JP2022549005A - 抗Ｎｒｐ１Ａ抗体及びその眼又は眼部疾患を治療するための使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ニューロピリン－１（Ｎｒｐ１Ａ）のＡドメインを標的とする抗体及びそのフラグメントに関する。より具体的には、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体、及び多数の疾患又は障害の治療用の方法が開示される。【選択図】 なし

Description

本発明は、一般的には、ニューロピリン－１（Ｎｒｐ１）、より正確には、Ｎｒｐ１のＡドメイン（Ｎｒｐ１Ａ）を標的とする抗体及びそのフラグメントに関する。より具体的には、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体、及び様々な疾患又は障害の治療用の方法が開示される。該抗Ｎｒｐ１Ａ抗体を含む医薬組成物も開示される。

糖尿病性網膜症は、最も衰弱性の糖尿病合併症の１つである。この疾患の病因の理解及び現在の治療法の有効性には大きな躍進があるものの、糖尿病性網膜症は、労働年齢の人の中で新規発症失明の主因となっている。

糖尿病性網膜症は、血管、グリア及びニューロンレベルで生じる異常な進行を特徴とする。血管合併症の１つが、網膜虚血をもたらす小さい毛細血管の減少である。虚血性網膜症は、網膜血管系の消失や機能不全を特徴として、血流の減少及び低酸素症を引き起こす。毛細血管の脱落は、中心窩無血管域（ＦＡＺ）の周囲によく現れることでそのサイズを広げ、この状態は、糖尿病性黄斑虚血（ＤＭＩ）と呼ばれる。網膜の虚血は、血管形成促進増殖因子（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の上昇と血管反発因子（ｖａｓｏｒｅｐｕｌｓｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）の上昇を同時に引き起こし、血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の方向を誤らせる。虚血性網膜の血行再建（ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）が発生しない一方で、頑強な病的血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）が硝子体（通常血管がない眼の領域）内にある。増殖性網膜症のこれらの異常な新血管の増殖は、出血を引き起こすか、又は最終的に網膜剥離になり得る瘢痕を引き起こす漏れを起こし得るため、視力に対する大半の脅威を作り出す。増殖性網膜症のための現在の治療は、存在する病的血管を破壊しようとするものであるが、かかる血管の増殖を推進する根底にある虚血に対処するものではない。現在、増殖性網膜症のための標準治療は、レーザーにより網膜の一部を破壊し、新しい血管の増殖の停止と中心視（ｃｅｎｔｒａｌ ｖｉｓｉｏｎ）の維持を試みる。しかしながら、これらの治療はある程度役に立たない。多少の患者は安定な視力を長年維持できるが、網膜症を患う高比率の患者は、最終的に完全に失明する。

網膜症は、網膜血管漏出が増加し、黄斑浮腫をもたらすことも特徴として挙げられるだろう。現在、糖尿病性黄斑浮腫を患う患者は、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ、血管形成及び血管透過性の両方を促進する増殖因子）を標的にする化合物で治療されている。この治療方針は、黄斑虚血及び黄斑浮腫の両方を患う患者の治療にとって十分ではない可能性がある。

したがって、ＶＥＧＦ－Ａの血管形成促進の性質からベネフィットを受けることができる患者、特に黄斑虚血及び黄斑浮腫の両方を患う患者を治療する治療手段のニーズが依然として存在する。その結果、眼疾患や網膜疾患を効率よく治療するための新たな治療手段に対するニーズが依然として満たされていない。

ニューロピリン（ＮＲＰｓ）は、膜貫通型糖タンパク質受容体であり、軸索ガイダンス因子であるクラス３セマフォリンファミリー（ＳＥＭＡｓ）のメンバーの受容体及び血管形成因子である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーの受容体として、神経系及び血管系の発達に重要な役割を果たす。２つのニューロピリンタンパク質、ニューロピリン－１（Ｎｒｐ１）とニューロピリン－２（Ｎｒｐ２）が同定されている。それらの細胞外領域には３つのドメインが含まれる：Ｓｅｍａ３リガンド結合ドメインとしての２つのＣＵＢホモロジードメイン（Ｎｒｐ１のＡドメイン、本明細書において「Ｎｒｐ１Ａ」とも呼ばれる）、ＶＥＧＦ結合ドメインとしての２つの凝固因子Ｖ／ＶＩＩＩホモロジードメイン（Ｎｒｐ１のＢドメイン、本明細書において「Ｎｒｐ１Ｂ」とも呼ばれる）、及びＮｒｐ１の二量体化に関与するＭＡＭドメイン（ｃ）。Ｎｒｐ１は、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＰｌＧＦ、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｂ及びＳｅｍａ３Ｃに結合できるのに対し、Ｎｒｐ２は、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ａ１４５、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＳＥＭＡ３Ｂ、Ｓｅｍａ３Ｃ、Ｓｅｍａ３Ｆ及びＳｅｍａ３Ｇに結合する。ＶＥＧＦリガンドとの結合部位はＮｒｐ１のＢドメインの上に局在しているのに対し、セマフォリンとの結合はＮｒｐ１のＡドメインの上に局在している。

ヒトＮｒｐ１の配列がオンラインで入手可能であり、Ｎｒｐ１アイソフォームＡの前駆体が、配列番号：２６に示され、参考タンパク質の配列ＮＰ＿００３８６４に基づいて入手可能である。Ｎｒｐ１は、腫瘍の血管形成及び転移について何年にわたって研究されているが、その網膜の血行再建及び血管新生への効果は十分に理解されていない。本発明者らは、本明細書において、Ｎｒｐ１、特にＮｒｐ１のＡドメインを標的にすることが、眼疾患及び網膜疾患を治療するための効果の高い手段であることを示した。

第１の態様において、本発明は、
配列番号：１（Ｈ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：２（Ｈ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：３（Ｈ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号：４（Ｌ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：５（Ｌ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：６（Ｌ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、
配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６又は配列番号：１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号：１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、
配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６又は配列番号：１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号：１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
前記重鎖可変領域が、配列番号：１（Ｈ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：２（Ｈ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：３（Ｈ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変領域が、配列番号：４（Ｌ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：５（Ｌ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：６（Ｌ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。

さらにもう１つの実施形態において、本発明は、
配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６又は配列番号：１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号：１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。

もう１つの実施形態において、本発明は、
ａ．配列番号：１０及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
ｂ．配列番号：１２及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
ｃ．配列番号：１３及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
ｄ．配列番号：１４及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
ｅ．配列番号：１５及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
ｆ．配列番号：１６及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、又は
ｇ．配列番号：１７及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。

さらにもう１つの実施形態において、本発明は、
配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４又は配列番号：２５のアミノ酸配列を含む重鎖、好ましくは配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４又は配列番号：２５のアミノ酸配列からなる重鎖、及び
配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、好ましくは配列番号：１９のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。

具体的な実施形態において、本発明は、
ａ．配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｂ．配列番号：２０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｃ．配列番号：２１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｄ．配列番号：２２のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｅ．配列番号：２３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
ｆ．配列番号：２４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、又は
ｇ．配列番号：２５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、に関する。

具体的な好ましい実施形態において、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、ヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体である。

第２の態様において、本発明は、配列番号：２６に示されるヒトＮｒｐ１のアミノ酸領域６８-７７内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、配列番号：２６に示されるアミノ酸領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：２７に示されるアミノ酸領域に結合する、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。

第３の態様において、本発明は、医薬としての使用のための、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、Ｓｅｍａ３Ａの血管反発（ｖａｓｏｒｅｐｕｌｓｉｖｅ）効果を抑制し、及び／又は網膜の血行再建を改善するための、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又は抗原結合フラグメント、を提供する。更なる実施形態において、本発明は、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される血液網膜関門（ＢＲＢ）の透過性を抑制し、ＶＥＧＦ、特にＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を抑制するための、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又は抗原結合フラグメント、を提供する。

さらにもう１つの実施形態において、本発明は、
網膜の血行再建を改善するために、血管形成の方向を虚血性領域に向け直し（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）、
硝子体部位の病的血管新生を予防し、
Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される血液網膜関門の破綻（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）を予防し、
ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の破綻を予防するための、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又は抗原結合フラグメント、を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、網膜疾患又は眼疾患の治療用又は予防用のための、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。

もう１つの実施形態において、本発明は、１又は複数の網膜疾患又は眼疾患を治療するための方法に関し、前記方法は、治療が必要な患者に、医薬上の有効量の抗体又は抗原結合フラグメントを投与することを含む。

第４の態様において、本発明は、網膜症、未熟児網膜症や虚血性網膜症などの増殖性網膜症（ＰＲ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）及び非増殖性糖尿病性網膜症を含む糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性黄斑虚血（ＤＭＩ）、加齢黄斑変性、網膜色素変性、遺伝性網膜ジストロフィー、近視性変性、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、眼内炎、ぶどう膜炎、のう胞様黄斑浮腫、任意の網膜疾患に続く脈絡膜新生血管膜、視神経症、緑内障、網膜剥離、中毒性網膜症、放射線網膜症、外傷性網膜症、薬物誘発性網膜脈管障害、網膜血管新生、ポリープ状脈絡膜血管症、網膜血管炎、網膜毛細血管瘤、フックスジストロフィー、黄斑毛細血管拡張症、アッシャー症候群、並びにシュタルガルト病からなる群より選択される疾患の治療用又は予防用のための抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。

もう１つの実施形態において、本発明は、増殖性糖尿病性網膜症及び非増殖性糖尿病性網膜症を含む糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性黄斑虚血、加齢黄斑変性、網膜血管新生、緑内障、並びに脈絡膜血管新生からなる群より選択される疾患の治療用又は予防用のための抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。好ましいのは、前記疾患は、糖尿病性黄斑浮腫及び／又は糖尿病性黄斑虚血である。

好ましい実施形態において、本発明は、虚血性網膜内の血管再生（血行再建）を促進し、眼の硝子体部位の病的血管新生を減少させることによる、糖尿病性黄斑虚血の治療用の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。１つの実施形態において、本発明の抗体は、ＶＥＧＦによって誘発される血管形成、好ましくはＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血管形成を抑制しない。

もう１つの好ましい実施形態において、本発明は、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を減少し、好ましくは予防し、及びＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を減少し、好ましくは予防することによる、糖尿病性黄斑浮腫の治療用の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント、を提供する。

第５の態様において、本発明は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントと、医薬上許容される担体とを含む医薬組成物、を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント或いは抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供し、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、非経口経路、静脈内経路、硝子体内経路又は皮下経路の投与によって投与され、好ましくは硝子体内経路によって投与される。

第６の態様において、本発明は、
配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４若しくは配列番号：２５に示される重鎖をコードする配列、又は配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６若しくは配列番号：１７に示される重鎖可変領域をコードする配列と、
配列番号：１９に示される軽鎖をコードする配列又は配列番号：１１に示される軽鎖可変領域をコードする配列とを含む、１又は複数の単離されたポリヌクレオチド、を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４若しくは配列番号：２５に示される重鎖をコードする配列、又は配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６若しくは配列番号：１７に示される重鎖可変領域をコードする配列と、配列番号：１９に示される軽鎖をコードする配列又は配列番号：１１に示される軽鎖可変領域をコードする配列とを含む、１又は複数の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４若しくは配列番号：２５に示される重鎖をコードする配列、又は配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６若しくは配列番号：１７に示される重鎖可変領域をコードする配列と、配列番号：１９に示される軽鎖をコードする配列又は配列番号：１１に示される軽鎖可変領域をコードする配列とを含む、１又は複数の単離されたポリヌクレオチドを含むウイルスベクター、を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、発現ベクター或いは１又は複数の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、前記発現ベクター或いは１又は複数の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４若しくは配列番号：２５に示される重鎖をコードする配列、又は配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６若しくは配列番号：１７に示される重鎖可変領域をコードする配列と、配列番号：１９に示される軽鎖をコードする配列又は配列番号：１１に示される軽鎖可変領域をコードする配列とを含む。

１つの実施形態において、本発明は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを作製するための方法を提供し、前記方法は、発現ベクター或いは１又は複数の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を得ることと、前記宿主細胞を培養することとを含み、前記発現ベクター或いは１又は複数の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４若しくは配列番号：２５に示される重鎖をコードする配列、又は配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６若しくは配列番号：１７に示される重鎖可変領域をコードする配列と、配列番号：１９に示される軽鎖をコードする配列又は配列番号：１１に示される軽鎖可変領域をコードする配列とを含む。

１つの実施形態において、前記抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを作製するための方法は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを回収し、精製することをさらに含む。

ヒト眼におけるＳｅｍａ３Ａの局在 図１は、糖尿病性網膜症又は原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）の病歴を有するヒトドナーからの事前に決められた網膜サンプル中のヒト眼内のＳｅｍａ３Ａの局在と、年齢が一致したコントロール（年齢コントロール）及び糖尿病を有するが眼の症状のない患者（ＤＭコントロール）のヒト眼内のＳｅｍａ３Ａの局在との対比を示す。Ｓｅｍａ３Ａは、網膜血管の脈管壁（ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｗａｌｌ）に発見された。なお、不明であるが特徴的なＳｅｍａ３Ａ蛍光の対象が網膜神経節細胞層に観察された。 ＶＥＧＦを介した効果の抑制－ＢＮラット（Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙ Ｒａｔ）の網膜におけるＶＥＧＦ－Ａによる透過性の誘発の抑制 透過性の読み出しとして、網膜のエバンスブルー蛍光を用いて、血管漏出を評価する。ＶＥＧＦ－Ａの硝子体内注射により、網膜における透過性亢進を誘発する。Ｎｒｐ１のＡドメインに結合する本発明の抗体は、ＶＥＧＦトラップ（アフリベルセプト）と同様、ＶＥＧＦ－Ａ誘発性網膜透過性を抑制する。Ｎｒｐ１リガンドであるセマフォリン３Ａに対する抗体（Ｓｅｍａ３Ａ抗体）は網膜におけるＶＥＧＦ－Ａ誘発性透過性を抑制しない。 マウスＯＩＲモデルにおける先端細胞密度、無血管領域及び網膜前叢に対する、本発明の抗体及び抗ＶＥＧＦ治療の効果 マウスの子の酸素誘発性網膜症モデルにおいて、先端細胞密度、無血管領域及び網膜前血管新生（叢）を調べた。動物を、生後７日目（Ｐ７）から１２日目（Ｐ１２）まで７５％酸素に曝し、Ｐ１２に酸素正常状態に戻した後に抗体の単回の硝子体内注射を受けた。コントロール抗体は、トリニトロフェノールに対するものである。生後１７日目（Ｐ１７）、網膜フラットマウント（ｆｌａｔ ｍｏｕｎｔ）を作り、イソレクチンＢ４で染色して、先端細胞のカウント及び網膜の無血管領域のサイズの測定のために使用した。Ｎｒｐ１のＡドメインに結合する本発明の抗体は、先端細胞密度を増加させ、無血管領域を減少するのに対して、ＶＥＧＦトラップ（アフリベルセプト）はそうではない（図３Ａ、図３Ｃ）。先端細胞密度と無血管領域との間の相互関係を図３Ｂに示す。反対側の眼を眼杯の組織学的切片化のために使用し、網膜前細胞核をカウントした。網膜前血管新生は、本発明の抗体よりもアフリベルセプトによってより強く抑制された（図３Ｄ）。 本発明の抗体の、ＶＥＧＦ及びＮｒｐ１への結合 バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて、ビオチン化したヒト血管内皮増殖因子－１６５（ｈＶＥＧＦ１６５）の存在下での本発明の抗体のヒトＮｒｐ１（ｈＮｒｐ１）への結合を完了した。１０μｇ／ｍＬビオチンｈＮＦＡＭ１（又はバッファー）を用いて、ビオチン化したｈＶＥＧＦ１６５をストレプトアビジンセンサーチップの上に捕獲した（図４のポイントＡ）。センサーチップを洗浄した後、ｈＶＥＧＦ１６５で１００ｎＭのヒトＮｒｐ１を捕獲した（図４のポイントＢ）。最後に、センサーを本発明の抗体の種々の濃度（１００ｎＭ及び４００ｎＭ）に浸し、結合が認められたかについて観察した（図４のポイントＣ）。図４により、ｈＮｒｐ１がビオチン化したｈＶＥＧＦ１６５に結合したことを確認する。図４はさらに、この相互作用の後、同時にｈＶＥＧＦ１６５に結合している間でも、本発明の抗体が依然としてｈＮｒｐ１に結合し得ることを示す。これは、本発明の抗体がＶＥＧＦとヒトＮｒｐ１との結合を妨げないことを表わす。 ＶＥＧＦ－Ａ誘発性内皮細胞増殖 Ｉｎｃｕｃｙｔｅシステム（Sartorius）を用いて、ヒト網膜の微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）における内皮細胞増殖を調べた。この機能性アッセイでは、ＨＲＭＥＣのサブコンフルエント層への組換えＶＥＧＦ－Ａタンパク質の添加が、ＨＲＭＥＣの増殖を誘発する。本発明の抗体はＶＥＧＦ－Ａによって誘発される内皮細胞増殖を妨げないのに対し、ＶＥＧＦトラップ（アフリベルセプト、アイリーア（登録商標））は、ＶＥＧＦ－Ａ誘発性内皮細胞増殖において用量依存性の減少を示す。 ＶＥＧＦ－Ａ誘発性内皮ネットワーク形成アッセイ インビトロでの血管形成を内皮細胞／線維芽細胞の共培養におけるネットワーク形成アッセイにおいて評価した。この機能性アッセイでは、ＶＥＧＦ－Ａが線維芽細胞のコンフルエント層のトップに内皮ネットワーク形成を誘発する。本発明の例示的な抗体及びＶＥＧＦトラップ（ベバシズマブ、アバスチン（登録商標））の効能及び効力（ＩＣ５０）を評価して、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ－Ａネットワーク形成を阻止した。本発明の抗体は、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される内皮ネットワーク形成を妨げないのに対し、ＶＥＧＦトラップ（ベバシズマブ、アバスチン（登録商標））は、ＶＥＧＦ－Ａ誘発性ネットワーク形成において用量依存性の減少を示す。 眼のレーザー光凝固後のＢＮラットにおける脈絡膜血管新生の病変面積 動物は、１日目と８日目にＩｇＧコントロール抗体（１０９μｇ／眼）、本発明の抗体（低用量：５４.５ｍｇ／眼；高用量：１０９ｍｇ／眼）又はＶＥＧＦトラップアイリーア（登録商標）（２００μｇ／眼）の２回の硝子体内注射を受けた。１日目の初回の硝子体内注射の直前にレーザー光凝固を実施した。ＲＰＥ／脈絡膜／強膜フラットマウントのイソレクチンＢ４染色で、１５日目に病変面積を解析した。データは、平均値±ＳＥＭである。独立した両側ｔ検定で統計解析を行った（＊＊＊＊、ｐ＜０.０００１）。

定義
抗体や免疫グロブリンの一般的な構造は当業者に周知であり、これらの分子は、典型的には約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される。各軽鎖は、１つのジスルフィド結合によって重鎖に共有結合してヘテロ二量体を形成し、ヘテロ三量体分子は、ヘテロ二量体の２つの同一の重鎖間の共有結合性ジスルフィド結合を介して形成される。軽鎖と重鎖は、１つのジスルフィド結合によって互いに結合しているが、両重鎖間のジスルフィド結合数は、免疫グロブリンアイソタイプによって変わる。各重鎖及び各軽鎖はまた、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、アミノ末端に可変ドメイン（Ｖ_H＝可変重鎖）、続いて３つ又は４つの定常ドメイン（Ｃ_H1、Ｃ_H2、Ｃ_H3及びＣ_H4）、並びにＣ_H1とＣ_H2との間にヒンジ領域を有する。各軽鎖は、２つのドメイン、アミノ末端の可変ドメイン（Ｖ_L＝可変軽鎖）及びカルボキシ末端の定常ドメイン（Ｃ_L）を有する。Ｖ_Lドメインは、Ｖ_Hドメインと非共有結合的に関連するのに対し、Ｃ_Lドメインは、通常ジスルフィド結合を介してＣ_H1ドメインに共有結合している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に境界面を形成すると考えられている（Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663）。

可変ドメイン内のある種のドメインは、異なる抗体間で大幅に異なる（すなわち、「超可変（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）」である）。これらの超可変ドメインは、各特定の抗体の特異的な抗原決定基について、該抗体の結合及び特異性に直接関与する残基を含有する。軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方における超可変は、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変ループ（ＨＶＬ）として知られる３つのセグメントに集中している。ＣＤＲは、Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.における配列比較によって規定される一方で、ＨＶＬは、Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917に記載されるとおり、可変ドメインの三次元構造に基づいて構造的に規定される。これら２つの方法が、ＣＤＲの若干異なる同定をもたらす場合、構造的規定が好ましい。Ｋａｂａｔによる定義のとおり、ＣＤＲ－Ｌ１は軽鎖可変ドメイン中の約残基２４～３４に、ＣＤＲ－Ｌ２は約残基５０～５６に、ＣＤＲ－Ｌ３は約残基８９～９７に位置し；ＣＤＲ－Ｈ１は重鎖可変ドメイン中の約残基３１～３５に、ＣＤＲ－Ｈ２は約残基５０～６５に、ＣＤＲ－Ｈ３は約残基９５～１０２に位置する。したがって、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、所定の抗体について特異的な独特かつ機能的な特性を規定する。

各重鎖及び各軽鎖内の３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）により分けられ、ＦＲは、より可変性が近い傾向がある配列を含有する。ＦＲ及びＣＤＲは、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのアミノ末端からカルボキシ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順で配置されている。ＦＲの主にβシート立体配置により、各鎖内のＣＤＲを互いに極めて接近させるのみならず、他の鎖由来のＣＤＲに極めて接近する。全てのＣＤＲ残基が必ずしも抗原結合に直接関与するわけではないが、得られた立体構造は抗原結合部位に寄与する（Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669を参照）。

ＦＲ残基及びＩｇ定常ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、抗原結合に寄与し、及び／又は抗体エフェクター機能を仲介する。いくつかのＦＲ残基は、少なくとも３種の方法（エピトープに直接に非共有結合すること、１個以上のＣＤＲ残基と相互作用すること、及び重鎖と軽鎖との間の境界面を影響することによる）で、抗原結合に対して有意な効果を有すると考えられている。定常ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、様々なＩｇエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）への抗体の関与を仲介する。

脊椎動物の免疫グロブリンの軽鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるクラスであるカッパ（κ）及びラムダ（λ）の１つに割り当てられる。これに対し、哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖は、定常ドメインの配列に基づいて、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの１つに割り当てられる。ＩｇＧ及びＩｇＡはそれぞれ、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃、ＩｇＧ₄、ＩｇＡ₁、及びＩｇＡ₂に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれている。天然の免疫グロブリンクラスのサブユニット構造及び三次元的立体配置は周知である。

用語「抗体」、「抗Ｎｒｐ１Ａ抗体」、「ヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体」、及び「ヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体変異体」は、本明細書において最も広い意味で使用され、具体的にはモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメント（例えば、可変ドメイン、所望の生物学的活性（例えば、Ｎｒｐ１Ａへの結合）を表わす抗体の他の部分）を包含する。

用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に同種の抗体の集団の抗体を指す。すなわち、この集団の個々の抗体は、少量存在し得る自然に発生する突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基である「エピトープ」に対する高度に特異的な抗体である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、同一のエピトープに対する抗体の実質的に同種の集団を示すものであり、任意の具体的な方法による抗体産生を必要とするとは解釈されない。モノクローナル抗体は、当技術分野において知られている任意の技術又は方法論（例えば、ハイブリドーマ法（Kohler et al., 1975, Nature 256:495）、当技術分野において知られている組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）、Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628、及びMarks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597に記載される技術を用いたファージ抗体ライブラリーを用いて組換え的に産生されるモノクローナル抗体の単離方法が挙げられる）により、作製されることができると理解されるべきである。

キメラ抗体は、１つの種（例えば、マウスなどの非ヒト哺乳動物）由来の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、並びに別の種（例えば、ヒト）の抗体の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域からなり、第１の種（例えば、マウス）由来の抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を、第２の種（例えば、ヒト）由来の抗体の定常領域についてのＤＮＡ配列に連結させ、宿主を、連結させた配列を含有する発現ベクターで形質転換することにより、キメラ抗体の産生を可能にすることにより得ることができる。或いは、キメラ抗体はまた、重鎖及び／又は軽鎖の１個以上の領域又はドメインが、別の免疫グロブリンクラス若しくはアイソタイプ由来、又はコンセンサス配列若しくは生殖細胞系配列由来のモノクローナル抗体における対応する配列と同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）、相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、又は変異体であるものであってもよい。キメラ抗体は、その親抗体の所望の生物学的活性（例えば、同一のエピトープへの結合）を表わす抗体のフラグメントであれば、かかる抗体のフラグメントを含んでもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びMorrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855を参照）。

用語「抗体フラグメント」、「抗原結合フラグメント」、「抗Ｎｒｐ１Ａ抗体フラグメント」、「ヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体フラグメント」、「ヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体フラグメント変異体」は、全長抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の一部（可変領域又は機能性能力（例えば、特異的なＮｒｐ１エピトープ結合）が保持される）を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、直鎖状抗体、一本鎖抗体、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、抗体フラグメントから形成される二重特異性抗体、抗体フラグメントから形成される多特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

全長抗体は、パパインやペプシンなどの酵素で処理されて、有用な抗体フラグメントを生成することができる。パパイン消化は、それぞれ単一の抗原結合部位、を有する、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合抗体フラグメントと、残りの「Ｆｃ」フラグメントとを作製することに用いられる。Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖のＣ_H1ドメインとを含有する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、かつ、抗原を架橋結合できるＦ（ａｂ’）₂フラグメントを生じる。

Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆａｂフラグメントとは、Ｃ_H1ドメインのＣ末端に抗体ヒンジ領域由来の１個以上のシステインを含む追加残基の存在によって異なる。Ｆ（ａｂ’）₂抗体フラグメントは、ヒンジ領域においてシステイン残基によって結合されている一対のＦａｂ’フラグメントである。抗体フラグメントの他の化学的結合も知られている。

「Ｆｖ」フラグメントは、タイトな非共有結合性会合の、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの２量体からなる完全な抗原認識結合部位を含有する。この立体配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互作用して、抗原結合部位をＶ_H－Ｖ_L２量体の表面上に規定する。６つのＣＤＲは共同して抗原結合特異性を抗体に付与する。

「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶ_Hドメイン及びＶ_Lドメイン（ドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する）を含む一本鎖Ｆｖ変異体である。一本鎖Ｆｖは、抗原を認識し、結合することができる。ｓｃＦｖポリペプチドはまた、ｓｃＦｖによる抗原結合のための所望の三次元構造の形成を促進するために、Ｖ_HドメインとＶ_Lドメインとの間に置かれるポリペプチドリンカーを含有してもよい（例えば、Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315を参照）。

他の認識される抗体フラグメントとしては、一対の抗原結合領域を形成するための一対のタンデムＦｄセグメント（Ｖ_H－Ｃ_H1－Ｖ_H－Ｃ_H1）を含む抗体フラグメントが挙げられる。これらの「直鎖状抗体」は、例えば、Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062に記載されるとおり、二重特異性又は単一特異性であり得る。

「ヒト化抗体」又は「ヒト化抗体フラグメント」は、免疫グロブリンアミノ酸配列変異体を含むキメラ抗体又はそのフラグメントの特異的タイプであり、所定の抗原に結合可能であり、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有する１個以上のＦＲ、及び非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有する１個以上のＣＤＲを含む。しばしば「移入」配列と称されるこの非ヒトアミノ酸配列は、典型的には「移入」抗体ドメイン、具体的には可変ドメインから入手される。一般的には、ヒト化抗体は、ヒト重鎖可変ドメイン又はヒト軽鎖可変ドメインのＦＲの間に挿入された、非ヒト抗体の少なくともＣＤＲ又はＨＶＬを含む。

本発明により、ヒト生殖細胞系配列の重鎖可変ドメインのＦＲ及び軽鎖可変ドメインのＦＲの間に挿入されたマウス由来又はキメラ抗体由来のＣＤＲを含有する特定のヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体を説明する。ある種のマウスＦＲ残基がヒト化抗体の機能にとって重要であり得るため、ある種のヒト生殖細胞系配列の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの残基は、対応するマウス配列の残基と同じになるように修飾されると理解されるだろう。

本明細書において使用されるとおり、表現「本発明の抗体」及び「本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体」は、本明細書において記載されるＮｒｐ１に対する抗体又はその抗原結合フラグメント、好ましくはＮｒｐ１のＡドメインに対する抗体又はその抗原結合フラグメントを指す。好ましいのは、前記本発明の抗体が、配列番号：１（Ｈ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：２（Ｈ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：３（Ｈ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：４（Ｌ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：５（Ｌ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：６（Ｌ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

１つの実施形態において、本発明はヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体に関する。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂｃ、Ｆｖフラグメントなどにおいて含有される）、本明細書において、すべて又は実質的にすべてのＣＤＲは、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、特に本明細書において、ＣＤＲはマウス配列であり、ＦＲはヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列又は生殖細胞系配列のＦＲである。もう１つの態様において、ヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体はまた、免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃ領域の一部を含む。通常、抗体は、軽鎖も、重鎖の少なくとも可変ドメインも含有するだろう。抗体はまた、必要に応じて、重鎖の１個以上のＣ_H1、ヒンジ、Ｃ_H2、Ｃ_H3、及び／又はＣ_H4領域を含んでもよい。

ヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリン、並びにＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃、ＩｇＧ₄、ＩｇＡ₁、及びＩｇＡ₂を含む任意のアイソタイプから選択することができる。例えば、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞毒性活性を表することが望まれる場合、補体結合定常ドメイン（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆｉｘｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ）であり得、アイソタイプは典型的にはＩｇＧ₁である。かかる細胞毒性活性が望まれない場合、定常ドメインは別のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ₂）であってもよい。代わりのヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、複数の免疫グロブリンクラス又はアイソタイプ由来の配列を含むことができ、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当技術分野における通常の技術である。特定の実施形態において、本発明は、ＩｇＧ₁抗体、より具体的には、エフェクター機能が低下していることを特徴とするＩｇＧ₁抗体を提供する。

好ましい実施形態において、本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、ＩｇＧ１ＫＯのようにフォーマットされたヒト化抗体である。

ヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体のＦＲ、及びＣＤＲ又はＨＶＬは、親配列に正確に対応している必要はない。例えば、移入ＣＤＲ若しくはＨＶＬ、又はコンセンサスＦＲ配列若しくは生殖細胞系ＦＲ配列における１個以上の残基は、得られたアミノ酸残基がいずれかの親配列における対応する位置の元の残基ともはや同一ではないが、それにも関わらず抗体がＮｒｐ１に対する結合機能を保持するように、置換、挿入、又は欠失によって変更（例えば、突然変異）されてもよい。かかる変更は、典型的には広範囲ではなく、保存的変更であろう。通常、少なくとも７５％のヒト化抗体残基、より頻繁には少なくとも９０％のヒト化抗体残基、最も頻繁には９５％より多く、９８％より多く、又は９９％より多いヒト化抗体残基は、親のコンセンサスＦＲ又は生殖細胞系ＦＲ及び移入ＣＤＲ配列の残基に対応するだろう。

重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の境界面（「Ｖ_L－Ｖ_H境界面」）に影響する免疫グロブリン残基は、二本鎖の互いの近接性又は配向性に影響する残基である。鎖間の相互作用に関与し得るある種の残基としては、Ｖ_L残基３４、３６、３８、４４、４６、８７、８９、９１、９６、及び９８、並びにＶ_H残基３５、３７、３９、４５、４７、９１、９３、９５、１００、及び１０３が挙げられる（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)において示される番号付けシステムを利用している）。米国特許第６，４０７，２１３号にはまた、Ｖ_L残基４３及び８５、並びにＶ_H残基４３及び６０などの残基もこの相互作用に関与し得ることが議論されている。これらの残基はヒトＩｇＧについてのみ示されているが、前記残基は種を超えて適用可能である。鎖間の相互作用に関与すると合理的に予測される重要な抗体残基は、コンセンサス配列への置換のために選択される。

用語「コンセンサス配列」及び「コンセンサス抗体」は、任意の特定のクラス、アイソタイプ、又はサブユニット構造のすべての免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン可変ドメイン）における各位置で最も頻繁に生じるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を指す。コンセンサス配列は、特定の種や多くの種の免疫グロブリンに基づいてもよい。「コンセンサス」配列、構造、又は抗体は、ある種の実施形態において記載されるとおり、コンセンサスヒト配列を包含し、任意の特定のクラス、アイソタイプ、又はサブユニット構造のすべての免疫グロブリンにおける各位置で最も頻繁に生じるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を指すと理解される。したがって、コンセンサス配列は、１個以上の既知の免疫グロブリンにおいて存在するアミノ酸を各位置で有するアミノ酸配列を含有するが、任意の単一の免疫グロブリンのアミノ酸配列全体を正確に複製しなくてもよい。可変領域のコンセンサス配列は、いかなる天然に産生される抗体又は免疫グロブリン（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.）、及びその変異体から得られない。重鎖のコンセンサス配列のＦＲ及び軽鎖のコンセンサス配列のＦＲ、並びにそれらの変異体は、ヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の調製のための有用な配列を提供する。例えば、米国特許第６，０３７，４５４号及び第６，０５４，２９７号を参照されたい。

ヒト生殖細胞系配列は、ヒト集団において天然に見られる。それらの生殖細胞系遺伝子の組み合わせは、抗体の多様性を生み出す。抗体の軽鎖の生殖細胞系抗体配列は、保存されたヒト生殖細胞系カッパのｖ－遺伝子及びｊ－遺伝子、又はラムダのｖ－遺伝子及びｊ－遺伝子に由来する。同様に、重鎖配列は、重鎖配列は、生殖細胞系のｖ－遺伝子、ｄ－遺伝子、及びｊ－遺伝子に由来する（LeFranc, M-P, and LeFranc, G, “The Immunoglobulin Facts Book” Academic Press, 2001）。

「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定され、分離され、及び／又は回収されたものである。抗体の天然環境の混入成分は、抗体の診断又は治療の使用を妨げ得る物質であり、酵素、ホルモン、又は他のタンパク質性溶質若しくは非タンパク質性溶質であり得る。１つの態様において、抗体は、抗体重量の少なくとも９５％より高い単離物に精製されるであろう。

用語「抗体パフォーマンス」は、抗原の抗体認識又はインビボでの抗体の有効性に寄与するファクター／特性を指す。好ましい実施形態において、抗体パフォーマンスは、網膜細胞における細胞骨格崩壊を防ぐ抗体の能力を指す。抗体のアミノ酸配列における変更は、抗体特性（例えば、フォールディング）に影響を及ぼし得、物理的ファクター（例えば、抗体の抗原への結合の初速度（ｋ_a）、抗体の抗原からの解離定数（ｋ_d）、抗体の抗原に対する親和性定数（Ｋｄ）、抗体の立体構造、タンパク質安定性、及び抗体の半減期）に影響を及ぼし得る。

本明細書において使用されるとおり、２個以上の核酸又はポリペプチド配列という文脈における用語「同一」又は「％同一」は、最大の対応となるように比較及びアラインさせたとき、同一である２個以上の配列又はサブ配列、或いは特定のパーセンテージのヌクレオチド若しくはアミノ酸残基が同一である２個以上の配列又はサブ配列を指す。％同一を決定するために、最適な比較のために配列をアラインする（例えば、ギャップを第１のアミノ酸配列又は核酸配列の配列に導入することができる（第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適アラインメントのためである））。そして、対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置の同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有されている場合、前記位置で分子が同じである。両配列間の％同一は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一＝同一の位置の数／位置（例えば、重なる位置）の総数×１００）。いくつかの実施形態において、必要に応じて、ギャップを配列に導入した後、比較される両配列の長さは同じである（例えば、比較される配列を超えて延びた追加配列を除く）。例えば、可変領域配列を比較する場合、リーダー配列及び／又は定常ドメイン配列を考慮に入れない。両配列間の配列比較について、「対応する」ＣＤＲは、両配列における同じ位置でのＣＤＲ（例えば、各配列のＣＤＲ－Ｈ１）を指す。

両配列間の％同一又は％類似の決定は、数学的アルゴリズムを用いて、達成することができる。両配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの好ましい例としては、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムを、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のとおりに改変したものが挙げられるが、これに限定されない。かかるアルゴリズムはAltschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）で実施することができ、これにより興味のあるタンパク質をコードする核酸と相同なヌクレオチド配列を得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）で実施することができ、これにより興味のあるタンパク質と相同なアミノ酸配列を得る。比較の目的でギャップドアラインメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴを、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるように使用されることができる。或いは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の遠隔関係を検出する反復検索（ｉｔｅｒａｔｅｄ ｓｅａｒｃｈ）を実施することができる（同上）。ＢＬＡＳＴプログラム、ギャップドＢＬＡＳＴプログラム、及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用い得る。配列の比較に使用される数学的アルゴリズムのもう１つの好ましい例としては、Myers and Miller, CABIOS （1989）のアルゴリズムが挙げられるが、これに限定されない。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（２．０版）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を用い得る。配列解析用の追加のアルゴリズムは、当技術分野において知られており、Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5に記載されるＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8に記載されるＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡでは、ｋｔｕｐは、検索の感度及び速度を設定するコントロールオプションである。ｋｔｕｐ＝２である場合は、アラインさせた残基ペアを見ることによって、比較される両配列における類似する領域を見つけ出し、ｋｔｕｐ＝１である場合は、単一のアラインさせた残基を調べる。ｋｔｕｐは、タンパク質配列について２又は１に設定されてもよく、ＤＮＡ配列について１から６に設定されてもよい。ｋｔｕｐが明示されていない場合、デフォルトは、タンパク質について２であり、ＤＮＡについて６である。或いは、Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402に記載されるとおり、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを用いて、タンパク質配列アラインメントを実施してもよい。

本明細書において使用される表現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」は交換可能に使用されており、かかる名称のすべてはその子孫を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、継代数を問わず、初代対象細胞及びそれに由来する培養物を含む。

治療目的での用語「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、ヒト、家畜、及び動物園用、スポーツ用又はペット用の動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）が挙げられる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

本明細書において使用されるとおり、「疾患」又は「障害」は、本明細書に記載されたヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体による治療からベネフィットを受けるであろう任意の状態である。この状態は、慢性及び急性の障害、又は疾患、例えば問題になっている障害に哺乳動物をかかりやすくする病的状態を含む。

用語「硝子体内注射」は、当技術分野においてその通常の意味を有し、患者の硝子体の中への抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントの導入を指す。

用語「皮下投与」は、薬物容器からの比較的ゆっくりな持続型送達による、動物又はヒト患者の皮下、好ましくは皮膚と下部組織（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ）との間のポケット内への抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントの導入を指す。皮膚を掴むか又は皮膚を引き上げて、下部組織から離すことによって、ポケットを作り得る。

用語「皮下注入」は、時間をかける、薬物容器からの比較的ゆっくりな持続型送達による、動物又はヒト患者の皮下、好ましくは皮膚と下部組織との間のポケット内への薬物の導入を指し、前記時間は３０分以下、又は９０分以下が挙げられるが、これらに限定されない。注入は、動物又はヒト患者の皮下に移植された薬物送達ポンプの皮下移植によりなされてもよく、前記ポンプは、所定の時間（例えば、３０分、９０分）又は治療計画の長さを跨ぐ期間にわたって、所定の量の薬物を送達する。

用語「皮下ボーラス」は、動物又はヒト患者の皮膚の下への薬物投与を指し、ボーラス薬物送達は、約１５分未満であり、もう１つの態様においては５分未満であり、さらにもう１つの態様においては６０秒未満である。なお、さらにもう１つの態様において、投与は、皮膚と下部組織との間のポケット内であり、前記ポケットは、皮膚を掴むか又は皮膚を引き上げて、下部組織から離すことによって作られ得る。

用語「治療上の有効量」は、治療される障害の症状の１つ以上を軽減するか、或いは回復する抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントの量を指すために使用する。そうすることで、この量は、患者にとって有益な結果を有するものである。有効性は、治療されるべき状態に応じて、従来の方法で測定することができる。例えば、Ｎｒｐ１Ａを発現する細胞を特徴とする眼／網膜疾患又は障害において、有効性は、応答率（例えば、視力回復）を確認することによって、又は疾患進行までの遅延時間を評価することによって測定することができる。

用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」及び「治療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」等は、本明細書において使用されるとおり、臨床上望ましいか、又は有益なあらゆる効果を導く疾患又は障害のための治療的、及び予防的又は抑制的処置を含むことを意味し、前記臨床上望ましいか、又は有益な効果としては、１つ以上の症状の緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）又は軽減（ｒｅｌｉｅｆ）や、疾患又は障害の進行の退行、遅延又は停止が挙げられるが、これらに限定されない。したがつて、例えば、治療という用語は、疾患又は障害の症状の発症前又は発症後の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントの投与を含み、これによって、疾患又は障害の１つ以上の徴候を予防又は除去する。もう１つの例として、当該用語は、疾患の症状と闘うために、疾患の臨床的徴候後に抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することを含む。また、発症後、及び臨床的症状が現れた後の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントの投与（ここでの投与は、治療が疾患の回復を導くかどうかに関わらず、疾患又は障害の臨床的パラメーターに影響を与えることである）は、本明細書に使用された「治療」又は「治療法」を含む。さらに、本発明の組成物が単独で又は別の治療剤と組み合わせて、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体組成物又はその抗原結合フラグメントを使用しないときの症状と比較して、治療される障害の少なくとも１つの症状を緩和するか、或いは回復する限り、結果は、障害のすべての症状が緩和されるかどうかに関わらず、元の障害（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の効果的な治療と考えられるべきである。

用語「添付文書」は、治療用製品の市販のパッケージに習慣的に含まれる指示書を指すのに使用され、前記添付文書は、かかる治療用製品の使用に関する適応症、用法、投与、禁忌及び／又は注意についての情報を含む。

本発明の抗体
第１態様において、本発明は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。好ましくは、前記抗体は、ヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体であり、より好ましくは、ヒト化モノクローナル抗Ｎｒｐ１Ａ抗体である。
初期特徴化において、ファージライブラリーに由来するマウス抗体又はヒト抗体のＣＤＲを、ヒトのコンセンサス重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのＦＲに配置し、さらにＦＲを異なる変化で操作することにより、Ｎｒｐ１Ａ変異体を標的とする抗体のライブラリーを作成した。
これにより、本明細書に開示の様な強化された性質を有するＮｒｐ１Ａに対するヒト化抗体が得られた。本発明の抗体の配列を、以下の表１に示す。

１つの実施形態において、本発明は、
－配列番号：１（Ｈ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：２（Ｈ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：３（Ｈ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
－配列番号：４（Ｌ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：５（Ｌ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：６（Ｌ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

もう１つの実施形態において、本発明は、
－配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６又は配列番号：１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
－配列番号：１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

さらにもう１つの実施形態において、本発明は、
－配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６又は配列番号：１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
－配列番号：１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

好ましい実施形態において、本発明は、
ａ．配列番号：１０及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
ｂ．配列番号：１２及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
ｃ．配列番号：１３及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
ｄ．配列番号：１４及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
ｅ．配列番号：１５及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
ｆ．配列番号：１６及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、又は
ｇ．配列番号：１７及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

さらにもう１つの実施形態において、本発明は、
－配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４又は配列番号：２５のアミノ酸配列を含む重鎖、好ましくは配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４又は配列番号：２５のアミノ酸配列からなる重鎖、及び
－配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、好ましくは配列番号：１９のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

さらにもう１つの実施形態において、本発明は、
ａ．配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖（該抗体は、「クローンＩ」と呼ばれる）、
ｂ．配列番号：２０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖（該抗体は、「クローンＩＩ」と呼ばれる）、
ｃ．配列番号：２１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖（該抗体は、「クローンＩＩＩ」と呼ばれる）、
ｄ．配列番号：２２のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖（該抗体は、「クローンＩＶ」と呼ばれる）、
ｅ．配列番号：２３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖（該抗体は、「クローンＶ」と呼ばれる）、
ｆ．配列番号：２４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖（該抗体は、「クローンＶＩ」と呼ばれる）、又は
ｇ．配列番号：２５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む（該抗体は、「クローンＶＩＩ」と呼ばれる）を含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

ＩｇＧ１-ＫＯ変異体は、突然変異をＦｃ領域内に導入することで作られている。エフェクター機能を低下又は抑制する突然変異は、当業者によく知られており、かつ先行技術、例えば、Wang et al, Protein Cell 2018, 9(1):63-73、及びStewart et al. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2014, 2:29において完全に開示されている。典型的には、Ｆｃのエフェクター機能を低下させるために、ＩｇＧ１のＦｃ領域に導入される突然変異の非限定的リストは、
－Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、
－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＮ２９７Ｑ、
－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ、又は
－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ａを含み、
前記残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従い番号付けられる。
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、エフェクター機能を低下させるようＦｃ領域において、２つの突然変異（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ）を含む。

本明細書に開示される、配列番号：１～６に示されるＣＤＲは、ＣＣＧ（Almagro et al., Proteins 2011; 79:3050-3066、及びMaier et al, Proteins 2014; 82:1599-1610に説明のケミカルコンピューティンググループ）に従い、以下の表２に示される。

Ｋａｂａｔナンバリングに基づいて追加のナンバリングシステムを、以下の表３に要約する。

Ｃｈｏｔｈｉａに基づいて追加のナンバリングシステムを、以下の表４に示す。

したがって、特定の態様において、本発明は
－配列番号：１（Ｈ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：２（Ｈ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：３（Ｈ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号：４（Ｌ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：５（Ｌ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：６（Ｌ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
－配列番号：７（Ｈ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：２（Ｈ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：３（Ｈ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号：４（Ｌ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：５（Ｌ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：６（Ｌ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
－配列番号：８（Ｈ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：９（Ｈ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：３（Ｈ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号：４（Ｌ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：５（Ｌ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：６（Ｌ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。

本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、高い親和性でヒトＮｒｐ１Ａに結合する。この態様に関する実施形態において、本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、Ｋ_D＜５０ｎＭでヒトＮｒｐ１Ａに結合する。もう１つの実施形態において、実施例８に例示したように、本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、Ｋ_D＜１５ｎＭでヒトＮｒｐ１Ａに結合する。
本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、カニクイザルＮｒｐ１Ａ、マウスＮｒｐ１Ａ、ラットＮｒｐ１Ａ及びアレチネズミＮｒｐ１Ａにも結合する。
本発明の抗体の高い結合親和性は、硝子体内注射後のＮｒｐ１Ａの中和時間を延長することに寄与し、さらに注射頻度の減少を可能にする。より高い結合親和性はまた、より少ない用量の投与を可能にし、これにより、潜在的な副作用を制限する。改善した結合親和性と減少した注射頻度により、治療を必要とする患者の治療の有効性をかなり改善する。患者に対しても、貴重なベネフィット、特に改善された服薬オブザーバンス及び服薬コンプライアンスを提供する。

本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、１３０ｐＭ未満、好ましくは１１０ｐＭ未満、より好ましくは１００ｐＭ未満の機能的な効力で、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される網膜細胞における細胞骨格の崩壊を防ぐ。好ましい実施形態において、実施例４に例示したように、本発明の抗Ｎｒｐ１抗体は、９８ｐＭの機能的な効力で、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される網膜細胞における細胞骨格の崩壊を防ぐ。この結果は、本発明の抗体による、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される血管反発を抑制する有効性（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を説明している。

本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体はまた、４ｎＭ未満、好ましくは３ｎＭ未満、より好ましくは１ｎＭ未満の機能的な効力で、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を抑制する。好ましい実施形態において、実施例５に例示したように、本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、０.７４ｎＭの機能的な効力で、ＶＥＧＦによって誘発される網膜細胞完全性の喪失を防ぐ。この結果は、本発明の抗体による、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を抑制する有効性を説明している。

さらなる態様において、実施例９に記載したように、本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、免疫原性リスクが低いことが証明された。これは、抗体の免疫原性のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測に依存する。免疫原性リスクは、典型的には、様々な周知の方法、例えば、主要な免疫原性影響因子であるＴ細胞エピトープを予測するためのコンピュータアルゴリズムにより評価される。コンピューターのマトリックスアプローチに基づくアルゴリズム（ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（ＥｐｉＶａｘ製）の名称で入手可能）を用いることで、目的タンパク質に存在するＴ細胞エピトープを含有する配列を予測することができることが実際に報告されている。当業者は、Van Walle et al., Expert Opin Biol Ther. 2007 March; 7(3): 405-18 and Jawa and al., Clin Immunol. 2013 Dec;149(3):534-55を参照し得る。

本発明の抗体は、Ｓｅｍａ３を標的とすることに基づく治療アプローチとは異なる。実際、本発明の抗体は、ＶＥＧＦによって誘発される血液網膜関門の透過性、好ましくはＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を抑制するが、この効果は、Ｓｅｍａ３Ａを標的とする化合物では見られない。したがって、本発明の抗体に基づく抗Ｎｒｐ１Ａの治療アプローチは、以下の利点を有する：
－Ｓｅｍａ３Ａの血管反発作用を抑制すること、
－Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を抑制すること、及び
－ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を抑制すること。

本発明の抗体は、ＶＥＧＦ抑制に基づく治療アプローチとは異なる。実際には、本発明の抗体は、Ｓｅｍａ３ＡのＮｒｐ１への結合を抑制し、これにより、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される血管反発の抑制をもたらし、血行再建（特に、ＤＭＩを患う患者において）を改善する結果となっている。
なお、実施例５に説明したように、本発明者らは、ＶＥＧＦ誘発性－細胞完全性喪失アッセイにおいて、本発明の抗体の効力を、特にアバスチン（登録商標）、アイリーア（登録商標）及びルセンティス（登録商標）と比較した。アバスチン（登録商標）、アイリーア（登録商標）及びルセンティス（登録商標）は、すべてＶＥＧＦを標的とするものであるに対し、本発明の抗体は、Ｎｒｐ１のＡドメインを標的とするものである。注目すべきであるのは、ＶＥＧＦ誘発性－細胞完全性喪失アッセイにおける本発明の抗体の効力は、アバスチン（登録商標）及びアイリーア（登録商標）の効力に類似しており、ルセンティス（登録商標）の効力より良い。したがって、本発明者らは、
－Ｓｅｍａ３Ａによる血液網膜関門の透過性及び血管反発の誘発を抑制するよう、Ｎｒｐ１とＳｅｍａ３Ａの結合を妨げ、かつ、
－驚くべきことに、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性に影響する
抗体を開発した。

本発明者らは、本発明の抗体が、先行技術で述べたＮｒｐ１を標的とする他の抗体又はフラグメントと比べて、より一層有利な特性を示すことを説明し、本明細書において、実施例３に記載した。前記他の抗体は、Ｎｒｐ１上の異なるエピトープを標的とする。本発明者らは、本発明の抗体の特性を、
－Ｎｒｐ１のＡドメインに対する抗体（ＹＷ６４.３）、及び
－Ｎｒｐ１のＢドメインに対する抗体（ＹＷ１０７.４.８７）と比較した。
本発明者らは、本発明の抗体が、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される細胞骨格の崩壊アッセイにおいて有効である一方で、ＹＷ１０７.４.８７が有効ではないことを示した（実施例４）。かかる結果は、本発明の抗体は、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される血管反発を抑制し、これにより、血行再建（特に、ＤＭＩを患う患者において）に対する改善した特性をもたらすことを説明している。

本発明者らはまた、ＤＳＣにより評価されたように、本発明の抗体は、ＹＷ６４.３と比べて、改善された熱安定性を有することを示した（実施例１１）。かかる結果は、本発明の抗体が、生理的温度で、その天然かつ活性の立体配座のままであることを説明している。注目すべきであるのは、より高い熱転移中間点（Ｔ_m）は、タンパク質のより低い温度での改善した安定性を反映することである。したがって、本発明者らは、本発明の抗体が改善した熱安定性の特性を示し、該特性は、改善した治療上の有効性を示すことに寄与するとともに、患者に対する減少した注射量と注射頻度を可能にすることを示した。なお、Ｔ_mは、治療用製品である場合、より長い貯蔵寿命と改善した経時安定性を意味している。

ヒト化及びアミノ酸配列変異体
さらなる変異体抗Ｎｒｐ１Ａ抗体及び抗体フラグメントは、配列番号：１～６に示される配列で同定される一連のＣＤＲに基づいて操作され得る。理解すべきであるのは、前記変異体抗Ｎｒｐ１Ａ抗体及び抗体フラグメントにおいて、ＣＤＲのアミノ酸配列は不変であるが、周辺領域、例えば、ＦＲ領域は操作され得る。抗Ｎｒｐ１Ａ抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変更を抗Ｎｒｐ１Ａ抗体のＤＮＡ内に導入することにより、又はペプチド合成により、調製することができる。かかる変異体としては、例えば、本明細書における実施例の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は該残基への挿入、及び／又は該残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特徴を有する限り、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構築物に至るよう行う。アミノ酸の変更により、ヒト化又は変異体抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の翻訳後プロセスを変えること（例えば、グリコシル化部位の番号や位置を変えること）も可能である。
もう１つのタイプ抗体のアミノ酸変異体としては、抗体の元のグリコシル化パターンを変更することが挙げられる。この文脈における用語「変更する（ａｌｔｅｒｉｎｇ）」とは、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｍｏｉｅｔｙ）を除去すること、及び／又は以前に抗体において存在しなかった１つ以上のグリコシル化部位を加えることを意味する。

いくつかの態様において、本発明は、本明細書に記載の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子を含む。該抗Ｎｒｐ１Ａ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野において知られている様々な方法により調製される。かかる方法としては、天然ソース（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）からの単離、又は以前に調製した変異若しくは非変異バージョンの抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の、オリゴヌクレオチド媒介型（若しくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲによる突然変異誘発、及びカセット変異導入による調製が挙げられるが、これらに限定されない。

ある種の実施形態において、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントの作製についての手法が開発されている。フラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質消化によって得られることができる（例えば、Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117；及びBrennan et al., 1985, Science 229:81を参照されたい）。或いは、フラグメントは、組換え宿主細胞において、直接作製することができる。例えば、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接回収され、化学的に結合してＦ（ａｂ’）₂フラグメントを形成することができる（例えば、Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167を参照されたい）。別のアプローチにより、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントは、組換え宿主細胞の培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの作製についての別の手法は、当業者にとって明らかであろう。

抗Ｎｒｐ１Ａ抗体及びその抗原結合フラグメントは、改変を含んでもよい。
ある種の実施形態において、インタクトな抗体よりも、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体フラグメントを使用することが望ましいであろう。抗体フラグメントの血清半減期を長くするために、該抗体フラグメントを改変することが望ましいであろう。これは、例えば、サルベージ受容体結合エピトープを抗体フラグメントに組み込むことにより果たすことができる。１つの方法において、抗体フラグメントの適切な領域を変更することができ（例えば、突然変異）、或いはエピトープをペプチドタグに組み込むことができ、該ペプチドタグは、終期か又は中期で、抗体フラグメントと融合するものである（例えば、ＤＮＡ合成又はペプチド合成により）。例えば、ＷＯ９６/３２４７８を参照されたい。
別の実施形態において、本発明は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の共有結合的修飾を含む。共有結合的修飾としては、システイニル残基、ヒスチジル残基、リシニル残基及びアミノ末端残基、アルギニル残基、チロシル残基、カルボキシル側鎖（アスパルチル又はグルタミル）、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基、又はセリル残基、又はトレオニル残基の修飾が挙げられる。もう１つのタイプの共有結合的修飾としては、グリコシドを抗体に化学的又は酵素的に結合することが挙げられる。かかる修飾は、該当する場合、化学合成により、又は抗体の酵素的若しくは化学的切断により行ってもよい。別のタイプの抗体の共有結合的修飾は、抗体の標的とされるアミノ酸残基を、選択された側鎖又はアミノ末端若しくはカルボキシル末端残基と反応し得る有機誘導体化試薬と反応させることにより、分子に導入され得る。

抗体上の任意の炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に達成することができる。化学的な脱グリコシルは、Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52及びEdge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131に記載されている。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350に記載のような様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。
もう１つの有用な共有結合的修飾としては、米国特許第４,６４０,８３５号、米国特許第４,４９６,６８９号、米国特許第４,３０１,１４４号、米国特許第４,６７０,４１７号、米国特許第４,７９１,１９２号及び米国特許第４,１７９,３３７号の１つ以上に記載の方法により、抗体を非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレン）と結合させることを含む。

エピトープ結合
第２の態様において、本発明は、特定の「Ｎｒｐ１Ａエピトープ」を認識する抗体に関する。具体的には、本発明の抗体は、配列番号：２６に示されるヒトＮｒｐ１Ａエピトープに結合するものである。
１つの態様において、本発明は、配列番号：２６に示されるヒトＮｒｐ１Ａのアミノ酸領域６８-７７内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントである。
もう１つの態様において、本発明は、配列番号：２７に示される配列に結合するＮｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
配列番号：２６及び２７に示される配列を、以下の表５に示す。

本明細書において使用されるとおり、用語「Ｎｒｐ１Ａエピトープ」とは、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントに結合し得る分子（例えば、ペプチド）又は分子のフラグメントを指す。かかる用語はさらに、例えば、配列番号：１～３の重鎖ＣＤＲ及び配列番号：４～６の軽鎖ＣＤＲから選ばれる軽鎖ＣＤＲと重鎖ＣＤＲの組み合わせを有する、あらゆる本発明の抗体又は抗体フラグメントにより認識されるＮｒｐ１Ａ抗原決定基を含む。
Ｎｒｐ１Ａ抗原エピトープは、タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチドなどに含まれ得る。エピトープは、最も一般的なタンパク質、短いオリゴペプチド、オリゴペプチド模倣体（すなわち、Ｎｒｐ１抗原の抗体結合特性を模倣する有機化合物、又はこれらの組み合わせである。
本発明の抗体は、ヒトＮｒｐ１Ａの特有のエピトープに結合することが分かった。好ましくは、前記抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：２６に示される、ヒトＮｒｐ１Ａの細胞外ドメインのアミノ酸領域６８-７７内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する。
エピトープ結合の文脈において、「アミノ酸領域Ｘ－Ｙ内…に結合する」という表現は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列において特定されるアミノ酸領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくはすべてのアミノ酸残基に結合することを意味する。

もう１つの態様において、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：２７に示される、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％のアミノ酸配列に結合する。好ましくは、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：２７に示されるアミノ酸配列に結合する。

治療用途
第３の態様において、本発明は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントの、医薬品としての使用に関する。
上述したように、Ｓｅｍａ３Ａは、ＮＲＰ１の天然リガンドである。より正確には、Ｓｅｍａ３Ａは、Ｎｒｐ１のＡドメインに結合する。本発明者らは、セマフォリン３Ａが、虚血性／無血管網膜における低酸素性網膜神経節細胞により分泌され、血管反発のきっかけとして作用することを具体例により示した。本発明者らは、Ｓｅｍａ３Ａが、これらの細胞において細胞骨格の崩壊を誘発することにより、実際に虚血性領域から新生血管を追い払い、これにより網膜の血管再生を抑制し、病的網膜前血管新生を促進することを確認した。
Ｎｒｐ１、好ましくはＮｒｐ１のＡドメインを標的とすることにより、本発明の抗体は、Ｎｒｐ１とＳｅｍａ３Ａの結合を妨げる。本発明者らは、Ｎｒｐ１Ａ抗体を用いて血管反発作用を調節することで、先端細胞数が増加し、血管形成の方向を虚血性領域（例えば、糖尿病性黄斑虚血を患うヒトにおける病理学的に拡大した中心窩無血管域）に向け直すこと（実施例６）を示した。

Ｎｒｐ１のＡドメインとＳｅｍａ３Ａの結合を妨げることに加えて、本発明の抗体は、ＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ－Ａによって誘発される網膜透過性を抑制するという予想せぬ性質を示す。上述したように、ＶＥＧＦ－Ａは、Ｎｒｐ１のＢドメインの天然リガンドである。本発明の抗体は、Ｎｒｐ１のＡドメインを標的としているが、Ｎｒｐ１ＢとＶＥＧＦ－Ａの結合を特には標的としていない。しかしながら、本発明者らは、本発明の抗体が、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を抑制することを観察した。理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、Ｎｒｐ１のＡドメインに対する抗体、好ましくは本発明の抗体による、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される網膜関門の透過性の抑制が、Ｎｒｐ１、ＶＥＧＦ受容体２及び更なる共受容体からなるシグナルホロ受容体複合体による立体障害に起因するとの仮説を立てた。

ＶＥＧＦ－Ａは、中でも低酸素性アストロサイトにより分泌される。ＶＥＧＦ－Ａは、増殖性ＤＲ及び増殖性ＤＭＥの両方の進行における重要な因子であり、接着結合（例えば、ＶＥ－カドヘリン）や密着結合（例えば、オクルディン）を調節することにより、網膜毛細血管の透過性を変える。ＶＥＧＦ－Ａは、内皮細胞を刺激して、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を放出させることで、基底膜の分解をもたらし、細胞遊走を可能にする。
したがって、低酸素条件下でのＶＥＧＦ－Ａの分泌は、網膜透過性の一因になり、黄斑浮腫を悪化させる増悪因子である。加えて、本発明者らは、Ｓｅｍａ３ＡもＶＥＧＦ－Ａも、Ｎｒｐ１への結合により、血管透過性を促進して血管漏出を引き起こし、これにより黄斑浮腫の一因になることを示した。
本発明者らは、Ｎｒｐ１Ａを標的とする抗体を開発することで、この病的状態に対処し、
－網膜の血行再建を改善するために、血管形成の方向を虚血性領域に向け直し、
－硝子体部位の病的な血管新生を予防し、
－Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される血液網膜関門の破綻を予防し、及び
－ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の破綻を予防すること
に対して非常に有用であることを証明した。

したがって、２つの予想せぬ効果を組み合わせることにより、本発明の抗体は、
－典型的には、ＰＤＲ、特にＤＭＩを患う患者の網膜における、虚血性無血管領域の血行再建を改善し、
－典型的には、ＰＤＲ、特にＤＭＥを患う患者において、Ｓｅｍａ３Ａの分泌によって誘発される血管漏出を防ぎ、及び
－典型的には、ＰＤＲ、特にＤＭＥを患う患者において、ＶＥＧＦ－Ａの分泌によって誘発される血管漏出を防ぐこと
に対して非常に有益であることを証明した。
その結果、本発明は、網膜疾患又は眼疾患の治療用又は予防用の、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

注目すべきであるのは、実施例１２に示したように、本発明の抗体は、ＶＥＧＦとＮｒｐ１の結合を妨げない。本発明の抗体は、ＶＥＧＦによって誘発される血管形成に作用せずに（本発明の抗体は、ＶＥＧＦ－Ａ誘発性内皮細胞増殖を妨げないため）、ＶＥＧＦ－Ａ誘発性網膜透過性のみに影響を及ぼす。
本発明者らは、実施例１３に示したように、本発明の抗体が、内皮細胞増殖を妨げないことを実際に示した。本発明者らはまた、ＶＥＧＦ誘発性ネットワーク形成アッセイ（実施例１４）、及びレーザーによって誘発される脈絡膜血管新生（実施例１５）において、本発明の抗体が、ＶＥＧＦによって誘発される血管形成に作用しないことを示した。したがって、本発明者らは、本発明の抗体が、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血管形成を抑制しないことを確認した。

本発明の開示全体にわたって説明したように、本発明の抗体は、Ｓｅｍａ３Ａの血管反発作用を抑制するため、血管形成の方向を虚血性領域に向け直すことを可能にする。加えて、本発明の抗体は、Ｓｅｍａ３Ａ及びＶＥＧＦ－Ａの両方によって誘発される血液網膜関門の破綻を予防する。その、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性に対する抑制効果にかかわらず、驚くべきことに、本発明の抗体は、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血管形成に影響を及ぼさない。
加えて、本発明の抗体は、血行再建を阻止しない。そのため、虚血性領域の血管形成を妨害しないと思われる。したがって、本発明の抗体は、血行再建を促進しようとする臨床状況、例えば、虚血性無血管領域（典型的にはＰＤＲ、特にＤＭＩを患う患者の網膜における）の血行再建を改善する場合、極めて有用である。

第４の態様において、本発明は、網膜症、未熟児網膜症や虚血性網膜症などの増殖性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症や非増殖性糖尿病性網膜症を含む糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性黄斑虚血、加齢黄斑変性、網膜色素変性、遺伝性網膜ジストロフィー、近視性変性、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、眼内炎、ぶどう膜炎、のう胞様黄斑浮腫、任意の網膜疾患に続く脈絡膜新生血管膜、視神経症、緑内障、網膜剥離、中毒性網膜症、放射線網膜症、外傷性網膜症、薬物誘発性網膜脈管障害、網膜血管新生、ポリープ状脈絡膜血管症、網膜血管炎、網膜毛細血管瘤、フックスジストロフィー、黄斑毛細血管拡張症、アッシャー症候群、並びにシュタルガルト病からなる群より選択される疾患の治療用又は予防用の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、増殖性糖尿病性網膜症及び非増殖性糖尿病性網膜症を含む糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性黄斑虚血、加齢黄斑浮腫、網膜血管新生、並びに脈絡膜血管新生を治療又は予防することに特に有用である。
好ましい実施形態において、前記疾患は、糖尿病性黄斑虚血であり、本発明の抗体は、虚血性網膜内の血管再生（血行再建）を促進し、眼の硝子体部位の病的血管新生を予防する。

もう１つの好ましい実施形態において、前記疾患は、糖尿病性黄斑浮腫であり、本発明の抗体は、Ｓｅｍａ３Ａ及びＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を減少させる。
もう１つの好ましい実施形態において、本発明は、虚血性領域からの、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される血管退行（ｖａｓｏｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を抑制し、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を抑制し、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を抑制する、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

本明細書において使用されるとおり、表現「血液網膜関門の透過性の抑制（ＢＲＢ）」、「網膜透過性の抑制」、及び「血管透過性の抑制」は、交換可能に使用されており、血管漏出を引き起こす可能性のある血液網膜関門の破綻を意味する。前記血管漏出は、一方では、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発され得るが、他方では、ＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ－Ａによって誘発され得る。本発明者らは今回、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発されるＢＲＢの透過性を抑制し得るのみならず、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発されるＢＲＢの透過性を抑制することもできる抗体を開発した。そのため、本発明の抗体は、血液網膜関門の破綻を防ぎ、Ｓｅｍａ３Ａ及び／又はＶＥＧＦ－Ａによって誘発される網膜の細胞完全性の喪失を防ぐ。

好ましい態様において、本発明の抗体は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）及び／又は糖尿病性黄斑虚血（ＤＭＩ）の治療に有用である。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＤＭＥ及びＤＭＩを患う患者の治療に有用である。好ましくは、本発明の抗体は、１５％、２０％、２５％を超えた中心窩無血管域（ＦＡＺ）の拡大、より好ましくは３０％の中心窩無血管域（ＦＡＺ）の拡大により定義されるＤＭＩの治療に使用される。
本発明の抗体が、ＶＥＧＦ－Ａが虚血性網膜内の血管再生に及ぼす可能性のある血管形成促進（ｐｒｏ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）効果に影響せずに、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される網膜透過性を抑制するため、本発明は、ＤＭＩ及びＤＭＥの両方を患う患者にとって極めて有用であることが証明された。

第５の態様において、本発明は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントと、医薬上許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントは、あらゆる適切な手段（硝子体内、経口、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含む）により投与される。非経口注入としては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が挙げられる。加えて、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、パルスインフュージョン（特に、抗体用量の減少を伴う）により好適に投与される。１つの態様において、投薬は、短時間で投与するか又は長期投与することに一部依存するが、注射により、最も好ましくは静脈内注射又は皮下注射により与えられる。好ましくは、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、硝子体内注射を通じて眼内に投与される。

疾患の予防又は治療について、抗体の適切な投与量は、様々な要因（例えば、上記で定義したような治療しようとする疾患のタイプ、疾患の重症度と経過、抗体が予防又は治療のいずれの目的で投与されるか、以前の治療、患者の病歴と抗体に対する反応、及び主治医の裁量）によって決まるであろう。抗体は、１回で又は一連の治療にわたって患者に好適に投与される。
好ましい実施形態において、１回の注射で、適用できる本発明の抗体の用量範囲は通常、１ｍｇ／眼～１０ｍｇ／眼であり、好ましくは１.５ｍｇ／眼～５ｍｇ／眼であり、より好ましくは２ｍｇ／眼～３ｍｇ／眼であり、さらにより好ましくは約２.５ｍｇ／眼である。
用語「抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、本明細書において、「回復」及び「緩和」と同じ文脈で使用され、疾患の１つ以上の特徴を軽減、又は減少させることを意味する。

抗体組成物は、良好な医療行為と一致しているやり方で、調製され、投薬され、及び投与されるであろう。この文脈において検討する要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達の部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に知られている他の要因が挙げられる。投与しようとする抗体の「治療上の有効量」は、かかる検討によって決められ、本発明の抗体により対処される眼疾患又は網膜疾患を予防し、改善し、又は治療するのに必要な最少量である。
抗体は、必要ではないが、問題の障害の予防又は治療に一般的に使用されている１つ以上の薬剤と調剤してもよい。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の量、障害又は治療のタイプ、及び上記で検討した他の要因によって決められる。かかる他の薬剤は、一般的には、上記に使用される投与量と同じ量で、かつ上記に使用される投与経路で用いられるか、又は今まで使われている投与量の約１～９９％で用いられる。

治療方法
もう１つの態様において、本発明はまた、治療又は予防が必要な患者に、眼疾患又は眼部疾患を治療又は予防するためのあらゆる方法を包含し、前記方法は、本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の投与を含む。
好ましくは、本発明は、本発明の抗体を用いて、ＳｅｍａＡ３の血管抑圧（ｖａｓｏｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ）効果を抑制するための方法に関する。より好ましくは、本発明は、網膜の血行再建を改善するための前記方法に関する。

好ましくは、本発明は、眼疾患又は網膜疾患を治療又は予防するための方法に関し、該方法は、治療又は予防が必要な患者に、医薬上の有効量の本発明の抗体を投与することを含む。好ましくは、前記疾患は、網膜症、未熟児網膜症や虚血性網膜症などの増殖性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症及び非増殖性糖尿病性網膜症を含む糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性黄斑虚血、加齢黄斑変性、網膜色素変性、遺伝性網膜ジストロフィー、近視性変性、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、眼内炎、ぶどう膜炎、のう胞様黄斑浮腫、任意の網膜疾患に続く脈絡膜新生血管膜、視神経症、緑内障、網膜剥離、中毒性網膜症、放射線網膜症、外傷性網膜症、薬物誘発性網膜脈管障害、網膜血管新生、ポリープ状脈絡膜血管症、網膜血管炎、網膜毛細血管瘤、フックスジストロフィー、黄斑毛細血管拡張症、アッシャー症候群、並びにシュタルガルト病からなる群より選択される。より好ましくは、前記疾患は、増殖性糖尿病性網膜症及び非増殖性糖尿病性網膜症を含む糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性黄斑虚血、加齢黄斑浮腫、網膜血管新生、緑内障、並びに脈絡膜血管新生からなる群より選択される。さらに好ましく実施形態において、前記疾患は、糖尿病性黄斑浮腫及び／又は糖尿病性黄斑虚血である。
本明細書に記載した、すべての開示された技術的特徴は、前記治療方法に適用できる。

医薬組成物及びその投与
抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物は、眼疾患又は網膜疾患を有するか又は眼疾患又は網膜疾患のリスクを有する対象に投与することができる。本発明はさらに、Ｎｒｐ１Ａに関連する疾患の予防又は治療のための医薬品の製造における、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。本明細書において使用されるとおり、用語「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを投与し得るあらゆる哺乳類患者を意味し、例えば、ヒト又は非ヒト哺乳類（例えば、霊長類、齧歯類、及び犬）が挙げられる。本明細書に記載した方法を使用する治療を特に意図した対象としては、ヒトが挙げられる。抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントは、単独で投与するか、又は別の組成物と組み合わせて投与することができる。
様々な送達システムが知られており、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することに使用され得る。導入方法としては、硝子体内経路、点眼経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、注入、ボーラス又は注射により投与することができ、他の生物学的活性剤と一緒に投与することができる。投与は、全身又は局所的であってもよい。好ましい実施形態において、投与は、硝子体内注射による。このような注射用製剤は、例えば、予め充填された注射器（プレフィルドシリンジ）において調製することができる。

典型的な実施形態において、医薬組成物は、常法に従い、ヒトへの静脈内投与又は皮下投与に適した医薬組成物として調製される。典型的には、注射による投与用の組成物は、滅菌の等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、医薬組成物はまた、可溶化剤、及び注射部位の痛みを和らげる局所麻酔薬（例えば、リグノカイン）を含んでもよい。一般的には、これらの成分は、別々に与えられるか、又は混合して単位剤形で（例えば、活性剤の量を示す、アンプルやサシェなどの密封容器における乾燥凍結粉末や無水濃縮物として）与えられる。注入により医薬組成物を投与しようとする場合、該医薬組成物は、滅菌の医薬品グレードの水又は生理食塩水を含有する注入瓶で投薬され得る。注射により医薬組成物を投与する場合、成分を投与前に混合できるように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供し得る。
さらに、医薬組成物は、医薬キットとして提供され得、該キットは、（ａ）凍結乾燥した形態の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する容器と、（b）注射用の医薬上許容される希釈剤（例えば、滅菌水）を含有する第２容器とを含む。医薬上許容される希釈剤は、凍結乾燥した抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントの再構成又は希釈に使用され得る。かかる容器に、医薬品や生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制している政府機関が定めた形式の注意事項添付してもよく、該注意事項は、ヒト投与についての製造、使用又は販売の機関による承認を反映している。

眼疾患又は網膜疾患の治療又は予防に効く抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントの量は、標準的な臨床技術で決めることができる。加えて、インビトロアッセイは、場合によって、最適用量の範囲を確認するのを助けるために使用してもよい。製剤に使られる正確な用量はまた、投与経路や障害のステージによって決められ、医療従事者の判断及び患者ごとの状況に基づいて決定されるべきである。有効な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量－反応曲線から推定され得る。
例えば、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントの毒性と治療効果は、ＥＤ₅₀（集団の５０％において治療上有効な量）を決めるための標準的な薬学的手順により、細胞培養物又は実験動物において決めることができる。大きな治療指数を示す抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントが好ましい。

細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータを、ヒトに使用するための投与量の範囲を策定するのに用いることができる。抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントの投与量は、典型的には、毒性が殆どないか、又は無毒性のＥＤ₅₀を含む血中濃度（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）の範囲内にある。投与量は、使われる剤形と利用される投与経路によって、この範囲内で変動し得る。本発明の方法に用いられるあらゆる抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントについて、治療上の有効量は、初めに細胞培養物アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養で決められたＩＣ₅₀（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲を達成するよう、動物モデルで策定すれることができる。かかる情報を、ヒトにおける有用な用量をより正確に決めることに用いることができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーや、ＥＬＩＳＡなどにより測定することができる。

抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の硝子体内注射について、一般的にはより長い治療間隔が好ましい。本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、その改善した効力により、より長い間隔で投与することができる。
１つの実施形態において、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、６週間ごとに、好ましくは７週間ごとに、好ましくは８週間ごとに、好ましくは９週間ごとに、好ましくは１０週間ごとに、好ましくは１１週間ごとに、より好ましくは１２週間ごとに投与される。さらなる好ましい実施形態において、本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、３ケ月に１回で投与される。

眼に投与され得る量が厳しく制限されているため、本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体を高濃度で調製できることは非常に重要である。さらに、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の効力は特に重要であり、これは、強力な抗体がより低い用量であってもその効果を発揮し、それにより、活性のみならず、治療間隔も延長できるためである。
本発明の抗体は、非常に高濃度で調製することができ、該濃度としては、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、又は１００ｍｇ／ｍＬが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の抗体は、約５０ｍｇ／ｍＬの液体製剤に調製することができる。
患者に投与され得る典型的な投与量は、約２.５ｍｇ／眼である。かかる製剤に使用され得る典型的な緩衝液成分としては、例えば、酢酸ナトリウム、ＰＳ２０、及びトレハロース二水和物が挙げられる。
１つの実施形態において、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、１０ｍＭヒスチジン緩衝液、２４０ｍＭスクロース、０.０２ｗ/ｖ％ポリソルベート２０と共に調製され（ｐＨ５.５）、最終タンパク質濃度が６０ｍｇ／ｍＬとなる。

いくつかの実施形態において、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物は、結合剤と結合している治療薬又は結合していない治療薬をさらに含むことができる。
組み合わせ投与（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のための治療レジュメに関し、特定の実施形態において、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントは、治療薬と同時に投与される。もう１つの特定の実施形態において、治療薬は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントの投与前又は後の、少なくとも１時間から最大数ヶ月に投与される（例えば、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントの投与前の又はその後の少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１ヶ月又は３ヶ月）。

ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
第６の態様において、本発明は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド、ベクター、及び該ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、並びに抗体作製用の組換え手段を包含する。単離されたポリヌクレオチドは、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体のあらゆる所望の形態をコードすることができ、該形態として、例えば、全長モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）₂、及びＦｖフラグメント、二重特異性抗体、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、並びに抗体フラグメントから形成される多特異性抗体が挙げられる。
抗Ｎｒｐ１Ａ抗体、又はそのフラグメント若しくは鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドは、当技術分野において知られている、１つ以上の制御配列や調節配列と融合してもよく、当技術分野において知られている、適切な発現ベクターや宿主細胞に含まれてもよい。重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインをコードする各ポリヌクレオチド分子は、独立して定常ドメイン（例えば、ヒト定常ドメイン）をコードするポリヌクレオチド配列と融合してもよく、これによりインタクトな抗体の作製を可能にする。或いは、ポリヌクレオチド又はその一部は互いに融合してもよく、これにより一本鎖抗体作製のための鋳型を提供する。
組換え体の作製について、抗体をコードするポリヌクレオチドは、クローニング用（ＤＮＡの増幅）又は発現用の複製可能なベクター内に挿入される。組換え抗体を発現するための多くの適切なベクターが利用可能である。ベクターの構成要素としては、一般的には、以下の１つ以上：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。

抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、ポリペプチドの融合体として作製されてもよく、該抗体は、異種ポリペプチド（例えば、シグナル配列）、又は成熟タンパク質若しくはポリペプチドのアミノ末端で特異的な切断部位を有する他のポリペプチドと融合する。選ばれる異種シグナル配列は、典型的には、宿主細胞によって認識及びプロセシングされるものである（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断）。抗Ｎｒｐ１Ａ抗体のシグナル配列を認識もプロセシングもしない原核宿主細胞について、シグナル配列は、原核シグナル配列により置換されてもよい。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、リポタンパク質、熱安定性エンテロトキシンＩＩのリーダー等であってもよい。酵母分泌について、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼα因子（サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のα因子リーダーを含む）、酸性ホスファターゼ、カンジダ・アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ）のグルコアミラーゼから得られたリーダー配列、又はＷＯ９０/１３６４６に記載されたシグナルにより置換されてもよい。哺乳類細胞において、哺乳類シグナル配列及びウイルス分泌リーダー（例えば、単純ヘルペスのｇＤシグナル）が使用され得る。このような前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレームでヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体をコードするＤＮＡに連結する。

発現ベクター及びクローニングベクターは、１つ以上の選ばれた宿主細胞においてベクターを複製できるようにする核酸配列を含有する。一般的には、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターを宿主染色体ＤＮＡから独立して複製できるようにし、複製起点又は自律複製配列を含むものである。かかる配列は、様々な細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、２－υプラスミドの起点は、酵母に適しており、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｏｍａ）、アデノウイルス、ＶＳＶ、及びＢＰＶ）は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに適している。一般的には、複製起点成分は、哺乳類の発現ベクターにとって必要がない（ＳＶ４０起点は、典型的には、初期プロモーターを含有するという理由だけで使用され得る。）。
発現ベクター及びクローニングベクターは、発現の識別を容易にする、選択可能なマーカー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ）をコードする遺伝子を含有してもよい。典型的な選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質や他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、若しくはテトラサイクリンに対する耐性を与えるタンパク質、或いは栄養要求性欠損の補完タンパク質、又は他の選択肢において、複合培地に存在しない特定の栄養素を供給するタンパク質、をコードする遺伝子である（例えば、バシラスのＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。

選択スキームの一例は、薬剤を利用することで、宿主細胞の増殖を止めることである。異種遺伝子で形質転換に成功した細胞は、薬剤耐性を与えるタンパク質を産生するため、選択スキームから生き残る。かかる優性選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンという薬剤を使用する。哺乳類細胞用の一般的な選択可能なマーカーは、ヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体をコードする核酸を取り込む能力のある細胞の識別を可能にするものであり、例えば、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン－Ｉとメタロチオネイン－ＩＩ（例えば、霊長類のメタロチオネイン遺伝子）、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等である。ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞はまず、メトトレキサート（Ｍｔｘ、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬）を含有する培地においてすべての形質転換体を培養することにより識別される。野生型ＤＨＦＲを利用する場合、適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠いたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＤＧ４４）である。
或いは、抗Ｎｒｐ１抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及び他の選択可能なマーカー（例えば、アミノグリコシド３'－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ））をコードするＤＮＡ配列で形質転換又は同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、選択可能なマーカー用選択剤（例えば、アミノグリコシド系抗生物質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８）を含有する培地における細胞増殖により選択することができる。例えば、米国特許第４,９６５,１９９号を参照されたい。

宿主細胞としての酵母細胞において組換え体を作製する場合、酵母プラスミドＹＲｐ７（Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39）に存在するＴＲＰ１遺伝子を、選択可能なマーカーとして使用できる。ＴＲＰ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠いた酵母の突然変異株、例えば、ＡＴＣＣ受託番号４４０７６又はＰＥＰ４－１（Jones, 1977, Genetics 85:12）のための選択マーカーを提供する。酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷の存在は、続いてトリプトファン不存在下での増殖による形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。同様に、ＡＴＣＣ２０,６２２や３８,６２６などのＬｅｕ２ｐ欠損酵母株は、ＬＥＵ２遺伝子を有する既知のプラスミドにより補完される。
加えて、１.６μｍの環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クリベロマイセス酵母の形質転換に使用され得る。或いは、組換え子牛キモシンの大規模生産用の発現系は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓについて報告されている（Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135）。クリベロマイセスの工業用株による、成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌用の安定な多コピー発現ベクターも開示されている（Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975）。

発現ベクター及びクローニングベクターは通常、宿主生物により認識され、かつ抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はそのポリペプチド鎖をコードする核酸分子と作動可能に連結されるプロモーターを含有する。原核生物宿主との使用に適したプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β－ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。他の既知の細菌プロモーターも適している。細菌系で用いるプロモーターも、ヒト化抗Ｎｒｐ１Ａ抗体をコードするＤＮＡと作動可能に連結されるシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ-Ｄａｌｇａｍｏ、Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
多くの真核生物プロモーター配列が知られている。実質的には、すべての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５～３０塩基上流にあるＡＴリッチな領域を有する。多くの遺伝子の転写開始点から７０～８０塩基上流に見つかったもう１つの配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域である（Ｎは、いかなるヌクレオチドであってもよい）。ほとんどの真核生物遺伝子の３'末端には、ＡＡＴＡＡＡ配列があり、該配列は、コード配列の３'末端へのポリＡテール付加のためのシグナルであり得る。かかる配列はすべて、真核生物発現ベクター内に適切に挿入される。

酵母宿主と一緒に使用する適切なプロモーティング配列の例としては、３－ホスホグリセリン酸キナーゼや、他の解糖系酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３－ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼのためのプロモーターが挙げられる。
誘導性プロモーターは、増殖条件によって制御される転写の付加的利点を有する。誘導性プロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ（ｉｓｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ）、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連している誘導性酵素（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ）、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトースとガラクトースの利用を担う酵素のための酵母のプロモーター領域が挙げられる。酵母のエンハンサーも、酵母のプロモーターと一緒に有利に使用される。

哺乳類宿主細胞におけるベクターからの抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の転写は、例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びサルウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られたプロモーター、異種の哺乳類プロモーター（例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター）から得られたプロモーター、或いは熱ショックプロモーターから得られたプロモーターにより制御されるが、かかるプロモーターは、宿主細胞系と適合性があることが条件である。
ＳＶ４０ウイルスの初期と後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として便利に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として便利に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用する、哺乳類宿主におけるＤＮＡの発現系は、米国特許第４,４１９,４４６号に開示されている。この発現系の改変は、米国特許第４,６０１,９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下での、マウス細胞におけるヒトｐ－インターフェロンｃＤＮＡの発現を開示している、Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601も参照されたい。或いは、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復を、プロモーターとして使用できる。

組換え発現ベクターにおいて使用できるもう１つの有用なエレメントは、エンハンサー配列であり、高等真核生物による抗Ｎｒｐ１Ａ抗体をコードするＤＮＡの転写の増加に用いられる。哺乳類遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、及びインスリン）からの多くのエンハンサー配列が、現在、知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを用いている。例としては、複製起点の後期側（ｌａｔｅ ｓｉｄｅ）におけるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００-２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側におけるポリオーマウイルスエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンシングエレメントの記載について、Yaniv, 1982, Nature 297:17-18も参照されたい。エンハンサーは、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体をコードする配列に対して５’位又は３’位で、ベクターの中にスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置する。
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物からの有核細胞）に使用される発現ベクターはまた、転写の終止に必要な配列及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有することができる。かかる配列は、一般的には、真核生物又はウイルスのＤＮＡ若しくはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、及び場合により３’非翻訳領域から入手可能である。かかる領域は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終止の構成要素は、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域である。ＷＯ９４/１１０２６及びそれに開示した発現ベクターを参照されたい。いくつかの実施形態において、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、ＣＨＥＦ系を用いて発現することができる（例えば、米国特許第５,８８８,８０９号を参照されたい。その開示内容は参照として本明細書に含まれる。）。

本明細書において、ベクター中のＤＮＡをクローニング又は発現するための適切な宿主細胞は、上記で述べた原核生物、酵母、又は高等真核生物の細胞である。この目的のための適切な原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、大腸菌）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）などのセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）のみならず、枯草菌やリケニホルミス菌（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、例えば、１９８９年４月１２日に出版されたＤＤ２６６,７１０に開示したリケニホルミス菌４１ Ｐ）などのバシラス属、緑膿菌などのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１,５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７,３２５）などの別の株が適切であるが、１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ ３１,４４６）である。これらの例は例示であり、制限するものではない。

原核生物に加えて、糸状菌や酵母などの真核微生物は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主である。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は一般的なパン酵母は、低等真核微生物宿主の中で最も一般的に用いられるものである。しかしながら、多くの他の属、種及び菌株は、本明細書において、一般的には利用可能かつ有用であり、例えば、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）；クリベロマイセス宿主、例えば、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）(ＡＴＣＣ １２,４２４）、クリベロマイセス・ブルガリア（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）(ＡＴＣＣ １６,０４５）、クリベロマイセス・ウィケラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）(ＡＴＣＣ ２４,１７８）、クリベロマイセス・ワルチ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６,５００）、クリベロマイセス・ドロソフィラム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６,９０６）、クリベロマイセス・モトリーサラン（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びクリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウイア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２,２２６号）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｓ）（ＥＰ１８３,０７０号）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レエシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４,２３４号）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；及び糸状菌、例えば、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、並びにアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ．）が挙げられる。

グリコシル化した抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎生物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられ、該昆虫細胞は、例えば、多数のバキュロウイルスの細胞株や変異株、及び類似する許容される昆虫宿主細胞が挙げられ、該昆虫宿主細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、ミバエ）、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、カイコ）などの宿主からのものである。形質移入用の様々なウイルス株は、公的に入手可能であり（例えば、オートグラファ・カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ-１変異株、カイコガＮＰＶのＢｍ－５株）、かかるウイルスは、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質移入に使用できる。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア（ｐｅｔｕｎｉａ）、トマト、及びタバコの植物細胞培養物も、宿主として利用し得る。
本発明の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体はまた、ウイルスベクターに組み込まれることができる。すなわち、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクター内に導入され、ウイルスによる感染後に患者の体内で発現される。

もう１つの態様において、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の発現を、脊椎動物細胞において実行する。培養物（組織培養物）における脊椎動物細胞の増殖は常法になっており、技術は広く利用できる。有用な哺乳類宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚性腎細胞株（２９３細胞、又は懸濁培養物における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞（Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59））、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ１（ＣＨＯ、Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216；例えば、ＤＧ４４）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251）、サル腎細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ-７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ）肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳ガン細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲ１細胞（Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝がん細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。

宿主細胞は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の作製用の、上述した発現ベクター又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選別、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜改変された従来の栄養培地において培養される。
本明細書に記載した抗Ｎｒｐ１Ａ抗体の作製に使用する宿主細胞は、様々な培地において培養し得る。市販で入手可能な培地、例えば、ハムＦ１０（Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０、Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.）、最少必須培地（（ＭＥＭ）,（Sigma-Aldrich Co.）、ＲＰＭＩ－１６４０（Sigma-Aldrich Co.）、及びダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Sigma-Aldrich Co.）は、宿主細胞の培養に適している。加えて、Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44、Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255、米国特許第４，７６７，７０４号、米国特許第４，６５７，８６６号、米国特許第４，９２７，７６２号、米国特許第４，５６０，６５５号、米国特許第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／１０３４３０、及びＷＯ８７／００１９５の１つ以上に記載されたいずれかの培地を、宿主細胞の培養培地として使用し得る。あらゆるこれらの培地は、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、若しくは上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンやチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）、微量元素（マイクロモル濃度の範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義）、及びグルコース又は同等のエネルギー源を補充してもよい。他のサプリメントはまた、当業者に知られているであろう適切な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、発現のために選ばれた宿主細胞に以前使用した培養条件であり、当業者にとって明らかであろう。

組換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内や細胞膜周辺腔において作製し、又は培地に直接分泌することができる。抗体が細胞内で作製される場合、最初のステップとして、細胞を破壊することで、タンパク質を放出させることができる。微粒子状破片（宿主細胞も溶解されたフラグメントも）は、例えば、遠心分離や限外ろ過により取り除くことができる。Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167には、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌され抗体を単離するための手順が記載されている。簡潔に説明すると、酢酸ナトリウム（ｐＨ３.５）、ＥＤＴＡ及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、細胞ペーストを約３０分間かけて解凍する。細胞破片は、遠心分離により取り除くことができる。抗体が培地内に分泌される場合、一般的には、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター（例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）又はミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外ろ過ユニット）を用いて、かかる発現系からの上清をまず濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害薬を、タンパク質分解を抑制するために、前述のいずれかのステップに含ませてもよく、抗生物質を、外来の汚染物の増殖を防ぐために含ませてもよい。宿主細胞から抗体を単離するのに様々な方法を使用することができる。

細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて、精製することができる（アフィニティークロマトグラフィーを用いることが、典型的な精製手法である）。アフィニティリガンドとしてのタンパク質Ａの適合性は、抗体に存在するあらゆる免疫グロブリンのＦｃドメインの種とアイソタイプに依存する。タンパク質Ａは、ヒトγ１重鎖、ヒトγ２重鎖又はヒトγ４重鎖をベースとする抗体の精製に用いることができる（例えば、Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13を参照されたい）。タンパク質Ｇは、すべてのマウスアイソタイプとヒトγ３に対して推奨される（例えば、Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575を参照されたい）。アフィニティリガンドが接着するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス（例えば、コントロールドポアグラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）や、ポリ（スチレン－ジビニル）ベンゼン）は、アガロースで達成できる流量及び処理時間と比べて、より速い流量及びより短い処理時間を可能にする。抗体がＣ_H3ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.）は、精製に有用である。タンパク質精製用の他の手法、例えば、イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標））によるクロマトグラフィー、アニオン交換樹脂又はカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収しようとする抗体によって利用可能である。

あらゆる予備精製ステップの後、目的抗体と夾雑物とを含む混合物を、典型的には低い塩濃度（例えば、約０～０.２５Ｍの塩から）で実施される、約ｐＨ２.５～４.５間の溶出緩衝液を用いる低ｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。

本発明はまた、本明細書に規定した低ストリンジェンシー条件、中ストリンジェンシー条件及び高ストリンジェンシー条件下で、抗Ｎｒｐ１Ａ又は抗体フラグメントをコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド配列で示される、ヌクレオチド配列の全体又は一部（例えば、可変領域をコードする一部）にハイブリダイズする核酸を含む。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分の長さは、典型的には、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０又は５０）ヌクレオチドである。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は、抗Ｎｒｐ１Ａポリペプチド（例えば、重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域）をコードする核酸の全体若しくは一部の配列又はその相補的配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一である。本明細書に記載したタイプのハイブリダイズする核酸は、例えば、クローニング用プローブ、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）又は診断用プローブとして使用することができる。

１つの実施形態において、本発明は、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４若しくは配列番号：２５に示される重鎖をコードする配列、又は配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６若しくは配列番号：１７に示される重鎖可変領域をコードする配列と、配列番号：１９に示される軽鎖をコードする配列又は配列番号：１１に示される軽鎖可変領域をコードする配列とを含む、１又は複数の単離されたポリヌクレオチドに関する。
理解すべきであるのは、前記抗Ｎｒｐ１Ａ抗体及び抗体フラグメントにおいて、ＣＤＲをコードするための核酸配列は不変であるが（コードするアミノ酸に関しては不変であり、コドンの縮重によるＤＮＡ配列の同等物が可能である）、周辺領域、例えば、ＦＲ領域は操作され得ることである。

製品
もう１つの態様において、上記で述べた障害の治療に有用な材料を含有する製品を含む。製品は、容器とラベルとを含む。好適な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管が挙げられる。容器は、様々な材料、例えば、ガラスやプラスチックから形成され得る。容器は、状態の治療に有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい。例えば、容器は、皮下注射針によって突き刺すことが可能である静脈内用の溶液バッグ又は栓を有するバイアルであってもよい。組成物中の活性剤は、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントである。容器上のラベル又は容器と一緒のラベルは、組成物が、選ばれた状態の治療に用いるものであることを表示する。製品は、医薬上許容される緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液や、ブドウ糖（ｄｅｘｔｒｏｓｅ）溶液を含む第２容器をさらに含むことができる。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を有する添付文書を含む、商業上及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
以下の実施例において本発明をさらに説明するが、該実施例は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１：ＤＭＥ及びＰＤＲ患者の硝子体におけるＳｅｍａ３Ａの発現上昇
糖尿病性網膜症の病歴を有するヒトドナーからのサンプルの網膜におけるＳｅｍａ３Ａの発現を、免疫組織化学により調べた。免疫染色のプロトコールは、以下のとおりである：
１．スライドを解凍し、サンプルを室温（ＲＴ）で３０分間風乾させること、
２．パップペンボックス（ｐａｐ ｐｅｎ ｂｏｘ）を描いて、乾燥させること、
３．ＲＴで、１％ＳＤＳにおける抗原賦活化（５分間）、
４．ＰＢＳで、スライドを３回洗浄（５分間）
５．ＲＴで、１％ＢＳＡ／０．３％トリトンＸ１００／ＰＢＳ溶液（ブロッキング溶液）において、切片を３０分間ブロックすること、
６．ブロッキング溶液で、ウサギ-抗Ｓｅｍａ３a（abcam,ａｂ２３３９３）一次抗体を１:２００で希釈し、ＲＴで切片をスライド上で一晩インキュベートすること、
７．ＰＢＳで、スライドを３回すすぐこと（５分間）、
８．ＤＡＰＩ／０．３％トリトンＸ１００／ＰＢＳ溶液で１:４００に希釈したロバ抗－ウサギＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５４６（invitrogen,Ａ１００４０）との二次抗体インキュベーションを行い、ＲＴで切片をスライド上で３時間インキュベートすること、
９．ＰＢＳで、スライドを３～５回すすぐこと（５分間）、
１０．水性封入剤（Ａｑｕａｍｏｕｎｔ）で切片をカバースリップをし、風乾させること、
１１．４０倍の倍率で、切片を画像化し、強度をランク付けすること。

各ヒトドナーあたり３つの切片のセットをＳｅｍａ３Ａに対して免疫染色した。５ポイントグレード制のスキーム（０＝検出なし、１＝低い強度、僅かなスポット、２＝中程度の強度、いくつかのスポット、３＝明るい強度、広範な染色、及び４＝非常に明るい強度、多数の検出）を用いて、この特定の作業のために事前に訓練された観察者により、各領域におけるＳｅｍａ３Ａ標識を別々に評価した。観察者は、眼のドナーの健康状態を知らなかった。網膜内では、Ｓｅｍａ３Ａは、網膜血管の脈管壁と関連していた。眼病変のない糖尿病患者と比べて、糖尿病性黄斑浮腫を有する患者において、網膜血管系及び網膜の実質組織におけるＳｅｍａ３Ａの発現が増加した（図１）。

実施例２：ＶＥＧＦによって誘発される透過性の抑制
ＢＮラットの網膜において、透過性を測定した。組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ（２５０ｎｇ／２．５μＬ）を硝子体内注射し、透過性亢進を誘発した。抗体をＶＥＧＦと同時に注射した。ＶＥＧＦ治療の２４時間後に、エバンスブルー染料（４５ｍｇ／ｍＬ）を正中尾静脈（ｖｅｎａ ｃａｕｄａｌｉｓ ｍｅｄｉａｎａ）内に静脈内注射した（１ｍＬ／ｋｇ）。３０分後に眼を摘出し、ホルマリンに固定した。網膜フラットマウントを作り、共焦点蛍光顕微鏡と画像解析ソフトウェアを用いて、エバンスブルー蛍光を６２０ｎｍで測定した。

結果を図２に示す。本発明の抗体は、ＶＥＧＦによって誘発される透過性を完全に抑制した。これは、ＶＥＧＦトラップであるアフリベルセプト（アイリーア（登録商標））で観察された結果に類似している。Ｎｒｐ１リガンドであるセマフォリン３Ａに対する抗体は、網膜においてＶＥＧＦ－Ａ誘発性透過性を抑制しない。これにより、Ｎｒｐ１のＡドメインに対する本発明の抗体が、ＶＥＧＦ－Ａを介した効果を抑制すること、及びこの能力が、本発明の抗体をＮｒｐ１リガンドであるセマフォリン３Ａに対する抗体と区別することを確認した。本発明者らは、Ｓｅｍａ３Ａに対する抗体が、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される透過性を完全に抑制したものの、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される透過性を抑制しないことを示した。本発明者らは、Ｎｒｐ１のＡドメインに対する抗体による、ＶＥＧＦ－Ａ誘発性網膜透過性の抑制が、Ｎｒｐ１、ＶＥＧＦ受容体２及び更なる共受容体からなるシグナルホロ受容体複合体による立体障害に起因するとの仮説を立てた。

実施例３:比較の目的のための、Ｎｒｐ１Ａに対する抗体及びＮｒｐ１Ｂに対する抗体の作製
比較の目的のため、本発明者らは、Ｎｐｒ１Ａ及びＮｒｐ１Ｂのそれぞれに対する抗体をＷＯ２００８１４３６６６及びＷＯ２００７０５６４７０に開示したように開発した。かかる抗体は、
－「ＹＷ６４．３」と呼ばれる、Ｎｒｐ１Ａに対する抗体；及び
－「ＹＷ１０７．４．８７」と呼ばれる、Ｎｒｐ１Ｂに対する抗体、を含む。
抗Ｎｒｐ１Ａ抗体は、ＷＯ２００７０５６４７０に、クローン「ＹＷ６４．３」として開示されており、以下の特徴を有している：
－重鎖可変ドメインは、ＷＯ２００７０５６４７０における番号４の配列であること、及び
－軽鎖可変ドメインは、ＷＯ２００７０５６４７０における番号３の配列であること。
抗Ｎｒｐ１Ｂ抗体は、ＷＯ２００７０５６４７０に、クローン「ＹＷ１０７．４．８７」として開示されており、以下の特徴を有している：
－重鎖は、ＷＯ２００７０５６４７０における番号６の配列であること、及び
－軽鎖は、ＷＯ２００７０５６４７０における番号５の配列であること。
ＹＷ６４．３とＹＷ１０７．４．８７の配列は、以下の表６に以下のように要約される。

実施例４：Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される細胞骨格の崩壊アッセイ－Ｓｅｍａ３Ａによって誘発されるインピーダンスの低下における本発明の抗体の効力、並びに本発明の抗体と、クローンＹＷ６４．３及びクローンＹＷ１０７．４．８７との比較
ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム（リアルタイム細胞解析装置（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、ACEA Biosciences製）を用いるヒト網膜の微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）における細胞骨格の崩壊の測定により、Ｎｒｐ１抗体の細胞活性を評価した。該システムは、細胞のインピーダンスにより、細胞接着、コンフルエンス及び完全性を測定する。ＨＲＭＥＣは、クラス３セマフォリンホロ受容体の構成要素である、ニューロピリン－１（Ｎｒｐ１）及びプレキシンを内因的に発現する。この受容体複合体への結合により、セマフォリンは、内皮におけるＦ－アクチン繊維の崩壊を誘発する。この機能性アッセイでは、ヒト網膜の微小血管内皮細胞のコンフルエント層へ組換えＳｅｍａ３Ａタンパク質を添加すると、細胞骨格の崩壊とその後の細胞の収縮（細胞のインピーダンスの低下として測定）により、細胞のインピーダンスが低下した。

簡潔に説明すると、接着因子でＥ－プレートをコートした。細胞を２００００細胞／ウェルの密度で播種し、ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ装置の内部で一晩、細胞の正常な増殖条件の下で、単層に増殖させた。３ｍＭ ＣａＣｌ₂の存在下で、Ｎｒｐ１抗体の組み合わせと併用したＳｅｍａ３Ａ、及びＮｒｐ１抗体の組み合わせと併用しないＳｅｍａ３Ａを添加した。細胞指数を物質の添加前の時点に正規化した。刺激の５時間後に計算を行った。
細胞骨格の崩壊アッセイにおいて、例示的な本発明の抗体（ＶＨとして配列番号：１０に示される配列と、ＶＬとして配列番号：１１に示される配列とを有するクローンＩ）、クローンＹＷ６４．３、クローンＹＷ１０７．４．８７、及びＳｅｍａ３Ａに対する抗体の間での機能的な効力及び比較を決定するために、ＩＣ₅₀シフト実験として、Ｓｅｍａ３Ａ濃度反応曲線を抗体の濃度増加と組み合わせた。ギャダム－シルト（Ｇａｄｄｕｍ Ｓｃｈｉｌｄ）プロットを行い、ｐＡ₂値（抗体濃度の負の対数は、因子２によるＳｅｍａ３Ａ濃度反応曲線をシフトする必要があった）を算出した。Ｍでの効力をｐＡ₂値（効力（１０；－Ｘ）として）から算出し、以下の表７に開示する。

実施例５：ＶＥＧＦによって誘発される細胞完全性喪失アッセイ－ＶＥＧＦ－Ａによって誘発されるインピーダンスの低下における本発明の抗体の効力、並びに本発明の抗体と、クローンＹＷ６４．３、クローンＹＷ１０７．４．８７及びＶＥＧＦトラップとの比較
ＶＥＧＦ－Ａは、細胞－細胞接触の弛緩を誘発し、該弛緩は、内皮細胞における一時的なインピーダンスの低下として測定され得る。本発明の抗体は、機能的なＶＥＧＦ－Ａによって誘発されるインピーダンスの低下を防ぐ。ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム（リアルタイム細胞解析装置、ACEA Biosciences製）を用いるヒト網膜の微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）におけるインピーダンスの低下の測定により、ＶＥＧＦによって誘発される細胞完全性喪失を防ぐＮｒｐ１抗体の細胞活性を評価した。ＨＲＭＥＣは、ＶＥＧＦホロ受容体の構成要素であるニューロピリン－１（Ｎｒｐ１）及びＶＥＧＦＲ２を内因的に発現する。ＶＥＧＦ－Ａは、内皮細胞間の細胞結合の弛緩を誘発する。この機能性アッセイでは、ヒト網膜の微小血管内皮細胞のコンフルエント層へ組換えＶＥＧＦ－Ａタンパク質を添加すると、細胞完全性の喪失により、細胞のインピーダンスが低下した。

簡潔に説明すると、接着因子でＥ－プレートをコートした。細胞を２００００細胞／ウェルの密度で播種し、ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ装置の内部で一晩、細胞の正常な増殖条件の下で、単層に増殖させた。ＶＥＧＦ－Ａと抗体の添加前に、培地を、０．５％ＢＳＡを含有する無血清培地に変えた（３時間）。細胞指数を物質の添加前の時点に正規化した。ＶＥＧＦによって誘発される最小インピーダンス（刺激の後約３０分）で計算を行った。
機能的な効力を決定するために、組換えヒトＶＥＧＦ－Ａの固定される濃度によって誘発される細胞完全性喪失を防ぐ抗体のＥＣ５０を測定した。個々の実験のＥＣ５０値の幾何平均値を算出した。例示的な本発明の抗体（ＶＨとして配列番号：１０に示される配列と、ＶＬとして配列番号：１１に示される配列とを有するクローンＩ）と、いくつかの比較分子について、結果を以下の表８に要約する。

実施例６：マウスＯＩＲモデルにおける先端細胞密度、無血管領域及び網膜前叢に対する抗ＶＥＧＦ治療及び抗Ｎｒｐ１Ａの効果
酸素誘発性網膜症（ＯＩＲ）のマウスモデルにおいて、虚血性無血管領域の血行再建に対する、例示的な本発明の抗体（ＶＨとして配列番号：１０に示される配列と、ＶＬとして配列番号：１１に示される配列とを有するクローンＩ）の効果を調べた。同腹仔のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを生後７日目から生後１２日目まで７５％酸素の環境に曝した。これにより、網膜中心における血管退行及び無血管領域の形成を引き起こした。正常酸素圧状態に戻した後、この領域は、虚血性となった。マウスの子（ｐｕｐ）に、生後１２日目に、イソフルランによる麻酔下で、各眼に０．５μＬ溶液中１０μｇ抗体の１回硝子体内注射を受けさせた。生後１７日目、動物を犠牲にし、眼を摘出した。眼をホルマリンに固定し、網膜フラットマウントを作り、そこで網膜血管をイソレクチンＢ４で染色した。網膜全体の無血管の前部（網膜の血管新生した周辺領域と無血管の中心領域の間の境界）にある先端細胞（新しい血管の形成を開始する特化した内皮細胞）の数をカウントした。糸状仮足の伸展を示す先端細胞に特有の形態により、該細胞を識別した。解析のため、先端細胞の数を無血管の前部の長さに正規化した。共焦点顕微鏡と画像解析ソフトウェアを用いて、無血管領域のサイズを測定した。反対側の眼を眼杯の組織学的切片化のために使用し、網膜前細胞核をカウントした。

本発明の抗体は、マウスＯＩＲモデルにおける先端細胞密度を増加させた（図３Ａ）。さらに、本発明の抗体は、無血管領域の減少を示している（図３Ｃ）。これに対し、ＶＥＧＦトラップであるアフリベルセプト（アイリーア（登録商標））は、先端細胞密度を増加させることも、無血管領域を減少させることもなかった。先端細胞密度と無血管領域のサイズの間には負の相関があり（図３Ｂ）該２つのパラメーターの機構的な依存性を示す。全体的にみれば、本発明の抗体は、酸素誘発性網膜症の動物モデルにおいて虚血性無血管領域のサイズを減少させ、糖尿病性黄斑虚血に有益な効果を示す。網膜前細胞核により証明したように、硝子体における病的血管新生は、アフリベルセプトにより抑制されたのに対し、本発明の抗体は、この病的状態の中等度の減少を示した（図３Ｄ）。

実施例７：ウサギの眼における本発明の抗体及びアバスチンのｔ１／２の比較
本発明者らは、様々な条件において、例示的な本発明の抗体（ＶＨとして配列番号：１０に示される配列と、ＶＬとして配列番号：１１に示される配列とを有するクローンＩ）の半減期を測定した。結果を以下の表９に要約する。

硝子体、網膜、及び房水において算出した半減期は、それぞれ４．８日、３．５日、及び４．５日であった。これらの半減期は、臨床的に使用される組換えヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗体であるアバスチン（抗ＶＥＧＦ、ベバシズマブ、Bakri et al., Opthalmology, 2007）についての論文に報告されたものに類似しており、これも、社内でも実験的に確認した。全長のＩｇＧの硝子体内クリアランスは、主にその分子サイズに依存し、本発明の抗体とアバスチン（登録商標）は同様であることから、かかる結果は、予想通りであった。したがって、本発明の抗体とアバスチン（登録商標）の眼部半減期を含むヒトＰＫは、同様であると見込まれる。報告されたアバスチン（登録商標）のヒト眼部半減期は、９．７３±１．４８日である（Hutton-Smith, 2016）。

実施例８：ヒトＮｒｐ１Ａへの結合親和性
本発明者らは、例示的な本発明の抗体（ＶＨとして配列番号：１０に示される配列と、ＶＬとして配列番号：１１に示される配列とを有するクローンＩ）の結合親和性を評価した。
この実験用のランニング緩衝液及びすべての希釈（明言する場合を除く）は、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡ［Ｔｗｅｅｎ２０の最終濃度が０．０１％になるように、１００μＬの１００％Ｔｗｅｅｎ２０を２ＬのＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡに添加した］で行った。ＧＬＭセンサーチップを、メーカーの推奨通りに正規化して事前に調整した。センサーチップを、ＥＤＣ／ｓ－ＮＨＳの等量混合物で、水平方向に、３０μＬ／分の流量で３００秒間活性化した。該センサーチップを組換えプロテインＡ／Ｇ（１０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ４．５）中、６μｇ／ｍＬ）で、水平方向に、３０μＬ／分の流量で３００秒間固定し、これにより表面上に～４３７０－４８７５ＲＵのプロテインＡ／Ｇを固定化した。該センサーチップを１Ｍエタノールアミン塩酸塩で、水平方向に、３０μＬ／分の流量で３００秒間失活させた。水平的に３回かつ垂直的に３回、該センサーチップを０．８５％リン酸で、１００μＬ／分の流量で１８秒間安定化させた。

本発明の抗体（０．６μｇ／ｍＬ）を３０μＬ／分の流量で、プロテインＡ／Ｇの表面上に、垂直的に３００秒間捕捉し、～１６７８ＲＵの捕捉レベルを達成した。ＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡを１００μＬ／分の流量で、水平的に６０秒間注入し、１２０秒の解離を行うことで、ベースラインを安定させた。捕捉した抗体の上に、分析物を３０μＬ／分の流量で、水平的に３００秒間注入し、１８００秒の解離を行った。分析物の濃度は、０ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、及び１００ｎＭであった。水平的に１回かつ垂直的に１回、０．８５％リン酸を１００μＬ／分の流量で、１８秒間注入することにより、表面を再生させた。垂直的に１回かつ水平的に１回、ＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡを１００μＬ／分の流量で６０秒間注入した。

生データから、インタースポット（センサー表面との相互作用）及びブランク（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０又は０ｎＭの分析物を含むＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡ）を引いた。その後、センサーグラムを、１：１のラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合式に全体的にフィットさせ、on-rate値（ｋａ）、off-rate値（ｋｄ）及び親和性値（Ｋ_D）を提供した。
結果を以下の表１０に要約する。

実施例９：本発明の抗体の免疫原性の評価
本発明者らは、例示的な本発明の抗体（ＶＨとして配列番号：１０に示される配列と、ＶＬとして配列番号：１１に示される配列とを有するクローンＩ）の予想される免疫原性を評価した。この目的のために、本発明者らは、かかるＴ細胞エピトープを予想するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏのツール（ＥｐｉＶａｘ製のＥｐｉＭａｔｒｉｘ）を使用した。
多くのヒト抗体の単離物の配列をスクリーニングすることで、ＥｐｉＶａｘにより、制御可能性を有すると考えられるいくつかの高度に保存されたＨＬＡリガンドを同定した。実験的証拠は、ほとんどの対象において、これらのかかるペプチド多くが、積極的に寛容原性であることを示唆している。かかる高度に保存された制御的かつ乱雑なＴ細胞エピトープは、Ｔレジトープ（Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅ）として知られている（De Groot et al． Blood． 2008 Oct 15;112（8）:3303-11）。かなりの数のＴレジトープの存在下で、ヒト化抗体に含まれるネオエピトープの免疫原性の可能性を効果的に制御することができる。

抗体免疫原性の解析の目的のために、ＥｐｉＶａｘは、Ｔレジトープ調節性（Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅ－ａｄｊｕｓｔｅｄ）ＥｐｉＭａｔｒｉｘスコアと、抗治療性抗体反応に対応する予測とを含む。Ｔレジトープ調節性ＥｐｉＭａｔｒｉｘスコアを算出するために、ＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアからＴレジトープのスコアを差し引いた。Ｔレジトープ調節性スコアは、２３の市販の抗体のセットについて観察された臨床的免疫応答とよく相関することが示されている（De Groot et al． Clin Immunol． 2009 May;131（2）:189-201）．
ＥｐｉＭａｔｒｉｘスケールでの結果を以下の表１１に要約する。

本発明の抗体の配列は、ＥｐｉＭａｔｒｉｘスケールの下端にスコア付けした。これは、本発明の抗体が、免疫原性に対する可能性がより強い制限されていることを示している。前記ＥｐｉＭａｔｒｉｘスケールは、当業者によく知られており、Mufarrege et al．による論文（Clin Immunol., 2017 Mar;176:31-41）の図２において特に見られることができる。

実施例１０：本発明の抗体、ＹＷ６４．３及びＹＷ１０７．４．８７のヒトＮｒｐ１への結合親和性の比較
本発明者らは、例示的な本発明の抗体（ＶＨとして配列番号：１０に示される配列と、ＶＬとして配列番号：１１に示される配列とを有するクローンＩ）のヒトＮｒｐ１への結合親和性のみならず、ＹＷ６４．３及びＹＷ１０７．４．８７のヒトＮｒｐ１への結合親和性を評価した。
この実験用のランニング緩衝液及びすべての希釈（明言する場合を除く）は、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡ［Ｔｗｅｅｎ２０の最終濃度が０．０１％になるように、１００μＬの１００％Ｔｗｅｅｎ２０を２ＬのＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡに添加した］で行った。ＧＬＭセンサーチップを、メーカーの推奨通りに正規化して事前に調整した。センサーチップをＥＤＣ／ｓ－ＮＨＳの等量混合物で、水平方向に、３０μＬ／分の流量で３００秒間活性化した。該センサーチップを組換えプロテインＡ／Ｇ（１０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ４．５）中、６０μｇ／ｍＬ）で、水平方向に、３０μＬ／分の流量で３００秒間固定した。該センサーチップを１Ｍエタノールアミン塩酸塩で、水平方向に、３０μＬ／分の流量で３００秒間失活させた。水平的に３回かつ垂直的に３回、該センサーチップを０．８５％リン酸で、１００μＬ／分の流量で１８秒間安定化させた。

６つの垂直チャンネルのうちの３つにわたって、例示的な本発明の抗体、ＹＷ６４．３及びＹＷ１０７．４．８７をプロテインＡ／Ｇの表面上に捕捉した。１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、及び０ｎＭの濃度で、ＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡ緩衝液中でヒトＮｒｐ１Ａを調製した。ＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡ緩衝液の注入を、キネティクスデータ解析についての二重参照として使用した。６つの水平チャンネルにわったて、各ヒトＮｒｐ１Ａ溶液とＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡ緩衝液を４０μＬ／分の流量で、同時に５分間注入し、続いて３０分間の解離期を設けた。０．８５％リン酸を１００μＬ／分の流量で１８秒間注入し、続いてＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡを１００μＬ／分の流量で６０秒間注入することにより、表面を再生させた。生データから、インタースポット（センサー表面との相互作用）及びブランク（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０又は０ｎＭの分析物を含むＰＢＳ－Ｔ－ＥＤＴＡ）を引いた。その後、センサーグラムを、１：１のラングミュア結合式に全体的にフィットさせ、on-rate値（ｋａ）、off-rate値（ｋｄ）及び親和性値（Ｋ_D）を提供した。
本発明の抗体、ＹＷ６４．３及びＹＷ１０７．４．８７のキネティクス及び親和性データをそれぞれ以下の表１２にリストする。

実施例１１：本発明の抗体及びＹＷ６４．３のタンパク質の熱安定性の比較
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、熱力学的な手法であり、熱容量を温度の関数として測定し、タンパク質の構造の熱安定性を評価する最も正確な方法を構成する。ＤＳＣは、タンパク質の熱安定性及び構造の変化を評価することに広く使用されている。試料セルからのシグナルを、同一の溶液環境においてタンパク質を欠く基準細胞と比較する。セルの温度が上昇しているとき、参照セルと試料セルとの間の温度差を連続的に測定し、電力単位に較正する。このデータチャンネルは、ＤＰシグナル又は参照セルと試料セルとの間の差分電力と呼ばれる。ＤＰシグナルは、熱容量に変換する。熱容量を温度の関数として継続的に記録する。バッファーを算し引いたとき、得られたサーモグラムを解析した後、各遷移についてのエンタルピー及び（見かけの）温度遷移中間点（Ｔ_m）を得ることができる。
タンパク質アンフォールディングの温度（Ｔ_m）は、抗体の安定性、特に治療用製品の貯蔵中の凝集及び長期安定性に結びついている。モノクローナル抗体のＣＨ２及び３ドメインの温度遷移は、アイソタイプ中の異なる抗体について、典型的には不変であり、ＣＨ２ドメインのアンフォールディングがＣＨ３ドメインより先である。

本発明者らは、以下のＴ_mを比較した：
－本発明の抗体、より正確的には、ＶＨとして配列番号：１０に示される配列と、ＶＬとして配列番号：１１に示される配列とを有する「クローンＩ」、及び
－比較の目的用の、本明細書の実施例３に開示したクローンＹＷ６４．３。
自動化キャピラリー示差走査熱量測定（MicroCal, LLC）により、６０℃／時間の走査速度で、１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）中、１ｍｇ／ｍＬのリード化合物及びＹＷ６４．３の熱アンフォールディングと凝集を２５℃から１１０℃までモニターした。Ｏｒｉｇｉｎ７．０ソフトウェア（Origin-Lab）を用いてデータを解析した。アンフォールディングの見かけの中間点温度（Ｔ_m）を得るため、Ｏｒｉｇｉｎにおける２状態モデルを用いて、すべてのサーモグラムはベースライン補正され、フィットさせた。
リード化合物及びＹＷ６４．３の融解曲線を以下の表１３に開示する。

１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）中の本発明の抗体について、第１のＴ_mは、６８．３３℃に生じ、これは、おそらくＣＨ２ドメインのアンフォールディングに対応している。２つの更なるＴ_m、８３．２３℃及び８９．７０℃は、それぞれＣＨ３ドメイン及びＦａｂ領域に対応している。同様に、ＹＷ６４．３について、ＣＨ２ドメインは６８．５℃で、続いてＣＨ３は８１．９６℃で、最後にＦａｂドメインは８４．６５℃でアンフォールディングした。したがって、本発明の抗体のＦａｂのアンフォールディング温度は、ＹＷ６４．３よりも約５℃高い。
より高いＴ_m値は、所定の温度で、アンフォール状態にある分子がより少ないことを意味する。したがって、高いＴ_m値が生理的温度で活性な構造を維持するために、より高いＴ_m値は、治療用のタンパク質医薬品にとって有益である。

実施例１２：本発明の抗体はＶＥＧＦへのＮｒｐ１の結合を妨げない
本発明者らはさらに、例示的な本発明の抗体（ＶＨとして配列番号：１０に示される配列と、ＶＬとして配列番号：１１に示される配列とを有するクローンＩ）は、競合アッセイにおいて、ＶＥＧＦが存在しておりＮｒｐ１に結合していても、ヒトＮｒｐ１に結合することができることを示した。
この目的のために、サンプルプレートにおいて、各センサーを、１ｘキネティック緩衝液（Molecular Devices）で調製した１０μｇ／ｍＬのビオチン化したｈＶＥＧＦ１６５溶液に２分間浸すことで、ビオチン化したヒト血管内皮増殖因子－１６５（ｈＶＥＧＦ１６５）をストレプトアビジンセンサーチップ（Molecular Devices, LLC． San Jose CA）の上に捕獲した。次に、センサーを１ｘキネティック緩衝液を含むウェルに移し、あらゆる未結合分子を洗い流した（２分間）。次に、ｈＶＥＧＦ１６５により、１ｘキネティック緩衝液で調製した１００ｎＭのヒトＮｒｐ１を１０分間捕獲した。最後に、センサーを、種々の濃度（１００ｎＭ及び４００ｎＭ）の本発明の抗体に１０分間浸した。

活性センサーからのデータを、いくつかのコントロール（ｈＶＥＧＦ１６５の捕獲がない、ｈＮｒｐ１がない、及び抗体がないコントロールを含む）と比較した。
データは、本発明の抗体は、ＶＥＧＦが存在しており、Ｎｒｐ１に結合している状態でも、ヒトＮｒｐ１に結合することができることを示している（図４）。
これは、本発明の抗体がＶＥＧＦとヒトＮｒｐ１との結合を妨げないことを表わす。

実施例１３：本発明の抗体はＶＥＧＦ－Ａ誘発性内皮細胞増殖を妨げない
ＶＥＧＦ－Ａは、増殖を誘発する、内皮細胞に対する最も重要な増殖因子の１つである。Ｉｎｃｕｃｙｔｅシステム（Sartorius）を用いて、ヒト網膜の微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）における内皮細胞増殖を調べた。この機能性アッセイでは、ＨＲＭＥＣのサブコンフルエント層への組換えＶＥＧＦ－Ａタンパク質の添加が、ＨＲＭＥＣの増殖を誘発する。
簡潔に説明すると、ゼラチンで９６-ウェルプレートをコートした。細胞を３０００細胞／ウェルの密度で播種し、完全な内皮増殖培地に１８時間付着させた。細胞を、２％ＦＣＳを補充した内皮基本培地で１回洗浄し、同じ培地において８時間培養した。ＶＥＧＦ－Ａ及び／又は例示的な本発明の抗体（ＶＨとして配列番号：１０に示される配列と、ＶＬとして配列番号：１１に示される配列とを有するクローンＩ）を含む抗体を添加し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ装置の内部で細胞を増殖させた。合計で９６時間の間に、４時間ごとに位相差画像（ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｐｉｃｔｕｒｅ）を撮った。該画像を細胞数の評価に使用した。細胞数を物質の添加前の時点に正規化した。増殖曲線より曲線下面積を算出し、ベースライン値を引いた（図５）。
本発明者らは、本発明の抗体が、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ－Ａによって誘発される内皮細胞増殖を妨げないのに対し、ＶＥＧＦトラップであるアフリベルセプト（アイリーア（登録商標））が、ＶＥＧＦ－Ａ誘発性ＨＲＭＥＣ増殖において用量依存性の減少を示すことを示した。

実施例１４：ＶＥＧＦ誘発性ネットワーク形成アッセイ－線維芽細胞との共培養において内皮ネットワーク様構造のＶＥＧＦ－Ａ誘発性形成における本発明の抗体の効力、及び本発明の抗体とＶＥＧＦトラップとの間の比較
ＶＥＧＦ－Ａは、血管形成の主要制御因子であり、既存の血管から新しい血管の成長を強く誘発する。線維芽細胞層の上で培養したとき、内皮細胞が、ネットワーク様構造に配置する能力として、血管形成をインビトロで測定することができる。ネットワーク形成は、内皮細胞マーカーであるＣＤ３１で染色した後、定量化することができる。
本発明者らは、
－例示的な本発明の抗体（ＶＨとして配列番号：１０に示される配列と、ＶＬとして配列番号：１１に示される配列とを有するクローンＩ）、及び
－抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ、アバスチン（登録商標））
のＶＥＧＦ誘発性内皮ネットワーク形成を防ぐ能力を評価及び比較した。
より正確的には、線維芽細胞との共培養において、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される内皮ネットワーク構造の形成を阻止する前記化合物の能力により、ＶＥＧＦ誘発性内皮ネットワーク形成を阻止する前記化合物の細胞活性を評価した。ＨＵＶＥＣは、ＶＥＧＦホロ受容体の構成要素であるニューロピリン－１（Ｎｒｐ１）及びＶＥＧＦＲ２を内因的に発現する。この機能性アッセイでは、線維芽細胞のコンフルエント層の上に播種した内皮細胞へ組換えＶＥＧＦ－Ａタンパク質を添加すると、内皮ネットワークの形成が増加した。

簡潔に説明すると、若年者の包皮（ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｆｏｒｅｓｋｉｎ）由来の正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、ＦＧＭ-２培地及びＥＧＭ培地の等量混合物中、２５０００細胞／ウェルの密度で、ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ Ｕｌｔｒａ ９６-ウェルプレートに播種した。通常の増殖条件の下で（１回の培地交換）、ＮＨＤＦを７日間培養した。培地を除去し、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、１／１０のＥＧＭ／ＥＢＭ混合物中、５０００細胞／ウェルの密度で、ＮＨＤＦの上に播種した。
インキュベーターにおいて、ＨＵＶＥＣを４時間付着させた。培地を除去し、続いて１／１０のＥＧＭ／ＥＢＭ培地において、固定濃度の組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ及び濃度反応曲線の抗体で、細胞を刺激した。通常の培養条件の下で（３日目に新しく調製した刺激用培地に交換）、細胞を７日間培養した。

細胞を氷上で７０％エタノール／Ｈ₂Ｏで３０分間固定し、続いてＤＰＢＳ＋１％ＢＳＡで３０分間ブロックした。内皮細胞をＣＤ３１抗体（Miltenyi １３０-１０８-０３８）で６０分間室温で染色した。ＤＰＢＳで３回洗浄した後、４８８標識二次抗体（抗マウスＩｇＧ ＰＡｂ-Ａ４８８ ＰＬＵＳ；Thermo A３２７２３）及びヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）を添加し、暗所で６０分間室温で培養した。細胞をＤＰＢＳで３回洗浄した。ＡＦ４８８及びヘキスト用のチャンネルで、５倍空気対物レンズを備えるＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘを使用し、プレートを画像化した。核のヘキスト染色は、染色手順後の細胞層がインタクトであることを確認するためだけのものであり、画像解析の中に含まれるものではない。Ｈａｒｍｏｎｙ４．９ソフトウェアを使用し、ウェルあたりの４８８－陽性ネットワーク面積を算出した。

機能的な効力を決定するために、固定濃度の組換えヒトＶＥＧＦ－Ａによって誘発される内皮ネットワーク形成を阻止する抗体のＩＣ₅₀を測定した。
ＶＥＧＦ－Ａによって誘発されるネットワーク面積を算出し（＝ＶＥＧＦ－Ａによって誘発されるネットワーク面積の平均値－基底ネットワーク面積の平均値）、１００％になるように設定した。結果を図６に示す。
データは、ＶＥＧＦ－Ａの効果に対して平均値±ＳＤで表わす。個々の実験のＩＣ₅₀値の幾何平均値を算出した。最大効能は、ＶＥＧＦ誘発性ネットワーク面積の抑制％として、最高抗体濃度で算出し、その平均値を算出した。結果を表１４に要約する。

本発明者らは、本発明の抗体が、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発されるインビトロの血管形成に対して、実質的な効果を有しないことを示した。これに対して、ＶＥＧＦトラップ （ベバシズマブ、アバスチン（登録商標））は、有効かつ強力的にＶＥＧＦ－Ａによって誘発されるネットワーク形成を妨げた。
これらの結果により、ＶＥＧＦ－Ａ誘発性血管形成に影響を与えない一方で、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の破綻を防ぐという、本発明の抗体の驚くべき予想外の性質を確認した。

実施例１５：ＢＮラットにおけるレーザーによって誘発される脈絡膜血管新生－ＢＮラットにおけるレーザーによって誘発される脈絡膜血管新生に対する本発明の抗体の効力、及び本発明の抗体とＶＥＧＦトラップとの間の比較
ＶＥＧＦ－Ａは、血管形成の主要制御因子であり、既存の血管から新しい血管の成長を強く誘発する。血管形成は、レーザー凝固による網膜色素上皮（ＲＰＥ）及びブルッフ膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）における病変の発生後のＶＥＧＦ－Ａ依存性脈絡膜血管新生として、生体の眼内において測定することができる。血管形成は、ＲＰＥ、脈絡膜及び強膜のフラットマウントにおけるイソレクチンＢ４染色での病変染色後、定量化することができる。この実験的な生体内モデルは、レーザー損傷に依存してブルッフ膜を穿孔し、これにより脈絡膜からの網膜下血管補充をもたらす。これは、テスト血管形成治療法を試験するのに有用であることを証明した。
本発明者らは、レーザーによって誘発される脈絡膜血管新生に対して、
－例示的な本発明の抗体（ＶＨとして配列番号：１０に示される配列と、ＶＬとして配列番号：１１に示される配列とを有するクローンＩ）、及び
－ＶＥＧＦトラップ（アフリベルセプト、アイリーア（登録商標））
の効果を評価及び比較した。

１６０ｇ～１８０ｇの体重を有するオスのＢＮラット（ＢＮ／Ｃｒｌ）をチャールズリバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）ラボラトリーズ（Sulzfeld、ドイツ）から入手した。麻酔下で、視神経が画像の中心に配置するよう、動物を眼底カメラの前に置いた。マイクロンＩＶシステム（Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA）を用いて、５３２ｎｍ波長のグリーンアルゴンレーザー（Merilas）で、レーザー処置を実施した。
レーザーのビーム径を視神経の直径と一致させ、４００ｍＷのエネルギー及び１５０ミリ秒の時間幅を有するレーザーパルスを用いて、各眼に４つの損傷を生じた。
視神経からその直径の約２倍の距離で、損傷を大きな血管間に配置した。ブルッフ膜の破壊の成功を、レーザービームの直後のバブルの形成により識別し、ＯＣＴスキャンにより確認した。

硝子体内注射のため、ケタミン（６７ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（６．７ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で、ラットを麻酔した。ミドリン（Ｍｙｄｒｕｍ）点眼液の局所投与により瞳孔を散大させたことに加えて、動物に鎮痛性点眼液（ノベシン（Ｎｏｖｅｓｉｎｅ）０．４％）を受けさせた。３４Ｇのハミルトンシリンジを用いて、鋸状縁（ｏｒａ ｓｅｒｒａｔａ）に硝子体内注射をした。各眼に５μＬ容量の硝子体内注射を２回受けさせた。１日目のレーザー処置（同じ麻酔内）の直後に１回目の硝子体内注射を実施し、８日目に２回目の硝子体内注射を実施した。
レーザー処置後１４日目に、麻酔下で、頸椎脱臼法により動物を犠牲した。眼を摘出して鋸状縁に沿って切った。角膜、虹彩、水晶体、硝子体及び網膜を除去し、残りの眼杯（ＲＰＥ、脈絡膜及び強膜からなる）をＰＦＡ（４％）において、４℃で１時間固定し、続いて０．１％トリトンＸ１００を含有するＰＢＳに移した（１時間、４℃）。ＦＩＴＣ標識イソレクチンＢ４（生理食塩水中、１０μｇ／ｍＬ）を用いて、暗所で、眼杯を室温で一晩染色し、ＰＢＳで３回洗浄した。眼杯をガラススライドに移し、平らなクローバー葉様構造になるように４回切った。組織を封入剤（ＤＡＰＩを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｈ－１２００）で覆い、カバースリップを上に置いてＲＰＥ／脈絡膜／強膜フラットマウント（ＲＰＥ側を上に）を得た。ＬＳＭ７００共焦点レーザー走査顕微鏡（Carl Zeiss, Jena）を用いて、４８８ｎｍ波長でサンプルを解析し、画像解析により病変サイズを測定した。

結果を図７に示す。本発明の抗体は、病変面積に影響を与えなかったのに対し、ＶＥＧＦトラップであるアイリーア（登録商標）は、病変面積を２４％減少させた。したがって、本発明の抗体は、ＢＮラットにおけるＶＥＧＦ－Ａ依存性の脈絡膜血管新生に影響しなかった。
前記結果により、本発明の抗体は、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血管形成を抑制しないことを確認した。これにより、本発明の抗体は、血行再建を促進しようとする臨床状況において（例えば、網膜の血行再建が有効である糖尿病性黄斑虚血を患う患者において）、極めて有用であることを確認した。
本発明の開示全体にわたって説明したように、本発明の抗体は、Ｓｅｍａ３Ａの血管反発作用を抑制するため、血管形成の方向を虚血性領域に向け直すことを可能にする。加えて、本発明の抗体は、一方では、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される血液網膜関門の破綻を抑制するが、他方では、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の破綻を抑制する。
その、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性に対する抑制効果にかかわらず、驚くべきことに、本発明の抗体は、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血管形成に影響を及ぼさない。
結論として、本明細書において示されているように、本発明の抗体は、血行再建を阻止しないが、これは虚血性領域の血管形成を妨害しないであろうことを示している。したがって、かかる結果により、本発明の抗体は、虚血性無血管領域、典型的にはＰＤＲ、特にＤＭＩを患う患者の網膜における虚血性無血管領域の血行再建を改善することに対して非常に有益であることを確認した。

Claims (25)

1. 配列番号：１（Ｈ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：２（Ｈ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：３（Ｈ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
   配列番号：４（Ｌ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：５（Ｌ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：６（Ｌ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント。
2. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、
   配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６又は配列番号：１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
   配列番号：１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント。
3. 配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６又は配列番号：１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
   配列番号：１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、
   前記重鎖可変領域が、配列番号：１（Ｈ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：２（Ｈ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：３（Ｈ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含み、
   前記軽鎖可変領域が、配列番号：４（Ｌ－ＣＤＲ１）のアミノ酸配列、配列番号：５（Ｌ－ＣＤＲ２）のアミノ酸配列、及び配列番号：６（Ｌ－ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント。
4. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、
   配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６又は配列番号：１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
   配列番号：１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント。
5. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、
   ａ．配列番号：１０及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
   ｂ．配列番号：１２及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
   ｃ．配列番号：１３及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
   ｄ．配列番号：１４及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
   ｅ．配列番号：１５及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、
   ｆ．配列番号：１６及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖、又は
   ｇ．配列番号：１７及び配列番号：１１それぞれのアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含む、請求項１に記載の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント。
6. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、
   配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４又は配列番号：２５のアミノ酸配列を含む重鎖、好ましくは配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４又は配列番号：２５のアミノ酸配列からなる重鎖、及び
   配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、好ましくは配列番号：１９のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント。
7. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、
   ａ．配列番号：１８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
   ｂ．配列番号：２０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
   ｃ．配列番号：２１のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
   ｄ．配列番号：２２のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
   ｅ．配列番号：２３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、
   ｆ．配列番号：２４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖、又は
   ｇ．配列番号：２５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号：１９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント。
8. 配列番号：２６に示されるヒトＮｒｐ１Ａのアミノ酸領域６８-７７内の少なくとも一つのアミノ酸残基に結合する、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント。
9. 配列番号：２７に示される配列に結合する、抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメント。
10. 医薬としての使用のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
11. 眼疾患又は網膜疾患を治療又は予防するために使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
12. 前記疾患が、網膜症、未熟児網膜症や虚血性網膜症などの増殖性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症及び非増殖性糖尿病性網膜症を含む糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性黄斑虚血、加齢黄斑変性、網膜色素変性、遺伝性網膜ジストロフィー、近視性変性、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、眼内炎、ぶどう膜炎、のう胞様黄斑浮腫、任意の網膜疾患に続く脈絡膜新生血管膜、視神経症、緑内障、網膜剥離、中毒性網膜症、放射線網膜症、外傷性網膜症、薬物誘発性網膜脈管障害、網膜血管新生、ポリープ状脈絡膜血管症、網膜血管炎、網膜毛細血管瘤、フックスジストロフィー、黄斑毛細血管拡張症、アッシャー症候群、並びにシュタルガルト病からなる群より選択される、請求項１１に記載の使用のための抗体又は抗原結合フラグメント。
13. 前記疾患が、増殖性糖尿病性網膜症及び非増殖性糖尿病性網膜症を含む糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性黄斑虚血、加齢黄斑変性、網膜血管新生、緑内障、並びに脈絡膜血管新生からなる群より選択される、請求項１１又は１２に記載の使用のための抗体又は抗原結合フラグメント。
14. 前記疾患が、糖尿病性黄斑浮腫及び／又は糖尿病性黄斑虚血である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の使用のための抗体又は抗原結合フラグメント。
15. 前記疾患が、糖尿病性黄斑虚血であり、
    前記抗体又は抗原結合フラグメントが、虚血性網膜内の血管再生（血行再建）を促進し、眼の硝子体部位の病的血管新生を予防する、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の使用のための抗体又は抗原結合フラグメント。
16. 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血管形成を抑制しない、請求項１５に記載の使用のための抗体又は抗原結合フラグメント。
17. 前記疾患が、糖尿病性黄斑浮腫であり、
    前記抗体又は抗原結合フラグメントが、Ｓｅｍａ３Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を減少させ、
    前記抗体又は抗原結合フラグメントが、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血液網膜関門の透過性を減少させる、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の使用のための抗体又は抗原結合フラグメント。
18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントと、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
19. 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、非経口経路、静脈内経路、硝子体内経路又は皮下経路の投与によって投与される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント或いは請求項１８に記載の医薬組成物。
20. 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、硝子体内経路によって投与される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント或いは請求項１８に記載の医薬組成物。
21. 配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４若しくは配列番号：２５に示される重鎖をコードする配列、又は配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６若しくは配列番号：１７に示される重鎖可変領域をコードする配列と、
    配列番号：１９に示される軽鎖をコードする配列又は配列番号：１１に示される軽鎖可変領域をコードする配列とを含む、１又は複数の単離されたポリヌクレオチド。
22. 請求項２１に記載の１又は複数の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
23. 請求項２１に記載の１又は複数の単離されたポリヌクレオチド或いは請求項２２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
24. ａ．請求項２３に記載の宿主細胞を得ることと、
    ｂ．前記宿主細胞を培養することとを含む、
    抗Ｎｒｐ１Ａ抗体又はその抗原結合フラグメントを作製するための方法。
25. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントを回収し、精製することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。

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