KR101290503B1 - 개선된 항-ｔｒｋｂ 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 티로신 수용체 키나제 B (TrkB) 수용체를 특이적으로 인식하고 작용하는 개선된 항체 또는 항원-결합 분자, 및 그의 사용 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에서는 이러한 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터, 및 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 보유하는 숙주 세포가 제공된다.

Description

개선된 항-ＴＲＫＢ 항체{IMPROVED ANTI-TRKB ANTIBODIES}
<관련 출원에 대한 교차 참조>
본 출원은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 가출원 제61/021,820호 (2008년 1월 17일 출원)의 이점을 청구한다.
본 발명은 티로신 수용체 키나제 B (TrkB)의 항체 및 항원 결합 분자 효능제에 관한 것이다.
I. TrkB
티로신 수용체 키나제 B (TrkB)는 TrkA 및 TrkC를 포함하는 단일 막횡단 수용체 티로신 키나제의 족에 속한다. 이들 티로신 수용체 키나제 (trk)는 뉴로트로핀의 활성을 매개한다. 뉴로트로핀은 뉴런 생존 및 발생에 필요하며, 뉴런 구조 및 시냅스 가소성의 조절을 통해 시냅스 전달을 조절한다. 뉴로트로핀으로는, 이들로 한정되지는 않지만, 신경 성장 인자 (NGF), 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3 (NT-3) 및 뉴로트로핀-4/5 (NT-4/5) (문헌 [Lo, KY et al., J. Biol. Chem., 280:41744-52 (2005)])를 들 수 있다. TrkB는 BDNF의 고 친화성 수용체이다 (문헌 [Minichiello, et al., Neuron 21:335-45 (1998)]). trk에 뉴로트로핀이 결합하면 수용체가 활성화되는데, 이는 수용체의 세포내 도메인 상의 특이적인 티로신 잔기를 자가-인산화시키고 이량체화한다 (문헌 [Jing, et al. Neuron 9:1067-1079 (1992)]; [Barbacid, J. Neurobiol. 25:1386-1403 (1994)]; [Bothwell, Ann. Rev. Neurosci. 18:223 253 (1995)]; [Segal and Greenberg, Ann. Rev. Neurosci. 19:463 489 (1996)]; [Kaplan and Miller, Curr. Opinion Neurobiol. 10:381 391 (2000)]). 이들 포스포-티로신 잔기는 뉴로트로핀의 뉴런 사멸 및 기타 작용을 저해시키는 세포내 신호전달 캐스케이드의 요소에 대한 도킹 부위로서의 역할을 한다. 예를 들어, Shc, FRS-2, SH2B, rAPS 및 PLCγ는 인산화된 티로신 잔기를 통해서 TrkB와 상호작용한다. 이러한 어댑터 분자와 활성화된 TrkB의 결합을 통해 미토겐-활성화된 단백질 키나제, 포스파티딜이노시톨 3-키나제 및 PLCγ 경로를 비롯한 신호전달 경로를 개시하며, 이로써 뉴로트로핀의 작용을 매개한다 (문헌 [Lo, KY et al., J. Biol. Chem., 280:41744-52 (2005)]).
II . 당뇨병
정상적인 건강 상태를 유지하기 위해서는 인간 혈류 중 포도당의 농도를 상대적으로 엄격한 범위 (혈액 1 dl당 60-120 mg)로 제어해야 한다. 혈당이 너무 낮게 저하되면, 저혈당증으로 알려져 있는 상태가 실신, 쇠약, 두통, 착란 및 인격 변조와 같은 증상과 함께 발생한다. 과도한 혈당, 즉, 고혈당증은 세포, 조직 및 기관내 과량의 포도당과 단백질 사이의 화학적 반응에 기인한 조직 손상을 유발할 수 있다. 이러한 손상이 실명, 신부전, 발기부전, 죽상동맥경화증 및 감염 취약성의 증가라는 당뇨 합병증을 유발할 것으로 여겨진다.
당뇨병은 연속하여 병적으로 상승한 혈당 농도와 관련이 있는데; 이는 미국에서의 주요 사망 원인 중 하나이며, 전체 사망률 중 약 5％의 원인이 된다. 당뇨병은 2가지 주요 하위부류, 즉, 소아 당뇨병 또는 인슐린-의존성 당뇨병 (IDDM)으로도 알려져 있는 I형, 및 성인 당뇨병 또는 비-인슐린-의존성 당뇨병 (NIDDM)으로도 알려져 있는 II형으로 분류된다.
II형 당뇨병의 진단은 증상 평가, 및 뇨 및 혈액 중의 포도당 측정을 포함한다. 정확한 진단을 위해서는 혈당 수준 측정이 필수적이다. 더욱 특히, 공복 혈당 수준 측정이, 이용되는 표준 접근법이다. 그러나, 경구 내당능 검사 (OGTT)가 공복 혈당 수준 측정보다 더욱 민감한 것으로 고려된다. II형 당뇨병은 경구 내당능 (OGT) 장애와 관련되어 있다. 따라서, 일반적으로 당뇨병의 진단을 위해서 필수적인 것은 아니지만, OGTT가 II형 당뇨병의 진단에 도움을 줄 수 있다 (문헌 [Emancipator K, Am J Clin Pathol 1997 November; 112(5):665 74; Type 2 Diabetes Mellitus, Decision Resources Inc., March 2000]).
따라서, 내당능 장애는, II형 당뇨병의 진단에 필요한 공복 혈당 수준보다 낮은 공복 혈당 수준을 갖지만, OGTT 중에는 정상과 당뇨병 사이의 혈장 포도당 반응을 갖는 개체에서 진단된다. 내당능 장애는 전당뇨병 상태로 고려되며, 내당능 장애 (OGTT에 의해 규정된 것)는 II형 당뇨병의 발병에 대한 강한 지표가 된다 (문헌 [Haffner S M, Diabet Med 1997 August; 14 Suppl 3:S12 8]).
II형 당뇨병은, 췌장 기능 및/또는 기타 인슐린-관련 과정의 감소와 관련되어 있으며 혈장 포도당 수준 증가에 의해 악화되는 진행성 질환이다. 따라서, II형 당뇨병은 일반적으로 장기간의 전당뇨병 단계를 가지며, 예를 들어 비정상적인 포도당 이용 및 효능, 전당뇨병 상태에서의 인슐린 작용 및/또는 인슐린 생산과 같은 다양한 병리생리학적 기전은 병적 고혈당증 및 내당능 장애를 일으킬 수 있다 (문헌 [Goldberg R B, Med Clin North Am 1998 July;82(4):805 21]).
내당능 장애와 관련된 전당뇨병 상태는 또한 복부 비만, 인슐린 저항, 고지혈증 및 고혈압과 관련이 있을 수 있다 (문헌 [Groop L, Forsblom C, Lehtovirta M, Am J Hypertens 1997 September;10(9 Pt 2):172S 180S]; [Haffner S M, J Diabetes Complications 1997 March-April, 11(2):69 76]; [Beck-Nielsen H, Henriksen J E, Alford F, Hother-Nielson O, Diabet Med 1996 September; 13 (9 Suppl 6):S78 84]).
병적 고혈당증 또는 내당능 장애를 감소시키는 데 중점을 둔, II형 당뇨병이 발병할 위험이 있는 개체에서의 조기 중재가 II형 당뇨병 및 관련 합병증으로의 진행을 예방하거나 지연시킬 수 있다. 따라서, 경구 내당능 장애 및/또는 혈당 수준 상승을 효과적으로 치료함으로써 상기 장애가 II형 당뇨병으로 진행되는 것을 예방 또는 억제할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,109,174호를 참조한다.
인슐린 및 술포닐우레아 (경구 저혈당증 치료제)가 현재 미국에서 처방되는 2가지 주요 부류의 당뇨약이다. 인슐린은 I형 및 II형 당뇨병 둘 다에 대해 처방되는 반면, 술포닐우레아는 일반적으로 II형 당뇨병에 대해서만 처방된다. 술포닐우레아는 천연 인슐린 분비를 자극하고, 인슐린 저항을 감소시키는데; 이러한 화합물은 대사시 인슐린의 기능을 대체하지는 않는다. 술포닐우레아를 투여받은 환자들 중 대략 ⅓은 이에 대해 내성이 된다. 일부 II형 당뇨병은 술포닐우레아 요법에 대해 반응하지 않는다. 술포닐우레아를 사용한 초기 치료에 반응하는 환자들 중 5-10％는 약 10년 후에 술포닐우레아 효능의 감소를 경험하게 될 가능성이 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,115,284호를 참조한다.
II형 당뇨병의 치료를 위해 통상 처방되는 다수의 항당뇨제, 예를 들어 술포닐우레아 및 티아졸리딘디온은 체중 증가라는 바람직하지 않은 부작용을 갖는다. 전당뇨병의 상태를 갖거나 II형 당뇨병으로 진단받은 환자에서의 체중 증가는 대사 및 내분비 조절장애의 강화에 기인하는 유해한 영향을 초래하며, 비만 그 자체는 II형 당뇨병의 발병 및 진행성 악화의 중추적인 위험 요인이 된다. 따라서, 체중을 유지 또는 저하시키는 항당뇨제를 갖는 것이 바람직하다. 예를 들어, 미국 특허 제7,199,174호를 참조한다.
비만은 당뇨병, 심장병, 뇌졸중, 고혈압 및 몇몇 종류의 암을 비롯한 다수의 중증 상태에 대한 개인의 위험을 증가시키므로, 보편적이면서 가장 심각한 공중 보건 문제이다. 지난 20여년에 걸친 비만 개체 수의 상당한 증가는 충분한 공중 보건 관련성을 야기하였다. 식이 및 운동에 의한 비만의 감소가 관련된 위험 요인을 현저히 감소시킨다는 것이 연구를 통해 입증된 바 있지만, 비만은 식욕 증가, 고칼로리 음식물에 대한 선호, 신체 활동 감소 및 지방형성 대사 증가에 기여하는 유전적으로 계승된 요인과 강하게 관련되어 있다는 점을 고려하면, 이러한 치료법은 대개 성공적이지 못하다. 예를 들어, 미국 특허 제7,115,767호를 참조한다.
III . 레트 증후군(Rett Syndrome )
1966년에 안드레아스 레트 박사(Dr. Andreas Rett)에 의해 최초 확인된 레트 증후군 (RTT)은 늦은-신경발달 결함에 기인한 치명적인 CNS 장애이다. 정상 출산한 10,000-15,000명 중 1명의 비율로 모든 민족의 거의 여아에게만 영향을 미친다. 일부 개체는 어린 나이에 RTT로 사망하지만, 대부분은 성인기까지 생존할 수 있고, 심한 불구가 된다. 환자의 최대 25％가 심부전/호흡부전으로 사망한다. 이러한 질환의 효과적인 치료법이 지금까지 존재하지 않는다.
외견상의 정상 발달 기간 후, 이 병에 걸린 여아는 6-18개월령에 RTT 증상이 발병하고, 이는 다음 몇 년에 걸쳐 점차 악화된다. 증상으로는, 출생시 정상 머리 둘레 이후 머리 성장의 감소; 후천적 언어 능력의 상실, 대화 기능이상, 인지 손상; 상동증적(stereotypical) 손 운동 (굽은 손 떨기, 손 씻기, 박수치기, 가볍게 두드리기 등)으로 대체된 의도적인 손 기술; 운동능력 장애 또는 악화 (보행실조, 경직 등); 각성 중 호흡곤란; 전인 영아기로부터의 수면 패턴 장애; 근육 쇠약 및 근육 긴장이상에 수반된 비정상적 근긴장도; 말초 혈관 운동 장애; 진행성 척추측만증 또는 척추후만증; 및 성장 지연을 들 수 있다.
상기 장애는 또한 중추 자율신경 기능이상으로 특징지어지고, 레트 환자는 다음 증상 중 일부 또는 전부를 나타낸다: 호흡 중지, 얕은 호흡, 과다 호흡, 지속 무호흡의 주기로 이루어진 다중 호흡 리듬장애; 기준 심장 미주신경 긴장도 감소와 함께 심부정맥; 및 압력반사에 대한 심장 민감도. 이들 증상은 생명을 위협하고, 레트 환자를 급사 위험에 처하게 한다. 이는 뇌간 미숙, 및 각성 중 심장호흡 네트워크 내부 및 시상하부 또는 변연피질로부터의 통합적인 억제 결여를 나타낸다. 또한, 모노아민 (세로토닌, 노르에피네프린) 및 신경펩티드 (물질 P) 수준 감소와 같은 뇌간 뉴로트로핀 신호전달 (NGF 및 BDNF)에서의 변경이 레트 환자에서 보고된다.
RTT는 대부분의 경우에 전사 억제자인 MeCP2 (메틸CpG 시토신 결합 단백질 2)를 코딩하는 X 염색체-연관 유전자 mecp2에서의 돌연변이에 의해 유발되는 단일유전자 질환이다. MeCP2는 메틸화된 DNA에 우선적으로 결합한다.
뉴로트로핀 인자 BDNF는 MeCP2의 공지된 직접적인 표적이며, 노르에피네프린 및 세로토닌 뉴런에 대한 중요한 영양 인자이다. 놀랍게도, Mecp2-KO 마우스는 뇌 BDNF가 결핍되어 있고, 뇌 BDNF의 유전자 과발현은 이들의 수명을 증가시키고, 이들의 운동 결함 중 일부를 구제할 수 있다. 인간에서 확인된 BDNF 결핍 장애로는 레트 증후군, 빌름스 종양(Wilms' tumor), 무홍채증, 비뇨생식 이상 및 정신 지체 (WAGR) 증후군 (문헌 [Han, et al., N Engl J Med (2008) 359(9):918-27]), 멜라노코르틴 수용체 MC4R 결핍으로 인한 비만 (문헌 [Farooqi and O'Rahilly, Endocrine Rev (2006) 27(7):710-18]), 악액질/근육 쇠약 증후군 (문헌 [Lin, et al., PloS, 3(4):e1900; WO 2007/088476])을 들 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 티로신 수용체 키나제 B (TrkB)에 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체는
(a) 인간 중쇄 V-절편, 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDR3) 및 중쇄 프레임워크 영역 4 (FR4)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 인간 경쇄 V 절편, 경쇄 CDR3 및 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하고, 여기서
i) 중쇄 CDR3은 아미노산 서열 V(T/V)(S/T/R/N)WFAY (서열 34)을 포함하고;
ii) 경쇄 CDR3 가변 영역은 아미노산 서열 (S/M)QGT(H/A)(E/V/I)PYT (서열 42)을 포함하고;
여기서, 상기 항체는 TrkB 효능제이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 TrkB에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 각각 3개의 상보성 결정 영역 (CDR), 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고; 여기서
i) 중쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 25의 아미노산 서열을 포함하고;
ii) 중쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 28, 서열 29 및 서열 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
iii) 중쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 32 및 서열 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
iv) 경쇄 가변 영역의 CDR1은 서열 35, 서열 36 및 서열 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
v) 경쇄 가변 영역의 CDR2는 서열 39의 아미노산 서열을 포함하고;
vi) 경쇄 가변 영역의 CDR3은 서열 40 및 서열 41로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
항체의 실시양태와 관련하여, 몇몇 실시양태에서, 중쇄 V-절편은 서열 16에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 공유하고, 경쇄 V 절편은 서열 24에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 공유한다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 V-절편은 서열 12, 서열 13, 서열 14 및 서열 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 공유하고, 경쇄 V 절편은 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22 및 서열 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 공유한다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 CDR3은 서열 32 및 서열 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 CDR3은 서열 40 및 서열 41로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 FR4는 인간 생식계열(germline) FR4이다. 몇몇 실시양태에서, 중쇄 FR4는 서열 50이다. 몇몇 실시양태에서, 중쇄 J-절편은 인간 생식계열 JH4 부분 서열 WGQGTLVTVSS (서열 50)을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 경쇄 FR4는 인간 생식계열 FR4이다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 FR4는 인간 생식계열 Jk2 부분 서열 FGQGKLEIK (서열 61)이다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 V-절편 및 경쇄 V-절편은 각각 상보성 결정 영역 1 (CDR1) 및 상보성 결정 영역 2 (CDR2)를 포함하고; 여기서
i) 중쇄 V-절편의 CDR1은 서열 27의 아미노산 서열을 포함하고;
ii) 중쇄 V-절편의 CDR2는 서열 31의 아미노산 서열을 포함하고;
iii) 경쇄 V-절편의 CDR1은 서열 38의 아미노산 서열을 포함하고;
iv) 경쇄 V-절편의 CDR2는 서열 39의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서,
i) 중쇄 V-절편의 CDR1은 서열 25를 포함하고;
ii) 중쇄 V-절편의 CDR2는 서열 28을 포함하고;
iii) 중쇄 CDR3은 서열 32를 포함하고;
iv) 경쇄 V-절편의 CDR1은 서열 35를 포함하고;
v) 경쇄 V-절편의 CDR2는 서열 39를 포함하고;
vi) 경쇄 CDR3은 서열 41을 포함한다.
몇몇 실시양태에서,
i) 중쇄 V-절편의 CDR1은 서열 25를 포함하고;
ii) 중쇄 V-절편의 CDR2는 서열 28을 포함하고;
iii) 중쇄 CDR3은 서열 32를 포함하고;
iv) 경쇄 V-절편의 CDR1은 서열 36을 포함하고;
v) 경쇄 V-절편의 CDR2는 서열 39를 포함하고;
vi) 경쇄 CDR3은 서열 40을 포함한다.
몇몇 실시양태에서,
i) 중쇄 V-절편의 CDR1은 서열 25를 포함하고;
ii) 중쇄 V-절편의 CDR2는 서열 28을 포함하고;
iii) 중쇄 CDR3은 서열 32를 포함하고;
iv) 경쇄 V-절편의 CDR1은 서열 37을 포함하고;
v) 경쇄 V-절편의 CDR2는 서열 39를 포함하고;
vi) 경쇄 CDR3은 서열 40을 포함한다.
몇몇 실시양태에서,
i) 중쇄 V-절편의 CDR1은 서열 25를 포함하고;
ii) 중쇄 V-절편의 CDR2는 서열 29를 포함하고;
iii) 중쇄 CDR3은 서열 32를 포함하고;
iv) 경쇄 V-절편의 CDR1은 서열 35를 포함하고;
v) 경쇄 V-절편의 CDR2는 서열 39를 포함하고;
vi) 경쇄 CDR3은 서열 41을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 4의 가변 영역에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 공유하고, 경쇄 가변 영역은 서열 11의 가변 영역에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 공유한다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 1, 서열 2 및 서열 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가변 영역에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 공유하고, 경쇄 가변 영역은 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9 및 서열 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가변 영역에 대해 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 공유한다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 1, 서열 2 및 서열 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가변 영역에 대해 95％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 공유하고, 경쇄 가변 영역은 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9 및 서열 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가변 영역에 대해 95％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 공유한다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 1, 서열 2 및 서열 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9 및 서열 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 5 x 10-8 M 미만의 평형 해리 상수 (KD)로 TrkB에 결합한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 FAb' 단편이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 IgG이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 단일 쇄 항체 (scFv)이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 불변 영역을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 티로신 키나제 수용체 A 또는 티로신 키나제 수용체 C에 결합하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 TrkB의 리간드 결합 도메인 (LBD)에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 TrkB에 대한 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF)의 결합과 경쟁한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 1을 포함한 중쇄 및 서열 8을 포함한 경쇄를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 1을 포함한 중쇄 및 서열 9를 포함한 경쇄를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 1을 포함한 중쇄 및 서열 10을 포함한 경쇄를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 3을 포함한 중쇄 및 서열 8을 포함한 경쇄를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 및 생리학상 상용성인 부형제를 포함하는 제약상 허용되는 조성물을 제공한다. 제약상 허용되는 조성물의 실시양태는 항체에 대해 상기 기재된 바와 같다.
몇몇 실시양태에서, 제약 조성물은 호흡곤란을 감소 또는 억제하는 데 사용하기 위한 작용제, 예를 들어 노르에피네프린 및/또는 세로토닌 경로의 활성화제를 추가로 포함한다. 제2 작용제는 트리시클릭 항우울제, 예를 들어 데시프라민 (DMI)일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 제2 작용제는 세로토닌 1A 수용체 부분 효능제, 예를 들어 부스피론, 플루옥세틴 및 레복세틴이다. 몇몇 실시양태에서, 제2 작용제는 글루타메이트성 AMPA 수용체의 활성화제, 예를 들어 AMPAkine CX54이다. 몇몇 실시양태에서, 제2 작용제는 프로스타글란딘, 프로게스테론 또는 TrkB 활성의 증강제 (예를 들어, 단백질 티로신 포스파타제 억제제)이다.
몇몇 실시양태에서, 제약 조성물은 개체에서 혈당 수준을 감소시키는 작용제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제약 조성물은 개체에서 체중을 감소시키는 작용제를 추가로 포함한다.
관련 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 항체를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하여, 상기 개체에서 BDNF 부족으로 인한 장애를 치료, 감소, 억제, 완화 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 치료 방법의 실시양태는 항체에 대해 상기 및 본원에 기재된 바와 같다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 전신 또는 말초, 예를 들어 경구, 흡입, 정맥내 또는 복막내 투여된다. 몇몇 실시양태에서, BDNF 부족으로 인한 장애는 레트 증후군, WAGR 증후군, MC4R 결핍으로 인한 비만, 및 악액질 (예를 들어, 암, 노화, 섭식 장애 또는 약물 (아편양제제-유도성 구토 포함)로 인한 악액질)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 측면에서, 본 발명은, 치료 유효량의 본 발명의 항체를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 혈당 수준 및/또는 체중을 감소시키는 방법을 제공한다. 치료 방법의 실시양태는 항체에 대해 상기 및 본원에 기재된 바와 같다. 본 방법의 추가 실시양태와 관련하여, 몇몇 실시양태에서, 개체는 전당뇨병 상태이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 I형 당뇨병이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 II형 당뇨병이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 과체중이다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 비만이다.
몇몇 실시양태에서, 본 방법은 혈당을 감소시키는 데 효과적인 제2 작용제의 치료 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 제2 작용제는 인슐린, 술포닐우레아, 인슐린분비제, 메트포르민, PPARγ 효능제, PPARα 효능제, PPARδ 효능제, PPARα/γ 이중 효능제, PPARα/γ/δ pan 효능제, 알파-글루코시다제 억제제, DPP-IV 억제제 및 GLP-1/GLP-1 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시양태에서, 본 방법은 체중 감소 또는 비만에 효과적인 제2 작용제의 치료 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 제2 작용제는 리파제 억제제, 시부트라민, CB-1 억제제, 토피라메이트, 아밀린, 아밀린 유사체, 렙틴, PYY/PYY 유사체 및 GLP-1/GLP-1 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시양태에서, 제2 작용제 및 항체는 혼합물로서 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 제2 작용제 및 항체는 개별적으로 투여된다.
<정의>
"항체"는 면역글로불린 족의 폴리펩티드, 또는 해당 항원에 비공유 방식으로, 가역적으로 및 특이적인 방식으로 결합할 수 있는 면역글로불린의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 예시적인 항체 구조 단위는 사량체로 구성된다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되고, 각각의 쌍은 디술피드 결합을 통해 연결된 하나의 "경쇄" (약 25 kD) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kD)를 갖는다. 인정된 면역글로불린 유전자는 κ, λ, α, γ, δ, ε 및 μ 불변 영역 유전자, 및 또한 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 κ 또는 λ로서 분류된다. 중쇄는 γ, μ, α, δ 또는 ε으로서 분류되고, 이들은 각각 면역글로불린 부류 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 규정한다. 각 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 규정한다. 용어 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)는 각각 경쇄 및 중쇄의 상기 영역을 나타낸다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, "항체"는, 예를 들어 TrkB에 대해 특이적으로 특정 결합을 보유하는 항체 및 그의 단편의 모든 변형물을 포함한다. 따라서, 전장 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 항체 (ScFv), Fab, Fab', 및 동일한 결합 특이성을 갖는 이들 단편의 다량체 버전 (예를 들어, F(ab')2)이 상기 개념의 범위 내에 존재한다.
"상보성 결정 도메인" 또는 "상보성 결정 영역 ("CDR")은 상호교환적으로 VL 및 VH의 초가변 영역을 나타낸다. CDR은, 표적 단백질에 대한 특이성을 보유하는, 항체 사슬의 표적 단백질-결합 부위이다. 각각의 인간 VL 또는 VH에 3개의 CDR (N-말단으로부터 순차적으로 넘버링된 CDR1-3)이 존재하고, 이들은 가변 도메인의 약 15-20％를 구성한다. CDR은 표적 단백질의 에피토프에 대해 구조적으로 상보성이며, 따라서 직접적으로 결합 특이성을 제공한다. VL 또는 VH의 나머지 스트레치(stretch), 소위 프레임워크 영역은 아미노산 서열의 보다 적은 변형을 나타낸다 (문헌 [Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000]).
CDR 및 프레임워크 영역의 위치는 당업계의 널리 공지된 다양한 정의, 예를 들어 카바트(Kabat), 코티아(Chothia), 국제 ImMunoGeneTics 데이타베이스 (IMGT) (월드와이드 웹(worldwide web) 상의 imgt.cines.fr/) 및 AbM을 이용하여 결정된다 (예를 들어, 문헌 [Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001)]; [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)]; [Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992)]; [Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol., 273:927-748 (1997)] 참조). 항원 결합 부위의 정의는 다음 문헌에도 기재되어 있다: 문헌 [Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000)] 및 [Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001)]; [MacCallum et al. J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)]; 및 [Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989)]; [Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991)]; 및 [Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)].
용어 "결합 특이성 결정자" 또는 "BSD"는 상호교환적으로 항체의 결합 특이성 결정에 필요한 상보성 결정 영역 내의 최소 연속적인 또는 비-연속적인 아미노산 서열을 나타낸다. 최소 결합 특이성 결정자는 하나 이상의 CDR 서열 내에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 최소 결합 특이성 결정자는 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR3 서열의 일부 또는 전체 길이 내에 위치한다 (즉, 이에 의해서만 결정된다).
본원에서 사용된 "항체 경쇄" 또는 "항체 중쇄"는 각각 VL 또는 VH를 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 내인성 VL은 유전자 절편 V (가변 부위) 및 J (연결 부위)에 의해 코딩되고, 내인성 VH는 V, D (다양성 부위) 및 J에 의해 코딩된다. 각각의 VL 또는 VH는 CDR 및 프레임워크 영역을 포함한다. 본 출원에서, 항체 경쇄 및/또는 항체 중쇄는 때로는 집합적으로 "항체 사슬"로 언급될 수 있다. 당업자가 용이하게 인지할 바와 같이, 이들 용어는 VL 또는 VH의 기본 구조를 붕괴시키지 않는 돌연변이를 함유하는 항체 사슬을 포함한다.
항체는 무손상 면역글로불린으로서 또는 다양한 펩티다아제를 이용한 소화에 의해 생성된 다수의 잘 특성화된 단편으로서 존재한다. 따라서, 예를 들어, 펩신은 힌지 영역 내의 디술피드 연결 하에서 항체를 소화시켜, 그 자체가 디술피드 결합에 의해 VH-CH1에 연결된 경쇄인 Fab'의 이량체 F(ab)'2를 생성한다. F(ab)'2는 힌지 영역 내의 디술피드 연결을 파괴하는 온화한 조건 하에서 변형되어, F(ab)'2 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab이다 (문헌 [Paul, Fundamental Immunology 3d ed. (1993)]). 다양한 항체 단편이 무손상 항체의 소화의 측면에서 규정되지만, 당업자는 이러한 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법을 이용하여 드 노보(de novo)로 합성될 수 있음을 알 것이다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "항체"는 또한 온전한 항체의 변형에 의해 생성된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법을 이용하여 드 노보로 합성된 항체 단편 (예를 들어, 단일 쇄 Fv) 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 확인된 항체 단편 (예를 들어, 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)] 참조)을 포함한다.
모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 제조를 위해, 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)]; [Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)]; [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985] 참조). 단일 쇄 항체의 생산 기술 (미국 특허 제4,946,778호)을 변용하여 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 생성할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 마우스, 또는 다른 유기체, 예컨대 다른 포유동물을 사용하여 인간화 항체를 발현시킬 수 있다. 별법으로, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 헤테로머(heteromeric) Fab 단편을 확인할 수 있다 (예를 들어, 상기 맥카페르티(McCafferty) 등의 문헌; 문헌 [Marks et al., Biotechnology, 10:779-783, (1992)] 참조).
비-인간 항체를 인간화 또는 영장류화하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그 내부에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 도입 잔기로 지칭되고, 통상 도입 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 본질적으로 윈터(Winter) 및 공동 연구자의 방법에 따라 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)] 참조). 따라서, 이러한 인간화 항체는, 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 작은 영역이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 대체된 키메라 항체이다 (미국 특허 제4,816,567호). 실제로, 인간화 항체는 통상 일부 상보성 결정 영역 ("CDR") 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 ("FR") 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.
"키메라 항체"는 (a) 항원 결합 부위 (가변 영역)가 상이하거나 또는 변경된 부류, 효과기 기능 및/또는 종의 불변 영역에 연결되거나, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자 (예를 들어, 효소, 톡신, 호르몬, 성장 인자 및 약물)에 연결되도록 불변 영역 또는 그의 일부가 변경, 대체 또는 교환되거나; (b) 가변 영역 또는 그의 일부가 상이하거나 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 대체 또는 교환된 항체 분자이다.
용어 "가변 영역" 또는 "V-영역"은 상호교환적으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 중쇄 또는 경쇄를 나타낸다 (도 1 참조). 내인성 가변 영역은 면역글로불린 중쇄 V-D-J 유전자 또는 경쇄 V-J 유전자에 의해 코딩된다. V-영역은 자연 발생되거나, 재조합되거나 또는 합성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "가변 절편" 또는 "V-절편"은 상호교환적으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3을 포함하는 가변 영역의 하위서열을 나타낸다 (도 1 참조). 내인성 V-절편은 면역글로불린 V-유전자에 의해 코딩된다. V-절편은 자연 발생되거나, 재조합되거나 또는 합성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "J-절편"은 CDR3의 C-말단 부분 및 FR4를 포함하는 코딩된 가변 영역의 하위서열을 나타낸다. 내인성 J-절편은 면역글로불린 J-유전자에 의해 코딩된다 (도 1 참조). J-절편은 자연 발생되거나, 재조합되거나 또는 합성될 수 있다.
"인간화" 항체는, 비-인간 항체의 반응성을 보유하지만 인간에서 덜 면역원성인 항체이다. 이는, 예를 들어 비-인간 CDR 영역을 보유하고 항체의 나머지 부분을 그의 인간 대응물로 대체함으로써 얻어질 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]; [Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]; [Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991)]; [Padlan, Molec. Immun., 31(3): 169-217 (1994)] 참조).
용어 "상응하는 인간 생식계열 서열"은, 인간 생식계열 면역글로불린 가변 영역 서열에 의해 코딩되는 모든 다른 평가된 가변 영역 아미노산 서열에 비해, 참조 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열과 가장 높게 측정된 아미노산 서열 동일성을 공유하는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 상응하는 인간 생식계열 서열은 또한 모든 다른 평가된 가변 영역 아미노산 서열에 비해 참조 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열과 가장 높은 아미노산 서열 동일성을 갖는 인간 가변 영역 아미노산 서열 또는 하위서열을 지칭할 수 있다. 상응하는 인간 생식계열 서열은 프레임워크 영역 단독, 상보성 결정 영역 단독, 프레임워크 및 상보성 결정 영역, 가변 절편 (상기 정의된 바와 같음), 또는 가변 영역을 포함하는 서열 또는 하위서열의 다른 조합일 수 있다. 서열 동일성은 본원에 기재된 방법을 이용하여, 예를 들어 BLAST, ALIGN, 또는 당업계에 공지된 다른 정렬 알고리즘을 이용하여 2개의 서열을 정렬시켜 결정될 수 있다. 상응하는 인간 생식계열 핵산 또는 아미노산 서열은 참조 가변 영역 핵산 또는 아미노산 서열과 약 90％, 92％, 94％, 96％, 98％, 99％ 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 상응하는 인간 생식계열 서열은, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 국제 ImMunoGeneTics 데이타베이스 (IMGT) (월드와이드 웹 상의 imgt.cines.fr/) 및 V-base (월드와이드 웹 상의 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)를 통해 결정될 수 있다.
항체 또는 항체-유래 결합제에 대한 항원, 예를 들어 단백질 사이의 상호작용을 기재하는 문맥에서 사용된 어구 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하다"는 단백질 및 다른 생물학적 물질의 이종 집단에서 항원의 존재를 결정하는 결합 반응을 나타낸다. 따라서, 제시된 면역분석 조건 하에, 특정 결합 특이성을 갖는 항체 또는 결합제는 특정 항원에 대해 배경보다 2배 이상 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 항원에 실질적으로 유의한 양으로 결합하지 않는다. 상기 조건 하에서 항체 또는 결합제에 대한 특이적 결합은, 특정 단백질에 대한 그의 특이성에 대해 항체 또는 결합제를 선택하는 것을 필요로 할 수 있다. 상기 선택은, 예를 들어 다른 종 (예를 들어, 마우스)으로부터의 TrkB 분자 또는 다른 Trk 하위유형 (예를 들어, TrkA, TrkC 등)과 교차-반응하는 항체를 배제함으로써 달성할 수 있다. 다양한 면역분석 포맷을 이용하여 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택할 수 있다. 예를 들어, 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하기 위해서 고상 ELISA 면역분석이 통상 이용된다 (예를 들어, 특이적 면역반응성을 측정하는 데 사용될 수 있는 면역분석 포맷 및 조건의 기재에 대해서는 문헌 [Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)] 참조). 일반적으로, 특이적인 또는 선택적인 결합 반응은 배경 신호보다 2배 이상, 보다 일반적으로 배경 신호보다 10 내지 100배 이상의 신호를 생성할 것이다.
용어 "평형 해리 상수 (KD, M)"는 해리 속도 상수 (kd, 시간-1)를 결합 속도 상수 (ka, 시간-1, M-1)로 나눈 것을 나타낸다. 평형 해리 상수는 당업계의 임의의 공지의 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 본 발명의 항체는 일반적으로 평형 해리 상수가 약 10-7 M 또는 10-8 M 미만, 예를 들어 약 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 일부 실시양태에서는 약 10-11 M, 10-12 M 또는 10-13 M 미만일 것이다.
본원에서 사용된 용어 "항원-결합 영역"은 분자와 TrkB 사이의 특이적 결합을 담당하는 본 발명의 TrkB-결합 분자의 도메인을 나타낸다. 항원-결합 영역은 하나 이상의 항체 중쇄 가변 영역 및 하나 이상의 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 각각의 TrkB-결합 분자에 존재하는 하나 이상의 이러한 항원-결합 영역이 있으며, 각각의 항원-결합 영역은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 TrkB-결합 분자의 하나 이상의 항원-결합 영역은 TrkB의 효능제로서 작용한다.
용어 "항체 효능제" 또는 "효능제"는 상호교환적으로 수용체를 활성화시켜 전체 또는 부분적인 (예를 들어, 60％ 이상) 수용체-매개 반응을 유도할 수 있는 항체를 나타낸다. 예를 들어, TrkB의 효능제는 TrkB에 결합하고, TrkB-매개 신호전달을 유도한다. 일부 실시양태에서, TrkB 항체 효능제는 TrkB에 결합하여 SH-SY5Y 세포에 접촉시 신경돌기 증식을 유도하는 그의 능력에 의해서 또는 본원에 달리 기재된 바와 같이 확인될 수 있다. 다른 실시양태에서, TrkB 항체 효능제는 본원에 기재된 아노이키스 분석에 측정된 바와 같이 분리-의존성 아팝토시스로부터 세포를 구제하는 그의 능력으로 확인될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 아노이키스 분석에서 5 nM 미만, 예를 들어 1 nM, 500 pM, 250 pM, 100 pM, 50 pM 또는 30 pM 미만의 EC50을 갖는 항-TrkB 항체가 TrkB 항체 효능제인 것으로 고려된다.
용어 "TrkB" 또는 "티로신 수용체 키나제 B"는 상호교환적으로 수용체 티로신 키나제의 트로포마이오신-관련 키나제 (Trk) 족의 3가지 구성원 중 하나를 지칭하며, 다른 구성원은 TrkA 및 TrkC이다. TrkB는 신경영양 티로신 수용체 키나제 (NTRK) 족의 구성원이며, 이는 또한 신경영양 티로신 키나제 수용체, 유형 2 (NTRK2)로도 알려져 있다. TrkB는 뉴로트로핀 결합시 그 자체 및 MAPK 경로의 구성원을 인산화하는 막-결합 수용체이다. TrkB에 대한 리간드로는 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) 및 뉴로트로핀-3을 들 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Haniu, et al., Arch Biochem Biophys (1995) 322(1):256-264]; [Squinto, et al., Cell (1991) 65(5) 885-893]; 및 [Soppet, et al., Cell (1991) 65(5) 895-903]을 참조한다. TrkB를 통한 신호전달은 세포 분화를 유발한다. 상기 유전자에서의 돌연변이는 비만 및 기분 장애와 관련되어 있다. TrkB의 상이한 이소형을 코딩하는 또다른 전사 스플라이싱 변이체가 존재한다. TrkB의 핵산 및 아미노산 서열은 공지되어 있으며, 진뱅크(GenBank) 등록번호 NM_001018064 (gi:65506744, PRI 18-NOV-2007)로 공개되어 있다. 또한, 진뱅크 등록번호 BC075804.1, U12140.1, BC031835.1 및 AF410899.1을 참조한다. 본원에서 사용된 바와 같이, TrkB 폴리펩티드는, BDNF 또는 뉴로트로핀-3의 결합에 의해 활성화되고, 그 자체 및 MAPK 경로의 구성원의 인산화에 의해 세포내 신호전달을 유발하는 기능상 티로신 키나제 수용체이다. 구조적으로, TrkB 아미노산 서열은 진뱅크 등록번호 NP_001018074.1, AAB33109, AAL67968, AAL67964, AAC51371.1, AAH31835.1 또는 AAL67965.1의 아미노산 서열과 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 서열 동일성을 공유한다. 구조적으로, TrkB 핵산 서열은 진뱅크 등록번호 NM_001018064, S76473, BC075804.1, U12140.1, BC031835.1 또는 AF410899.1의 핵산 서열과 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 동일성을 공유한다.
본 발명의 폴리펩티드의 "활성"은 그의 천연 세포 또는 조직에서의 폴리펩티드의 구조적, 조절상의 또는 화학적 기능을 나타낸다. 폴리펩티드의 활성의 예는 직접적인 활성 및 간접적인 활성 둘 모두를 포함한다. 직접적인 활성의 예는 TrkB의 리간드 결합 도메인 (LBD) (예를 들어, 문헌 [Naylor et al., Biochem Biophys Res Commun. 291(3):501-7 (2002)] 참조)에 대한 BDNF의 결합과 같은 리간드 결합을 비롯한 폴리펩티드와의 직접적인 상호작용의 결과, 제2 메신저 (예를 들어, cAMP, cGMP, IP3, DAG 또는 Ca2 +)의 생성 또는 고갈, 이온 유입, 및 인산화 또는 전사 수준의 변화이다. TrkB와 관련한 간접적인 활성의 예는 폴리펩티드의 지정된 활성에 대한 세포 또는 조직내 표현형 또는 반응에서의 변화로서, 예를 들어 폴리펩티드와 다른 세포 또는 조직 성분들과의 상호작용의 결과로서 전체 혈당 수준 저하로서 관찰된다.
성인 인간과 관련하여 사용된 용어 "비만"은 체질량 지수 (BMI)가 30 이상인 개체를 나타낸다. 성인 인간과 관련하여 사용시 "과체중"은 BMI가 25 이상이 개체를 나타낸다. 어린이의 경우, 연령별 체질량 지수 차트가 사용되는데, 여기서 BMI가 85th 백분위수 초과인 경우 "과체중"으로 간주되고, BMI가 95th 백분위수 초과인 경우 "비만"으로 간주된다. 예를 들어, 문헌 [Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adult (National Heart, Lung and Blood Institute, June 17, 1998)] 및 [Preventing and Managing the Global Epidemic of Obesity in Report of the World Health Organization Consultation of Obesity (WHO, Geneva, June 1997)]을 참조한다.
"전당뇨병의 개체"는 공복 혈당 수준이 110 mg/dl 초과 126 mg/dl 미만이거나, 2시간 PG 판독값이 140 mg/dl 초과 200 mg/dl 미만인 성인을 나타낸다. 환자로부터의 샘플과 비교하는 데 사용되는 경우, "당뇨병인 개체"는 공복 혈당 수준이 126 mg/dl 초과이거나 2시간 PG 판독값이 200 mg/dl 초과인 성인을 나타낸다. "공복"은 적어도 8시간 동안 칼로리 섭취를 하지 않은 것을 나타낸다. "2시간 PG"는 물에 용해된 75 g의 무수 포도당의 등가물을 함유하는 포도당 부하물을 환자에게 부하한 후의 혈당 수준을 나타낸다. 전반적인 검사를 통상 경구 내당능 검사 (OGTT)라 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Diabetes Care, 2003, 26(11): 3160-3167 (2003)]을 참조한다.
핵산 또는 단백질에 적용되는 경우에 용어 "단리된"은, 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 결합된 다른 세포 성분을 본질적으로 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 동질 상태인 것이 바람직하다. 이는 건조 상태로 또는 수용액으로 존재할 수 있다. 순도 및 동질성은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 이용하여 통상 측정된다. 시료 중에 우세하게 존재하는 종류의 단백질이 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 유전자는, 상기 유전자의 측면에 위치하며 관심 유전자 이외에 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성함을 나타낸다. 특히, 이는 핵산 또는 단백질이 85％ 이상 순수, 더욱 바람직하게는 95％ 이상 순수, 가장 바람직하게는 99％ 이상 순수하다는 것을 의미한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)을 나타낸다. 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는, 참조 핵산으로서 유사한 결합 특성을 가지며 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명확하게 명시된 서열 뿐만 아니라, 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 올소로그(ortholog), SNP 및 상보적 서열을 함축적으로 포함한다. 특히, 축퇴성 코돈 치환은, 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈 중 세번째 위치의 것이 혼합형 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (문헌 [Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; [Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)]; 및 [Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]).
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 아미노산 잔기의 중합체를 나타내는 데 사용된다. 이 용어들은 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체, 및 또한 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산 및 합성 아미노산, 및 또한 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 나타낸다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해서 코딩된 아미노산, 및 또한 추후 변형된 이들 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기에 결합된 α-탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 나타낸다. 이러한 유사체는 변형된 R기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 상이한 구조를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 나타낸다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 나타낸다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 소정의 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈으로 명시된 모든 위치에서, 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 기재된 상응하는 코돈 중의 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류인 "침묵 변이"이다. 본원에서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재하고 있다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)을 변형시켜 기능적으로 동일한 분자를 수득할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내재한다.
아미노산 서열에 대해, 당업자는 코딩되는 서열 내의 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가가, 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환된 변경에 의해 "보존적으로 변형된 변이체"가 되게 함을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 당업계에 널리 알려져 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 대해 부가적인 것이며, 이들을 제외하지 않는다.
다음의 8개의 군은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌 (A), 글리신 (G);
2) 아스파르트산 (D), 글루타민산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 라이신 (K);
5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);
6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W);
7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및
8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조).
"서열 동일성의 백분율"은 2개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교창(comparison window) 상에서 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교창 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 부가 또는 결실을 포함하지 않는 참조 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드)과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 두 서열 모두에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 측정하여 매칭된 위치의 수를 얻고, 매칭된 위치의 수를 비교창 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 얻음으로써 계산될 수 있다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성"％는 동일한 서열인 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 나타낸다. 2개의 서열은, 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 검사로 측정시 비교창 또는 지정된 영역에 대해서 최대로 상응하도록 비교 및 정렬될 때, 2개의 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 백분율 (즉, 특정 영역에 대해서 또는 특정되지 않을 때 참조 서열의 전체 서열에 대해서 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％의 서열 동일성)을 가질 경우 "실질적으로 동일하다". 본 발명은 각각 본원에서 예시된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 서열 1-11 중 임의의 하나에서 예시된 가변 영역; 서열 12-24 중 임의의 하나에서 예시된 가변 절편; 서열 25-42 중 임의의 하나에서 예시된 CDR; 서열 43-61 중 임의의 하나에서 예시된 FR; 서열 62-73 중 임의의 하나에서 예시된 핵산 서열)와 실질적으로 동일한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 임의로, 동일성은 길이가 약 15, 25 또는 50개 이상의 뉴클레오티드인 영역, 또는 보다 바람직하게는 길이가 100 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드인 영역, 또는 참조 서열의 전장에 걸쳐 존재한다. 아미노산 서열과 관련하여, 동일성 또는 실질적인 동일성은 길이가 5, 10, 15 또는 20개 이상의 아미노산인 영역, 임의로 길이가 약 25, 30, 35, 40, 50, 75 또는 100개 이상의 아미노산인 영역, 임의로 길이가 약 150, 200 또는 250개 이상의 아미노산인 영역, 또는 참조 서열의 전장에 걸쳐 존재할 수 있다. 보다 짧은 아미노산 서열, 예를 들어 20개 이하의 아미노산의 아미노산 서열과 관련하여, 본원에서 정의된 보존적 치환에 따라 1 또는 2개의 아미노산 잔기가 보존적으로 치환될 때 실질적인 동일성이 존재한다.
서열 비교를 위해, 일반적으로 하나의 서열이 참조 서열로서 작용하고, 그에 대해 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우에 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트(default) 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 또는 별도의 파라미터를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기초로 하여 참조 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성％를 계산한다.
본원에서 사용된 "비교창"은, 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후에 서열을 동일한 근접 위치의 수의 참조 서열에 대해 비교할 수 있는, 20 내지 600, 일반적으로 약 50 내지 약 200, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 근접 위치의 수 중 임의의 하나의 절편에 대한 참조를 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 검색 방법에 의해, 상기 알고리즘의 컴퓨터 실행 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) (제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재) 중 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성％ 및 서열 유사성 결정에 적합한 알고리즘의 2가지 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이들은 문헌 [Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402] 및 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 내셔날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information)을 통해 공개적으로 이용가능하다. 상기 알고리즘은 먼저 질의 서열 내에 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 스코어링 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함하고, 이는 데이타베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드로 정렬될 때 일부 양의 값의 역치 스코어 T에 일치하거나 이 스코어를 만족시킨다. T는 인접한 워드(neighborhood word) 스코어 역치로 지칭된다 (상기 알출(Altschul) 등의 문헌). 이들 초기의 인접한 워드 일치(hit)는 이들을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾는 검색을 개시하기 위한 초기값(seed)으로서 작용한다. 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한, 워드 일치는 각각의 서열을 따라 두 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라미터 M (매칭 잔기의 쌍에 대한 리워드 스코어; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스가 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 각각의 방향으로 워드 일치의 연장은, 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성값에서 양 X만큼 하락하거나; 누적 스코어가 하나 이상의 음의 스코어링의 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 또는 그 미만이 되거나; 어느 한 서열의 말단에 도달하는 경우에 중지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 워드길이 (W), 10의 예상치 (E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 이용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 워드 길이 및 10의 예상치 (E)를 이용하고, BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 참조)는 50의 정렬 (B), 10의 예상치 (E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 이용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 최소 합 확률 (P(N))이고, 이는 그에 의해 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매칭이 우연히 일어날 확률을 표시한다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면, 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 표시는, 하기 기재된 바와 같이 제1 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학상 교차 반응성이다는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 통상, 예를 들어 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또다른 표시는, 하기 기재된 바와 같이 2개의 분자 또는 그들의 상보체가 엄격한 조건 하에 서로에 대해 혼성화한다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또다른 표시는 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.
항원-결합 영역이 본 발명의 TrkB-결합 분자 내에서 연결되는 방식을 기재하는 것과 관련하여 사용된 용어 "연결하다"는 영역들을 물리적으로 연결하기 위한 모든 가능한 수단을 포함한다. 다수의 항원-결합 영역들은 공유 결합 (예를 들어, 펩티드 결합 또는 디술피드 결합), 또는 직접 결합 (즉, 2개의 항원-결합 영역 사이에 링커 없이 결합) 또는 간접 결합 (즉, 2개 이상의 항원-결합 영역 사이에 하나 이상의 링커 분자의 도움으로 결합)일 수 있는 비-공유 결합과 같은 화학 결합에 의해 자주 연결된다.
용어 "대상체", "환자" 및 "개체"는 상호교환적으로 포유동물, 예를 들어 인간 또는 비-인간 영장류 포유동물을 나타낸다. 포유동물은 또한 실험실 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 햄스터일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 농경 포유동물 (예를 들어, 말, 양, 소, 돼지, 낙타과) 또는 가축 포유동물 (예를 들어, 개, 고양이)일 수 있다.
용어 "치료상 허용되는 양" 또는 "치료 유효 용량"은 상호교환적으로 목적하는 결과 (즉, 표적 세포의 아팝토시스)를 수행하기에 충분한 양을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 치료상 허용되는 양은 바람직하지 않은 부작용을 유발 또는 초래하지 않는다. 치료상 허용되는 양은 먼저 적은 용량을 투여한 후, 목적하는 효과가 달성될 때까지 용량을 점차 증가시켜 결정될 수 있다. 본 발명의 TrkB 효능 항체의 "예방적 유효 투여량" 및 "치료 유효 투여량"은 각각 질환 증상 (예를 들어, TrkB 신호전달의 비정상적으로 낮은 수준과 관련된, 예컨대 BDNF를 포함한 TrkB 리간드 결핍으로 인한 장애의 증상)의 발병을 예방하거나 또는 이들의 중증도를 감소시킬 수 있다. 상기 용어는 또한 질환 증상이 없는 빈도 및 기간을 각각 증진 또는 상승시킬 수 있다. "예방적 유효 투여량" 및 "치료 유효 투여량"은 또한 TrkB의 불충분한 활성화로 인한 장애 및 질환에 기인한 손상 또는 장애를 각각 예방 또는 완화시킬 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "호흡성 장애"로는, 이들로 한정되지는 않지만, 무기폐, 낭성 섬유증, 레트 증후군 (RTT), 천식, 무호흡 (예를 들어, 수면 무호흡), 급성 호흡곤란 증후군 (ARDS), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 기종, 급성 호흡곤란, 빠른호흡, 기좌호흡, 류마티스성 폐 질환, 폐 울혈 또는 부종, 만성 폐쇄성 기도 질환 (예를 들어, 기종, 만성 기관지염, 기관지 천식 및 기관지확장증), 호흡저하, 픽윅(Pickwickian) 증후군, 비만-호흡저하 증후군, 유아 돌연사 증후군 (SIDS) 및 과탄산혈증을 들 수 있다. 게다가, "호흡성 장애"는 또한 유전자 결함과 관련된 것으로 알려진 인간의 상태, 예컨대 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease), 체인-스토크스(Cheyne-Stokes) 호흡 장애, 윌리-프라더(Willi-Prader) 증후군, 유아 돌연사 증후군, 선천성 중추성 호흡저하, 미만성 간질성 질환 (예를 들어, 사르코이드증, 진폐증, 과민성 폐렴, 세기관지염, 굿패스쳐(Goodpasture's) 증후군, 특발성 폐 섬유증, 특발성 폐 혈철증, 폐포성 단백증, 박리성 간질성 폐렴, 만성 간질성 폐렴, 섬유화 폐포염, 해만-리치 증후군, 폐호산구증가증, 미만성 간질성 섬유증, 베게너(Wegener's) 육아종, 림프종양 육아종증 및 지질폐렴) 또는 종양 (예를 들어, 기관지원성 암종, 기관지 폐포암, 기관지 카르시노이드, 과오종 및 중간엽 종양)을 포함한다.
도 1은 항체의 V-영역을 포함하는 구조 단위의 개략도이다. 중쇄는 3개의 유전자 족 (중쇄-V, D 및 J)에 의해 코딩되고, 경쇄는 2개의 유전자 족 (카파 또는 람다 V 및 J)에 의해 코딩된다. 이들 유전자의 재조합은 무손상 V-영역을 생성시킨다. CDR3 서열은 중쇄의 경우에는 중쇄 V, D 및 J 유전자의 재조합 부위에, 경쇄의 경우에는 카파 또는 람다 V 및 J 유전자의 재조합 부위에 존재한다.
도 2는 인간 아미노산 서열로 참조 항체 아미노산 서열을 대체한 개략도를 예시한다.
도 3은 포르테바이오 옥테트(ForteBio Octet) 바이오센서 기술을 이용한 바이오-층 간섭법에 의한 재조합 TrkB 항원에 대한 Fab의 결합 분석을 예시한다. 이들 곡선에 대한 수치 데이타는 표 1 및 2에 나타낸다.
도 4는 포르테바이오 옥테트 바이오센서 기술을 이용한 바이오-층 간섭법에 의한 재조합 TrkB 항원에 대한 IgG의 결합 분석을 예시한다. 이들 곡선에 대한 수치 데이타는 표 3에 나타낸다.
도 5는 Fab 클론 TR134-4 (서열 76 및 80), TR135-8 (서열 76 및 81), TR139-2 (서열 76 및 82), TR151-1 (서열 77 및 82) 및 TR144-1 (서열 78 및 81)의 정렬된 가변 영역 아미노산 서열 (FR1에서 CDR3), 및 생식계열 Vh1-02 (서열 15) 또는 VkII A23 (서열 79)의 인접한 단일 인간 가변 영역 번역물과의 비교를 예시한다. 모든 Fab Vh-영역에 대한 FR4 (나타내지 않음)는 인간 생식계열 JH4로부터이고, 서열 WGQGTLVTVSS (서열 50)를 갖는다. 모든 Fab Vk-영역에 대한 FR4 (나타내지 않음)는 인간 생식계열 Jk2로부터이고, 서열 FGQGKLEIK (서열 61)를 갖는다. CDR은 상자 모양으로 표시하고, 생식계열 서열 (CDR3 "BSD" 서열 제외)에서 상응하는 위치와 상이한 잔기는 굵은 글씨로 표시한다. CDR3에 대한 친화도 성숙 변화는 밑줄로 표시하고, Vk CDR3에서의 생식계열 대체 잔기는 이탤릭체로 표시한다.
도 6은 IgG 클론 TR127-2 (서열 76), TR143-3 (서열 78), TR154-2 (서열 77), TR119-1 (서열 84), TR129-1 (서열 85) 및 TR137-1 (서열 86)의 정렬된 가변 영역 아미노산 서열 (FR1에서 CDR3), 및 생식계열 Vh1-02 (서열 15) 또는 VkII A23 (서열 83)의 인접한 단일 인간 가변 영역 번역물과의 비교를 예시한다. 모든 IgG Vh-영역에 대한 FR4 (나타내지 않음)는 인간 생식계열 JH4로부터이고, 서열 WGQGTLVTVSS (서열 50)를 갖는다. 모든 IgG Vk-영역에 대한 FR4 (나타내지 않음)는 인간 생식계열 Jk2로부터이고, 서열 FGQGKLEIK (서열 61)를 갖는다. CDR은 상자 모양으로 표시하고, 생식계열 서열 (CDR3 "BSD" 서열 제외)에서 상응하는 위치와 상이한 잔기는 굵은 글씨로 표시한다. CDR3에 대한 친화도 성숙 변화는 밑줄로 표시하고, Vk CDR3에서의 생식계열 대체 잔기는 이탤릭체로 표시한다.
도 7은 ELISA 분석에서 Fab와 인간 V-절편의 결합이 A10F18.2 IgG의 농도 증가에 의해 차단됨을 예시한다.
도 8a-d는 인간 Fc-TrkB에 대한 NVP-LFD253 (a), NVP-LFD254 (b), NVP-LFC325 (c) 또는 NVP-LFC327 (d)의 결합을 예시한다.
도 9a-d는, 인간 TrkB-Fc 또는 TrkC-Fc 융합 단백질이 아닌, 인간 TrkB-Fc 융합 단백질에 대한 NVP-LFD253, NVP-LFD254, NVP-LFC325 및 NVP-LFC327의 특이적인 결합을 나타내는 ELISA 분석을 예시한다. 2 μg/ml의 정제된 IgG를 3가지 상이한 Trk 족 구성원 (TrkA, TrkB 및 TrkC)과의 상호작용을 조사함으로써 특이성에 대해 평가하였다. 2차 Ab는 염소-항-인간 Fab-HRP 검출 Ab만을 이용하여 차단 및 처리된 복제물이다.
도 10a-d는 아노이키스 분석에서 효능제 활성에 대한 NVP-LFD253, NVP-LFD254, NVP-LFC325 및 NVP-LFC327의 평가를 예시한다. 정제된 IgG를 48시간 동안 RIE-TrkB 세포 상에서 평가하였다. (-)는 항체로 처치되지 않았던 세포이다.
도 11a-d는 IgG 항체 NVP-LFD253, NVP-LFD254, NVP-LFC325 및 NVP-LFC327에 대한 대표적인 바이아코어(Biacore) 동적 트레이스를 예시한다. Fc-TrkB는 바이아코어 칩 표면에 대해 고정되었다. IgG의 연속 희석물을 30 μL/분으로 칩 상에서 유동시켰다. 결합 단계는 300초였으며, 이 후 자유 완충 유동에서의 해리 단계는 1200초였다.
도 12는 항-TrkB 효능제를 이용한 장기 처치가 Mecp2-Bird 마우스의 수명을 연장시킨다는 것을 예시한다. Mecp2tm1.1Bird 무표지(null) 마우스는 레트 증후군을 앓고 있는 대상체의 여러 주요 호흡 기능이상 (호흡 주기 동안 증가된 변동성, 빠르고 느린 호흡 주기의 기간 교차, 무호흡의 발생, 증가된 평균 호흡 주기 (및 분당 환기량) 포함)을 반복한다. 상기 마우스는 결국 치명적인 호흡 부전으로 사망한다. 항체 A10은 본원에 기재된 개선된 항-TrkB 항체 효능제와 상보성 결합 결정 영역 (CDR) 및 최소 결합 결정자를 공유하는 모 마우스 모노클로날 항체를 나타낸다.
도 13은 항-TrkB 효능제 mAb로 처치된 Mecp2-Bird 마우스에서의 호흡 기능 개선을 예시한다. 항-TrkB 효능제 mAb를 이용한 처치 후 Mecp2 마우스의 호흡 파라미터를 전신 체적변동기록으로 평가하였다. 비처치된 Mecp2 마우스는 mAb 처치된 동물에서 감소되었던 강화된 호흡 중지 (Penh)에서의 연령-의존성 증가를 나타내었다. 연령-의존성 Penh는 증가된 기도 저항을 나타낼 수 있으며, RTT 환자에서 표현형모사 발살바법(valsalva maneuver) 합병증일 수 있다. 증가된 호흡 주기 및 감소된 흡기 시간이 야생형 및 mAb 처치에 따른 Mecp2 마우스 모두에서 관찰되었다. * p<.05, ** p<.01 대 동일한 유전자형, 상방된 처치; # p<.05, ## p<.01, ### p<.001 대 상반된 유전자형, 동일한 처치; $ p<.05, $$ p<.01, $$$ p<.001 MeCP2-KO/A10 대 MeCP2-WT/SAL. 일원 ANOVA, 이어서 스튜던트 t-검정(Student's t-test).
도 14는 사이노몰거스(Cynomolgus) 원숭이에 대한 항-TrkB 효능제 mAb LFI987의 정맥내 투여 후 음식 섭취 및 체중에 대한 효과를 예시한다. 항체 클론 LFD253을, HC 가변 영역을 침묵(silent) IgG1 주쇄로 이동시켜 LFI987로 전환하였다. 제1, 5 및 8일에 동물에게 0.3 및 3.0 mg/kg의 LFI987을 3회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 데이타는 평균 ± SE; n=4-6이었다. 반복 측정 아노바 및 이어서 듀넷(Dunnett's) 검정에 의한 *P<0.05 대 기준선. LFI987은 투여량-의존성 방식으로 음식 섭취 및 체중을 유의하게 증가시켰다.
1. 도입
본 발명은 개선된 TrkB 효능제 항체를 제공한다. 본 발명의 개선된 TrkB 효능제 항체는 TrkB에 특이적으로 결합하고, TrkB를 활성화시킨다. 본 발명의 TrkB 효능제 항체는 TrkB 효능제 리간드 결핍, 예를 들어 BDNF 결핍으로 인한 장애 및 질환의 증상을 감소, 억제 및 예방하는 데 있어서 사용을 제공한다. 본 발명의 항-TrkB 효능제 항체를 사용하여 치료가능한 예시적인 질환으로는 레트 증후군, WAGR 증후군, MC4R 돌연변이로 인한 비만, 및 악액질/소모 증후군 (예를 들어, 암, 노화, 섭식 장애 또는 약물로 인한 것)을 들 수 있다. 항-TrkB 효능제 항체는 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 혈당 수준을 감소시키는 데 있어서 사용을 제공한다. 또한, 본 발명의 TrkB 효능제 항체는 체중 증가를 예방하는 데 있어서 사용을 제공한다. TrkB 활성화는 고혈당증 및 그의 관련 상태, 비만, 전당뇨병 및 II형 당뇨병을 예방하는 데 유용하다.
2. 일반적으로 개선된 항-TrkB 항체
본 발명의 항체는 트로포마이오신-관련 키나제 (Trk) 수용체 티로신 키나제 B (TrkB)와 특이적으로 결합한다. 이렇게 하여, 본 항체는 리간드 결합 부위에 결합하여 천연 리간드 (예를 들어, 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) 또는 뉴로트로핀-3)의 결합을 차단할 수 있고, 이는 길항제로서 작용하거나 또는 효능제로서 작용한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항-TrkB 항체는 TrkB 수용체의 효능제로서 작용한다. TrkB 항체 효능제는, TrkB에 특이적으로 결합하고 TrkB-매개된 세포내 신호전달을 활성화 또는 증가시키는 항체이다. 항-TrkB 항체는 본 발명의 방법에 따라 임의로 다량체화되어 사용될 수 있다. 항-TrkB 항체는 전장 사량체 항체 (즉, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 가짐), 단일 쇄 항체 (예를 들어, ScFv), 또는 하나 이상의 항원-결합 부위를 형성하고 TrkB-결합 특이성을 제공하는 항체 단편, 예를 들어 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (예를 들어, Fab' 또는 다른 유사 단편)을 포함하는 분자일 수 있다.
항-TrkB 항체 단편은, 이들로 한정되지는 않지만, 재조합 발현, 화학적 합성 및 항체 사량체의 효소 소화를 비롯한 당업계에 공지된 임의의 수단으로 생성될 수 있는 반면, 전장 모노클로날 항체는, 예를 들어 하이브리도마 또는 재조합 생산에 의해 수득될 수 있다. 재조합 발현은 당업계에 공지된 임의의 적절한 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포, 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포 등으로부터일 수 있다. 존재하는 경우, 항-TrkB 항체의 불변 영역은 적절한 경우에 임의의 유형 또는 하위유형일 수 있고, 본 방법으로 치료될 대상체의 종 (예를 들어, 인간, 비-인간 영장류 또는 다른 포유동물, 예를 들어 농경 포유동물 (예를 들어, 말, 양, 소, 돼지, 낙타과), 가축 포유동물 (예를 들어, 개, 고양이) 또는 설치류 (예를 들어, 래트, 마우스, 햄스터, 토끼))으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 항-TrkB 항체 또는 항원-결합 분자는 또한 낙타과 골격을 갖는 단일 도메인 항원-결합 단위를 포함한다. 낙타과의 동물로는 낙타, 라마 및 알파카를 들 수 있다. 낙타과는 경쇄가 없는 기능적 항체를 생성한다. 중쇄 가변 (VH) 도메인은 자발적으로 폴딩되고, 항원-결합 단위로서 독립적으로 기능한다. 그의 결합 표면은, 전형적인 항원-결합 분자 (Fab) 또는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)의 6개의 CDR에 비해 단지 3개의 CDR만을 포함한다. 낙타과 항체는 통상적인 항체의 결합 친화도와 유사한 결합 친화도를 달성할 수 있다. 본원에 예시된 항-TrkB 항체의 결합 특이성을 갖는 낙타과 골격-기반 항-TrkB 분자는 당업계에 널리 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Dumoulin et al., Nature Struct. Biol. 11:500-515, 2002]; [Ghahroudi et al., FEBS Letters 414:521-526, 1997]; 및 [Bond et al., J Mol Biol. 332:643-55, 2003]의 방법을 이용하여 생성될 수 있다.
본 발명의 개선된 항-TrkB 항체는, 참조 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서, 인간 생식계열 V-영역 서열에 대해 실질적인 아미노산 서열 동일성을 갖는 V-영역 서열을 갖는 유전자 조작된 인간 항체이다. 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 제2005/0255552호 및 미국 특허 공개 제2006/0134098호를 참조한다. 개선 방법은, 참조 항체의 가변 영역으로부터 항원-결합 특이성을 결정하기 위해 필요한 최소 서열 정보를 확인하고, 상기 정보를 인간 부분적 V-영역 유전자 서열의 라이브러리에 전달하여 인간 항체 V-영역의 에피토프-집중(focused) 라이브러리를 생성시킨다. 미생물-기반 분비 시스템을 사용하여 항체 Fab 단편으로서 라이브러리의 구성원을 발현시킬 수 있고, 라이브러리는 예를 들어 콜로니-리프트(colony-lift) 결합 분석법을 이용하여 항원-결합 Fab에 대해 스크리닝된다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제2007/0020685호를 참조한다. 양성 클론은 최고 친화도를 갖는 클론을 확인하기 위해서 추가로 특성화될 수 있다. 생성된 유전자 조작된 인간 Fab는 모 항체, 즉, 참조 항-TrkB 항체의 결합 특이성을 보유하고, 통상 모 항체와 비교시 항원에 대해 동등하거나 더 높은 친화도를 갖고, 인간 생식계열 항체 V-영역과 비교시에 고도의 서열 동일성을 갖는 V-영역을 갖는다.
에피토프-집중 라이브러리를 생성하는 데 필요한 최소 결합 특이성 결정자 (BSD)는 일반적으로 중쇄 CDR3 ("CDRH3") 내의 서열 및 경쇄 CDR3 ("CDRL3") 내의 서열에 의해 제시된다. BSD는 CDR3의 일부 또는 전체 길이를 포함할 수 있다. BSD는 연속적인 또는 비-연속적인 아미노산 잔기로 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 에피토프-집중 라이브러리는 BSD를 함유하는 참조 항체로부터의 특이한 CDR3-FR4 영역에 연결된 인간 V-절편 서열 및 인간 생식계열 J-절편 서열로부터 제작된다 (도 1 및 미국 특허 공개 제2005/0255552호 참조). 별법으로, 인간 V-절편 라이브러리는 참조 항체 V-절편의 일부만이 초기에 인간 서열의 라이브러리로 교체되는 순차적인 카세트(cassette) 교체에 의해 생성될 수 있다. 이어서, 잔류하는 참조 항체 아미노산 서열과 관련하여 결합을 지지하는 확인된 인간 "카세트"를 제2 라이브러리 스크린에서 재조합하여 완전 인간 V-절편를 생성한다 (미국 특허 공개 제2006/0134098호 참조).
각 경우에, 참조 항체로부터의 특이성 결정자를 함유하는 페어링된 중쇄 및 경쇄 CDR3 절편, CDR3-FR4 절편 또는 J-절편을 사용하여, 라이브러리로부터 얻은 항원-바인더가 참조 항체의 에피토프-특이성을 보유하도록 결합 특이성을 강요한다. 라이브러리를 제작하는 동안 각 사슬의 CDR3 영역 내에 추가의 성숙 변화를 도입하여 최적의 결합 운동학을 갖는 항체를 확인할 수 있다. 생성돤 유전자 조작된 인간 항체는 인간 생식계열 라이브러리로부터 유도된 V-절편 서열을 갖고, CDR3 영역 내부로부터의 짧은 BSD 서열을 보유하고, 인간 생식계열 프레임워크 4 (FR4) 영역을 갖는다.
따라서, 몇몇 실시양태에서, 항-TrkB 항체는 기원 또는 참조 모노클로날 항체로부터 유도된 중쇄 및 경쇄의 CDR3 내부의 최소 결합 서열 결정자 (BSD)를 함유한다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (CDR 및 FR)의 나머지 서열, 예를 들어 V-절편 및 J-절편은 상응하는 인간 생식계열 및 친화도 성숙 아미노산 서열로부터이다. V-절편은 인간 V-절편 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 추가의 서열 개선(refinement)은 친화도 성숙에 의해 달성할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 항-TrkB 항체의 중쇄 및 경쇄는, 예를 들어 인간 V-절편 라이브러리로부터 선택되는 상응하는 인간 생식계열 서열로부터의 인간 V-절편 (FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3), 및 기원 모노클로날 항체로부터의 CDR3-FR4 서열 절편을 함유한다. CDR3-FR4 서열 절편은 서열 절편의 상응하는 인간 생식계열 서열로의 교체 및/또는 친화도 성숙에 의해 추가로 개선될 수 있다. 예를 들어, BSD 주위의 FR4 및/또는 CDR3 서열은 상응하는 인간 생식계열 서열로 교체될 수 있는 반면, 기원 모노클로날 항체의 CDR3으로부터의 BSD는 보유된다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 V-절편에 대한 상응하는 인간 생식계열 서열은 Vh1-02이다. 몇몇 실시양태에서, 중쇄 J-절편에 대한 상응하는 인간 생식계열 서열은 JH4이다. 몇몇 실시양태에서, 중쇄 J-절편은 인간 생식계열 JH4 부분 서열 WGQGTLVTVSS (서열 50)를 포함한다. 인간 생식계열 JH4로부터의 전장 J-절편은 YFDYWGQGTLVTVSS (서열 74)이다. 가변 영역 유전자는 면역글로불린 가변 영역 유전자에 대한 표준 명명법에 따라 언급된다. 현재의 면역글로불린 유전자 정보는 월드와이드 웹을 통해서, 예를 들어 ImMunoGeneTics (IMGT), V-base 및 PubMed 데이타베이스 상에서 이용가능하다. 또한, 문헌 [Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(2):100-16]; [Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(3):161-74]; [Exp Clin Immunogenet. 2001;18(4):242-54]; 및 [Giudicelli, et al., Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D256-61]을 참조한다.
몇몇 실시양태에서, 경쇄 V-절편에 대한 상응하는 인간 생식계열 서열은 VKII A23이다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 J-절편에 대한 상응하는 인간 생식계열 서열은 Jk2이다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 J-절편은 인간 생식계열 Jk2 부분 서열 FGQGTKLEIK (서열 61)을 포함한다. 인간 생식계열 Jk2로부터의 전장 J-절편은 YTFGQGTKLEIK (서열 75)이다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 V-절편은 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(G/A)Y(D/Y)MHWVRQAPGQGLEWMGWI(D/N)P(N/R)SG(G/D)T(N/R/S)Y(A/K)QKFQGRVTMTRDTSISTAYMEL(H/S)RL(R/T)SDDTAVYYC(A/T)(G/R) (서열 16)에 대해 90％, 93％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 서열 동일성을 공유한다. 몇몇 실시양태에서, 경쇄 V-절편은 아미노산 서열 D(I/V)VMTQ(S/T)PLS(L/S)PVTLGQPASISCRSSQSL(L/V)HS(D/N)GNTYL(N/S)W(L/Y)QQ(K/R/T)PGQPPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC (서열 24)에 대해 90％, 93％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 서열 동일성을 공유한다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 V-절편은 서열 12, 서열 13, 서열 14 또는 서열 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 90％, 93％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 서열 동일성을 공유한다.
몇몇 실시양태에서, 경쇄 V-절편은 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20. 서열 21, 서열 22 또는 서열 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 90％, 93％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 서열 동일성을 공유한다.
몇몇 실시양태에서
i) 중쇄 CDR3은 아미노산 서열 모티프 V(T/V)(S/T/R/N)WFAY (서열 34)를 포함하고;
ii) 경쇄 CDR3은 아미노산 서열 모티프 (S/M)QGT(H/A)(E/V/I)PYT (서열 42)를 포함한다.
몇몇 실시양태에서
i) 중쇄 CDR3은 VTTWFAY (서열 32) 및 VTSWFAY (서열 33)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
ii) 경쇄 CDR3은 MQGTHEPYT (서열 40) 및 MQGTHVPYT (서열 41)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아미노산 서열 (A/G)Y(D/Y)MH (서열 27)를 포함한 CDR1; 아미노산 서열 WI(D/N)P(N/R)SG(G/D)T(N/R/S)Y(A/K)QKFQG (서열 31)를 포함한 CDR2; 및 V(T/V)(S/T/R/N)WFAY (서열 34)의 아미노산 서열을 포함한 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아미노산 서열 RSSQSL(L/V)HSNGNTYL(N/S) (서열 38)을 포함한 CDR1; 아미노산 서열 KISNRFS (서열 39)를 포함한 CDR2; 및 (S/M)QGT(H/A)(E/V/I)PYT (서열 42)의 아미노산 서열을 포함한 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 43의 아미노산 서열을 포함한 FR1; 서열 44의 아미노산 서열을 포함한 FR2; 서열 49의 아미노산 서열을 포함한 FR3; 및 서열 50의 아미노산 서열을 포함한 FR4를 포함한다. 확인된 아미노산 서열은 하나 이상의 치환된 아미노산 (예를 들어, 친화도 성숙으로부터), 또는 1 또는 2개의 보존적으로 치환된 아미노산을 가질 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열 55의 아미노산 서열을 포함한 FR1; 서열 59의 아미노산 서열을 포함한 FR2; 서열 60의 아미노산 서열을 포함한 FR3; 및 서열 61의 아미노산 서열을 포함한 FR4를 포함한다. 확인된 아미노산 서열은 하나 이상의 치환된 아미노산 (예를 들어, 친화도 성숙으로부터), 또는 1 또는 2개의 보존적으로 치환된 아미노산을 가질 수 있다.
이들의 전장에 걸쳐, 본 발명의 항-TrkB 항체의 가변 영역은 일반적으로 상응하는 인간 생식계열 가변 영역 아미노산 서열에 대해 약 90％ 이상, 예를 들어 약 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 전체 가변 영역 (예를 들어, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4) 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 예를 들어, 항-TrkB 항체의 중쇄는 인간 생식계열 가변 영역 Vh1-02/JH4에 대해 약 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 공유할 수 있다. 항-TrkB 항체의 경쇄는 인간 생식계열 가변 영역 VKII A23/Jk2에 대해 약 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열을 공유할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 프레임워크 영역 내의 아미노산만을 첨가, 결실 또는 치환한다. 몇몇 실시양태에서, 서열 동일성 비교는 CD3을 제외한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항-TrkB 항체는 서열 4의 중쇄 가변 영역에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 11의 경쇄 가변 영역에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항-TrkB 항체는 서열 1, 서열 2 및 서열 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9 및 서열 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항-TrkB 항체는 서열 1의 중쇄 가변 영역에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 8 (즉, 클론 LFC325)의 경쇄 가변 영역에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항-TrkB 항체는 서열 1의 중쇄 가변 영역에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 9 (즉, 클론 LFC327)의 경쇄 가변 영역에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항-TrkB 항체는 서열 1의 중쇄 가변 영역에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 10 (즉, 클론 LFD253)의 경쇄 가변 영역에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항-TrkB 항체는 서열 3의 중쇄 가변 영역에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 8 (즉, 클론 LFD254)의 경쇄 가변 영역에 대해 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상 또는 100％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
길이가 20개 미만의 아미노산인 확인된 아미노산 서열에 대해, 1 또는 2개의 보존적 아미노산 잔기 치환은 목적하는 특이적 결합 및/또는 길항제 활성을 여전히 보유하면서 허용될 수 있다.
본 발명의 항-TrkB 항체는 일반적으로 약 10-8 M 또는 10-9 M 미만, 예를 들어 약 10-10 M 또는 10-11 M 미만, 몇몇 실시양태에서는 약 10-12 M 또는 10-13 M 미만의 평형 해리 상수 (KD)로 TrkB에 결합할 것이다.
3. TrkB 효능제 항체를 확인하기 위한 분석법
효능제 항체는, 항-TrkB 항체를 생성한 후에 각각의 항체를 TrkB-매개된 사건을 촉발시키는 능력, 예를 들어 SH-SY5Y 세포의 분화 및/또는 가지형성(dendrification)을 개시하는 능력에 대해 시험하고, 잠재적 TrkB 효능제를 이용한 세포 처리에 대한 반응으로서 아노이키스 (세포-매트릭스 상호작용의 소실로 인한 아팝토시스)로부터의 구제를 측정하거나, 또는 BaF3/TrkB 세포 증식 분석을 이용함으로써 확인될 수 있다.
SH-SY5Y 분석법은 SH-SY5Y 세포를 플레이팅하고, 상기 세포를 잠재적 효능제 항체 및/또는 BDNF의 존재 또는 부재하에 레티노산으로 처리하는 것을 포함하며, 후속적으로 신경돌기 증식을 측정한다. 일반적으로, 레티노산 단독은 소량의 신경돌기 증식을 유도할 것이다. BDNF 단독은 현저한 신경돌기 증식을 유도하지 않으며, 항체 단독도 현저한 신경돌기 증식을 유도하지 않는다. 그러나, 레티노산, BDNF 및 항체로 처리된 세포는 대규모의 신경돌기 증식을 나타낸다. 예시적인 SH-SY5Y 분석법은 문헌 [Kaplan DR, et al., Neuron 11:321-331 (1993)]에 기재되어 있다. 항-TrkB 효능제 항체에 대한 분석 시험에서, BDNF를 시험 항체로 대체한다. 양성 대조군 세포를 BDNF에 노출시킨다.
BaF3 조혈 세포/TrkB 세포 증식 분석법은 TrkB 수용체의 효능 작용에 의해 자극된 세포의 증식을 측정하는 것을 포함한다. 예를 들어, BaF3 세포를 IL-3을 갖는 완전 RPMI 배지에서 성장시키고, TrkB를 발현하는 레트로바이러스로 감염시킨다. 세포를 IL-3의 부재하에 세척하고, 플레이팅한다. 적절한 인큐베이션 후, 잠재적인 효능제 항체 및 세포 생존을 측정한다 (예를 들어, 발광 세포 생존력 검출 시약, 예컨대 셀-타이터 글로(CeIl-Titer Glo)™를 이용함). 양성 대조군 세포는 BDNF와 함께 인큐베이션한다.
아노이키스 분석법은 래트 창자 상피성 (RIE)/TrkB 세포를 (예를 들어, DMEM 배지에서) 재현탁시키고, 세포를 임의로 다중 웰 용기에서 잠재적 항체 효능제 (예를 들어, 1-20 μg/ml 항체 중 2.5x104 세포 10 μl)와 접촉시키는 것을 포함한다. 혼합물을 BDNF 대조군의 존재 또는 부재하에 인큐베이션한 후, 세포 생존력을 측정한다 (예를 들어, 발광 세포 생존력 검출 시약, 예컨대 셀-타이터 글로™를 이용함). 예시적인 아노이키스 분석법은 문헌 [Douma et al., Nature 430:1034-1039(2004)]에 기재되어 있다.
TrkB 효능제는 또한 빈블라스틴 및 시스플라틴 독성으로부터 세포를 보호하는 그의 능력에 대해 SH-SY5Y 세포 상에서 평가될 수 있다. 이들 분석법은 예를 들어 문헌 [Scala et al., Cancer Res. 56(16):3737-42 (1996)]; 및 [Jaboin et al., Cancer Res. 62(22):6756-63 (2002)]에 기재되어 있다.
4. 항- TrkB 효능제 항체의 이용 방법
본 발명의 항-TrkB 효능제 항체를 이용하여 호흡성 장애 및 질환, 특히 불충분한 TrkB 신호전달로 인한 장애 및 질환; BDNF 불충분으로 인한 장애 및 질환; 및 불충분한 TrkB 신호전달로 인한 낮은 창자 운동성 질환 (예를 들어, 염증성 장 증후군)을 비롯한, 증가된 TrkB 활성으로부터 이점을 얻는 임의의 질환 또는 상태를 치료 또는 완화시킬 수 있다.
본 발명의 TrkB 효능제 항체는 TrkB와 상호작용하고, 이로써 TrkB 기능을 조절할 수 있다. 본 발명의 TrkB 효능제 항체는 TrkB의 하나 이상의 생물학적 기능을 조절 (예를 들어, 촉진)할 수 있다. 예를 들어, TrkB 효능제 항체는 TrkB의 이량체화, 및 TrkB 세포내 도메인 상의 특정 티로신 잔기의 후속적인 자가인산화를 조절할 수 있다. 추가 예로서, TrkB 효능제 항체는 뉴런 사멸 저해, 신경돌기 증식 촉진 및 뉴로트로핀의 다른 작용을 유발하는 TrkB-관련 세포내 신호전달 캐스케이드 (예를 들어, 미토겐-활성화 단백질 키나제, 포스파티딜이노시톨 3-키나제 및 PLCγ 경로)를 개시할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 TrkB 효능제 항체는 BDNF 모방체로서 작용하고, 이를 사용하여 BDNF 및 다른 TrkB 효능제 리간드의 영양 활성을 반복함으로써 신경보호 및 신경영양 효과를 제공할 수 있다. 본 방법의 항-TrkB 효능제 항체는 TrkB와의 결합에 대해 BDNF와 경쟁함으로써 TrkB 경로 활성화 및 신호전달을 활성화, 향상 또는 영구화할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 TrkB 효능제 항체는 TrkB 리간드 결합 도메인에 결합하여, TrkB와의 결합에 대해 BDNF와 경쟁한다.
따라서, TrkB 효능제 항체를 사용하여 시험관내 및 생체내에서 TrkB 경로 신호전달을 용이하게 할 수 있다. 본 발명의 TrkB 효능제 항체는, 예를 들어 TrkB 경로 신호전달의 비정상적으로 낮은 수준과 관련된 장애 (예를 들어, 고통받는 대상체에서 BDNF 불충분 또는 또다른 TrkB 효능제 리간드의 불충분에 기인함)의 증상을 진단, 억제, 예방, 완화시키고, 상기 장애로부터 보호하며, 상기 장애를 치료하는 데 있어서 사용을 제공한다. TrkB 신호전달의 비정상적인 하향조절과 관련된 장애의 비제한적인 예로는 MeCP2 (BDNF에 직접 결합함)를 코딩하는 유전자에서의 돌연변이를 특징으로 하는 레트 증후군 (RTT); TrkB 기능 상실 돌연변이로 인한 심한 비만 및 발달 지체 (문헌 [Giles, S., et al. (2004) Nature Neuroscience 7:1187-9]), 빌름스 종양, 무홍채증, 비뇨생식 이상 및 정신 지체 (WAGR) 증후군 (문헌 [Han, et al., N Engl J Med (2008) 359(9):918-27]), 멜라노코르틴 수용체 MC4R 결핍으로 인한 비만 (문헌 [Farooqi and O'Rahilly, Endocrine Rev (2006) 27(7):710-18]), 악액질/근육 쇠약 증후군 (문헌 [Lin, et al., PIoS, 3(4):el900; WO 2007/088476])을 들 수 있다.
따라서, 본 발명은, 치료 또는 예방 유효량의 본원에 기재된 TrkB 효능제 항체 및 제약 담체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, BDNF 결핍으로 인한 장애 및 질환 (예를 들어, 레트 증후군 (RTT), WAGR 증후군, 멜라노코르틴 수용체 MC4R 결핍으로 인한 비만, 악액질/근육 쇠약 증후군)을 치료, 진단, 예방 및/또는 완화시키는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 항-TrkB 항체는 전신 또는 말초, 예를 들어 경구, 흡입, 정맥내 또는 복막내 투여된다.
본원에 기재된 항-TrkB 항체는 또한 호흡성 질환 및 장애, 특히 불충분한 TrkB 활성으로 인한 질환 및 장애를 치료, 진단, 예방 및/또는 완화시키는 데 있어서 사용을 제공한다. 예시적인 호흡성 장애로는 레트 증후군, 수면 무호흡, 픽윅 증후군 및 본원에 기재된 기타 장애를 들 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 제약 조성물은 호흡곤란 (예를 들어, 호흡 장애)의 치료, 진단, 예방 및/또는 완화에서 사용하기 위한 별개의 독립적인 작용제, 예컨대 노르에피네프린 및/또는 세로토닌 경로의 소분자 활성화제 (예로는, 제한 없이 트리시클릭 항우울제 데시프라민 (DMI), 세로토닌 1A 수용체 부분 효능제, 부스피론, 및 보다 선택적인 항우울제인 플루옥세틴 및 레복세틴을 들 수 있음), 글루타메이트성 AMPA 수용체의 활성화제, 예를 들어 AMPAkine CX546, 프로스타글란딘, 프로게스테론, 또는 TrkB 활성의 증강제 (예를 들어, 단백질 티로신 포스파타제 억제제)를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 호흡 장애 또는 호흡곤란의 증상을 치료, 진단, 예방 및/또는 완화시키는 데 효과적인 제2 작용제의 치료 및/또는 예방 유효량을 TrkB의 항체 효능제와의 조합물 (또는 이들을 함유하는 제약 조성물)로 개체에 투여한다. 몇몇 실시양태에서, 제2 작용제 및 TrkB의 항체 효능제 (또는 이들을 함유하는 제약 조성물)을 혼합물로서 투여한다. 몇몇 실시양태에서, 제2 작용제는 노르에피네프린 및/또는 세로토닌 경로의 소분자 활성화제 (예로는 트리시클릭 항우울제 데시프라민 (DMI), 세로토닌 1A 수용체 부분 효능제, 부스피론, 및 보다 선택적 항우울제인 플루옥세틴 및 레복세틴을 들 수 있음), 글루타메이트성 AMPA 수용체의 활성화제, 예를 들어 AMPAkine CX546, 프로스타글란딘, 프로게스테론, 또는 TrkB 활성의 증강제 (예를 들어, 단백질 티로신 포스파타제 억제제)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한, 항-TrkB 효능제 항체 또는 이를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, TrkB로부터의 세포내 신호전달 결핍으로 인한 호흡곤란 또는 호흡 장애의 증상을 치료, 진단, 예방 및/또는 완화시키는 방법을 제공한다. 상기 증상으로는, 이들로 한정되지는 않지만, 호흡 장애 (예를 들어, 협착음 또는 천명, 호흡 중지, 얕은 호흡, 과호흡, 지속 무호흡), 혈액의 불량하거나 감소된 산소공급 (예를 들어, 산소 흡수 장애, 혈액을 이용한 불충분한 폐관류 등에 기인한 청색증), 감소된 노르에피네프린 (NE) 함량, 수질에서 뉴런을 발현시키는 티록신 히드록실라제 (TH)의 감소 및 흉부 동통을 들 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같이 치료 또는 예방 유효량의 티로신 키나제 수용체 B (TrkB)의 항체 효능제를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 치료 또는 예방 유효량의 TrkB 효능제 항체 및 제약 담체를 포함하는 제약 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 레트 증후군을 갖고/거나 호흡곤란의 하나 이상의 증상을 경험한다. 몇몇 실시양태에서, 개체는 호흡곤란의 증상에 취약하다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 TrkB 효능제 항체를 사용하여 개체에서 고혈당증 및/또는 당뇨병 또는 이들의 증상을 치료 또는 경감시킨다. 다르게는 또는 조합으로, 본 발명의 항체를 사용하여 이를 필요로 하는 개체에서 체중을 감소시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 항체를 사용하여 비만을 경감시킨다. 이는 특히, 비만인 개체는 인슐린 저항 및 II형 당뇨병에 걸리기가 더욱 쉽다는 점에서 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 TrkB 효능제 항체 (또는 이를 포함하는 제약 조성물)를 투여하는 것을 포함하는, 신경 세포 사멸을 저해하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 또한 본 발명의 TrkB 효능제 항체를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하여 신경변성 또는 중추신경계 (CNS) 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 예시적인 CNS 질환으로는 예를 들어 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병 또는 ALS 질환을 들 수 있다.
TrkB 활성화를 증가시키는 것은 또한 물질 남용 완화와 관련되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제2005/0203011호를 참조한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 TrkB 효능제 항체를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하여 물질 (예를 들어, 알코올, 니코틴 및/또는 마약) 남용 및 의존을 완화시키는 방법을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 단일 쇄 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 티로신 키나제 수용체 A 또는 티로신 키나제 수용체 C에 결합하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 뉴로트로핀 수용체 p75NR에 결합하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 다른 종류의 TrkB (예를 들어, 비-인간 영장류 또는 마우스 TrkB)에 최소로 결합하거나 결합하지 않으면서 인간 TrkB에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 TrkB 및 다른 종의 TrkB (즉, 마우스, 래트 및/또는 비-인간 영장류 (예를 들어, 사이노몰거스 원숭이 또는 레서스(rhesus) 원숭이)를 비롯한 다른 종의 TrkB와 교차-반응함)에 특이적으로 결합한다.
5. 제약 조성물
본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제형화된 항-TrkB 항체 또는 항원-결합 분자를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 주어진 장애를 치료 또는 예방하기에 적합한 다른 치료제를 추가로 함유할 수 있다. 제약상 담체는 조성물을 강화 또는 안정화하거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 한다. 제약상 허용되는 담체로는 생리학상 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 들 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 투여 방식은 목적하는 결과에 따라 좌우된다. 정맥내, 근육내, 복막내 또는 피하 투여되거나, 또는 표적 부위에 인접하게 투여되는 것이 바람직하다. 제약상 허용되는 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 비강내, 흡입, 척추 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는, 화합물을 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
항체는 단독으로 또는 다른 적합한 성분과 조합하여 에어로졸 제제 (즉, 이는 "분무화"될 수 있음)로 제조되어 흡입을 통해 투여될 수 있다. 에어로졸 제제는 가압형의 허용가능한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등 내에 위치할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 조성물은 멸균 상태 및 유체이다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해서, 분산액의 경우 요구되는 입도 유지에 의해서, 및 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 내에 등장제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 포함시킴으로써 일어날 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 당업계에 널리 공지되고 일상적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 투여될 특정 조성물에 의해서 뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 이용되는 특정 방법에 의해서 어느 정도 결정된다. 따라서, 본 발명의 제약 조성물의 다양한 적합한 제제가 존재한다. 항체를 제제화하고 적절한 투여량 및 스케쥴을 결정하는 데 적용가능한 방법은, 예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., 2005, Lippencott Williams & Wilkins (2006)]; 및 [Martindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press.] 및 [Martindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition., 1996, Amer Pharmaceutical Assn] 및 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]에서 찾을 수 있고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 제약 조성물은 바람직하게는 GMP 조건하에 제조된다. 전형적으로, 항-TrkB 항체의 치료 유효 용량 또는 효능 용량이 본 발명의 제약 조성물 에서 사용된다. 항-TrkB 항체는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제형화된다. 투여 처방계획은 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 치료 또는 예방 유효 용량을 결정하는 데 있어서, 적은 용량을 투여한 후, 목적하는 반응이 최소의 바람직하지 않은 부작용과 함께 또는 부작용 없이 달성될 때까지 점차 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 단일 볼러스를 투여할 수 있거나, 몇몇 분할 용량을 일정 시간에 걸쳐 투여할 수 있거나, 용량을 치료 상황의 위급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여의 용이함과 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 투여 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 구분되는 단위를 나타내고; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다.
본 발명의 제약 조성물 내 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 변경될 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 치료 지속 기간, 사용된 특정 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료할 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의료력 등의 요인을 비롯한 다양한 약동학적 요인에 따라 달라진다.
의사 또는 수의사는 제약 조성물에 사용되는 본 발명의 항체의 용량을 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해서 요구되는 것보다 더 낮은 수준으로 시작하여, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 유효 용량은 치료할 특정 질환 또는 상태, 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 의약, 및 치료가 예방적인지 치료적인지 여부를 비롯한 여러 다양한 요인에 따라 달라진다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 필요가 있다. 항체를 사용한 투여의 경우, 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 일반적으로 0.01 내지 5 mg/kg 숙주 체중의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 1 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중이거나, 또는 1-10 mg/kg의 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 처방계획은 2주마다 1회 또는 매월 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다.
작용제가 핵산인 실시양태에서, 통상적인 투여량은 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중 이하, 예를 들어 약 1 mg/kg 체중 내지 약 50 mg/kg 체중의 범위일 수 있다. 몇몇 실시양태에서는 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50 mg/kg 체중이다.
항체는 단일 또는 분할 용량으로 투여될 수 있다. 항체는 일반적으로 여러 번 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 매주, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 항-TrkB 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙할 수 있다. 일부 방법에서 투여량은, 1-1000 ㎍/ml, 일부 방법에서는 25-300 ㎍/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다. 별법으로, 항체는 지속 방출 제형으로서 투여될 수 있고, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자 내 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간화 항체는 키메라 항체 및 비-인간 항체보다 더 긴 반감기를 나타낸다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 치료적인지 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방 용도에서는, 비교적 적은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 덜 빈번한 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그들의 나머지 생애 동안 치료를 계속 받는다. 치료 용도에서는, 비교적 짧은 간격의 비교적 높은 투여량이 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적인 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 때때로 요구된다. 그 후, 환자는 예방적 처방계획으로 투여받을 수 있다.
TrkB 항체 효능제는 체중을 감소시키거나, 혈당 수준을 저하시키거나, 당뇨병을 치료하거나, 당뇨병 증상을 완화시키거나, 신경퇴행성 질환을 치료하거나, 물질 남용을 감소시키는 데 유익한 것으로 알려져 있는 작용제와 조합하여 사용될 수 있다. 당뇨병을 치료하는 데 사용되는 예시적인 작용제로는 예를 들어 인슐린; 술포닐우레아 (예를 들어, 글리피지드 및 아마릴) 및 인슐린분비제 (예를 들어, 나테글리니드 및 레파글리니드); 메트포르민; PPAR감마 효능제 (예를 들어, 로시글리티존 및 피오글리타존) 뿐만 아니라, PPAR알파, PPAR델타, PPAR알파/델타 이중 효능제 및 PPAR알파/감마/델타 pan 효능제; 알파-글루코시다제 억제제 (예를 들어, 아카르보스); DPP-IV 억제제 (예를 들어, 빌다글립틴); 및 GLP-1/GLP-1 유사체 (예를 들어, 엑세나티드)를 들 수 있다. 비만 치료에 사용되는 예시적인 작용제로는, 예를 들어 리파제 억제제 (예를 들어, 오를리스타트); 시부트라민; CB-1 억제제 (예를 들어, 리모나반트); 토피라메이트; 아밀린/아밀린 유사체 (예를 들어, 프람린티드), 렙틴, PYY/PYY 유사체; 및 GLP-1/GLP-1 유사체 (예를 들어, 엑세나티드)를 들 수 있다.
활성제는 TrkB 효능제 항체와의 혼합물로서 함께 투여될 수 있거나, 또는 각각을 개별 투여할 수 있다. 항체 작용제 및 기타 활성제는 동시에 투여될 수 있지만, 그러할 필요는 없다.
< 실시예 >
다음 실시예는 청구된 발명을 예시하지만 제한하지 않도록 제공된다.
실시예 1:
하기 실시예는 인간 생식계열 V-영역 서열에 대해 실질적인 아미노산 서열 동일성을 갖는 항-TrkB 항체의 제작 및 스크리닝을 제공한다.
방법
V-영역의 서브-클로닝
V-영역을 기원 모노클로날 항체 A10F18.2로부터 서브-클로닝하였다. PCR을 이용하여 V-중쇄 및 V-카파 영역의 V-유전자를 증폭시키고, 클로닝에 적합한 제한 효소 부위를 발현 벡터 내로 혼입시켰다. V-영역은 Fab 단편으로서 클로닝되었고, 이를 이. 콜라이(E. coli) 내에서 발현 벡터로부터 발현시켰다. 참조 Fab를 TrkB-항원 결합에 대해 시험하고, 이를 TR3-1로 나타내었다.
또한, V-영역을 IgG 발현 벡터 내로 클로닝하였다. PCR 증폭 및 부가된 제한 부위를 갖는 프라이머를 사용하여 Vh 영역을 증폭시키고, 인간 IgG1 불변 영역을 함유하고 암피실란 및 네오마이신 내성을 제공하는 발현 벡터 내로 클로닝하였다. PCR 증폭 및 부가된 제한 부위를 갖는 프라이머를 사용하여 Vk 영역을 증폭시키고, 인간 카파 불변 영역을 함유하고 암피실란 및 히그로마이신 내성을 제공하는 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 이들 벡터를 다양한 조합물에서 시험하여 기능 분석을 위한 완전 IgG의 패널을 생성하였다.
항체 정제
Fab 단편을 발현 벡터를 사용하여 이. 콜라이로부터의 분비에 의해 발현시켰다. 세포를 OD600이 0.6이 되도록 2xYT 배지에서 성장시켰다. 33 ℃에서 3시간 동안 IPTG를 사용하여 발현을 유도하였다. 어셈블리된 Fab를 주변세포질 분획으로부터 얻고, 표준 방법에 따라 연쇄구균(Streptococcal) 단백질 G를 사용하는 친화도 크로마토그래피 (HiTrap Protein G HP 컬럼; 지이 헬스케어(GE Healthcare))로 정제하였다. Fab를 pH 2.0 완충액에서 용리시키고, 즉시 pH 7.0으로 조정하고, PBS pH 7.4에 대해 투석하였다 (PBS는 칼슘 및 마그네슘을 함유하지 않음).
IgG를 일시적으로 형질 감염된 CHO 세포의 배지 (혈청-무함유)로부터 제조하였다. IgG를 표준 방법에 따라 단백질 A를 사용하는 친화도 크로마토그래피 (HiTrap Protein A HP 컬럼; 지이 헬스케어)로 정제하였다. Fab를 pH 2.7 완충액에서 용리시키고, 즉시 pH 7.0으로 조정하고, PBS pH 7.4에 대해 투석하였다 (PBS는 칼슘 및 마그네슘을 함유하지 않음).
일반적인 ELISA
100 ng의 재조합 Fc-TrkB 항원을 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하여 96웰 미세적정 플레이트에 결합시켰다. 플레이트를 PBS-Tween ("PBST") 중 5％ 우유의 용액으로 33 ℃에서 1시간 동안 차단하였다. 정제된 Fab를 PBS에서 희석하고, 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 33 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 3회 세정하였다. 50 ㎕의 항-인간-카파 사슬 HRP 콘쥬게이트 (시그마(Sigma); PBST에서 0.1 ng/ml로 희석함)를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 33 ℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 및 PBS로 1회 세척하였다. 100 ㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 ("TMB") 기질 (시그마)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 약 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응을 중지시키기 위해, 100 ㎕의 0.2 N H2SO4를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 분광광도계에서 450 nm에서 판독하였다.
차단 ELISA
ELISA 플레이트를 100 ng Fc-TrkB 항원으로 코팅하였다. A10F18.2 IgG의 2배 연속 희석물을 항원과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 IgG를 세정하여 제거하고, Fab의 50 nM 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 Fab를 세정하여 제거하고, 결합된 Fab를 항-인간 카파-HRP 콘쥬게이트로 검출하였다.
콜로니 리프트 결합 분석법 ("CLBA")
Fab 단편의 라이브러리의 스크리닝을 항원 Fc-TrkB-코팅된 니트로셀룰로스 여과기를 사용하여 본질적으로 (미국 특허 공개 제2005/0255552호 및 동 제2006/0134098호) 기재된 바와 같이 수행하였다.
포르테바이오를 이용한 친화도 평가
포르테바이오 옥테트 바이오센서를 사용하여 IgG 및 Fab 단편의 결합 운동학을 분석하였다. 재조합 Fc-TrkB 항원을 EZ-링크(link) 비오티닐화 키트 (피어스(Pierce))를 사용하여 제조사의 방법에 따라 비오티닐화하였다. 이어서, 항원을 스트렙타비딘-코팅된 센서 (포르테바이오)와 커플링시켰다. Fab 결합을 바이오-층 간섭법 분석 및 제조사 제공 소프트웨어를 사용하여 실시간으로 모니터링하였다. 친화도는 측정된 결합 및 해리 상수로부터 계산하였다.
바이아코어를 이용한 친화도 측정
모든 바이아코어 시약은 바이아코어 (지이 헬스케어의 분사, 노르웨이 피스카타웨이 소재)로부터 구입하였다. 광학 바이오센서 바이아코어 S51을 사용한 표면 플라즈몬 공명 측정에 의해 운동 결합 파라미터의 측정을 수행하였다. 상기 기술은 수용체에 대한 리간드의 결합 (ka) 및 해리 (kd)에 관한 미시적 속도 상수의 무-표지 측정을 가능하게 하였다. 이에 따라, 항체-항원 상호작용을 특성화하기에 특히 적합하였다.
시리즈 S CM-5 바이아코어 센서 칩 (보증됨) (바이아코어 #BR-1005-30) 상에 Fc-hTrkB를 고정화하여 개선된 항체에 대한 결합 연구를 수행하였다. Fc-융합 단백질의 공유 결합을 '아민 커플링 키트' (바이아코어 #BR-1000-50)를 사용하여 수행하였다. Fc-융합 단백질을 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.5 (바이아코어 #BR-1003-50) 중 5 μg/ml로 10 μL/분의 유속으로 EDC-활성화된 덱스트란 표면에 부착하였다.
일련의 농도의 개선된 항체를 PBS 및 100 mM NaCl, 0.005％ P20 (바이아코어 #BR-1000-54) 중 Fc-TrkB 포획 칩 상에서 유동시켰다. 생성된 센서그램(sensorgram)을 바이아코어 S51 평가 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 모든 농도로부터의 데이타를 1:1 랑뮤어(Langmuir) 모델에 포괄적으로 피팅하였다.
아노이키스 분석법
아노이키스 분석법에서 래트 창자 상피성 (RIE)-TrkB 세포를 사용하였다. RIE/TrkB 세포를 아큐타제(Accutase) (이노베이티브 셀 테크놀로지스 인크.(Innovative Cell Technologies Inc., 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재))를 사용하여 떼어내고, 완전 DMEM 배지 중에 재현탁시켰다. 상기 세포를 혈청-무함유 DMEM으로 3회 세척하고, PBS 중 2％ BSA의 스톡으로부터 희석된 0.1％ BSA (세포-배양 등급, #A8806-5G 시그마)를 함유하는 혈청-무함유 DMEM 중에 재현탁시켰다. 이어서, 상기 세포를 96-웰 코닝 코스타(Corning Costar) 초-저 군집 플레이트 (코스타 #3474)에 4.2 x 105 세포/mL, 60 ml/웰 (= 2.5 x 104 세포/웰)로 플레이팅하였다. 10 ml의 TrkB 효능제 항체 (PBS 중의 스톡)를 1-20 μg/mL의 최종 농도로 시험 웰에 첨가하였다. 세포를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 10 ml의 인간 BDNF (R&D, 0.1％ BSA/PBS 중 스톡 20 mg/mL)를 10-50 ng/mL의 최종 농도로 대조군 웰에 첨가하였다. BDNF를 DMEM(SF)/0.1％ BSA로 희석하였다. 이어서, 세포를 추가 24-48시간 동안 인큐베이션하였다. 80 ml/웰의 셀-타이터 글로 (프로메가(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재))를 첨가하고, 플레이트를 적당히 진탕하였다. 15분 후, 액체를 96-웰 백색 투명 바닥 플레이트로 옮기고, 발광을 판독하였다.
결과
V-영역의 클로닝 및 발현
Fab TR3-1은 인간 불변 영역과 융합된 기원 항체, A10F18.2로부터의 무손상 V-영역을 가졌고, 이를 이. 콜라이로부터 정제하였다. TrkB 항원 결합의 희석 ELISA 시험에서, 클로닝된 Fab는 항체 농도에 의존성인 결합 곡선을 생성하였다 (데이타는 나타내지 않음).
라이브러리 제작 및 V-영역 카세트
에피토프-집중 라이브러리는, 결합 특이성 결정자 ("BSD") 및 인간 생식계열 J-절편 서열을 함유하는 기원 항체로부터의 독특한 CDR3-FR4 영역에 연결된 인간 V-절편 라이브러리 서열로부터 제작되었다. 이들 "전장" 라이브러리를, 기원 항체의 V-절편의 일부만이 초기에 인간 서열의 라이브러리로 교체되는 "카세트" 라이브러리의 제작을 위한 기초로서 사용하였다. 2가지 유형의 카세트를 제작하였다. V-중쇄 및 V-카파 사슬 모두에 대한 카세트는, 프레임워크 2 영역 내에서 겹치는 공통 서열을 사용하는 브릿지(bridge) PCR에 의해 제조되었다. 상기 방식으로, 인간 V-중쇄 1 및 V-카파 II 이소형에 대해 "프론트-엔드(front-end)" 및 "중간(middle)" 인간 카세트 라이브러리가 제작되었다. TrkB 항원에 대한 결합을 지지하는 인간 카세트를 콜로니-리프트 결합 분석법으로 확인하고, ELISA 및 포르테 분석법에서 친화도에 따라 순위를 매겼다. 이어서, 최고 친화도 카세트의 풀(pool)을 제2 라이브러리 스크린에서 재조합하여 완전 인간 V-절편을 생성하였다.
인간 V-절편과의 고 친화도 Fab의 풀을 확인한 후, 친화도 성숙 라이브러리를 제작하였다. 인간 V-절편을 갖는 Fab 클론의 패널의 공통 BSD 서열을 퇴행 PCR 프라이머를 사용하여 돌연변이시켜 라이브러리를 생성하였다. 이들 돌연변이원 라이브러리를 콜로니 리프트 결합 분석법을 이용하여 스크리닝하였다. 선택된 Fab를 ELISA 및 포르테 분석을 이용하여 친화도에 대해 순위를 매겼다. 참조 TR3-1 Fab와 비교시 항원에 대해 유사하거나 개선된 친화도를 지지하는 돌연변이가 확인되었다.
추가로, 인간 생식계열에 대한 점 돌연변이가 인간 V-절편을 갖는 각각의 Fab에 대한 경쇄의 CDR3에서 일어났다. 위치 89 (코티아 넘버링)가 S에서 M으로 변경되었고, 이는 그 위치에서의 모든 인간 생식계열 VkII 절편에 의해 코딩된 아미노산이다.
포르테 옥테트 분석을 이용한 인간 TrkB 항원에 대한 인간 V-절편을 갖는 Fab 및 IgG의 친화도
인간 V-절편을 갖는 Fab를 콜로니-리프트 결합 분석법으로부터 단리하고, 항원-결합 ELISA로 확인하였다. 항원-결합 ELISA에서 강한 양성 신호를 나타내는 Fab 클론을 정제하고, 참조 Fab TR3-1과의 운동학 비교에 의해 추가로 특성화하였다. 결합 운동학은 단백질-단백질 상호작용의 실시간 무-표지 모니터링에 대한 포르테바이오 옥테트 시스템을 이용하여 분석되었다. 대표적인 운동학 분석을 도 3에 나타내었다. 계산된 결합 및 해리 상수를 하기 표 1 및 2에 나타내었다.
Figure 112010052510929-pct00001
결합 상수 (Ka), 해리 상수 (Kd) 및 계산된 친화도 (KD)를 나타낸 표 1은 포르테바이오 옥테트 바이오센서 기술을 이용하는 바이오-층 간섭법에 의한 재조합 TrkB 항원에 대한 Fab 결합의 분석을 요약한다.
Figure 112010052510929-pct00002
결합 상수 (Ka), 해리 상수 (Kd) 및 계산된 친화도 (KD)를 나타낸 표 2는 포르테바이오 옥테트 바이오센서 기술을 이용하는 바이오-층 간섭법에 의한 재조합 TrkB 항원에 대한 Fab 결합의 분석을 요약한다.
Fab 클론 TR134-4, TR135-8, TR139-2, TR151-1 및 TR144-1, 및 참조 클론 TR3-1의 운동학 분석은 모두 TrkB 항원에 대해 낮은 나노몰 친화도를 나타내었다. 클론 TR139-2 및 TR151-1은 참조 대조군과 비교시 일관되게 개선된 해리 상수 (Kd) 및 보다 높은 전체 친화도를 가졌다. TR144-1, TR135-8 및 TR 134-4는 참조 대조군과 비교시 일관되게 대략 동일한 전체 친화도를 가졌다.
인간 V-절편을 갖는 IgG도 또한 CHO 세포의 일시적 형질감염으로부터 제조되었다. IgG 제조물을 정제하고, 참조 IgG A10F18.2와의 운동학 비교에 의해 추가로 특성화하였다. 인간 V-절편을 갖는 IgG 중 2개에 대한 결합 운동학을 단백질-단백질 상호작용의 실시간 무-표지 모니터링에 대한 포르테바이오 옥테트 시스템을 이용하여 분석하였다. 대표적인 운동학 분석을 도 4에 나타내었다. 계산된 결합 및 해리 상수를 하기 표 3에 나타내었다. 결과는, 인간 V-절편을 갖는 IgG가 참조 A10F18.2 IgG와 동일한 친화도로 항원에 결합한다는 것을 나타낸다.
Figure 112010052510929-pct00003
결합 상수 (Ka), 해리 상수 (Kd) 및 계산된 친화도 (KD)를 나타낸 표 3은 포르테바이오 옥테트 바이오센서 기술을 이용하는 바이오-층 간섭법에 의한 재조합 TrkB 항원에 대한 IgG 결합의 분석을 요약한다.
인간 생식계열 서열에 대한 동일성％
V-영역을 PCR-증폭시키고, 제한 효소로 소화시키고, IgG 발현 벡터로 클로닝하였다. TR134-4, TR144-1 및 TR151-1로부터의 중쇄를 PCR-증폭시키고, SalI 및 NheI로 소화시키고; 생성된 단편을 인간 IgG1 불변 영역을 함유하는 발현 벡터로 클로닝하여 각각 TR127, TR143 및 TR154를 수득하였다. TR134-4, TR135-8 및 TR139-2로부터의 경쇄를 PCR-증폭시키고, BssHII 및 BsiWI로 소화시키고; 생성된 단편을 인간 카파 불변 영역을 함유하는 발현 벡터로 클로닝하여 각각 TR119, TR129 및 TR137을 수득하였다. 삽입물의 동일성 및 완전성을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
Figure 112010052510929-pct00004
*ND = 수행되지 않음;
a인간 생식계열에 대한 동일성％는 CDR3을 제외함.
표 4는 IgG 발현 벡터 내부에 함유된 V-영역에 대한 인간 생식계열 서열과의 동일성％를 예시하며: 모든 ％는 V-영역과 교차한 단일 인간 생식계열 서열에 대한 동일성을 나타내고, CDR3 BSD 서열을 제외한다. Fab의 Vh-영역 및 Vk-영역 각각은 인간 생식계열 아미노산 서열과 매우 밀접하였다.
에피토프 특이성을 나타내기 위한 차단 ELISA
방법 섹션에 기재된 바와 같이 인간 V-절편을 함유하는 정제된 Fab를 사용하여 차단 ELISA를 수행하였다. 결과를 도 7에 나타내었다. 모든 Fab 클론의 결합을 기원 모노클로날 항체 A10F18.2 IgG의 농도를 증가시켜 차단하였고, 이는 Fab가 기원 모노클로날 IgG로서 동일한 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다.
ELISA에 의한 TrkB 단백질에 대한 항체 결합
IgG 항체 NVP-LFD253, NVP-LFD254, NVP-LFC325 및 NVP-LFC327을 일시적 형질감염으로 생성하고, 본원에 기재된 바와 같이 정제하고, Fc-TrkB와의 특이적 결합에 대해 평가하였다. 인간 TrkB 및 각각의 항체, 즉, LFD253, LFD254, LFC325 또는 LFC327의 연속 희석물을 사용하여 ELISA를 수행하였다. ELISA 분석 결과, LFD253, LFD254, LFC325 및 LFC327이 인간 TrkB에 결합하는 것으로 나타났다 (도 8 참조).
인간 V-절편을 갖는 IgG (예를 들어, NVP-LFD253, NVP-LFD254, NVP-LFC325 및 NVP-LFC327)는 TrkB에 특이적으로 결합하지만, TrkA 또는 TrkC에는 결합하지 않는다. 2 μg/ml의 정제된 IgG 항체를, 3가지 상이한 Trk 족 구성원 (TrkA, TrkB 및 TrkC)과 이들의 상호작용을 조사하여 특이성에 대해 평가하였다. 오직 염소-항-인간 Fab-HRP 검출 Ab로 차단 및 처리된 2차 Ab를 복제하였다. 도 9a-d에 나타낸 바와 같이, LFD253, LFD254, LFC325 또는 LFC327은 이러한 관련 Trk 족 수용체 중 어느 하나와도 결합하지 않았다.
아노이키스 분석법: 기능적 효능 작용
정제된 IgG (예를 들어, LFD253, LFD254, LFC325 또는 LFC327)를 래트 창자 상피성 (RIE)-TrkB 세포를 사용하여 아노이키스 분석법에서 평가하였다. 이들 세포는 아노이키스 (분리 의존성 아팝토시스)에 민감하지만, TrkB 수용체의 활성화를 이용하여 구제될 수 있다. LFD253 처치는 세포 생존력으로 측정된 바와 같이 RIE-TrkB 세포를 아노이키스로부터 구제할 수 있고, 이러한 작용은 용량 의존성이다 (도 10a-d 참조). 상기 데이타로부터 계산된 LFD253에 대한 EC50은 4.1 ng/ml (28 pM)이다. 상기 데이타로부터 계산된 LFD254에 대한 EC50은 24.0 ng/ml (160 pM)이다. 상기 데이타로부터 계산된 LFC325에 대한 EC50은 41.8 ng/ml (280 pM)이다. 상기 데이타로부터 계산된 LFC327에 대한 EC50은 26.9 ng/ml (180 pM)이다.
바이아코어에 의한 항체 친화도 측정
고정화된 Fc-TrkB에 대한 NVP-LFD253, NVP-LFD254, NVP-LFC325 및 NVP-327의 결합에 관한 운동 상수를 측정하였다. 도 11a-d는 각각의 IgG에 대한 동적 트레이스의 대표적인 세트를 상세히 나타낸다. 도 11a는 62.5 nM에서 2배 희석으로 3.9까지 떨어진 LFD253의 적정의 센서그램을 나타낸다. 도 11b는 31.25 nM에서 2배 희석으로 1.9까지 떨어진 LFD254의 적정의 센서그램을 나타낸다. 도 11c는 31.25 nM에서 2배 희석으로 1.95까지 떨어진 LFC325의 적정의 센서그램을 나타낸다. 도 11d는 31.25 nM에서 2배 희석으로 1.95까지 떨어진 LFC327의 적정의 센서그램을 나타낸다. 하기 표 5는 바이아코어 S51 평가 소프트웨어를 사용하여 랑뮤어 모델에 실험 결과를 포괄적으로 피팅하여 얻어진 데이타의 요약을 나타내었다. 항체는 2가이지만, 결합은 1:1 사건으로 처리하였다.
Figure 112010052510929-pct00005
표 5는 항체-수용체 복합체의 빠른 결합 및 느린 해리 운동학 둘 다를 나타낸다. 센서그램을 포괄적으로 처리할 때 최상의 피팅이 얻어졌다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시의 목적을 위한 것이고, 그에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시될 것이며, 이는 본 출원 및 첨부된 특허청구범위의 취지 및 범주에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그의 전문이 참조로 포함된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (53)

  1. (a) 인간 생식계열(germline) 서열로부터 유래한 인간 중쇄 V-절편, 상보성 결정 영역 3(CDR3)를 포함하는 중쇄 최소 결합 특이성 결정자 서열, 및 중쇄 프레임워크 영역 4(FR4) 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    (b) 인간 생식계열 서열로부터 유래한 인간 경쇄 V-절편, CDR3를 포함하는 경쇄 최소 결합 특이성 결정자 서열, 및 경쇄 FR4 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하고, 여기서
    i) 중쇄 CDR3는 서열 32 및 서열 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
    ii) 경쇄 CDR3는 서열 40 및 서열 41로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
    iii) 중쇄 V-절편는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하고;
    iv) 경쇄 V-절편은 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 21 또는 서열 22 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    티로신 수용체 키나제 B(TrkB)에 특이적으로 결합하고, TrkB 효능제인 항체.
  2. (a) 인간 생식계열(germline) 서열로부터 유래한 인간 중쇄 V-절편, 상보성 결정 영역 3(CDR3)를 포함하는 중쇄 최소 결합 특이성 결정자 서열, 및 중쇄 프레임워크 영역 4(FR4) 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    (b) 인간 생식계열 서열로부터 유래한 인간 경쇄 V-절편, CDR3를 포함하는 경쇄 최소 결합 특이성 결정자 서열, 및 경쇄 FR4 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하고, 여기서
    i) 중쇄 CDR3는 서열 32 및 서열 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
    ii) 경쇄 CDR3는 서열 40 및 서열 41로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
    iii) 중쇄 V-절편는 서열 16의 아미노산 서열을 포함하고;
    iv) 경쇄 V-절편은 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    티로신 수용체 키나제 B(TrkB)에 특이적으로 결합하고, TrkB 효능제인 항체.
  3. (a) 인간 생식계열(germline) 서열로부터 유래한 인간 중쇄 V-절편, 상보성 결정 영역 3(CDR3)를 포함하는 중쇄 최소 결합 특이성 결정자 서열, 및 중쇄 프레임워크 영역 4(FR4) 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    (b) 인간 생식계열 서열로부터 유래한 인간 경쇄 V-절편, CDR3를 포함하는 경쇄 최소 결합 특이성 결정자 서열, 및 경쇄 FR4 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하고, 여기서
    i) 중쇄 CDR3는 서열 32 및 서열 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
    ii) 경쇄 CDR3는 서열 40 및 서열 41로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
    iii) 중쇄 V-절편는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하고;
    iv) 경쇄 V-절편은 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    티로신 수용체 키나제 B(TrkB)에 특이적으로 결합하고, TrkB 효능제인 항체.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 중쇄 FR4가 인간 생식계열 FR4인 항체.
  6. 제5항에 있어서, 중쇄 FR4가 서열 50인 항체.
  7. 제5항에 있어서, 중쇄 J-절편이 인간 생식계열 JH4 부분 서열 WGQGTLVTVSS (서열 50)을 포함하는 것인 항체.
  8. 제1항에 있어서, 경쇄 FR4가 인간 생식계열 FR4인 항체.
  9. 제8항에 있어서, 경쇄 FR4가 서열 61인 항체.
  10. 제8항에 있어서, 경쇄 J-절편이 인간 생식계열 Jk2 부분 서열 FGQGKLEIK (서열 61)을 포함하는 것인 항체.
  11. (a) 인간 생식계열 서열로부터 유래한 인간 중쇄 V-절편, 상보성 결정 영역 3(CDR3)를 포함하는 중쇄 최소 결합 특이성 결정자 서열, 및 중쇄 프레임워크 영역 4(FR4) 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    (b) 인간 생식계열 서열로부터 유래한 인간 경쇄 V-절편, CDR3를 포함하는 경쇄 최소 결합 특이성 결정자 서열, 및 경쇄 FR4 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하고, 상기 중쇄 V-절편 및 경쇄 V-절편은 각각 CDR1 및 CDR2를 포함하며, 여기서
    i) 중쇄 V-절편의 CDR1은 서열 27의 아미노산 서열을 포함하고;
    ii) 중쇄 V-절편의 CDR2는 서열 31의 아미노산 서열을 포함하고;
    iii) 중쇄 CDR3는 서열 32 및 서열 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
    iv) 경쇄 V-절편의 CDR1은 서열 38의 아미노산 서열을 포함하고;
    v) 경쇄 V-절편의 CDR2는 서열 39의 아미노산 서열을 포함하고;
    vi) 경쇄 CDR3는 서열 40 및 서열 41로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    티로신 수용체 키나제 B(TrkB)에 특이적으로 결합하고, TrkB 효능제인 항체.
  12. 제11항에 있어서,
    i) 중쇄 V-절편의 CDR1이 서열 25를 포함하고;
    ii) 중쇄 V-절편의 CDR2가 서열 28을 포함하고;
    iii) 중쇄 CDR3이 서열 32를 포함하고;
    iv) 경쇄 V-절편의 CDR1이 서열 35를 포함하고;
    v) 경쇄 V-절편의 CDR2가 서열 39를 포함하고;
    vi) 경쇄 CDR3이 서열 41을 포함하는 것인 항체.
  13. 제11항에 있어서,
    i) 중쇄 V-절편의 CDR1이 서열 25를 포함하고;
    ii) 중쇄 V-절편의 CDR2가 서열 28을 포함하고;
    iii) 중쇄 CDR3이 서열 32를 포함하고;
    iv) 경쇄 V-절편의 CDR1이 서열 36을 포함하고;
    v) 경쇄 V-절편의 CDR2가 서열 39를 포함하고;
    vi) 경쇄 CDR3이 서열 40을 포함하는 것인 항체.
  14. 제11항에 있어서,
    i) 중쇄 V-절편의 CDR1이 서열 25를 포함하고;
    ii) 중쇄 V-절편의 CDR2가 서열 28을 포함하고;
    iii) 중쇄 CDR3이 서열 32를 포함하고;
    iv) 경쇄 V-절편의 CDR1이 서열 37을 포함하고;
    v) 경쇄 V-절편의 CDR2가 서열 39를 포함하고;
    vi) 경쇄 CDR3이 서열 40을 포함하는 것인 항체.
  15. 제11항에 있어서,
    i) 중쇄 V-절편의 CDR1이 서열 25를 포함하고;
    ii) 중쇄 V-절편의 CDR2가 서열 29를 포함하고;
    iii) 중쇄 CDR3이 서열 32를 포함하고;
    iv) 경쇄 V-절편의 CDR1이 서열 35를 포함하고;
    v) 경쇄 V-절편의 CDR2가 서열 39를 포함하고;
    vi) 경쇄 CDR3이 서열 41을 포함하는 것인 항체.
  16. 중쇄 가변 영역이 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 티로신 수용체 키나제 B(TrkB)에 특이적으로 결합하고, TrkB 효능제인 항체.
  17. (1) 중쇄 가변 영역이 서열 1의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (2) 중쇄 가변 영역이 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열 7 또는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (3) 중쇄 가변 영역이 서열 3의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열 6 또는 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    티로신 수용체 키나제 B(TrkB)에 특이적으로 결합하고, TrkB 효능제인 항체.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제1항에 있어서, 5 x 10-8 M 미만의 평형 해리 상수 (KD)로 TrkB에 결합하는 항체.
  21. 제1항에 있어서, FAb' 단편인 항체.
  22. 제1항에 있어서, IgG인 항체.
  23. 제1항에 있어서, 단일 쇄 항체 (scFv)인 항체.
  24. 제1항에 있어서, 인간 불변 영역을 포함하는 항체.
  25. 제1항에 있어서, 티로신 키나제 수용체 A 또는 티로신 키나제 수용체 C에 결합하지 않는 항체.
  26. 제1항에 있어서, TrkB의 리간드 결합 도메인 (LBD)에 결합하는 항체.
  27. 제1항에 있어서, TrkB에 대한 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF)의 결합과 경쟁하는 항체.
  28. 제1항에 있어서, 서열 1을 포함한 중쇄 및 서열 8을 포함한 경쇄를 포함하는 항체.
  29. 제1항에 있어서, 서열 1을 포함한 중쇄 및 서열 9를 포함한 경쇄를 포함하는 항체.
  30. 제1항에 있어서, 서열 1을 포함한 중쇄 및 서열 10을 포함한 경쇄를 포함하는 항체.
  31. 서열 3을 포함하는 중쇄 및 서열 8을 포함하는 경쇄를 포함하는, 티로신 수용체 키나제 B(TrkB)에 특이적으로 결합하고, TrkB 효능제인 항체.
  32. 삭제
  33. 제1항의 항체 및 생리학상 상용성인 부형제를 포함하는, 레트 증후군(Rett Syndrome), 빌름스 종양(Wilms' tumor), 무홍채증, 비뇨생식 이상 및 정신 지체(WAGR) 증후군, 멜라노코르틴 수용체 MC4R 결핍으로 인한 비만, 또는 악액질/근육 쇠약 증후군 중 어느 하나로부터 선택된 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF) 결핍 장애의 증상을 감소 또는 억제하는데 사용하기 위한 제약상 허용되는 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 개체에서 혈당 수준을 감소시키는 작용제를 더 포함하는 조성물.
  35. 제33항에 있어서, 개체에서 체중을 감소시키는 작용제를 더 포함하는 조성물.
  36. 치료 유효량의 제1항의 항체를 포함하는, 개체에서 II형 당뇨병 또는 비만을 치료하거나 이들로의 진행을 지연시키기 위한 제약 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 개체가 전당뇨병 상태의 개체인 제약 조성물.
  38. 치료 유효량의 제1항의 항체를 포함하는, 개체에서 I형 당뇨병을 치료하거나 이로의 진행을 지연시키기 위한 제약 조성물.
  39. 제36항에 있어서, 개체가 II형 당뇨병에 걸린 개체인 제약 조성물.
  40. 제36항에 있어서, 개체가 과체중 개체인 제약 조성물.
  41. 제36항에 있어서, 개체가 비만 개체인 제약 조성물.
  42. 제36항에 있어서, 개체에서 혈당을 감소시키는 데 효과적인 치료 유효량의 제2 작용제를 더 포함하는 제약 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 제2 작용제 및 항체를 혼합물로서 투여하는 것인 제약 조성물.
  44. 제42항에 있어서, 제2 작용제 및 항체를 개별적으로 투여하는 것인 제약 조성물.
  45. 제42항에 있어서, 제2 작용제가 인슐린, 술포닐우레아, 인슐린분비제, 메트포르민, PPARγ 효능제, PPARα 효능제, PPARδ 효능제, PPARα/γ 이중 효능제, PPARα/γ/δ pan 효능제, 알파-글루코시다제 억제제, DPP-IV 억제제 및 GLP-1/GLP-1 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  46. 제36항에 있어서, 개체에서 체중 감량 또는 비만에 효과적인 치료 유효량의 제2 작용제를 더 포함하는 제약 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 제2 작용제 및 항체를 혼합물로서 투여하는 것인 제약 조성물.
  48. 제46항에 있어서, 제2 작용제 및 항체를 개별적으로 투여하는 것인 제약 조성물.
  49. 제46항에 있어서, 제2 작용제가 리파제 억제제, 시부트라민, CB-1 억제제, 토피라메이트, 아밀린, 아밀린 유사체, 렙틴, PYY/PYY 유사체 및 GLP-1/GLP-1 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  50. 치료 유효량의 제1항의 항체를 포함하는, 레트 증후군(Rett Syndrome), 빌름스 종양(Wilms' tumor), 무홍채증, 비뇨생식 이상 및 정신 지체(WAGR) 증후군, 멜라노코르틴 수용체 MC4R 결핍으로 인한 비만, 또는 악액질/근육 쇠약 증후군 중 어느 하나로부터 선택된 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF) 결핍 장애의 증상을 감소 또는 억제하기 위한 제약 조성물.
  51. 제50항에 있어서, BDNF 결핍 장애가 멜라노코르틴 수용체 MC4R 결핍으로 인한 비만, 및 악액질/근육 쇠약 증후군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  52. 제50항에 있어서, BDNF 결핍 장애가 레트 증후군인 제약 조성물.
  53. 제50항에 있어서, 항체를 전신 투여하는 것인 제약 조성물.
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Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2738026C (en) 2008-09-22 2017-01-24 Array Biopharma Inc. Substituted imidazo[1,2b]pyridazine compounds as trk kinase inhibitors
PT2725028T (pt) 2008-10-22 2016-08-31 Array Biopharma Inc Compostos de pirazolo[1,5-]pirimidina substituídos como intermediários na síntese de inibidores de cinase trk
AR077468A1 (es) 2009-07-09 2011-08-31 Array Biopharma Inc Compuestos de pirazolo (1,5 -a) pirimidina sustituidos como inhibidores de trk- quinasa
EP2504024A2 (de) * 2009-09-27 2012-10-03 Ruhr-Universität Bochum Verfahren zur therapie und diagnose von morbus alzheimer
PL2918588T3 (pl) 2010-05-20 2017-10-31 Array Biopharma Inc Związki makrocykliczne jako inhibitory kinazy TRK
ES2926988T3 (es) 2011-03-15 2022-10-31 X Body Inc Métodos de cribado de anticuerpos
CN102830228B (zh) * 2011-06-15 2015-01-21 格诺思博生物科技(上海)有限公司 定量分析循环肿瘤细胞的试剂及试剂盒
CN102944674B (zh) * 2012-11-05 2014-10-22 武汉远征世纪制药有限公司 一种检测TrkB受体pan-Tyr位点活性的ELISA试剂盒及其使用方法
WO2014117089A1 (en) * 2013-01-25 2014-07-31 Case Western Reserve University Compositions and methods for the treatment of pervasive development disorders
US8652527B1 (en) 2013-03-13 2014-02-18 Upsher-Smith Laboratories, Inc Extended-release topiramate capsules
US9101545B2 (en) 2013-03-15 2015-08-11 Upsher-Smith Laboratories, Inc. Extended-release topiramate capsules
BR112015032540A2 (pt) * 2013-06-26 2017-07-25 Baylor College Medicine síndrome de rett e tratamentos para a mesma
KR102649887B1 (ko) 2014-11-16 2024-03-22 어레이 바이오파마 인크. (s)-n-(5-((r)-2-(2,5-디플루오로페닐)-피롤리딘-1-일)-피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)-3-히드록시피롤리딘-1-카르복스아미드 히드로겐 술페이트의 결정질 형태
CN104524568B (zh) * 2015-01-08 2018-04-20 中国人民解放军第二军医大学 一种治疗肥胖症的药物组合物及其应用
US9869297B2 (en) 2015-05-07 2018-01-16 General Electric Company Attachment method and system to install components, such as vortex generators, to a wind turbine blade
US9869296B2 (en) 2015-05-07 2018-01-16 General Electric Company Attachment method and system to install components, such as tip extensions and winglets, to a wind turbine blade
US9869295B2 (en) 2015-05-07 2018-01-16 General Electric Company Attachment method to install components, such as tip extensions and winglets, to a wind turbine blade, as well as the wind turbine blade and component
CA2988423A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Loxo Oncology, Inc. Methods of diagnosing and treating cancer
EA035049B1 (ru) 2015-07-16 2020-04-22 Аррэй Байофарма Инк. СОЕДИНЕНИЯ ЗАМЕЩЕННОГО ПИРАЗОЛО[1,5-a]ПИРИДИНА В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ RET КИНАЗЫ
US10100805B2 (en) 2015-10-12 2018-10-16 General Electric Compant Tip extension assembly for a wind turbine rotor blade
CN108697708A (zh) 2015-10-26 2018-10-23 洛克索肿瘤学股份有限公司 Trk抑制剂抗性癌症中的点突变以及与此相关的方法
US11078287B2 (en) 2015-11-17 2021-08-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Binding agonist for treatment of neurological and other disorders
TN2018000335A1 (en) 2016-04-04 2020-01-16 Loxo Oncology Inc Liquid formulations of (s)-n-(5-((r)-2-(2,5-difluorophenyl)-pyrrolidin-1-yl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)-3-hydroxypyrrolidine-1-carboxamide
US10045991B2 (en) 2016-04-04 2018-08-14 Loxo Oncology, Inc. Methods of treating pediatric cancers
MA44612A (fr) 2016-04-04 2019-02-13 Loxo Oncology Inc Méthodes de traitement de cancers pédiatriques
CN110049987B (zh) 2016-05-18 2022-02-18 阵列生物制药公司 制备化合物及其盐的方法
TWI704148B (zh) 2016-10-10 2020-09-11 美商亞雷生物製藥股份有限公司 作為ｒｅｔ激酶抑制劑之經取代吡唑并[1,5-a]吡啶化合物
JOP20190077A1 (ar) 2016-10-10 2019-04-09 Array Biopharma Inc مركبات بيرازولو [1، 5-a]بيريدين بها استبدال كمثبطات كيناز ret
AU2017342176A1 (en) * 2016-10-10 2019-05-02 The National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd. Non-cytotoxic modified cells and use thereof
TW202300515A (zh) * 2016-10-20 2023-01-01 法商賽諾菲公司 抗ｃｈｉｋｖ抗體及其用途
JOP20190092A1 (ar) 2016-10-26 2019-04-25 Array Biopharma Inc عملية لتحضير مركبات بيرازولو[1، 5-a]بيريميدين وأملاح منها
US9914781B1 (en) 2016-11-08 2018-03-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Binding agonist for treatment of neurological and other disorders
US10443579B2 (en) 2016-11-15 2019-10-15 General Electric Company Tip extensions for wind turbine rotor blades and methods of installing same
EP3571203B1 (en) 2017-01-18 2023-06-07 Array BioPharma Inc. Substituted pyrazolo[1,5-a]pyrazine compounds as ret kinase inhibitors
WO2018136663A1 (en) 2017-01-18 2018-07-26 Array Biopharma, Inc. Ret inhibitors
US11098691B2 (en) 2017-02-03 2021-08-24 General Electric Company Methods for manufacturing wind turbine rotor blades and components thereof
US10830206B2 (en) 2017-02-03 2020-11-10 General Electric Company Methods for manufacturing wind turbine rotor blades and components thereof
JOP20190213A1 (ar) 2017-03-16 2019-09-16 Array Biopharma Inc مركبات حلقية ضخمة كمثبطات لكيناز ros1
JP2020522269A (ja) 2017-06-06 2020-07-30 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ レット症候群におけるｍｅｃｐ２の安全な発現のための自己調節ａａｖベクター
US10793634B2 (en) * 2017-06-09 2020-10-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-TrkB antibodies
TWI812649B (zh) 2017-10-10 2023-08-21 美商絡速藥業公司 6-(2-羥基-2-甲基丙氧基)-4-(6-(6-((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-3,6-二氮雜雙環[3.1.1]庚-3-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲腈之調配物
TWI791053B (zh) 2017-10-10 2023-02-01 美商亞雷生物製藥股份有限公司 6-(2-羥基-2-甲基丙氧基)-4-(6-(6-((6-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-3,6-二氮雜雙環[3.1.1]庚-3-基)吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲腈之結晶形式及其醫藥組合物
MA50456A (fr) 2017-10-26 2020-09-02 Array Biopharma Inc Formulations d'un inhibiteur de kinase trk macrocyclique
US10913216B2 (en) 2017-11-21 2021-02-09 General Electric Company Methods for manufacturing wind turbine rotor blade panels having printed grid structures
US11040503B2 (en) 2017-11-21 2021-06-22 General Electric Company Apparatus for manufacturing composite airfoils
US10865769B2 (en) 2017-11-21 2020-12-15 General Electric Company Methods for manufacturing wind turbine rotor blade panels having printed grid structures
US11390013B2 (en) 2017-11-21 2022-07-19 General Electric Company Vacuum forming mold assembly and associated methods
US10773464B2 (en) 2017-11-21 2020-09-15 General Electric Company Method for manufacturing composite airfoils
US10920745B2 (en) 2017-11-21 2021-02-16 General Electric Company Wind turbine rotor blade components and methods of manufacturing the same
US10821652B2 (en) 2017-11-21 2020-11-03 General Electric Company Vacuum forming mold assembly and method for creating a vacuum forming mold assembly
US11668275B2 (en) 2017-11-21 2023-06-06 General Electric Company Methods for manufacturing an outer skin of a rotor blade
US11248582B2 (en) 2017-11-21 2022-02-15 General Electric Company Multiple material combinations for printed reinforcement structures of rotor blades
EP3717514A1 (en) * 2017-11-30 2020-10-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-trkb monoclonal antibodies and methods of use
JP6997876B2 (ja) 2018-01-18 2022-02-04 アレイ バイオファーマ インコーポレイテッド Ｒｅｔキナーゼ阻害剤としての置換ピラゾリル［４，３－ｃ］ピリジン化合物
US11524963B2 (en) 2018-01-18 2022-12-13 Array Biopharma Inc. Substituted pyrazolo[3,4-d]pyrimidines as RET kinase inhibitors
TWI802635B (zh) 2018-01-18 2023-05-21 美商亞雷生物製藥股份有限公司 作為ｒｅｔ激酶抑制劑之經取代吡咯并[2,3-d]嘧啶化合物
CN108265036B (zh) * 2018-01-26 2021-04-27 山东大学齐鲁医院 一种沉默t1蛋白的重组病毒及其构建方法与应用
US10821696B2 (en) 2018-03-26 2020-11-03 General Electric Company Methods for manufacturing flatback airfoils for wind turbine rotor blades
US11035339B2 (en) 2018-03-26 2021-06-15 General Electric Company Shear web assembly interconnected with additive manufactured components
EP3773725A1 (en) 2018-03-29 2021-02-17 Loxo Oncology Inc. Treatment of trk-associated cancers
CA3224949A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Loxo Oncology, Inc. Spray-dried dispersions, formulations, and polymorphs of (s)-5-amino-3-(4-((5-fluoro-2-methoxybenzamido)methyl)phenyl)-1-(1,1,1-trifluoropropan-2-yl)-1h-pyrazole-4-carboxamide
CA3111984A1 (en) 2018-09-10 2020-03-19 Array Biopharma Inc. Fused heterocyclic compounds as ret kinase inhibitors
WO2020131674A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Array Biopharma Inc. 7-((3,5-dimethoxyphenyl)amino)quinoxaline derivatives as fgfr inhibitors for treating cancer
EP3898626A1 (en) 2018-12-19 2021-10-27 Array Biopharma, Inc. Substituted pyrazolo[1,5-a]pyridine compounds as inhibitors of fgfr tyrosine kinases

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22979A1 (es) 2000-12-08 2004-09-09 Centro Inmunologia Molecular Combinación inmunoterapéutica para el tratamiento de tumores que sobre-expresan receptores con actividad quinasa en residuos de tirosina
SI1517921T1 (sl) * 2002-06-28 2006-10-31 Domantis Ltd Dvojno-specificni ligandi z zvisano serumsko razpolovno dobo
AU2007316418A1 (en) 2006-11-09 2008-05-15 Irm Llc Agonist TrkB antibodies and uses thereof
EA201000603A1 (ru) 2007-10-23 2010-12-30 Новартис Аг ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛ К TrkB ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕСПИРАТОРНЫХ НАРУШЕНИЙ

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Endocrinology. 2008(2007년 12월 6일), Vol. 149, No. 3, pp.1038-1048 *
Endocrinology. 2008(2007년 12월 6일), Vol. 149, No. 3, pp.1038-1048*
The Journal of Neuroscience. 2006, Vol. 26, No. 37, pp.9394-9403 *
The Journal of Neuroscience. 2006, Vol. 26, No. 37, pp.9394-9403*

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Publication number Publication date
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