CN102015769A

CN102015769A - 改进的抗-trkb抗体

Info

Publication number: CN102015769A
Application number: CN2009801097196A
Authority: CN
Inventors: K·R·鲁尔森
Original assignee: IRM LLC
Current assignee: Novartis International Pharmaceutical Ltd; Novartis AG
Priority date: 2008-01-17
Filing date: 2009-01-16
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2029-01-16
Also published as: EP2235062A1; CN102015769B; US8642035B2; PE20091326A1; JP5420568B2; JP2011510021A; CA2712298A1; AU2009205937B2; TW200936608A; CA2712298C; AR070202A1; KR101290503B1; KR20100103693A; MX2010007841A; CL2009000090A1; EA028621B1; US20110097326A1; EA201001139A1; BRPI0906877A2; WO2009092049A1

Abstract

本发明提供特异性识别和激动酪氨酸受体激酶B(TrkB)受体的改进的抗体或抗原结合分子及其使用方法。本发明中还提供编码这类分子的多核苷酸和载体，以及包含所述所核苷酸或载体的宿主细胞。

Description

改进的抗-TRKB抗体

相关申请的交叉参考

本申请要求2008年1月17日提交的美国临时申请号61/021,820的权益，该美国临时申请的所有内容在此引用作为参考。

技术领域

本发明涉及酪氨酸受体激酶B(TrkB)的抗体和抗原结合分子兴奋剂。

背景技术

I.TrkB

酪氨酸受体激酶B(TrkB)属于包含TrkA和TrkC的单跨膜受体酪氨酸激酶家族。这些酪氨酸受体激酶(trk)介导神经营养蛋白的活性。神经营养蛋白为神经元存活及发育所需，并通过调节神经元结构及突触可塑性来调节突触传递。神经营养蛋白包含但不限于神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)。(Lo，KY等，J.Biol.Chem.，280：41744-52(2005))。TrkB是BDNF的高亲和力受体(Minichiello等，Neuron 21：335-45(1998))。结合trk的神经营养蛋白激活受体，其二聚化并使受体胞内结构域上的特定酪氨酸残基自磷酸化(Jing等Neuron 9：1067-1079(1992)；Barbacid，J.Neurobiol.25：1386-1403(1994)；Bothwell，Ann.Rev.Neurosci.18：223253(1995)；Segal和Greenberg，Ann.Rev.Neurosci.19：463489(1996)；Kaplan和Miller，Curr.Opinion Neurobiol.10：381391(2000))。这些磷酸酪氨酸残基作为胞内信号发放(signaling)级联元件的停泊位点，所述胞内信号发放级联导致神经元死亡的抑制和神经营养蛋白的其他效应。例如，Shc、FRS-2、SH2B、rAPS和PLCγ通过磷酸化的酪氨酸残基与TrkB相互作用。这些衔接分子与激活的TrkB的结合导致信号发放途径的开始，所述信号途径包含促分裂原活化蛋白激酶途径、磷脂酰肌醇3-激酶途径和PLCγ途径，从而介导神经营养蛋白的作用(Lo，KY等，J.Biol.Chem.，280：41744-52(2005))。

II.糖尿病

人血流中葡萄糖的浓度必须控制在相对严格的范围(60-120毫克/分升血液)内以维持正常的健康。若血糖降得过低，则导致产生称为低血糖的病症，其症状如昏晕、虚弱、头痛、意识错乱和个性改变。由于过量葡萄糖与细胞、组织和器官中蛋白质之间的化学反应，过量血糖或高血糖可引起组织损伤。认为该损伤会引起失明、肾衰竭、阳痿、动脉粥样硬化及对感染的易感性增加的糖尿病并发症。

糖尿病与持续的和病理性升高的血糖浓度相关；在美国它是引起死亡的主要原因之一，并占全部死亡率的约5％。糖尿病分为两种主要的亚类：I型，也称为青少年糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)；和II型，也称为成年型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)。

II型糖尿病的诊断包含症状的评估和尿及血液中葡萄糖的测量。血糖水平测定对准确的诊断是必需的。更具体而言，空腹血糖水平测定是所用的标准方法。然而，认为口服葡萄糖耐量试验(OGTT)比空腹血糖水平更为灵敏。II型糖尿病与受损的口服葡萄糖耐量(OGT)相关。因此，虽然通常并非诊断糖尿病所必需，但OGTT可帮助诊断II型糖尿病(Emancipator K，Am J Clin Pathol 1997年11月；112(5)：66574；Type 2Diabetes Mellitus，Decision Resources Inc.，2000年3月)。

因此，在个体中诊断受损的葡萄糖耐量，所述个体具有低于II型糖尿病的诊断所需的空腹血糖水平，但在oGTT过程中具有介于正常人和糖尿病患者之间的血浆葡萄糖反应。认为受损的葡萄糖耐量是前驱糖尿病病症，并且受损的葡萄糖耐量(由oGTT定义)是发生II型糖尿病的强预测因子(Haffner S M，Diabet Med 1997年8月；14Suppl 3：S12 8)。

II型糖尿病是与胰脏功能和/或其他胰岛素相关过程减弱相关的进行性疾病，其被升高的血糖水平加剧。因此，II型糖尿病通常具有延长的前驱糖尿病期，并且多种病理生理学机制可导致病理学上的高血糖症和受损的葡萄糖耐量，例如，前驱糖尿病病症中葡萄糖利用及有效性、胰岛素作用和/或胰岛素产生中的异常(Goldberg R B，Med Clin North Am 1998年7月；82(4)：805 21)。

与葡萄糖耐受不良相关的前驱糖尿病病症也可与对腹部肥胖症、胰岛素抗性、高脂血症及高血压的易感性相关(Groop L、Forsblom C、Lehtovirta M，Am J Hypertens 1997年9月；10(9Pt 2)：172S 180S；Haffner SM，J Diabetes Complications 1997年3月-4月，11(2)：6976；Beck-Nielsen H、Hen riksen J E、Alford F、Hother-Nielson O，Diabet Med 1996年9月；13(9附录6)：S78 84)。

在具有发生II型糖尿病风险的个体中进行早期干预(其集中在降低病理学上的高血糖症或受损的葡萄糖耐量)可预防或延迟向II型糖尿病及相关并发症的发展。因而，通过有效治疗受损的口服葡萄糖耐量和/或升高的血糖水平，人们可以预防或抑制该障碍向II型糖尿病发展。见例如美国专利号7,109,174。

胰岛素和磺酰脲类(口服低血糖治疗剂)是美国当今建议的两类主要的糖尿病药物。建议胰岛素用于I型和II型糖尿病二者，而通常建议磺酰脲类仅用于II型糖尿病。磺酰脲类刺激天然胰岛素的分泌并降低胰岛素抗性；这些化合物并不代替胰岛素在代谢中的功能。大约三分之一接受磺酰脲的患者变得对其具有抗性。一些II型糖尿病患者不响应磺酰脲治疗。在对磺酰脲首次治疗不响应的患者中，5-10％在约10年后可能经历磺酰脲有效性的丧失。见例如美国专利号7,115,284。

通常建议用于治疗II型糖尿病的许多抗糖尿病剂(例如磺酰脲类和噻唑烷二酮类)具有所不希望的增加体重的副作用。因代谢失调和内分泌失调的增强，具有前驱糖尿病病症或具有诊断的II型糖尿病的患者中增加的体重产生有害作用，而肥胖症本身就是II型糖尿病发生及进行性恶化的关键性风险因素。因此希望具有维持或减轻体重的抗糖尿病剂。见例如美国专利号7,199,174。

肥胖症是常见且非常严重的公共健康问题，因为它增加了个人患许多严重疾病的风险，所述疾病包含糖尿病、心脏病、中风、高血压和一些类型的癌症。在过去二十年里，肥胖个体数量上的大量增加已经产生了深远的公共健康问题。虽然研究已表明通过饮食及锻炼而减少肥胖症显著降低相关危险因素，但鉴于肥胖症与遗传学上的遗传因素紧密相关，这些治疗大多不成功，所述遗传因素促进食欲增强、对高热量食物的偏爱、体力活动减少及脂肪生成代谢提高。见例如美国专利号7,115,767。

III.Rett综合症

Rett综合症(RTT)最先由Andreas Rett博士在1966年鉴定，是源自晚期神经发育缺陷的破坏性CNS障碍。它以1/10,000-15,000活产的比例几乎专一性地影响所有种族的少女。一些患有RTT的个体在幼年死亡；但是，许多个体可以活至成年并重度残疾。高达25％的患者死于心脏/呼吸衰竭。至今没有该疾病的有效疗法。

在表面上正常的发育期之后，受影响的女孩在6-18个月的年龄发展出RTT症状，所述症状在随后几年内进行性恶化。症状包含出生时头围正常，随后头部生长减速；获得性语言能力散失、交流障碍、认知同能障碍；刻板的手部动作(扭曲的手部扭绞、洗手、鼓掌、抚拍等)代替有目的的手部技能；受损的或恶化的行进(步态共济失调、僵硬等)；清醒时呼吸困难；来自婴儿早期的受损的睡眠模式；伴随肌肉萎缩和张力障碍的异常肌紧张；外周血管舒缩障碍；进行性脊柱侧凸或脊柱后凸；和生长阻滞。

该障碍还表征为中枢自主功能障碍，且Rett患者显示以下症状中的一些或全部：屏气期、浅呼吸、通气增强、延长的呼吸暂停组成的多重呼吸节律障碍；伴随基线心脏迷走紧张降低的心率失常；和心脏压力反射器敏感性。这些症状是威胁生命的，并使Rett患者处于猝死的风险。它们表明脑干的不成熟和觉醒时心肺网络及下丘脑或边缘皮质内整合抑制的缺乏。此外，在Rett患者中报道了脑干神经营养蛋白信号发放(NGF和BDNF)中的改变，也报道了单胺(5-羟色胺，去甲肾上腺素)和神经肽(P物质)水平的降低。

RTT是单基因疾病，其在绝大部分病例中由X染色体连锁基因mecp2中的突变引起，该基因编码转录阻抑物MeCP2(甲基CpG胞嘧啶结合蛋白2)。MeCP2优先结合甲基化DNA。

神经营养蛋白因子BDNF是已知的MeCP2的直接靶标，且是去甲肾上腺素神经元和5-羟色胺神经元的重要营养因子。令人惊奇地，Mecp2-KO小鼠脑BDNF缺乏，而脑BDNF的遗传过量表达可以提高它们的寿命，并拯救(rescue)它们的一些行动缺陷。在人类中鉴定的BDNF缺乏障碍包含Rett综合症、维尔姆斯瘤(Wilms’tumor)、无虹膜、泌尿生殖异常和智力发育迟缓(WAGR)综合症(Han等，N Engl J Med(2008)359(9)：918-27)、黑皮质素受体MC4R缺乏引起的肥胖症(Farooqi和O’Rahilly，EndocrineRev(2006)27(7)：710-18)、恶病质/肌肉萎缩综合症(Lin等，PloS，3(4)：e1900；WO 2007/088476)。

发明概述

一方面，本发明提供结合酪氨酸受体激酶B(TrkB)的抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含：

(a)重链可变区，其包含人重链V区段、重链互补决定区3(CDR3)和重链构架区4(FR4)，和

(b)轻链可变区，其包含人轻链V区段、轻链CDR3和轻链FR4，其中

i)重链CDR3包含氨基酸序列V(T/V)(S/T/R/N)WFAY(SEQ IDNO：34)；和

ii)轻链CDR3可变区包含氨基酸序列(S/M)QGT(H/A)(E/V/I)PYT(SEQ ID NO：42)；和

其中该抗体是TrkB激动剂。

另一方面，本发明提供特异性结合TrkB的抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区和轻链可变区各包含以下三个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3；其中：

i)重链可变区的CDR1包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列；

ii)重链可变区的CDR2包含选自SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的氨基酸序列；

iii)重链可变区的CDR3包含选自SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的氨基酸序列；

iv)轻链可变区的CDR1包含选自SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37的氨基酸序列；

v)轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列；

vi)轻链可变区的CDR3包含选自SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41的氨基酸序列。

关于抗体的实施方案，在一些实施方案中，重链V区段与SEQ IDNO：16具有至少90％序列同一性，且其中轻链V区段与SEQ ID NO：24具有至少90％序列同一性。

在一些实施方案中，重链V区段与选自SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的氨基酸具有至少90％序列同一性，且轻链V区段与选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的氨基酸具有至少90％序列同一性。

在一些实施方案中，重链CDR3包含选自SEQ ID NO：32和SEQ IDNO：33的氨基酸序列；轻链CDR3包含选自SEQ ID NO：40和SEQ IDNO：41的氨基酸序列。

在一些实施方案中，重链FR4是人种系FR4。在一些实施方案中，重链FR4是SEQ ID NO：50。在一些实施方案中，重链J区段包含人种系JH4部分序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：50)。

在一些实施方案中，轻链FR4是人种系FR4。在一些实施方案中，轻链FR4是人种系Jk2部分序列FGQGKLEIK(SEQ ID NO：61)。

在一些实施方案中，重链V区段和轻链V区段各包含互补决定区1(CDR)和互补决定区2(CDR2)；其中：

i)重链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列；

ii)重链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列；

iii)轻链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列；和

iv)轻链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。

在一些实施方案中，

i)重链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：25；

ii)重链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：28；

iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：32；

iv)轻链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：35；

v)轻链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：38；和

vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：41。

在一些实施方案中，

i)重链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：25；

ii)重链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：28；

iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：32；

iv)轻链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：36；

v)轻链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：38；和

vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：40。

在一些实施方案中，

i)重链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：25；

ii)重链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：28；

iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：32；

iv)轻链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：37；

v)轻链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：38；和

vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：40。

在一些实施方案中，

i)重链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：25；

ii)重链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：29；

iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：32；

iv)轻链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：35；

v)轻链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：38；和

vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：41。

在一些实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO：4的可变区具有至少90％氨基酸序列同一性，且轻链可变区与SEQ ID NO：11的可变区具有至少90％氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，重链可变区与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的可变区具有至少90％氨基酸序列同一性，且轻链可变区与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的可变区具有至少90％氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，重链可变区与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的可变区具有至少95％氨基酸序列同一性，且轻链可变区与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的可变区具有至少95％氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，重链可变区包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列，且轻链可变区包含选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体以低于5x10^-8M的平衡解离常数(K_D)结合TrkB。

在一些实施方案中，抗体是FAb’片段。在一些实施方案中，抗体是IgG。在一些实施方案中，抗体是单链抗体(scFv)。在一些实施方案中，抗体包含人恒定区。

在一些实施方案中，抗体不结合酪氨酸激酶受体A或酪氨酸激酶受体C。在一些实施方案中，抗体结合TrkB的配体结合结构域(LBD)。在一些实施方案中，抗体与脑衍生神经营养因子竞争结合TrkB。

在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：1的重链和含有SEQID NO：8的轻链。

在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：1的重链和含有SEQID NO：9的轻链。

在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：1的重链和含有SEQID NO：10的轻链。

在一些实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：3的重链和含有SEQID NO：8的轻链。

另一方面，本发明提供可药用组合物，其包含本发明的抗体和生理学上相容的赋形剂。可药用组合物的实施方案如上文针对抗体所述。

在一些实施方案中，药物组合物还包含用于减轻或抑制呼吸窘迫的药剂(agent)，例如去甲肾上腺素和/或5-羟色胺途径的激活剂。第二药剂可以是三环抗抑郁剂，例如地昔帕明(DMI)。在一些实施方案中，第二药剂是5-羟色胺1A受体部分激动剂，例如丁螺环酮(buspirone)、氟西汀(Fluoxetine)和瑞波西汀(Reboxetine)。在一些实施方案中，第二药剂是谷氨酸能AMPA受体的激活剂，例如AMPAkine CX54。在一些实施方案中，第二药剂是前列腺素、孕酮或TrkB活性的增效剂(例如蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂)。

在一些实施方案中，药物组合物还包含在个体中降低血糖水平的药剂。在一些实施方案中，药物组合物还包含在个体中减轻体重的药剂。

在相关的方面，本发明提供通过对有需要的个体施用本发明的抗体来治疗、减轻、抑制、缓解和/或预防BDNF缺乏引起的障碍的方法。该治疗方法的实施方案如上文及此处针对抗体所述。在一些实施方案中，在全身或外周施用抗体，例如口服施用、吸入施用、静脉内施用或腹膜内施用。在一些实施方案中，BDNF缺乏引起的障碍选自Rett综合症、WAGR综合症、MC4R缺乏引起的肥胖症和恶病质(例如由癌症、衰老、进食障碍或药物引起，包含阿片样物质诱导的呕吐)。

在另一方面，本发明提供在有需要的个体中降低血糖水平和/或体重的方法，该方法包括对个体施用治疗有效量的本发明的抗体。该治疗方法的实施方案如上文及此处针对抗体所述。关于该方法的其他实施方案，在一些实施方案中，所述个体是前驱糖尿病患者。在一些实施方案中，所述个体患有I型糖尿病。在一些实施方案中，所述个体患有II型糖尿病。在一些实施方案中，所述个体超重。在一些实施方案中，所述个体肥胖。

在一些实施方案中，所述方法还包括对个体施用有效降低血糖的治疗有效量的第二药剂的步骤。在一些实施方案中，所述第二药剂选自胰岛素、磺酰脲类、促胰岛素剂、二甲双胍、PPARγ激动剂、PPARα激动剂、PPARδ激动剂、PPARα/γ双激动剂、PPARα/γ/δ泛激动剂、α-葡糖苷酶抑制剂、DPP-IV抑制剂和GLP-1/GLP-1类似物。

在一些实施方案中，所述方法还包括对个体施用有效减轻体重或肥胖症的治疗有效量的第二药剂的步骤。在一些实施方案中，所述第二药剂选自脂肪酶抑制剂、西布茶明(sibutramine)、CB-1抑制剂、托吡酯(topiramate)、糊精、糊精类似物、瘦素、PYY/PYY类似物和GLP-1/GLP-1类似物。

在一些实施方案中，所述第二药剂和抗体作为混合物施用。在一些实施方案中，第二药剂和抗体分开施用。

定义

“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽或包含免疫球蛋白的片段的多肽，其能够非共价地、可逆地和以特异性的方式结合相应抗原。示例性抗体结构单位包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)，二者通过二硫键连接。已确认的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其分别依次定义免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每条链的N端定义了约100-110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指重链和轻链的这些区域。如本申请中所用，“抗体”包含对例如TrkB具有特定结合特异性的抗体的所有变体及其片段。因此，具有相同结合特异性的全长抗体、嵌合抗体、单链抗体(ScFv)、Fab、Fab′和这些片段的多聚体形式(例如F(ab′)₂)都在此概念的范围之内。

“互补性决定结构域”或“互补决定区”(“CDR”)可互换地指V_L和V_H的高变区。CDR具有对此类靶蛋白的特异性的抗体链的靶蛋白结合位点。每个人V_L或V_H中具有3个CDR(CDR1-3，从N端顺次编号)，它们组成可变结构域的大约15-20％。CDR在结构上与靶蛋白的表位互补，从而直接负责结合特异性。V_L或V_H的其余延伸(所谓的构架区)在氨基酸序列中显示较少变异(Kuby，Immunology，第四版，第四章.W.H.Freeman&Co.，New York，2000)。

用多种本领域熟知的定义来确定CDR和构架区的位置，例如Kabat，Chothia，国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(在万维网imgt.cines.fr/上)和AbM(见例如Johnson等，Nucleic Acids Res.，29：205-206(2001)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)；Chothia等，Nature，342：877-883(1989)；Chothia等，J.Mol.Biol.，227：799-817(1992)；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.，273：927-748(1997))。抗原结合部位的定义也描述于以下中：Ruiz等，Nucleic Acids Res.，28：219-221(2000)；和Lefranc，M.P.，Nucleic Acids Res.，29：207-209(2001)；MacCallum等，J.Mol.Biol.，262：732-745(1996)；和Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9268-9272(1989)；Martin等，Methods Enzymol.，203：121-153(1991)；和Rees等，InSternberg M.J.E.(编辑)，Protein Structure Prediction，牛津大学出版社，牛津，141-172(1996)。

术语“结合特异性决定簇(determinant)”或“BSD”可互换地指互补决定区内决定抗体结合特异性必需的最小连续或非连续氨基酸序列。最小结合特异性决定簇可以处于一个或多个CDR序列中。在一些实施方案中，最小结合特异性决定簇处于抗体重链CDR3和轻链CDR3序列的部分或全长内(即由其单独决定)。

如本文所用，“抗体轻链”或“抗体重链”分别指包含V_L或V_H的多肽。内源V_L由基因区段V(可变的)和J(连接的)编码，内源V_H由V、D(多样性)和J编码。每个V_L或V_H包含CDR以及构架区。在本申请中，抗体轻链和/或抗体重链有时可以共同称为“抗体链”。如本领域技术人员将容易地认识到，这些术语包含含有不破坏V_L或V_H基本结构的突变的抗体链。

抗体以完整的免疫球蛋白或经多种肽酶消化产生的大量充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中的二硫键处消化抗体，以产生Fab’的二聚体F(ab)′₂，所述Fab’本身是通过二硫键结合V_H-C_H1的轻链。可在温和条件下还原F(ab)′₂，以断裂铰链区中的二硫键，从而将F(ab)′₂二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体基本上是具有部分铰链区的Fab。Paul，Fundamental Immunology第三版(1993)。虽然多种抗体片段是根据完整抗体的消化定义的，但技术人员将理解，可通过化学或使用重组DNA方法从头合成这类片段。因此，如本文所用，术语“抗体”也包含通过全长抗体的修饰产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如单链Fv)，或使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(见例如McCafferty等，Nature 348：552-554(1990))。

对于单克隆或多克隆抗体的制备，可使用本领域已知的任意技术(见例如Kohler&Milstein，Nature256：495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，77-96页Alan R.Liss，Inc.1985)。用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)可适用于产生针对本发明多肽的抗体。同样，转基因小鼠或其他生物(如其他哺乳动物)可用于表达人源化抗体。备选地，噬菌体展示技术可用于鉴定特异性结合所选抗原的抗体和异聚体Fab片段(见例如McCafferty等，上文；Marks等，Biotechnology，10：779-783(1992))。

人源化或灵长类动物源化非人抗体的方法为本领域所熟知。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为输入残基(import residue)，其通常取自输入可变结构域。基本上可以按Winter及其同事的方法(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science239：1534-1536(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))，通过将啮齿类动物的CDR或CDR序列替换为相应的人抗体序列来进行人源化。因此，这类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上已通过来自非人物种的相应序列替换少于完整的人可变结构域。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中用来自啮齿类动物抗体中类似部位的残基替换一些互补决定区(“CDR”)残基和可能替换一些构架区(“FR”)残基。

“嵌合抗体”是抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，使得抗原结合部位(可变区)连接到不同的或改变类型的效应子功能和/或物种分子，或者完全不同的分子(其赋予嵌合抗体新的性质，例如酶、毒素、激素、生长因子和药物)的恒定区上；或(b)可变区或其部分被具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。

术语“可变区”或“V区”可互换地指包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的重链或轻链。见图1。内源可变区由免疫球蛋白重链V-D-J基因或轻链V-J基因编码。V区可以是天然存在的、重组的或合成的。

如本文所用，术语“可变区段”或“V区段”可互换地指包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的可变区的子序列。见图1。内源V区段由免疫球蛋白V基因编码。V区段可以是天然存在的、重组的或合成的。

如本文所用，术语“J区段”指所编码的包含CDR3的C端部分和FR4的可变区的子序列。内源J区段由免疫球蛋白J基因编码。见图1。J区段可以是天然存在的、重组的或合成的。

“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性，而在人类中免疫原性较低的抗体。这例如可通过保留非人CDR区并用它们的人类对应物替换抗体的其余部分来实现。见例如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)：169-217(1994)。

术语“相应的人种系序列”指编码人可变区氨基酸序列或子序列的核酸序列，与所评估的其他所有由人种系免疫球蛋白可变区序列编码的可变区氨基酸序列相比，所述序列或子序列与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高的测定的氨基酸序列同一性。相应的人种系序列还可以称为与所评估的所有其他可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或子序列具有最高的氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或子序列。相应的人种系序列可以仅是构架区、仅是互补决定区、构架区和互补决定区、可变区段(如上文所定义)或包含可变区的序列或子序列的其他组合。可以用本文所述的方法测定序列同一性，例如用BLAST、ALIGN或本领域已知的其他比对算法比对两条序列。相应的人种系核酸或氨基酸序列与参考可变区核酸或氨基酸序列可以具有至少约90％、92％、94％、96％、98％、99％序列同一性。可以通过例如公开可得的国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(在万维网imgt.cines.fr/上)和V-base(在万维网vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk上)确定相应的人种系序列。

用于描述抗原(如蛋白质)与抗体或抗体衍生的结合剂之间的相互作用的背景时，短语“特异性(或选择性)结合”指确定抗原在蛋白质和其他生物制品的异源群体中存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合剂至少两倍于背景结合特定抗原，且基本上不大量结合样品中存在的其他抗原。这种条件下的特异性结合抗体或结合剂可以需要已针对抗体或结合剂对特定蛋白质的特异性对其进行了选择。可通过扣除与例如来自其他物种(如小鼠)的TrkB或其他Trk亚型(例如TrkA、TrkC等)的交叉反应的抗体来完成这种选择。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定法常规用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(见例如Harlow&Lane，Using Antibodies，实验室手册(1988)，关于可用于测定特异性免疫反应的免疫测定形式和条件的描述)。通常，特异性或选择性结合反应将产生至少两倍于背景信号的信号，并且更通常地高于10到100倍背景。

术语“平衡解离常数(K_D，M)”指解离速率常数(k_d，时间^-1)除以结合速率常数(k_a，时间^-1，M^-1)。可以用任意本领域已知的方法测量平衡解离常数。本发明的抗体一般具有低于约10^-7M或10^-8M的平衡解离常数，例如低于约10^-9M或10^-10M，在一些实施方案中低于约10^-11M、10^-12M或10^-13M。

如本文所用，术语“抗原结合区”指本发明的TrkB结合分子的结构域，其负责该分子和TrkB间的特异性结合。抗原结合区包含至少一个抗体重链可变区和至少一个抗体轻链可变区。至少有一个这类抗原结合区存在于本发明的每个TrkB结合分子中，且每个抗原结合区可以相同或彼此之间不同。在一些实施方案中，本发明的TrkB结合分子的至少一个抗原结合区作为TrkB的激动剂。

术语“抗体激动剂”或“激动剂”可互换地指能够激活受体以诱导全部或部分(例如至少60％)受体介导的应答的抗体。例如，TrkB激动剂结合TrkB并诱导TrkB介导的信号发放。在一些实施方案中，可通过其结合TrkB和在接触SH-SY5Y细胞时诱导神经突派生(outgrowth)的能力或按照本文另作的描述来鉴定TrkB抗体激动剂。在其他实施方案中，如在本文所述的失巢凋亡测定中所测量，可以通过其拯救细胞免于脱附作用依赖的凋亡的能力来鉴定TrkB抗体激动剂。认为在如本文所述的失巢凋亡测定中具有低于5nM的EC50的抗-TrkB抗体是TrkB抗体激动剂，例如低于1nM、500pM、250pM、100pM、50pM或30pM。

术语“TrkB”或“酪氨酸受体激酶B”可互换地指受体酪氨酸激酶的原肌球蛋白相关激酶(Trk)家族的三个成员之一，其他成员是TrkA和TrkC。TrkB是神经营养性酪氨酸受体激酶(NTRK)家族的成员，也称为2型神经营养性酪氨酸激酶受体(NTRK2)。TrkB是膜结合的受体，神经营养蛋白结合时，其磷酸化自身和MAPK途径的成员。TrkB的配体包含脑衍生神经营养因子(BDNF)和神经营养蛋白-3。见例如Haniu等，ArchBiochem Biophys(1995)322(1)：256-264；Squinto等，Cell(1991)65(5)885-893；和Soppe等，Cell(1991)65(5)895-903。通过TrkB的信号发放导致细胞分化。已将这个基因中的突变与肥胖症和心境障碍相关联。存在编码不同TrkB同种型的其他转录剪切变体。已知TrkB的核酸和氨基酸序列，并已公开于GenBank检索号NM_001018064(gi：65506744，PRI18-NOV-2007)。还见GenBank检索号BC075804.1、U12140.1、BC031835.1和AF410899.1。如本文所用，TrkB多肽在功能上是酪氨酸激酶受体，它通过BDNF或神经营养蛋白-3的结合来激活，并通过磷酸化自身和MAPK途径的成员来引发细胞内信号发放。在结构上，TrkB氨基酸序列与GenBank检索号NP_001018074.1、AAB33109、AAL67968、AAL67964、AAC51371.1、AAH31835.1或AAL67965.1的氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％，93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在结构上，TrkB核酸序列与GenBank检索号NM_001018064、S76473、BC075804.1、U12140.1、BC031835.1或AF410899.1的核酸序列具有至少约90％、91％、92％，93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

本发明多肽的“活性”指多肽在其天然细胞或组织中的结构功能、调节功能或生物化学功能。多肽活性的实例包含直接活性和间接活性二者。示例性直接活性是与多肽直接相互作用的结果，包含配体结合，如BDNF与TrkB的配体结合结构域(LBD)的结合(见例如Naylor等，Biochem Biophys Res Commun.291(3)：501-7(2002))、第二信使(例如cAMP、cGMP、IP₃、DAG或Ca²⁺)的产生或耗尽、离子流及磷酸化水平或转录水平的变化。在TrkB的背景中，示例性间接活性被视为细胞或组织中对多肽直接活性的表型或响应中的变化，例如由于多肽与其他细胞或组织成分的相互作用而降低整体血糖水平。

当用于指成年人时，术语“肥胖的”指具有30或更高的体重指数(BMI)的个体。当用于指成年人时，“超重”指具有25或更高BMI的个体。对于儿童，使用年龄体重指数图，其中认为BMI高于第85百分位数是“超重”，并且认为BMI高于第95百分位数是“肥胖”。见例如Clinical Guidelines on the Identification，Evaluation，and Treatment of Overweight and Obesity in Adult(National Heart，Lung and Blood Institute，June 17，1998)和世界卫生组织肥胖症协会(WHO，Geneva，June 1997)的报告中的Preventing and Managing the Global Epidemic of Obesity。

“前驱糖尿病个体”指空腹血糖水平高于110mg/dl但低于126mg/dl，或2小时PG读数高于140mg/dl但低于200mg/dl的成人。当用于与来自患者的样品比较时，“糖尿病个体”指空腹血糖水平高于126mg/dl或2小时PG读数高于200mg/dl的成人。“空腹”指无热量摄入至少8小时。“2小时PG”指使患者接受葡萄糖负荷后的血糖水平，所述葡萄糖负荷含有溶解在水中的75g无水葡萄糖当量。所有测试通常称作口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。见例如Diabetes Care，2003，26(11)：3160-3167(2003)。

当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示所述核酸或蛋白质基本上不含在天然状态中与其结合的其他细胞成分。它优选处于均一状态。它可以是干燥的或水溶液。通常使用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来测定纯度和同质性。在制剂中以优势种类存在的蛋白质是基本上纯化的。具体而言，分离的基因从所述基因两侧的可读框分开，并编码不同于目的基因的蛋白质。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条带。特别地，它指所述核酸或蛋白质为至少85％纯、更优选至少95％纯和最优选至少99％纯。

术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限制，所述术语包含含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合性质，并以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另有指出，具体的核酸序列也暗含其保守修饰变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列及明确指出的序列。具体地，可通过产生其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来完成简并密码子取代(Batzer等，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，还应用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，及以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构(即结合氢的α-碳、羧基、氨基和R基团)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的化合物。

“保守修饰变体”应用于氨基酸序列和核酸序列二者。对于具体核酸序列，“保守修饰变体”指编码相同或基本上相同的氨基酸序列或其中所述核酸不编码氨基酸序列的那些核酸，或指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任意给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸被密码子指定的每个位置上，可在不改变编码的多肽的情况下将所述密码子改变成所描述的任意对应的密码子。这种核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰变异的一种。本文编码多肽的每个核酸序列也描述了所述核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，可修饰核酸中的每个密码子(除了AUG(其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)和TGG(其通常是色氨酸的唯一密码子))以产生功能上相同的分子。因此，在每个所述序列中暗含编码多肽的核酸的每种沉默变异。

对于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加(其改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或少部分氨基酸)是“保守修饰变体”，其中所述改变导致化学上类似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表为本领域熟知。这类保守修饰变体是除本发明多态性变体、种间同源物和等位基因之外的，而不排除本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。

以下8组各包含彼此是保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见例如Creighton，Proteins(1984))。

通过在比较窗内比较两条最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中为了两条序列的最佳比对，与不包含添加或缺失的参考序列(例如本发明的多肽)相比，比较窗中的多核苷酸序列部分可包含添加或缺失(即空位)。按如下计算百分比：确定相同核酸碱基或氨基酸残基在两条序列中都存在的位置数以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗中位置的总数并将结果乘以100来产生序列同一性的百分比。

在两条或多条核酸序列或多肽序列的背景中，术语“同一的”或百分比“同一性”指相同序列的两条或更多条序列或子序列。如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目检测定所测量，当在比较窗或指定区域内比较和比对最大对应时，若两条序列具有相同的氨基酸残基或核苷酸的指定百分比(即在指定区域内或未指定时在参考序列的全序列内具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)，则两条序列是“基本上同一的”。本发明提供分别与本文所示例的多肽或多核苷酸(例如SEQ ID NO：1-11中任一个所示例的可变区；SEQID NO：12-24中任一个所示例的可变区段；SEQ ID NO：25-42中任一个所示例的CDR；SEQ ID NO：43-61中任一个所示例的FR；和SEQ ID NO：62-73中任一个所示例的核酸序列)基本上同一的多肽或多核苷酸。可选地，同一性存在于长度为至少约15、25或50个核苷酸的区域内，或更优选长度为100到500或1000或更多个核苷酸的区域内，或参考序列的全长内。对于氨基酸序列，同一性或基本的同一性可存在于长度为至少5、10、15或20个氨基酸，可选地长度为至少约25、30、35、40、50、75或100个氨基酸的区域内，可选地长度为至少约150、200或250个氨基酸的区域内，或参考序列的全长内。对于更短的氨基酸序列(例如20或更少个氨基酸的氨基酸序列)，当根据本文所定义的保守取代来保守地取代一个或两个氨基酸残基时，存在基本的同一性。

为了进行序列比较，通常一条序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标并指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或可指定备选的参数。然后序列比较算法基于程序参数来计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

如本文所用，“比较窗”包含参考任何一个数目相邻位置的区段，所述相邻位置数选自从20到600，通常从约50到约200，更通常从约100到约150，其中在两条序列进行最佳比对后，可将序列与相同数目的相邻位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法为本领域所熟知。例如通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机执行(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手动比对和目检(见例如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995附录))。

适合用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等(1977)Nuc.AcidsRes.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。可通过National Center for Biotechnology Information公开获得用于进行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字串来鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字串比对时，其匹配或满足一定的正值阈值得分T。T被称为邻近字串得分阈值(neighborhood word score threshold)(Altschul等，上文)。这些初始相邻字串命中作为种子用于启动搜索以发现包含它们的更长HSP。字串命中沿每条序列向两个方向延伸，直至累积比对得分可以提高。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，用评分矩阵计算累积得分。当累积比对得分从其最大获得值下降数量X；累积得分因一个或多个负得分残基比对的累积而达到零或以下；或到达任一条序列的末端时，字串命中在每个方向上的延伸就中止。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长3和期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。

BLAST算法也进行两条序列间相似性的统计学分析(见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性的测量是最小总数概率(P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列间偶然发生匹配的概率的指示。例如，在测试核酸与参考核酸的比较中，若最小总数概率低于约0.2、更优选低于约0.01和最优选低于约0.001，则认为核酸与参考核酸相似。

如下文所述，两条核酸序列或多肽基本上相同的指征是，由第一条核酸编码的多肽在免疫学上与针对由第二条核酸编码的多肽产生的抗体交叉反应。因此，例如两条多肽仅通过保守替换而不同时，多肽通常与第二多肽基本上相同。如下文所述，两条核酸序列基本上相同的另一指征是，这两个分子或它们的互补分子在严格条件下彼此杂交。两条核酸序列基本上相同的另一指征是，可以用相同的引物来扩增所述序列。

当用于描述抗原结合区如何在本发明的TrkB结合分子内连接时，术语“连接”包含在物理上连接该区的所有可能的方法。大多数抗原结合区常通过诸如共价键(例如肽键或二硫键)或非共价键的化学键连接，其可以是直接结合(即两个抗原结合区之间无接头)或间接结合(即在两个或更多个抗原结合区之间有至少一个接头分子的辅助)。

术语“受试者”、“患者”和“个体”可互换地指哺乳动物，例如人或非人灵长类哺乳动物。所述哺乳动物也可以是实验室哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠。在一些实施方案中，所述哺乳动物可以是农业哺乳动物(例如马、羊、牛、猪、骆驼)或家养哺乳动物(例如犬、猫)。

术语“治疗可接受量”或“治疗有效剂量”可互换地指足以取得所希望结果(即靶细胞的凋亡)的量。在一些实施方案中，治疗可接受量不诱导或引起不希望的副作用。可以通过首先施用低剂量，然后增加该剂量直到达到所希望的效果来确定治疗可接受量。本发明的TrkB激动抗体的“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”分别可以防止疾障碍状(即与TrkB信号发放的异常低水平相关的障碍的症状，例如由包含BDNF的TrkB配体的缺乏引起)的发作或导致疾障碍状严重度的降低。所述术语还可以分别促进或增加无疾障碍状期的频率和持续时间。“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”还可以分别预防或缓解TrkB激活不足引起的障碍和疾病所引起的损伤或残疾。

如本文所用，术语“呼吸系统障碍”包含但不限于肺膨胀不全、囊性纤维化、Rett综合症(RTT)、哮喘、呼吸暂停(例如睡眠型呼吸暂停)、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、急性呼吸困难、呼吸急促、端坐呼吸、类风湿肺疾病、肺充血或水肿、慢性阻塞性气道疾病(例如肺气肿、慢性支气管炎、支气管哮喘和支气管扩张)、通气不足、匹克威克综合症(Pickwickian Syndrome)、肥胖通气不足综合症、婴儿猝死综合症(SIDS)和呼吸过度。此外，“呼吸系统疾病”还包含已知与遗传缺陷相关的人类病症，如进行性神经性腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)、潮式呼吸障碍(Cheyne-Stokes breathing disorder)、威-普二氏综合症、婴儿猝死综合症、先天性中枢通气不足、弥漫性间质性疾病(例如肉样瘤病、尘肺病、过敏性肺炎、细支气管炎、古德帕斯彻综合症(Goodpasture′s syndrome)、特发性肺纤维化、特发性肺含铁血黄素沉积症、肺泡蛋白沉积症、脱屑性间质肺炎、慢性间质性肺炎、纤维化肺泡炎、hamman-rich综合症(hamman-rich syndrome)、肺嗜酸细胞增多症、弥漫性间质性纤维化、韦格纳肉芽肿病(Wegener′sgranulomatosis)、淋巴瘤样肉芽肿和脂质性肺炎)或肿瘤(例如支气管原癌、细支气管肺泡癌(bronchiolovlveolar carcinoma)、支气管癌、错构瘤和间充质肿瘤)。

附图简述

图1图示包含抗体V区的结构单位的示意图。重链由三个基因家族(重链V、D和J)编码，轻链由两个基因家族(κ或λV和J)编码。这些基因的重组产生完整的V区。在重链的情况下，CDR3序列处于重链V、D和J基因的重组位点，在轻链的情况下，CDR3序列处于处于κ或λV和J的重组位点。

图2图示用人氨基酸序列替换参考抗体氨基酸序列的示意图。

图3图示用ForteBio Octet生物传感器技术，通过生物薄膜干涉技术对结合重组TrkB抗原的Fab进行的分析。这些曲线的数值数据显示于表1和表2中。

图4图示用ForteBio Octet生物传感器技术，通过生物薄膜干涉技术对结合重组TrkB抗原的IgG进行的分析。这些曲线的数值数据显示于表3中。

图5图示比对的Fab克隆TR134-4(SEQ ID NO：76和80)、TR135-8(SEQ ID NO：76和81)、TR139-2(SEQ ID NO：76和82)、TR151-1(SEQ IDNO：77和82)和TR144-1(SEQ ID NO：78和81)的可变区氨基酸序列(FR1到CDR3)和与最接近的种系的单个人可变区翻译Vh1-02(SEQ ID NO：15)或VkII A23(SEQ ID NO：79)的比较。所有Fab Vh区的FR4(未显示)均来自人种系JH4，并具有序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：50)。所有Fab Vk区的FR4(未显示)均来自人种系Jk2，并具有序列FGQGKLEIK(SEQ ID NO：61)。框出CDR，与种系序列(除CDR3“BSD”序列外)中的相应位置不同的残基为黑体。下划线为对CDR3的亲和力成熟改变，斜体为Vk CDR3中的种系替换残基。

图6图示比对的IgG克隆TR127-2(SEQ ID NO：76)、TR143-3(SEQ IDNO：78)、TR154-2(SEQ ID NO：77)、TR119-1(SEQ ID NO：84)、TR129-1(SEQ ID NO：85)和TR137-1(SEQ ID NO：86)的可变区氨基酸序列(FR1到CDR3)和与最接近的种系的单个人可变区翻译Vh1-02(SEQ ID NO：15)或VkJI A23(SEQ ID NO：83)的比较。所有IgG Vh区的FR4(未显示)均来自人种系JH4，并具有序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：50)。所有IgG Vk区的FR4(未显示)均来自人种系Jk2，并具有序列FGQGKLEIK(SEQ ID NO：61)。框出CDR，与种系序列(除CDR3“BSD”序列外)中的相应位置不同的残基为黑体。下划线为对CDR3的亲和力成熟改变，斜体为Vk CDR3中的种系替换残基。

图7图示在ELISA测定中通过提高A10F18.2IgG的浓度来阻断Fab与人V区段的结合。

图8A-D图示NVP-LFD253(A)、NVP-LFD254(B)、NVP-LFC325(C)或NVP-LFC327(D)与人Fc-TrkB的结合。

图9A-D图示显示NVP-LFD253、NVP-LFD254、NVP-LFC325和NVP-LFC327与人TrkB-Fc融合蛋白特异性结合而不与人TrkB-Fc或TrkC-Fc融合蛋白特异性结合的ELISA测定。通过检测其与三个不同的Trk家族成员(TrkA、TrkB和TrkC)的相互作用，评估纯化的2μg/ml的IgG的特异性。二抗(Secondary Ab)是仅用山羊-抗-人Fab-HRP检测抗体阻断和处理的重复试验。

图10A-D 图示NVP-LFD253、NVP-LFD254、NVP-LFC325和NVP-LFC327在失巢凋亡测定中的激动剂活性评估。在RIE-TrkB细胞上评估纯化的IgG 48小时。(-)表示未用抗体处理的细胞。

图11A-D图示IgG抗体NVP-LFD253、NVP-LFD254、NVP-LFC325和NVP-LFC327的代表性Biacore动力学描迹。将Fc-TrkB固定于Biacore芯片表面。IgG的系列稀释液以30μL/min流过芯片。结合期为300秒，随后是在自由缓冲液流中持续1200秒的解离期。

图12图示抗-TrkB的激动剂mAb长期治疗延长Mecp2-Bird小鼠的寿命。Mecp2tm1.1Bird裸鼠出现患Rett综合症的患者的许多核心的呼吸功能障碍，包含：提高的呼吸周期持续时间的可变性、急促和慢速呼吸频率的交替期、呼吸暂停的发生、提高的平均呼吸频率(和分通气量)。小鼠最终死于致死性呼吸衰竭。抗体A10指亲本小鼠单克隆抗体，其与本文所述改进的抗-TrkB抗体激动剂共有互补结合决定区和最小结合决定簇。

图13图示用抗-TrkB激动剂mAb处理的Mecp2-Bird小鼠中呼吸功能的改善。通过全身体积描记法评估用抗-TrkB激动剂mAb处理后的Mecp2小鼠的呼吸参数。未处理的Mecp2小鼠在增强的呼吸暂停(Penh)中显示年龄依赖的增加，增强的呼吸暂停在mAb治疗的动物中降低。年龄依赖的Penh可以指示增加的气道阻力，可以表型模拟RTT患者中的瓦尔萨尔瓦动作并发症。mAb处理后在野生型和Mecp2小鼠中都观察到了增加的呼吸频率和减少的吸气时间。对相同基因型、相反治疗，^＊p＜.05、^＊＊p＜.01；对相反基因型、相同治疗，#p＜.05、##p＜.01、###p＜.001；MeCP2-KO/A10对MeCP2-WT/SAL，$p＜.05、$$p＜.01、$$$p＜.001。单因素方差分析后进行t检验。

图14图示对食蟹猴(Cynomolgus monkey)静脉内施用抗-TkB激动剂mAb LFI987后对食物摄取和体重的影响。通过将HC可变区转入沉默IgG1主链，将抗体克隆LFD253转化为LFI987。在第1、5和8天按0.3和3.0mg/kg LFI987静脉注射动物3次。数据为平均值±SE；n＝4-6。通过重复测量方差分析后进行Dunnett’s test，对基线^＊P＜0.05，LFI987以剂量依赖的方式显著增加食物摄取和体重。

发明详述

1.引言

本发明提供改进的TrkB激动剂抗体。本发明的改进的TrkB激动剂抗体特异性结合TrkB并激活TrkB。发现本发明的TrkB激动剂抗体用于减轻、抑制和预防TrkB激动剂配体缺乏(例如BDNF缺乏)引起的障碍和疾病的症状。可用本发明的抗-TrkB激动剂抗体治疗的示例性疾病包含Rett综合症、WAGR综合症、MC4R突变引起的肥胖症和恶病质/衰竭(wasting)综合症(例如由癌症、衰老、进食障碍或药物引起)。发现抗-TrkB激动剂抗体还用于在有需要的受试者中降低血糖水平。此外，本发明的TrkB激动剂抗体用于预防体重增加。TrkB激活用于预防高血糖症及其相关病症、肥胖症、前驱糖尿病和II型糖尿病。

2.改进的抗-TrkB抗体总览

本发明的抗体特异性结合原肌球蛋白相关激酶(Trk)受体酪氨酸激酶B(TrkB)。为此，抗体可以结合配体结合位点并阻断天然配体(例如脑衍生神经营养因子(BDNF)或神经营养蛋白-3)的结合，作为拮抗剂或作为激动剂。在一些实施方案中，本发明的抗-TrkB抗体作为TrkB受体的激动剂。TrkB抗体激动剂是特异性结合TrkB并激活或增强TrkB介导的细胞内信号发放的抗体。抗-TrkB抗体可选地可以是多聚化的，并按照本发明的方法使用。抗-TrkB抗体可以是全长四聚体抗体(即具有两条轻链和两条重链)、单链抗体(例如ScFv)或包含形成一个或多个抗原结合部位并赋予TrkB结合特异性的抗体片段的分子，例如包含重链和轻链可变区(例如Fab′或其他类似片段)。

可以通过本领域已知的任意方法产生抗-TrkB抗体片段，其包括但不限于重组表达、化学合成和抗体四聚体的酶消化，而可通过例如杂交瘤或重组产生来获得全长单克隆抗体。重组表达可来自本领域已知的任意适合的宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。当存在时，抗-TrkB抗体的恒定区可以是适合的任意类型或亚型，可以选择其是来自待通过本方法治疗的受试者的物种(例如人、非人灵长类动物或其他哺乳动物，例如农业哺乳动物(马、羊、牛、猪、骆驼)、家养哺乳动物(例如犬、猫)或啮齿类动物(例如大鼠、小鼠、仓鼠、兔))。

本发明的抗-TrkB抗体或抗原结合分子还包含具有骆驼主链(scaffold)的单结构域抗原结合单位。骆驼家族的动物包含骆驼、美洲驼(llamas)和羊驼(alpacas)。骆驼产生无轻链的功能性抗体。重链可变(VH)结构域自主折叠并作为抗原结合单位独立发挥功能。与经典的抗原结合分子(Fab)或单链可变片段(scFv)中的六个CDR相比，其结合表面仅涉及三个CDR。骆驼抗体能够获得与常规抗体相当的结合亲和力。可以用本领域熟知的方法产生具有本文所示例的抗-TrkB抗体的结合特异性的基于骆驼主链的抗-TrkB分子，例如Dumoulin等，Nature Struct.Biol.11：500-515，2002；Ghahroudi等，FEBS Letters 414：521-526，1997；和Bond等，J MolBiol.332：643-55，2003。

本发明的改进的抗-TrkB抗体是具有V区序列的经改造的人抗体，所述V区序列与人种系V区序列具有基本的氨基酸序列同一性，同时保留参考抗体的特异性和亲和力。见美国专利公开号2005/0255552和美国专利公开号2006/0134098，二者在此引用作为参考。改进方法是从参考抗体的可变区鉴定出决定抗原结合特异性所需的最小序列信息，并将该信息转移至人部分V区基因序列的文库，产生人抗体V区的表位聚焦文库(epitope-focused library)。可用基于微生物的分泌系统表达文库成员为抗体Fab片段，并用例如菌落转移结合测定针对结合抗原的Fab筛选该文库。见例如美国专利公开号2007/0020685。可以进一步表征阳性克隆来鉴定具有最高亲和力的克隆。产生的经改造的人Fab保留亲本(参考抗-TrkB抗体)的结合特异性，与亲本抗体相比通常具有相等的或更高的亲和力，且与人种系抗体V区相比具有具有高度序列同一性的V区。

产生表位聚焦文库所需的最小结合特异性决定簇(BSD)通常由重链CDR3(“CDRH3”)内的序列和轻链CDR3(“CDRL3”)内的序列所代表。BSD可以包含CDR3的部分或全长。BSD可以由连续或非连续的氨基酸残基组成。在一些情况下，从人V区段序列构建表位聚焦文库，所述V区段连接至来自包含BSD的参考抗体的独特的CDR3-FR4区和人种系J区段序列(见图1和美国专利公开号2005/0255552)。备选地，可通过连续的盒式替换产生人V区段文库，其中最初通过人序列文库仅替换部分参考抗体V区段。然后在第二文库筛选中重组鉴定出的在参考抗体氨基酸序列环境中支持结合的人“盒”，以产生全人V区段(见美国专利公开号2006/0134098)。

在每种情况下，用包含来自参考抗体的特异性决定簇的配对的重链和轻链CDR3区段、CDR3-FR4区段或J区段来限制结合特异性，以使从文库获得的抗原结合剂保留参考抗体的表位特异性。为了鉴定具有最佳结合动力学的抗体，在文库构建过程中可以在每条链的CDR3区中引入其他成熟改变。产生的经改造的人抗体具有衍生自人种系文库的V区段序列、保留来自CDR3区内的短BSD序列和具有人种系构架区4(FR4)。

因此，在一些实施方案中，抗-TrkB抗体在衍生自起始或参考单克隆抗体的重链和轻链的CDR3内包含最小结合序列决定簇(BSD)。重链和轻链可变区(CDR和FR)的其余序列(例如V区段和J区段)来自相应的人种系氨基酸序列和亲和力成熟的氨基酸序列。V区段可以选自人V区段文库。可以通过亲和力成熟完成进一步的序列精炼。

在另一个实施方案中，抗-TrkB抗体的重链和轻链包含来自相应的人种系序列(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)的人V区段(例如选自人V区段文库)和来自起始单克隆抗体的CDR3-FR4序列区段。可以通过用相应的人种系序列替换序列区段和/或通过亲和力成熟来进一步精炼CDR3-FR4序列区段。例如，可以用相应的人种系序列替换围绕BSD的FR4和/或CDR3序列，同时保留来自起始单克隆抗体CDR3的BSD。

在一些实施方案中，重链V区段的相应的人种系序列是Vh1-02。在一些实施方案中，重链J区段的相应的人种系序列是JH4。在一些实施方案中，重链J区段包含人种系JH4部分序列WGQGTLVTVSS(SEQ IDNO：50)。来自人种系JH4的全长J区段是YFDYWGQGTLVTVSS(SEQID NO：74)。按照免疫球蛋白可变区基因标准命名法命名可变区基因。可通过万维网在例如ImMunoGeneTics(IMGT)、V-base和PubMed数据库中获得当前的免疫球蛋白基因信息。还见Lefranc，Exp Clin Immunogenet.2001；18(2)：100-16；Lefranc，Exp Clin Immunogenet.2001；18(3)：161-74；ExpClin Immunogenet.2001；18(4)：242-54；和Giudicelli等，Nucleic Acids Res.2005年1月1日；33(Database版本)：D256-61。

在一些实施方案中，轻链V区段的相应的人种系序列是VKII A23。在一些实施方案中，轻链J区段的相应的人种系序列是Jk2。在一些实施方案中，轻链J区段包含人种系Jk2部分序列FGQGTKLEIK(SEQ IDNO：61)。来自人种系Jk2的全长J区段是YTFGQGTKLEIK(SEQ IDNO：75)。

在一些实施方案中，重链V区段与氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(G/A)Y(D/Y)MHWVRQAPGQGLEWMGWI(D/N)P(N/R)SG(G/D)T(N/R/S)Y(A/K)QKFQGRVTMTRDTSISTAYMEL(H/S)RL(R/T)SDDTAVYYC(A/T)(G/R)(SEQ IDNO：16)具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，轻链V区段与氨基酸序列D(I/V)VMTQ(S/T)PLS(L/S)PVTLGQPASISCRSSQSL(L/V)HS(D/N)GNTYL(N/S)W(L/Y)QQ(K/R/T)PGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO：24)具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些实施方案中，重链V区段与选自SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些实施方案中，轻链V区段与选自SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些实施方案中：

i)重链CDR3包含氨基酸序列基序V(T/V)(S/T/R/N)WFAY(SEQ IDNO：34)；和

ii)轻链CDR3包含氨基酸序列基序(S/M)QGT(H/A)(E/V/I)PYT(SEQID NO：42)。

在一些实施方案中：

i)重链CDR3包含选自VTTWFAY(SEQ ID NO：32)和VTSWFAY(SEQ ID NO：33)的氨基酸序列；和

ii)轻链CDR3包含选自MQGTHEPYT(SEQ ID NO：40)和MQGTHVPYT(SEQ ID NO：41)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含：包含氨基酸序列(A/G)Y(D/Y)MH(SEQ ID NO：27)的CDR1；包含氨基酸序列WI(D/N)P(N/R)SG(G/D)T(N/R/S)Y(A/K)QKFQG(SEQ IDNO：31)的CDR2；和包含氨基酸序列V(T/V)(S/T/R/N)WFAY(SEQ IDNO：34)的CDR3。

在一些实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含氨基酸序列RSSQSL(L/V)HSNGNTYL(N/S)(SEQ ID NO：38)的CDR1；包含氨基酸序列KISNRFS(SEQ ID NO：39)的CDR2；和包含氨基酸序列(S/M)QGT(H/A)(E/V/I)PYT(SEQ ID NO：42)的CDR3。

在一些实施方案中，重链可变区包含：包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的FR1；包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的FR2；包含SEQ IDNO：49的氨基酸序列的FR3；和包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的FR4。鉴定的氨基酸序列可以具有一个或多个取代的氨基酸(例如来自亲和力成熟)或一个或两个保守性取代的氨基酸。

在一些实施方案中，轻链可变区包含：包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的FR1；包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的FR2；包含SEQ IDNO：60的氨基酸序列的FR3；和包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列的FR4。鉴定的氨基酸序列可以具有一个或多个取代的氨基酸(例如来自亲和力成熟)或一个或两个保守性取代的氨基酸。

本发明的抗-TrkB抗体的可变区在其全长内一般与相应的人种系可变区氨基酸序列具有至少约90％，例如至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的整体可变区(例如FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)氨基酸序列同一性。例如，抗-TrkJB抗体的重链可以与人种系可变区Vh1-02/JH4具有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。抗-TrkB抗体的轻链可以与人种系可变区VKII A23/Jk2具有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，仅添加、缺失或取代构架区内的氨基酸。在一些实施方案中，序列同一性比较排除了CD3。

在一些实施方案中，本发明的抗-TkkB抗体包含与SEQ ID NO：4的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，且包含与SEQ IDNO：11的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。

在一些实施方案中，本发明的抗-TrkB抗体包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，且包含与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。

在一些实施方案中，本发明的抗-TrkB抗体包含与SEQ ID NO：1的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，且包含与SEQ IDNO：8的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区(即克隆LFC325)。

在一些实施方案中，本发明的抗-TrkB抗体包含与SEQ ID NO：1的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，且包含与SEQ IDNO：9的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区(即克隆LFC327)。

在一些实施方案中，本发明的抗-TrkB抗体包含与SEQ ID NO：1的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，且包含与SEQ IDNO：10的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区(即克隆LFD253)。

在一些实施方案中，本发明的抗-TrkB抗体包含与SEQ ID NO：3的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，且包含与SEQ IDNO：8的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区(即克隆LFD254)。

对于已鉴定的长度少于20个氨基酸的氨基酸序列，可以容忍一个或两个保守氨基酸取代而仍然保留所希望的特异性结合和/或拮抗剂活性。

本发明的抗-TrkB抗体一般将以低于约10^-8M或10^-9M的平衡解离常数(K_D)结合TrkB，例如低于约10^-10M或10^-11M，在一些实施方案中低于约10^-12M或10^-13M。

3.鉴定TrB激动剂抗体的测定法

可通过产生抗-TrkB抗体，然后测试每个抗体触发TrkB介导事件(例如启动SH-SY5Y细胞的分化和/或树突化(dendrification))的能力、测量响应于用潜在TrkB激动剂处理细胞而从失巢凋亡(细胞基质相互作用的丧失引起的凋亡)逃离，或使用BaF3/TrkB细胞增殖测定来鉴定激动剂抗体。

SH-SY5Y测定法涉及平板接种SH-SY5Y细胞并在有或没有潜在激动剂抗体和/或BDNF的情况下用视黄酸处理细胞，然后测量神经突派生。通常，视黄酸单独将诱导少量的神经突派生。BDNF单独将不诱导显著的神经突派生，并且抗体单独将不诱导显著的神经突派生。然而，用视黄酸、BDNF和抗体处理的细胞显示广泛的神经突派生。示例性SH-SY5Y测定法描述于Kaplan DR等，Neuron 11：321-331(1993)中。在测试抗-TrkB激动剂抗体的测定中，用测试抗体代替BDNF。将阳性对照细胞暴露于BDNF。

BaF3造血细胞/TrkB细胞增殖测定法涉及测量由TrkB受体的激动作用刺激的细胞增殖。例如，BaF3细胞在具有IL-3的完全RPMI培养基中生长并用表达TrkB的逆转录病毒感染。细胞在缺少IL-3的情况下进行洗涤并接种平板。在适当孵育后，测量潜在的激动剂抗体和细胞存活(例如使用发光细胞生存力检测试剂，如Cell-Titer Glo^TM)。用BDNF孵育阳性对照细胞。

失巢凋亡测定法涉及重悬大鼠肠上皮(RIE)/TrkB细胞(例如在DMEM培养基中)并可选地在多孔容器中使细胞接触潜在的抗体激动剂(例如，2.5x10⁴个细胞，10ul的1-20μg/ml抗体)。在存在或缺少BDNF对照的情况下孵育混合物，然后测量细胞生存力(例如使用发光细胞生存力检测试剂，如Cell-Titer Glo^TM)。示例性失巢凋亡测定法描述于Douma等，Nature 430：1034-1039(2004)中。

也可以在SH-SY5Y细胞上评估TrkB激动剂保护细胞免受长春碱和顺铂毒性的能力。该测定法已描述于例如Scala等，Cancer Res.56(16)：3737-42(1996)；和Jaboin等，Cancer Res.62(22)：6756-63(2002)中。

4.使用抗-TrkB激动剂抗体的方法

本发明的抗-TrkB激动剂抗体可以用来治疗或缓解从提高的TrkB活性受益的任意疾病或病症，其包含呼吸系统障碍和疾病，尤其是TrkB信号发放缺乏引起的障碍和疾病；BDNF缺乏引起的障碍和疾病；和TrkB信号发放缺乏引起的下部肠道活动力疾病(lower intestinal gut motility disease，例如炎性肠综合症)。

本发明的TrkB激动抗体与TrkB相互作用，从而能够调节TrkB功能。本发明的TrkB激动抗体可以调节(例如促进)TrkB的一种或多种生物学功能。例如，TrkB激动剂抗体可以调节TrkB的二聚化和随后的TrkB胞内结构域上特定酪氨酸残基的自磷酸化。作为另一个实例，TrkB激动剂抗体可以起始TrB相关的胞内信号发放级联(例如促分裂原活化蛋白激酶途径、磷脂酰肌醇3-激酶途径和PLCγ途径)，其导致神经元死亡的抑制、神经突派生的促进和神经营养蛋白的其他作用。

在一些实施方案中，本文所述TrkB激动剂抗体作为BDNF模拟物，并可以用来再现BDNF和其他TrkB激动剂配体的营养活性，从而发挥神经保护和神经营养作用。本方法的抗-TrkB激动剂抗体可与BDNF竞争结合TrkB，从而激活、增强或延续TrkB途径的激活和信号发放。在一些实施方案中，所述TrkB激动剂抗体结合TrkB配体结合结构域，从而与BDNF竞争结合TrkB。

因此，TrkB激动抗体可以用来在体外和体内促进TrkB途径信号发放。本发明的TrkB激动抗体用于例如诊断、抑制、预防、缓解其症状、防御和治疗与TrkB途径信号发放的异常低水平相关的障碍(例如由染病受试者中BDNF缺乏或另一TrkB激动剂配体缺乏引起)。与TrkB信号发放的异常下调相关的障碍的非限制性实例包含例如Rett综合症(RTT)，其表征为编码MeCP2(其直接结合BDNF)的基因中的突变；由TrkB功能丧失突变引起的严重肥胖症和发育迟缓(Giles，S.等(2004)Nature Neuroscience 7：1187-9)；维尔姆斯瘤；无虹膜；泌尿生殖异常和智力发育迟缓(WAGR)综合症(Han等，N Engl J Med(2008)359(9)：918-27)；黑皮质素受体MC4R缺乏引起的肥胖症(Farooqi和O’Rahilly，Endocrine Rev(2006)27(7)：710-18)；恶病质/肌肉萎缩综合症(Lin等，PloS，3(4)：e1900；WO 2007/088476)。

因此，本发明提供治疗、诊断、预防和/或缓解由BDNF缺乏引起的障碍和疾病(例如Rett综合症(RTT)、WAGR综合症、黑皮质素受体MC4R缺乏引起的肥胖症、恶病质/肌肉萎缩综合症)的方法，该方法包括施用药物组合物，该药物组合物包含治疗或预防有效量的本文所述TrkB激动抗体和药物载体。在一些实施方案中，在全身或外周施用本文所述的抗-TrkB抗体，例如口服施用、吸入施用、静脉内施用或腹膜内施用。

本文所述抗-TrkB抗体还用于治疗、诊断、预防和/或缓解呼吸系统疾病和障碍，尤其是由TrkB活性缺乏引起的疾病和障碍。示例性呼吸系统障碍包含Rett综合症、睡眠型呼吸暂停、匹克威克综合症和本文所述的其他障碍。

在一些实施方案中，药物组合物还包含用于治疗、诊断、预防和/或缓解呼吸窘迫(例如呼吸困难)症状的分开和独立的药剂，如去甲肾上腺素途径和/或5-羟色胺途径的小分子激活剂(实例非限制性地包含三环抗抑郁剂地昔帕明(DMI)、5-羟色胺1A受体部分激动剂、丁螺环酮和更有选择性的抗抑郁剂氟西汀和瑞波西汀)、谷氨酸能AMPA受体的激活剂(例如AMPAkine CX54、前列腺素、孕酮)或TrkB活性的增效剂(例如蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂)。

在一些实施方案中，在治疗、诊断、预防和/或缓解呼吸系统障碍或呼吸窘迫症状中有效的治疗和/或预防有效量的第二药剂与TrkB抗体激动剂(或包含TrkB抗体激动剂的药物组合物)组合对个体施用。在一些实施方案中，第二药剂和TrkB抗体激动剂(或包含TrkB抗体激动剂的药物组合物)作为混合物施用。在一些实施方案中，第二药剂选自去甲肾上腺素途径和/或5-羟色胺途径的小分子激活剂(实例包含三环抗抑郁剂地昔帕明(DMI)、5-羟色胺1A受体部分激动剂、丁螺环酮和更有选择性的抗抑郁剂氟西汀和瑞波西汀)、谷氨酸能AMPA受体的激活剂(例如AMPAkineCX54、前列腺素、孕酮)或TrkB活性的增效剂(例如蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂)。

本发明还提供治疗、诊断、预防和/或缓解胞内TrkB信号发放缺乏引起的呼吸窘迫症状或呼吸系统障碍的方法，其包括施用抗-TrkB激动抗体或包含抗-TrB激动抗体的药物组合物。所述症状包含但不限于呼吸困难(例如喘鸣或哮鸣、屏气、浅呼吸、过度换气、延长的窒息)、血液氧合作用弱或降低(例如紫绀，例如由氧气吸收受损、肺部血液灌注不足引起)、降低的去甲肾上腺素(NE)含量、髓质中表达酪氨酸羟化酶(TH)的神经元减少和胸痛。在一些实施方案中，所述方法包括对个体施用如本文所述的治疗或预防有效量的酪氨酸激酶受体B(TrkB)的抗体激动剂。在一些实施方案中，所述方法包括对个体施用包含治疗或预防有效量的TrkB激动抗体和药物载体的药物组合物。在一些实施方案中，所述个体患有Rett综合症和/或正经历呼吸窘迫的一种或多种症状。在一些实施方案中，所述个体易感呼吸窘迫的症状。

在一些实施方案中，本发明的TrkB激动剂抗体用于治疗或缓解个体中的高血糖症和/或糖尿病或其症状。备选地，或组合，本发明抗体可用于减轻需要减轻体重的个体体重。在一些实施方案中，所述抗体用于缓解肥胖症。这尤其有用，因为肥胖个体更易于发生胰岛素抗性和II型糖尿病。

本发明提供抑制神经细胞死亡的方法，其包括施用本文所述TrkB激动抗体(或包含TrkB激动抗体的药物组合物)。例如，本发明还提供通过对有需要的个体施用本发明的TrkB激动剂抗体，来治疗或预防神经变性疾病或中枢神经系统(CNS)疾病的方法。示例性CNS疾病包含例如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病或ALS病。

提高的TrkB激活也涉及药物滥用的缓解。见例如美国专利公开号2005/0203011。因此，本发明提供通过向需要其的个体施用本发明的TrkB激动剂抗体来缓解药物(例如酒精、烟碱和/或麻醉药)滥用和药物依赖性的方法。

在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是单链抗体。在一些实施方案中，抗体不结合酪氨酸激酶受体A或酪氨酸激酶受体C。在一些实施方案中，抗体不结合神经营养蛋白受体p75NR。在一些实施方案中，抗体特异性结合人TrkB，对其他物种的TrkB(例如非人灵长类动物或小鼠的TrkB)具有最小的结合或无结合。在一些实施方案中，抗体特异性结合人TrkB，也结合其他物种的TrkB(即与包含小鼠、大鼠和/或非人灵长类动物(例如食蟹猴或猕猴(rhesus monkey))的其他物种的TrkB交叉反应)。

5.药物组合物

本发明提供包含与可药用载体配制在一起的抗-TrkB抗体或抗原结合分子的药物组合物。组合物可以额外包含适合用于治疗或预防给定障碍的其他治疗剂。药物载体增强或稳定组合物，或便于组合物的制备。可药用载体包含生理上相容的溶剂、分散剂、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。

可以通过本领域已知的多种方法施用本发明的药物组合物。给药的途径和/或模式取决于所希望的结果而不同。优选静脉内、肌内、腹膜内或皮下给药，或在接近靶位点处给药。可药用载体应适合用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、鼻内、吸入、脊柱或表皮给药(例如通过注射或灌注)。取决于给药途径，可以将活性化合物(即抗体、双特异性和多特异性分子)包衣于材料中，以保护该化合物免受酸和其他可失活该化合物的自然条件的作用。

可将抗体单独或与其他合适的成分组合制备成经过吸入施用的气溶胶制剂(即它们可以进行“喷雾”)。可将气溶胶制剂置于加压的可接受喷射剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。

在一些实施方案中，组合物是无菌流体。例如可以通过使用如卵磷脂的包衣、维持在分散相的情况下所需颗粒的大小和使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖类、多元醇类(如甘露醇和山梨醇)和氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝或明胶)，可以产生可注射组合物的长期吸收。

可以按照本领域熟知和常规实施的方法制备本发明的药物组合物。可药用载体部分决定于所施用的具体组合物以及施用该组合物的具体方法。因此，存在本发明药物组合物的多种适合的制剂。配制抗体和确定适合剂量及时间安排的可应用的方法可见于例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，2005，Lippencott Williams&Wilkins(2006)；Martindale：The Complete Drug Reference，Sweetman，2005，London：Pharmaceutical Press.；Martindale，Martindale：The Extra Pharmacopoeia，第31版，1996，Amer Pharmaceutical Assn；Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978，每篇文献在此引用作为参考。

优选在GMP条件下生产药物组合物。通常，在本发明的药物组合物中使用抗-TrkB抗体的治疗有效剂量或功效(efficacious)剂量。通过本领域技术人员已知的常规方法将抗-TrkB抗体配制入可药用剂型中。调节剂量方案以提供所希望的反应(例如治疗反应)。为确定治疗或预防有效剂量，可以施用低剂量，然后增加剂量直至以最小的不希望的副作用或无不希望的副作用达到所希望的反应。例如，可以以单次快速浓注施用、可以随时间推移施用几个分份剂量或可以如治疗情况的急迫性所指示按比例降低或增加剂量。为了给药的方便和剂量的一致性，以剂量单位形式配制肠胃外组合物尤其有利。如本文所用，剂量单位形式指为待治疗患者包装为单个剂量的物理上分离的单位；每个单位包含计算为与所需药物载体组合产生所希望疗效的预定量的活性化合物。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以不同，以在对患者无毒性的情况下，针对具体患者、组合物和给药方式获得有效达到所希望的治疗反应的活性成分量。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，所述药代动力学因素包含所使用的本发明具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性；给药途径；给药时间；所使用的具体化合物的排泄速率；治疗持续时间；与所使用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料；所治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和既往病史等因素。

医生或兽医可以在低于达到希望的疗效所需的水平开始施用药物组合物中所用的本发明抗体，并逐渐增加剂量直至达到希望的效果。一般而言，本发明组合物的有效剂量取决于许多不同因素而不同，所述因素包含特治疗的具体疾病或病症、给药方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人或动物、施用的其他药物和处理是预防性的或治疗性的。需逐步增加剂量，以优化安全性和有效性。对于用抗体给药，剂量在约0.0001到100mg/kg宿主体重、更通常在0.01到5mg/kg宿主体重间的范围内。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg体重的范围内。示例性治疗方案需每两周给药一次或每月给药一次或每3-6个月给药一次。

在药剂是核酸的实施方案中，剂量一般可以在约0.1mg/kg体重至达到约100mg/kg体重间的范围内，例如在约1mg/kg体重到50mg/kg体重的范围内。在一些实施方案中，约1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50mg/kg体重。

可以以单剂量或分割的剂量施用抗体。通常在多种场合施用抗体。单剂量间的间隔可以是每周、每个月或每年。如通过测量患者抗-TrkB抗体的血液水平所指示，间隔可以是不定期的。在一些方法中，调节剂量以达到1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中达到25-300μg/ml的血浆抗体浓度。备选地，抗体可以作为持续释放制剂施用，其中需要较不频繁的给药。剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期而变化。一般，人源化抗体显示比嵌合抗体和非人抗体长的半衰期。给药的剂量和频率可以取决于处理是预防性的或治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时期内按相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生接受治疗。在治疗性应用中，有时需要在相对短的间隔的相对高的剂量，直至疾病的进程减缓或终止，优选直至患者显示疾障碍状的部分或彻底缓解。此后，可对患者实施预防性方案。

TrkB抗体激动剂可与已知有益于减轻体重、降低血糖水平、治疗糖尿病或缓解糖尿障碍状、治疗神经变性疾病或减少药物滥用的药剂组合使用。用于治疗糖尿病的示例性药剂包含例如胰岛素；磺酰脲类(例如格列吡嗪(Glipizide)或格列美脲(Amaryl))和促胰岛素剂类(例如那格列奈(nateglinide)和瑞格列奈(repaglinide))；二甲双胍；PPARγ激动剂(例如罗格列酮(rosiglitizone)和吡格列酮(pioglitazone))及PPARα激动剂、PPARδ激动剂、PPARα/γ双激动剂和PPARα/γ/δ泛激动剂；α-葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖(Acarbose))；DPP-IV抑制剂(例如vildagliptin)；和GLP-1/GLP-1类似物(例如依泽那太(exenatide))。用于治疗肥胖症的示例性药剂包含例如脂肪酶抑制剂(例如奥利司他(orlistat))；西布茶明；CB-1抑制剂(例如利莫那班(rimonabant))；托吡酯；糊精/糊精类似物(例如普兰林肽(pramlintide))、瘦素(leptin)、PYY/PYY类似物；和GLP-1/GLP-1类似物(例如依泽那太)。

活性药剂可与TrkB激动剂抗体以混合物的形式一起施用，或者各自分别施用。抗体药剂和其他活性药剂可以但不必同时施用。

实施例

提供以下实施例来说明而非限制本发明。

实施例1

以下实施例提供与人种系V区序列具有基本的氨基酸序列同一性的抗-TrkB抗体的构建和筛选。

方法

V区的亚克隆

从起始单克隆抗体A10F18.2亚克隆V区。用PCR扩增V重链和Vκ区的V基因，并参入适合用于克隆入表达载体的限制酶位点。将V区克隆为Fab片段并在大肠杆菌(E.coli)中从表达载体表达。测试参考Fab的TrkB抗原结合，并称之为TR3-1。

还将V区克隆入IgG表达载体。使用PCR扩增和具有附加的限制位点的引物，将Vh区扩增并克隆入表达载体，该表达载体包含人IgG1恒定区，并赋予氨苄青霉素(ampicillan)和新霉素抗性。使用PCR扩增和具有附加的限制位点的引物，将Vk区扩增并克隆入表达载体，该表达载体包含人κ恒定区，并赋予氨苄青霉素和潮霉素抗性。在多种组合中测试这些载体以产生一组全IgG用于功能分析。

抗体纯化

通过用表达载体从大肠杆菌中分泌来表达Fab片段。细胞在2xYT培养基中生长至OD600为0.6。用IPTG于33℃诱导表达3小时。从周质馏分中获得组装的Fab，并按照标准方法，通过使用Streptococcal G蛋白(HiTrap Protein G HP柱；GE Healthcare)的亲和层析来纯化。将Fab洗脱于pH 2.0的缓冲液中，立即调节至pH 7.0，并对PBS pH 7.4(PBS无钙和镁)透析。

从瞬时转染的CHO细胞的培养基(无血清)制备IgG。按照标准方法，通过使用A蛋白(HiTrap Protein A HP柱；GE Healthcare)的亲和层析来纯化IgG。将Fab洗脱于pH 2.7的缓冲液中，立即调节至pH 7.0，并对PBS pH 7.4(PBS无钙和镁)透析。

一般ELISA

通过在4℃孵育过夜将100ng重组Fc-TrkB抗原结合至96孔微量滴定板。用5％PBS-Tween(“PBST”)中的牛奶溶液于33℃封闭微量滴定板1小时。将纯化的Fab稀释在PBS中，并向每个孔中加入50μl。在33℃孵育1小时后，用PBST漂洗微量滴定板3次。向每个孔中加入50μl抗-人-κ链HRP缀合物(Sigma；在PBST中稀释至0.1ng/ml)，并在33℃孵育微量滴定板40分钟。将微量滴定板用PBST洗3次，用PBS洗1次。向每个孔中加入100μl 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(“TMB”)底物(Sigma)，并在室温孵育微量滴定板约5分钟。向每个孔中加入100μl 0.2N H₂SO₄终止反应。在分光光度计中于450nm读板。

阻断ELISA

用100ng Fc-TrkB抗原包被ELISA板。A10F18.2IgG的2倍稀释系列与抗原在室温孵育1小时。漂洗去未结合的IgG，向每个孔中加入50nMFab溶液并在室温孵育1小时。漂洗去未结合的Fab，并用抗-人κ-HRP缀合物检测结合的Fab。

菌落转移结合测定(“CLBA”)

基本上按美国专利公开号2005/0255552和2006/0134098所述，用抗原Fc-TrkB包被的硝酸纤维素滤膜进行Fab片段文库的筛选。

使用ForteBio的亲和力测量

用ForteBio Octet生物传感器分析IgG和Fab片段的结合动力学。按照产家的方法用EZ-link生物素化试剂盒(Pierce)将重组Fc-TrkB抗原生物素化。然后将抗原偶联至链霉亲和素包被的传感器(ForteBio)。用生物薄膜干涉分析和产家提供的软件实时监测Fab结合。从测定的结合常数和解离常数计算亲和力。

使用Biacore的亲和力测量

所有Biacore试剂均购自GE Healthcare分部Biacore(Piscataway，NJ)。用光学生物传感器Biacore S51，通过表面等离振子共振测量完成结合动力学参数的测定。此技术允许配体与受体结合(ka)和解离(kd)的微观速率常数的无标签测量。因此其尤其适合用于表征抗体-抗原相互作用。

通过将Fc-hTrkB固定于Series S CM-5Biacore传感芯片(经认证的)(Biacore#BR-1005-30)进行关于改进抗体的结合研究。用“Amine Coupling Kit”(Biacore#BR-1000-50)完成Fc融合蛋白质的共价结合。以5μg/ml于pH 4.5的10mM醋酸钠中(Biacore#BR-1003-50)，按10μL/分钟的流速将Fc融合蛋白质连接至EDC激活的葡聚糖表面。

一系列浓度的改进抗体在加入100mM NaCl、0.005％P20的PBS(Biacore#BR-1000-54)中流过捕获了Fc-TrkB的芯片。用Biacore S51评估软件分析产生的传感图。来自所有浓度的数据整体拟合至1∶1 Langmuir模型。

失巢凋亡

在失巢凋亡测定中使用大鼠肠上皮(RIE)-TrkB细胞。用Accutase(Innovative Cell Technologies Inc.，San Diego，CA)分离RIE/TrkB细胞，并重悬于DMEM完全培养基中。用无血清DMEM洗细胞3次，并重悬于含0.1％BSA的无血清DMEM中，其中0.1％BSA稀释自在PBS中的2％BSA贮液(细胞培养级，#A8806-5G Sigma)。然后将细胞按4.2x10⁵细胞/mL、60ml/孔(＝2.5x 10⁴细胞/孔)接种至96孔Corning Costar超低集聚平板(Costar#3474)中。向测试孔中加入10ml TrkB激动剂抗体(保存在PBS中)至终浓度在1-20μg/mL之间。细胞于37℃孵育1小时。向对照孔中加入10ml人BDNF(R&D，以20mg/mL保存在0.1％BSA/PBS中)至终浓度在10-50ng/mL之间。用DMEM(SF)/0.1％BSA稀释BDNF。然后将细胞孵育额外的24-48小时。按80ml/孔加入Cell-Titer Glo(Promega，Madison，WI)并轻摇平板。15分钟后，将液体转入96孔白色透明底平板中并读出发光。

结果

V区的克隆和表达

Fab TR3-1具有与人恒定区融合的来自起始抗体A10F18.2的完整V区，从大肠杆菌纯化Fab TR3-1。在TrkB抗原结合的稀释ELISA测试中，克隆的Fab产生依赖于抗体浓度的结合曲线(数据未显示)。

文库构建和V区盒

从人V区段文库序列构建表位聚焦文库，所述人V区段文库序列连接至包含结合特异性决定簇(“BSD”)和人种系J区段序列的来自起始抗体的独特的CDR3-FR4区。用这些“全长”文库作为“盒”文库构建的基础，在“盒”文库中，最初仅通过人序列文库替换起始抗体中的部分V区段。构建了两种类型的盒。用构架区2内重叠的共同序列通过搭桥PCR(bridge PCR)产生V重链和V κ链二者的盒。以这种方式构建了人V重链1和Vκ链II同种型的“前端”人盒文库和“中间”人盒文库。通过菌落转移结合测定法鉴定出支持结合TrkB抗原的人盒，并根据在ELISA和Forte分析中的亲和力排序。然后在第二文库筛选中重组具有最高亲和力的盒群体，以产生全人V区段。

在鉴定出一群具有人V区段的高亲和力Fab群体后建立亲和力成熟文库。用简并PCR引物突变一组具有人V区段的Fab克隆的共同的BSD序列以产生文库。用菌落转移结合测定法筛选这些诱变文库。针对ELISA和Forte分析的亲和力排序所选择的Fab。鉴定出与参考TR3-1Fab相比时支持相似的或提高的抗原亲和力的突变。

此外，对每个具有人V区段的Fab，在轻链的CDR3中产生对人种系的点突变。将89位(Chothia编号)从S变为M，M是所有人种系VkII区段在该位置编码的氨基酸。

用Forte Octet分析的具有人V区段的Fab和IgG对人TrkB抗原的亲和力

从菌落转移结合测定法中分离具有人V区段的Fab，并通过抗原结合ELISA确认。纯化在抗原结合ELISA中显示强阳性信号的Fab克隆，并通过与参考Fab TR3-1的动力学比较进一步表征。用ForteBio Octet系统分析结合动力学，该系统用于蛋白质-蛋白质相互作用的实时无标签检测。代表性动力学分析显示于图3中。计算的结合常数和解离常数显示于表1和表2中。

表1

表1总结用ForteBio Octet生物传感器技术通过生物薄膜干涉技术对结合重组TrkB抗原的Fab进行的分析，显示结合常数(Ka)、解离常数(Kd)和计算的亲和力(KD)。

表2

表2总结用ForteBio Octet生物传感器技术通过生物薄膜干涉技术对结合重组TrkB抗原的Fab进行的分析，显示结合常数(Ka)、解离常数(Kd)和计算的亲和力(KD)。

Fab克隆TR134-4、TR135-8、TR139-2、TR151-1和TR144-1和参考克隆TR3-1的动力学分析均显示对TrkB抗原的低纳摩尔亲和力。与参考对照相比时，克隆TR139-2和TR151-1始终具有提高的解离速率(off-rate，Kd)和更高的整体亲和力。与参考对照相比时，TR144-1、TR135-8和TR134-4始终具有大致相同的整体亲和力。

还从瞬时转染的CHO细胞制备了具有人V区段的IgG。纯化了IgG制剂，并通过与参考IgG A10F18.2的动力学比较进一步表征。用ForteBioOctet系统分析了具有人V区段的两种IgG的结合动力学，该系统用于蛋白质-蛋白质相互作用的实时无标签监测。代表性动力学分析显示于图4中。计算的结合常数和解离常数显示于表3中。结果显示，具有人V区段的IgG以与参考A10F18.2 IgG相等的亲和力结合抗原。

表3

表3总结用ForteBio Octet生物传感器技术通过生物薄膜干涉技术对结合重组TrkB抗原的IgG进行的分析，显示结合常数(Ka)、解离常数(Kd)和计算的亲和力(KD)。

与人种系序列的同一性百分比

PCR扩增V区，用限制酶消化，并克隆入IgG表达载体。PCR扩增来自TR134-4、TR144-1和TR144-1的重链，并用SalI和NheI消化；将产生的片段克隆入包含人IgG1恒定区的表达载体，以分别产生TR127、TR143和TR154。PCR扩增来自TR134-4、TR135-8和TR139-2的轻链，并用BssHII和BsiWI消化；将产生的片段克隆入包含人κ恒定区的表达载体，以分别产生TR119、TR129和TR137。通过DNA测序确认插入片段的同一性和完整性。

表4

^＊ND＝未进行；

^a与排除CDR3的人种系的百分比同一性

表4说明包含于IgG表达载体内的V区与人种系序列的百分比同一性：所有百分比表示跨越V区的单个人种系序列与排除CDR3 BSD序列的单个人种系序列的同一性。Fab的每个Vh区和Vk区非常接近于人种系氨基酸序列。

显示表位特异性的阻断ELISA

如在方法部分中所述，用纯化的包含人V区段的Fab进行阻断ELISA。结果显示在图7中。所有Fab克隆的结合被浓度逐渐增加的起始单克隆抗体A10F18.2IgG所阻断，表明Fab结合与起始单克隆IgG相同的表位。

通过ELISA结合TrkB蛋白质的抗体

通过瞬时转染产生IgG抗体NVP-LFD253、NVP-LFD254、NVP-LFC325和NVP-LFC327，将其按本文所述纯化，并针对特异性结合Fc-TrkB对其进行评估。用人TrkB和LFD253、LFD254、LFC325或LFC327各抗体的稀释系列进行ELISA。ELISA测定显示LFD253、LFD254、LFC325或LFC327结合人TrkB。见图8。

具有人V区段的IgG(例如LFD253、LFD254、LFC325和LFC327)特异性结合TrkB，但不结合TrkA或TrkC。通过检测其与三个不同的Trk家族成员(TrkA、TrkB和TrkC)的相互作用，评估纯化的处于2μg/ml的IgG抗体的特异性。二抗是仅用山羊-抗-人Fab-HRP检测抗体阻断和处理的重复试验。如图9A-D中所示，LFD253、LFD254、LFC325或LFC327均不结合这些相关Trk家族受体的任一个。

失巢凋亡测定：功能性激动

在使用大鼠肠上皮(RIE)-TrkB细胞的失巢凋亡测定中评估纯化的IgG(例如LFD253、LFD254、LFC325或LFC327)。这些细胞易感失巢凋亡(脱附作用依赖的凋亡)，但是可以用TrkB受体的激活来拯救。如通过细胞生存力所测量，LFD253处理能够从失巢凋亡拯救RIE-TrkB细胞，且这种作用是剂量依赖的。见图10A-D。从此数据计算的LFD253的EC50是4.1ng/ml(28pM)。从此数据计算的LFD254的EC50是24.0ng/ml(160pM)。从此数据计算的LFC325的EC50是41.8ng/ml(280pM)。从此数据计算的LFC327的EC50是26.9ng/ml(180pM)。

通过Biacore的抗体亲和力测定

测定了NVP-LFD253、NVP-LFD254、NVP-LFC325和NVP-327与固定化Fc-TrkB结合的动力学常数。图11A-D显示每种IgG的代表性动力学描迹集的详情。图11A显示从62.5nM向下2倍稀释至3.9nM的LFD253滴定的传感图。图11B显示从31.25nM向下2倍稀释至1.9nM的LFD254滴定的传感图。图11C显示从31.25nM向下2倍稀释至1.95nM的LFC325滴定的传感图。图11D显示从31.25nM向下2倍稀释至1.95nM的LFC327滴定的传感图。表5显示用Biacore S51评估软件将实验整体拟合至Langmuir模型时获得的数据的总结。虽然该抗体是二价的，但将结合处理为1∶1事件。

表5

表5显示抗体-受体复合物的快速结合动力学和缓慢解离动力学二者。整体处理传感图时获得最佳拟合。

应理解本文所述实施例和实施方案只是为了说明性目的，将向本领域技术人员暗示根据这些实施例和实施方案的多种修改或改变，这些修改或改变包含于本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此为了所有目的以其整体引入作为参考。

Claims

1.结合酪氨酸受体激酶B(TrkB)的抗体，其中所述抗体包含：

(b)轻链可变区，其包含人轻链V区段、轻链CDR3和轻链FR4，其中：

(i)所述重链CDR3包含氨基酸序列V(T/V)(S/T/R/N)WFAY(SEQ IDNO：34)；和

(ii)所述轻链CDR3可变区包含氨基酸序列(S/M)QGT(H/A)(E/V/I)PYT(SEQ ID NO：42)；和

其中所述抗体是TrkB激动剂。

2.权利要求1的抗体，其中所述重链V区段与SEQ ID NO：16具有至少90％序列同一性，且其中所述轻链V区段与SEQ ID NO：24具有至少90％序列同一性。

3.权利要求1的抗体，其中所述重链V区段与选自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的氨基酸具有至少90％序列同一性，且其中所述轻链V区段与选自SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的氨基酸具有至少90％序列同一性。

4.权利要求1的抗体，其中：

i)所述重链CDR3包含选自SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的氨基酸序列；且

ii)所述轻链CDR3包含选自SEQ ID nO：40和SEQ ID NO：41的氨基酸序列。

5.权利要求1的抗体，其中所述重链FR4是人种系FR4。

6.权利要求5的抗体，其中所述重链FR4是SEQ ID NO：50。

7.权利要求5的抗体，其中所述重链J区段包含人种系JH4部分序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：50)。

8.权利要求1的抗体，其中所述轻链FR4是人种系FR4。

9.权利要求8的抗体，其中所述轻链FR4是SEQ ID NO：61。

10.权利要求8的抗体，其中所述轻链J区段包含人种系Jk2部分序列FGQGKLEIK(SEQ ID NO：61)。

11.权利要求1的抗体，其中所述重链V区段和所述轻链V区段各包含互补决定区1(CDR1)和互补决定区2(CDR2)；其中：

i)所述重链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列；

ii)所述重链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列；

iii)所述轻链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列；和

iv)所述轻链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。

12.权利要求11的抗体，其中：

i)所述重链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：25；

ii)所述重链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：28；

iii)所述重链CDR3包含SEQ ID NO：32；

iv)所述轻链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：35；

iv)所述轻链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：38；和

vi)所述轻链CDR3包含SEQ ID NO：41。

13.权利要求11的抗体，其中：

i)所述重链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：25；

ii)所述重链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：28；

iii)所述重链CDR3包含SEQ ID NO：32；

iv)所述轻链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：36；

iv)所述轻链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：38；和

vi)所述轻链CDR3包含SEQ ID NO：40。

14.权利要求11的抗体，其中：

i)所述重链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：25；

ii)所述重链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：28；

iii)所述重链CDR3包含SEQ ID NO：32；

iv)所述轻链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：37；

iv)所述轻链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：38；和

vi)所述轻链CDR3包含SEQ ID NO：40。

15.权利要求11的抗体，其中：

i)所述重链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：25；

ii)所述重链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：29；

iii)所述重链CDR3包含SEQ ID NO：32；

iv)所述轻链V区段的CDR1包含SEQ ID NO：35；

iv)所述轻链V区段的CDR2包含SEQ ID NO：38；和

vi)所述轻链CDR3包含SEQ ID NO：41。

16.权利要求1的抗体，其中所述重链可变区与SEQ ID NO：4的可变区具有至少90％氨基酸序列同一性，且所述轻链可变区与SEQ ID NO：11的可变区具有至少90％氨基酸序列同一性。

17.权利要求1的抗体，其中所述重链可变区与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的可变区具有至少90％氨基酸序列同一性，且其中所述轻链可变区与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的可变区具有至少90％氨基酸序列同一性。

18.权利要求1的抗体，其中所述重链可变区与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的可变区具有至少95％氨基酸序列同一性，且其中所述轻链可变区与选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的可变区具有至少95％氨基酸序列同一性。

19.权利要求1的抗体，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列，且其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9和SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

20.权利要求1的抗体，其中所述抗体以低于5x10^-8M的平衡解离常数(K_D)结合TrkB。

21.权利要求1的抗体，其中所述抗体是FAb’片段。

22.权利要求1的抗体，其中所述抗体是IgG。

23.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单链抗体(scFv)。

24.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含人恒定区。

25.权利要求1的抗体，其中所述抗体不结合酪氨酸激酶受体A或酪氨酸激酶受体C。

26.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合TrkB的配体结合结构域(LBD)。

27.权利要求1的抗体，其中所述抗体与脑衍生神经营养因子(BDNF)竞争结合TrkB。

28.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：1的重链和含有SEQ ID NO：8的轻链。

29.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：1的重链和含有SEQ ID NO：9的轻链。

30.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：1的重链和含有SEQ ID NO：10的轻链。

31.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：3的重链和含有SEQ ID NO：8的轻链。

32.特异性结合TrkB的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区各包含以下三个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3；其中：

i)所述重链可变区的CDR1包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列；

ii)所述重链可变区的CDR2包含选自SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的氨基酸序列；

iii)所述重链可变区的CDR3包含选自SEQ ID NO：32和SEQ IDNO：33的氨基酸序列；

iv)所述轻链可变区的CDR1包含选自SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37的氨基酸序列；

v)所述轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列；

vi)所述轻链可变区的CDR3包含选自SEQ ID NO：40和SEQ IDNO：41的氨基酸序列。

33.可药用组合物，其包含权利要求1的抗体和生理学上相容的赋形剂。

34.权利要求33的组合物，其中所述药物组合物还包含在个体中降低血糖水平的药剂。

35.权利要求33的组合物，其中所述药物组合物还包含在个体中减轻体重的药剂。

36.在有需要的个体中降低血糖水平和/或体重的方法，所述方法包括对所述个体施用治疗有效量的权利要求1的抗体。

37.权利要求36的方法，其中所述个体患有前驱糖尿病。

38.权利要求36的方法，其中所述个体患有I型糖尿病。

39.权利要求36的方法，其中所述个体患有II型糖尿病。

40.权利要求36的方法，其中所述个体超重。

41.权利要求36的方法，其中所述个体肥胖。

42.权利要求36的方法，其还包括对所述个体施用在降低血糖中有效的治疗有效量的第二药剂。

43.权利要求42的方法，其中所述第二药剂和所述抗体作为混合物施用。

44.权利要求42的方法，其中所述第二药剂和所述抗体分开施用。

45.权利要求42的方法，其中所述第二药剂选自胰岛素、磺酰脲类、促胰岛素剂类、二甲双胍、PPARγ激动剂、PPARα激动剂、PPARδ激动剂、PPARα/γ双激动剂、PPARα/γ/δ泛激动剂、α-葡糖苷酶抑制剂、DPP-IV抑制剂和GLP-1/GLP-1类似物。

46.权利要求36的方法，其还包括对所述个体施用在减轻体重或肥胖症中有效的治疗有效量的第二药剂。

47.权利要求46的方法，其中所述第二药剂和所述抗体作为混合物施用。

48.权利要求46的方法，其中所述第二药剂分开施用。

49.权利要求46的方法，其中所述第二药剂选自脂肪酶抑制剂、西布茶明、CB-1抑制剂、托吡酯、糊精、糊精类似物、瘦素、PYY/PYY类似物和GLP-1/GLP-1类似物。

50.减轻或抑制脑衍生神经营养因子(BDNF)缺乏引起的障碍症状的方法，其包括对有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1的抗体。

51.权利要求50的方法，其中所述BDNF缺乏引起的障碍选自Rett综合症、维尔姆斯瘤、无虹膜、泌尿生殖异常和智力发育迟缓(WAGR)综合症、黑皮质素受体MC4R缺乏引起的肥胖症、恶病质/肌肉萎缩综合症。

52.权利要求50的方法，其中所述BDNF缺乏引起的障碍是Rett综合症。

53.权利要求50的方法，其中全身施用所述抗体。