вследствие любого из заболеваний сетчатки, оптические нейропатии, глаукому, отслойку сетчатки, токсическую ретинопатию, лучевую ретинопатию и травматическую ретинопатию.The TrkB agonistic antibodies of the present invention stimulate TrkB signaling. Without wishing to be bound by theory, it is believed that TrkB signaling is beneficial in protecting photoreceptors, other retinal neurons, including ganglion cells, and retinal pigment epithelial cells from cell death in the retina. Therefore, agonistic antibodies to TrkB may protect retinal neurons such as photoreceptors from degeneration, that is, prevent neurodegeneration, and also enhance neuronal survival and/or plasticity, ultimately counteracting vision loss associated with either reduced TrkB activity and/or or increased cellular stress or apoptotic activity. Thus, the antibodies are useful for treating eye diseases or retinal diseases, especially neurodegenerative retinal diseases or eye diseases. Such diseases include, but are not limited to, age-related macular degeneration, geographic atrophy, diabetic retinopathy, diabetic macular edema, retinal pigmentary degeneration, hereditary retinal dystrophy, hereditary macular degeneration, myopic degeneration, retinal vein occlusions, retinal artery occlusions, endophthalmitis, uveitis, cystoid macular edema, choroidal neovascular membrane due to any of the retinal diseases, optic neuropathies, glaucoma, retinal detachment, toxic retinopathy, radiation retinopathy and traumatic retinopathy.
Антитела также пригодны для лечения заболеваний центральной нервной системы, таких как продромальная и от легкой до умеренной болезнь Альцгеймера, задержка прогрессирования заболевания у пациентов с болезнью Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, большое депрессивное расстройство, шизофрения, когнитивное нарушение, связанное с шизофренией, предотвращение первого приступа психоза у индивидуумов с ослабленным психозным синдромом, предотвращение повторения у пациентов с шизофренией или терапевтически резистентная депрессия.The antibodies are also useful for the treatment of diseases of the central nervous system, such as prodromal and mild to moderate Alzheimer's disease, delayed disease progression in patients with Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, major depressive disorder, schizophrenia, cognitive impairment associated with schizophrenia, prevention first episode of psychosis in individuals with attenuated psychosis, preventing recurrence in patients with schizophrenia or treatment-resistant depression.
В другом варианте осуществления антитела могут применяться для лечения потери слуха, в особенности индуцированной цисплатином потери слуха, а также потери слуха от воздействия шума и возрастной потери слуха.In another embodiment, the antibodies can be used to treat hearing loss, particularly cisplatin-induced hearing loss, as well as noise-induced hearing loss and age-related hearing loss.
В особенности, агонистические антитела к TrkB согласно настоящему изобретению показаны для лечения непролиферативной и/или пролиферативной диабетической ретинопатии и/или диабетического отека желтого пятна дополнительно к стандартному лечению: Дисфункция нейронов сетчатки и нейродегенерация являются одним из серьезных патологических событий при диабетической ретинопатии и диабетическом отеке желтого пятна (на всех стадиях заболевания), которые в конечном итоге вызывают потерю зрения и зрительную дисфункцию. Активация TrkB будет противодействовать потере и функциональным нарушениям нейронов сетчатки и, таким образом, помогать поддерживать нормальное зрение, уменьшать потерю зрительной функции при заболевании и потенциально помогать восстанавливать зрительную функцию.In particular, the anti-TrkB agonistic antibodies of the present invention are indicated for the treatment of non-proliferative and/or proliferative diabetic retinopathy and/or diabetic macular edema in addition to standard treatment: Retinal neuronal dysfunction and neurodegeneration are one of the major pathological events in diabetic retinopathy and diabetic macular edema spots (at all stages of the disease) that ultimately cause vision loss and visual dysfunction. Activation of TrkB would counteract the loss and functional impairment of retinal neurons and thus help maintain normal vision, reduce loss of visual function in disease, and potentially help restore visual function.
Кроме того, существует потенциальное применение активации TrkB в качестве дополнительного к анти-VEGF лечению, которое будет существенно усиливать терапевтические преимущества последнего, поскольку анти-VEGF нацелено только на сосудистую дисфункцию в глазе, но не на систему нейроны /глиальные клетки; дополнительно, длительное анти-VEGF лечение может вызывать нейродегенеративные побочные эффекты. Подход активации TrkB в качестве дополнения к анти-VEGF будет уменьшать такие нейродегенеративные побочные эффекты.In addition, there is a potential application of TrkB activation as an adjunct to anti-VEGF treatment, which would significantly enhance the therapeutic benefits of the latter, since anti-VEGF only targets vascular dysfunction in the eye and not the neuronal/glial cell system; additionally, long-term anti-VEGF treatment may cause neurodegenerative side effects. The approach of activating TrkB as a complement to anti-VEGF would reduce such neurodegenerative side effects.
Антитела к TrkB или их антигенсвязывающие фрагменты в особенности пригодны для лечения или предотвращения нарушений сетчатки, таких как диабетическая ретинопатия, диабетический отек желтого пятна, географическая атрофия и глаукома.Antibodies to TrkB or antigen binding fragments thereof are particularly useful for the treatment or prevention of retinal disorders such as diabetic retinopathy, diabetic macular edema, geographic atrophy and glaucoma.
В дальнейшем аспекте, антитела к TrkB или их антигенсвязывающие фрагменты также пригодны для лечения метаболических заболеваний, таких как гиперфагия, ожирение и метаболический синдром.In a further aspect, antibodies to TrkB or antigen binding fragments thereof are also useful for the treatment of metabolic diseases such as hyperphagia, obesity and metabolic syndrome.
В другом аспекте, антитела к TrkB согласно настоящему изобретению могут применяться в способе лечения и/или предотвращения нарушения, связанного с TrkB, в особенности географической атрофии, который включает введение терапевтически эффективного количества антитела к TrkB согласно изобретению индивидууму, страдающему от географической атрофии, таким образом ослабляя один или несколько симптомов географической атрофии.In another aspect, the anti-TrkB antibodies of the present invention may be used in a method of treating and/or preventing a TrkB-associated disorder, particularly geographic atrophy, which includes administering a therapeutically effective amount of an anti-TrkB antibody of the invention to an individual suffering from geographic atrophy, thereby reducing one or more symptoms of geographic atrophy.
В еще дальнейшем аспекте, агонистические антитела к TrkB могут применяться в способе лечения и/или предотвращения географической атрофии, который включает введение терапевтически эффективного количества агонистического антитела к TrkB индивидууму, страдающему от географической атрофии, таким образом ослабляя один или несколько симптомов географической атрофии.In a still further aspect, anti-TrkB agonistic antibodies may be used in a method of treating and/or preventing geographic atrophy, which includes administering a therapeutically effective amount of an anti-TrkB agonist antibody to an individual suffering from geographic atrophy, thereby reducing one or more symptoms of geographic atrophy.
Фармацевтические композиции и их введениеPharmaceutical compositions and their administration
Композиция, содержащая антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, может вводиться субъекту, который страдает от или имеет риск развития заболевания глаз или сетчатки. Изобретение дополнительно обеспечивает применение антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента дляA composition containing an anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof can be administered to a subject who suffers from, or is at risk of developing, an eye or retinal disease. The invention further provides the use of an anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof for
- 33 043771 приготовления лекарственного средства для предотвращения или лечения TrkB заболевания. Термин субъект, как используется в настоящей заявке, обозначает любого пациента-млекопитающего, которому можно вводить антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, включая, например, людей и млекопитающих, отличающихся от человека, таких как приматы, грызуны и собаки. Субъектов, включая людей, в частности, можно лечить с использованием способов, представленных в настоящем описании. Антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент можно вводить либо отдельно или в комбинации с другими композициями.- 33 043771 preparation of a medicinal product for the prevention or treatment of TrkB disease. The term subject, as used herein, refers to any mammalian patient to which an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof can be administered, including, for example, humans and non-human mammals such as primates, rodents and dogs. Subjects, including humans in particular, can be treated using the methods presented herein. The anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof can be administered either alone or in combination with other compositions.
Предпочтительными антителами для применения в таких фармацевтических композиций являются антитела, представляющие собой гуманизированное антитело или фрагменты антител, имеющее (имеющие) вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2 и 12, или 3 и 13, или 4 и 14, или 5 и 15, или 6 и 16, или 7 и 17, или 8 и 18, или 9 и 19, или 10 и 20, соответственно.Preferred antibodies for use in such pharmaceutical compositions are antibodies that are a humanized antibody or antibody fragments having a variable light chain and a variable heavy chain with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 2 and 12, or 3 and 13, or 4 and 14, or 5 and 15, or 6 and 16, or 7 and 17, or 8 and 18, or 9 and 19, or 10 and 20, respectively.
Также охватываются антитела для применения в таких фармацевтических композициях, представляющие собой гуманизированное антитело или фрагменты антител, имеющее (ие) вариабельную легкую цепь и вариабельную тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 и 12, или 3 и 13, или 4 и 14, или 5 и 15, или 6 и 16, или 7 и 17, или 8 и 18, или 9 и 19, или 10 и 20 соответственно.Also covered are antibodies for use in such pharmaceutical compositions that are a humanized antibody or antibody fragments having a variable light chain and a variable heavy chain with an amino acid sequence of at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and 12, or 3 and 13, or 4 and 14, or 5 and 15, or 6 and 16, or 7 and 17, or 8 and 18, or 9 and 19, or 10 and 20, respectively.
Дальнейшими предпочтительными антителами для применения в таких фармацевтических композициях являются антитела, представляющие гуманизированное антитело или фрагменты антител, имеющее (имеющие) аминокислотную последовательность легкой цепи и тяжелой цепи SEQ ID NO: 21 и 22 или 23; 24 и 25 или 26; 27 и 28 или 29; 30 и 31 или 32; 33 и 34 или 35; 36 и 37 или 38; 39 и 40 или 41; 42 и 43 или 44; 45 и 46 или 47, соответственно.Further preferred antibodies for use in such pharmaceutical compositions are those comprising a humanized antibody or antibody fragments having the light chain and heavy chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and 22 or 23; 24 and 25 or 26; 27 and 28 or 29; 30 and 31 or 32; 33 and 34 or 35; 36 and 37 or 38; 39 and 40 or 41; 42 and 43 or 44; 45 and 46 or 47, respectively.
Дальнейшие предпочтительные антитела для применения в таких фармацевтических композициях, которые представляют собой гуманизированное антитело или фрагменты антител, имеющее (ие) аминокислотную последовательность легкой цепи и тяжелой цепи по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21 и 22 или 23; 24 и 25 или 26; 27 и 28 или 29; 30 и 31 или 32; 33 и 34 или 35; 36 и 37 или 38; 39 и 40 или 41; 42 и 43 или 44; 45 и 46 или 47 соответственно.Further preferred antibodies for use in such pharmaceutical compositions are those that are a humanized antibody or antibody fragments having at least 80%, at least 90%, or at least 95% amino acid sequence of a light chain and a heavy chain. , at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and 22 or 23; 24 and 25 or 26; 27 and 28 or 29; 30 and 31 or 32; 33 and 34 or 35; 36 and 37 or 38; 39 and 40 or 41; 42 and 43 or 44; 45 and 46 or 47 respectively.
Подразумевается, что в указанных антителах к TrkB и фрагментах антител, аминокислотная последовательность CDR остается неизмененной, но окружающие области, например, FR области, могут быть сконструированы.It is understood that in these anti-TrkB antibodies and antibody fragments, the amino acid sequence of the CDR remains unchanged, but the surrounding regions, eg, FR regions, can be engineered.
Известны различные системы доставки и они могут использоваться для введения антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента. Способ введения включают, но не ограничиваясь только ими, интравитреальный, глазные капли, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, внутриносовой, эпидуральный и пероральный пути. Антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент могут вводиться, например, путем инфузии, болюса или инъекции, и могут вводиться совместно с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или местным. В предпочтительных вариантах осуществления, введение осуществляют путем интравитреальной инъекции. Препараты для таких инъекций могут быть приготовлены, например, в предварительно заполненных шприцах.Various delivery systems are known and can be used to administer an anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof. Routes of administration include, but are not limited to, intravitreal, eye drops, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof may be administered, for example, by infusion, bolus, or injection, and may be administered in conjunction with other biologically active agents. Administration may be systemic or local. In preferred embodiments, administration is by intravitreal injection. Preparations for such injections can be prepared, for example, in pre-filled syringes.
Антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент можно водить в виде фармацевтических композиций, содержащих терапевтически эффективное количество антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента и один или несколько фармацевтически совместимых ингредиентов.The anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof can be administered in the form of pharmaceutical compositions containing a therapeutically effective amount of the anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof and one or more pharmaceutically compatible ingredients.
Согласно типичным вариантам осуществления изобретения фармацевтическую композицию приготавливают согласно общепринятым процедурам с получением фармацевтической композиции, пригодной для внутривенного или подкожного введения человеку. Как правило, композиции для введения путем инъекции представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости фармацевтическое средство может содержать также солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лидокаин, для снятия боли в месте инъекции. Как правило, ингредиенты поставляются либо по отдельности, либо их смешивают с получением стандартной дозы лекарственного средства, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воду концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества действующего вещества. В тех случаях, когда фармацевтическое средство предназначено для введения путем инфузии, то его можно разливать по бутылям для инфузий, содержащим стерильную воду или физиологический раствор фармацевтической степени чистоты. В тех случаях, когда фармацевтическое средство вводят с помощью инъекции, то можно использовать ампулу со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором для того, чтобы ингредиенты можно было перемешивать перед введением.According to exemplary embodiments of the invention, the pharmaceutical composition is prepared according to conventional procedures to provide a pharmaceutical composition suitable for intravenous or subcutaneous administration to humans. Typically, compositions for injection are solutions in sterile isotonic aqueous buffer. If necessary, the pharmaceutical composition may also contain a solubilizing agent and a local anesthetic, such as lidocaine, to relieve pain at the injection site. Typically, the ingredients are supplied either separately or mixed to form a unit dose of the drug, for example, as a dry lyophilized powder or a water-free concentrate in a sealed container such as an ampoule or sachet, indicating the amount of active ingredient. In cases where the pharmaceutical agent is intended for administration by infusion, it can be filled into infusion bottles containing sterile water or pharmaceutical grade saline solution. In cases where the pharmaceutical agent is administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline may be used so that the ingredients can be mixed before administration.
Кроме того, фармацевтическую композицию можно включать в фармацевтический набор, который содержит (а) контейнер, содержащий антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент в лиофилизованной форме и (б) второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель (например, стерильную воду) для инъекций. Фармацевтически приемлемый разбавитель можно использо- 34 043771 вать для восстановления или разведения лиофилизованного антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента. Необязательно к указанному(ым) контейнеру(ам) может прилагаться уведомление в форме, утвержденной официальным агентством, разрешающим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, где в уведомлении отражено разрешение агентства на производство, применение или продажу с целью введения людям.In addition, the pharmaceutical composition can be included in a pharmaceutical kit that contains (a) a container containing an anti-TrkB antibody or antigen binding fragment thereof in lyophilized form and (b) a second container containing a pharmaceutically acceptable diluent (eg, sterile water) for injection. A pharmaceutically acceptable diluent can be used to reconstitute or dilute the lyophilized anti-TrkB antibody or antigen binding fragment thereof. Optionally, the specified container(s) may be accompanied by a notice in a form approved by an official agency authorizing the manufacture, use, or sale of pharmaceuticals or biological products, where the notice reflects the agency's approval of the manufacture, use, or sale for the purpose of administration to humans.
Количество антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента, которое эффективно для лечения или предотвращения нарушения, связанного с TrkB, можно определять обычными методами клинических исследований. Кроме того, необязательно можно использовать анализы in vitro, результаты которых могут способствовать определению оптимальных пределов доз. Точная доза для применения в препаративной форме также должна зависеть от пути введения и стадии нарушения, и она должна приниматься на основе рекомендаций лечащего врача и обстоятельств, характерных для каждого пациента. Эффективные дозы можно определять путем экстраполяции на основе кривых дозовой зависимости, полученных по результатам опытов in vitro или на модельных тест-системах с использованием животных.The amount of anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof that is effective in treating or preventing a TrkB-related disorder can be determined by conventional clinical research methods. In addition, in vitro assays may not necessarily be used, the results of which may help determine optimal dosage limits. The exact dose to be used in the formulation should also depend on the route of administration and the stage of the disorder, and should be based on the recommendations of the treating physician and the circumstances specific to each patient. Effective doses can be determined by extrapolation from dose response curves obtained from in vitro experiments or animal model test systems.
Например, токсичность и терапевтическую эффективность антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента можно определить в клеточных культурах или на экспериментальных животных стандартными фармацевтическими методами, используемыми для определения ED50 (терапевтически эффективная доза для 50% популяции). Предпочтительным является антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент, которое (который) проявляет высокий терапевтический индекс.For example, the toxicity and therapeutic efficacy of an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof can be determined in cell cultures or experimental animals by standard pharmaceutical methods used to determine the ED 50 (therapeutically effective dose for 50% of a population). Preferred is an anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof that exhibits a high therapeutic index.
Данные, полученные по результатам анализов на клеточных культурах и исследований на животных, можно использовать при определении предела доз, предназначенных для применения на человеке. Как правило, доза антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента находится в пределах концентраций в кровотоке, которые включают ED50, обладая при этом низкой токсичностью или не проявляя токсичности. Дозу можно варьировать в указанных пределах в зависимости от используемой лекарственной формы и применяемого пути введения. Для любого антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента, используемого согласно способу, терапевтически эффективную дозу можно первоначально устанавливать по результатам анализов на клеточных культурах. Дозу можно определить, исходя из данных, полученных на животных моделях, достигая пределов концентраций в плазме крови, которые включают IC50 (т.е. концентрацию тестируемого соединения, при которой достигается ингибирование симптомов, составляющее половину от максимального) по данным, полученным на культуре клеток. Такую информацию можно использовать для более точного определения пригодных доз для человека. Можно определять концентрации в плазме крови, например, с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения, ELISA и т.п.Data obtained from cell culture assays and animal studies can be used to determine dose limits for human use. Typically, the dose of anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof is within the range of circulating concentrations that include the ED50 while exhibiting little or no toxicity. The dose can be varied within these limits depending on the dosage form used and the route of administration used. For any anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof used in the method, a therapeutically effective dose may initially be determined based on the results of cell culture assays. The dose can be determined based on data obtained in animal models, reaching plasma concentration limits that include the IC 50 (i.e., the concentration of the test compound at which half the maximum inhibition of symptoms is achieved) based on data obtained in culture cells. Such information can be used to more accurately determine suitable doses for humans. Plasma concentrations can be determined, for example, by high performance liquid chromatography, ELISA, etc.
Для интравитреальной инъекции антитела к TrkB, как правило, предпочтительными являются более длительные интервалы между лечениями. Благодаря их улучшенной эффективности, антитела к TrkB согласно настоящему изобретению могут вводиться с более длительными интервалами.For intravitreal injection of anti-TrkB antibody, longer treatment intervals are generally preferred. Due to their improved efficacy, the anti-TrkB antibodies of the present invention can be administered at longer intervals.
В одном варианте осуществления, антитело к TrkB вводят каждые 6 недель, предпочтительно каждые 7 недель, также предпочтительно каждые 8 недель, в дальнейшем предпочтительно каждые 9 недель, более предпочтительно каждые 10 недель, в дальнейшем предпочтительно каждые 11 недель, и более предпочтительно каждые 12 недель. В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления, антитело к TrkB вводят один раз каждые 3 месяца.In one embodiment, the anti-TrkB antibody is administered every 6 weeks, preferably every 7 weeks, also preferably every 8 weeks, further preferably every 9 weeks, more preferably every 10 weeks, further preferably every 11 weeks, and more preferably every 12 weeks . In a further preferred embodiment, the anti-TrkB antibody is administered once every 3 months.
В одном варианте осуществления, антитело к TrkB вводят субъекту, который в этом нуждается, в начальной дозе 1-2000 мг. В другом варианте осуществления, необязательно вводят одну или несколько последующих доз, каждая из которых содержит 1-2000 мг антитела к TrkB.In one embodiment, the anti-TrkB antibody is administered to a subject in need thereof at an initial dose of 1-2000 mg. In another embodiment, optionally one or more subsequent doses are administered, each containing 1-2000 mg of anti-TrkB antibody.
В связи с тем, что объем, которые может вводиться в глаз, существенно ограничен, то чрезвычайно важным является то, что антитело к TrkB может быть приготовлено в виде препарата в высоких концентрациях. Кроме того, эффективность антитела к TrkB является чрезвычайно важной, поскольку эффективное антитело может проявлять свой эффект даже в очень низких дозах и, следовательно, пролонгирует активность, а также интервалы между лечениями.Due to the fact that the volume that can be injected into the eye is significantly limited, it is extremely important that the anti-TrkB antibody can be formulated in high concentrations. In addition, the effectiveness of the anti-TrkB antibody is extremely important since an effective antibody can exert its effect even at very low doses and therefore prolongs activity as well as treatment intervals.
Антитела согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде препаратов в чрезвычайно высоких дозах, которые включают, но не ограничиваясь только ими, 20 мг/мл, 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл или 100 мг/мл.The antibodies of the present invention can be formulated at extremely high doses, which include, but are not limited to, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml or 100 mg/ml.
Типичная дозировка, которая может вводиться пациенту, составляет приблизительно 3 мг/глаз. Типичные буферные компоненты, которые можно применять для такого препарата, содержат, например, ацетат натрия, PS20 и дигидрат трегалозы.The typical dosage that may be administered to a patient is approximately 3 mg/eye. Typical buffer components that can be used for such a formulation include, for example, sodium acetate, PS20 and trehalose dihydrate.
В одном варианте осуществления, антитело к TrkB приготовлено в виде препарата с 10 мМ гистидиновым буфером, 240 мМ сахарозой, 0,02% мас./об. полисорбата 20 при рН 5,5 с конечной концентрацией белка 60 мг/мл.In one embodiment, the anti-TrkB antibody is formulated with 10 mM histidine buffer, 240 mM sucrose, 0.02% w/v. polysorbate 20 at pH 5.5 with a final protein concentration of 60 mg/ml.
В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции, содержащие антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент могут дополнительно включать терапевтическое средство, конъюгированное или неконъютированное со связывающим агентом. Антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент можно совместно вводить в комбинации с одним или несколькими терапевтическими средствами для лечения или предотвращения заболевания, связанного с TrkB. Например, комби- 35 043771 нированная терапия может включать анти-VEGF, анти-PDGF или анти-ANG2.In some embodiments, pharmaceutical compositions comprising an anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof may further include a therapeutic agent, conjugated or unconjugated to a binding agent. An anti-TrkB antibody or an antigen-binding fragment thereof can be co-administered in combination with one or more therapeutic agents to treat or prevent a TrkB-associated disease. For example, combination therapy may include anti-VEGF, anti-PDGF or anti-ANG2.
Такая комбинированная терапия может обладать аддитивным или синергетическим действием в отношении признаков заболевания (например, тяжести проявления симптома, количества симптомов или частоты рецидивов).Such combination therapy may have additive or synergistic effects on disease features (eg, symptom severity, number of symptoms, or relapse rates).
При применении схем лечения при комбинированном введении в конкретном варианте осуществления изобретения, антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент вводят одновременно с терапевтическим средством. В другом конкретном варианте осуществления изобретения, терапевтическое средство вводят до или после введения антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента, в течение от 1 часа до нескольких месяцев, например, по меньшей мере, в течение 1 часа, 5 часов, 12 часов, суток, недели, месяца или трех месяцев до или после введения антитела к TrkB или его антигенсвязывающего фрагмента.When using combination administration treatment regimens, in a particular embodiment of the invention, the anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof is administered simultaneously with the therapeutic agent. In another specific embodiment of the invention, the therapeutic agent is administered before or after administration of the anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof, for from 1 hour to several months, for example, for at least 1 hour, 5 hours, 12 hours, days, weeks, a month or three months before or after administration of an anti-TrkB antibody or antigen-binding fragment thereof.
ИзделияProducts
Другим объектом изобретения является изделие, содержащее вещества, пригодные для лечения нарушений, описанных выше. Изделие включает контейнер и этикетку. Приемлемыми контейнерами являются, например, бутыли, флаконы, шприцы и лабораторные пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая является эффективной для лечения конкретного состояния, и может иметь стерильное отверстие для доступа. Например, контейнер может представлять собой мешок или флакон для внутривенного раствора, имеющий запирающее устройство, проницаемое для инъекционной иглы для подкожного введения. Действующее вещество в композиции представляет собой антитело к TrkB или его антигенсвязывающий фрагмент. На этикетке на контейнере или связанной с ним указывается, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Изделие может дополнительно включать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие вещества, присутствие которых желательно с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.Another object of the invention is an article containing substances suitable for the treatment of the disorders described above. The product includes a container and a label. Acceptable containers include, for example, bottles, vials, syringes and laboratory tubes. Containers can be made from various materials such as glass or plastic. The container contains a composition that is effective for treating a particular condition and may have a sterile access opening. For example, the container may be a bag or vial for an intravenous solution having a closure device permeable to a hypodermic injection needle. The active substance in the composition is an antibody to TrkB or its antigen-binding fragment. The label on or associated with the container states that the composition is used to treat the selected condition. The article may further include a second container containing a pharmaceutically acceptable buffer, such as phosphate buffered saline, Ringer's solution, and dextrose solution. It may additionally include other substances whose presence is desirable from a commercial and consumer point of view, including other buffers, diluents, filters, needles, syringes and package inserts with instructions for use.
Изобретение описано ниже с помощью представленных примеров, которые не направлены на ограничение объема изобретения.The invention is described below using the examples provided, which are not intended to limit the scope of the invention.
ПримерыExamples
1. Создание антитела (иммунизация).1. Creation of an antibody (immunization).
В-клетки от мышей при осуществлении комплекса иммунизации подвергали скринингу, используя собственную разработанную технологию платформу единичных В-клеток. Анти-TrkB связыватели минимизировали после тестирования для определения активности, эффективность и действенности в исследовании фосфорилирования TrkB in-vitro.B cells from mice during the immunization complex were screened using a proprietary single B cell platform technology. Anti-TrkB binders were minimized after testing to determine activity, potency, and efficiency in an in-vitro TrkB phosphorylation assay.
2. Получение гуманизированных антител.2. Obtaining humanized antibodies.
Мышиный лидерный D003 отбирали для дальнейшей оптимизации. Мышиный лидерный компонент имел вариабельную легкую цепь, соответствующую SEQ ID NO: 1 и вариабельную тяжелую цепь, соответствующий SEQ ID NO: 11. Для оптимизации последовательности TrkB мышиного лидерного D003, отбирали наиболее сходные последовательности антител зародышевой линии человека, IGKV41*01, KJ2 для легкой цепи и IGHV1-46*03, HJ6 для тяжелой цепи. Создавали библиотеку вариантов. Это приводило к получению гуманизированных вариабельных последовательностей легкой цепи, представленных в SEQ ID NO: 2-10, и вариабельных последовательностей тяжелой цепи, представленных в SEQ ID NO: 12-20.The mouse leader D003 was selected for further optimization. The mouse leader component had a variable light chain corresponding to SEQ ID NO: 1 and a variable heavy chain corresponding to SEQ ID NO: 11. To optimize the TrkB sequence of the mouse leader D003, the most similar human germline antibody sequences were selected, IGKV41*01, KJ2 for mild chains and IGHV1-46*03, HJ6 for heavy chain. We created a library of options. This resulted in the humanized light chain variable sequences shown in SEQ ID NOs: 2-10 and the heavy chain variable sequences shown in SEQ ID NOs: 12-20.
Таблица 2table 2
- 36 043771- 36 043771
Типичные гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению представляют собой антитела, которые имеют последовательности легкой и тяжелой цепи, как указано в таблице ниже. IgG1KO имеет две мутации в Fc области, Leu234Ala и Leu235Ala для уменьшения эффекторной функции.Exemplary humanized antibodies of the present invention are antibodies that have light and heavy chain sequences as indicated in the table below. IgG1KO has two mutations in the Fc region, Leu234Ala and Leu235Ala, to reduce effector function.
Таблица 3Table 3
3. Информация об эпитопе.3. Information about the epitope.
Материалы.Materials.
Вода (Sigma Aldrich, номер по каталогу 37877-4L).Water (Sigma Aldrich, part number 37877-4L).
Ацетонитрил (Sigma Aldrich, номер по каталогу 34998-4L).Acetonitrile (Sigma Aldrich, part number 34998-4L).
Муравьиная кислота (Fluka, номер по каталогу 94318).Formic acid (Fluka, catalog number 94318).
Мочевина (Sigma Aldrich, номер по каталогу 51456-500G).Urea (Sigma Aldrich, part number 51456-500G).
ТСЕР-HCl - 10 г (Thermo Scientific - Pierce, номер по каталогу 20491).TCEP-HCl - 10 g (Thermo Scientific - Pierce, catalog number 20491).
Двухосновный фосфат натрия (Sigma Aldrich, номер по каталогу S7907-100G).Dibasic sodium phosphate (Sigma Aldrich, part number S7907-100G).
Одноосновный фосфат натрия (Sigma Aldrich, номер по каталогу S8282-500G).Monobasic sodium phosphate (Sigma Aldrich, part number S8282-500G).
Предколонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 VanGuard, 130А, 1,7 мкм, 2,1 мм X 5 мм (Waters TechnoloPre-column ACQUITY UPLC VEN C18 VanGuard, 130A, 1.7 microns, 2.1 mm X 5 mm (Waters Technolo
- 37 043771 gies Corp, 186003975).- 37 043771 gies Corp, 186003975).
Картридж с иммобилизованным пепсином Poroszyme® I, 2,1 мм х 30 мм (Life Technologies Corp, 2313100).Poroszyme® I immobilized pepsin cartridge, 2.1 mm x 30 mm (Life Technologies Corp, 2313100).
Колонка Acquity UPLC ВЕН С18 1,7 мкм, 1 мм X 50 мм (Waters, 186002344).Acquity UPLC column VEN C18 1.7 µm, 1 mm X 50 mm (Waters, 186002344).
Растворитель А: 0,1 % Муравьиная кислота /99% вода /1% ацетонитрил.Solvent A: 0.1% Formic acid/99% water/1% acetonitrile.
Растворитель В: 0,1 % Муравьиная кислота /5% вода /95% ацетонитрил.Solvent B: 0.1% Formic acid / 5% water / 95% acetonitrile.
Водный буфер: Н2О 10 мМ фосфат натрия рН 7,4.Aqueous buffer: H 2 O 10 mM sodium phosphate pH 7.4.
Дейтериевый буфер: D2O 10 мМ фосфат натрия рН 7,4.Deuterium buffer: D2O 10 mM sodium phosphate pH 7.4.
Закаливающий буфер: вода, 8М мочевина, 0,4М ТСЕР-HCl.Quenching buffer: water, 8M urea, 0.4M TCEP-HCl.
В контрольных образцах для картирования эпитопов, антиген прогоняли с антителом и без него. Для определения перечня антигенных пептидов, в этом проколе сначала осуществляли первый прогон, используя водный буфер вместо дейтериевого буфера. 4 мкл образца смешивали с 40 мкл дейтериевого буфера. Эту смесь инкубировали при 20°С для нескольких временных точек (1, 2 и 4 мин). После этого 40 мкл смеси переносили в 40 мкл 4°С закаливающего буфера (4М Мочевина, 0,4М Тсер-HCl) и смешивали. Инъецировали 60 мкл закаливающего белка, где он расщепляется на пепсиновой колонке в течение 2 минут путем промывания 200 мкл/мл растворителя А: 0,1 %Муравьиная кислота /99% вода /1% ацетонитрил. Последующие пептиды обессоливали на предколонке Vanguard в течение 3 минут. Расщепленные пепсином пептиды отправляли на колонку с обращенной фазой ВЕН С18 внутри колонки /клапана терморегулируемого компартмента. Использовали градиент системы растворителей, состоящей из: растворитель А: 0,1 %Муравьиная кислота /99% вода /1% ацетонитрил и растворитель В: 0,1 % Муравьиная кислота /5% вода /95% ацетонитрил. Процентное содержание растворителя В повышали от 10% до 15% через 5,1 минуты, до 50% через 11 минут, до 90% через 11,5 минуты, выдерживая до 12,5 минут, до 0% В через 13 минут, выдерживая до 14 минут. Хроматографическое разделение происходило при 4°С при скорости потока 180 мкл/мин. После хроматографического разделения образец поступал на Thermo Scientific Orbitrap Fusion масс-спектрометр, работающий в режиме положительной электрораспылительной ионизации. Используемый метод включал активационные типы CID и ETD при идентификации контрольных пептидов, используя разделение 120 тыс., минимальный сигнал 10 тыс., ширину выделения 1,0 и нормированную энергию столкновений 35,0 В. RF уровень S-линз устанавливали на 60%. Для контрольных пептидов тип сбора данных представлял собой профили для полного МС сканирования и центроид для CID МС/мС данных. Для дейтерированных образцов, не собирали МС /мС. Данные собирали для массового диапазона 280-1800 Да. Для анализа необработанных данных ЖХ-МС /мс фрагментации, контрольные образцы (с CID и ETD МС/мС) анализировали, используя Proteome Discover 1.4 (Thermo Scientific) и PMi Byonic (Protein Metrics) по отношению к заданной последовательности для создания перечня пептидов и времени удерживания. Файлы с необработанными данными предварительно обрабатывали и превращали в ASCII формат, используя собственное разработанное программное обеспечение SHARC. После этого отмечали идентифицированные пептиды и обобщали полученные данные, используя собственное разработанное программное обеспечение SHAFT. Эпитопы определяли на основании отличий сдвига средней массы, индуцированного связыванием после мечения дейтерием. На уровне пептида, защита больше 0,4 Да рассматривалась как достоверная.In control samples for epitope mapping, antigen was run with and without antibody. To determine the list of antigenic peptides, a first run was first performed in this puncture using aqueous buffer instead of deuterium buffer. 4 μl of sample was mixed with 40 μl of deuterium buffer. This mixture was incubated at 20°C for several time points (1, 2 and 4 min). After this, 40 μl of the mixture was transferred to 40 μl of 4°C quenching buffer (4 M Urea, 0.4 M Tser-HCl) and mixed. 60 μl of quenching protein was injected, where it was digested on a pepsin column for 2 minutes by washing with 200 μl/ml solvent A: 0.1% Formic acid/99% water/1% acetonitrile. Subsequent peptides were desalted on a Vanguard precolumn for 3 minutes. Pepsin-digested peptides were sent to a reverse-phase VEN C18 column inside a temperature-controlled compartment column/valve. A gradient solvent system was used consisting of: solvent A: 0.1% Formic acid/99% water/1% acetonitrile and solvent B: 0.1% Formic acid/5% water/95% acetonitrile. The percentage of solvent B was increased from 10% to 15% after 5.1 minutes, to 50% after 11 minutes, to 90% after 11.5 minutes, holding until 12.5 minutes, to 0% B after 13 minutes, holding until 14 minutes. Chromatographic separation occurred at 4°C with a flow rate of 180 μL/min. After chromatographic separation, the sample was fed to a Thermo Scientific Orbitrap Fusion mass spectrometer operating in positive electrospray ionization mode. The method used included CID and ETD activation types in identifying reference peptides using a separation of 120k, a minimum signal of 10k, a separation width of 1.0, and a normalized collision energy of 35.0V. The RF level of the S-lenses was set to 60%. For control peptides, the data acquisition type was profiles for full MS scans and centroid for CID MS/mS data. For deuterated samples, no MS/MS was collected. Data were collected over the mass range of 280–1800 Da. For analysis of raw LC-MS/ms fragmentation data, control samples (with CID and ETD MS/ms) were analyzed using Proteome Discover 1.4 (Thermo Scientific) and PMi Byonic (Protein Metrics) against a given sequence to generate a peptide list and time holding. The raw data files were pre-processed and converted to ASCII format using proprietary SHARC software. The identified peptides were then noted and the data summarized using our own developed SHAFT software. Epitopes were determined based on differences in the average mass shift induced by binding after deuterium labeling. At the peptide level, protection greater than 0.4 Da was considered significant.
Результаты картирования эпитопов показаны для BDNF, 277-антител, (С2) (US20100196390), и (С20) (US20100150914) на фиг. 1. Специфические связывающие сайты для каждой молекулы с внеклеточным доменом TrkB человека с SEQ ID NO: 54 выделены темно-серым цветом. По сравнению с природным лигандом BDNF, 277-антитела связываются с другими новыми эпитопами.Epitope mapping results are shown for BDNF, 277 antibodies, (C2) (US20100196390), and (C20) (US20100150914) in FIG. 1. Specific binding sites for each human TrkB extracellular domain molecule with SEQ ID NO: 54 are highlighted in dark gray. Compared to the natural BDNF ligand, 277 antibodies bind to other novel epitopes.
4. Подверженности последовательностей в CDR.4. Susceptibility sequences in CDRs.
Последовательности CDR проверяли относительно наличия любых потенциальных подверженностей, таких как сайты N-гликозилирования, мотивы сильного дезамидирования (NG, NS, NH, NA, ND, NT, NN), мотивы изомеризации аспартата (DG), мотивы фрагментации (DG, DS), цистеин. Эти аминокислот или мотивы могут подвергаться химической реакции и придавать продукту нежелательную гетерогенность, также с возможностью отрицательного влияния на целевое связывание и функционирования. Из этих соображений, является предпочтительным удалять такие аминокислоты или мотивы (если они присутствуют) из CDR.CDR sequences were checked for the presence of any potential exposures such as N-glycosylation sites, strong deamidation motifs (NG, NS, NH, NA, ND, NT, NN), aspartate isomerization motifs (DG), fragmentation motifs (DG, DS), cysteine. These amino acids or motifs may undergo a chemical reaction and impart undesirable heterogeneity to the product, also with the potential to negatively affect target binding and function. For these reasons, it is preferable to remove such amino acids or motifs (if present) from the CDR.
CDR мышиной лидерной и гуманизированных последовательностей не содержали таких потенциальных мотивов подверженности.The CDRs of the mouse leader and humanized sequences did not contain such potential susceptibility motifs.
Таблица 4Table 4
5. Иммуногенность.5. Immunogenicity.
Иммуногенность последовательностей оценивали in silico с помощью алгоритма по лицензии от компании Epivax. Шкала EpiMatrix Treg-adj учитывает эпитопы Т-клеток и Treg эпитопы. Чем более низкая оценка иммуногенности, тем меньше вероятность того, что последовательность будет иммуногенной. В целом, отрицательная оценка рассматривается как низкий риск иммуногенности, в то время как поло- 38 043771 жительная оценка расценивается как указание на потенциальную иммуногенность. ______________________________________________________________Таблица 5Sequence immunogenicity was assessed in silico using an algorithm licensed from Epivax. The EpiMatrix Treg-adj score takes into account T cell epitopes and Treg epitopes. The lower the immunogenicity score, the less likely the sequence is to be immunogenic. In general, a negative score is considered to indicate a low risk of immunogenicity, while a positive score is considered to indicate potential immunogenicity. ______________________________________________________________ Table 5
6. Аффинность.6. Affinity.
Использовали технологию поверхностного плазмонного резонанса (SPR) для определения аффинности связывания 277-антител, С2 (US 20100196390), и С20 (US 20100150914) и ТАМ-163 (WO 2015173756) с Hu-TrkB-His. Эксперимент осуществляли на приборе ProteOn XPR36.Surface plasmon resonance (SPR) technology was used to determine the binding affinity of 277 antibodies, C2 (US 20100196390), and C20 (US 20100150914) and TAM-163 (WO 2015173756) to Hu-TrkB-His. The experiment was carried out on a ProteOn XPR36 device.
Метод: Подвижный буфер для этого эксперимента и все разведения (за исключением тех случаев, когда конкретно указано) осуществляли в PBS-T-EDTA с 0,01% Tween20 [100 мкл 100% Tween20 добавляли к 2 л PBS-T-EDTA для получения конечной концентрации Tween 20 0,01%]. Сенсорный чип GLM нормировали и устанавливали предварительные условиях согласно инструкциям производителя. Сенсорный чип активировали с применением уравновешенной смеси EDC/s-NHS в горизонтальном направлении в течение 300 с при скорости потока 30 мкл/мин и иммобилизовали с Рекомбинантным белком A/G (60 мкг/мл в 10 мМ ацетате рН 4,5) в горизонтальном направлении в течение 300 с при скорости потока 30 мкл/мин, что приводило к ~7100-7130 ЕО Белка A/G на поверхности. Сенсорный чип деактивировали с применением 1М этаноламина HCl в горизонтальном направлении в течение 300 с при скорости потока 30 мкл/мин. Сенсорный чип стабилизировали в течение 18 с с 0,85% фосфорной кислотой при скорости потока 100 мкл/мин 3 раза горизонтально и 3 раза вертикально. 277-антитело (0,6 мкг/мл), С2 (2,1 мкг/мл), С20 (1,2 мкг/мл), и ТАМ-163 (5 мкг/мл) захватывали на поверхность Белка A/G вертикально в течение 70 с при скорости потока 30 мкл/мин, что приводило к уровням захвата ~615, 1390, 780 и 3380 ЕО, соответственно. Исходный уровень стабилизировали путем инъецирования PBS-T-EDTA в течение 60 с при скорости потока 100 мкл/мин горизонтально и затем второй инъекции PBS-T-EDTA в течение 60 с при скорости потока 100 мкл/мин и диссоциации 120 с горизонтально. Аналит (Hu-TrkB-His) инъецировали горизонтально над захваченным антителом в течение 600 с при скорости потока 30 мкл/мин и диссоциации в течение 1800 с. Концентрации аналитов составляли 0 нМ, 1,23 нМ, 3,7 нМ, 11,11 нМ, 33,33 нМ и 100 нМ. Поверхность регенерировали путем инъецирования 0,85% фосфорной кислоты в течение 18 с при скорости потока 100 мкл/мин один раз горизонтально и один раз вертикально. PBS-TEDTA инъецировали в течение 60 с при скорости потока 100 мкл/мин один раз вертикально. Взаимные помехи (взаимодействия с поверхностью сенсора) и холостые данные (PBS-T-EDTA с 0,01% Tween20 или 0 нМ аналита) вычитали из необработанных данных. После этого сенсограммы подгоняли глобально к 1:1 связыванию Ленгмюра, получая значения ассоциации (ka), диссоциации (kd) и аффинности (KD).Method: The running buffer for this experiment and all dilutions (except where specifically noted) were done in PBS-T-EDTA with 0.01% Tween20 [100 µL 100% Tween20 was added to 2 L PBS-T-EDTA to obtain final concentration of Tween 20 0.01%]. The GLM sensor chip was normalized and preconditioned according to the manufacturer's instructions. The sensor chip was activated using an equilibrated EDC/s-NHS mixture in a horizontal direction for 300 s at a flow rate of 30 μL/min and immobilized with Recombinant Protein A/G (60 μg/ml in 10 mM acetate pH 4.5) in a horizontal direction. direction for 300 s at a flow rate of 30 μl/min, which resulted in ~7100-7130 EO Protein A/G on the surface. The sensor chip was deactivated using 1 M ethanolamine HCl in a horizontal direction for 300 s at a flow rate of 30 μL/min. The sensor chip was stabilized for 18 s with 0.85% phosphoric acid at a flow rate of 100 μL/min 3 times horizontally and 3 times vertically. 277-antibody (0.6 μg/ml), C2 (2.1 μg/ml), C20 (1.2 μg/ml), and TAM-163 (5 μg/ml) were captured vertically onto the surface of Protein A/G for 70 s at a flow rate of 30 μL/min, resulting in capture levels of ∼615, 1390, 780, and 3380 EO, respectively. The baseline was stabilized by injecting PBS-T-EDTA for 60 s at a flow rate of 100 μL/min horizontally and then a second injection of PBS-T-EDTA for 60 s at a flow rate of 100 μL/min and dissociating for 120 s horizontally. The analyte (Hu-TrkB-His) was injected horizontally over the captured antibody for 600 s at a flow rate of 30 μL/min and dissociated for 1800 s. The analyte concentrations were 0 nM, 1.23 nM, 3.7 nM, 11.11 nM, 33.33 nM, and 100 nM. The surface was regenerated by injecting 0.85% phosphoric acid for 18 s at a flow rate of 100 μL/min once horizontally and once vertically. PBS-TEDTA was injected for 60 s at a flow rate of 100 μL/min once vertically. Crosstalk (interactions with the sensor surface) and blank data (PBS-T-EDTA with 0.01% Tween20 or 0 nM analyte) were subtracted from the raw data. The sensorgrams were then fitted globally to 1:1 Langmuir binding, yielding association (ka), dissociation (kd) and affinity ( KD ) values.
277-антитела связываются с Hu-TrkB-His с ka 1,93 X 105 1/Мс, KD 3,51 X 10-4 1/с, и KD 1,2 нМ. С2 связывается с Hu-TrkB-His с ka 2,32 X 104 1/Мс, KD 3,39 X 10-4 1/с, и KD 10,5 нМ. С20 связывается с HuTrkB-His с ка 1,29 X 105 1/Мс, KD 6,13 X 10-3 1/с, и KD 47,7 нМ. ТАМ-163 не связывается с 100 нМ HuTrkB-His.277 antibodies bind to Hu-TrkB-His with a ka of 1.93 X 10 5 1/Ms, KD of 3.51 X 10 -4 1/s, and KD of 1.2 nM. C2 binds to Hu-TrkB-His with a ka of 2.32 X 10 4 1/Ms, KD of 3.39 X 10 -4 1/s, and KD of 10.5 nM. C20 binds to HuTrkB-His with a KA of 1.29 X 10 5 1/Ms, a KD of 6.13 X 10 -3 1/s, and a KD of 47.7 nM. TAM-163 does not bind to 100 nM HuTrkB-His.
Таблица 6Table 6
TrkB человекаHuman TrkB
7. Неспецифическое связывание.7. Nonspecific binding.
Разрабатывали анализ неспецифического связывания, используя технологию биосенсора, для определения, будут ли кандидаты новых биологических соединений (NBE) иметь существенное связывание с неродственными заряженными белками. В этом анализе, антитела проходили над двумя SPR поверхностями, одна из них была покрыта неродственным отрицательно заряженным белком, а вторая покрытаA nonspecific binding assay was developed using biosensor technology to determine whether novel biological entity (NBE) candidates would have significant binding to unrelated charged proteins. In this assay, antibodies passed over two SPR surfaces, one coated with an unrelated negatively charged protein and the other coated with
- 39 043771 неродственным положительно заряженным белком. Когда NBE кандидат демонстрирует существенное неспецифическое связывание с этими поверхностями, то, вероятно, что причиной связывания является присутствие положительно или отрицательно заряженных поверхностных участков на кандидате. Неспецифическое связывание NBE кандидатов могут приводить к плохим фармакокинетике (ФК) и биораспределению и также может отрицательно влиять на последующую производственную технологичность. Результаты этого анализа использовали в контексте оценки риска по данному проекту. Целью этого исследования являлось уменьшение риска плохой ФК, отсутствия распределения в целевой ткани и сложности последующей производственной технологичности.- 39 043771 unrelated positively charged protein. When an NBE candidate exhibits significant nonspecific binding to these surfaces, it is likely that the cause of binding is the presence of positively or negatively charged surface sites on the candidate. Non-specific binding of NBE candidates may result in poor pharmacokinetics (PK) and biodistribution and may also negatively impact subsequent manufacturability. The results of this analysis were used in the context of the risk assessment for this project. The purpose of this study was to reduce the risk of poor PK, lack of distribution in the target tissue and difficulty in subsequent manufacturing processability.
Задачей являлось определение, будут ли 277-антитела проявлять неспецифическое связывание или не будут проявлять неспецифического связывания путем сбора сенсограмм связывания 277-антител и сравнения их с сенсограммами контролей для определения категории неспецифического связывания как благоприятное (зеленое), приемлемое (желтое) или неблагоприятное (красное).The objective was to determine whether 277 antibodies would exhibit nonspecific binding or not exhibit nonspecific binding by collecting 277 antibody binding sensorgrams and comparing them with those of controls to categorize nonspecific binding as favorable (green), acceptable (yellow), or unfavorable (red). ).
Метод.Method.
Эксперимент осуществляли на Biacore T200. Разведение, приготовление поверхности и эксперименты связывания осуществляли при 25°С в 1X HBS-EP буфере, приготовленном из 10Х HBS-EP. Скорость течения для обоих протоколов, как протокола иммобилизации, так и эксперимента связывания, составляла 5 мкл/мин.The experiment was carried out on a Biacore T200. Dilution, surface preparation, and binding experiments were performed at 25°C in 1X HBS-EP buffer prepared from 10X HBS-EP. The flow rate for both the immobilization protocol and the binding experiment was 5 μL/min.
Для приготовления поверхности для эксперимента неспецифического связывания, белый лизоцим куриных яиц и ингибитор трипсина типа 1-S из сои связывали вручную с сериями S CM5 чипа с плотностью поверхности 3000-5000 ЕО, используя набор для иммобилизации по амино-группе согласно инструкциям производителя. FC1 и FC2 активировали путем инъецирования 1:1 смеси EDC и NHS в течение 7 минут. Поверхностью белого лизоцима куриных яиц приготавливали на FC2 путем инъецирования 150 мкг/мл белого лизоцима куриных яиц в 10 мМ NaOAc, pH 5,5 в течение 5 минут. FC1 и FC2 дезактивировали путем инъецирования 1 М этаноламин-HCl в течение 7 минут. FC1 использовали в качестве эталонной поверхности. FC3 активировали путем инъецирования 1:1 смеси EDC и HNS в течение 7 минут. Поверхность ингибитора трипсина типа 1-S из сои приготавливали на FC3 путем инъецирования 300 мкг/мл ингибитора трипсина типа 1-S из сои в 10 мМ NaOAc, рН 4,0 буфера в течение 20 минут с последующей 7 мин. инъекцией 1 М этаноламин-HCl для дезактивации проточной ячейки. Поликлональное антитело к лизоциму, антитело к ингибитору трипсина, и BI отрицательный контроль использовали в качестве контролей в анализе. Контроли и антитела приготавливали в 1 мкМ в 1X HBS-EP буфере. Образцы инъецировали над FC1, FC2 и FC3 поверхностями с 10 мин. ассоциацией и 15 мин. диссоциацией. Поверхности регенерировали между каждым циклом связывания путем инъецирования 1 мин. 0,85% фосфорной кислоты и 30 с 50 мМ NaOH при скорости потока 50 мкл/мин с последующим периодом стабилизации 2 мин. с 1X HBS-EP буфером, текущим через все поверхности. Поликлональное антитело к лизоциму и антитело к ингибитору трипсина инъецировали над FC1, FC2 и FC3 в начале и конце эксперимента. Данные собирали, используя Biacore T200 Control Software версия 2.0.1, и анализировали, используя Biacore T200 Evaluation Software версия 3.0.To prepare the surface for the nonspecific binding experiment, white lysozyme from chicken eggs and trypsin inhibitor type 1-S from soybean were manually bound to the S Series CM5 chip with a surface density of 3000-5000 EO using an amino immobilization kit according to the manufacturer's instructions. FC1 and FC2 were activated by injecting a 1:1 mixture of EDC and NHS for 7 minutes. The surface of chicken egg white lysozyme was prepared on FC2 by injecting 150 μg/ml chicken egg white lysozyme in 10 mM NaOAc, pH 5.5 for 5 minutes. FC1 and FC2 were deactivated by injection of 1 M ethanolamine-HCl for 7 minutes. FC1 was used as a reference surface. FC3 was activated by injecting a 1:1 mixture of EDC and HNS for 7 minutes. Soybean type 1-S trypsin inhibitor surface was prepared on FC3 by injecting 300 μg/ml soybean type 1-S trypsin inhibitor in 10 mM NaOAc, pH 4.0 buffer for 20 min followed by 7 min. injection of 1 M ethanolamine-HCl to deactivate the flow cell. Polyclonal anti-lysozyme antibody, anti-trypsin inhibitor antibody, and BI negative control were used as controls in the assay. Controls and antibodies were prepared at 1 μM in 1X HBS-EP buffer. Samples were injected over FC1, FC2 and FC3 surfaces for 10 min. association and 15 min. dissociation. The surfaces were regenerated between each binding cycle by injection for 1 min. 0.85% phosphoric acid and 30 s of 50 mM NaOH at a flow rate of 50 μl/min, followed by a stabilization period of 2 min. with 1X HBS-EP buffer flowing through all surfaces. Polyclonal anti-lysozyme antibody and anti-trypsin inhibitor antibody were injected over FC1, FC2 and FC3 at the beginning and end of the experiment. Data were collected using Biacore T200 Control Software version 2.0.1 and analyzed using Biacore T200 Evaluation Software version 3.0.
Сенсограммы связывания антител сравнивали с сенсограммами BI отрицательного контроля для определения уровня неспецифического связывания с поверхностями белого лизоцима куриных яиц и ингибитора трипсина типа 1-S из сои.Antibody binding sensorgrams were compared with negative control BI sensorgrams to determine the level of nonspecific binding to the surfaces of chicken egg white lysozyme and soybean trypsin inhibitor type 1-S.
Полученные данные показали, что 277-антитело не связывается существенно с неродственными заряженными белками; специфически белым лизоцимом куриных яиц и ингибитором трипсина типа 1-S из сои. 277-антитело классифицировано как благоприятное (зеленое) по сравнению с ответом связывания и формой кривых по сравнению с контролями. Следовательно, можно предположить, что 277-антитело будет обладать незначительным риском относительно фармакокинетики, биораспределения и приготовления на основании нецелевых заряженных видов.The data obtained showed that the 277 antibody does not bind significantly to unrelated charged proteins; specifically white lysozyme from chicken eggs and trypsin inhibitor type 1-S from soybeans. The 277 antibody is classified as favorable (green) compared to the binding response and shape of the curves compared to controls. Therefore, it can be assumed that the 277 antibody will have negligible risks regarding pharmacokinetics, biodistribution and formulation based on off-target charged species.
Таблица 7Table 7
8. Активность (SY5Y) и эффективность.8. Activity (SY5Y) and efficiency.
Дифференциация SH-SY5Y клеток к нейронному фенотипу.Differentiation of SH-SY5Y cells to a neuronal phenotype.
Клетки SH-SY5Y (АТСС® CRL-2266™) культивировали в DMEM:F12 (Lonza № BE12-719F) с 15% фетальной бычьей сывороткой в колбе для культивирования ткани 175 см2 (Corning №353112). Для высевания клеток колбу промывали один раз с помощью D-PBS (Lonza № 17-512Q) и клетки отсоединяли с применением 37°С предварительно нагретого раствора аккутазы (А6964 SIGMA). После инкубирования в течение 3 минут при комнатной температуре клетки присоединены с помощью пипетки 10 мл и перенесены в пробирку фирмы Falcon объемом 15 мл. Клетки подсчитывали и 6000 клеток в 100 мклSH-SY5Y cells (ATCC® CRL-2266™) were cultured in DMEM:F12 (Lonza #BE12-719F) with 15% fetal bovine serum in a 175 cm2 tissue culture flask (Corning #353112). For cell seeding, the flask was washed once with D-PBS (Lonza No. 17-512Q) and cells were detached using 37°C prewarmed Accutase solution (A6964 SIGMA). After incubation for 3 minutes at room temperature, the cells are attached using a 10 ml pipette and transferred to a 15 ml Falcon tube. Cells were counted and 6000 cells per 100 µl
- 40 043771- 40 043771
DMEM:F12 с 15% FBS на лунку высевали в покрытые коллагеном-I планшеты на 96 лунок (BD Biosciences № 354407). Клетки поддерживали во влажном инкубаторе при 37°С, 5% СО2. Через 8 часов, в каждую лунку добавляли 100 мкл 6 мкМ раствора ретиноевой кислоты (Sigma № R2625). Конечная концентрация ретиноевой кислоты составляла 3 мкМ. Через 48 часов и 96 часов, необходима стимуляция с дополнительным количеством ретиноевой кислоты. Для этого, удаляли 100 мкл среды на лунку и добавляли 100 мкл свежей среды с 6 мкМ ретиноевой кислоты. После дифференциации в течение 7 дней SHSY5Y клетки имели допаминергически-подобный фенотип и были готовы к использованию.DMEM:F12 with 15% FBS per well was seeded into collagen-I-coated 96-well plates (BD Biosciences no. 354407). Cells were maintained in a humidified incubator at 37°C, 5% CO 2 . After 8 hours, 100 μl of 6 μM retinoic acid solution (Sigma no. R2625) was added to each well. The final concentration of retinoic acid was 3 μM. After 48 hours and 96 hours, stimulation with additional retinoic acid is necessary. To do this, 100 μl of medium per well was removed and 100 μl of fresh medium with 6 μM retinoic acid was added. After differentiation for 7 days, SHSY5Y cells had a dopaminergic-like phenotype and were ready for use.
Стимуляция и лизис дифференцированных клеток SH-SY5Y.Stimulation and lysis of differentiated SH-SY5Y cells.
Среду с лунок заменяли на 80 мкл предварительно нагретой DMEM-F12 с 0,2% BSA. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Пептиды и антитела разводили в DMEM-F12 с 0,2% BSA. Все разведения приготавливали с наконечниками, пробирками и планшетами с низким связыванием. Клетки стимулировали путем добавления 20 мкл соответствующего пептида/антитела в течение 45 мин при комнатной температуре. Во время инкубирования приготавливали буфер для лизиса клеток в пробирке фирмы Falcon объемом 15 мл на льду: 1 мл 10х Triton X-100 лизирующий буфер 8,7 мл Н2О 1 таблетка полная мини, ингибитор протеазы 100 мкл коктейль ингибиторов фосфатаз 2 100 мкл коктейль ингибиторов фосфатаз 3 100 мкл 1 мМ PMSF. После стимуляции клеток среду удаляли и на каждую лунку добавляли 30 мкл охлажденного на льду лизирующего буфера. Планшет покрывали верхним уплотнением и инкубировали на льду в течение 20 мин. После этого содержимое планшета перемешивали на встряхивателе для планшетов эппендорфа при 500 об/мин в течение 5 мин.Well media was replaced with 80 μl of prewarmed DMEM-F12 with 0.2% BSA. The plate was incubated at room temperature for 15 minutes. Peptides and antibodies were diluted in DMEM-F12 with 0.2% BSA. All dilutions were prepared with low binding tips, tubes and plates. Cells were stimulated by adding 20 μl of the appropriate peptide/antibody for 45 min at room temperature. During incubation, a buffer for cell lysis was prepared in a 15 ml Falcon tube on ice: 1 ml 10x Triton X-100 lysis buffer 8.7 ml H2O 1 full mini tablet, protease inhibitor 100 µl cocktail of phosphatase inhibitors 2 100 µl cocktail phosphatase inhibitors 3 100 µl 1 mM PMSF. After cell stimulation, the medium was removed and 30 μl of ice-cold lysis buffer was added to each well. The plate was covered with a top seal and incubated on ice for 20 min. After this, the contents of the tablet were mixed on an Eppendorf plate shaker at 500 rpm for 5 minutes.
Для этой стадии все материалы и растворы хранили на льду. Планшет на 96 лунок с лизированными клетками центрифугировали при 235 g в течение 10 с и хранили на льду. Буфер для AlphaLISA иммуноанализа (PerkinElmer №AL000C) приготавливали путем разведения 260 мкл 10х маточного раствора в 2340 мкл Н2О. pNTRK2 акцепторные шарики (PerkinElmer № CUSM81822; шарики, покрытые Perkin Elmer с антителом от CellSignaling CST № 4621 клон C50F3) разводили в буфере для AlphaLISA иммуноанализа до конечной концентрации 10 мкг/мл. NTRK2 биотиновое антитело (PerkinElmer № CUSM81820; меченное с Perkin Elmer с антителом от CellSignaling CST=№4609 клон C17F1 ) разводили в буфере для AlphaLISA иммуноанализа до конечной концентрации 1 нМ и стрептавидин-донорные шарики (PerkinElmer № 6760002S) разводили в буфере для AlphaLISA иммуноанализа до конечной концентрации 20 мкг/мл. 5 мкл pNTRK2 акцепторных шариков и 2,5 мкл клеточного лизата на лунку переносили в белый планшет небольшого объема на 384 лунки (Greiner № 784075) с плоским дном и центрифугировали при 235 g в течение 10 с и хранили в течение 45 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубирования добавляли 2,5 мкл NTRK2 биотинового антитела на лунку и планшет центрифугировали при 235 g в течение 10 с и хранили в течение 45 минут при комнатной температуре в темноте. В завершение, добавляли 2,5 мкл стрептавидин-донорных шариков на лунку и планшет центрифугировали при 235 g в течение 10 с и хранили в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Сразу после этого планшет анализировали с помощью планшет-ридера EnVision, используя протокол AlphaScreen (фильтр 570 нМ № 244 и зеркало № 444).For this step, all materials and solutions were kept on ice. A 96-well plate with lysed cells was centrifuged at 235 g for 10 s and stored on ice. AlphaLISA immunoassay buffer (PerkinElmer #AL000C) was prepared by diluting 260 μl of a 10x stock solution in 2340 μl H 2 O. pNTRK2 acceptor beads (PerkinElmer #CUSM81822; beads coated with Perkin Elmer antibody from CellSignaling CST # 4621 clone C50F3) were diluted in buffer for AlphaLISA immunoassay to a final concentration of 10 μg/ml. NTRK2 biotin antibody (PerkinElmer #CUSM81820; tagged with PerkinElmer with CellSignaling antibody CST=#4609 clone C17F1) was diluted in AlphaLISA immunoassay buffer to a final concentration of 1 nM and streptavidin donor beads (PerkinElmer #6760002S) were diluted in AlphaLISA immunoassay buffer to a final concentration of 20 μg/ml. 5 μl of pNTRK2 acceptor beads and 2.5 μl of cell lysate per well were transferred to a white flat-bottomed 384-well small volume plate (Greiner #784075) and centrifuged at 235 g for 10 s and stored for 45 min at room temperature in darkness. After incubation, 2.5 μl of NTRK2 biotin antibody per well was added and the plate was centrifuged at 235 g for 10 s and stored for 45 minutes at room temperature in the dark. Finally, 2.5 μl of streptavidin donor beads per well was added and the plate was centrifuged at 235 g for 10 s and stored for 30 min at room temperature in the dark. Immediately thereafter, the plate was analyzed with an EnVision plate reader using the AlphaScreen protocol (570 nM filter #244 and mirror #444).
Определение ERK1/2 фосфорилирования.Determination of ERK1/2 phosphorylation.
Измерение ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) фосфорилирования осуществляли с применением 8 кл клеточного лизата согласно инструкциям производителя (AlphaScreen SureFire p-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) набора (PerkinElmer №TGRES10k))Measurement of ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) phosphorylation was carried out using 8 cells of cell lysate according to the manufacturer's instructions (AlphaScreen SureFire p-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) kit (PerkinElmer #TGRES10k))
Определение АКТ 1/2/3 фосфорилирования.Determination of AKT 1/2/3 phosphorylation.
Измерение Akt 1/2/3 (Thr308) фосфорилирования осуществляли с применением 8 кл клеточного лизата согласно инструкциям производителя ((AlphaScreen SureFire p-Akt 1/2/3 (Thr308) набора (PerkinElmer № TGRA3S10K)).Measurement of Akt 1/2/3 (Thr308) phosphorylation was carried out using 8 cells of cell lysate according to the manufacturer's instructions ((AlphaScreen SureFire p-Akt 1/2/3 (Thr308) kit (PerkinElmer no. TGRA3S10K)).
Несколько антител к TrkB согласно изобретению анализировали для определения их потенциальной активности активировать TrkB, а также инициировать нижерасположенные сигналы. Также в исследование включали природный лиганд BDNF и антитела С2 и С20. Антитела к TrkB согласно настоящему изобретению в среднем в десять раз более активны относительно активации TrkB по сравнению с природным лигандом BDNF. При сравнении с антителами С2 и С20, антитела к TrkB согласно изобретению в среднем в три раза - в пятнадцать раз более эффективными. Нижерасположенная передача сигналов pERK и AKT1/2/3 полностью согласуется с этими измерениями относительно активации TrkB и проявляет сходную улучшенную активность антител к TrkB согласно изобретению.Several anti-TrkB antibodies of the invention were assayed to determine their potential activity to activate TrkB as well as trigger downstream signals. The study also included the natural ligand BDNF and antibodies C2 and C20. The anti-TrkB antibodies of the present invention are on average ten times more potent in activating TrkB compared to the natural ligand BDNF. When compared with antibodies C2 and C20, the anti-TrkB antibodies of the invention are on average three times to fifteen times more effective. The downstream signaling of pERK and AKT1/2/3 is entirely consistent with these measurements regarding TrkB activation and exhibits similar improved activity of the anti-TrkB antibodies of the invention.
- 41 043771- 41 043771
Таблица 8Table 8
9. Экспрессия генов.9. Gene expression.
Осуществляли анализ секвенирования следующего поколения (данные не показаны) для дифференцированных SH-SY5Y клеток после стимуляции с применением нескольких TrkB агонистов. Для подтверждения результатов, выбирали большинство регулируемых генов по отношению к синаптической пластичности и затем анализировали изменения с помощью кПЦР. ARC, VGF, EGR1 представляют собой известные маркеры для синаптической пластичности. Синаптическая пластичность представляет собой процесс, с помощью которого специфические паттерны синаптической активности приводят к изменениям синаптической силы. На фиг. 2 стимуляция дифференцированных SH-SY5Y клеток с помощью BDNF или агонистических антител повышает количество экспрессии мРНК ARC, VGF, EGR1, что может быть маркером для увеличенной синаптической пластичности. На экспрессию мРНК NTRK2 не влияет стимуляция с применением BDNF или агонистических антител. Изменения картин экспрессии, индуцированные BDNF и D003, в целом являются очень сходными. Эти результаты подтверждают данные, полученные при анализе секвенирования следующего поколения.Next generation sequencing analysis (data not shown) was performed on differentiated SH-SY5Y cells after stimulation with several TrkB agonists. To confirm the results, most of the regulated genes in relation to synaptic plasticity were selected and then the changes were analyzed by qPCR. ARC, VGF, EGR1 are known markers for synaptic plasticity. Synaptic plasticity is the process by which specific patterns of synaptic activity lead to changes in synaptic strength. In fig. 2 stimulation of differentiated SH-SY5Y cells with BDNF or agonistic antibodies increases the amount of ARC, VGF, EGR1 mRNA expression, which may be a marker for increased synaptic plasticity. NTRK2 mRNA expression was not affected by stimulation with BDNF or agonistic antibodies. The changes in expression patterns induced by BDNF and D003 are generally very similar. These results confirm those obtained from next generation sequencing analysis.
Специфически, SH-SY5Y клетки дифференцировали в течение 7 дней в культуральном планшете на 6 лунок (SIGMA № Corning CLS3516). После дифференциации, клетки стимулировали в бессывороточной DMEM:F12 с 0,2% BSA с контрольным IgG [10 нМ], BDNF [10 нМ] и D003 [10 нМ] в течение 6 часов во влажном инкубаторе при 37°С, 5% СО2. После этого клетки промывали один раз с помощью предварительно нагретой lx D-PBS и осуществляли выделение мРНК согласно инструкциям производителя (Qiagen № 74104 RNeasy Mini Kit). Транскрипцию мРНК до кДНК осуществляли согласно инструкциям производителя (Qiagen № 205310 QuantiTect Rev. Набор для транскрипции). кДНК использовали для анализов TaqMan ПЦР в режиме реального времени на основании 5' - нуклеазных зондов (ThermoFischer Scientific) на 7900НТ Fast системе ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems). Значения дельта СТ рассчитывали на основании значения СТ для АСТВ (СТ=18,18).Specifically, SH-SY5Y cells were differentiated for 7 days in a 6-well culture plate (SIGMA no. Corning CLS3516). After differentiation, cells were stimulated in serum-free DMEM:F12 with 0.2% BSA with control IgG [10 nM], BDNF [10 nM] and D003 [10 nM] for 6 hours in a humidified incubator at 37°C, 5% CO2 . Cells were then washed once with prewarmed lx D-PBS and mRNA extraction was performed according to the manufacturer's instructions (Qiagen #74104 RNeasy Mini Kit). Transcription of mRNA to cDNA was performed according to the manufacturer's instructions (Qiagen no. 205310 QuantiTect Rev. Transcription Kit). The cDNA was used for TaqMan real-time PCR assays based on 5' nuclease probes (ThermoFischer Scientific) on a 7900HT Fast real-time PCR system (Applied Biosystems). Delta CT values were calculated based on the CT value for ASTV (CT = 18.18).
Анализы TaqMan экспрессии генов от ThermoFischer Scientific:TaqMan Gene Expression Assays from ThermoFischer Scientific:
АСТВ-актин бета: Hs01060665_g1; № кат. 4331182,ACTB-actin beta: Hs01060665_g1; Cat. no. 4331182,
NTRK2-нейротрофическая рецепторная тирозинкиназа 2: Hs0017881 1_ml; № кат. 4331182,NTRK2-neurotrophic receptor tyrosine kinase 2: Hs0017881 1_ml; Cat. no. 4331182,
ARC-связанный с цитоскелетом белок с регулируемой активностью: Hs01045540_g1; № кат. 4331182,ARC-associated cytoskeleton activity-regulated protein: Hs01045540_g1; Cat. No. 4331182,
VGF-индуцибельный фактор роста нервов: Hs00705044_s1, № кат. 4331182 EGR1 -ранний ростовой ответ 1: Hs00152928_m1; № кат. 4331182.VGF-inducible nerve growth factor: Hs00705044_s1, Cat. No. 4331182 EGR1 -early growth response 1: Hs00152928_m1; Cat. no. 4331182.
10. Фармакокинетическое исследование интравитреального введения (ивт) на кроликах.10. Pharmacokinetic study of intravitreal administration (IV) in rabbits.
Самки новозеландских белых кроликов (вес тела 1,7-2 кг) акклиматизировали >15 дней до начала исследования. Антитело 277 приготавливали стерильным в концентрации 20 мг/мл и 1 мг (в 50 мкл буфера: 60 мМ ацетат натрия, 150 мМ NaCl, pH 5,0) инъецировали билатерально в стекловидное тело анестезированных животных. В различные временные точки, 2 животных подвергали эвтаназии и собирали ткани глаза, состоящие из внутриглазной жидкости, стекловидного тела и сетчатки, и замораживали вплоть до проведения анализов. Образцы крови отбирали в различные временные точки (фиг. 3), центрифугировали и плазму замораживали вплоть до проведения анализов.Female New Zealand White rabbits (1.7–2 kg body weight) were acclimatized for >15 days prior to study entry. Antibody 277 was prepared sterile at a concentration of 20 mg/ml and 1 mg (in 50 μl of buffer: 60 mM sodium acetate, 150 mM NaCl, pH 5.0) was injected bilaterally into the vitreous body of anesthetized animals. At different time points, 2 animals were euthanized and ocular tissues consisting of aqueous humor, vitreous, and retina were collected and frozen until analysis. Blood samples were collected at various time points (Fig. 3), centrifuged, and plasma frozen until analysis.
- 42 043771- 42 043771
Количественное определение антитела осуществляли с помощью ELISA. Для каждого типа ткани, приготавливали калибровочную кривую антитела (в трех повторах в диапазоне 0,5-100 нг/мл) в идентичном буфере в качестве образцов и включали в каждый планшет. Поглощение измеряли при 405 нм, используя фотометр SpectraMax 340PC-384 и анализ данных осуществления с помощью SoftMaxPro6.5.Antibody quantification was performed using ELISA. For each tissue type, an antibody calibration curve was prepared (in triplicate ranging from 0.5-100 ng/mL) in identical sample buffer and included in each plate. Absorbance was measured at 405 nm using a SpectraMax 340PC-384 photometer and analysis of the implementation data using SoftMaxPro6.5.
Концентрация 277-антитела представлена на фиг. 3, демонстрируя концентрацию в различных компартментах глаза, как указано, и плазме после ивт инъекции 1 мг 277-антитела в глаза кроликам в зависимости от времени. Рассчитанное время полужизни в глазу и плазме представлены в таблице ниже.The concentration of 277 antibody is shown in FIG. 3, showing the concentration in various compartments of the eye, as indicated, and plasma after intravenous injection of 1 mg of 277-antibody into the eyes of rabbits as a function of time. Estimated ocular and plasma half-lives are presented in the table below.
Таблица 9Table 9
Рассчитанное время полужизни составляло 4,9, 4,8, 5,2 и 7,0 дней в стекловидном теле, внутриглазной жидкости, сетчатке и плазме, соответственно. Эти времени полужизни сходны с теми, которые описаны в литературе для клинически используемого рекомбинантного гуманизированного моноклонального IgG1 антитело Авастин (анти-VEGF, бевацизумаб, Bakri и др., Opthalmology, 2007), которые также были подтверждены экспериментально в собственных условиях. Эти результаты соответствовали предполагаемым, поскольку интравитреальный клиренс полноразмерных IgG главным образом зависит от их молекулярного размера, который сходен для нашего антитела 277 и Авастина. Таким образом, полагают, что ФК для человека, включая время полужизни в глазе антитела 277 и Авастина, является сходной. Описанное время полужизни в глазе человека для Авастина составляет 9,73±1,48 дня (Hutton-Smith, 2016).The estimated half-lives were 4.9, 4.8, 5.2 and 7.0 days in the vitreous, aqueous humor, retina and plasma, respectively. These half-lives are similar to those described in the literature for the clinically used recombinant humanized monoclonal IgG1 antibody Avastin (anti-VEGF, bevacizumab, Bakri et al., Opthalmology, 2007), which have also been validated experimentally in-house. These results were consistent with those expected, since intravitreal clearance of full-length IgG is mainly dependent on their molecular size, which is similar for our antibody 277 and Avastin. Thus, the human PK, including ocular half-life, of antibody 277 and Avastin is believed to be similar. The reported half-life in the human eye for Avastin is 9.73 ± 1.48 days (Hutton-Smith, 2016).
11. Частота ивт инъекции IgG1 антитела.11. Frequency of intravenous injection of IgG1 antibodies.
На основании данных in vivo, полученных в фармакокинетическом исследовании (пример 10), а также данных активности, полученных в SH-SY5Y клетках, исследовали глазную ФК для человека (витреальную концентрацию в динамике) IgG1 антител и рассчитывали на основании хорошо зарекомендовавших себя однокамерных моделей кинетики относительно глазного клиренса биомолекул. Для расчетов, использовали следующие параметры: время полужизни в глазе человека t1/2 =10 дней, как описано для Авастина, а также подтверждается приведенными данными in vivo в примере 10; молекулярный вес 149 кДа как для полноразмерных IgG1 антител, и количество ивт инъецированного антитела 1 мг (см. фиг. 4). Поскольку глазная ФК главным образом зависит от молекулярного веса, то идентичный график глазной ФК получали для всех пяти антител.Based on in vivo data obtained in the pharmacokinetic study (Example 10), as well as activity data obtained in SH-SY5Y cells, human ocular PK (vitreal concentration over time) of IgG1 antibodies was studied and calculated based on well-established single-compartment kinetics models relative to ocular clearance of biomolecules. For the calculations, the following parameters were used: half-life in the human eye t 1/2 =10 days, as described for Avastin, and also confirmed by the given in vivo data in example 10; molecular weight of 149 kDa as for full-length IgG1 antibodies, and the amount of i.t. injected antibody is 1 mg (see Fig. 4). Since ocular PK is primarily dependent on molecular weight, an identical ocular PK plot was obtained for all five antibodies.
Для оценки частоты ивт инъекции, следует принять во внимание, что эффективность in vivo может поддерживаться при витреальных концентрациях > клеточным ЕС50, как определено на основании анализов TrkB-фосфорилирования в SH-SY5Y клетках (Пример 8). Время после ивт инъекции для достижения витреальной концентрации, эквивалентной ЕС50, указано стрелками на фиг. 4. На основании этого анализа, время до достижения такой витреальной концентрации после инъекции 1 мг антитела обобщено в следующей таблице для каждого антитела.To assess the frequency of iVT injection, it should be taken into account that in vivo efficacy can be maintained at vitreal concentrations > cellular EC 50 as determined by TrkB phosphorylation assays in SH-SY5Y cells (Example 8). The time after IVT injection to achieve a vitreal concentration equivalent to EC 50 is indicated by arrows in Fig. 4. Based on this analysis, the time to achieve this vitreal concentration after injection of 1 mg of antibody is summarized in the following table for each antibody.
Таблица 10Table 10
Например, после инъецирования 1 мг С2 в глаз человеку, витреальная концентрация, соответствующая EC50 для С2 (табл. 10), достигается через 136 дней (то есть, через 136 дней, необходима следующая ивт инъекция). Для сравнения, в случае с 277-64 (IgG1), это время будет удлинено до 150 дней после ивт инъекции. В этом случае, следующая ивт инъекция будет необходима на 14 дней позже по сравнению с С2. Принимая во внимание, что минимальная эффективная доза значений в 10 раз выше, чем ЕС50, будет снижать время между инъекциями, однако, временное отличие в частоте инъекции между С2 и другими антителами, перечисленными табл. 10 выше, будет оставаться идентичным.For example, after injection of 1 mg C2 into the human eye, the vitreal concentration corresponding to the EC 50 for C2 (Table 10) is achieved after 136 days (i.e., after 136 days, the next IVT injection is required). In comparison, in the case of 277-64 (IgG1), this time will be extended to 150 days after the injection. In this case, the next IVT injection will be needed 14 days later compared to C2. Taking into account that the minimum effective dose values 10 times higher than the EC 50 will reduce the time between injections, however, the temporal difference in injection frequency between C2 and the other antibodies listed in Table. 10 above will remain identical.
Инъецируемый объем, который можно вводить в глаз, сильно ограничен. В то же время, повторные инъекции в глаза необходимы для лечения глазных состояний. Улучшение времени полужизни антитела является одним из способов увеличения времени между интервалами инъекций, но, как указано, главным образом зависит от молекулярного веса молекулы. Как было показано in vivo в примере 10 и на SH-SY5Y клетках в примере 8, путем обеспечения улучшенного и более эффективного антитела интервалы инъекций можно удлинить, что для пациентов представляет возможность менее часто получать инъекции в глаза.The injectable volume that can be injected into the eye is highly limited. At the same time, repeated injections into the eyes are necessary to treat eye conditions. Improving the half-life of an antibody is one way to increase the time between injection intervals, but is stated to be primarily dependent on the molecular weight of the molecule. As demonstrated in vivo in Example 10 and in SH-SY5Y cells in Example 8, by providing an improved and more effective antibody, injection intervals can be lengthened, allowing patients to receive ocular injections less frequently.
12. Нейрозащитный и нейрорегенеративный эффекты агонистического антитела TrkB у STZиндуцированных диабетических крыс.12. Neuroprotective and neuroregenerative effects of TrkB agonist antibody in STZ-induced diabetic rats.
Ни одно из 277-антител не является перекрестно реактивным у грызунов, следовательно, исследо- 43 043771 вания для подтверждения концепции и эффективности in vivo осуществляли с применением TrkB активирующего антитела С2 в качестве антитела суррогатных средств для тестирования гипотезы о том, что TrkB активирующие подход I) обеспечивает нейропротективное действие ('нейрозащитный подход'), и II) обеспечивает реактивацию дисфункциональных нейронов/совокупностей ('регенерационный подход'). Оба подхода рассматриваются в нескольких исследованиях. В качестве моделей болезней животных, использовали модель диабета, индуцированного стрептозотоцином (STZ) у крыс, которая характеризуется потерей бета-клеток поджелудочной железы, низкими уровнями инсулина, стабильной гипергликемией и последующей нейронной дисфункцией в сетчатке.None of the 277 antibodies are cross-reactive in rodents, therefore, proof of concept and in vivo efficacy studies were performed using the TrkB activating antibody C2 as a surrogate antibody to test the hypothesis that TrkB activating approach I ) provides a neuroprotective effect ('neuroprotective approach'), and ii) provides reactivation of dysfunctional neurons/assemblies ('regenerative approach'). Both approaches are considered in several studies. As an animal disease model, a rat model of streptozotocin (STZ)-induced diabetes was used, which is characterized by loss of pancreatic beta cells, low insulin levels, stable hyperglycemia and subsequent neuronal dysfunction in the retina.
Исследование на животных.Animal research.
Самцов серых крыс (BN крысы) получали от Charles River (Германия). Животных содержали в группах по 2 в IVC в условиях контролируемой температуры и влажности, с 12-ти часовым циклом день /ночь (свет был выключен в период от 18 ч до 6 ч утра). Они получали питание ad libitum с гранулированным рационом № 3438 от Provimi Kliba (Швейцария) и имели свободный доступ к питьевой воде. Животных акклиматизировали к их окружающей среде в течение одной недели перед началом исследования. Возраст крыс составлял 6-8 недель на начало прижизненной фазы исследования. Гипергликемию индуцировали путем в/б инъекции STZ (65 мг/кг вес тела; Sigma № S0130-1G). Животных, которые не отвечают, или плохо отвечают, не включали в исследование, то есть, животных с концентрациями глюкозы в крови <20 мМ в день 5 после применения STZ. За весом тела и уровнями глюкозы в крови наблюдали регулярно. Животным вводили дозу путем однократной ивт инъекции С2 (50 мкг в 4,6 мкл) или контрольного антитела к 2,4,6-тринитрофенилу (анти-TNP) (50 мкг в 4,5 мкл) в день 36 после применения STZ. Функция сетчатки оценивали с помощью записей электроретинографии (ЭРГ), и животных умертвляли после последней записи с помощью смертельной дозы в/б введения фенобарбитала.Male gray rats (BN rats) were obtained from Charles River (Germany). Animals were housed in groups of 2 in an IVC under temperature and humidity controlled conditions on a 12-hour day/night cycle (lights off from 6:00 pm to 6:00 am). They were fed ad libitum with pelleted diet no. 3438 from Provimi Kliba (Switzerland) and had free access to drinking water. Animals were acclimatized to their environment for one week before the start of the study. The rats were 6-8 weeks old at the beginning of the intravital phase of the study. Hyperglycemia was induced by IP injection of STZ (65 mg/kg body weight; Sigma no. S0130-1G). Animals that do not respond, or respond poorly, were not included in the study, that is, animals with blood glucose concentrations <20 mM on day 5 after STZ administration. Body weight and blood glucose levels were monitored regularly. Animals were dosed by a single i.v. injection of C2 (50 μg in 4.6 μl) or control anti-2,4,6-trinitrophenyl antibody (anti-TNP) (50 μg in 4.5 μl) on day 36 after STZ administration. Retinal function was assessed using electroretinography (ERG) recordings, and animals were sacrificed after the last recording using a lethal dose of intravenous phenobarbital.
Дозирование и интравитреальные инъекции.Dosing and intravitreal injections.
Общая схема исследования представлена на фиг. 5. Для ивт инъекции, крыс анестезировали с применением 2,5-3% изофлурана (Forene; Abbvie). Вводили каплю 4 мг/мл оксибупрокаингидрохлорида (Novesine; Omnivision) в качестве местной локальной анестезии. 4,6 мкл С2 маточного раствора (10,9 мг/мл; буфер: 20 мМ цитрат натрия, 115 мМ NaCl, pH 6,0) инъецировали ивт в каждый глаз гипергликемических крыс (группа 3, n=24 глаза, фиг. 5), что приводило к инъецируемой дозе ~50 мкг/глаз. В качестве контроля, 4,5 мкл анти- анти-2,4,6-тринитрофенильного маточного раствора (11,2 мг/мл; буфер 20 мМ цитрат натрия, 115 мМ NaCl, pH 6,0) инъецировали ивт в глаза недиабетических и диабетических контрольных крыс (группа 1, n=24 глаза, и группа 2, n=22 глаза, фиг. 5), что приводило к инъецируемой дозе ~50 мкг/глаз. Ивт инъекции осуществляли под препарировальной лупой. Раствор Антитела доставляли с помощью иглы 34 калибра (насаженной на стеклянный шприц Гамильтона объемом 10 мкл) в стекловидное тело сразу позади лимба, и общее качество инъекции контролировали с помощью фундоскопии (используя Micron IV Retinal Imaging Microscope, Phoenix Research Labs).The general scheme of the study is presented in Fig. 5. For IVT injection, rats were anesthetized using 2.5-3% isoflurane (Forene; Abbvie). A drop of 4 mg/mL oxybuprocaine hydrochloride (Novesine; Omnivision) was administered as a topical local anesthetic. 4.6 μl of C2 stock solution (10.9 mg/ml; buffer: 20 mM sodium citrate, 115 mM NaCl, pH 6.0) was injected i.t. into each eye of hyperglycemic rats (group 3, n=24 eyes, Fig. 5 ), resulting in an injected dose of ~50 μg/eye. As a control, 4.5 μl of anti-anti-2,4,6-trinitrophenyl stock solution (11.2 mg/ml; buffer 20 mM sodium citrate, 115 mM NaCl, pH 6.0) was injected i.t. into the eyes of nondiabetic and diabetic control rats (group 1, n=24 eyes, and group 2, n=22 eyes, Fig. 5), resulting in an injected dose of ~50 μg/eye. IVT injections were carried out under a dissecting loupe. The Antibody solution was delivered using a 34-gauge needle (attached to a 10-μL glass Hamilton syringe) into the vitreous just posterior to the limbus, and the overall quality of the injection was monitored by fundoscopy (using a Micron IV Retinal Imaging Microscope, Phoenix Research Labs).
Электроретинография.Electroretinography.
Электроретинография (ЭРГ) представляет собой неинвазивную электрофизиологическую технику для оценки индуцированной светом электрической активности различных нейронов сетчатки, и предоставляет возможность количественного определения различных аспектов функции сетчатки, таких как зрение при низком уровне освещенности или цветовое зрение. ЭРГ измеряли в качестве изменения потенциала между роговичным и эталонным электродом, используя систему записи Espion Е3 ЭРГ (Diagnosys LLC). Перед записями ЭРГ, животных адаптировали к темноте в течение по меньшей мере 2 часов, и анестезировали путем в/б инъекции кетамина (Ketanest, прибл. 100 мг/кг) и ксилазина (Rompun, прибл. 5 мг/кг). Животных помещали на столик с подогревом для поддержания постоянной температуры тела при 37°С. Зрачки расширяли с помощью 1% циклопентолат-HCl и 2,5% фенилэфрина. Каплю раствора Methocel 2% (OmniVision) капали на роговицу для предотвращения высушивания глаза и развития катаракты во время записей. Записи осуществляли одновременно для обоих глаз с помощью золотых петлевых электродов. Эталонный электрод представлял собой беззубый зажим типа крокодил, увлажненный Methocel, и прикрепленный к щеке животного. Для электрического заземления, зажим присоединяли к хвосту животного. ЭРГ сигналы замеряли при 1 кГц и записывали с граничными режимами 0,15 Гц низкой частоты и 500 Гц высокой частоты. Световые стимулы состояли из коротких вспышек с полным полем, доставляемых с помощью набора светоизлучающих диодов (продолжительность, <4 мс). Все вспышки продуцировали с помощью стимулятора Ganzfeld (ColorDome; Diagnosys), либо в темноте или на немигающем зеленом или красном фоновом свете.Electroretinography (ERG) is a non-invasive electrophysiological technique for assessing light-induced electrical activity of various retinal neurons, and provides the ability to quantify various aspects of retinal function, such as low-light vision or color vision. ERG was measured as the change in potential between the corneal and reference electrodes using an Espion E3 ERG recording system (Diagnosys LLC). Before ERG recordings, animals were dark-adapted for at least 2 hours and anesthetized by intravenous injection of ketamine (Ketanest, ca. 100 mg/kg) and xylazine (Rompun, ca. 5 mg/kg). Animals were placed on a heated table to maintain a constant body temperature at 37°C. The pupils were dilated with 1% cyclopentolate-HCl and 2.5% phenylephrine. A drop of Methocel 2% solution (OmniVision) was placed on the cornea to prevent drying of the eye and the development of cataracts during recordings. Recordings were made simultaneously for both eyes using gold loop electrodes. The reference electrode was a toothless alligator clip, moistened with Methocel, and attached to the animal's cheek. For electrical grounding, a clamp was attached to the animal's tail. ERG signals were sampled at 1 kHz and recorded with cutoff modes of 0.15 Hz low frequency and 500 Hz high frequency. Light stimuli consisted of short, full-field flashes delivered by an array of light-emitting diodes (duration, <4 ms). All flashes were produced using a Ganzfeld stimulator (ColorDome; Diagnosys) either in the dark or against a steady green or red background light.
ЭРГ протоколы.ERG protocols.
ЭРГ ответы сначала записывали от адаптированных к темноте животных (для выделения опосредованных палочками ответов), после этого записывали от животных, адаптированных к красному фоновому свету (50 кд/м2, для выделения УФ опосредованных колбочками ЭРГ ответов) и затем адаптированных к зеленому фоновому свету (25,5 кд/м2, для выделения опосредованные колбочками М-типа ответы). В случае адаптированных к темноте ЭРГ, ответы вызвали сериями вспышек в диапазоне от 1-10’5 до 0,1 кд-с/м2. Для вспышек с люминесценцией 1-10’5 и 3-10’5 кд-с/м2, ответы 20 опытов были усреднены.ERG responses were first recorded from dark-adapted animals (to isolate rod-mediated responses), then recorded from animals adapted to red background light (50 cd/ m2 , to isolate UV-cone-mediated ERG responses) and then adapted to green background light. (25.5 cd/ m2 , to highlight M-cone-mediated responses). In the case of dark-adapted ERGs, responses were evoked by series of flashes ranging from 1-10'5 to 0.1 cd-s/m 2 . For flashes with luminescence of 1-10'5 and 3-10'5 cd-s/m 2 , the responses of 20 experiments were averaged.
- 44 043771- 44 043771
Для вспышек в диапазоне от 1 -10-4 вплоть до 0,05 кд-с/м2, ответы 10 опытов были усреднены, и для конечной вспышки 0,1 кд-с/м2, 8 опытов были усреднены. Интервалы между индивидуальными вспышками выбирали таким образом, чтобы обеспечить полное восстановление сетчатки от каждой вспышки (нет признаков индуцированного вспышкой уменьшения амплитуд ответов или сокращения латентности). На основании этого критерия, интервалы между вспышками составляли 2 с для 1 -10-5 и 3-10-5 кд-с/м2 вспышки, 5 с для вспышек в диапазоне от 1 -10-4 вплоть до 0,05 кд-с/м2, и 10 с для вспышки 0,1 кд-с/м2.For flashes ranging from 1 -10 -4 down to 0.05 cd-s/m 2 , the responses of 10 trials were averaged, and for a final flash of 0.1 cd-s/m 2 , 8 trials were averaged. The intervals between individual flashes were chosen to ensure complete retinal recovery from each flash (no evidence of flash-induced reduction in response amplitudes or reduction in latency). Based on this criterion, the inter-flash intervals were 2 s for 1 -10 -5 and 3-10 -5 cd-s/m 2 flashes, 5 s for flashes in the range from 1 -10 -4 down to 0.05 cd- s/m 2 , and 10 s for a flash of 0.1 cd-s/m 2 .
Для записей УФ опосредованных колбочками ответов, животные были адаптированы к свету для красного фонового света в течение 2 мин. Световые ответы вызывали с помощью УФ вспышек 0,02, 0,04, 0,08, 0,17, 0,35, 0,83, 1,66, 2,90, и 4,15 мкВт/м2. Для записей опосредованных колбочками М-типа ответов, животные были адаптированы к свету для зеленого фонового света в течение 2 мин. Световые ответы вызывали с помощью зеленых вспышек 0,25, 0,1, 1,0, 5,0, 50, и 150 кд-с/м2. Для УФ и зеленых вспышек, ответы 10 опытов были усреднены с интервалами между вспышками 3 с.For recordings of UV cone-mediated responses, animals were light-adapted to red background light for 2 min. Light responses were induced using UV flashes of 0.02, 0.04, 0.08, 0.17, 0.35, 0.83, 1.66, 2.90, and 4.15 μW/m 2 . For recordings of M-cone-mediated responses, animals were light-adapted to a green background light for 2 min. Light responses were evoked using green flashes of 0.25, 0.1, 1.0, 5.0, 50, and 150 cd-s/ m2 . For UV and green flashes, responses from 10 trials were averaged with inter-flash intervals of 3 s.
Анализ данных.Data analysis.
Для определения ЭРГ амплитуд b-волн (положительная реакция деполяризации, имеющая происхождение главным образом из биполярных клеток), записывали данные ЭРГ и анализировали с использованием программного обеспечения MATLAB (версия R2014a; MathWorks). Осцилляторные потенциалы (небольшие высокочастотные волны, накладывающиеся на b-волну) удаляли от сигналов путем 55 Гц быстрого преобразования Фурье фильтрации низких частот, поскольку осцилляторные потенциалы могут оказывать влияние на амплитуду и положение пика b-волны, в особенности в адаптированных к свету условиях. Амплитуду b-волны вычисляли от нижнего уровня ответа а-волны (отрицательное отклонение, возникающее главным образом вследствие активности фоторецептора) к пику пика b-волны. Латентность b-волны измеряли как время после стимуляции вспышкой, необходимое для достижения пика b-волны.To determine ERG b-wave amplitudes (a positive depolarization response originating primarily from bipolar cells), ERG data were recorded and analyzed using MATLAB software (version R2014a; MathWorks). Oscillatory potentials (small high-frequency waves superimposed on the b-wave) were removed from the signals by 55 Hz fast Fourier transform low-pass filtering because oscillatory potentials can influence the amplitude and position of the b-wave peak, particularly under light-adapted conditions. The b-wave amplitude was calculated from the trough of the a-wave response (the negative deflection resulting primarily from photoreceptor activity) to the peak of the b-wave peak. b-wave latency was measured as the time after flash stimulation required to reach the peak of the b-wave.
Амплитуды b-волн в зависимости от интенсивности стимула подгоняли с помощью следующего уравнения, используя процедуру выравнивания методом наименьших квадратов (GraphPad Prism, версия 6.01): р тП R=7^} (Уравнение!) где R представляет собой амплитуду ответа, Rmax представляет собой амплитуду насыщающих колебаний, I интенсивность вспышки, Ih полунасыщающую интенсивность вспышки и п коэффициент Хилла.b-wave amplitudes as a function of stimulus intensity were fitted using the following equation using a least-squares fitting procedure (GraphPad Prism, version 6.01): р тП R =7^ } (Equation!) where R is the response amplitude, Rmax is amplitude of saturating oscillations, I flare intensity, I h half-saturating flare intensity and n Hill coefficient.
Светочувствительность, S, определяли как соотношение между амплитудой насыщающих колебаний, Rmax, и полунасыщающей интенсивностью вспышки, Ih.Photosensitivity, S, was defined as the ratio between the amplitude of the saturating oscillations, Rmax , and the half-saturating flash intensity, Ih.
S и Rmax значения нормировали к средним значениям не-диабетических контролей, полученных для недели 5, до ивт, и для недели 7, после ивт лечения, соответственно.S and Rma x values were normalized to the mean values of non-diabetic controls obtained for week 5, before IVT, and for week 7, after IVT treatment, respectively.
Для анализа латентности опосредованной палочками b-волны, определяли среднюю латентность недиабетических контрольных животных для b-волны, вызываемых вспышками 1-10-5, 3-10-5, 1-10-4 и 2-10-4 кд-с/м2 (соответствующая латентность является очень похожей). Для каждой исследуемой группы, рассчитывали относительное изменение для среднего значения контролей для интенсивностей вспышек, указанных выше, и усредняли, получая среднее относительное изменение латентности b-волны.To analyze the latency of rod-mediated b-waves, the average latency of non-diabetic control animals for b-waves evoked by bursts of 1-10 -5 , 3-10 -5 , 1-10 -4 and 2-10 -4 cd-s/m was determined. 2 (the corresponding latency is very similar). For each study group, the relative change for the mean of the controls was calculated for the flash intensities indicated above and averaged to obtain the mean relative change in b-wave latency.
Для анализа УФ опосредованной колбочками латентности b-волны, рассчитывали относительные изменения латентности к среднему значению контролей для b-волновых ответов, вызываемых интенсивностями вспышек 0,042, 0,083, 0,166 и 0,348 мкВт/см2, и усредняли.To analyze UV cone-mediated b-wave latency, relative latency changes to the control mean for b-wave responses evoked by flash intensities of 0.042, 0.083, 0.166, and 0.348 μW/cm 2 were calculated and averaged.
Для анализа латентности опосредованной колбочками М-типа b-волны, рассчитывали относительные изменения латентности к среднему значению контролей для b-волновых ответов, вызываемых интенсивностями вспышек 1, 5, 50 и 150 кд-с/м2, и усредняли.To analyze the latency of the M-type cone-mediated b-wave, relative changes in latency to the control mean were calculated for b-wave responses evoked by flash intensities of 1, 5, 50, and 150 cd-s/m 2 and averaged.
Ответ опосредованной палочками а-волны определяли на пике а-волны (отрицательное отклонение сигнала сразу после светового стимула), вызываемого вспышкой 0,1 кд-с/м2.The rod-mediated a-wave response was determined at the peak of the a-wave (negative signal deflection immediately after the light stimulus) evoked by a 0.1 cd-s/m 2 flash.
Результаты.Results.
В неделю 5 после индукции диабета, осуществляли записи исходных ЭРГ для количественного определения степени нейронной дисфункции в сетчатке перед ивт лечением (см. также фиг. 5). На основании этих результатов ЭРГ, было установлено, что две диабетические (гипергликемические) группы проявляли сходное распределение дисфункции сетчатки (которые получали последующее ивт лечение либо с применением контрольного IgG1 к 2,4,6-тринитрофенилу - группа 2 - или TrkB агонистическое IgG1 C2 - группа 3). В целом, все ивт лечения хорошо переносились и не наблюдали побочных эффектов. Глюкоза в крови была стабильной на уровне ~5 мМ у недиабетических контрольных крыс (группа 1, n=12) в период осуществления исследования. В STZ-индуцированных диабетических животных (группа 2 и 3, каждая n=12), концентрации глюкозы в крови достигали уровней >20 мМ через ~4 дня после STZ обработки, и не снижались ниже 20 мМ в период осуществления исследования. Ивт лечение с применением С2 или контрольного IgG1 к 2,4,6-тринитрофенилу не оказывает каких-либо влияний на уровни глюкозы в крови.At week 5 after diabetes induction, baseline ERG recordings were performed to quantify the degree of neural dysfunction in the retina before IVT treatment (see also FIG. 5). Based on these ERG results, it was determined that the two diabetic (hyperglycemic) groups exhibited a similar distribution of retinal dysfunction (which received subsequent IVT treatment with either control IgG1 to 2,4,6-trinitrophenyl - group 2 - or TrkB agonist IgG1 C2 - group 3). In general, all IVT treatments were well tolerated and no side effects were observed. Blood glucose was stable at ~5 mM in nondiabetic control rats (group 1, n=12) during the study period. In STZ-induced diabetic animals (groups 2 and 3, each n=12), blood glucose concentrations reached levels of >20 mM ∼4 days after STZ treatment, and did not decrease below 20 mM during the study period. IVT treatment with C2 or control IgG1 to 2,4,6-trinitrophenyl did not have any effect on blood glucose levels.
- 45 043771- 45 043771
Латентность опосредованной палочками b-волны.Rod-mediated b-wave latency.
Латентность b-волны представляет собой критерий для скорости индуцированного светом электрического ответа в сетчатке (главным образом на уровне биполярных клеток и синаптической трансмиссии фоторецептор-на-биполярные клетки). Латентность определяется как время, необходимое для достижения амплитуды ответа после стимуляции вспышкой света. Влияния гипергликемии и ивт лечения обобщены на фиг. 6. Рассчитывали изменения латентности относительно средней латентности, измеренных от контрольных крыс, для данных, полученных до ивт лечения (оценка исходного состояния ЭРГ) и после ивт лечения. Существует сильное увеличение латентности на ~14 мс в двух гипергликемических группах до ивт лечения, указывая на индуцированное гипергликемией замедление кинетики ответа bволны, то есть, уменьшенная скорость опосредованного палочками процессинга в сетчатке. Ивт инъекция контрольного IgG1 к 2,4,6-тринитрофенилу не оказывала каких-либо существенных влияний на латентность у недиабетической контрольной группе и гипергликемической группе (группа 1, черные столбики, и группа 2, обозначенные точками столбики на фиг. 6, после ивт, соответственно). Однако, ивт лечение с применением TrkB активатора С2 очевидно приводит к уменьшенной задержке латентности (группа 3, серый столбик на фиг. 6, после ивт). В среднем, ивт лечение с применением С2 вызывает существенное ускорение ответов b-волны на ~9 мс (то есть задержка латентности сокращается от 14 мс вплоть до 5 мс).b-wave latency is a measure of the rate of light-induced electrical response in the retina (mainly at the level of bipolar cells and photoreceptor-to-bipolar cell synaptic transmission). Latency is defined as the time required to reach response amplitude after stimulation with a flash of light. The effects of hyperglycemia and IVT treatment are summarized in FIG. 6. Changes in latency relative to the mean latency measured from control rats were calculated for data obtained before IVT treatment (ERG baseline assessment) and after IVT treatment. There is a strong increase in latency of ~14 ms in the two hyperglycemic groups before IVT treatment, indicating a hyperglycemia-induced slowing of b-wave response kinetics, that is, a reduced rate of rod-mediated processing in the retina. IVT injection of control IgG1 to 2,4,6-trinitrophenyl did not have any significant effects on latency in the nondiabetic control group and the hyperglycemic group (group 1, black bars, and group 2, dotted bars in Fig. 6, after IVT, respectively). However, iT treatment with the TrkB activator C2 apparently resulted in reduced latency (group 3, gray bar in Fig. 6, after iT). On average, IVT treatment with C2 causes a significant acceleration of b-wave responses by ~9 ms (ie, latency is reduced from 14 ms down to 5 ms).
Светочувствительность опосредованной палочками b-волны.Rod-mediated b-wave photosensitivity.
ЭРГ ответы светочувствительности опосредованной палочками b-волны являются показателем количества нейронов, принимающих участие в опосредованных палочками путях передачи сигналов в сетчатке, и их чувствительность к световым стимулам для образования деполяризующих световых ответов. Светочувствительности нормировали к средним светочувствительностям контрольных крыс (группа 1, до и после ивт лечения) и графически представляли на фиг. 7. Нормированные светочувствительности снижались на ~40-50% у гипергликемических животных (до ивт лечения, группа 2 и 3). Ивт инъекция контрольного IgG1 не оказывала каких-либо существенных влияний на светочувствительности контрольных крыс (группа 1) или гипергликемических крыс (группа 2). Чрезвычайно важным является тот факт, что ивт лечение с применением TrkB активатора С2 существенно повышало светочувствительность на ~30% (группа 3, серые, после ивт по сравнению с до ивт).ERG responses of rod-mediated b-wave light sensitivity are an indicator of the number of neurons participating in rod-mediated signaling pathways in the retina and their sensitivity to light stimuli to produce depolarizing light responses. Light sensitivity was normalized to the average light sensitivity of control rats (group 1, before and after IHT treatment) and graphically presented in Fig. 7. Normalized photosensitivity decreased by ~40-50% in hyperglycemic animals (before IHT treatment, groups 2 and 3). IVT injection of control IgG1 did not have any significant effects on the photosensitivity of control rats (group 1) or hyperglycemic rats (group 2). It is extremely important that IVT treatment with the TrkB activator C2 significantly increased photosensitivity by ~30% (group 3, gray, after IVT compared with before IVT).
Ответы опосредованной палочками а-волны.Rod-mediated a-wave responses.
Ответ опосредованной палочками а-волны является показателем для размера световых ответов палочкового фоторецептора, вызванных вспышкой света. Ответы опосредованной палочками а-волны нормировали к средним значениям, полученным от контрольные крысы (группа 1, до и после ивт лечения) и графически представляли на фиг. 8. Нормированные амплитуды насыщающих колебаний снижались на ~17% у гипергликемических животных (группа 2 и 3, до ивт лечения). Ивт инъекция контрольного IgG1 не оказывала каких-либо существенных влияний на нормированные ответы а-волны у контрольных крыс (группа 1, черные) или гипергликемических крыс (группа 2, обозначенные точками), где у последней группы проявляется дальнейшее снижение ответа а-волны во время проведения исследования. Однако, ивт лечение с применением TrkB активатора С2 (группа 3, серые) может полностью предотвращать дальнейшее снижение ответов а-волны, что наблюдается для гипергликемической группы 2.The rod-mediated a-wave response is an indicator for the size of the rod photoreceptor light responses evoked by a flash of light. Rod-mediated a-wave responses were normalized to the mean values obtained from control rats (group 1, before and after IVT treatment) and are graphically presented in Fig. 8. Normalized amplitudes of saturating oscillations decreased by ~17% in hyperglycemic animals (groups 2 and 3, before IVT treatment). IVT injection of control IgG1 did not have any significant effects on normalized a-wave responses in control rats (group 1, black) or hyperglycemic rats (group 2, indicated by dots), where the latter group showed a further decrease in a-wave response during conducting research. However, iT treatment with the TrkB activator C2 (group 3, gray) can completely prevent the further decrease in a-wave responses observed for hyperglycemic group 2.
УФ и латентность опосредованной колбочками М-типа b-волны.UV and M-cone-mediated b-wave latency.
Рассчитывали изменения латентности относительно средней латентности, измеренной для контрольных крыс, для данных, полученных до ивт лечения (оценка исходного состояния ЭРГ) и после ивт лечения. Этот анализ осуществляли для УФ латентности опосредованной колбочками b-волны (фиг. 9) и латентности опосредованной колбочками М-типа b-волны (фиг. 10). В случае УФ опосредованных колбочками ответов, существует сильное увеличение латентности на ~8 мс в двух гипергликемических группах до ивт лечения, в то время как увеличение опосредованный колбочками М-типа латентности составляет ~5 мс для гипергликемических крыс. Эти статистически достоверные эффекты указывают на индуцированное гипергликемией замедление кинетики ответов b-волны и уменьшает скорость опосредованного колбочками процессинга в сетчатке. Ивт инъекции контрольного IgG1 не оказывал каких-либо существенных влияний на латентность у недиабетической контрольной группы (группа 1, черные) или гипергликемической группы (группа 2, обозначенные точками), для обоих УФ и латентности опосредованной колбочками М-типа b-волны. Ивт лечение с применением С2 (группа 3, серые) сокращает латентность на ~5 мс в случае УФ колбочек (что соответствует ~50% нормализации кинетики ответов bволны), и практически полное восстановление кинетики нормальных ответов b-волны в случае опосредованных колбочками М-типа b-волн.Changes in latency relative to the mean latency measured for control rats were calculated for data obtained before IVT treatment (ERG baseline assessment) and after IVT treatment. This analysis was performed for UV cone b-wave latency (FIG. 9) and M-cone b-wave latency (FIG. 10). In the case of UV cone-mediated responses, there is a strong increase in latency of ~8 ms in the two hyperglycemic groups before IVT treatment, while the increase in M-cone-mediated latency is ~5 ms for the hyperglycemic rats. These statistically significant effects indicate a hyperglycemia-induced slowing of the kinetics of b-wave responses and a decrease in the rate of cone-mediated processing in the retina. IVT injection of control IgG1 did not have any significant effects on latency in the nondiabetic control group (group 1, black) or hyperglycemic group (group 2, dotted), for both UV and M-cone b-wave mediated latency. IVT treatment with C2 (group 3, gray) reduced latency by ~5 ms in the case of UV cones (corresponding to ~50% normalization of the kinetics of b-wave responses), and almost complete restoration of the kinetics of normal b-wave responses in the case of M-type cone-mediated responses b-waves
Светочувствительность УФ опосредованной колбочками b-волны.Cone-mediated b-wave UV photosensitivity.
ЭРГ ответы светочувствительности УФ опосредованной колбочками b-волна оценивали, как описано для опосредованной палочками ЭРГ. Светочувствительности нормировали к средним светочувствительностям контрольных крыс (группа 1, до и после ивт лечения) и графически представляли на фиг. 11. Нормированные светочувствительности снижались на ~50% у гипергликемических животных на исходном уровне (до ивт). Ивт инъекция контрольного IgG1 не оказывала каких-либо существенных влияний на светочувствительности, в то время как ивт лечение с применением С2 существенно повышало светоCone-mediated b-wave UV photosensitivity ERG responses were assessed as described for rod-mediated ERG. Light sensitivity was normalized to the average light sensitivity of control rats (group 1, before and after IHT treatment) and graphically presented in Fig. 11. Normalized photosensitivity decreased by ~50% in hyperglycemic animals at baseline (before IVT). IVT injection of control IgG1 did not have any significant effects on photosensitivity, while IVT treatment with C2 significantly increased light sensitivity.
- 46 043771 чувствительность до уровня, наблюдаемого у здоровых контрольных крыс (группа 3, серые).- 46 043771 sensitivity to the level observed in healthy control rats (group 3, gray).
Амплитуда ответа опосредованной колбочками М-типа насыщающей b-волны.M-cone-mediated saturating b-wave response amplitude.
Влияние гипергликемии на светочувствительность опосредованной колбочками М-типа b-волны является менее выраженным, чем для УФ опосредованной колбочками b-волны (в исследуемые временные точки). Тем не менее, можно наблюдать существенное ухудшение амплитуды насыщающих колебаний опосредованных колбочками М-типа b-волн в неделю 5 после начала гипергликемии (~15% уменьшение по сравнению с не-диабетическими контрольными крысами, фиг. 12). Ивт лечение с применением С2 может восстанавливать амплитуду насыщающих колебаний до уровня контролей (группа 3, серые), в то время как лечение с применением контрольного IgG1 не оказывало каких-либо существенных влияний (группа 2, обозначенные точками).The effect of hyperglycemia on M-cone-mediated b-wave photosensitivity is less pronounced than that on UV-cone-mediated b-wave (at the time points studied). However, a significant deterioration in the amplitude of saturating oscillations of M-cone b-waves can be observed at week 5 after the onset of hyperglycemia (~15% reduction compared to non-diabetic control rats, Fig. 12). IVT treatment with C2 could restore the amplitude of saturating oscillations to the level of controls (group 3, gray), while treatment with control IgG1 did not have any significant effects (group 2, dots).
Основные результаты исследований обобщены ниже.The main research findings are summarized below.
Активация TrkB вызывает нейропротективное действие и сохраняет функцию сетчатки. Нейропротективное действие было показано на модели STZ-индуцированного диабета у крыс, отображающей индуцированную гипергликемией нейронную дисфункцию. Было показано, что активация TrkB предотвращает дисфункцию фоторецепторов.Activation of TrkB causes neuroprotection and preserves retinal function. Neuroprotective effects were demonstrated in a rat model of STZ-induced diabetes, displaying hyperglycemia-induced neural dysfunction. Activation of TrkB has been shown to prevent photoreceptor dysfunction.
Активация TrkB индуцирует восстановление/улучшение функции нейронов в сетчатке на модели STZ-индуцированного диабета у крыс после пролонгированной гипергликемии, например, улучшенную латентность светового ответа (то есть, сокращение ЭРГ латентности b-волны), или улучшенные опосредованных палочками и колбочками светочувствительности.Activation of TrkB induces restoration/improvement of neuronal function in the retina in a rat model of STZ-induced diabetes after prolonged hyperglycemia, such as improved light response latency (i.e., reduction in ERG b-wave latency), or improved rod- and cone-mediated light sensitivity.
Подводя итог, следует отметить, что фармакологические данные обеспечивают подтверждение терапевтической концепции о том, что активация TrkB может улучшать/восстанавливать функцию различных типов нейронных клеток в глазе при различных болезненных состояния.In summary, pharmacological data provide support for the therapeutic concept that TrkB activation can improve/restore the function of various types of neuronal cells in the eye in various disease states.
Активация TrkB также защищает фоторецепторы и наружную сетчатку, как показано с помощью анализа ЭРГ а-волны, которая является показателем световых ответов фоторецепторов. Подобно результатам, полученным для ЭРГ а-волны, контрастная чувствительность глаз диабетических крыс снижается во время продолжающейся гипергликемии, в то время как ивт лечение с применением TrkB активатора С2 полностью сохраняет контрастную чувствительность. Кроме того, улучшение ЭРГ светочувствительности световых ответов опосредованных палочками и колбочками b-волны, как описано выше (отображающее светочувствительности синаптической трансмиссии фоторецепторов на биполярные клетки) дополнительно усиливает концепцию о том, что активация TrkB может улучшать/защищать функцию наружной сетчатки, включая фоторецепторы.Activation of TrkB also protects photoreceptors and the outer retina, as shown by a-wave ERG analysis, which is an indicator of photoreceptor light responses. Similar to the results obtained for the α-wave ERG, contrast sensitivity of the eyes of diabetic rats decreases during ongoing hyperglycemia, whereas iT treatment with the TrkB activator C2 completely preserves contrast sensitivity. In addition, the improvement in ERG light sensitivity to rod and cone b-wave mediated light responses as described above (reflecting light sensitivity of photoreceptor synaptic transmission onto bipolar cells) further strengthens the concept that TrkB activation may improve/protect outer retinal function, including photoreceptors.
13. BDNF функция при комбинированных лечениях.13. BDNF function in combination treatments.
Культивирование СНО клеток, экспрессирующих TrkB рецептор человека.Cultivation of CHO cells expressing the human TrkB receptor.
СНО клетки, экспрессирующие TrkB рецептор человека (hTrkB) (ThermoFisher Scientific, № K1491) культивировали в DMEM (Lonza, № BE12-604F), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, глутамаксом, заменимыми аминокислотами, 20 мМ HEPES, 5 мкг/мл бластицидина и 200 мкг/мл зеоцина. За двадцать четыре часа до стимуляции, 5000 клеток (30 мкл) высевали в каждую полость прозрачного планшета для культивирования тканей на 384 лунки (BD Falcon, № 353963) и инкубировали в увлажненном инкубаторе при 37°С и 5% СО2.CHO cells expressing the human TrkB receptor (hTrkB) (ThermoFisher Scientific, no. K1491) were cultured in DMEM (Lonza, no. BE12-604F) supplemented with 10% fetal bovine serum, glutamax, nonessential amino acids, 20 mM HEPES, 5 μg/ml blasticidin and 200 μg/ml zeocin. Twenty-four hours before stimulation, 5000 cells (30 μl) were seeded into each cavity of a clear 384-well tissue culture plate (BD Falcon, #353963) and incubated in a humidified incubator at 37°C and 5% CO 2 .
Анализ ERK фосфорилирования в СНО клетках с помощью hTrkB рецептора.Analysis of ERK phosphorylation in CHO cells by the hTrkB receptor.
Через двадцать четыре часа после высевания, супернатант CHO/hTrkB клеток заменяли на 40 мкл DMEM комнатной температуры с 0,1% BSA, но без других дополнительных компонентов. Через 15 мин, добавляли 10 мкл DMEM/0,1% BSA с возрастающими концентрациями BDNF (1E-13 до 3Е-8 моль/л), 277-антитела (1Е-13 до 2,025Е-8 моль/л), или С2-антитела (1Е-13 до 2,025Е-8 моль/л) отдельно или комбинации с 1 нМ BDNF с возрастающими концентрациями 277- или С2-антитела (оба 1Е-13 до 2,025Е-8 моль/л) в трех повторах для стимуляции ERK фосфорилирования. После инкубирования в течение 45 мин при комнатной температуре, супернатанты удаляли и клетки лизировали в течение 20 мин на жидком льду в 20 мкл лизирующего буфера на лунку (1x Tryton лизирующий буфер (CellSignaling № 9803-S), дополненным таблетками полного мини протеазного ингибитора (Roche № 04693124001) и коктейлями ингибиторов фосфатаз 2 (Sigma № Р5726) и 3 (Sigma № Р0044), и 1 мМ PMSF (Sigma № 93482)). Пять микролитров полученного лизата использовали для количественного определения ERK1/2 фосфорилирования в T202/Y204, используя коммерчески доступный анализ (Perkin Elmer № TGRES500), согласно инструкциям производителя. Излучение света акцепторных шариков, отображающее ERK фосфорилирование, записывали при 570 нм на микропланшет-ридере Perking Elmer EnVision и подготавливали для презентации с помощью GraphPad Prism (версия 7), включая необработанные данные (среднее ± СПС) и нелинейную регрессию (лог(агонист) отн. ответа (три параметра)).Twenty-four hours after plating, the CHO/hTrkB cell supernatant was replaced with 40 μl of room temperature DMEM with 0.1% BSA but no other additional components. After 15 min, 10 μl of DMEM/0.1% BSA was added with increasing concentrations of BDNF (1E-13 to 3E-8 mol/L), 277-antibody (1E-13 to 2.025E-8 mol/L), or C2 -antibodies (1E-13 to 2.025E-8 mol/l) alone or combination with 1 nM BDNF with increasing concentrations of 277- or C2-antibodies (both 1E-13 to 2.025E-8 mol/l) in triplicate for stimulation ERK phosphorylation. After incubation for 45 min at room temperature, supernatants were removed and cells were lysed for 20 min on liquid ice in 20 μl of lysis buffer per well (1x Tryton lysis buffer (CellSignaling no. 9803-S) supplemented with complete mini protease inhibitor tablets (Roche No. 04693124001) and cocktails of phosphatase inhibitors 2 (Sigma No. P5726) and 3 (Sigma No. P0044), and 1 mM PMSF (Sigma No. 93482)). Five microliters of the resulting lysate was used to quantify ERK1/2 phosphorylation at T202/Y204 using a commercially available assay (Perkin Elmer #TGRES500), according to the manufacturer's instructions. Acceptor bead light emission representing ERK phosphorylation was recorded at 570 nm on a Perking Elmer EnVision microplate reader and prepared for presentation using GraphPad Prism (version 7), including raw data (mean ± SPE) and nonlinear regression (log(agonist)rel response (three parameters)).
Как показано на фиг. 13, 277-антитело не уменьшает BDNF индуцированное ERK фосфорилирование. Возрастающие концентрации С2 антитела приводят к уменьшению BDNF индуцированного ERK фосфорилирования вплоть до уровня С2 индуцированного ERK фосфорилирования. Это может оказывать существенное влияние на дозирование антитела к TrkB в глаза, где антитела вводятся в высоких насыщающих концентрациях для пролонгирования времени, необходимого до следующего введения.As shown in FIG. 13,277 antibody does not reduce BDNF-induced ERK phosphorylation. Increasing concentrations of C2 antibody result in a decrease in BDNF-induced ERK phosphorylation down to the level of C2-induced ERK phosphorylation. This may have a significant impact on dosing of anti-TrkB antibody to the eye, where the antibody is administered at high saturating concentrations to prolong the time required before the next administration.
--
Claims (23)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP17175122.5 | 2017-06-09 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA043771B1 true EA043771B1 (en) | 2023-06-21 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6053834B2 (en) | Compositions and methods for binding sphingosine-1-phosphate | |
JP7505084B2 (en) | Anti-TRKB antibody | |
AU2019254934A1 (en) | Monoclonal antibody of nerve growth factor and encoding gene and use thereof | |
TW201722474A (en) | Methods of treating inflammatory diseases | |
TWI836069B (en) | Anti-sema3a antibodies and their uses for treating eye or ocular diseases | |
AU2016285858A1 (en) | Multi-specific binding proteins | |
US8758754B2 (en) | Nogo-A binding molecules and pharmaceutical use thereof | |
US20220363743A1 (en) | Anti-angpt2 antibodies | |
AU2018279184B2 (en) | Anti-TrkB antibodies | |
EA043771B1 (en) | ANTIBODIES TO TRKB | |
JP7512433B2 (en) | Anti-PD-1 antibody | |
JP2016537406A (en) | Disease treatment composition for binding to cysteinyl leukotriene (cysLT) and method thereof | |
EA047046B1 (en) | ANTIBODIES TO ANGPT2 | |
CN114423788A (en) | anti-NRP 1A antibodies and their use for treating ocular or ocular diseases | |
EA046375B1 (en) | METHOD FOR TREATING INFLAMMATORY DISEASES |