CN106456754A - 改善或加速髋部骨折术后身体恢复的方法 - Google Patents

改善或加速髋部骨折术后身体恢复的方法 Download PDF

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Abstract

本公开是关于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复的用途和方案，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发，其采用治疗有效量的肌肉抑制素拮抗剂，例如肌肉抑制素结合分子，例如肌肉抑制素抗体或ActRII受体结合分子、ActRII受体抗体，例如比麦单抗抗体。

Description

改善或加速髋部骨折术后身体恢复的方法
技术领域
本公开处在肌肉抑制素拮抗剂(例如肌肉抑制素结合分子或活化素受体IIB(ActRIIB)结合分子，例如针对ActRIIB的拮抗剂抗体，例如比麦单抗(bimagrumab))的领域。具体地，其是关于髋部骨折的手术治疗(或髋部骨折手术)后恢复的改善或加速和用于此适应症的新型给药方案，其采用治疗有效量的ActRII拮抗剂，例如活化素受体II(ActRII)结合分子，例如抗活化素受体II(ActRII)抗体，例如比麦单抗。
背景技术
肌肉抑制素(转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员)是一种在动物和人类整个生命周期中负调控骨骼肌质量的分泌蛋白。肌肉抑制素通过II型活化素受体(主要通过ActRIIB)起作用，提出信号传导是通过SMAD 2/3路径，其参与抑制蛋白质合成，和肌细胞分化与增殖。肌肉抑制素的抑制或遗传消融增加肌肉量和强度(Lee等，2005，Lee和McPherron2001，Whittemore等，2003)。
比麦单抗(BYM338)是经研发以竞争性结合II型活化素受体(ActRII)的单克隆抗体，其结合亲和力大于肌肉抑制素或活化素(ActRII的天然配体)。比麦单抗是全人类抗体(经修饰IgG1、234-235-Ala-Ala、λ2)，其结合ActRII的配体结合结构域，从而阻止其配体(包括担当骨骼肌生长天然抑制剂的肌肉抑制素和活化素)的结合和后续信号传导。肌肉抑制素(转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员)是一种负调控动物和人类的骨骼肌质量的分泌蛋白。肌肉抑制素信号传导发生在ActRII处，且所提出的其作用机制是通过Smad 2/3路径来抑制蛋白质合成和肌细胞分化与增殖。肌肉抑制素抑制或遗传消融增加肌肉质量和强度(Lee等，2005；Lee和McPherron 2001；Whittemore等，2003)。
比麦单抗与人类和小鼠ActRIIB交叉反应，且对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠骨骼肌细胞有效。比麦单抗经调配用于静脉内(i.v.)施用。
肌肉抑制素、ActRIIB受体和ActRIIB受体抗体
比麦单抗(也称为BYM338)是一种经研发竞争性结合II B型活化素受体(ActRIIB)的人类单克隆抗体，其结合亲和力大于肌肉抑制素(ActRIIB的主要天然配体)。比麦单抗公开于WO2010/125003中，该专利的全文以引用方式并入本文中。肌肉抑制素(转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员)是一种在动物和人类整个生命周期中负调控骨骼肌质量的分泌蛋白。肌肉抑制素信号传导发生在ActRIIB处，且所提出的其作用机制是通过Smad 2/3路径来抑制蛋白质合成以及肌细胞分化与增殖。在发育期动物和人类中缺失肌肉抑制素会产生肌肉纤维数目和尺寸增加的超级肌肉表型。产后肌肉抑制素的含量降低造成现有肌纤维的尺寸增加导致的骨骼肌肥大。在成人中，肌肉抑制素是在骨骼肌中产生，且在血液中循环，部分作为潜在无活性复合物。
与肌肉抑制素作为骨骼肌质量内源抑制剂的作用一致，在失用且类固醇诱导萎缩的临床前鼠类模型和在健康食蟹猴的毒物学研究中，比麦单抗显著增加骨骼肌质量。此外，小鼠和大鼠中的质量增加导致肌肉强度(力量生成)相应增加。i.v.和s.c.施用于小鼠和食蟹猴后，比麦单抗显示一致的IgG1药物代谢动力学(PK)曲线与靶点介导药物处置(TMDD)，且耐受良好。
首次人类单次剂量递增研究的六个剂量水平的分析表明，比麦单抗的0.1、0.3、1、3、10和30mg/kg的单次i.v.剂量是安全且耐受良好的，且产生可根据模型化临床前数据预测的PK曲线。与安慰剂相比，在四周时3-30mg/kg的剂量产生大腿肌肉体积自基线2.7％-5.2％的可测量增加。
身体组成在移动性和髋部骨折风险的测定中的作用
已确定即使在健康老年人中，肌肉强度下降也不能完全由骨骼肌质量损失来解释(Frontera等，2000,Vandervoort 2002)。此外，肌肉质量的维持或甚至增加不必定能阻止肌肉强度损失(Goodpaster等，2006)；且由每单位肌肉质量骨骼肌产生的力随着年龄增长而减少(Goodpaster等，2006；Brooks和Faulkner 1994)。尽管这些事实并未降低在老化期间维持肌肉质量的重要性，但其强调为解决年龄相关的移动性下降，不止需要了解和治疗肌肉组织的损失。
除肌肉质量损失外，也存在肌肉组织由脂质和其他非收缩性组分浸润。新出现的证据表明，骨骼肌脂质含量直接影响肌肉强度和移动性功能(Goodpaster等，2001；Visser等，2002)以及老年男性和女性中将来移动性损失增加的风险(Visser等，2005)。Beavers等(2013)显示，大腿中高/增加的肌间脂肪组织(IMAT)面积以及总大腿肌肉面积减少是步行速度下降的重要预测因子。基线大腿IMAT预测男性和女性中的每年步行速度下降。在纵向分析中，大腿IMAT和总大腿肌肉的变化是预测男性和女性中步行速度下降的唯一身体组成量度(图1)。
肌肉组织的年龄相关性脂肪浸润以及与下肢性能降低结合的肌肉强度降低使得多种结果例如移动性损失、跌倒和骨骼骨折(包括髋部骨折)的风险升高(Lang等，2010)。
肌间脂肪质量影响骨骼肌的机制
IMAT增加与步行速度下降之间联系的基本机制可能包括脂肪组织的内分泌性质。肌肉中的过量脂肪累积可能与促炎细胞因子的过量分泌相关(Fantuzzi等，2005)。慢性发炎与较低的肌肉强度相关(Visser等，2002)，且能预测老年人中的失能(Verghese等，2011)，这可能是肌肉-纤维收缩性受损的结果(Pahor和Kritchevsky 1998)。过度肥胖也可下调胰岛素、睪酮和生长激素的合成代谢作用(Chevalier等，2006，Schaap等，2005，Waters等，2008)，这些因子都可促使肌肉损失和功能下降。
髋部骨折后身体组成变化
临床观察指示，由于手术后的移动性限制加剧，经受髋部骨折且随后经历骨折修复大手术的老年个体经受身体组成的额外快速变化的恶性循环(Wehren等，2005；D’Adamo等，2014)。直接或快速推进的变化包括神经性肌无力、骨骼肌损伤(失用性萎缩)、脂肪质量增加和加速的骨损失(D’Adamo等，2014，Fox等，2000，Daguet等，2011)。重要的是，这些变化的显现可早在手术后第10天且可在术后约2个月达到最大值。
总之，脆弱性和易碎性的急性并发症(髋部骨折)进一步恶化身体组成，这促使首先出现并发症。另外，其减少手术后功能恢复的速度和幅度，这进而增加移动性相关并发症(伤害性跌倒、骨折和相关再度住院)的风险。该恶性循环的净结果是髋部骨折后患者的惊人死亡率：在第一年期间介于8.4％-36％的范围(Abrahamsen等，2009)。
预防手术后并发症的早期需要
重要的是，大部分并发症往往在手术后前6个月内发生，提高对以下措施的需求：可加速和增加全身移动性的幅度以预防移动性相关并发症、再度住院并最终降低此群体中相当高的死亡率。
未满足的医学需要
涵盖饮食措施(蛋白质、维生素D和Ca补充)的当前护理标准、早期手术后动员和阻力训练结合抗吸回疗法离最优选化仍有相当大的空间。对复健的依从性是有限的且当前药理学治疗(双膦酸酯、狄诺塞麦(denosumab)、维生素D)的效应相对较小且起效缓慢。
对理想药剂的需求
鉴于这些需求，存在下述明确未满足的需求：需要一种药剂，它在具有合并症共存的这一脆弱群体中能加速并加强当前护理标准的功效而不会出现显著安全性问题。因此，理想药物候选者可满足以下要求：
A.就逆转身体组成的不良改变而言可快速达成最大益处
B.可诱导临床上有意义的肌肉质量变化，其可转化成肌肉强度和身体性能增加
C.可实质上降低骨骼肌的脂肪浸润，从而改善肌肉品质和改善肌肉强度和移动性
D.没有显著安全性或耐受性问题来限制预期进行的6个月治疗
比麦单抗对实现前述3个要求有机会的证据
申请人有证据：用以防止肌肉抑制素信号传导(抗肌肉抑制素抗体、可溶性IIB型活化素受体和针对细胞结合的II型活化素受体的抗体)的当前方法中，活化素受体拮抗作用提供功效与安全性之间的最佳平衡(最高效益/风险比)，因此能够诱导快速且实质的肌肉生长并伴以肌间脂肪组织减少(即肌肉品质改善)，这二者直接促使肌肉收缩和最终移动性的改善。
临床前证据
ActRII阻断诱导肌肉质量的最大增加
通过比较抗体与仅中和循环中肌肉抑制素的抑制剂，申请人研究了通过ActRII传导的其他配体的抑制是否在由比麦单抗诱导的肥大中起显著作用(Lach-Trifilieff2014)。出于此目的，使用稳定化肌肉抑制素前肽(D76A)，其经验证是肌肉抑制素特异性抑制剂。向年轻SCID小鼠每周施用比麦单抗和肌肉抑制素前肽达5周；比麦单抗是以10mg/kg施用，肌肉抑制素前肽是以30mg/kg施用。
体重在整个治疗期间增加，仅在用比麦单抗治疗中达到显著(36％相比肌肉抑制素前肽的15％)。由肌肉抑制素前肽诱导的15％增加与先前出版物中所述一致(Trendelenburg等，2009)；ActRII抗体的功效是其2倍以上(图2，左图)。肌肉重量在检查的大部分肌肉中显著增加，其中用比麦单抗显示出更显著的增加(图2，中间图)。通过分析纤维横截面积分布进一步证实此较大的总肌肉质量增加，证明这些因子是通过增加纤维直径而非纤维数量起作用(图2，右图)。
相比循环肌肉抑制素库的中和，II型活化素受体阻断显著更高的功效明确展示：除肌肉抑制素外还存在能够通过IIB型活化素受体促使肌肉损失的配体。
阻断肌肉抑制素信号传导的第三种方法是通过能捕获循环中此受体的所有可能配体(包括肌肉抑制素)的可溶性IIB型活化素受体陷阱/诱饵(ActRIIB-Fc)。就诱导肌肉生长而言，此方法的功效很可能与比麦单抗的功效相当。对迪谢内肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy)的男孩用ActRIIB-Fc(ACE-031)所作2期研究的结果显示：LBM增加和TMV和六分钟步行距离的下降减弱(Campbell等，2012)。然而，在健康志愿者MAD研究以及2期肌营养不良研究中观察到的可逆鼻出血和皮肤毛细管扩张已导致这些试验和此药理学方法的临床研发的终止(Smith和Lin 2013)。比麦单抗有别于后一方法的基本差异在于其仅阻断靶组织(例如肌肉)上通过受体的配体运输，且不消除循环配体到达其自身替代配体以发挥效应的机会，这可对安全性至关重要(例如，通过骨骼肌上ActRIIB的BMP的信号传导将受阻，但BMP可到达其自身BMP受体并通过这些受体传导信号，这不是以诱捕来阻止作用的选择)。
尽管活化素受体IIB陷阱可诱发的肌肉体积增加与通过膜结合ActRIIB来阻断所诱发的肌肉体积增加相当，且迪谢内肌营养不良男孩中利用ActRIIB-Fc(ACE-031)的2期研究结果显示瘦体重质量增加和大腿肌肉体积和六分钟步行距离的下降减弱(Campbell等，2012)，在健康志愿者MAD研究以及2期肌营养不良研究中观察到的可逆鼻出血和皮肤毛细管扩张已导致这些试验的终止(Smith和Lin 2013)。两种方法之间的基本差异在于ActRIIB-Fc捕获并中和循环中受体的所有可能配体阻止这些配体结合其他可能的靶受体，但比麦单抗仅阻断靶组织(例如肌肉)上通过ActRIIB的配体运输。例如结合ActRIIB的BMP可继续通过其BMP受体传导信号。
年轻和年老动物中对ActRII抑制的响应性
动物研究展示，在6月龄和21月龄大鼠中，单次施用20mg/kg I.V.比麦单抗在2至3周显著增加体重，表明促进合成代谢肌肉的作用。这实际上通过基于MRI的后腿肌肉体积的评估得以确认，证明施用单剂比麦单抗在6月龄和21月龄大鼠中都促使肌肉肥大(图3)。
比麦单抗的肥大性作用在其单次施用2周后明显，其相对于对照组达到13％至15％的增加。重要的是，对比麦单抗的最大响应在6月龄和21月龄大鼠中类似，证明在平行设定中比较时年老动物仍与年轻动物对ActRII抑制有同等响应且能够生成相同的骨骼肌体积增加。
临床证据
健康年轻志愿者中失用性萎缩的逆转：全长上石膏腿模型
申请人有证据表明，比麦单抗能够在一只腿全长上石膏2周的年轻健康志愿者(平均年龄24岁)中引发失用性相关肌肉损失的快速逆转。此固定(即肌肉的失活)在2周过程中诱导约5％的快速肌肉损失。比麦单抗的单次i.v.剂量(30mg/kg)在石膏移除后2周内产生大腿肌肉体积的几乎完全恢复(至浇铸前的-0.8％)，而仅通过恢复至正常每日活动(没有针对性复健项目)恢复肌肉质量的群组看来需要耗费12周以恢复至基线。该观察明确证实了通过比麦单抗的ActRII阻断作用的快速起效，如由重新活动早期的骨骼肌质量增加所反映。
正常化进一步地，大腿肌肉质量在石膏移除后第2周至第12周继续增加，最后比没有接受比麦单抗的群组大约增加5％体积(图4)。因此，可在12周观察时段内可见所述药物的单次静脉内剂量导致大腿肌肉体积增加全部总计为约10％。
肌减少性患者中恢复肌肉质量
在最近完成的对患有肌肉减少症和身体脆弱的老年患者的研究中，单剂30mg/kg静脉内比麦单抗可引发大腿肌肉体积增加，与失用性萎缩的实验模型中观察到的肌肉生长幅度相当，即在8周内自基线增加>8％(图5)。在大部分移动性受限的患者(以6MWD<300m开始的那些)中，此质量增加先于6分钟步行距离(6MWD)的显著增加(+76米，p＝0.02)。
因此，不管其是施用于失用性萎缩的年轻个体或是由于老龄患有实质肌肉萎缩的年老个体，比麦单抗都能够诱导相当的反应。
肌间脂肪组织(IMAT)显著减少
在49名最高65岁的健康女性和男性的随机化、六种处理、双盲、安慰剂对照的单一剂量递增设计试验中，以交错方式施用0.1、0.3、1、3、10和30mg/kg的单一i.v.剂量。在此试验中，除安全性、耐受性和药物动力学外，也评价通过磁共振成像测量的比麦单抗对大腿肌肉体积以及肌间脂肪组织的效应。如图6中所示，比麦单抗诱导剂量依赖性肌间脂肪组织减少。10和30mg/kg的效应在药物注射后第10周相当，都自基线减少超过10％。
比麦单抗治疗与功能性能的显著改善相关
如通过来自散发性包涵体肌炎(一种进行性肌肉退化疾病)患者的数据所说明，由单次注射比麦单抗(30mg/kg)诱导的瘦体质量的快速增加(自基线>5％)能够引发身体性能的显著增加(图7)。重要的是，肌肉质量增加后功能的改善需要一段滞后时间，这可能反映骨骼肌在完全成熟且准备好用于增强态收缩活动前的结构/功能重塑。
总之，比麦单抗看来具有能够逆转年龄相关的身体组成变化以及髋部骨折手术后的反应变化(失用性萎缩)的能胜任的药理试剂特性。申请人也有越来越多的证据证明，该药物候选者可引发肌肉消瘦疾病的功能改善。因此，利用对肌肉和IMAT的相对快速且显著的效应，比麦单抗提供髋部骨折后加速恢复的创新方法。
发明内容
经历过髋部骨折手术的患者群体中的干预是高度创新的且能满足高度未满足的医学需要。实际上，目前没有改善和/或加速自髋部骨折手术恢复的治疗选择。该目的是通过本公开提供的方法和给药方案来实现的。
因此，本公开的第一主题是关于包含肌肉抑制素拮抗剂的组合物改善和/或加速自髋部骨折手术恢复的方法或用途，所述肌肉抑制素拮抗剂可以是肌肉抑制素结合分子或ActRII结合分子。肌肉抑制素结合分子可以是(例如)针对肌肉抑制素的拮抗剂抗体。ActRII结合分子可以是(例如)针对ActRII的拮抗剂抗体，例如比麦单抗(也称为BYM338)。
如本文所使用的“肌肉抑制素拮抗剂”是指能够拮抗(例如降低、抑制、减小、延迟)肌肉抑制素功能、表达和/或信号传导(例如通过阻断肌肉抑制素与肌肉抑制素受体(即ActRII)结合)的分子。拮抗剂的非限制性实例包括肌肉抑制素结合分子和ActRII受体结合分子。在所公开方法、方案、套件、过程、用途和组合物的一些实施方式中，采用肌肉抑制素拮抗剂。
“肌肉抑制素结合分子”意指能够单独或与其他分子缔合来结合人类肌肉抑制素抗原的任意分子。可通过标准方法(定性分析)显示结合反应，包括(例如)结合分析、竞争分析或用于测定肌肉抑制素与其受体结合的抑制的生物分析或任意种类的结合分析，以使用具有不相关特异性但理想地属于相同同种型的抗体(例如抗CD25抗体)的阴性对照测试为参照。肌肉抑制素结合分子的非限制性实例包括如小分子、肌肉抑制素受体诱饵和由B细胞或杂交瘤所产生结合肌肉抑制素的抗体以及嵌合抗体、CDR移植抗体或人类抗体或其任意片段(例如F(ab’)2和Fab片段)以及单链或单一结构域抗体。优选地，肌肉抑制素结合分子拮抗(例如降低、抑制、减小、延迟)肌肉抑制素的功能、表达和/或信号传导。在所公开方法、方案、套件、过程、用途和组合物的一些实施方式中，采用肌肉抑制素结合分子。
“ActRII结合分子”意指能够单独或与其他分子缔合来结合人类ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)的任意分子。可通过标准方法(定性分析)显示结合反应，包括(例如)结合分析、竞争分析或用于测定ActRII受体与肌肉抑制素结合的抑制的生物分析或任意种类的结合分析，以使用具有不相关特异性但理想地属于相同同种型的抗体(例如抗CD25抗体)的阴性对照测试为参照。ActRII受体结合分子的非限制性实例包括小分子、肌肉抑制素诱饵和如由B细胞或杂交瘤所产生针对ActRII受体的抗体以及嵌合抗体、CDR移植抗体或人类抗体或其任意片段(例如F(ab’)2和Fab片段)以及单链或单一结构域抗体。优选地，ActRII受体结合分子拮抗(例如降低、抑制、减小、延迟)肌肉抑制素的功能、表达和/或信号传导。在所公开方法、方案、套件、过程、用途和组合物的一些实施方式中，采用ActRIIB受体结合分子。
在另一个实施方式中，组合物包含抗ActRII抗体，其结合由SEQ ID NO:181(SEQID NO:182)的氨基酸19-134组成的结合结构域，或结合包含以下序列或由以下序列组成的表位：(a)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)；(b)SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)；(c)SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)；(d)SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)；(e)SEQ IDNO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)；(f)SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT-SEQ ID NO:191)；(g)SEQ ID NO:181的氨基酸100-110(YFCCCEGNFCN-SEQ ID NO:192)；或(h)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ IDNO:181的氨基酸52-56(EQDKR)。
在另一个替代性实施方式中，上文所提及的组合物包含抗ActRII抗体，其结合ActRIIB的亲和力是其结合ActRIIA结合的亲和力的10倍或更高。
另外地，本公开关于组合物，其中抗ActRIIB抗体包含重链可变区CDR1，其包含选自SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列；重链可变区CDR2，其包含选自SEQ ID NO:15-28的氨基酸序列；重链可变区CDR3，其包含选自SEQ ID NO:29-42的氨基酸序列；轻链可变区CDR1，其包含选自SEQ ID NO:43-56的氨基酸序列；轻链可变区CDR2，其包含选自SEQ ID NO:57-70的氨基酸序列；和轻链可变区CDR3，其包含选自SEQ ID NO:71-84的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本公开提供组合物，其中抗ActRII抗体包含：(a)SEQ ID NO:1的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:15的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:29的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:43的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:57的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:71的轻链可变区CDR3，(b)SEQ ID NO:2的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:16的重链可变区CDR2；SEQID NO:30的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:44的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:58的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:72的轻链可变区CDR3，(c)SEQ ID NO:3的重链可变区CDR1；SEQ IDNO:17的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:31的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:45的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:59的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:73的轻链可变区CDR3，(d)SEQ IDNO:4的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:18的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:32的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:46的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:60的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:74的轻链可变区CDR3，(e)SEQ ID NO:5的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:19的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:33的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:47的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:61的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:75的轻链可变区CDR3，(f)SEQ ID NO:6的重链可变区CDR1；SEQID NO:20的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:34的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:48的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:62的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:76的轻链可变区CDR3，(g)SEQ IDNO:7的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:21的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:35的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:49的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:63的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:77的轻链可变区CDR3，(h)SEQ ID NO:8的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:22的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:36的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:50的轻链可变区CDR1，SEQ ID NO:64的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:78的轻链可变区CDR3，(i)SEQ ID NO:9的重链可变区CDR1；SEQID NO:23的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:37的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:51的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:65的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:79的轻链可变区CDR3，(j)SEQ IDNO:10的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:24的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:38的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:52的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:66的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:80的轻链可变区CDR3，(k)SEQ ID NO:11的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:25的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:39的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:53的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:67的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:81的轻链可变区CDR3，(l)SEQ ID NO:12的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:26的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:40的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:54的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:68的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:82的轻链可变区CDR3，(m)SEQ ID NO:13的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:27的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:41的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:55的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:69的轻链可变区CDR2；和SEQID NO:83的轻链可变区CDR3，或(n)SEQ ID NO:14的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:28的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:42的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:56的轻链可变区CDR1；SEQ IDNO:70的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:84的轻链可变区CDR3。
在另一个实施方式中，上文所提及的抗ActRII抗体包含(i)全长重链氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO:146-150和156-160的至少一个序列具有至少95％的序列一致性，(ii)全长轻链氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO:141-145和151-155的至少一个序列具有至少95％的序列一致性，或(iii)(a)SEQ ID NO:99的可变重链序列和SEQ ID NO:85的可变轻链序列；(b)SEQ ID NO:100的可变重链序列和SEQ ID NO:86的可变轻链序列；(c)SEQ ID NO:101的可变重链序列和SEQ ID NO:87的可变轻链序列；(d)SEQ ID NO:102的可变重链序列和SEQ ID NO:88的可变轻链序列；(e)SEQ ID NO:103的可变重链序列和SEQ ID NO:89的可变轻链序列；(f)SEQ ID NO:104的可变重链序列和SEQ ID NO:90的可变轻链序列；(g)SEQID NO:105的可变重链序列和SEQ ID NO:91的可变轻链序列；(h)SEQ ID NO:106的可变重链序列和SEQ ID NO:92的可变轻链序列；(i)SEQ ID NO:107的可变重链序列和SEQ ID NO:93的可变轻链序列；(j)SEQ ID NO:108的可变重链序列和SEQ ID NO:94的可变轻链序列；(k)SEQ ID NO:109的可变重链序列和SEQ ID NO:95的可变轻链序列；(l)SEQ ID NO:110的可变重链序列和SEQ ID NO:96的可变轻链序列；(m)SEQ ID NO:111的可变重链序列和SEQID NO:97的可变轻链序列；或(n)SEQ ID NO:112的可变重链序列和SEQ ID NO:98的可变轻链序列。
在某些方面中，本公开关于上述组合物，其中所包含抗ActRII抗体包含(a)SEQ IDNO:146的重链序列和SEQ ID NO:141的轻链序列；(b)SEQ ID NO:147的重链序列和SEQ IDNO:142的轻链序列；(c)SEQ ID NO:148的重链序列和SEQ ID NO:143的轻链序列；(d)SEQID NO:149的重链序列和SEQ ID NO:144的轻链序列；(e)SEQ ID NO:150的重链序列和SEQID NO:145的轻链序列；(f)SEQ ID NO:156的重链序列和SEQ ID NO:151的轻链序列；(g)SEQ ID NO:157的重链序列和SEQ ID NO:152的轻链序列；(h)SEQ ID NO:158的重链序列和SEQ ID NO:153的轻链序列；(i)SEQ ID NO:159的重链序列和SEQ ID NO:154的轻链序列；或(j)SEQ ID NO:160的重链序列和SEQ ID NO:155的轻链序列。
本公开的另一主题关于组合物，其中(i)抗ActRII抗体交叉阻断或被上述抗体中之一交叉阻断，(ii)具有通过Fc区突变而改变的效应子功能，和/或(iii)结合由上述抗体之一识别的表位。
在另一个实施方式中，所公开组合物包含由pBW522(DSM22873)或pBW524(DSM22874)编码的抗ActRII抗体。
附图说明
图1.步行速度变化与大腿肌间脂肪组织面积和大腿肌肉面积变化之间的相关性。
如图所示，具有肌肉质量最小增加和脂肪质量最大增加的患者显示步行/步行速度最大下降(采用自Beavers等，2013)。
图2.抗ActRII抗体治疗相对于药理学肌肉抑制素抑制的功效的比较。治疗是比麦单抗(10mg/kg；条纹块)、肌肉抑制素前肽D76A(30mg/kg；灰色块)或磷酸缓冲盐水(白色块)。结果以平均值±SEM(n＝9或10)表示。*，相对经PBS处理的组P<0.05；**，相对经PBS处理的组P0.01。
图3.经单剂20mg/kg IV IgG1或比麦单抗治疗3周的大鼠的通过MRI测量的后腿肌肉体积。
图4.全腿上石膏2周期间和后续在有或没有单剂比麦单抗(30mg/kg)的情况下自行恢复期间大腿肌肉体积变化。
图5.具有功能性移动障碍(步行速度低于1.0m/s)的肌减少性个体中对于一个或两个剂量的比麦单抗(30mg/kg iv.)的大腿肌肉体积变化。
图6.接受单剂比麦单抗(0.1、0.3、1、10、30mg/kg)的健康志愿者中肌间脂肪组织自基线的变化，结果以平均值(SEM)显示。
图7.在散发性包涵体肌炎患者中，比麦单抗诱导的瘦体质量(LBM)、四头肌强度(QMT)和6分钟步行距离(6MWD)自基线的变化。应注意LBM增加(在第8周至第16周)与第16周开始肌肉强度和身体性能显著增加之间的时间间隔。
图8.BYM338D2201研究设计。
具体实施方式
定义
为更容易地理解本发明，首先定义某些术语。其他定义在整个详细说明书中进行阐释。
术语“包含”意指“包括”，例如“包含”X的组合物可排他地由X组成或可包括额外某物，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”意指(例如)x±10％。
术语“失用性萎缩”是肌肉萎缩或肌肉消瘦的另一术语。其发生在肌肉不再如平常一样活跃之时。当肌肉不再使用时，其缓慢变弱。最终，其开始收缩。在一些情况下，如果肌肉再次变活跃，则失用性萎缩可被逆转。
失用性萎缩可由不活动引起，例如手臂长时间上石膏。如果人停止进行其常见活动(例如步行)，则也可在一定程度上发生失用性萎缩。
术语“大手术”是任何涉及麻醉和呼吸辅助的手术。在本发明上下文中，其意指手术中或手术后并发症(心脏或呼吸道并发症、大出血、严重感染)风险的显著切除(关节的移除和置换)。所述手术包含内固定或关节成形术。
下文例示评估使用肌肉抑制素拮抗剂(例如肌肉抑制素结合分子或ActRII结合分子，优选ActRII结合分子，更优选针对ActRII的拮抗剂抗体，例如比麦单抗)治疗的可能效应的可能临床前治疗方案。
该治疗是通过使用食蟹猴来例示，但所述实验并不限于猴，且本领域技术人员知悉如何针对其他物种、特别是人设定合适的实验或给药方案：可通过静脉内注射向雄性和雌性食蟹猴每周一次持续3个月施用抗ActRII抗体(例如比麦单抗)。可将32只食蟹猴(16只/性别)分配给四个治疗组中的一个(3-5只动物/性别/组)，且可以10、30或100mg/kg每周一次持续13周静脉内注射载剂或ActRIIB抗体(例如BYM338)(总共14个剂量；剂量应基于猴的肌肉肥大活动来选择)来施用。
术语“ActRIIA”和“ActRIIB”是指活化素受体。活化素通过受体丝氨酸激酶的异二聚体复合物传导信号，所述复合物包括至少两种I型(I和IB)和两种II型(IIA和IIB、也称ACVR2A和ACVR2B)受体。这些受体都是跨膜蛋白，由具有半胱氨酸富集区的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有所预测丝氨酸/苏氨酸特异性的细胞质结构域构成。I型受体为信号传导所必需，而II型受体为结合配体和表达/募集I型受体所必需。I型和II型受体在配体结合后形成稳定复合物，引起II型受体对I型受体的磷酸化。活化素受体II B(ActRIIB)是肌肉抑制素的受体。活化素受体II A(Act RIIA)也是肌肉抑制素的受体。术语ActRIIB或Act IIB受体是指如SEQ ID NO:181(AAC64515.1，GI:3769443)所定义的人类ActRIIB。本领域内已知研究级多克隆和单克隆抗ActRIIB抗体，例如由R&DMN,USA制造的那些。当然，抗体可针对其他物种的ActRIIB，且被用于治疗那些物种的病理学病况。
术语“免疫响应”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(例如抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用导致选择性损害、破坏或自人体消除入侵病原体、感染病原体的细胞或组织、癌性细胞或(在自体免疫或病理性发炎的情形下的)正常人类细胞或组织。
“信号传导活动”是指通常由蛋白-蛋白相互作用(例如生长因子与受体的结合)引发的使信号自细胞的一部分传递至细胞另一部分的生化因果关系。通常传递涉及在引起信号转导的反应系列中一或多种蛋白质的一或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特异性磷酸化。倒数第二个过程通常包括核事件，引起基因表达发生变化。
术语“抗体”在本文中提及时包括全抗体和其任意抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。天然存在的“抗体”是糖蛋白，包含由二硫键互联的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每一重链包括重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域：CH1、CH2和CH3。每一轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域CL。VH和VL区可进一步细分成多个超变区(称为互补决定区(CDR))，间杂着更为保守的区(称为框架区(FR))。每一VH和VL是由三个CDR和四个FR构成，其自氨基末端至羧基末端按下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应子细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。
如本文所使用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单称为“抗原部分”)是指全长或抗体的保留了特异性结合到抗原(例如ActRIIB的部分)能力的一或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来实施。涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，即包含各自结合相同抗原、在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，1989，Nature 341:544-546)；和经分离的互补决定区(CDR)。
此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由单独基因编码，但可使用重组方法通过合成接头使该两个结构域连接在一起，该合成接头使该两个结构域能够被制备成其中VL与VH区配对形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv)；例如参见Bird等，1988Science242:423-426；和Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。这些单链抗体也被涵盖于术语抗体的“抗原结合区”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常用技术来获得，且这些片段经筛选以与完整抗体相同的方式使用。
如本文所使用，“经分离抗体”是指抗体实质上不含具有不同抗原特异性的其它抗体(例如特异性结合ActRIIB的经分离抗体实质上不含特异性结合ActRIIB以外抗原的抗体)。然而，特异性结合ActRIIB的经分离抗体可能与其他抗原(例如来自其他物种的ActRIIB分子)具有交叉反应性。此外，经分离抗体可以实质上不含其他细胞材料和/或化学品。
术语“交叉阻断(cross-block、cross-blocked和cross-blocking)”在本文中可互换使用，意指在标准竞争性结合分析中抗体或其他结合剂干扰其他抗体或结合剂结合ActRIIB、特别是配体结合结构域的能力。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物展示针对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所使用，术语“人类抗体”包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区二者都源自人类来源的序列。另外，如果抗体含有恒定区，则该恒定区也源自这些人类序列，例如人类种系序列或人类种系序列的突变形式或含有源自人类框架序列分析的一致性框架序列的抗体(例如，如Knappik等(2000.J Mol Biol 296,57-86所述)。本公开的人类抗体可包括并非由人类序列编码的氨基酸残基(例如通过体外的随机诱变或定点诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。然而，如本文所使用的术语“人类抗体”并不包括有源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列被移植至人类框架序列上的抗体。
术语“人类单克隆抗体”是指展示单一结合特异性的抗体，其可变区中框架区和CDR区都源自人类序列。在一个实施方式中，人类单克隆抗体是由杂交瘤产生，该杂交瘤所含与永生细胞融合的B细胞获自转基因非人类动物(例如转基因小鼠)，该转基因非人类动物的基因组具有包含人类重链转基因和轻链转基因。
如本文所使用的术语“重组人类抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如分离自就人类免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或自其制备的杂交瘤的抗体，分离自经转化以表达人类抗体的宿主细胞(例如自转染瘤)的抗体，分离自重组、组合人类抗体文库的抗体，以及通过涉及将人类免疫球蛋白基因、序列的全部或部分剪接至其他DNA序列的任何其他方式来制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人类抗体具有的可变区中框架区和CDR区源自人类种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方式中，可使这些重组人类抗体经历体外诱变(或当使用就人类Ig序列的转基因动物时经历体内体细胞诱变)，因此尽管源自人类种系VH和VL序列及与其相关，重组抗体VH和VL区的氨基酸序列是可以不天然存在于体内人类抗体种系谱内的序列。
如本文所使用的“同种型”是指由重链恒定区基因提供的抗体类别(例如IgM、IgE、IgG(例如IgG1或IgG2))。
片语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
如本文所使用，“特异性结合ActRIIB多肽”的抗体指以约100nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小的KD结合人类ActRIIB多肽的抗体。“与ActRIIB外的抗原交叉反应”的抗体指以约10×10-9M或更小、约5×10-9M或更小或约2×10-9M或更小的KD结合该抗原的抗体。“不与具体抗原交叉反应”的抗体指以约1.5×10-8M或更大的KD或约5-10×10-8M或约1×10-7M或更大的KD结合该抗原的抗体。在某些实施方式中，在标准结合分析中，不与抗原交叉反应的这些抗体展现出针对这些蛋白质本质上不可检测的结合。KD可使用生物传感器系统(例如系统)或溶液平衡滴定来测定。
如本文所使用，术语“拮抗剂抗体”指在肌肉抑制素或其他ActRIIB配体(例如活化素或GDF-11)存在下能抑制由ActRIIB诱导的信号传导活动的抗体和/或在肌肉抑制素或其他ActRIIA配体(例如活化素或GDF-11)存在下能抑制由ActRIIA诱导的信号传导活动的抗体。用于检测此的分析的实例包括抑制肌肉抑制素诱导的信号传导(例如通过Smad依赖性报告基因分析)、抑制肌肉抑制素诱导的Smad磷酸化(P-Smad ELISA)和抑制肌肉抑制素诱导的骨骼肌细胞分化抑制(例如通过肌酸激酶分析)。
在一些实施方式中，如Smad依赖性报告基因分析中所测量，这些抗体以约10nM或更小、约1nM或更小或约100pM或更小的IC50抑制了肌肉抑制素诱导的信号传导。
如本文所使用，“无激动活性”的抗体指在基于细胞的分析中，在肌肉抑制素不存在时不显著增加ActRIIB介导的信号传导活性的抗体，例如抑制肌肉抑制素诱导的信号传导(例如通过Smad依赖性报告基因分析)、抑制肌肉抑制素诱导的Smad磷酸化(P-SmadELISA)和抑制肌肉抑制素诱导的骨骼肌细胞分化的抑制(例如通过肌酸激酶分析)。这些分析更详细地阐述于下文实例中。
如本文所使用，术语“K缔合”或“Ka”指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所使用的术语“K解离”或“Kd”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所使用，术语“KD”指解离常数，其从Kd对Ka的比率(即Kd/Ka)获得且以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可使用本领域内已确定的方法测定。用于测定抗体KD的一种方法是使用表面等离子共振，例如的生物传感器系统，或者溶液平衡滴定(SET)(参见Friguet B等(1985)J.ImmunolMethods；77(2):305-319，和Hanel C等(2005)Anal Biochem；339(1):182-184)。
如本文所使用，术语“亲和力”是指单一抗原位点处抗体与抗原之间相互作用的强度。在每一抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力在多个位点处与抗原相互作用；相互作用愈大，则亲和力愈强。
如本文所使用，术语“亲合力”是指抗体-抗原复合物的总体稳定性或强度的有用量度。其受控于三个主要因素：抗体表位亲和力；抗原和抗体二者的化合价；以及相互作用部分的结构排列。最终，这些因素定义抗体的特异性，即特定抗体结合精确抗原表位的可能性。
如本文所使用，术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞毒性”活性是指人类B细胞耗减活动。ADCC活性可通过本领域内已知的人类B细胞耗减分析来测量。
为获得较高亲合力探针，可构建二聚偶联物(两分子抗体蛋白偶合至FACS标记物)，因此更容易通过FACS检测到低亲和力相互作用(例如与种系抗体)。此外，增加抗原结合亲合力的另一方式涉及产生本文所述抗ActRIIB抗体的任意构建体的二聚体、三聚体或多聚体。这些多聚体可通过个体模块之间的共价结合(例如通过模仿天然C至N末端结合或通过模仿通过其恒定区连接在一起的抗体二聚体)来产生。在Fc/Fc界面改造的键可为共价或非共价的。另外，除Fc外的二聚或多聚配偶体可用于ActRIIB杂合体中以产生这些高阶结构。例如可使用多聚结构域，例如WO2004/039841中所阐述的三聚结构域或WO98/18943中所阐述的五聚结构域。
如本文所使用，术语抗体的“选择性”是指结合某些靶多肽但不结合密切相关多肽的抗体。
如本文所使用，术语抗体的“高亲和力”是指对靶抗原的KD为1nM或更小的抗体。如本文所使用，术语“个体”包括任何人类或非人类动物。
术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
如本文所使用，术语“优化的”意指核苷酸序列经改变以编码氨基酸序列，其所用密码子在生产用细胞或有机体中是优选，生产用有机体通常为真核细胞(例如毕赤酵母属细胞、木霉属细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人类细胞)。优化的核苷酸序列经改造以完全或尽可能多地保留由起始核苷酸序列原始编码的氨基酸序列，也称为“亲代”序列。本文的优化序列已经改造以具有在CHO哺乳动物细胞中优选的密码子，然而本文也设想这些序列在其他真核细胞中的优化表达。由优化核苷酸序列编码的氨基酸序列也称为被优化的。
详细内容
已发现针对ActRII受体的抗体(例如比麦单抗)可阻止肌肉抑制素结合受体，由此改善或加速髋部骨折术患者的恢复。
因此，在一方面，本公开提供组合物，其包含肌肉抑制素拮抗剂，例如肌肉抑制素结合分子或ActRII结合分子，优选ActRII结合分子，更优选抗ActRII抗体，例如比麦单抗或包含该抗体的抗原结合部分的功能蛋白供应用。在一个实施方式中，ActRIIB是人类ActRIIB。人类ActRIIB的多肽序列记录于SEQ ID NO:181(AAC64515.1,GI:3769443)中。在一个实施方式中，抗体或功能蛋白是来自哺乳动物，具有例如人类或骆驼科动物起源。因此，所公开组合物中包含的抗体可为嵌合、人类或人源化抗体。在一个特定的实施方式中，所公开组合物中包含的抗ActRIIB抗体表征为含有对靶蛋白ActRIIB具有特异性且结合ActRIIB或ActRIIB片段的抗原结合区。
在一个实施方式中，所公开组合物中包含的抗体是不具有或具有低激动活性的ActRII拮抗剂。在另一个实施方式中，所公开组合物中包含的抗体或功能片段结合靶蛋白ActRII，且将肌肉抑制素与ActRII的结合减少至基底水平。在此实施方式的另一方面，所公开组合物中包含的抗体或功能片段完全阻止肌肉抑制素结合ActRII。在另一个实施方式中，所公开组合物中所包含的抗体或功能片段抑制Smad活化。在另一个实施方式中，所公开组合物中包含的抗体或功能片段通过Smad依赖性路径抑制IIB型活化素受体介导的肌肉抑制素诱导性骨骼分化抑制。
所述结合可通过一或多种可用于测量抗体的拮抗作用或激动作用活性的分析来测定。优选地，这些分析测量抗体对ActRIIB的至少一种效应，包括：抑制肌肉抑制素与ActRIIB的结合(通过ELISA测量)、抑制肌肉抑制素诱导的信号传导(例如通过Smad依赖性报告基因分析)、抑制肌肉抑制素诱导的Smad磷酸化(P-Smad ELISA)和抑制肌肉抑制素诱导的骨骼肌细胞分化抑制(例如通过肌酸激酶分析)。
在一个实施方式中，本公开提供包含特异性结合ActRIIB肌肉抑制素结合区(即配体结合结构域)的抗体的组合物。此配体结合结构域是由SEQ ID NO:181的氨基酸19-134组成，且在本文中已编为SEQ ID NO:182。配体结合结构域包括若干下文所阐述的表位。
在一个实施方式中，所公开组合物中包含的抗体以约100nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小的KD结合ActRIIB。优选地，所公开组合物中包含的抗体以100pM或更小(即约100pM、约50pM、约10pM、约2pM、约1pM或更小)的亲和力结合ActRIIB。在一个实施方式中，所公开组合物中包含的抗体以介于约1pM与约10pM之间的亲和力结合ActRIIB。
在一个实施方式中，所公开组合物中包含的抗体不与ActRIIB相关蛋白交叉反应，尤其不与人类ActRIIA(NP_001607.1,GI:4501897)交叉反应。在另一个实施方式中，所公开组合物中包含的抗体与ActRIIA交叉反应，且结合ActRIIB的亲和力与结合ActRIIA的亲和力相当或是后者的约1、2、3、4或5倍、更优选约10倍、仍更优选约20倍、30倍、40倍或50倍、仍更优选约100倍。
在一个实施方式中，所公开组合物中包含的抗体以100pM或更大(即约250pM、约500pM、约1nM、约5nM或更大)的亲和力结合ActRIIA。
在一个实施方式中，所公开组合物中包含的抗体具有IgG2同种型。
在另一个实施方式中，所公开组合物中包含的抗体具有IgG1同种型。在另一个实施方式中，所公开组合物中包含的抗体具有IgG1同种型，且具有通过Fc区突变而改变的效应子功能。所述经改变的效应子功能可以是降低的ADCC和CDC活性。在一个实施方式中，所述经改变的效应子功能是沉默的ADCC和CDC活性。
在另一个相关实施方式中，所公开组合物中含的抗体是不具抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性或CDC活性的完整人类或人源化IgG1抗体，且结合由SEQ ID NO:181的氨基酸19-134组成的ActRIIB区。
在另一个相关实施方式中，所公开组合物中所包含的抗体是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性或CDC活性降低的完整人类或人源化IgG1抗体，且结合由SEQ ID NO:181的氨基酸19-134组成的ActRIIB区。
本发明也关于包含人类或人源化抗ActRIIB抗体的组合物，其用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发。
在某些实施方式中，所公开组合物中包含的抗体源自特定重链和轻链序列和/或包含特定结构特征，例如含特定氨基酸序列的CDR区。本公开提供经分离的ActRIIB抗体，制备此类抗体的方法，含此类抗体的免疫偶联物和多价或多特异性分子以及含有所述抗体、免疫偶联物或双特异性分子的药用组合物。
在替代的实施方式中，本公开关于以下方面：
1.一种肌肉抑制素拮抗剂，供应用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发的。
2.如方面1供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂在确认髋部修复手术成功和伤口愈合后施用。
3.如方面1或2中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中在有或没有助步器情况下能进行负重步行且能开始身体复健的患者中施用所述肌肉抑制素拮抗剂。
4.如方面1-3供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂在手术后7-42天或约1-6周、优选14-42天、或约2-6周、最多8周开始施用。
5.如方面1-4中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂以约3-10mg/kg的剂量施用于有需要的患者。
6.如方面5供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂以约3mg/kg体重或约10mg/kg体重的剂量施用。
或者，所述肌肉抑制素拮抗剂以约3、4、5、6、7、8、9或约10mg/kg体重的剂量施用。
7.如方面1-3中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂以约70-700mg的剂量施用于有需要的患者。
8.如方面5供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂以约210mg或约700mg的剂量施用。
或者，所述肌肉抑制素拮抗剂以约210mg、280mg、300mg、350mg、400mg、420mg、450mg、490mg、500mg、550mg、560mg、600mg、630mg或约700mg的剂量施用。
9.如方面1-8供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂经静脉内施用。
10.如方面1-9中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂每四周施用。
或者，所述肌肉抑制素拮抗剂可每8周施用。
11.如方面1-10中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂施用至少3个月。
12.如方面1-11中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂施用约6个月。
13.如方面1-11中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂施用最长达12个月。
优选地，所述肌肉抑制素拮抗剂施用至少或最长达3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。
14.如前述方面中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中施用所述肌肉抑制素以加速/改善失用性萎缩患者身体恢复(所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发)意味着增强肌肉生长、增加肌肉强度和身体性能、改善自我感知移动性、加速恢复至独立以及降低跌倒和伤害性跌倒的风险。
15.一种加速/改善失用性萎缩患者身体恢复的方法，所述失用性萎缩由髋部骨折和用于骨折修复的后续大手术而造成移动性降低所引发，包含施用肌肉抑制素拮抗剂。
16.如方面15的方法，包含在确认髋部修复手术成功和伤口愈合后施用肌肉抑制素拮抗剂。
17.如方面16的方法，包含在手术后约7-42天或约1-6周、优选14-42天或约2-6周、最多8周开始施用所述肌肉抑制素拮抗剂。
18.如方面15-17中任意一项的方法，包含对能在有或没有助步器情况下进行负重步行且开始身体复健的患者开始施用所述肌肉抑制素拮抗剂。
19.如方面15-18中任意一项的方法，包含以约3-10mg/kg的剂量向有需要的患者施用所述肌肉抑制素拮抗剂。
20.如方面15-19中任意一项的方法，包含以约3mg/kg体重或约10mg/kg体重的剂量向有需要的患者施用所述肌肉抑制素拮抗剂。
21.如方面15-20中任意一项的方法，包含经静脉内施用所述肌肉抑制素拮抗剂。
22.如方面15-21中任意一项的方法，包含每4周施用所述肌肉抑制素拮抗剂。
23.如方面15-22中任意一项的方法，包含施用所述肌肉抑制素拮抗剂至少3个月。
24.如方面15-23中任意一项的方法，包含施用所述肌肉抑制素拮抗剂至少6个月。
25.如方面23的方法，包含施用所述肌肉抑制素拮抗剂长达12个月。
26.如方面15-25中任意一项的方法，其中加速/改善失用性萎缩患者身体恢复(所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发)意味着增强的肌肉生长、增加的肌肉强度和身体性能、改善的自我感知移动性、加速的恢复至独立和降低的跌倒和伤害性跌倒风险。
27.如方面1-26中任意一项使用的肌肉抑制素拮抗剂或方法，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是肌肉抑制素受体结合分子。
28.如方面1-27中任意一项使用的肌肉抑制素拮抗剂或方法，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是ActRII受体拮抗剂。
29.如方面1-28中任意一项使用的肌肉抑制素拮抗剂或方法，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是抗ActRII受体抗体。
30.如方面1-29中任意一项的供应用的肌肉抑制素拮抗剂或方法，其中所述抗ActRII受体抗体是比麦单抗。
31.如方面29的供应用的肌肉抑制素拮抗剂或方法，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是结合由SEQ ID NO:181的氨基酸19-134(SEQ ID NO:182)组成的ActRIIB表位的抗ActRII抗体。
32.如方面29-31中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂或方法，其中所述抗ActRII抗体结合的ActRIIB包含以下序列或由以下序列组成：
(a)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)；
(b)SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)；
(c)SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)；
(d)SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)；
(e)SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)；
(f)SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT-SEQ ID NO:191)；
(g)SEQ ID NO:181的氨基酸100-110(YFCCCEGNFCN-SEQ ID NO:192)；或
(h)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)。
33.如方面29-32中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述抗ActRIIB抗体选自下组：
a)抗ActRIIB抗体，其结合的ActRIIB表位包含以下序列：
(a)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)；
(b)SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)；
(c)SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)；
(d)SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)；
(e)SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)；
(f)SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT-SEQ ID NO:191)；
(g)SEQ ID NO:181的氨基酸100-110(YFCCCEGNFCN-SEQ ID NO:192)；或
(h)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)
；和b)针对ActRIIB的拮抗剂抗体，其结合的ActRIIB表位包含以下序列：
(a)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)；
(b)SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)；
(c)SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)；
(d)SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)；
(e)SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)；
(f)SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT–SEQ ID NO:191)；
(g)SEQ ID NO:181的氨基酸100-110(YFCCCEGNFCN–SEQ ID NO:192)；或
(h)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)，
其中所述抗体具有约2pM的KD。
34.如方面29-33中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂或方法，其中所述抗体结合ActRIIB的亲和力是其与ActRIIA结合亲和力的10倍或更大。
35.如方面29-34中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂或方法，其中所述抗体包含重链可变区CDR1，其包含选自SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列；重链可变区CDR2，其包含选自SEQ ID NO:15-28的氨基酸序列；重链可变区CDR3，其包含选自SEQ ID NO:29-42的氨基酸序列；轻链可变区CDR1，其包含选自SEQ ID NO:43-56的氨基酸序列；轻链可变区CDR2，其包含选自SEQ ID NO:57-70的氨基酸序列；和轻链可变区CDR3，其包含选自SEQ ID NO:71-84的氨基酸序列。
36.如方面29-35中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂或方法，其中所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO:1的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:15的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:29的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:43的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:57的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:71的轻链可变区CDR3，
(b)SEQ ID NO:2的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:16的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:30的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:44的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:58的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:72的轻链可变区CDR3，
(c)SEQ ID NO:3的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:17的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:31的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:45的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:59的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:73的轻链可变区CDR3，
(d)SEQ ID NO:4的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:18的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:32的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:46的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:60的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:74的轻链可变区CDR3，
(e)SEQ ID NO:5的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:19的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:33的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:47的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:61的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:75的轻链可变区CDR3，
(f)SEQ ID NO:6的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:20的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:34的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:48的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:62的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:76的轻链可变区CDR3，
(g)SEQ ID NO:7的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:21的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:35的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:49的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:63的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:77的轻链可变区CDR3，
(h)SEQ ID NO:8的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:22的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:36的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:50的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:64的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:78的轻链可变区CDR3，
(i)SEQ ID NO:9的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:23的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:37的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:51的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:65的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:79的轻链可变区CDR3，
(j)SEQ ID NO:10的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:24的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:38的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:52的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:66的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:80的轻链可变区CDR3，
(k)SEQ ID NO:11的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:25的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:39的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:53的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:67的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:81的轻链可变区CDR3，
(l)SEQ ID NO:12的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:26的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:40的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:54的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:68的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:82的轻链可变区CDR3，
(m)SEQ ID NO:13的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:27的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:41的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:55的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:69的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:83的轻链可变区CDR3，或
(n)SEQ ID NO:14的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:28的重链可变区CDR2；SEQ IDNO:42的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:56的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:70的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:84的轻链可变区CDR3。
37.如方面29-36中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂或方法，其中所述抗体包含的全长重链氨基酸序列与选自SEQ ID NO:146-150和156-160的至少一个序列具有至少95％序列一致性。
38.如方面29-37中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂或方法，其中所述抗体包含的全长轻链氨基酸序列与选自SEQ ID NO:141-145和151-155的至少一个序列具有至少95％序列一致性。
39.如方面29-38中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂或方法，其中所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO:99的可变重链序列和SEQ ID NO:85的可变轻链序列；
(b)SEQ ID NO:100的可变重链序列和SEQ ID NO:86的可变轻链序列；
(c)SEQ ID NO:101的可变重链序列和SEQ ID NO:87的可变轻链序列；
(d)SEQ ID NO:102的可变重链序列和SEQ ID NO:88的可变轻链序列；
(e)SEQ ID NO:103的可变重链序列和SEQ ID NO:89的可变轻链序列；
(f)SEQ ID NO:104的可变重链序列和SEQ ID NO:90的可变轻链序列；
(g)SEQ ID NO:105的可变重链序列和SEQ ID NO:91的可变轻链序列；
(h)SEQ ID NO:106的可变重链序列和SEQ ID NO:92的可变轻链序列；
(i)SEQ ID NO:107的可变重链序列和SEQ ID NO:93的可变轻链序列；
(j)SEQ ID NO:108的可变重链序列和SEQ ID NO:94的可变轻链序列；
(k)SEQ ID NO:109的可变重链序列和SEQ ID NO:95的可变轻链序列；
(l)SEQ ID NO:110的可变重链序列和SEQ ID NO:96的可变轻链序列；
(m)SEQ ID NO:111的可变重链序列和SEQ ID NO:97的可变轻链序列；或
(n)SEQ ID NO:112的可变重链序列和SEQ ID NO:98的可变轻链序列。
40.如方面29-39中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂或方法，其中所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO:146的重链序列和SEQ ID NO:141的轻链序列；
(b)SEQ ID NO:147的重链序列和SEQ ID NO:142的轻链序列；
(c)SEQ ID NO:148的重链序列和SEQ ID NO:143的轻链序列；
(d)SEQ ID NO:149的重链序列和SEQ ID NO:144的轻链序列；
(e)SEQ ID NO:150的重链序列和SEQ ID NO:145的轻链序列；
(f)SEQ ID NO:156的重链序列和SEQ ID NO:151的轻链序列；
(g)SEQ ID NO:157的重链序列和SEQ ID NO:152的轻链序列；
(h)SEQ ID NO:158的重链序列和SEQ ID NO:153的轻链序列；
(i)SEQ ID NO:159的重链序列和SEQ ID NO:154的轻链序列；或
(j)SEQ ID NO:160的重链序列和SEQ ID NO:155的轻链序列。
41.如方面29-40中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述组合物中包含的抗体交叉阻断至少一种如方面36的抗体与ActRIIB的结合或被至少一种如方面36的抗体交叉阻断与ActRIIB的结合。
42.如方面29-41中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述组合物中包含的抗体具有通过Fc区突变改变的效应子功能。
43.如方面29-42中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述组合物中包含的抗体结合由方面39-40中所列抗体识别的表位。
44.如方面29-43中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述抗体是由pBW522(DSM22873)或pBW524(DSM22874)编码。
45.比麦单抗，供应用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发，其中比麦单抗以约3-10mg/kg体重的剂量每四周经静脉内施用。
46.比麦单抗，其供应用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发，其中比麦单抗以约3mg/kg体重的剂量每四周经静脉内施用。
47.比麦单抗，其供应用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发，其中比麦单抗以约10mg/kg体重的剂量每四周经静脉内施用。
48.一种组合物，其包含150mg/ml的比麦单抗，供应用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复的方法中，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发。
49.一种单一剂型，其包含150mg/ml的比麦单抗。
在其他实施方式中，所述单一剂型(即小瓶)包含100-200mg/ml的比麦单抗，优选100mg/ml、105mg/ml、110mg/ml、115mg/ml、120mg/ml、125mg/ml、130mg/ml、135mg/ml、140mg/ml、145mg/ml、150mg/ml、155mg/ml、160mg/ml、165mg/ml、170mg/ml、175mg/ml、180mg/ml、185mg/ml、190mg/ml、195mg/ml、200mg/ml的比麦单抗。
50.一种输液袋，其包含来自一或多瓶经溶液稀释的适量比麦单抗。
该溶液优选是右旋糖溶液。
在一些其他的实施方式中，肌肉抑制素拮抗剂、优选AcRII拮抗剂或抗ActRII抗体(例如比麦单抗)以约1mg/kg体重、2mg/kg体重、3mg/kg体重、4mg/kg体重、5mg/kg体重、6mg/kg体重、7mg/kg体重、8mg/kg体重、9mg/kg体重、10mg/kg体重的剂量施用。
本文公开的是用于制造药物的肌肉抑制素拮抗剂，该药物用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发。
在其他实施方式中，本文公开的所有方面都可以组合其一与任意其它来使用。
本公开的多个方面进一步详细阐述于以下子部分中。本领域已知用于评估抗体对不同物种ActRII的结合能力的标准分析，包括(例如)ELISA、蛋白质印迹和RIA。合适的分析详细阐述于实施例中。抗体的结合亲和力也可通过本领域内已知的标准分析、例如通过Biacore分析或溶液平衡滴定来评价。基于表面等离子共振的技术(例如Biacore)可测定能计算结合亲和力的结合动力学。用于评估抗体对ActRIIB功能特性的效应(例如受体结合、阻止或诱导人类B细胞增殖或IgG产生)的分析进一步详细阐述于实施例中。
因此，如根据本领域内已知的方法测定并在本文中阐述的“抑制”这些ActRII功能特性(例如生物化学、免疫化学、细胞、生理学或其他生物活性等)中的一或多个的抗体与特定活性应理解为关联有相对于在抗体不存在(例如，或存在不相关特异性的对照抗体时)所观察到活性的统计学上显著的降低。抑制ActRII活性的抗体影响所测量参数统计学上显著减小至少10％、至少50％、80％或90％，且在某些实施方式中，本公开的抗体可抑制超过95％、98％或99％的ActRII功能活性。
可以使用标准竞争性结合分析来测定抗体或其他结合剂能够干扰另一抗体或结合分子与ActRII结合的能力或程度，并由此测定其根据本公开是否可称为交叉阻断。一种合适的分析涉及使用Biacore技术(例如通过使用BIAcore仪器(Biacore,Uppsala,Sweden))，其可使用表面等离子共振技术来测量相互作用程度。用于测量交叉阻断的另一分析使用基于ELISA的方法。另一分析使用FACS分析，其中测试不同抗体竞争结合ActRIIB表达型细胞(例如阐述于实施例中)。
根据本公开，在所阐述的BIAcore交叉阻断分析中本公开的交叉阻断抗体或其他结合剂结合ActRII，以使得抗体或结合剂的组合(混合物)的所记录的结合介于组合中两种抗体或结合剂的最大理论结合的80％与0.1％(例如80％-4％)之间，特定地介于最大理论结合的75％与0.1％(例如75％-4％)之间，且更特定地介于最大理论结合的70％与0.1％(例如70％-4％)之间，且更特定地介于65％与0.1％(例如65％-4％)之间(如上文所定义)。
在ELISA分析中，如果与阳性对照孔(即相同的抗ActRIIB抗体和ActRIIB，但无“测试”的交叉阻断抗体)相比，测试抗体能够引起抗ActRII抗体与ActRIIB的结合减少介于60％与100％之间、特定地介于70％与100％之间、且更特定地介于80％与100％之间，则将该测试抗体定义为交叉阻断本公开的抗ActRIIB抗体。如本文所引用的交叉阻断抗体的实例是MOR08159和MOR08213(公开于WO2010/125003中)。因此，本公开提供如下组合物，其包含交叉阻断MOR08159或MOR08213与ActRIIB结合的抗体。
重组抗体
用于本公开的组合物中所含抗体(例如针对ActRII的拮抗剂抗体，例如比麦单抗)包括人类重组抗体，其如实施例中所阐述进行分离和结构表征。本发明组合物中所包含抗体的VH氨基酸序列显示于SEQ ID NO:99-112中。本发明组合物中所包含抗体的VL氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:85-98中。本发明组合物中所包含抗体的优选全长重链氨基酸序列的实施例显示于SEQ ID NO:146-150和156-160中。本发明组合物中所包含抗体的优选全长轻链氨基酸序列的实施例分别显示于SEQ ID NO:141-145和151-155中。本发明组合物中所包含的其他抗体包括已通过氨基酸缺失、插入或替代而突变、但在CDR区中与上述序列中所示CDR区具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％一致性的氨基酸。在一些实施方式中包括突变体氨基酸序列，其中当与上述序列中所示CDR区相比时，不超过1个、2个、3个、4个或5个氨基酸已通过CDR区中的氨基酸缺失、插入或替代而突变。
此外，可变重链亲代核苷酸序列显示于SEQ ID NO:127-140中。可变轻链亲代核苷酸序列显示于SEQ ID NO:113-126中。经优化以在哺乳动物细胞中表达的全长轻链核苷酸序列显示于SEQ ID NO:161-165和171-175中。经优化以在哺乳动物细胞中表达的全长重链核苷酸序列显示于SEQ ID NO:166-170和176-180中。本发明组合物中所包含的其他抗体包括由已经突变、但仍与上述序列具有至少60％或更高(即80％、90％、95％、97％、99％或更高)一致性的核酸编码的氨基酸。在一些实施方式中包括突变体氨基酸序列，其中当与上述序列中所示可变区相比时，不超过1个、2个、3个、4个或5个氨基酸已通过可变区中的氨基酸缺失、插入或替代而突变。
由于这些抗体中的每一个都结合相同表位且是来自相同亲代抗体的子代，所以可“混合搭配”VH、VL、全长轻链和全长重链序列(核苷酸序列和氨基酸序列)以产生本公开的其他抗ActRIIB结合分子。可使用上文和实例中所阐述的结合分析法(例如ELISA)来测试这些“混合搭配”抗体的ActRIIB结合性。当混合搭配这些链时，来自特定VH/VL配对的VH序列应更换为结构类似的VH序列。同样地，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长重链序列应更换为结构类似的全长重链序列。同样地，来自特定VH/VL配对的VL序列应更换为结构类似的VL序列。同样地，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应更换为结构类似的全长轻链序列。因此，在一个方面，本公开提供的组合物包含具有以下要素的重组抗ActRII抗体或其抗原结合区：重链可变区，其包含选自SEQ ID NO:99-112的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO:85-98的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供组合物，其包含：
(i)经分离重组抗ActRII抗体，其具有包含选自SEQ ID NO:99-112的氨基酸序列的全长重链；和包含选自SEQ ID NO:85-98的氨基酸序列的全长轻链，或
(ii)包含其抗原结合部分的功能蛋白。
在另一方面，本公开提供组合物，其包含：
(i)经分离重组抗ActRII抗体，其具有由已经优化以在哺乳动物细胞中表达且选自SEQ ID NO:127-140的核苷酸序列编码的全长重链和由已经优化以在哺乳动物细胞中表达且选自SEQ ID NO:113-126的核苷酸序列编码的全长轻链，或
(ii)包含其抗原结合部分的功能蛋白。
本发明组合物中所包含的抗体的VH CDR1的氨基酸序列的示例显示于SEQ ID NO:1-14中。抗体的VH CDR2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:15-28中。抗体的VH CDR3的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:29-42中。抗体的VL CDR1的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:43-56中。抗体的VL CDR2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:57-70中。抗体的VL CDR3的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:71-84中。使用Kabat系统描绘CDR区(Kabat,E.A.等，1991Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和公共服务部(U.S.Departmentof Health and Human Services)，NIH出版物第91-3242号)。测定CDR区的替代方法使用由Chothia设计的方法(Chothia等1989,Nature,342:877-883)。Chothia定义是基于结构环区的位置。然而，由于Chothia所使用的编号系统发生变化(参见例如http://www.biochem.ucl.ac.uk/～martin/abs/GeneralInfo.html和http://www.bioinf.org.uk/abs/)，该系统现在较不常用。存在用于定义CDR的其他系统，且也在该两个网站上有所提及。
鉴于这些抗体中的每一个都可以结合ActRII且抗原结合特异性主要是由CDR1区、2区和3区提供，可“混合搭配”VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列(即可混合搭配来自不同抗体的CDR)，含有VH CDR1、2和3和VL CDR1、2和3的每一抗体产生本公开的其他抗ActRII结合分子。可使用上文和实施例中所阐述的结合分析(例如ELISA)来测试这些“混合搭配”抗体的ActRIIB结合。当混合搭配VH CDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应更换为结构类似的CDR序列。同样地，当混合搭配VL CDR序列时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应更换为结构类似的CDR序列。本领域技术人员将容易了解可通过使一或多个VH和/或VL CDR区序列用来自本文所示单克隆抗体CDR序列的结构类似序列替代来产生新型的VH和VL序列。
所公开组合物中包含的抗ActRII抗体或其抗原结合区具有：重链可变区CDR1，其包含选自SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列；重链可变区CDR2，其包含选自SEQ ID NO:15-28的氨基酸序列；重链可变区CDR3，其包含选自SEQ ID NO:29-42的氨基酸序列；轻链可变区CDR1，其包含选自SEQ ID NO:43-56的氨基酸序列；轻链可变区CDR2，其包含选自SEQ IDNO:57-70的氨基酸序列；和轻链可变区CDR3，其包含选自SEQ ID NO:71-84的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:1的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:15的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:29的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:43的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:57的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:71的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:2的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:16的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:30的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:44的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:58的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:72的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:3的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:17的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:31的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:45的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:59的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:73的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:4的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:18的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:32的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:46的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:60的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:74的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:5的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:19的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:33的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:47的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:61的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:75的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:6的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:20的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:34的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:48的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:62的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:76的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:7的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:21的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:35的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:49的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:63的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:77的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:8的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:22的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:36的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:50的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:64的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:78的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:9的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:23的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:37的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:51的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:65的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:79的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:10的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:24的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:38的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:52的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:66的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:80的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:11的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:25的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:39的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:53的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:67的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:81的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:12的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:26的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:40的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:54的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:68的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:82的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:13的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:27的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:41的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:55的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:69的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:83的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体包含：SEQ ID NO:14的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:28的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:42的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:56的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:70的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:84的轻链可变区CDR3。
在一个实施方式中，本公开提供包含包含以下序列的抗体的组合物：(a)SEQ IDNO:85的可变重链序列和SEQ ID NO:99的可变轻链序列；(b)SEQ ID NO:86的可变重链序列和SEQ ID NO:100的可变轻链序列；(c)SEQ ID NO:87的可变重链序列和SEQ ID NO:101的可变轻链序列；(d)SEQ ID NO:88的可变重链序列和SEQ ID NO:102的可变轻链序列；(e)SEQ ID NO:89的可变重链序列和SEQ ID NO:103的可变轻链序列；(f)SEQ ID NO:90的可变重链序列和SEQ ID NO:104的可变轻链序列；(g)SEQ ID NO:91的可变重链序列和SEQ IDNO:105的可变轻链序列；(h)SEQ ID NO:92的可变重链序列和SEQ ID NO:106的可变轻链序列；(i)SEQ ID NO:93的可变重链序列和SEQ ID NO:107的可变轻链序列；(j)SEQ ID NO:94的可变重链序列和SEQ ID NO:108的可变轻链序列；(k)SEQ ID NO:95的可变重链序列和SEQ ID NO:109的可变轻链序列；(l)SEQ ID NO:96的可变重链序列和SEQ ID NO:110的可变轻链序列；(m)SEQ ID NO:97的可变重链序列和SEQ ID NO:111的可变轻链序列；或(n)SEQ ID NO:98的可变重链序列和SEQ ID NO:112的可变轻链序列。
在一个实施方式中，本公开提供包含包含以下序列的抗体的组合物：(a)SEQ IDNO:146的重链序列和SEQ ID NO:141的轻链序列；(b)SEQ ID NO:147的重链序列和SEQ IDNO:142的轻链序列；(c)SEQ ID NO:148的重链序列和SEQ ID NO:143的轻链序列；(d)SEQID NO:149的重链序列和SEQ ID NO:144的轻链序列；(e)SEQ ID NO:150的重链序列和SEQID NO:145的轻链序列；(f)SEQ ID NO:156的重链序列和SEQ ID NO:151的轻链序列；(g)SEQ ID NO:157的重链序列和SEQ ID NO:152的轻链序列；(h)SEQ ID NO:158的重链序列和SEQ ID NO:153的轻链序列；(i)SEQ ID NO:159的重链序列和SEQ ID NO:154的轻链序列；或(j)SEQ ID NO:160的重链序列和SEQ ID NO:155的轻链序列。
如本文所使用，如果抗体的可变区或全长链是获自使用人类种系免疫球蛋白基因的系统，则人类抗体包含的重链或轻链可变区或全长重链或轻链是“源自”特定种系序列或是其“产物”。这些系统包括使用感兴趣抗原对携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠实施免疫或使用感兴趣抗原筛选噬菌体上展示的人类免疫球蛋白基因文库。作为“源自”人类种系免疫球蛋白序列或是其“产物”的人类抗体可通过以下方式来鉴定：比较人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列，并选择序列最接近于人类抗体序列(即最大一致性％)的人类种系免疫球蛋白序列。作为“源自”特定人类种系免疫球蛋白序列或是其“产物”的人类抗体与种系序列相比可具有氨基酸差异，这是因为(例如)存在天然产生的体细胞突变或有意引入的定点突变。然而，所选人类抗体的氨基酸序列通常与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％一致，且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠类种系序列)相比时将该人类抗体鉴定为确属人类的氨基酸残基。在某些情形下，人类抗体的氨基酸序列可与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少80％、90％或至少95％或甚至至少96％、97％、98％或99％一致。通常，源自特定人类种系序列的人类抗体将显示与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比不超过10个的氨基酸差异。在某些情形下，人类抗体可显示与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比不超过5个或甚至不超过4个、3个、2个或1个的氨基酸差异。
在一个实施方式中，本公开组合物中所包含的抗体是由pBW522或pBW524编码的抗体(分别以保藏号DSM22873和DSM22874保藏于DSMZ，Inhoffenstr.7B，D-38124Braunschweig，德国，2009年8月18日)。
同源抗体
在另一个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体具有与本文所阐述抗体的氨基酸和核苷酸序列同源的全长重链和轻链氨基酸序列；全长重链和轻链核苷酸序列、可变区重链和轻链核苷酸序列或可变区重链和轻链氨基酸序列，且其中所述抗体保留本公开的抗ActRIIB抗体所需的功能特性。
例如，本公开提供组合物，其包含含有重链可变区和轻链可变区的经分离重组抗ActRIIB抗体(或包含其抗原结合部分的功能蛋白)，其中：重链可变区包含与选自SEQ IDNO:99-112的氨基酸序列至少80％或至少90％(优选至少95％、97％或99％)一致的氨基酸序列；轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:85-98的氨基酸序列至少80％或至少90％(优选至少95％、97％或99％)一致的氨基酸序列；或者，这些组合物包含含有重链可变区和轻链可变区的重组抗ActRIIB抗体(或包含其抗原结合部分的功能蛋白)，其中：重链可变区包含与选自SEQ ID NO:99-112的氨基酸序列相比不超过5个氨基酸、或不超过4个氨基酸、或不超过3个氨基酸、或不超过2个或不超过1个氨基酸变化；轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:85-98的氨基酸序列相比不超过5个氨基酸、或不超过4个氨基酸、或不超过3个氨基酸、或不超过2个或不超过1个氨基酸变化，且所述抗体展现至少一个以下的功能特性：(i)其抑制体外或体内肌肉抑制素结合，(ii)降低通过Smad依赖性路径的肌肉分化抑制和/或(iii)不诱导血液学变化，具体地说没有RBC变化。在此背景下，术语“变化”是指插入、缺失和/或替代。
在另一个实施例中，本公开提供组合物，其包含含有全长重链和全长轻链的经分离重组抗ActRII抗体(或包含其抗原结合部分的功能蛋白)，其中：全长重链包含与选自SEQID NO:146-150和156-160的氨基酸序列至少80％或至少90％(优选至少95％、97％或99％)一致的氨基酸序列；全长轻链包含与选自SEQ ID NO:141-145和151-155的氨基酸序列至少80％或至少90％(优选至少95％、97％或99％)一致的氨基酸序列；或者，这些组合物包含含有重链可变区和轻链可变区的重组抗ActRII抗体(或包含其抗原结合部分的功能蛋白)，其中：重链可变区包含与选自SEQ ID NO:146-150和156-160的氨基酸序列相比不超过5个氨基酸、或不超过4个氨基酸、或不超过3个氨基酸、或不超过2个或不超过1个氨基酸的变化；轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:141-145和151-155的氨基酸序列相比不超过5个氨基酸、或不超过4个氨基酸、或不超过3个氨基酸、或不超过2个或不超过1个氨基酸的变化，且所述抗体表现至少一个以下功能特性：(i)其抑制体外或体内肌肉抑制素结合，(ii)降低通过Smad依赖性路径的肌肉分化抑制和/或(iii)不诱导血液学变化，具体地说没有RBC变化。优选地，该抗体结合ActRIIB和/或ActRIIA的配体结合结构域。在此背景下，术语“变化”是指插入、缺失和/或替代。
在另一个实施例中，本公开提供组合物，其包含含有全长重链和全长轻链的经分离重组抗ActRII抗体(或包含其抗原结合部分的功能蛋白)，其中：全长重链的编码核苷酸序列与选自SEQ ID NO:166-170和176-180的核苷酸序列至少80％或至少90％(优选至少95％、97％或99％)一致；全长轻链的编码核苷酸序列与选自SEQ ID NO:161-165和171-175的核苷酸序列至少80％或至少90％(优选至少95％、97％或99％)一致；或者，这些组合物包含含有重链可变区和轻链可变区的重组抗ActRIIB抗体(或包含其抗原结合部分的功能蛋白)，其中：重链可变区包含与选自SEQ ID NO:166-170和176-180的氨基酸序列相比不超过5个氨基酸、或不超过4个氨基酸、或不超过3个氨基酸、或不超过2个或不超过1个氨基酸的变化；轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:161-165和171-175的氨基酸序列相比不超过5个氨基酸、或不超过4个氨基酸、或不超过3个氨基酸、或不超过2个或不超过1个氨基酸的变化，且所述抗体表现至少一个以下功能特性：(i)其抑制体外或体内肌肉抑制素结合，(ii)降低通过Smad依赖性路径的肌肉分化抑制和/或(iii)不诱导血液学变化，具体地说没有RBC变化。优选地，该抗体结合ActRIIB的配体结合结构域。在此背景下，术语“变化”是指插入、缺失和/或替代。
在多个实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体可展现一种或更多种、两种或更多种或三种上文所讨论的功能特性。所述抗体可是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。优选地，所述抗体是完全人类IgG1抗体。
在其他实施方式中，VH和/或VL氨基酸序列可与上文所阐释的序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。在其他实施方式中，除不超过1个、2个、3个、4个或5个氨基酸位置的氨基酸替代外，VH和/或VL氨基酸序列可一致。所含VH和VL区分别与SEQ ID NO99-112和SEQ ID NO:85-98的VH和VL区具有高(即80％或更高)一致性的抗体可通过以下方式来获得：分别诱变(例如定点诱变或PCR介导诱变)核酸分子SEQ ID NO:127-140和113-126，然后使用本文所阐述的功能分析测试所编码的经改变抗体的保留功能(即上文所阐释的功能)。
在其他实施方式中，全长重链和/或全长轻链氨基酸序列可与上文所阐释的序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致，或除不超过1个、2个、3个、4个或5个氨基酸位置的氨基酸变化外可一致。所含全长重链和全长轻链分别与SEQ ID NO:146-150和156-160中任何的全长重链以及SEQ ID NO:141-145和151-155中任何的全长轻链具有高(即至少80％或更大)一致性的抗体可通过以下方式来获得：分别诱变(例如定点诱变或PCR介导诱变)核酸分子SEQ ID NO:166-170和176-180以及SEQ ID NO:161-165和171-175，然后使用本文所阐述的功能分析测试所编码的经改变抗体的保留功能(即上文所阐释的功能)。
在其他实施方式中，全长重链和/或全长轻链核苷酸序列可与上文所阐释的序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。
在其他实施方式中，重链和/或轻链核苷酸序列的可变区可与上文所阐释的序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致，或除不超过1个、2个、3个、4个或5个氨基酸位置的氨基酸变化外可一致。
如本文所使用，考虑到为达成两条序列最优比对而需要引入的缺口数和各缺口的长度，两个序列之间的一致性百分比是序列共有的相同位置数的函数(即一致性％＝相同位置数/总位置数×100)。如下文所阐述，两条序列之间的序列比较与一致性百分比测定可使用数学算法来完成。
两个氨基酸序列之间的一致性百分比可使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17,1988)的算法来测定，该算法已纳入ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12且缺口罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的一致性百分比可使用Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.48:444-453,1970)算法来测定，该算法已纳入GCG软件包装的GAP程序(于http://www.gcg.com处获得)中，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，且缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，且长度权重为1、2、3、4、5或6。
具有保守修饰的抗体
在某些实施方式中，本发明组合物中所包含的抗体具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区以及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一或多个具有基于本文所阐述抗体的指定氨基酸序列或其包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化或其保守修饰的变体序列，且其中这些抗体保留本公开抗ActRIIB抗体的所需功能特性。因此，本公开提供组合物，其包含经分离重组抗ActRIIB抗体或包含其抗原结合部分的功能蛋白，具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区以及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：重链可变区CDR1氨基酸序列是选自SEQ ID NO:1-14或其包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化和其保守修饰的变体序列；重链可变区CDR2氨基酸序列是选自SEQID NO:15-28或其包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化和其保守修饰的变体序列；CDR3氨基酸序列的重链可变区是选自SEQ ID NO:29-42或其包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化和其保守修饰的变体序列；轻链可变区CDR1氨基酸序列是选自SEQ ID NO:43-56或其包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化和其保守修饰的变体序列；轻链可变区CDR2氨基酸序列是选自SEQ ID NO:57-70或其包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化和其保守修饰的变体序列；CDR3氨基酸序列的轻链可变区是选自SEQ ID NO:71-84或其包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化和其保守修饰的变体序列。优选地，所述抗体显示至少一个以下功能特性中：(i)其抑制体外或体内肌肉抑制素结合，(ii)降低通过Smad依赖性路径的肌肉分化抑制和/或(iii)不诱导血液学变化，具体地说没有RBC变化。
在多个实施方式中，所述抗体可表现一或两个上文所列示的功能特性。这些抗体可是(例如)人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其他实施方式中，本发明组合物中所包含的经优化以在哺乳动物细胞中表达的抗体具有全长重链序列和全长轻链序列，其中这些序列中的一或多个具有基于本文所阐述的抗体或其保守修饰的指定氨基酸序列，且其中这些抗体保留本公开抗ActRIIB抗体的所需功能特性。因此，本公开提供组合物，其包含经优化以在哺乳动物细胞中表达、由全长重链和全长轻链组成的经分离单抗抗ActRII抗体，其中：全长重链具有的氨基酸序列选自SEQID NO:146-150和156-160或其包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化和其保守修饰的变体序列；且全长轻链具有的氨基酸序列选自SEQ ID NO:141-145和151-155或其包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化和其保守修饰的变体序列；且所述抗体表现至少一个以下功能特性：(i)其抑制体外或体内肌肉抑制素结合，(ii)降低通过Smad依赖性路径的肌肉分化抑制和/或(iii)不诱导血液学变化，具体地说没有RBC变化。
在多个实施方式中，所述抗体可表现一或两个上文所列示的功能特性。这些抗体可是(例如)人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如本文所使用，术语“保守序列修饰”指氨基酸修饰不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。这些保守修饰包括氨基酸替代、添加和缺失。可通过本领域内已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导诱变)将修饰引入本公开的抗体中。
保守氨基酸替代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的那些。本领域内已定义具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有无电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本公开的抗体的CDR区内的一或多个氨基酸残基可被来自同一侧链家族的其他氨基酸残基替代，且可使用本文所阐述的功能分析来测试经改变抗体的保留功能。
与所公开组合物中包含的抗ActRII抗体结合相同表位的抗体
在另一个实施方式中，本发明提供组合物，其包括与本文所阐述的多个特异性抗ActRII抗体结合相同表位的抗体。实施例中所阐述能够阻断肌肉抑制素与ActRIIA和ActRIIB结合的所有抗体以高亲和力结合ActRIIA和ActRIIB中的一个表位，所述表位包括在SEQ ID NO:181的氨基酸19-134之间。
因此，基于其与本公开的其他抗体交叉竞争(例如以统计学上显著的方式竞争性抑制结合)的能力，可在标准ActRIIB结合分析中鉴定额外的抗体。测试抗体抑制本发明组合物中所含抗体与人类ActRIIB结合的能力显示，测试抗体可与所述抗体竞争结合人类ActRIIB；根据非限制性理论，这样的抗体可与其所竞争的抗体结合至人类ActRIIB上的相同或相关(例如结构类似或空间近端)表位。在某一个实施方式中，与本发明组合物中所含抗体结合人类ActRIIA和ActRIIA上相同表位的抗体是人类重组抗体。这些人类重组抗体可如实施例中所阐述来制备和分离。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:85所示可变重链序列和SEQ ID NO:99所示可变轻链序列的抗体识别的表位和/或与其竞争结合。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:86所示可变重链序列和SEQ ID NO:100所示可变轻链序列的抗体识别的表位。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:87所示可变重链序列和SEQ ID NO:101所示可变轻链序列的抗体识别的表位。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:88所示可变重链序列和SEQ ID NO:102所示可变轻链序列的抗体识别的表位。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:89所示可变重链序列和SEQ ID NO:103所示可变轻链序列的抗体识别的表位。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:90所示可变重链序列和SEQ ID NO:104所示可变轻链序列的抗体识别的表位。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:91所示可变重链序列和SEQ ID NO:105所示可变轻链序列的抗体识别的表位。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:92所示可变重链序列和SEQ ID NO:106所示可变轻链序列的抗体识别的表位。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:93所示可变重链序列和SEQ ID NO:107所示可变轻链序列的抗体识别的表位。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:94所示可变重链序列和SEQ ID NO:108所示可变轻链序列的抗体识别的表位。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:95所示可变重链序列和SEQ ID NO:109所示可变轻链序列的抗体识别的表位。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:96所示可变重链序列和SEQ ID NO:110所示可变轻链序列的抗体识别的表位。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:97所示可变重链序列和SEQ ID NO:111所示可变轻链序列的抗体识别的表位。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由具有SEQ ID NO:98所示可变重链序列和SEQ ID NO:112所示可变轻链序列的抗体识别的表位。
根据更详细的表位定位实验，已更明确地定义了本发明组合物的优选抗体的结合区。
因此，本公开提供包含抗体的组合物，所述抗体结合包含SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)的表位。
本公开也提供包含抗体的组合物，所述抗体结合包含SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)的表位。
本公开也提供包含抗体的组合物，所述抗体结合包含SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)的表位。
本公开也提供包含抗体的组合物，所述抗体结合包含SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)的表位。
本公开也提供包含抗体的组合物，所述抗体结合包含SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)的表位。
本公开也提供包含抗体的组合物，所述抗体结合包含SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT-SEQ ID NO:191)或由其组成的表位。
本公开也提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)组成的表位；和(b)由SEQ ID NO:181的氨基酸49-63()组成的表位。
本公开也提供包含抗体的组合物，所述抗体结合由这些序列组成的表位或包含这些表位区的组合的表位。
因此，本公开也提供包含抗体的组合物，所述抗体结合包含SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)或由其组成的表位。
经改造和经修饰抗体
本发明组合物中所包含的抗体可进一步使用具有本文所显示VH和/或VL序列中一或多个的抗体作为起始材料来改造出经修饰抗体而制得，该经修饰抗体可具有与起始抗体相比改变的特性。抗体可通过修饰一或两个可变区(即VH和/或VL)内、例如一或多个CDR区内和/或一或多个框架区内的一或多个残基来改造。补充或替代地，抗体可通过修饰恒定区内的残基来改造，例如改变抗体的效应子功能。
可实施的一种可变区改造类型是CDR移植。抗体与靶抗原主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基相互作用。出于此原因，在个体抗体之间CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列差异更大。由于CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，故可通过构建表达载体来表达模拟特异性天然抗体特性的重组抗体，这些表达载体包括移植至具有不同特性的不同抗体的框架序列上的来自特异性天然抗体的CDR序列(例如，参见Riechmann,L.等，1998Nature 332:323-327；Jones,P.等，1986Nature 321:522-525；Queen,C.等，1989Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033；颁予Winter的美国专利第5,225,539号以及颁予Queen等的美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号和第6,180,370号)。
因此，本公开的另一个实施方式是关于包含单克隆抗ActRII抗体或包含其抗原结合部分的功能蛋白的组合物，其包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区包含具有选自SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列的CDR1序列、具有选自SEQ ID NO:15-28的氨基酸序列的CDR2序列和具有选自SEQ ID NO:29-42组成的群的氨基酸序列CDR3序列；轻链可变区具有选自SEQ ID NO:43-56的氨基酸序列的CDR1序列、具有选自SEQ ID NO:57-70的氨基酸序列的CDR2序列和由选自SEQ ID NO:71-84的氨基酸序列组成的CDR3序列。因此，这些抗体含有单克隆抗体的VH和VL CDR序列，但可含有不同于这些抗体的框架序列。
这些框架序列可获自包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献。例如，人类重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可参见“VBase”人类种系序列数据库(在互联网www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得)以及Kabat,E.A.等[参见上文]；Tomlinson,I.M.等，1992J.fol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等，1994Eur.J Immunol.24:827-836。用于本公开抗体中的框架序列的实例是那些与由本公开特选抗体使用的框架序列(例如共有序列)和/或由本公开的单克隆抗体使用的框架序列结构类似的那些。可将VH CDR1、2和3序列和VL CDR1、2和3序列移植到具有序列与衍生出框架序列的种系免疫球蛋白基因中所见一致的框架区上，或可将CDR序列移植到与种系序列相比含有一或多个突变的框架区上。例如，已发现在某些情况下，突变框架区内的残基对维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(例如参见颁予Queen等的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一类型的可变区修饰是突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基，从而改善感兴趣抗体的一或多种结合特性(例如亲和力)，这称为“亲和力成熟”。可实施定点诱变或PCR介导诱变以引入突变，且可在如本文所阐述和在实施例中提供的体外或体内分析中评估抗体结合效应或其他感兴趣的功能特性。可引入(如上文所讨论的)保守修饰。突变可为氨基酸替代、添加或缺失。此外，通常改变CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，在另一个实施方式中，本公开提供经分离抗ActRII单克隆抗体或包含其抗原结合部分的功能蛋白，所述抗体或功能蛋白具有重链可变区组成，该重链可变区具有：VHCDR1区，其具有选自SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-14相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列组成；VH CDR2区，其具有选自SEQ ID NO:15-28的氨基酸序列或与SEQ ID NO:15-28相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列；VH CDR3区，其具有选自SEQ ID NO:29-42的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29-42相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列；VL CDR1区，其具有选自SEQ ID NO:43-56的氨基酸序列或与SEQ ID NO:43-56相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列；VLCDR2区，其具有选自SEQ ID NO:52-70的氨基酸序列或与SEQ ID NO:52-70相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列；和VL CDR3区，其具有选自SEQ ID NO:71-84的氨基酸序列或与SEQ ID NO:71-84相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列。
骆驼科抗体
已对自骆驼和单峰骆驼家族成员(双峰骆驼(Camelus bactrianus)和单峰骆驼(Camelus dromaderius)，包括新世界成员，例如美洲驼(llama)种(羊驼(Lama paccos)、大羊驼(Lama glama)和小羊驼(Lama vicugna)))获得的抗体蛋白尺寸、结构复杂度和对人类个体的抗原性进行了表征。发现某些来自此哺乳动物家族的IgG抗体天然缺少轻链，且因此在结构上与来自其他动物抗体的具有两条重链和两条轻链的典型四链四级结构不同(参见WO94/04678)。
可通过遗传改造来获得被鉴别为VHH的小型单一可变结构域的骆驼科抗体区以产生对靶标具有高亲和力的小蛋白，从而产生称为“骆驼科纳米抗体”的低分子量抗体衍生蛋白(参见US5,759,808；Stijlemans,B.等，2004J Biol Chem 279:1256-1261；Dumoulin,M.等，2003Nature 424:783-788；Pleschberger,M.等2003Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo,V.等2002Int J Cancer 89:456-62；和Lauwereys,M.等1998EMBO J 17:3512-3520)。骆驼科抗体和抗体片段的经改造文库可自(例如)Ablynx(比利时根特)购得。与非人类来源的其他抗体一样，可重组改变骆驼科抗体的氨基酸序列，以获得更密切类似于人类序列的序列，即可“人源化”纳米抗体。因此，可进一步降低骆驼科抗体对人类的天然低抗原性。
骆驼科纳米抗体的分子量约为人类IgG分子的十分之一，且该蛋白质具有仅几纳米的物理直径。小尺寸的一个结果是骆驼科纳米抗体有能力结合在功能上对于较大抗体蛋白不可见的抗原位点，即骆驼科纳米抗体可用作试剂来检测原本使用经典免疫学技术时隐秘的抗原，也可用作可能的治疗剂。因此，小尺寸的另一结果在于，骆驼科纳米抗体可由于与靶蛋白的沟或窄缝中特异性位点的结合而抑制，并因此可提供较经典抗体更近似于经典低分子量药物功能的能力。
低分子量和紧凑尺寸进一步使得骆驼科纳米抗体极其热稳定、对极端pH和蛋白水解消化稳定以及抗原性不足。另一结果在于，骆驼科纳米抗体容易自循环系统移动至组织中，甚至穿过血脑屏障，且可治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步促进药物运输穿过血脑屏障(参见US2004/0161738)。这些特征与对人类的低抗原性相结合指示了较大的治疗潜能。此外，这些分子可在原核细胞(例如大肠杆菌)中完整表达，且表达为细菌噬菌体的融合蛋白并具有功能。
因此，在一个实施方式中，本发明是关于组合物，其包含对ActRIIB具有高亲和力的骆驼科抗体或纳米抗体。在本文的某些实施方式中，骆驼科抗体或纳米抗体在骆驼科动物中以天然方式产生，即用本文阐述用于其他抗体的技术，由骆驼科在用ActRIIB或其肽片段实施免疫后产生。或者，抗ActRIIB骆驼科纳米抗体是工程改造的，即如本文实施例中所阐述，使用以ActRIIB为靶的淘选程序，通过(例如)自展示骆驼科纳米抗体蛋白适当诱变的噬菌体文库选择得到。经改造纳米抗体可进一步通过遗传改造来定制使其在接受个体中具有45分钟到两周的半衰期。在一个具体实施方式中，骆驼科抗体或纳米抗体是通过将本公开人类抗体的重链或轻链CDR序列移植至纳米抗体或单一结构域抗体框架序列中来获得，如(例如)WO94/04678中所阐述。
非抗体支架
已知非免疫球蛋白框架或支架包括但不限于阿德奈汀(Adnectin)(纤连蛋白)(Compound Therapeutics公司，Waltham,MA)、锚蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、结构域抗体(Domantis有限公司(Cambridge,MA)和Ablynx nv(Zwijnaarde,Belgium))、脂质运载蛋白(抗运载蛋白(Anticalin))(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小模块免疫医药(Trubion Pharmaceuticals公司，Seattle,WA)、马克西抗体(maxybody)(Avidia公司(Mountain View,CA))、蛋白质A(Affibody AG,Sweden)和亲和素(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)、蛋白质表位模拟物(Polyphor有限公司，Allschwil,Switzerland)。
(i)纤连蛋白支架
纤连蛋白支架优选是基于III型纤连蛋白结构域(例如III型纤连蛋白的第十模块(10Fn3结构域))。III型纤连蛋白结构域具有7或8条分布于两个β片之间的β链，这些链本身彼此堆砌形成蛋白质的核心，并进一步含有将β链彼此连接且暴露于溶剂中的环(类似于CDR)。在β片夹心的每一边缘处存在至少三个这种环，其中该边缘是垂直于β链方向的蛋白质的边界(US 6,818,418)。
虽然这些基于纤连蛋白的支架的总体折迭与包含骆驼和美洲驼IgG中的整个抗原识别单元的最小功能抗体片段重链可变区的折迭密切相关，但是这些基于纤连蛋白的支架并非免疫球蛋白。由于此结构，非免疫球蛋白抗体能模拟在性质和亲和力方面与抗体类似的抗原结合特性。这些支架可用于与体内抗体亲和力成熟过程类似的体外环随机化和改组策略。这些基于纤连蛋白的分子可用作支架，其中该分子的环区可使用标准克隆技术使用本公开的CDR来替代。
(ii)锚蛋白-分子配偶体
该技术是基于使用具有锚蛋白衍生重复模块的蛋白质作为支架来支撑可用于与不同靶向结合的可变区。锚蛋白重复模块是由两个反向平行的α-螺旋与β转角组成的33氨基酸多肽。可变区的结合大多通过使用核糖体展示来优化。
(iii)马克西抗体/厄维体(Avimer)-Avidia
厄维体是源自含有A-结构域的天然蛋白质，例如LRP-1。这些结构域天然用于蛋白质-蛋白质相互作用，且在人类中超过250种蛋白质的结构是基于A-结构域。厄维体是由多个不同的“A-结构域”单体(2-10)通过氨基酸接头连接组成。可结合靶抗原的厄维体可使用(例如)US2004/0175756、US2005/0053973、US2005/0048512和US2006/0008844中所阐述的方法来产生。
(vi)蛋白质A-亲和体
亲和力配体是由基于蛋白质A的一个IgG结合结构域的支架的三螺旋束构成的简单小蛋白质。蛋白质A是来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白。此支架结构域是由58个氨基酸组成，将其中的13个随机化以产生具有大量配体变体的文库(例如参见US 5,831,012)。分子模拟抗体，其与抗体的150kDa分子量相比具有6kDa的分子量。尽管其尺寸较小，分子的结合位点与抗体的结合位点类似。
(v)抗运载蛋白(Anticalin)-粉蝶属(Pieris)
是由Pieris ProteoLab AG公司研发的产品。其是源自脂质运载蛋白，这些脂质运载蛋白是一类广泛的小且稳健的蛋白质，其通常参与化学敏感或不可溶化合物的生理运输或储存。若干天然脂质运载蛋白出现在人类组织或体液中。
蛋白质架构像免疫球蛋白，具有刚性框架上的超变环。然而，与抗体或其重组片段不同，脂质运载蛋白是由具有160至180个氨基酸残基的单一多肽链构成，仅略大于单一免疫球蛋白结构域。
组成结合口袋的四环集合显示显著的结构可塑性并耐受多条侧链。因此，可在专有过程中对结合位点进行重塑以高亲和力和特异性识别所指定的不同形状的靶分子。
已使用脂质运载蛋白家族的一种蛋白质(欧洲粉蝶(Pieris brassicae)的胆素(bilin)结合蛋白(BBP))通过诱变四环集合来研发抗运载蛋白。阐述“抗运载蛋白”的专利申请的一个实例是WO1999/16873。
AFFILINTM分子是经设计对蛋白质和小分子有特定亲和力的小的非免疫球蛋白。新型AFFILINTM分子可极快速地选自两个文库，文库各自都基于源自人类的不同支架蛋白。
AFFILINTM分子并不显示任何与免疫球蛋白的结构同源性。Scil蛋白采用两种AFFILINTM支架，其中一种是γ晶体蛋白(人类结构晶状体蛋白)，另一种是“泛素”超家族蛋白。两种人类支架都极小，显示出高温稳定性病几乎耐受pH变化和变性剂。此高稳定性主要归因于这些蛋白质的扩展β片结构。γ晶体蛋白衍生蛋白质的实例阐述于WO2001/004144中，“泛素样”蛋白的实例阐述于WO2004/106368中。
(vii)蛋白质表位模拟物(PEM)
PEM是模拟蛋白质的二级β-发夹结构(参与蛋白质-蛋白质相互作用的主要二级结构)的中等尺寸环状肽样分子(MW 1-2kDa)。
将抗原结合结构域移植到替代框架或支架中
可采用多种抗体/免疫球蛋白框架或支架，只要所得多肽包括至少一个特异性结合ActRIIB的结合区。这些框架或支架包括人类免疫球蛋白或其片段的5个主要的个体基因型(例如本文其他处所公开的那些)，且包括其他动物物种的免疫球蛋白，优选具有人源化的方面。单一重链抗体(例如于骆驼科中所鉴定的那些)在此方面尤其受关注。本领域技术人员持续发现并研发新型框架、支架和片段。
在一个方面中，本公开组合物可包含基于非免疫球蛋白的抗体，其使用其上可移植有所公开抗体CDR的非免疫球蛋白支架。可采用已知或未来的非免疫球蛋白框架和支架，只要其包含特异性针对靶蛋白SEQ ID NO:181的结合区(优选其配体结合结构域如SEQ IDNO:182中所显示)。这些化合物在本文中称为“包含靶特异性结合区的多肽”。非免疫球蛋白框架的实例进一步阐述于以下部分中(骆驼科抗体和非抗体支架)。
框架或Fc改造
本公开组合物中所包含的经改造抗体包括其中已对VH和/或VL内的框架残基进行修饰以(例如)改善抗体特性的那些。通常，这些框架修饰经制备以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一或多个框架残基“回复突变”成相应的种系序列。更特定地，已经历体细胞突变的抗体可含有与衍生出所述抗体的种系序列不同的框架残基。这些残基可通过比较抗体框架序列与衍生出所述抗体的种系序列来鉴定。为使框架区序列返回至其种系构型，可通过(例如)定点诱变或PCR介导诱变将体细胞突变“回复突变”成种系序列。这些“回复突变”抗体也可包含在本发明组合物中。
另一类型的框架修饰涉及突变框架区或甚至一或多个CDR区内的一或多个残基，以移除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。此方法也称为“去免疫化”且进一步详细阐述于US2003/0153043中。
补充或替代在框架或CDR区内进行的修饰，本公开的抗体可经改造以包括Fc区内的修饰，通常改变抗体的一或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本公开组合物中所包含的抗体可经化学修饰(例如可将一或多个化学部分附接至所述抗体)或经修饰以改变其糖基化，以同样改变抗体的一或多种功能特性。这些实施方式中的每一个都进一步详细阐述于下文中。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数。
在一个实施方式中，CH1的铰链区经修饰以改变(例如增加或减少)铰链区中的半胱氨酸残基数。此方法进一步阐述于US5,677,425中。改变CH1铰链区中的半胱氨酸残基数以(例如)促进轻链和重链组装或增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方式中，抗体的Fc铰链区经突变以缩短抗体的生物半衰期。更特定地，将一或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中，以使得所述抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。此方法进一步详细阐述于US 6,165,745中。
在另一个实施方式中，抗体经修饰以延长其生物半衰期。多种方法是可行的。例如可如US6,277,375中所阐述引入以下突变中的一或多个：T252L、T254S、T256F。或者，为延长生物半衰期，可改变抗体的CH1或CL区以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两环的补救受体结合表位，如US5,869,046和US6,121,022中所阐述。
在其他实施方式中，通过使用不同氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应子功能。例如可使用不同的氨基酸残基来替代一或多个氨基酸，以使得抗体具有对效应子配体经改变的亲和力但保留亲代抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变的效应子配体可是(例如)Fc受体或补体的C1组分。此方法进一步详细阐述于Winter等的US5,624,821和US5,648,260中。具体地，可突变残基234和235。具体地，这些突变可变成丙氨酸。因此，在一个实施方式中，本公开组合物中所包含的抗体在氨基酸234和235中的一或两个具有Fc区的突变。在另一个实施方式中，可用丙氨酸替代氨基酸234和235中的一或两个。用丙氨酸替代氨基酸234和235二者可降低ADCC活性。
在另一个实施方式中，选自所阐述抗体的氨基酸残基的一或多个氨基酸可被不同氨基酸残基替代，以使得抗体具有经改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法进一步详细阐述于US6,194,551中。
在另一个实施方式中，改变所阐述抗体的一或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。此方法进一步阐述于WO94/29351中。
在另一个实施方式中，通过修饰一或多个氨基酸对所阐述抗体的Fc区进行修饰，以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力。此方法进一步阐述于WO00/42072中。此外，已定位了人类IgG1上FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并阐述了结合有所改善的变体(参见Shields,R.L.等，2001J.Biol.Chen.276:6591-6604)。
在另一个实施方式中，对本公开组合物中所包含的抗体的糖基化进行修饰。例如，可制备未糖基化的抗体(即抗体缺少糖基化)。可改变糖基化以(例如)增加抗体对抗原的亲和力。这些碳水化合物修饰可通过(例如)改变抗体序列内的一或多个糖基化位点来完成。例如，一或多个氨基酸替代可引起消除一或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点处的糖基化。该无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。此方法进一步详细阐述于Co等的美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中。
补充或替代地，可使用具有经改变类型的糖基化的抗体，例如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二分型GlcNac结构的抗体。已显示这些经改变糖基化模式增加了抗体的ADCC能力。这些碳水化合物修饰可通过(例如)在具有经改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。本领域内已经阐述了具有经改变糖基化机制的细胞，且其可用作其中表达所公开重组抗体的宿主细胞，从而产生具有经改变糖基化的抗体。例如，Hang等的EP 1,176,195描述了编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因功能被破坏的细胞系，使得在这一细胞系中表达的抗体呈现低岩藻糖基化。因此，在一个实施方式中，本公开组合物中所包含的抗体是通过在展现低岩藻糖基化模式的细胞系(例如编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因表达缺陷的哺乳动物细胞系)中重组表达来产生。WO03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体低岩藻糖基化(也参见Shields,R.L.等，2002J.Biol.Chem.277:26733-26740)。WO99/54342阐述经改造以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如β(1,4)-N乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，以使得在经改造细胞系中表达的抗体展现出增加的二分型GlcNac结构，导致增加抗体的ADCC活性(也参见Umana等，1999Nat.Biotech.17:176-180)。或者，本公开组合物中所包含的抗体可在经改造用于哺乳动物样糖基化模式的酵母菌或丝状真菌中产生，且能够产生缺少岩藻糖作为糖基化模式的抗体(例如参见EP1297172B1)。
本公开考虑的本文抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。抗体可经聚乙二醇化以(例如)延长抗体的生物(例如血清)半衰期。为对抗体实施聚乙二醇化，通常在一或多个PEG基团会附接至抗体或抗体片段的条件下将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的活性酯或醛衍生物)反应。聚乙二醇化可通过与活性PEG分子(或类似活性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来实施。如本文所使用，术语“聚乙二醇”涵盖已用于衍生化其他蛋白质的任意形式PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方式中，所用聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。用于聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域内已知且可应用于所公开抗体(例如参见EP0154316和EP0401384)。
本公开所涵盖的抗体的另一种修饰是本公开组合物中所包含抗体的至少抗原结合区与血清蛋白(例如人类血清白蛋白或其片段)的偶联或蛋白融合，以延长所得分子的半衰期(例如参见EP0322094)。
另一可能性是融合本公开组合物中所包含抗体的至少抗原结合区与能够结合血清蛋白(例如人类血清白蛋白)的蛋白质，以延长所得分子的半衰期(例如参见EP0486525)。
改造经改变抗体的方法
如上文所论述，通过修饰CDR序列全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列或附接的恒定区，具有本文所示的CDR序列、VH和VL序列或全长重链和轻链序列的抗ActRIIB抗体可被用来产生新型抗ActRIIB抗体。因此，在本公开的另一方面，使用本公开组合物中所包含的抗ActRIIB抗体的结构要素来产生结构相关的抗ActRIIB抗体，其保留本公开组合物中所包含抗体的至少一种功能特性，例如结合人类ActRIIB，也抑制ActRIIB的一或多种功能特性(例如抑制Smad活化)。
例如，本公开组合物中所包含抗体的一或多个CDR区或其突变可以与已知框架区和/或其他CDR重组组合，以产生如上文所论述的本公开组合物中所包含的额外的经重组改造抗ActRIIB抗体。其他类型的修饰包括先前部分中所阐述的那些。用于改造方法的起始材料是本文所提供VH和/或VL序列中的一或多个，或其一或多个CDR区。为产生经改造抗体，实际上无需制备(即表达为蛋白质)具有本文所提供VH和/或VL序列中的一或多者或其一或多个CDR区的抗体。相反地，使用序列中所含有的信息作为起始材料以产生源自初始序列的“第二代”序列，然后制备“第二代”序列并表达为蛋白质。
经改变抗体序列也可通过筛选抗体文库来制备，这些抗体文库具有选自SEQ IDNO:29-42和SEQ ID NO:71-84的固定CDR3序列或如US2005/0255552中所阐述的最小必需结合决定簇和多样的CDR1和CDR2序列。筛选可根据适用于自抗体文库筛选抗体的任何筛选技术(例如噬菌体展示技术)来实施。
可使用标准分子生物学技术来制备并表达经改变抗体序列。由经改变抗体序列编码的抗体保留本文所阐述抗ActRIIB抗体的一个、一些或所有功能特性，包括但不限于与人类ActRIIB特异性结合和抑制Smad活化。
经改变抗体可展现上文所论述功能特性中的一或多个、两个或更多个或三个或更多个。
经改变抗体的功能特性可使用本领域内可获得和/或本文所阐述的标准分析(例如实例中所阐释的那些(例如ELISA))来评价。
可沿抗ActRIIB抗体编码序列的全部或部分随机或选择性引入突变，且可针对结合活性和/或如本文所阐述的其他功能特性来筛选所得的经修饰抗ActRIIB抗体。本领域已阐述了突变方法。例如WO02/092780阐述使用饱和诱变、合成性连接组装或其组合来产生并筛选抗体突变的方法。或者，WO03/074679阐述使用计算筛选方法优化抗体的物理化学特性的方法。
编码本公开组合物中所包含抗体的核酸分子
优化用于哺乳动物细胞中表达的全长轻链核苷酸序列的实例示于SEQ ID NO:161-165和171-175中。优化用于哺乳动物细胞中表达的全长重链核苷酸序列的实例示于SEQ ID NO:166-170和176-180中。
这些核酸可存在于全细胞、细胞裂解物中，或可以是呈部分纯化或实质上纯净形式的核酸。当通过标准技术自其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)纯化出时，核酸是“经分离”或“实质上纯净”的，这些标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域内熟知的其他方法。参见F.Ausubel等编辑，1987CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,NewYork。核酸可使用标准分子生物学技术来获得。对于由杂交瘤(例如如下文进一步阐述的自携载人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码杂交瘤所制抗体的轻链和重链的cDNA可通过标准PCR扩增或cDNA选殖技术来获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)获自免疫球蛋白基因文库的抗体，可从多个是文库成员的噬菌体克隆回收编码抗体的核酸。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，以(例如)将可变区基因转化成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至另一DNA分子或编码另一蛋白质的片段(例如抗体恒定区或挠性接头)。如在此背景下所使用，术语“可操作地连接”指以功能方式连接两个DNA片段，例如使由该两个DNA片段编码的氨基酸序列保留在框内，或使蛋白质在所需启动子的控制下表达。
通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子，可将编码VH区的经分离DNA转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列为本领域内已知(例如参见Kabat,E.A.等[参见上文])且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。重链恒定区可是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。重链恒定区可选自IgG1同种型。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可操作地连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，可将编码VL区的经分离DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列为本领域内已知(例如参见Kabat,E.A.等[参见上文])且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为产生scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可操作地连接至编码挠性接头、例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段，以使得VH和VL序列可表达为连续单链蛋白，且VL和VH区通过挠性接头连接(例如参见Bird等，1988Science 242:423-426；Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等，1990Nature 348:552-554)。
单克隆抗体的生成
单克隆抗体(mAb)可通过多种技术(包括传统单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein的标准体细胞细胞杂交技术)来产生(1975Nature 256:495)。可采用多种技术来产生单克隆抗体，例如B淋巴细胞的病毒或癌性转化。
用于制备杂交瘤的一种动物系统是鼠类系统。小鼠中的杂交瘤产生是已确立的程序。分离融合用免疫脾细胞的免疫方案和技术为本领域内已知。融合配偶体(例如鼠类骨髓瘤细胞)和融合程序也已知。
本发明组合物中所包含的嵌合或人源化抗体可基于前述制备的鼠类单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可获自感兴趣鼠类杂交瘤并使用标准分子生物学技术加以改造以含有非鼠类(例如人类)免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，可使用本领域内已知的方法将鼠类可变区连接至人类恒定区(例如，参见US4,816,567)。为产生人源化抗体，可使用本领域内已知的方法将鼠类CDR区插入人类框架中(例如参见美国专利第5225539号、第5530101号、第5585089号、第5693762号和第6180370号)。
在某一个实施方式中，本公开组合物中所包含的抗体是人类单克隆抗体。可使用携载部分人类免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生针对ActRIIB的这些人类单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，且在本文中统称为“人类Ig小鼠”。
HuMAb(Medarex公司)含有编码非重排人类重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列以及使内源性μ和κ链基因座失活的定向突变的人类免疫球蛋白基因微小基因座(例如参见Lonberg等，1994Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠展现降低的小鼠IgM或κ表达，且在对免疫接种的反应中，所引入人类重链和轻链转基因进行类别转换和体细胞突变，以产生高亲和力人类IgGκ单克隆抗体(Lonberg,N.等，1994[参见上文]；综述于Lonberg,N.,1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.和Huszar,D.,1995 Intern.Rev.Immunol.13:65-93，以及Harding,F.和Lonberg,N.,1995Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。HuMAb小鼠和这些小鼠所携载基因组修饰的制备和用途进一步阐述于Taylor,L.等，1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等，1993 International Immunology 5:647-656；Tuaillon等，1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3720-3724；Choi等，1993Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等，1993 EMBO J.12:821-830；Tuaillon等，1994 J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等，1994 International Immunology 579-591；和Fishwild,D.等，1996NatureBiotechnology 14:845-851，这些文献中所有的全文都以引用方式并入本文中。进一步参见美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,789,650号、第5,877,397号、第5,661,016号、第5,814,318号、第5,874,299号、第5,770,429号和第5,545,807号；以及WO92/103918、WO93/12227、WO94/25585、WO97/113852、WO98/24884；WO99/45962和WO01/14424。
在另一个实施方式中，本公开组合物中所包含的人类抗体可使用转基因和转染色体上携载人类免疫球蛋白序列的小鼠(例如携载人类重链转基因和人类轻链转染色体的小鼠)来产生。这些小鼠(在本文中称为“KM小鼠”)详细阐述于WO02/43478中。
此外，本领域内可获得表达人类免疫球蛋白基因的替代性转基因动物系统且可用其来产生本公开的抗ActRIIB抗体。例如，可使用称为Xenomouse(Abgenix公司)的替代性转基因系统。这些小鼠阐述于例如美国专利第5,939,598号、第6,075,181号、第6,114,598号、第6,150,584号和第6,162,963号中。
此外，本领域内可获得另一种表达人类免疫球蛋白基因的转染色体动物系统且可用其来产生本公开的抗ActRIIB抗体。例如，可使用携载人类重链转染色体和人类轻链转染色体的小鼠(称为“TC小鼠”)；这些小鼠阐述于Tomizuka等，2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中。此外，本领域内已阐述携载人类重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等，2002Nature Biotechnology 20:889-894)，且可用其来产生抗ActRIIB抗体。
本公开组合物中所包含的人类重组抗体也可使用用于筛选人类免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。用于分离人类抗体的这些噬菌体展示方法在本领域内已确立或阐述于以下实施例中。参见(例如)美国专利第5,223,409号、第5,403,484号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,580,717号、第5,969,108号、第6,172,197号、第5,885,793号、第6,521,404号、第6,544,731号、第6,555,313号、第6,582,915号和第6,593,081号。
本公开组合物中所包含的人类单克隆抗体也可使用SCID小鼠来制备，人类免疫细胞已经重构入此类小鼠以使得免疫后可产生人类抗体反应。这些小鼠阐述于(例如)美国专利第5,476,996号和第5,698,767号中。
产生人类单克隆抗体的杂交瘤的生成
为生成产生本公开组合物中所包含的人类单克隆抗体的杂交瘤，可自经免疫小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞并融合至合适的永生细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。所得杂交瘤可就抗原特异性抗体的生产作筛选。例如，可使用50％PEG将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液融合至六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC,CRL 1580)。将细胞以约2×145平铺于平底微量滴定板中，然后在含有20％胎牛克隆血清、18％"653"条件化培养基、5％奥瑞金(origen)(IGEN)、4mM L-谷酰氨酸、1mM丙酮酸钠、5mMHEPES、0:055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)的选择培养基中培育两周。约两周后，可在HAT更换为HT的培养基中培养细胞。然后个体孔可通过ELISA筛选人类单抗IgM和IgG抗体。一旦出现杂交瘤过度生长，通常即可在10-14天后观察培养基。可将分泌杂交瘤的抗体再铺板，再筛选，且如果对人类IgG仍呈阳性，则可通过限制性稀释将单克隆抗体亚克隆至少两次。然后可在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
为纯化人类单克隆抗体，可使所选杂交瘤在两升转瓶中生长用于纯化单克隆抗体。可将上清液过滤并浓缩，然后使用琼脂糖凝胶蛋白质A(Pharmacia)进行亲和层析。可通过凝胶电泳和高效液相层析检查所洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液更换为PBS，且可使用1.43消光系数通过OD280来测定浓度。可将单克隆抗体等分并储存在-80℃下。
产生单克隆抗体的转染瘤的生成
本公开组合物中所包含的抗体也可使用(例如)如本领域内所熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合来在宿主细胞转染瘤中产生(例如Morrison,S.(1985)Science229:1202)。
例如，为表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如PCR扩增或使用表达感兴趣抗体的杂交瘤的cDNA选殖)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，且DNA可插入表达载体中，以使得这些基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。在此背景下，术语“可操作地连接”指使抗体基因接合至载体中，以使得该载体内的转录和翻译控制序列发挥其调控抗体基因转录和翻译的预期功能。表达载体和表达控制序列经选择与所用表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入单独载体中，或更典型地，将两种基因插入同一表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入表达载体中(例如，将抗体基因片段上的互补限制位点与载体接合，或如果不存在限制位点则使用钝端接合)。通过将其插入已编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体，可使用本文所阐述抗体的轻链和重链可变区来产生任何抗体同种型的全长抗体基因，以使VH区段可操作地连接至载体内的CH区段，且使VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。补充或替代地，重组表达载体可编码促进自宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆至载体中，以使得信号肽在框内连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除抗体链基因外，本公开的重组表达载体可携载控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调控序列。术语“调控序列”包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这些调控序列阐述于(例如)Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA1990)中。那些本领域技术人员应了解，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可取决于例如转化宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括在哺乳动物细胞中引导高水平蛋白质表达的病毒元件，例如源自以下各项的启动子和/或增强子：巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。或者，可使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或P-球蛋白启动子。此外，调控元件是由来自不同来源的序列构成，例如含有来自SV40早期启动子的序列和人类T细胞1型白血病病毒的长末端重复的SRa启动子系统(Takebe,Y.等，1988Mol.Cell.Biol.8:466-472)。
除抗体链基因和调控序列外，重组表达载体可携载额外序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因促进选择其中已引入载体的宿主细胞(例如参见美国专利第4,399,216号、第4,634,665号和第5,179,017号)。例如，通常选择标记基因赋予已引入载体的宿主细胞对药物(例如G418、潮霉素或氨甲喋呤)的耐受性。选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于经氨甲喋呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
为表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式涵盖众多常用的将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。理论上可在原核或真核宿主细胞中表达本公开的抗体。讨论了抗体在真核细胞尤其是哺乳动物宿主细胞中的表达，因为这些真核细胞且尤其是哺乳动物细胞比原核细胞更可能组装并分泌经正确折叠的具免疫学活性的抗体。已报导抗体基因的原核表达无法有效地产生高产量的活性抗体(Boss,M.A.和Wood,C.R.,1985Immunology Today 6:12-13)。
用于表达本公开组合物中所包含的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括阐述于Urlaub和Chasing,1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中的dhfr-CHO细胞，其与DH FR选择标记一起使用(例如如R.J.Kaufman和P.A.Sharp,1982Mol.Biol.159:601-621中所阐述))、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是CHO K1PD细胞。具体地，为与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一表达系统是WO87/04462、WO89/01036和EP 338,841中所显示的GS基因表达系统。用于表达本公开组合物中所包含的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括FUT8基因表达缺陷的哺乳动物细胞系，例如如US6,946,292B2中所阐述。当编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间来产生抗体，该段时间足以在宿主细胞中表达抗体或分泌抗体至生长宿主细胞的培养基中。可使用标准蛋白质纯化方法自培养基回收抗体。
免疫交联物
在另一方面，本发明的特征在于包含偶联至治疗部分(例如细胞毒素、药物(例如免疫阻抑剂)或放射性毒素)的抗ActRIIB抗体或其片段的组合物。这些偶联物在本文中称为“免疫交联物”。包括一或多种细胞毒素的免疫交联物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(例如杀死)的任何药剂。
使用本领域内可获得的接头技术将细胞毒素偶联至本公开的抗体。已用于将细胞毒素偶联至抗体的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽接头。可选择(例如)易受溶酶体隔室内的低pH影响而裂解或易受蛋白酶(例如在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D))影响而裂解的接头。
关于细胞毒素的类型、将治疗剂偶联至抗体的接头和方法的进一步论述，也参见Saito,G.等，2003 Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail,P.A.等，2003 CancerImmunol.Immunother.52:328-337；Payne,G.2003Cancer Cell 3:207-212；Allen,T.M.,2002 Nat.Rev.Cancer 2:750-763；Pastan,I.和Kreitman,R.J.,2002Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091；Senter,P.D.和Springer,C.J.,2001 Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。
也可将本发明组合物中所包含的抗体偶联至放射性同位素以产生细胞毒性放射性药剂，也称为放射性免疫交联物。可偶联至抗体用于诊断或治疗的放射性同位素的实例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。用于制备放射性免疫交联物的方法在本领域内已确立。放射性免疫交联物的实例市售可得，包括ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，且可使用类似方法用本公开的抗体来制备放射性免疫交联物。
可使用本公开组合物中所包含的抗体偶联物来调整给定生物反应，且药物部分不应理解为局限于经典化学治疗剂。例如，药物部分可是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这些蛋白质可包括(例如)酶促活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物反应修饰剂，例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
用于偶联该治疗部分与抗体的技术已众所周知(例如，参见Amon等,MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(编辑)，第243至56页(Alan R.Liss公司，1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson(编辑)，第623-53页(Marcel Dekker公司，1987)；Thorpe,“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”，MonoclonalAntibodies'84:Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编辑)，第475-506页(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin等(编辑)，第303-16页(Academic Press 1985)和Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”,Inmunol.Rev.,62:119-58(1982)。
双特异性分子
在另一方面，本发明的特征在于本公开组合物，其包含含有抗ActRIIB抗体或其片段的双特异性或多特异性分子。本公开组合物中所包含的抗体或其抗原结合区可衍生化或连接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白质(例如受体的另一抗体或配体)，以产生结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。本公开的抗体事实上可衍生化或连接至超过一个其他功能分子，以产生结合超过两个不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；这些多特异性分子也涵盖于如本文所使用的术语“双特异性分子”中。为产生本公开的双特异性分子，本公开的抗体可在功能上连接(例如通过化学偶合、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一或多个其他结合分子，例如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，以产生双特异性分子。
因此，本发明包括包含双特异性分子的组合物，这些双特异性分子包含至少一种对ActRIIB的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性。例如，第二靶表位可以是ActRIIB的与第一靶表位不同的另一表位。
此外，对于其中双特异性分子具有多特异性的组合物，该分子可进一步包括除第一和第二靶表位外的第三结合特异性。
在一个实施方式中，所公开组合物的双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段(包含例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv)作为结合特异性。所述抗体也可为轻链或重链二聚体或其任何最小片段，例如Fv或单链构建体，如Ladner等US4,946,778中所述，其公开以引用方式并入本文中。
可用于双特异性分子中的其他抗体是鼠类、嵌合和人源化单克隆抗体。
本发明组合物中所包含的双特异性分子可使用本领域内已知方法通过偶联多个成分结合特异性来制备。例如，可分别产生双特异性分子的各结合特异性，然后再彼此偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶合或交联剂进行共价偶联。交联剂的实例包括蛋白质A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯(磺基-SMCC)(例如，参见Karpovsky等，1984J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等，1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括阐述于以下文献中的：Paulus,1985Behring Ins.Mitt.第78期，118-132；Brennan等，1985Science 229:81-83)和Glennie等，1987J.Immunol.139:2367-2375)。偶联剂是SATA和磺基-SMCC，其都可自PierceChemical公司(Rockford,IL)购得。
当结合特异性是抗体时，其可通过两条重链的C末端铰链区的巯基键来偶联。在特定实施方式中，在偶联前铰链区经修饰而含有奇数个巯基残基，例如1个。
或者，两种结合特异性可在同一载体中编码且在同一宿主细胞中表达并组装。此方法在双特异性分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2或配体×Fab融合蛋白时尤其有用。本公开组合物中所包含的双特异性分子可是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法阐述于(例如)美国专利第5,260,203号、第5,455,030号、第4,881,175号、第5,132,405号、第5,091,513号、第5,476,786号、第5,013,653号、第5,258,498和第5,482,858号中。
双特异性分子与其特异性靶的结合可通过(例如)酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生长抑制)或蛋白印迹分析来确认。这些分析中的每一个对尤为感兴趣的蛋白质-抗体复合物的检测通常都通过采用对该感兴趣复合物具有特异性的经标记试剂(例如抗体)来进行。
多价抗体
在另一方面，本发明是关于包含多价抗体的组合物，这些抗体包含所公开ActRIIB结合抗体的至少两个相同或不同的抗原结合部分。在一个实施方式中，多价抗体提供至少两个、三个或四个抗体的抗原结合部分。抗原结合部分可通过蛋白融合或共价或非共价连接连接在一起。或者，已就双特异性分子阐述连接方法。在多个实施方式中，组合物可具有单价、二价或多价(例如能够结合一个、两个或若干个抗原)和/或单特异性、双特异性或多特异性(例如具有能够结合一种、两种或若干种不同抗原的结合区)。组合物可以是这些任意组合，例如单价和单特异性(具有一个结合一种抗原或表位的结合区)；或二价和双特异性(具有两个结合区，其各自结合不同表位或抗原)；或二价和单特异性(具有两个结合区，其各自结合相同表位或抗原)；或多价和单特异性(具有若干结合区，其都结合相同抗原或表位)；或多价和多特异性(具有若干结合区，其结合若干个不同的抗原或表位)。
医药组合物
在另一方面，本发明提供组合物，例如医药组合物，其含有上文所阐述抗体/单克隆抗体或其抗原结合部分其中之一或其组合，与药学上可接受载剂调配在一起。这些组合物可包括所阐述抗体或免疫交联物或双特异性分子其中一个或其组合(例如两个或更多个不同的)。例如，本公开的医药组合物可包含结合靶抗原上不同表位或具有互补活性的多个抗体的组合。
本公开的医药组合物也可在组合疗法中施用，即与其他药剂组合施用。例如，组合疗法可包括本发明抗ActRII抗体与至少一种其他肌肉质量/强度增加剂的组合，该增加剂是(例如)IGF-1、IGF-2或IGF-1或IGF-2的变体、抗肌肉抑制素抗体、肌肉抑制素前肽、结合ActRIIB但不使其活化的肌肉抑制素诱饵蛋白、β2激动剂、胃饥饿素(Ghrelin)激动剂、SARM、GH激动剂/模拟物或卵泡抑素。可用于组合疗法中的治疗剂的实例更详细阐述于下文关于本公开的抗体的用途部分中。
如本文所使用，“药学上可接受的载剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂和类似试剂。载剂应适于静脉内、肌内、皮下、非经肠、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)，优选适于静脉内注射或输注。根据施用路径，可在材料中对活性化合物(即抗体、免疫交联物或双特异性分子)进行包衣以保护化合物免受可使化合物失活的酸和其他天然条件影响。
本公开的医药组合物可包括一或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物所需生物活性而不造成任何不想要的毒理学效应的盐(例如参见Berge,S.M.等，1977J.Pharm.Sci.66:1-19)。这些盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及衍生自无毒有机酸(例如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等)的那些。碱加成盐包括那些衍生自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等)以及衍生自无毒有机胺(例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些。
本公开的医药组合物也可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本公开的医药组合物中合适的水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其合适混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。适当的流动性可得以维持，例如通过使用例如卵磷脂等包衣材料、在分散系的情况中通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂。
这些组合物也可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌程序(同前)和通过纳入各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)可确保阻止微生物的存在。这些组合物中也可包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可通过纳入吸收延迟剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射医药形式的延长吸收。
药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散液和用于当场制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。本领域内已知用于医药活性物质的这些介质和试剂的使用。任何常规介质或药剂除与活性化合物不相容的以外，本公开涵盖其在医药组合物中的用途。这些组合物中也可纳入增补的活性化合物。
通常，治疗组合物必须无菌且在制造和储存条件下稳定。组合物可调配成溶液、微乳液、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构。载剂可为溶剂或分散介质，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物。可(例如)通过使用包衣(例如卵磷脂)、在分散液情形中通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情形下，可向组合物中纳入等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可通过向组合物中纳入延迟吸收剂(例如单硬脂酸盐和明胶)实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物根据需要和上文所列举试剂其中一个或其组合一同纳入合适溶剂中然后进行无菌微滤来制备。通常，可通过将活性化合物纳入含有基本分散介质和来自上文所列举所需其他试剂的无菌载剂中来制备分散液。在使用无菌粉末制备无菌可注射溶液的情形下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其可自其预先经无菌过滤的溶液产生由活性剂加上任意所需额外试剂构成的粉末。
可与载剂材料组合产生单一剂型的活性剂的量将根据所治疗个体和特定施用模式而变化。可与载剂材料组合产生单一剂型的活性剂的量通常是产生治疗效应的组合物的量。通常在100％中，此量为活性剂在约0.01％至约99％范围内，约0.1％-约70％或约1％-约30％范围内，组合以药学上可接受载剂。
可对剂量方案进行调整以提供最优选的所需反应(例如治疗反应)。例如可施用单次推注，可随时间施用若干个分次剂量或可根据治疗状况紧急程度所示按比例减少或增加剂量。尤其有利的是将非经肠组合物调配成剂量单位形式以便于施用和剂量均匀性。如本文所使用的剂量单位形式是指适于作为单位剂量供待治疗个体使用的物理离散单元；各单元含有经计算与所需医药载剂一起产生所需治疗效应的预定量的活性化合物。本公开的剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，以及复合这一活性化合物以治疗个体敏感性的现有技术中的固有限制。
对于含抗体组合物的施用，抗体剂量介于约0.0001mg/kg-约100mg/kg、且更通常介于约0.01mg/kg-约30mg/kg宿主体重范围内。例如，剂量为约1mg/kg体重、约3mg/kg体重、约5mg/kg体重或约10mg/kg体重，介于约1-10mg/kg范围内，例如约1mg/kg体重、2mg/kg体重、3mg/kg体重、4mg/kg体重、5mg/kg体重、6mg/kg体重、7mg/kg体重、8mg/kg体重、9mg/kg体重、10mg/kg体重，优选每4周一次。优选在静脉内施用。用于本公开的抗ActRII抗体(例如比麦单抗)的剂量方案包括每四周一次静脉内施用约1mg/kg体重或约3mg/kg体重或约10mg/kg体重。
同样，可基于70kg成人个体平均重量以相应的固定剂量施用上述剂量范围。
例如，剂量是约70mg、约210mg、约350mg或约500mg或约700mg，介于约70-700mg/kg范围内，例如约70mg/kg体重、140mg/kg体重、210mg/kg体重、280mg/kg体重、350mg/kg体重、420mg/kg体重、490mg/kg体重、560mg/kg体重、630mg/kg体重、700mg/kg体重，优选每4周一次。
优选地，本公开组合物用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发。
在一些方法中，本公开组合物包含两个或更多个具有不同结合特异性的单克隆抗体并因而同时施用，在该情形下所施用每一抗体的剂量在所指示范围内。抗体通常是在多个时机施用。单个剂量之间的间隔可是(例如)每周、每月、每三个月、每六个月或每年。间隔也可如通过测量患者的针对靶抗原的抗体血液水平所指示而不规则。在一些方法中，对剂量进行调整以实现约1μg/ml-约1000μg/ml、且在一些方法中为约25μg/ml-约300μg/ml的血浆抗体浓度。例如，本公开的ActRII抗体可与抗肌肉抑制素抗体共施用。
剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而变化。通常，人类抗体显示出最长半衰期，其次为人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。施用剂量和频率可根据治疗是否为预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，以相对较不频繁的间隔经较长时间段施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要相对较短间隔的相对较高剂量直至减轻或终止疾病进展或直至患者显示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可向患者施用预防性方案。
“治疗有效剂量”的本公开组合物中所含抗ActRII抗体的施用可减轻疾病症状的严重程度、增加无疾病症状时段的频率和持续时间或预防感病性所致损害或失能，即增加肌肉质量和/或强度。
活性化合物可用保护化合物免于快速释放的载剂制备，例如控释剂型，包括植入物、经皮贴剂和微囊封递送系统。可使用生物可降解的生物相容聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些剂型的许多方法已申请专利或通常为本领域技术人员已知。例如，参见Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker公司，New York,1978。
治疗性组合物可与本领域已知的医学装置一起施用。
本发明的用途和方法
本发明的组合物和所公开抗体具有治疗效用，这是因为其对散发性包涵体肌炎的治疗或受散发性包涵体肌炎影响患者病况的改善或与散发性包涵体肌炎相关症状的减轻有影响。
如本文所使用，术语“对象”或“个体”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物。
因此，本公开也关于治疗方法，其中本公开组合物或所公开肌肉抑制素拮抗剂(例如肌肉抑制素结合分子或ActRII结合分子，优选ActRII结合分子，更优选针对ActRII的抗体，例如比麦单抗或BYM338)抑制(即拮抗)ActRII的功能，并从而引起髋部骨折手术恢复的改善。本公开提供加速/改善失用性萎缩患者身体恢复的方法，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发，包含向患者施用治疗有效量的肌肉抑制素拮抗剂(例如肌肉抑制素结合分子或ActRIIB结合分子，优选ActRIIB结合分子，更优选针对ActRIIB的拮抗剂抗体，例如比麦单抗或BYM338)或所公开组合物。
可用于所公开治疗方法中的肌肉抑制素拮抗剂(例如肌肉抑制素结合分子或ActRII结合分子，优选ActRIIB结合分子，更优选针对ActRIIB的拮抗剂抗体，例如比麦单抗或BYM338)的实例已公开或详细阐述于上文中。在某些实施方式中，本文所公开的本发明组合物包含ActRII抗体(例如比麦单抗或BYM338)。
本公开也关于肌肉抑制素拮抗剂(例如肌肉抑制素结合分子或ActRIIB结合分子，优选ActRIIB结合分子，更优选针对ActRII的拮抗剂抗体，例如BYM338)在制备药物中的用途，所述药物用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发。
在另一个实施方式中，患者可以未响应先前治疗。例如，患者可能未响应使用以下物质的治疗：IGF-1、IGF-2或IGF-1或IGF-2的变体、抗肌肉抑制素抗体、肌肉抑制素前肽、结合ActRIIB但不使其活化的肌肉抑制素诱饵蛋白、β2激动剂、胃饥饿素激动剂、SARM、GH激动剂/模拟物或卵泡抑素。测量患者对治疗响应的简单方式可以是对患者爬上已知高度的楼梯所花费时间进行计时并比较治疗前和治疗后的结果。
肌肉抑制素拮抗剂(例如肌肉抑制素结合分子或ActRII结合分子，优选ActRII结合分子，更优选针对ActRII的拮抗剂抗体，例如比麦单抗或BYM338)可作为唯一活性剂施用，或结合(例如作为佐药或组合)例如以下的其他药物施用：IGF-1、IGF-2或IGF-1或IGF-2的变体、抗肌肉抑制素抗体、肌肉抑制素前肽、结合ActRIIB但不使其活化的肌肉抑制素诱饵蛋白、β2激动剂、胃饥饿素激动剂、SARM、GH激动剂/模拟物或卵泡抑素。例如，本公开的拮抗剂可与如WO2007/146689中所公开的IGF-1模拟物组合使用。
根据上文，本发明在另一方面提供：
一种如上文所定义的方法或用途，其包含共施用(例如同时或依序)治疗有效量的肌肉抑制素拮抗剂(例如肌肉抑制素结合分子或ActRII结合分子，优选ActRII或结合分子，更优选针对ActRII的拮抗剂抗体，例如比麦单抗或BYM338)与至少一种第二药品，该第二药品是IGF-1、IGF-2或IGF-1或IGF-2的变体、抗肌肉抑制素抗体、肌肉抑制素前肽、结合ActRII但不使其活化的肌肉抑制素诱饵蛋白、β2激动剂、胃饥饿素激动剂、SARM、GH激动剂/模拟物或卵泡抑素。
套件
本发明也涵盖套件，其可包含肌肉抑制素拮抗剂，例如肌肉抑制素结合分子(例如肌肉抑制素抗体或其抗原结合片段，例如比麦单抗或BYM338)或肌肉抑制素受体(即ActRIIB受体)结合分子(例如抗ActRIIB抗体或其抗原结合片段)(例如呈液体或冻干形式)或包含所述肌肉抑制素拮抗剂(如上所述)的医药组合物。此外，这些套件可包含用于施用肌肉抑制素拮抗剂的构件(例如注射器和小瓶、预填充注射器、预填充笔)和使用说明书。这些套件可含有其他治疗剂(如上所述)，例如用于与所装肌肉抑制素拮抗剂(例如BYM338)联合递送。
片语“用于施用……的构件”用来指用于向患者全身性施用药物的任意可用器具，包括但不限于预填充注射器、小瓶和注射器、注射笔、自动注射器、静脉滴注器和静脉输液袋、泵等。使用这些物项，患者可自施用药物(即自己施用药物)或医师可施用药物。
套件的每一部件通常装在个别容器内，且所有不同容器都与使用说明书一起在单个包装内。
序列
表1：序列表
所公开方法、治疗、方案、用途和套件的一些实施方式采用肌肉抑制素拮抗剂，例如肌肉抑制素结合分子或ActRIIB结合分子。在其他实施方式中，ActRIIB结合分子是针对ActRIIB的拮抗剂抗体。
在所公开方法、治疗、方案、用途和套件的一些实施方式中，该抗ActRIIB抗体是选自下组：a)抗ActRIIB抗体，其结合的ActRIIB表位包含以下序列：SEQ ID NO:SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)；
(b)SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)；
(c)SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)；
(d)SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)；
(e)SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)；
(f)SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT-SEQ ID NO:191)；
(g)SEQ ID NO:181的氨基酸100-110(YFCCCEGNFCN-SEQ ID NO:192)；或
(h)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)；
和b)针对ActRIIB的拮抗剂抗体，其结合的ActRIIB表位包含以下序列：SEQ IDNO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)；
(b)SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)；
(c)SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)；
(d)SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)；
(e)SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)；
(f)SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT-SEQ ID NO:191)；
(g)SEQ ID NO:181的氨基酸100-110(YFCCCEGNFCN-SEQ ID NO:192)；或
(h)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)，
其中所述抗体具有约2pM的KD。
在所公开方法、治疗、方案、用途和套件的一些实施方式中，针对ActRIIB的拮抗剂抗体是人类抗体。
在所公开方法、治疗、方案、用途和套件的一些实施方式中，抗体是比麦单抗或BYM338。
本公开的一或多个实施方式详细阐释于以上随附说明中。任意类似于或等效于本文所述方法和材料的那些方法和材料都可用于本发明实践或测试中，而现在阐述优选方法和材料。根据说明书和权利要求书可显见本发明的其他特征、目标和优点。在说明书和随附权利要求书中，除非上下文另外明确指明，否则单数形式包括复数个所指物。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本领域技术人员通常所理解相同的含义。本说明书中所引用的所有专利和出版物都以引用方式并入。呈现下列实施例以更全面地说明本发明的优选实施方式。这些实施例决不应理解为限制所公开专利内容的范围，该范围由随附权利要求书限定。
实施例
一般方法
ActRIIB抗体，其表征和其相关方法，如(i)功能分析，(ii)报告基因分析(RGA)，(iii)HEK293T/17细胞系的培养，(iv)肌肉抑制素诱导的萤光素酶报告基因分析，(v)特异性ELISA，(vi)ActRIIB/Fc-肌肉抑制素结合相互作用ELISA，(vii)对表达hActRIIB和hActRIIA的细胞的FACS滴定，(viii)结合原代人类骨骼肌细胞，(ix)使用表面等离子共振(Biacore)的所选抗人类ActRIIB Fab的亲和力测定，(x)CK分析，(xi)动物模型，(xii)治疗方案，(xiii)统计分析，(xiiii)淘选，(xv)抗体鉴定和表征，(xvi)源自第一次亲和力成熟的抗体的优化，(xvii)亲和力成熟Fab(第1次成熟)的IgG2转化，(xviiii)第二次亲和力成熟，(xx)IgG2转化和IgG2的表征(第2次成熟)，(xxi)体内鼠类研究中抗ActRIIB抗体的表征，(xxii)通过SET的亲和力确认，(xxiii)交叉阻断研究和(xxiv)表位定位详情和技术都已公开于WO 2010/125003中。
研究设计
这是IIa/IIb期、56周、4治疗组、平行组、随机化、双盲、安慰剂对照的多中心临床研究(图8)。用术后至多5周的筛选期评价适格性。在基线拜访时，将245名适格患者以2:1:2:2随机化至安慰剂、70mg比麦单抗、210mg比麦单抗或700mg比麦单抗。随机化患者将被治疗12个月且每4周接受研究治疗持续总共13个剂量。在所有患者都完成24周治疗后，将进行终点分析以评价主要和次要终点以及关键安全性量度。在完成治疗期后，患者将进入4周的治疗后随访。研究结束(EOS)拜访将在接受研究治疗的最后剂量之后8周。
存在3个研究期：
筛选期：在实施任何研究特定程序前必须获得知情同意。一旦患者开始步行(定义为完成4米步行速度测试的个体)且能够进入复健程序(根据个体患者的功能恢复而定，预计在手术后约7天开始)，立刻开始筛选期。筛选期可持续其后最多4周(手术后最多35天)；然而，应尽可能快地完成以确保患者在其功能恢复开始时进入试验。
必须在患者随机化前确认骨折修复手术成功介入，其由研究者评估为：1)通过X-射线所确认的按照制造商说明书的手术固定或关节成形术，和2)完成手术伤口愈合。
在确认满足所有纳入准则和无一排除准则后，将患者随机化。
随机化必须在筛选起始后尽快发生，以使研究药剂的治疗可在患者的个体“功能基线”后不久开始。
随机化日期是“第1天”研究拜访(基线/随机化)且用作整个研究时段访问日程的参照。
治疗期：
在随机化当天(第1天)施用研究治疗的第一个剂量。在每次拜访时，所有评估将在研究治疗施用前实施，给药后PK取样除外。患者将接受13个剂量，每4周一个剂量。最终剂量将在第48周拜访时施用且治疗期将在4周后即在第52周拜访时结束(治疗结束)。
在用于髋部骨折的局部标准护理以外施用研究治疗并联合需要遵守方案规定最小需求的局部复健程序(包括阻力训练)。
治疗后追踪期：在完成治疗结束拜访后，患者将进入治疗后随访时且在4周后即在第56周(或在接受研究治疗的最终剂量后8周)完成研究。
研究设计的原理
没有公开的医疗管理机构指南提供关于此研究群体或手术后失用性萎缩的治疗的考虑因素。所用的假说是：与仅接受标准护理的患者相比，药物诱导的肌肉质量增加与标准复健结合将引起肌肉强度和耐力的恢复增强以及随后的功能性能改善。由于身体性能改善，可预计跌倒和相关损伤/骨折的发生率将减小。
剂量/方案、施用路径和治疗持续时间的原理
施用剂量、频率、路径和治疗持续时间的选择是基于三个I期研究的结果：首次人体(FIH)研究(CBYM338X2101 A部分)、健康男性志愿者中的上石膏研究(CBYM338X2101 B部分)和健康志愿者中的多剂量研究(CBYM338X2102)。剂量和频率
在所述I期试验中，3mg/kg和10mg/kg剂量可有效增加健康志愿者中的TMV，因此预计这些剂量在髋部骨折后的患者中有效。健康志愿者(CBYM338X2101和CBYM338X2102)中的结果指示，对于10mg/kg和30mg/kg的单一剂量，通过MRI所评价的大腿肌肉体积的增加相当，但30mg/kg的效果持续时间更长。即使认为3mg/kg在给药间隔内所引起完全受体占有的持续时间是10mg/kg的约一半，比麦单抗的3个重复每月剂量在3mg/kg和10mg/kg下使得健康成人的TMV增加相当。在健康志愿者(CBYM338X2101)中，在输注单一剂量的1mg/kg比麦单抗后观察到对TMV的效应有限且短暂。因此，预计在此研究中，1mg/kg剂量是无效或最小有效剂量。
此研究将评估每4周施用的70mg、210mg或700mg比麦单抗的固定i.v.剂量。相当于前述研究中所用的mg/kg剂量的该固定剂量是基于平均患者重量计算的，且当前研究用类似计算基于文献中报导的髋部骨折患者(66±12kg)的四舍五入成70kg的平均患者重量(Mak等，2014)算出。因此，此研究将评估70mg(最初1mg/kg)、210mg(最初3mg/kg)或700mg(最初10mg/kg)的比麦单抗的固定i.v.剂量。
最初选择基于重量给药以确保在各治疗组中覆盖所有患者体重的一致暴露。然而无论是固定给药或基于重量的给药，并不预计随机化患者将以超过那些在前述研究中经历最高测试剂量(即30mg/kg)的Cmax值暴露于比麦单抗。
每4周的给药频率是基于自PK/PD研究，观察到10mg/kg每4周给药和30mg每8周i.v.给药的功效达到相同平台。
施用路径
研究药剂通过静脉内输注30分钟来施用，其在研究BYM338X2107中经过测试并记载为耐受良好。
治疗持续时间
在用合成代谢剂(甲磺酸伊布莫仑)治疗髋部骨折患者的新近研究显示，按简短身体功能量表其步行速度评分部分所测量，6个月(而非3个月)治疗可有效改善身体功能(Adunsky等，2011)。由于预计LBM增加在2至3个月治疗后达到最大值且预计观察到的功能益处具有延迟，假定疗法的6个月持续时间足以增加髋部骨折患者的功能恢复看来是合理的。
然而，由于髋部骨折恢复需要约1年，因此至多12个月的较长治疗可能有增加益处(次要目标)，特别是如果可减少在12月时段内跌倒次数。继发性髋部骨折的主要风险因素是跌倒，且所有骨折的90％以上发生在跌倒后。使用65岁和更大年纪的髋部骨折患者的医疗保险(Medicare)和医疗援助(Medicaid)数据，Bischoff-Ferrari等(2010)报导了10.3％在3年内遭受第二次髋部骨折-51％的二次髋部骨折发生在首次骨折的6个月内且75％发生在一年内。
第一剂量的时间安排
比麦单抗的功效预计在伴有身体活动时最优，因此协调第一剂量的时间安排在临近物理疗法的开始(即手术后7天-4周且最多6周)。由Chudyk等，2009和English andPaddon-Jones D 2010综述的多个研究表明，髋部骨折手术固定后的早期离床活动可改善患者结果，例如早期身体功能、出院回家的速度、并发症和再入院。最近的综述也主张物理治疗的及早(且优选更加强的)开始对于克服髋部骨折手术后肌肉强度的早期损失是至关重要的(Bandholm and Kehlet 2012)，这是恢复过程的重要预测因子。
选择比较剂的原理
需要选择安慰剂作为对照试剂以获得关于积极治疗的特异性效果相对非特异性效果的信息，且其提供评估比麦单抗功效和评价安全性及耐受性的最好方法。
在失用性萎缩中不存在任何批准的药理学比较剂(即“黄金标准”或“护理标准”)下，在维生素D(最少800IU/天)和身体复健外，也使用安慰剂。
预期益处
预计如在健康志愿者和sIBM患者中所见，髋部骨折患者肌肉质量将增加，其可转变成更好的功能且较快恢复至移动。在研究持续时间内，跌倒次数可能减少，从而引起继发性髋部骨折的减少。
群体
纳入准则
适于纳入此研究中的患者必须满足所有以下标准：
1.随机化时≥65岁的男性和绝经后女性；
2.患者必须已进行髋部骨折的手术治疗(内侧、外侧和股骨转子近端股骨骨折，AO分类31A-C(AO Foundation 2013)；
3.患者在随机化时必须心智健全，Folstein简易精神状态检查(MMSE)评分至少≥21；
4.患者必须能够完成4m步行速度测试。在手术后初始7天期间重新获得移动性(即负重步行能力)的患者不合格。
5.患者必须能够理解并遵循研究的需求和程序，承诺参与复健训练且愿意参与约56周；
6.患者在筛选时必须至少35kg且必须具有介于15-35kg/m2范围内的身体质量指数(BMI)；
排除标准
满足以下任意标准的患者不适于纳入此研究中。研究者不可施加其他排除，以确保研究群体能代表所有适格患者：
矫正外科病史、与肌肉损失相关的医学病况、干扰身体评价(SPPB和步行速度)的医学病况、临床上显著的心血管共病、肝相关病况或提出问题的其他医学病况。
治疗
1.研究治疗
诺华将供应以下研究药物：
·比麦单抗：BYM338 150mg/1ml液体，在小瓶(具有橡胶塞和铝钳口瓶盖的无色玻璃小瓶)中。
·安慰剂：BYM338安慰剂/1ml液体，在小瓶(具有橡胶塞和铝钳口瓶盖的无色玻璃小瓶)中。
2.其他研究治疗
髋部骨折后护理疗法的局部标准
用于围手术期或手术后管理患者的护理疗法的局部标准(例如用于血栓形成预防、疼痛管理、钙补充、继发性骨质疏松症预防)是可接受的且可根据国际或当地指南使用。
方案要求的额外研究治疗
此方案需要遵守：
·复健(最低需求在下文定义)
·维生素D补充(每日最少800国际单位(IU))
最低复健要求
假定髋部骨折后的复健是使比麦单抗在该适应症中效果最大化的先决条件。尤其是复健过程中的阻力和强度训练可与诱导肌肉肥大的合成代谢化合物协同工作。理想地，对所有患者实施标准复健程序，以避免评价不同的比麦单抗给药方案功效中的变化。
然而，在此研究中，出于两个原因未定义详细单一复健方案：
·化合物应在不同情况(包括不同复健程序)下起效，和
·包括多个场所与不同复健方法的统一似乎不可行。医学界中存在关于复健主要阶段的总体共识，包括阻力练习程序的有益影响。此方案将确保入选的每一患者都接受最少的所需复健要素，作为比麦单抗与练习训练协同作用的基础(表1)。通过使用由患者以及研究组完成的电子练习遵守日记监测对程序的遵守。
表1最少所需复健训练，3课时/周，持续10周
场所应愿意且能够遵守最少复健措施以参与此研究。如果在特定场所需要，患者可实施额外练习。
关键功效评价
通过DXA评价总LBM和aLBM
监测LBM(瘦体质量)变化的临床相关性在于以下事实：药物诱导的肌肉质量增加是后续功能改善的先决条件。关于睪酮补充的先前工作已通过记录突出此情况：为增强肌肉强度和身体功能阈值，必须改善LBM和四肢骨骼肌质量(Sattler等，2011)。与此先前观察一致，接受单一剂量比麦单抗(30mg/kg)的sIBM患者的初步数据显示，药物诱导的LBM增加(在8-12周时为平台期)之后，按第24周时的6分钟步行距离(6MWD)所定量(图6-1)，身体性能显著增加。此外，随着药物退出LBM下降并恢复至基线时，功能益处也消失。因此，LBM增加是预计功能益处的临床相关反映。
双能量X射线吸收测定法提供用于估计骨骼肌质量的推荐替代方法，与黄金标准方法(例如电脑化断层摄影(CT)和MRI)相比，其具有以下优点：不太昂贵、扫描时间短、对患者的辐射暴露大幅降低以及在临床和研究设定中更广泛可用。
研究文献记载DXA方法给出平均总身体骨骼肌估计值，其与通过CT或MRI所测量的肌肉紧密一致，尽管DXA往往系统地高估总身体骨骼肌约5％(Wang等，1996，Chen等，2007)。这是由于以下事实：当测量总LBM时，DXA也考虑躯干、皮肤和脂肪组织中非脂肪组分的器官瘦肉质量(Wang等，1976)。
关注于aLBM(腿加上肢)或腿LBM的瘦肉质量测量仅可稍微改善骨骼肌质量的估计(Chen等，2007)。然而，当在监测设定中使用时，消除躯干对更高准确度的优点可由于在使用解剖学标志以定义四肢中被不同扫描之间差异产生的变化压倒(Covey等，2010，Wang等，1996)。在旨在确立药物与诱导的骨骼肌质量变化之间剂量-反应关系的多中心2期临床试验背景中，后一变化尤其相关。
此外，在监测设定中较少顾虑用以估计总骨骼肌质量的总LBM的相对不准确度，这是因为药物对器官瘦肉质量、皮肤或脂肪质量的非脂肪组分不具有已知的效应。作为支持，BYM338X2102研究中的观察指示总LBM(DXA)的变化％与大腿肌肉体积(MRI)变化％之间的高度相关性(r＝0.94)。
尽管总LBM是定量药物的主要药效学效果并确立剂量-反应关系的优选选择，但对aLBM变化(其也是手术后复健(体育锻炼)的目标)的测量和监测的兴趣也在增加，以探究药物诱导的骨骼肌质量变化如何预测/反映治疗的预期功能益处。
简短身体功能量表(SPPB)
流行病学研究和门诊诊所已显示简短身体功能量表(SPPB)可高度预测社区老年人的后续失能、住院、机构收治和死亡(Guralnik等，2000；Studenski等，2003)。即使在调节共病和自陈功能状态的水平和严重性后，仍保持失能。
最近，已证明SPPB可行且能安全地被用于评估因严重医学病况被收入医院的急性疾病老年患者的功能状态，且SPPB评分可提供重要短期预后信息(Volpato等，2008)。SPPB评分低于10的患者相较评分为10或更高的那些患者更可能出现若干其他疾病。在多个回归分析中，作者发现较下肢功能差的显著独立预测因子是年龄、糖尿病、中风和骨质疏松症。
此外，在住院期间和在出院后头几周中通过SPPB对身体性能的序贯评估可提供关于老年急性疾病患者中未来健康风险的额外信息。总之，可将SPPB视为非特异性但反映若干潜在生理损害的整体健康状态的高度敏感性指示因子。
步行速度
步行速度将作为SPPB的一部分来测得以评价功能改善。常见步行速度代表应用于老年人的标准临床评估中的最合适身体性能量度之一。步行速度与身体活动水平、下肢肌肉的等长收缩力变化、脆弱性和跌倒相关(Newman等，2005，Chandler等，1998，Cesari等，2005)。
步行速度不仅是充分确立的身体功能量度，其也可在不同的社区老年群体中预测未来失能，且灵敏反映身体状态对身体活动(包括短期复健)的响应(Barthuly等，2012)。按步行速度缓慢或下降测量的较差功能性能与失能、住院和死亡风险相关(Studenski等，2011)，而步行速度改善与死亡风险降低有关(Hardy等，2007)。出于这些原因，步行速度经常被引用为老年群体健康的整体指示因子。
跌倒和骨折
髋部骨折患者在骨折后经历实质移动性降低，其中大部分患者从未恢复至骨折前的移动性程度。许多这些患者也在骨折后时段中经历移动性有关的事件，尤其是跌倒(Bischoff-Ferrari等，2010)。在这些脆性个体中，跌倒经常引起损伤，包括复发性骨折。骨折后时段中的比麦单抗治疗可能加速肌肉体积增加，且可改善强度和移动性，可能引起改善的身体功能和潜在地引起移动性相关不良事件减少。
关键安全性评价
此研究中的安全性评价包括：
·所有AE和SAE(包括输注位点和过敏反应)的评估
·身体检查
·生命体征、身高和重量
·实验室评估
·心电图(ECG)
·心维、壁厚度和收缩性的二维超声心动图监测
·手术并发症(如果有)和髋部骨折愈合的X射线评价
·免疫原性
·营养状态
·监测对侧(未影响)髋部BMD的DEXA
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Claims (39)

1.一种肌肉抑制素拮抗剂，供应用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发。
2.如权利要求1供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是在确认髋部修复手术成功和伤口愈合后施用。
3.如权利要求1或2供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是在手术后约7-42天或约1-6周开始施用。
4.如权利要求1-3中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是在患者能够在有或没有助步器的情况下进行负重步行且开始身体复健时开始施用于该患者。
5.如权利要求1-4中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是肌肉抑制素受体结合分子。
6.如权利要求1-5中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是ActRII受体拮抗剂。
7.如权利要求1-6中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是抗ActRII受体抗体。
8.如权利要求1-7中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中该抗ActRII受体抗体是比麦单抗。
9.如权利要求8供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是以约70mg-700mg的剂量施用于有需要的患者。
10.如权利要求8或9供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是以约70mg、或约210mg或约700mg的剂量施用。
11.如权利要求1-10中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是经静脉内施用。
12.如权利要求1-11中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是每四周施用。
13.如权利要求1-12中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是施用至少3个月。
14.如权利要求1-13中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是施用至少约6个月。
15.如权利要求1-14中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是施用长达12个月。
16.如权利要求1-15中任意一项供应用的肌肉抑制素拮抗剂，其中施用所述肌肉抑制素拮抗剂以加速/改善失用性萎缩患者的身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发，意味着增强肌肉生长、增加肌肉强度和身体性能、改善自我感知移动性、加速恢复至独立和降低跌倒和伤害性跌倒的风险。
17.一种加速/改善失用性萎缩患者身体恢复的方法，所述失用性萎缩由髋部骨折和用于骨折修复后续大手术造成移动性降低所引发，其特征在于包含施用肌肉抑制素拮抗剂。
18.如权利要求17的方法，其特征在于包含在确认髋部修复手术成功和伤口愈合后施用肌肉抑制素拮抗剂。
19.如权利要求18的方法，其包含在手术后约7-42天或约1-6周开始施用所述肌肉抑制素拮抗剂。
20.如权利要求18-19中任意一项的方法，其特征在于包含对能够在有或没有助步器情况的下进行负重步行且开始身体复健的患者开始施用所述肌肉抑制素拮抗剂。
21.如权利要求17-20中任意一项的方法，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是肌肉抑制素受体结合分子。
22.如权利要求17-21中任意一项的方法，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是ActRII受体拮抗剂。
23.如权利要求17-22中任意一项的方法，其中所述肌肉抑制素拮抗剂是抗ActRII受体抗体。
24.如权利要求17-23中任意一项的方法，其中该抗ActRII受体抗体是比麦单抗。
25.如权利要求24的方法，其包含以约70-700mg的剂量向有需要的患者施用所述肌肉抑制素拮抗剂。
26.如权利要求25的方法，其包含以约70mg或约210mg或约700mg的剂量向有需要的患者施用所述肌肉抑制素拮抗剂。
27.如权利要求21-26中任意一项的方法，其包含经静脉内施用所述肌肉抑制素拮抗剂。
28.如权利要求21-27中任意一项的方法，其包含每四周施用所述肌肉抑制素拮抗剂。
29.如权利要求21-28中任意一项的方法，其包含施用所述肌肉抑制素拮抗剂至少3个月。
30.如权利要求21-29中任意一项的方法，其包含施用所述肌肉抑制素拮抗剂约6个月。
31.如权利要求21-30的方法，其包含施用所述肌肉抑制素拮抗剂长达12个月。
32.如权利要求21-31中任意一项的方法，其中加速/改善失用性萎缩患者身体恢复(所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发)意味着增强肌肉生长、增加肌肉强度和身体性能、改善自我感知移动性、加速恢复至独立、和降低跌倒和伤害性跌倒的风险。
33.比麦单抗，供应用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发，其中比麦单抗是每四周经静脉内施用约70mg-700mg的剂量。
34.比麦单抗，供应用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发，其中比麦单抗是每四周经静脉内施用约70mg的剂量。
35.比麦单抗，供应用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发，其中比麦单抗是每四周经静脉内施用约210mg的剂量。
36.比麦单抗，供应用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发，其中比麦单抗是每四周经静脉内施用约700mg的剂量。
37.一种组合物，其特征在于包含150mg/ml的比麦单抗，供应用于加速/改善失用性萎缩患者身体恢复的方法中，所述失用性萎缩由髋部骨折和后续大手术造成移动性降低所引发。
38.一种单一剂型，其特征在于包含150mg/ml的比麦单抗。
39.一种输液袋，其特征在于包含来自一或多瓶经溶液稀释的适量比麦单抗。
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