CN101821291B - 抗硬骨素抗体的组合物和应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对硬骨素的抗体，并涉及所述抗体用于治疗骨异常相关疾病诸如骨质疏松症的组合物和方法。

Description

抗硬骨素抗体的组合物和应用方法
技术领域
本发明涉及抗硬骨素的抗体及应用所述抗体治疗由硬骨素(sclerostin)介导的病理异常或与骨异常相关的疾病(诸如骨质疏松症)的组合物及方法。
发明背景
SOST基因编码蛋白硬骨素，其为213个氨基酸的分泌糖蛋白。硬骨素是含胱氨酸纽结(cystine-knot)因子超家族的成员。硬骨素与DAN/Cerberus蛋白质家族相关，其通过抑制BMP与受体的结合直接干扰BMP信号，并且因此干扰BMP信号级联(Avsian-Kretchmer，MolEndocrinol 2004，18(1)：1-12)。
在成年人中主要在骨和肾脏中检测到硬骨素mRNA表达。主要在骨中可检测到硬骨素蛋白。在骨中，其表达限制在成熟且终末分化的成骨细胞，即骨细胞中。
硬骨素是人和小鼠中骨形成的强有力的负调控因子。缺乏SOST表达导致产生硬化性骨化病(Balemans等，Hum Mol Genet.，2001，10(5)：537-43；Brunkow等，Am J Hum Genet，2001，68(3)：577-89)。患者患有终身的骨过生长，其导致增加的骨矿质密度和强度。他们没有显示出其它的内分泌异常——他们在生命期间所体验的并发症都与骨的异常积累相关。这一隐性疾病的杂合携带者也表现出增加的骨质量(Gardner等，JClin Endocrinol Metab，2005，90(12)：6392-5)。这一表型可在SOST缺陷小鼠中再现，并且其过量表达导致骨质疏松症。此外，Van Buchem病[MIM239100](硬化性骨化病的一种表型拷贝)也是由SOST误调控所引起的，其中所述误调控是由于远距离骨增强子的基因组缺失所导致的(Balemans等，J Med Gene，2002，39(2)：91-7；Loots等，Genome Res，2005，15(7)：928-35)。最后，在骨形成期间SOST由甲状旁腺激素下调(临床上确认的骨形成原理)，这表明PTH的部分合成代谢作用可能通过SOST介导(Keller and Kneissel Bone，2005，37(2)：148-58)。
硬骨素在体外结合BMP(骨形态发生蛋白)并可作为BMP拮抗剂(Winkler等，EMBO J.，2003，22(23)：6267-76)。硬骨素还作为典型的Wnt信号的负调控因子起作用，其或者通过结合至LRP5/LRP6直接作用(Li等，J Biol Chem.，2005，20；280(20)；Semenov，J Biol Chem.2006年10月19日；van Bezooijen等，J Bone Miner Res，2006年10月10日)，或间接起作用(Winkler等，J Biol Chem.，2005，28；280(4)：2498-502)。
缺乏硬骨素表达导致高骨形成，而骨吸收未被干扰(硬化性骨化病，Van Buchem病)(Balemans等，2001；Brunkow等，Am J Hum Genet，2001，68(3)：577-89，Balemans等2006；Loots等，Genome Res，2005，15(7)：928-35)。
当前可用的骨疾病治疗很少能增加成年人骨密度，并且大多数当前可用的治疗主要通过抑制进一步的骨吸收而非刺激新骨形成起作用。
用于治疗骨丧失的药物的一个实例是雌激素。然而，不清楚雌激素是否具有任何长期效果。此外，雌激素可能有增加各种类型的肿瘤(诸如乳腺癌及子宫内膜癌)发病率的风险。治疗骨质疏松症的其它当前方法包括双膦酸盐类(例如，FosamaxTM、ActonelTM、BonvivaTM、ZometaTM、奥帕膦酸盐、奈立膦酸盐、替鲁膦酸钠片、骨膦)、甲状旁腺激素、Calcilytics、钙敏感受体调节剂(Calcimimetics)(例如，cinacalcet)、他汀类药物、合成代谢类固醇、镧和锶盐、以及氟化钠。然而，此类治疗通常与不期望的副作用相关。
发明概述
本发明的一个实施方案提供了针对硬骨素多肽(SEQ ID NO：155)中的靶的抗体或包含该抗体的抗原结合片段的功能蛋白，其特征在于该抗体或功能蛋白特异性地与硬骨素多肽结合并能在哺乳动物中增加骨形成、骨矿质密度、骨矿质含量、骨质量、骨品质和骨强度中的至少一种。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体具有逆转硬骨素抑制体外骨矿化作用的能力。在一个相关的实施方案中，它们具有逆转硬骨素抑制wnt-1介导的信号通路的能力。在另一相关的实施方案中，它们破坏硬骨素LRP6结合，并能阻断硬骨素在高剂量所具有的对BMP诱导的Smad1磷酸化的抑制作用。在另一实施方案中，本发明的抗体与包含SEQ ID NO：155的氨基酸112至126的硬骨素区域(即，所述区域由SEQ ID NO：155的氨基酸112至126组成)和/或包含SEQ ID NO：155的氨基酸160-174的区域(即，所述区域由SEQ ID NO：155的氨基酸160至174组成)结合，并且更具体地，与包含ARLLPNAIGRGKWWR(SEQ ID NO 156)和RLVASCKCKRLTRFH(SEQ ID NO 157)两者的区域结合。
硬骨素在HEK293细胞中抑制由wnt-1介导的STF(Supertopflash，读出经典wnt信号的报告物)的活化。在一些实施方案中，本发明的抗体以高度可重复方式恢复wnt信号报告物读数。
已显示将观察到的根据本发明的抗体对硬骨素在非成骨细胞中的Wnt信号报告物测试法中的作用的抑制效果转化为体内诱导由于硬骨素抑制所导致的骨形成反应。实际上，在老年啮齿动物中的体内实验显示根据本发明的抗体促进强的骨合成代谢。骨质量的升高达到了用极高合成代谢剂量的甲状旁腺激素(其用作阳性对照)每天间歇治疗的效果水平。
因此，根据另一优选的实施方案，根据本发明的抗体具有在低pM范围内的与硬骨素的亲和性，以及以约10nM的IC50抑制硬骨素对wnt信号的影响。
更优选地，在另一优选的实施方案中，根据本发明的抗体与包含SEQID NO：155的氨基酸112至126的硬骨素(即，所述区域由SEQ ID NO：155的氨基酸112至126组成)和氨基酸160至174的区域(即，所述区域由SEQID NO：155的氨基酸160至174组成)的硬骨素区域结合，以及更特别地与分别覆盖至少以下肽ARLLPNAIGRGKWWR(SEQ ID NO：156)和RLVASCKCKRLTRFH(SEQ ID NO：157)的区域结合，并且具有在低pM范围内的与硬骨素的亲和性，以及以约10nM的IC50抑制硬骨素对wnt信号的影响。此类抗体具有以用极高合成代谢剂量的甲状旁腺激素(阳性对照)每天皮下治疗的效果水平增加小鼠动物模型的中轴骨骼及四肢骨胳骨质量的能力，并且因此可用于治疗与骨异常相关的疾病，诸如骨质疏松症。
其它实施方案包括包含与治疗骨质疏松症的备选治疗联合的本发明抗体的组合物，其中所述备选治疗诸如是双膦酸盐、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素释放剂(calcilytics)、LRP4中和抗体和DKK-1中和抗体。
附图简述
图1：MOR05813_IgG2λ在wnt-1测试法中的效果
图2：MC3T3-1b细胞中BMP-2诱导的矿化作用中的MOR05813_IgG2λ
图3：MOR05813_IgG2λ在LRP6-SOST ELISA中的效果
图4：MOR05813_IgG2λ在磷酸化-Smad1测试法中的效果
图5：A-在Hek293细胞中LRP4敲低(siRNA)对wnt-1测试法中SOST抑制作用的影响(黑体数字：相对于不存在SOST时的STF活性，粗黑体数字：存在/不存在SOST时STF活性比)；B-在Hek293细胞中的wnt-1测试法中，LRP4过量表达对SOST IC50和Dkk1 IC50的影响的特异性；C-在C28a2细胞中的wnt-1测试法中，LRP4过量表达对SOST和Dkk1抑制作用的影响的特异性；C-在Hek293细胞中的wnt-1测试法中，LRP4敲低(siRNA)对SOST和Dkk1抑制作用的影响的特异性；E-通过LRP4调节MOR05813的活性。
图6：小鼠研究，体内pQCT-用MOR05813治疗2.5周增加近端胫骨干骺端中的总骨矿质含量。
图7：小鼠研究，体内pQCT-用MOR05813治疗2.5周增加近端胫骨干骺端中的总骨矿质密度。
图8：小鼠研究，体内pQCT-用MOR05813治疗2.5周增加近端胫骨干骺端中的皮质厚度。
图9：小鼠研究，体内uQCT-用MOR05813治疗2.5周增加近端胫骨干骺端中的骨松质体积。
图10：小鼠研究，体内uQCT-用MOR05813治疗2.5周增加近端胫骨干骺端中的小梁厚度。
图11：小鼠研究，体内pQCT-用MOR05813治疗5周进一步增加近端胫骨干骺端中的总骨矿质密度。
图12：小鼠研究，间接体内(ex vivo)DEXA-用MOR05813治疗5周进一步增加胫骨中的骨矿质密度。
图13：小鼠研究，间接体内DEXA-用MOR05813治疗5周进一步增加股骨中的骨矿质密度。
图14：小鼠研究，间接体内DEXA-用MOR05813治疗5周进一步增加脊柱中的骨矿质密度。
图15：小鼠研究，间接体内组织形态测定术-用MOR05813治疗2.5周增加四肢骨胳(股骨远端干骺端)中的骨形成率。
图16：小鼠研究，间接体内组织形态测定术-用MOR05813治疗2.5周增加四肢骨胳(股骨远端干骺端)中的矿质添附率。
图17：小鼠研究，间接体内组织形态测定术-用MOR05813治疗2.5周增加四肢骨胳(股骨远端干骺端)中的矿化表面。
图18：小鼠研究，间接体内组织形态测定术-用MOR05813治疗2.5周增加中轴骨(腰椎)中的骨形成。
图19：小鼠研究，间接体内组织形态测定术-用MOR05813治疗2.5周不影响四肢骨胳(股骨远端干骺端)中骨吸收，如通过破骨细胞表面测量的那样。
图20：RLISA，其显示MOR05813_IgG2λ对SOST与LRP6的结合的影响。在每一种情况下使用0.9nM SOST。
图21：小鼠研究，用MOR05813和唑来膦酸(zoledronic acid)共治疗后的体内pQCT，(A)总骨矿质密度，(B)总骨矿质含量，(C)皮质厚度，以及(D)骨松质矿质密度。
图22：小鼠研究，体内pQCT：在阿伦膦酸盐(alen)预治疗后用MOR05813治疗，(A)总骨矿质密度，(B)总骨矿质含量，(C)皮质厚度，以及(D)骨松质矿质密度。
图23：小鼠研究，用MOR05813和(i)抗DKK1或(ii)PTH共治疗后的体内pQCT，(A)总骨矿质密度，(B)总骨矿质含量，(C)皮质厚度，以及(D)骨松质矿质密度。
发明详述
本发明涉及分离的抗体，尤其人抗体，其特异结合硬骨素并且抑制硬骨素的功能性质。在一些实施方案中，本发明的抗体衍生自特定的重链和轻链序列和/或包含特定的结构特征，诸如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供了分离的抗体、制备此类抗体的方法，包含此类抗体的免疫缀合物和多价或多特异性分子，以及含有本发明的此类抗体、免疫缀合物或双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及使用此类抗体抑制与硬骨素表达的存在相关的病症或疾病的方法，例如，治疗由硬骨素介导或与增加的硬骨素水平相关的疾病；例如，诸如骨质疏松症的骨相关疾病。
为了可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。在详细描述中给出其它的定义。
术语“包含”包含了“包括”以及“由......组成”，例如，“包含”X的组合物可排它地由X组成，或可以包括其它的某些成分，例如X+Y。
与数值x有关的术语“约”的意思是例如x±10％。
词语“基本上”不排除“完全地”，例如，“基本上无”Y的组合物可以是完全没有Y。在需要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。
术语“免疫应答”指例如，淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致选择性损害、破坏或从人体清除侵入性病原体、受病原体感染的细胞或组织、癌性细胞，或者(在自身免疫或病理炎症的情况下)正常人细胞或组织。
术语硬骨素是指如SEQ ID NO：155所定义的人硬骨素。可从R&DSystems(Minneapolis，MN，USA；2006目录号1406-ST-025)中获得重组人硬骨素。此外，可从R&D Systems(Minneapolis，MN，USA；2006目录号1589-ST-025)商购获得重组小鼠硬骨素/SOST。美国专利6,395,511和6,803,453号，以及美国专利公开20040009535和20050106683一般地涉及抗硬骨素抗体。
本文涉及的术语“抗体”包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。天然存在的“抗体”是糖蛋白，其包含通过二硫键连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(本文中简写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中简写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。可以将VH区和VL区进一步细分为高变区，称作互补决定区(CDR)，其散布着更保守的称作构架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个DR，它们从氨基端到羧基端以下面的顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗原部分”)指抗体的全长或一个或多个片段，其保留特异结合抗原(例如，硬骨素)的能力。已经表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段、包含通过二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，1989Nature 341：544-546)；和分离的互补决定区(CDR)。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以用重组方法通过合成接头连接，所述接头使得它们作为一条蛋白质链而制得，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；见例如，Bird等人，1988Science 242：423-426；和Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。此类单链抗体意在也被术语抗体的“抗原结合部分”包括在内。使用本领域技术人员已知的常规技术得到这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。
如本文使用的“分离的抗体”指这样的抗体，其基本上没有具有不同抗原特异性的其它抗体(例如，特异结合硬骨素的分离的抗体基本上无特异结合不同于硬骨素的抗原的抗体)。然而，特异结合硬骨素的分离的抗体可以与其它抗原，诸如来自其它物种的硬骨素分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上无其它细胞材料和/或化学品。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一分子组分的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。
如本文使用的术语“人抗体”意在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区都来自人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，那么该恒定区也来自此类人序列，例如，人种系序列，或者人种系序列的突变形式，或含有来自如在Knappik等(2000.J Mol Biol 296，57-86)中所描述的人构架序列分析的保守构架序列的抗体。
本发明的人抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人抗体”不意在包括这样的抗体，其中来自另一哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列已经被嫁接到人构架序列上。
术语“人单克隆抗体”指显示出单结合特异性的抗体，其具有可变区，其中构架区和CDR区都来自人序列。在一个实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，所述杂交瘤包括与永生细胞融合的获自转基因非人动物例如转基因小鼠的B细胞，所述B细胞具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用的术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如从对于人免疫球蛋白基因为转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体，从被转化而表达人抗体的宿主细胞分离的抗体，例如，从转染瘤分离的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，以及通过涉及人免疫球蛋白基因的全长或部分、序列与其它DNA序列的拼接的其它任何方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中构架区和CDR区衍生自人种系免疫球蛋白序列。然而，在一些实施方案中，此类重组人抗体可以进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其尽管来自并且涉及人种系VH和VL序列，但可能不天然存在于体内的人抗体种系库中。
如本文所用的那样，“同种型”指由重链恒定区基因提供的抗体类别(例如，IgM、IgE、IgG诸如IgG1或IgG2)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”可互换使用。
如本文所用的，“特异结合硬骨素肽”的抗体意指以1x10-8M或更小、1x10-9M或更小、或1x10-10M或更小的KD结合硬骨素肽的抗体。“与硬骨素之外的抗原交叉反应”的抗体意指以0.5x10-8M或更小、5x10-9M或更小、或2x10-9M或更小的KD结合该抗原的抗体。“不与特定抗原交叉反应”的抗体意指以1.5×10-8M或更大的KD、或5×10-8M至10×10-8M之间的KD、或1×10-7M或更大的KD结合该抗原的抗体。在一些实施方案中，不与所述抗原交叉反应的此类抗体在标准结合测试法中显示出对于这些蛋白质的基本上检测不到的结合。
如本文所用的，“在基于细胞的wnt信号测试法中阻断硬骨素的抑制作用”的抗体是指这样的抗体，其在基于细胞的超高闪烁(super topflash(STF))测试法中在硬骨素的存在下以低于1mM、100nM、20nM、10nM或更低的IC50恢复wnt诱导的信号。此类STF测试法在以下实施例中将更详细地描述。
如本文所用的，“在基于细胞的矿化测试法中阻断硬骨素的抑制作用”的抗体意指这样的抗体，其在基于细胞的测试法中在硬骨素的存在下以低于1mM、500nM、100nM、10nM、1nM或更低的IC50恢复BMP2诱导的矿化。此类测试法在以下实施例中将更详细地描述。
如本文所用的，“在Smad1磷酸化测试法中阻断硬骨素的抑制作用”的抗体意指这样的抗体，其在基于细胞的测试法中在硬骨素的存在下以低于1mM、500nM、100nM、10nM、1nM或更低的IC50恢复BMP6诱导的Smad1磷酸化。此类测试法在以下实施例中将更详细地描述。
如本文所用的，“抑制硬骨素与LRP-6结合”的抗体意指这样的抗体，其以1mM、500nM、100nM、10nM、5nM、3nM、1nM或更低的IC50抑制硬骨素与LRP-6结合。此类测试法在以下实施例中将更详细地描述。
如本文所用的，“增加骨形成和质量及密度”的抗体意指能以这样的水平达到骨形成、质量和密度的抗体，所述水平为如实施例10所示的高合成代谢剂量PTH每日间歇治疗的水平。
如本文所用的术语“Kassoc”或“Ka”意指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文所用的术语“Kdis”或“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用的术语“KD”意指解离常数，其从Kd与Ka的比(即Kd/Ka)得到并且表达为摩尔浓度(M)。可以使用本领域成熟的方法测定抗体的KD值。用于测定抗体KD的一种方法是通过使用表面等离子体共振，或者使用生物传感器系统，如
Figure GPA00001091835000101
系统。
如本文所使用的术语“亲和性”是指抗体与抗原在单个抗原部位相互作用的强度。在每一抗原部位中，抗体“臂”的可变区通过弱非共价键与抗原在多个位点相互作用，相互作用越多，亲和性越强。
如本文所用的术语“抗体亲抗原性”指抗体-抗原复合物的总体稳定性或强度的信息性测量。其由三种主要因素控制：抗体表位亲和性；抗原和抗体两者的价；这些相互作用部分的结构排列。最终这些因素限定抗体的特异性，即特定抗体结合精确抗原表位的可能性。
为了获得具有较高抗体亲抗原性的探针，可以构建二聚体缀合物，从而使得低亲和性的相互作用(例如与种系抗体)更加容易通过FACS检测。此外，另一种提高抗原结合的抗体亲抗原性的方法涉及生成抗硬骨素抗体的任何本文所述构建体的二聚体、三聚体或多聚体。这种多聚体可以通过单个模块之间的共价结合生成，例如通过模仿天然C-至-N-端结合或通过模仿抗体二聚体，所述抗体二聚体通过其恒定区保持在一起。工程化设计入Fc/Fc界面的键可以是共价的或非共价键。此外，可以将Fc之外的二聚或多聚部分用于抗硬骨素抗体杂合物之中，以生成这种更高级的结构。例如，可应用多聚化结构域，诸如在Borean(WO2004039841)中描述的三聚化结构域或在公开专利申请WO98/18943中描述的五聚化结构域。
如本文所使用的术语“交叉反应性”是指抗体或抗体群与其它抗原上的表位结合。这可能由低抗体亲抗原性或低的抗体特异性引起，或由具有同一或非常类似的表位的多个不同抗原引起。当人们想要与相关抗原群通用结合时，或当在抗原表位序列在进化中非高度保守而试图跨物种标记时，交叉反应性有时是所期望的。
如本文所用对于IgG抗体的“高亲和性”术语指对于靶抗原具有10-8M或更小，10-9M或更小或10-10M或更小的KD的抗体。然而，“高亲和性”结合对其它抗体同种型而言可以是变化的。例如对于IgM同种型的“高亲和性”结合指具有10-7M或更小或10-8M或更小的KD的抗体。
如本文所用的术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类、爬行动物等。
如本文所使用的术语“优化的”指核苷酸序列已被改变以利用在生产细胞或生物中优选的密码子编码氨基酸序列，所述细胞一般为真核细胞，例如例如毕赤酵母(Pichia)或木霉属(Trichoderma)的细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞。对优化的核苷酸序列进行改造，完全或尽可能地保留由最初核苷酸序列，也称作“亲本”序列所最初编码的氨基酸序列。本文优化的序列已经被改造成具有哺乳动物细胞中优选的密码子，然而这里还预想了这些序列在其它真核细胞中优化表达。由优化的核苷酸序列所编码的氨基酸序列也称为优化的。
在下面的小节中进一步详述本发明的各个方面。
用于评估抗体对多种物种硬骨素的结合能力的标准测试法是本领域已知的，包括例如，ELISA、蛋白质印迹和RIA。合适的测定法在实施例中详述。也可以通过本领域已知的标准测试法，如通过Biacore分析来评估抗体的结合动力学(例如，结合亲和性)。用于评估抗体对硬骨素的功能性质(例如，受体结合，预防或改善骨质溶解)的影响的测试法在实施例中进一步详细描述。
因此，如通过本领域已知的和本文所述的方法测定的“抑制”这些硬骨素功能性质(例如，生物化学、免疫化学、细胞的、生理的或其它生物活性等等)中一种或多种的抗体将被理解为涉及相对于不存在所述抗体时(或者当存在不相关特异性的对照抗体时)具体活性的统计学显著降低。抑制硬骨素活性的抗体实现所测量参数的这种统计学显著减少至少10％，至少50％、80％或90％，以及在一些实施方案中，本发明的抗体可抑制硬骨素功能活性大于95％、98％或99％。
术语“交叉阻断”、“交叉阻断的”在本文中可互换使用，其是指抗体或其它结合剂在标准竞争性结合测试法中干扰其它抗体或结合剂与硬骨素结合的能力。
抗体或其它结合剂能够干扰另一抗体或结合剂与硬骨素结合的能力或程度，并且因此其是否能认为是根据本发明的交叉阻断，这可以应用标准竞争结合测试法来确定。一个合适的测试法包括应用Biacore技术(例如，通过应用BIAcore 3000仪器(Biacore，Uppsala，Sweden))，其可应用表面等离子共振技术测量相互作用的程度。另一用于测量交叉阻断的测试法应用基于ELISA的方法。
对于两个方法的更详细的描述在实施例中给出。
根据本发明，本发明的交叉阻断抗体或其它结合剂在所描述的BIAcore交叉阻断测试法中与硬骨素结合，使得所记录的该抗体或结合剂组合(混合物)的结合是所组合的两个抗体或结合剂最大理论结合的80％至0.1％(例如，80％至4％)，尤其是最大理论结合的75％至0.1％(例如，75％至4％)，以及更特别地是70％至0.1％(例如，70％至4％)，且更特别地是最大理论结合(如上定义)的65％至0.1％(例如，65％至4％)。
在如实施例所描述的ELISA测试法中，如果与不存在溶液相抗硬骨素抗体(即，阳性对照孔)时获得的硬骨素检测信号相比，溶液相抗硬骨素抗体能够引起硬骨素检测信号(由包被抗体结合的硬骨素的量)减少60％至100％，特别是70％至100％，以及更特别是80％至100％，则将该抗体定义为交叉阻断。
单克隆抗体
本发明的抗体包括如实施例所描述的那样分离的人单克隆抗体。本发明分离的抗体的VH氨基酸序列显示于SEQ ID NO：69-77。本发明分离的抗体的VL氨基酸序列分别在SEQ ID NO：80-88中显示。本发明抗体的相应优选的全长重链氨基酸序列分别在SEQ ID NO：113-121中显示。本发明抗体的相应优选的全长轻链氨基酸序列分别在SEQ ID NO：124-132中显示。本发明的其它抗体包括已经被突变，然而在CDR区中与上述序列中描述的CDR区具有至少60、70、80、90或95％或更大同一性的氨基酸。在一些实施方案中，本发明包括突变的氨基酸序列，其中与上述序列中描述的CDR区相比较，在CDR区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已被突变。
此外，可变重链亲本核苷酸序列显示于SEQ ID NO 89-90。可变重链亲本核苷酸序列显示于SEQ ID NO 100-101。为在哺乳动物细胞中表达而优化的全长轻链核苷酸序列显示于SEQ ID NO 146-154。为在哺乳动物细胞中表达而优化的全长重链核苷酸序列显示于SEQ ID NO 135-143。由优化的轻链核苷酸序列编码的全长轻链氨基酸序列显示于SEQ ID NO124-132。由优化的重链核苷酸序列编码的全长重链氨基酸序列显示于SEQID NO 113-121。本发明的其它抗体包括已经被突变，然而与上述序列具有至少60、70、80、90或95％或更大同一性的氨基酸或核苷酸。在一些实施方案中，本发明包括突变的氨基酸序列，其中与上述序列中描述的可变区相比较，在可变区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已被突变，而基本上保持了相同的治疗活性。
因为这些抗体的每一种都可以结合硬骨素，所以，可以将VH和VL、全长轻链和全长重链序列(核苷酸序列和氨基酸序列)“混合并匹配”以产生本发明的其它抗硬骨素结合分子。可以使用上述和实施例中所述的结合测定法(例如，ELISA)测试此类“混合并匹配的”抗体的硬骨素结合。当这些链被混合并匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列应该用结构上相似的VH序列置换。同样，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长重链序列应该用结构上相似的全长重链序列置换。同样，来自特定VH/VL配对的VL序列应该用结构上相似的VL序列置换。同样，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应该用结构上相似的全长轻链序列置换。因此，一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合区域，其具有：包含选自SEQ ID NO：69-77的氨基酸序列的重链可变区；以及包含选自SEQID NO：80-88的氨基酸序列的轻链可变区，其中该抗体与硬骨素特异性地结合。
另一方面，本发明提供了：
(i)分离的单克隆抗体，其具有：包含选自SEQ ID NO：113-121的为在哺乳动物细胞中表达而经优化的氨基酸序列的全长重链；以及包含选自SEQ ID NO：124-132的为在哺乳动物细胞中表达而经优化的氨基酸序列的全长轻链；或
(ii)包含其抗原结合部分的功能蛋白。
另一方面，本发明提供了：
(i)分离的单克隆抗体，其具有：包含选自SEQ ID NO：135-143的为在哺乳动物细胞中表达而经优化的核苷酸序列的全长重链；以及包含选自SEQ ID NO：146-154的为在哺乳动物细胞中表达而经优化的核苷酸序列的全长轻链；或
(ii)包含其抗原结合部分的功能蛋白。
另一方面，本发明提供了抗体，其包含抗体的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3，或其组合。抗体的VH CDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO：1-11中显示。抗体的VH CDR2的氨基酸序列通过SEQ ID NO：12-22显示。抗体的VH CDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO：23-33中显示。抗体的VL CDR1的氨基酸序列在SEQ ID NO：34-44中显示。抗体的VL CDR2的氨基酸序列在SEQ ID NO：45-55中显示。抗体的VL CDR3的氨基酸序列在SEQ ID NO：56-66中显示。使用Kabat系统描述CDR区(Kabat，E.A.，等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Departmentof Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)。
考虑到这些抗体的每一种可以结合硬骨素并且抗体结合特异性主要通过CDR1、2和3区提供，可以将VH CDR1、2和3序列与VL CDR1、2和3序列“混合并匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以被混合并匹配)，尽管每个抗体必须含有VH CDR1、2和3和VL CDR1、2和3，以产生本发明的其它抗硬骨素结合分子。可以使用上文和实施例中描述的结合测试法(例如，ELISA)测试此类“混合并匹配的”抗体的硬骨素结合。当混合和匹配VH CDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应该用结构上相似的CDR序列置换。同样，当混合和匹配VL CDR序列时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应该用结构上相似的CDR序列置换。本领域技术人员将容易显而易见的是，对于本发明的单克隆抗体，通过用结构上相似的来自本文所示CDR序列的序列替代一个或多个VH和/或VL CDR序列，可以产生新的VH和VL序列。
分离的单克隆抗体或者其抗原结合部分具有：包含选自SEQ ID NO：1-11的氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含选自SEQ ID NO：12-22的氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含选自SEQ ID NO：23-33的氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含选自SEQ ID NO：34-44的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含选自SEQ ID NO：45-55的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；包含选自SEQ ID NO：56-66的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；其中该抗体特异结合硬骨素。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：3的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：14的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：25的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：36的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：47的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：58的轻链可变区CDR3。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：4的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：15的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：26的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：37的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：48的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：59的轻链可变区CDR3。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：5的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：16的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：27的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：38的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：49的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：60的轻链可变区CDR3。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：6的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：17的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：28的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：39的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：50的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：61的轻链可变区CDR3。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：7的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：18的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：29的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：40的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：51的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：62的轻链可变区CDR3。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：8的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：19的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：30的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：41的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：52的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：63的轻链可变区CDR3。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：9的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：20的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：31的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：42的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：53的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：64的轻链可变区CDR3。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：10的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：21的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：32的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：43的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：54的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：65的轻链可变区CDR3。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：11的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：22的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：33的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：44的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：55的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：66的轻链可变区CDR3。
如本文所用，如果人抗体的可变区或全长链从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得，则该人抗体包含作为特定种系序列的“产物”或者“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区或全长重链或轻链。此类系统包括用感兴趣的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或者用感兴趣的抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或者“衍生自”所述序列的人抗体可以如下鉴定：通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择在序列上与人抗体的序列最接近(即，最大的％同一性)的人种系免疫球蛋白序列。作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或者“衍生自”所述序列的人抗体可以由于例如天然存在的体细胞突变或者有意引入定点突变而与种系序列相比含有氨基酸差异。然而，所选的人抗体通常与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上至少90％同一并且含有这样的氨基酸残基，当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)比较时，所述氨基酸残基将所述人抗体鉴定为人的。在一些情况中，人抗体可以在氨基酸序列上与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％、或至少95％、或甚至至少96％、97％、98％、或99％同一。通常，衍生自具体人种系序列的人抗体将显示出与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸差异。在一些情况中，人抗体可以显示出与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。在某个实施方案中，种系免疫球蛋白氨基酸序列选自以下这些序列：其包含分别由SEQ IDNO：67-68组成的可变重链序列以及分别由SEQ ID NO：78-79组成的可变轻链序列。
同源抗体
在再一个实施方案中，本发明的抗体具有与本文所述抗体的氨基酸和核苷酸序列同源的全长重和轻链氨基酸序列；全长重和轻链核苷酸序列，可变区重和轻链核苷酸序列，或可变区重和轻链氨基酸序列，并且其中所述抗体保留本发明的抗硬骨素抗体的所希望的功能性质。
例如，本发明提供了包含重链可变区和轻链可变区的分离的单克隆抗体(或包含其抗原结合部分的功能蛋白)，其中：该重链可变区包含与选自SEQ ID NO：67-77的氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列；该轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：78-88的氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列；该抗体特异结合硬骨素，并且抗体呈现至少一种下列功能性质：该抗体在基于细胞的wnt信号测试法中阻断硬骨素的抑制作用，该抗体在基于细胞的矿化测试法中阻断硬骨素的抑制作用或在Smad1磷酸化测试法中阻断硬骨素的抑制作用，或者该抗体抑制硬骨素与LRP-6的结合，或该抗体增加骨形成和质量及密度。
在另一实例中，本发明提供了包含全长重链和全长轻链的分离的单克隆抗体(或包含其抗原结合部分的功能蛋白)，其中：该全长重链包含与选自SEQ ID NO：111-121的氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列；该全长轻链包含与选自SEQ ID NO：122-132的氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列；该抗体特异结合硬骨素，并且该抗体呈现至少一种下列功能性质：该抗体在基于细胞的wnt信号测试法中阻断硬骨素的抑制作用，该抗体在基于细胞的矿化测试法中阻断硬骨素的抑制作用或在Smad1磷酸化测试法中阻断硬骨素的抑制作用，或者该抗体抑制硬骨素与LRP-6的结合，或该抗体增加骨形成和质量及密度。
在另一实例中，本发明提供了包含全长重链和全长轻链的分离的单克隆抗体(或包含其抗原结合部分的功能蛋白)，其中：该全长重链由与选自SEQ ID NO：133-143的核苷酸序列至少80％同一的核苷酸序列编码；该全长轻链由与选自SEQ ID NO：144-154的核苷酸序列至少80％同一的核苷酸序列编码；该抗体特异结合硬骨素，并且该抗体呈现至少一种下列功能性质：该抗体在基于细胞的wnt信号测试法中阻断硬骨素的抑制作用，该抗体在基于细胞的矿化测试法中阻断硬骨素的抑制作用或在Smad1磷酸化测试法中阻断硬骨素的抑制作用，或者该抗体抑制硬骨素与LRP-6的结合，或该抗体增加骨形成和质量及密度。
在多个实施方案中，抗体可以显示出上面讨论的功能性质的一种或多种、两种或多种，或三种。该抗体可以是例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其它实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与上述序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。在另一实施方案中，除了在不超过1、2、3、4或5个氨基酸位置的氨基酸置换外，VH和/或VL氨基酸序列可以是同一的。具有分别与SEQ ID NO：67-77和SEQ ID NO：78-88的VH和VL区具有高(即，80％或更高)同一性的VH和VL区的抗体可以如下获得，即，诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)分别编码SEQ ID NO：89-99和100-110的核酸分子、然后用本文所述的功能测试法对所编码的经改变抗体测试保留的功能(即上述功能)。
在其它实施方案中，全长重链和/或全长轻链氨基酸序列可以与上述序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。具有分别与SEQ ID NO：111-121任一个的全长重链和SEQ ID NO：122-132任一个的全长轻链具有高(即，80％或更高)同一性的全长重链和全长轻链的抗体可以如下获得，即，诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)分别编码SEQ ID NO：133-143和144-154的核酸分子、然后用本文所述的功能测试法对所编码的经改变抗体测试保留的功能(即上述功能)。
在其它实施方案中，全长重链和/或全长轻链核苷酸序列可以与上述序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。
在其它实施方案中，重链可变区和/或轻链可变区核苷酸序列可以与上述序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。
如本文所使用，两序列之间的同一性百分数为序列共有的同一位置的数量的函数(即，同一性％＝相同位置的#/总位置#×100)，其中考虑两序列进行最佳比对需引入的空位数目和每个空位的长度。比较序列以及确定两序列间的同一性百分数可以用下文非限制性实例中描述的数学算法完成。
可以使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17，1988)的算法，使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数，该算法已经被结合到ALIGN程序(版本2.0)中。此外，可以使用整合到GCG软件包(可以在http://www.gcg.com得到)的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol，Biol.48：444-453，1970)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，和缺口权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。
额外地或备选地，本发明的蛋白质序列还可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索以例如鉴定相关的序列。可以使用Altschul等，1990J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(版本2.0)进行此类搜索。可以用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质搜索来得到与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了得到用于比较目的的缺口比对，可以用如Altschul等，1997Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的缺口BLAST。当利用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守修饰的抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个具有基于本文所述抗体的特定氨基酸序列或者其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明的抗硬骨素抗体的期望功能性质。因此，本发明提供了分离的单克隆抗体或包含其抗原结合部分的功能蛋白，其由包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区组成，其中：重链可变区CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：1-11，及其保守修饰；重链可变区CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO：12-22，及其保守修饰；重链可变区CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO：23-33，及其保守修饰；轻链可变区CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：34-44，及其保守修饰；轻链可变区CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO：45-55，及其保守修饰；轻链可变区CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO：56-66，及其保守修饰；该抗体特异结合硬骨素，并且该抗体呈现至少一种下列功能性质：该抗体在基于细胞的wnt信号测试法中阻断硬骨素的抑制作用，该抗体在基于细胞的矿化测试法中阻断硬骨素的抑制作用或在Smad1磷酸化测试法中阻断硬骨素的抑制作用，或者该抗体抑制硬骨素与LRP-6的结合，或该抗体增加骨形成和质量及密度。
在多个实施方案中，抗体可以显示出一种或多种、两种或多种，或三种或多种上面列出的功能性质。此类抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其它实施方案中，针对在哺乳动物细胞中表达而优化的抗体具有全长重链序列和全长轻链序列，其中这些序列中的一个或多个具有基于本文所述抗体的特定氨基酸序列或者其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明的抗硬骨素抗体的期望功能性质。因此，本发明提供了分离的为在哺乳动物中表达而优化的单克隆抗体，其由全长重链和全长轻链组成，其中：该全长重链具有选自SEQ ID NO：111-121的氨基酸序列，及其保守修饰；以及该全长轻链具有选自SEQ ID NO：122-132的氨基酸序列，及其保守修饰；该抗体特异结合硬骨素，并且该抗体呈现至少一种下列功能性质：该抗体在基于细胞的wnt信号测试法中阻断硬骨素的抑制作用，该抗体在基于细胞的矿化测试法中阻断硬骨素的抑制作用或在Smad1磷酸化测试法中阻断硬骨素的抑制作用，或者该抗体抑制硬骨素与LRP-6的结合，或该抗体增加骨形成和质量及密度。
在多个实施方案中，抗体可以显示出一种或多种、两种或多种，或三种或多种上面列出的功能性质。此类抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如本文所用的，术语“保守的序列修饰”意指氨基酸修饰，其不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸替代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变向本发明的抗体中引入修饰。
保守的氨基酸替换是将氨基酸残基替换为具相似侧链的氨基酸残基。本领域已经确定了具相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以将本发明抗体CDR区内的一个或多个氨基酸残基替换为相同侧链家族的其它氨基酸残基，并且可以用本文所述的功能测试法对该改变的抗体测试保留的功能。
结合与本发明的抗硬骨素抗体相同表位的抗体
在另一实施方案中，本发明提供了结合与本文描述的本发明的多种特定的抗硬骨素抗体结合相同表位的抗体。出人意料地发现，在实施例中描述的所有能够：
(i)在基于细胞的wnt信号测试法中阻断硬骨素的抑制作用；
(ii)在基于细胞的矿化测试法中阻断硬骨素的抑制作用；
(iii)抑制硬骨素与LRP-6的结合；以及
(iv)增加骨形成、质量及密度的抗体都以高亲和性与硬骨素中相同的表位结合，所述表位是包括来自SEQ ID NO：156和SEQ ID NO：157两者的氨基酸序列的构象表位。不受任何特定模型的限制，本文提出氨基酸序列SEQ ID NO：156和SEQ IDNO：157定义了硬骨素多肽中由本发明抗体识别的一个构象表位区。
额外的抗体因此可以基于它们在标准硬骨素结合测试法中与本发明的其它抗体交叉竞争(即，以统计学显著方式竞争性抑制结合)的能力来鉴定。受试抗体抑制本发明的抗体与人硬骨素结合的能力表明该受试抗体与本发明抗体竞争结合人硬骨素；根据非限制性理论，这种抗体可以与它所竞争的抗体结合人硬骨素上相同或相关的(例如，结构上相似或空间上接近的)表位。在一些实施方案中，与本发明的抗体结合人硬骨素上相同表位的抗体是人单克隆抗体。此类人单克隆抗体可以如实施例中所述的那样制备和分离。
改造的和修饰的抗体
还可以使用具有本文所示的一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始材料以改造修饰的抗体而进一步制备本发明的抗体，其中所述修饰的抗体可以具有与起始抗体不同的特性。可通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)，例如，一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内的一个或多个残基，从而改造抗体。额外地或备选地，抗体可以通过修饰恒定区内的残基来改造，例如以改变抗体的效应子功能。
一种可以进行的可变区改造是CDR嫁接。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因为这个原因，所以各抗体之间CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列有更大的差异。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体的性质的重组抗体，其中所述的表达载体包括嫁接到具有不同性质的不同抗体构架序列上的特定天然抗体的CDR序列(参见，例如Riechmann，L.等人，1998 Nature 332：323-327；Jones，P.等人，1986 Nature 321：522-525；Queen，C.等人，1989 Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539，以及Queen等人的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一实施方案涉及分离的单克隆抗体或包含其抗原结合部分的功能蛋白，其包含的重链可变区包含分别具有选自SEQ ID NO：1-11的氨基酸序列的CDR1序列、具有选自SEQ ID NO：12-22的氨基酸序列的CDR2序列、具有选自SEQ ID NO：23-33的氨基酸序列的CDR3序列，并且其包含的轻链可变区具有分别具有选自SEQ ID NO：34-44的氨基酸序列的CDR1序列、具有选自SEQ ID NO：45-55的氨基酸序列的CDR2序列、以及由选自SEQ ID NO：56-66的氨基酸序列组成的CDR3序列。因此，此类抗体含有单克隆抗体的VH和VL CDR序列，然而可以含有与这些抗体不同的构架序列。
此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase可获得)、以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson，I.M.等人，1992 J.fol.Biol.227：776-798：776-798和Cox，J.P.L.等人，1994 Eur.J Immunol.24：827-836中找到，其中所述的每篇参考文献的内容都清楚地引入本文作为参考。
可用于本发明抗体中的构架序列的实例为与所选的本发明抗体使用的构架序列(例如本发明单克隆抗体使用的共有序列和/或构架序列)结构上相似的构架序列。可以将VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列嫁接到构架区上，该构架区具有与其所来源的种系免疫蛋白基因中的构架区序列同一的序列，或者可以将CDR序列嫁接到相比较于该种系序列含有一个或多个突变的构架区上。例如，已发现在一些情况下，突变构架区内的残基对于保持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(参见例如Queen等人的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。
另一类型的可变区修饰是突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基从而提高目的抗体的一种或多种结合性质(例如，亲和性)，称作“亲和性成熟”。可以进行定点诱变或者PCR介导的诱变以引入突变，并且可以用如本文所述的和实施例中提供的体外或体内测试法评估对抗体结合或者其它感兴趣的功能性质的影响。可以引入保守修饰(如上文讨论)。突变可以是氨基酸替代、添加或缺失。此外，通常改变CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，在另一实施方案中，本发明提供了分离的抗硬骨素单克隆抗体，或包含其抗原结合部分的功能蛋白，其由重链可变区组成，该重链可变区具有：由选自SEQ ID NO：1-11的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1-11相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列组成的VH CDR1区；具有选自SEQ ID NO：12-22的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：12-22相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR2区；具有选自SEQ ID NO：23-33的氨基酸序列或与SEQ ID NO：23-33相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR3区；具有选自SEQ ID NO：34-44的氨基酸序列或与SEQ ID NO：34-44相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR1区；具有选自SEQ ID NO：45-55的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：45-55相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR2区；和具有选自SEQ ID NO：56-66的氨基酸序列或与SEQ ID NO：56-66相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR3区。
将抗原结合结构域嫁接到备选的构架和支架中
可以采用多种抗体/免疫球蛋白构架或支架，只要所得多肽包括至少一个特异结合硬骨素的结合区。此类构架或支架包括人免疫球蛋白的5种主要独特型或其片段(如本文其它地方公开的那些)，并且包括其它动物物种的、优选具有人源化方面的免疫球蛋白。从这方面考虑，尤其有意义的是单重链抗体诸如在骆驼中鉴定的单重链抗体。本领域技术人员将持续发现和研发出新的构架、支架和片段。
一方面，本发明涉及应用非免疫球蛋白支架产生基于非免疫球蛋白的抗体，其中可将本发明的CDR嫁接到所述支架中。可以应用已知的和将来的非免疫球蛋白构架和支架，只要它们包含对SEQ ID NO：155的靶蛋白特异的结合区域。本文中将此类化合物称为“包含靶特异性结合区域的多肽”。在下节将进一步描述非免疫球蛋白构架的实例(骆驼抗体和非抗体支架)。
骆驼抗体(Camelid antibodies)
已经对由骆驼和单峰骆驼家族成员(双峰驼(Camelus bactrianus)和Calelus dromaderius)获得的抗体蛋白质进行了关于大小、结构复杂性和在人受试者中的抗原性的表征，所述骆驼和单峰骆驼家族成员包括新大陆成员诸如美洲驼(llama)物种(Lama paccos，大羊驼(Lama glama)和骆马(Lama vicugna))。在自然界中发现来自这种哺乳动物科的某些IgG抗体缺少轻链，因而具有与具有两条重链和两条轻链的典型四链结构明显不同的结构，所述四链结构是来自其它动物的抗体的特征。参见PCT/EP93/02214(1994年3月3日公开的WO94/04678)。
骆驼抗体的区域，被鉴定为VHH的小的单一可变结构域，可以通过遗传工程改造来获得以产生对靶标具有高亲和性的小蛋白，导致一种低分子量的抗体衍生蛋白质，称作“骆驼纳米抗体”。参见1998年6月2日发布的美国专利5,759,808；还见Stijlemans，B.等，2004，J Biol Chem，279：1256-1261；Dumoulin，M.等，2003，Nature，424：783-788；Pleschberger，M.等，2003，Bioconjugate Chem，14：440-448；Cortez-Retamozo，V.等，2002，Int J Cancer，89：456-62；和Lauwereys，M.等，1998，EMBOJ，17：3512-3520。骆驼抗体和抗体片段经改造过的文库可以，例如从Ablynx、Ghent、Belgium商购。如本领域对于其它非人源抗体已知的，可以重组改变骆驼抗体的氨基酸序列，以获得更加近似人序列的序列，即该纳米抗体可以被“人源化”。因而骆驼抗体对人的天然低抗原性可以再减弱。
骆驼纳米抗体具有人IgG分子大约十分之一的分子量，并且所述蛋白只有几纳米的物理直径。小尺寸的一个结果是骆驼纳米抗体能够结合对于较大抗体蛋白而言为功能上不可识别的抗原性位点的能力，即骆驼纳米抗体可用作检测抗原的试剂，而所述抗原对于利用经典免疫技术而言是隐蔽的，骆驼纳米抗体还可用作可能的治疗剂。小尺寸的又一个结果是骆驼纳米抗体能够结合到靶蛋白凹槽或狭缝中特定位点而产生抑制性结果，因此能够提供比经典抗体更近似地模仿经典低分子量药物功能的能力。
低分子量和紧凑的尺寸还导致骆驼纳米抗体极端热稳定，对于极端pH稳定和对于蛋白水解消化稳定，并且具有低抗原性。另一个结果是骆驼纳米抗体容易从循环系统移入组织内，甚至穿过血脑屏障并因而可以治疗影响神经组织的病症。纳米抗体还可以促进药物转运穿过血脑屏障。参见公布于2004年8月19日的美国专利申请20040161738。这些特征结合对人的低抗原性表明极大的治疗潜能。另外，这些分子可以在原核细胞例诸如大肠杆菌(E.coli)中完全表达，以及作为与噬菌体的融合蛋白而表达，并且是功能性的。
因此，本发明一个特征是对硬骨素具有高亲和性的骆驼抗体或纳米抗体。在本文某些实施方案中，骆驼抗体或纳米抗体天然产生于骆驼科动物中，即利用本文用于其它抗体所述的技术，在用硬骨素或其肽片段免疫后由骆驼科动物产生。备选地，对抗硬骨素骆驼科纳米抗体进行改造，即，如本文实施例中所述以硬骨素作为靶标，利用淘选方法通过例如从噬菌体文库选择来产生，所述噬菌体展示适当诱变的骆驼纳米抗体蛋白。可以通过遗传工程来进一步定制改造的纳米抗体，以便在受体受试者体内具有45分钟到两周的半寿期。在特定的实施方案中，通过将本发明的人抗体的重链和轻链的CDR序列嫁接到纳米抗体和单结构域抗体构架序列中而获得骆驼抗体或纳米抗体，如例如在PCT/EP93/02214(WO94/04678)中所描述的那样。
非抗体支架
已知的非免疫球蛋白构架或支架包括但不限于Adnectins(纤连蛋白)(Compound Therapeutics，Inc.，Waltham，MA)、锚蛋白(MolecularPartners AG，Zurich，Switzerland)、结构域抗体(Domantis，Ltd(Cambridge，MA)和Ablynx nv(Zwijnaarde，Belgium)、脂笼蛋白(Anticalin)(PierisProteolab AG，Freising，Germany)、小模块免疫药物(small modularimmuno-pharmaceuticals)(Trubion Pharmaceuticals Inc.，Seattle，WA)、maxybodies(Avidia，Inc.(Mountain View，CA))、A蛋白(Affibody AG，Sweden)和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，Halle，德国)、蛋白表位模拟物(Polyphor Ltd，Allschwil，Switzerland)。
(i)adnectin-化合物治疗剂
adnectin支架基于纤连蛋白III型结构域(例如纤连蛋白类型III的第10个模块(10Fn3结构域))。该纤连蛋白III型结构域具有7或8个β折叠链(beta strand)，这些β折叠链分布在两个β片层之间，本身彼此紧密堆积以形成蛋白质的核，并进一步包含使β折叠链相互连接的、暴露于溶剂的环(类似于CDR)。在该β片层夹心结构的每一个边缘有至少三个这样的环，其中所述边缘为垂直于β折叠链方向的蛋白质的边界(US 6,818,418)。
这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白的，尽管整体折叠与骆驼和羊骆IgG中包含完整抗原识别单位的最小功能性抗体片段(即重链可变区)的整体折叠密切相关。因为这种结构，所以该非免疫球蛋白抗体可以模拟在性质和亲和性上与抗体相类似的抗原结合性质。这些支架可以用于与体内的抗体亲和性成熟过程类似的体外环随机化(loop randomization)和改组策略中。这些基于纤连蛋白的分子可以用作支架，其中用标准克隆技术将分子的环区替换为本发明的CDR。
(ii)锚蛋白-分子配偶体
该技术基于用具锚蛋白来源的重复模块的蛋白质作为支架以携带可用于结合不同靶的可变区。锚蛋白重复模块为由两个反向平行-螺旋和一个
-转角组成的33个氨基酸的多肽。可变区的结合主要通过使用核糖体展示来最优化。
(iii)Maxybodies/Avimers-Avidia
Avimers衍生自天然的含有A结构域的蛋白质，诸如LRP-1。这些结构域天然地用于蛋白质-蛋白质相互作用，并且在人中超过250种蛋白质在结构上基于A结构域。Avimers由许多(2-10个)不同“A结构域”单体通过氨基酸接头连接而组成。可以使用例如20040175756、20050053973、20050048512和20060008844中所述技术来产生能够结合靶抗原的Avimers。
(vi)A蛋白-Affibody
Figure GPA00001091835000291
亲合配体是基于A蛋白的IgG结合结构域之一的支架的、包含一个三螺旋束的简单小蛋白质。A蛋白是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白质。这个支架结构域由58个氨基酸组成，其中随机化13个氨基酸可以产生具大量配体变体的
Figure GPA00001091835000292
文库(参见例如US 5,831,012)。
Figure GPA00001091835000293
分子模拟抗体，相比分子量为150kDa的抗体，它们具有6kDa的分子量。虽然其大小很小，但
Figure GPA00001091835000294
分子的结合位点类似于抗体的结合位点。
(v)Anticalins-Pieris
Figure GPA00001091835000295
为Pieris ProteoLab AG公司研发的产品。它们衍生自脂笼蛋白，所述脂笼蛋白为一类广泛分布的小并且强韧的蛋白质，其通常涉及化学敏感性化合物或不溶性化合物的生理运输或储存。在人组织或体液中存在几种天然的脂笼蛋白。
该蛋白质结构使人联想到免疫球蛋白，在刚性构架顶上具有高变环。然而，与抗体或其重组片段不同，脂笼蛋白包含具160-180个氨基酸残基的单多肽链，仅微大于单个免疫球蛋白结构域。
组成结合口袋的一组四个环显示显著的结构可塑性，并且耐受多种侧链。因此，该结合位点可以在专利方法中重塑以便以高亲和性和高特异性识别不同形状的规定的靶分子。
已经用脂笼蛋白家族的一个蛋白质，即Pieris Brassicae的后胆色素结合蛋白(BBP)通过诱变该四环集合来研发anticalins。描述“anticalins”的专利申请的一个实例为PCT WO 199916873。
(vi)Affilin-Scil蛋白
AffilinTM分子是为获得对蛋白质和小分子的特定亲和性而设计的小的非免疫球蛋白蛋白质。新的Affilin TM分子可以非常快地从两个各基于不同的人衍生支架蛋白质的文库中筛选得到。
AffilinTM分子不显示与免疫球蛋白蛋白质的任何结构同源性。Scil蛋白采用两个AffilinTM支架，一个为γ-晶体蛋白，其为一种人的结构性眼晶状体蛋白质，而另一个为“泛素”超家族蛋白质。两种人支架都非常小，显示高温度稳定性，并且几乎耐受pH变化和变性剂。高稳定性主要是因为蛋白质中展开的β片层结构。WO200104144中描述了γ晶体蛋白衍生的蛋白质的实例，WO2004106368中描述了“泛素样”蛋白质的实例。
(vii)蛋白质表位模拟物(PEM)
PEM是中等大小的、环状的、肽样分子(MW 1-2kDa)，其模拟蛋白质的β发夹二级结构，所述β发夹二级结构是参与蛋白-蛋白相互作用的主要二级结构。更一般地，任何模拟本发明抗体表位3D结构的多肽都是本发明的一部分。优选的实施方案是30-100个氨基酸的多肽，其至少包含以下多肽E1-L-E2的，其中E1是SEQ ID NO：156、E2是SEQ ID NO：157，以及L是使得E1和E2再现由本发明抗体识别的区域的3D结构的多肽接头。根据一个优选的实施方案，L是由10-20个选自甘氨酸或丝氨酸的氨基酸组成的接头。优选地接头L包含肽GGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO：X/SEQ ID NO：158)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGG(SEQ IDNO：Y/SEQ ID NO：159)，更优选地接头L基本上由SEQ ID NO：X或SEQID NO：Y组成。
这些多肽应当保留对本发明抗体的高亲和性。这些多肽还可有利地用作免疫原以产生针对硬骨素的抗体。
这些多肽还可用作硬骨素的拮抗剂或激动剂，并且因此具有与如对本发明抗体所描述的那些类似的应用。
在E1和/或E2序列中具有一个或多个氨基酸替换或缺失，优选不超过1、2或3个氨基酸替换或缺失的多肽也是本发明的一部分。还可进一步改造这些多肽以增加半寿期或改善溶解性。特别地，可产生这些多肽与血清蛋白，诸如IgG或人血清白蛋白的Fc片段的融合构建物以增加半寿期，类似于下段中对本发明的抗体片段分子描述的Fc改造。
构架或Fc改造
本发明经改造的抗体包括其中对VH和/或VL中的构架残基进行修饰的那些抗体，以例如改善抗体的特性。一般进行这类构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个构架残基“回复突变”为相应种系序列的构架残基。更加具体地，已经进行过体细胞突变的抗体可以含有与该抗体源自的种系序列不同的构架残基。通过比较抗体构架序列与该抗体源自的种系序列可以鉴定这类残基。为了将构架区序列回复为它们的种系构型，可通过例如定向诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”为种系序列。这类“回复突变”的抗体也包括在本发明中。
另一种类型的构架修饰涉及在构架区内或甚至在一个或多个CDR区内突变一个或多个残基，以便除去T细胞表位，由此减弱抗体的潜在免疫原性。这种方法也称作“去免疫”并在Carr等的美国专利公开20030153043中作进一步描述。
除了在构架或CDR区内制作的修饰之外或作为在构架或CDR区内制作修饰的备选，可以对本发明抗体进行改造以便在Fc区内包括修饰，一般地以改变抗体的一种或多种功能特性，诸如血清半寿期，补体结合，Fc受体结合，和/或抗原依赖型细胞毒性。另外，可以对本发明抗体进行化学修饰(例如，可以将一个或多个化学部分附着在抗体上)或进行修饰以便改变其糖基化，再次改变抗体的一种或多种功能特性。下面进一步详述这些实施方案中的每一种。Fc区的残基编号是Kabat的EU索引的编号。
在一个实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰从而改变(例如增加或减少)铰链区中半胱氨酸残基的数目。在Bodmer等的美国专利5,677,425中对这一方法作进一步描述。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目，以便例如促进轻链和重链的组装，或增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变以便降低抗体的生物学半寿期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变导入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，从而使得抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白质A(SpA)结合。在Ward等的美国专利6,165,745中对这一方法作了进一步详述。
在另一个实施方案中，对抗体进行修饰以便提高其生物学半寿期。多种方法是可能的。例如，在Ward的美国专利6,277,375中所述，可以导入下列突变中的一种或多种：T252L、T254S、T256F。备选地，如在Presta等的美国专利5,869,046和6,121,022中所述为了提高生物学半寿期，可以在CH1或CL区内改变抗体以便包含取自IgG的Fc区中CH2结构域的两个环内的补救(salvage)受体结合表位。
在其它实施方案中，可以通过用不同氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以便改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基代替一个或多个氨基酸，从而使得抗体对效应子配体具有改变的亲和性但保留亲本抗体的抗原结合能力。对于其而言亲和性改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。在Winter等的美国专利5,624,821和5,648,260中对这一方法作了进一步详述。
在另一个实施方案中，可以用不同的氨基酸残基代替选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸，从而使得抗体具有改变的C1q结合和/或减弱或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在Idusogie等的美国专利6,194,551中对这一方法作了进一步详述。
在另一个实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，由此改变抗体固定补体的能力。在Bodmer等的PCT公开文本WO94/29351中对这一方法作了进一步描述。
在又一个实施方案中，通过修饰一个或多个氨基酸而修饰Fc区，以便提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或来提高抗体对Fc γ受体的亲和性。在Presta的PCT公开WO00/42072中对这一方法作了进一步描述。另外，已经对人IgG1上对Fc γRI，Fc γRII，Fc γRIII和FcRn的结合位点进行作图并已经描述了结合改善的变体(参见Shields，R.L.等，2001J.Biol.Chem.276：6591-6604)。
在又一个实施方案中，对抗体的糖基化进行修饰。例如，可以制备无糖基化(aglycoslated)的抗体(即缺少糖基化的抗体)。例如可以改变糖基化以提高抗体对“抗原”的亲和性。这种糖修饰可以通过例如改变抗体序列内糖基化的一个或多个位点来实现。例如可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致一个或多个可变区构架糖基化位点的消除，由此消除该位点上的糖基化。这种无糖基化可以提高抗体对抗原的亲和性。在Co等的美国专利5,714,350和6,350,861中对这种方法作了进一步详述。
额外地或备选地，抗体可以制备成具有改变类型的糖基化，诸如具有降低数量的岩藻糖基的低岩藻糖基化抗体或者具有增加的分叉性(bisecting)GlcNac结构的抗体。已经证实，此类改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。此类糖修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域得到描述，并且能够用作表达本发明重组抗体的宿主细胞来产生具改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人在EP 1,176,195中描述了具功能性破坏的FUT8基因(其编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，这样在该细胞系中表达的抗体将呈现低岩藻糖基化。Presta在PCT公开WO 03/035835中描述了变异的CHO细胞系Lecl3细胞，该细胞系具有降低的将岩藻糖附于Asn(297)-连接的糖上的能力，从而也导致在该宿主细胞中表达的抗体低岩藻糖基化(也参见Shields，R.L.等，2002J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人在PCT公开WO 99/54342中描述了经改造而表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如β(1，4)-N乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，这样在该改造的细胞系中表达的抗体呈现增加的分叉性GlcNac结构，从而导致抗体增加的ADCC活性(也参见Umana等，1999Nat.Biotech.17：176-180)。
本发明考虑的对本文抗体的另一种修饰为聚乙二醇化。可以聚乙二醇化抗体以例如增加抗体的生物(例如血清)半寿期。为了聚乙二醇化抗体，一般将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(诸如PEG的活性酯或醛衍生物)在可以将一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段上的条件下反应。聚乙二醇化可以通过与活性PEG分子(或相似的活性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行。如本文所使用的那样，术语“聚乙二醇”旨在包括任何形式的、已经被用来衍生其它蛋白质的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在一些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体为无糖基化的抗体。用于聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域所公知，并且能应用于本发明的抗体。参见，例如Nishimura等的EP 0154316和Ishikawa等的EP 0401384。
本发明考虑的另一种抗体修饰为至少本发明的抗原结合区域与血清蛋白(诸如人血清白蛋白或其片段)的缀合物或蛋白质融合，以增加所产生的分子的半寿期。此类方法例如描述于Balance等的EP0322094。
另一种可能性是至少本发明的抗原结合区域与能和血清蛋白(如人血清白蛋白)结合的蛋白质的融合，以增加所产生的分子的半寿期。此类方法例如描述于Nygren等的EP 0486525。
工程化改变的抗体的方法
如上面所讨论的，具有本文所示VH和VL或全长重链和轻链序列的抗硬骨素抗体可用于通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列、或与其连接的恒定区而产生新的抗硬骨素抗体。因而，本发明另一方面，本发明抗硬骨素抗体的结构特征被用来生成结构上相关的抗硬骨素抗体，其保留本发明抗体的至少一种功能特性，例如结合人硬骨素并抑制硬骨素的一种或多种功能特性(例如，受体结合、预防或改善骨质溶解)。
如上文所述，例如可以将本发明抗体的一个或多个CDR区或其突变与已知的构架区和/或其它CDR重组组合来产生本发明额外的、重组改造的、抗硬骨素抗体。其它类型的修饰包括前文部分所述的修饰。用于该改造方法的起始材料为本文提供的一个或多个VH和/或VL序列或者其一个或多个CDR区。为了产生改造的抗体，并不需要确实制备(即表达蛋白质)具有本文提供的一个或多个VH和/或VL序列、或者其一个或多个CDR区的抗体。而是可以将包含在序列中的信息用作起始材料来产生衍生自原始序列的“第二代”序列，然后制备“第二代”序列并表达成蛋白质。
因此，在另一实施方案中，本发明提供了制备抗硬骨素抗体的方法，其中所述抗体由重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列组成，其中所述重链可变区抗体序列具有选自SEQ ID NO：1-11的CDR1序列、选自SEQ ID NO：12-22的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO：23-33的CDR3序列，所述轻链可变区抗体序列具有选自SEQ ID NO：34-44的CDR1序列、选自SEQ ID NO：45-55的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO：56-66的CDR3序列；改变该重链可变区抗体序列和/或该轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基来产生至少一种改变的抗体序列；并将改变的抗体序列表达为蛋白质。
因此，在另一实施方案中，本发明提供了制备为在哺乳动物细胞中表达而优化的、由下列序列组成的抗硬骨素抗体的方法：具有选自SEQ ID NO：111-121序列的全长重链抗体序列；和具有选自SEQ ID NO：122-132的序列的全长轻链抗体序列；改变该全长重链抗体序列和/或该全长轻链抗体序列中的至少一个氨基酸残基来产生至少一种改变的抗体序列；并将改变的抗体序列表达为蛋白质。
还可通过筛选抗体文库来制备经改变的抗体序列，所述抗体文库具有选自SEQ ID NO：23-33或如在US20050255552中描述的最小必要结合决定簇的固定的CDR3序列，并且在CDR1和CDR2序列上不同。可根据适于从抗体文库中筛选抗体的任何筛选方法来进行该筛选，诸如噬菌体展示技术。
可以用标准的分子生物学技术来制备和表达改变的抗体序列。由改变的抗体序列编码的抗体将保持本文所述抗硬骨素抗体的一种、一些或所有的功能性质，其中所述的功能性质包括但不限于特异结合硬骨素，并且该抗体呈现至少一种下列功能性质：该抗体在基于细胞的wnt信号测试法中阻断硬骨素的抑制作用，该抗体在基于细胞的矿化测试法中阻断硬骨素的抑制作用或在Smad1磷酸化测试法中阻断硬骨素的抑制作用，或者该抗体抑制硬骨素与LRP-6的结合，或该抗体增加骨形成和质量及密度。
经改变的抗体可以呈现一种或多种、两种或多种、或者三种或多种的上述功能性质。
可以使用本领域中可获得的和/或本文所述的标准测试法，诸如实施例中给出的那些(例如，ELISA)来评估经改变的抗体的功能性质。
在改造本发明抗体的方法的一些实施方案中，可以沿着抗硬骨素抗体编码序列的全部或者部分随机或者选择性导入突变，并可以针对如本文所述的结合活性和/或其它功能性质对得到的经修饰的抗硬骨素抗体进行筛选。突变方法已经在本领域描述。例如，Short的PCT公开号WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接装配，或者其组合产生和筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等的PCT公开号WO 03/074679描述了使用计算机筛选方法优化抗体的理化性质的方法。
编码本发明抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及编码本发明抗体的核酸分子。全长轻链亲本核苷酸序列的实例如SEQ ID NO 144-145所示。全长重链亲本核苷酸序列的实例如SEQ ID NO 133-134所示。为在哺乳动物细胞中表达而优化的全长轻链核苷酸序列的实例如SEQ ID NO 146-154所示。为在哺乳动物细胞中表达而优化的全长重链核苷酸序列的实例如SEQ ID NO 135-143所示。
核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或者可以是部分纯化或者基本上纯的形式的核酸。当通过标准技术纯化核酸以除去其它细胞组分或其它污染物，例如，其它细胞核酸或蛋白质时，核酸是“分离的”或“使得基本上纯的”，所述标准技术包括碱/SDS处理、CsCl分带(banding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他技术。参见F.Ausubel等人编著，1987Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，纽约。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或不含有内含子序列。在一个实施方案中，核酸是cDNA分子。核酸可以存在于载体，诸如噬菌体展示载体，或者重组质粒载体中。
可以使用标准分子生物学技术得到本发明的核酸。对于通过杂交瘤(例如，如下文进一步描述的从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码通过杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术得到。对于从免疫球蛋白基因文库(例如，使用噬菌体展示技术)得到的抗体，可以从作为文库成员的多种噬菌体克隆回收编码所述抗体的核酸。
一旦得到编码VH和VL区段的DNA片段，就可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如，以将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因，或者scFv基因。在这些操作中，将编码VL-或VH的DNA片段有效地连接到另一DNA分子，或者编码另一蛋白质的片段，诸如抗体恒定区或柔性接头。该上下文中使用的术语“有效地连接”意指两个DNA片段以功能方式连接，例如，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合阅读框，或者使得该蛋白质在所希望的启动子控制下表达。
可以通过将编码VH的DNA有效地连接到编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子而将编码VH区的分离的DNA转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat，E.A.，等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interes，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)并且可以通过标准PCR扩增得到包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。重链恒定区优选选自IgG2同种型。对于Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA有效地连接到仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
可以通过将VL编码DNA有效地连接到编码轻链恒定区CL的另一DNA分子从而将分离的编码VL区的DNA转变成全长轻链基因(以及转变为Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(见例如，Kabat，E.A.，等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)，并且包含这些区的DNA片段可以通过标准DNA扩增得到。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，可以将编码VH和VL的DNA片段有效地连接到编码柔性接头(例如，编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段，由此使VH和VL序列能够表达为具有通过柔韧接头连接的VL和VH区的连续单链蛋白质(见，例如，Bird等人，1988Science 242：423-426；Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，1990Nature348：552-554)。
产生本发明的单克隆抗体
可以通过多种技术产生单克隆抗体(mAb)，所述技术包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein，1975Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。可以使用多种用于产生单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或癌基因转化。
用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。在小鼠中的杂交瘤产生是成熟的方法。用于分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合步骤也是已知的。
可基于如上述制备的鼠单克隆抗体的序列制备本发明的嵌合或人源化抗体。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目的鼠杂交瘤得到并使用标准分子生物学技术进行改造以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区(参见，例如，Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入到人构架区。参见，例如，Winter的美国专利号5,225,539和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6；180；370。
在某个实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠免疫系统的转基因或转染色体小鼠产生针对硬骨素的此类人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别称作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且它们在本文中统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb小鼠
Figure GPA00001091835000381
(Medarex，INc.)含有人免疫蛋白基因小基因座，其编码未重排的人重链(μ和γ)和K轻链免疫球蛋白序列，以及失活内源μ和κ链基因座的定向突变(见例如，Lonberg，等人，1994Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠显示出小鼠IgM或κ的降低的表达，并且在应答免疫时，所导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和性人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等人，1994同上；Lonberg，N.，1994Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101中的综述；Lonberg，N.和Huszar，D.，1995Intern.Rev.Immunol.13：65-93，和Harding，F.和Lonberg，N.，1995Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb小鼠的制备和用途，和此类小鼠携带的基因组修饰在Taylor，L.等，1992Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等，1993International Immunology 5：647-656；Tuaillon等，1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi等，1993Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等，1993EMBO J.12：821-830；Tuaillon等，1994J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等，1994International Immunology 579-591；和Fishwild，D.等，1996Nature Biotechnology 14：845-851中进一步描述，将它们的内容都完整引入本文作为参考。还见，Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429；Surani等人的美国专利号5,545,807；和Lonberg和Kay的PCT公布号WO 92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884和WO 99/45962；和Korman等人的PCT公布号WO 01/14424。
在另一实施方案中，使用在转基因或转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，诸如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生本发明的人抗体。此类小鼠在本文中称作“KM小鼠”，在Ishida等人的PCT公布号WO 02/43478中详细描述。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选的转基因动物系统可以在本领域中得到并且可以用于产生本发明的抗硬骨素抗体。例如，可以使用称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的备选转基因系统。此类小鼠在例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选的转染色体动物系统可以在本领域中获得并且可以用于产生本发明的抗硬骨素抗体。例如，可以使用称作“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；此类小鼠在Tomizuka等人，2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中描述。此外，携带人重链和轻链转染色体的奶牛已经在本领域描述(Kuroiwa等人，2002Nature Biotechnology 20：889-894)并且可以用于产生本发明的抗硬骨素抗体。
也可以使用筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备本发明的人单克隆抗体。本领域中建立了此类用于分离人抗体的噬菌体展示方法或在以下实施例中得以描述。参见例如：Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
也可以使用其中已经重建了人免疫细胞从而当免疫时可以产生人抗体应答的SCID小鼠制备本发明的人单克隆抗体。此类小鼠在例如Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中描述。
生成产生人单克隆抗体的杂交瘤
为了产生本发明的产生人单克隆抗体的杂交瘤，可从免疫小鼠分离脾细胞和/或淋巴节细胞并与合适的永生化细胞系融合，所述永生化细胞系诸如小鼠骨髓瘤细胞系。可针对抗原特异性抗体的产生筛选所得到的杂交瘤。例如通过50％的PEG使来自经免疫小鼠脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与1/6数量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融合。将细胞以约2x145铺在平底微量滴定板上，然后在选择培养基中温育2周，所述培养基含有20％胎克隆血清、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES，0.055mM2-巯基乙醇、50单位/毫升青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma；HAT在融合之后24小时添加)。大约两周之后，可将细胞培养在HAT被HT替代的培养基中。然后可以通过ELISA筛选每一个孔中的人单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生了广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天之后对培养基进行分析。可以将分泌抗体的杂交瘤重新铺平板，再次筛选，并且如果仍然对人IgG呈阳性，可以通过有限稀释亚克隆单克隆抗体至少2次。然后在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中制备少量用于进行表征的抗体。
为了纯化人单克隆抗体，可使所选择的杂交瘤在2L摇瓶中生长以用于单克隆抗体纯化。上清液过滤并浓缩后进行蛋白A-琼脂糖亲和层析(Pharmacia，Piscataway，NJ)。洗脱的IgG通过凝胶电泳和高效液相层析检查以确保纯度。可将缓冲溶液换成PBS，并且可在OD280用1.43消光系数测定浓度。单克隆抗体分成等份并储存于-80℃。
生成产生单克隆抗体的转染瘤
还可以在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体，使用例如，本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如，Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，为了表达抗体或者其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如，PCR扩增或cDNA克隆，使用表达目的抗体的杂交瘤)得到编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将DNA插入到表达载体中，使得基因有效连接到转录和翻译控制序列。在该上下文中，术语“有效连接”意指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到单独的载体，或者更一般地，可以将两种基因插入到相同的表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入表达载体中(例如，连接抗体基因片段或载体上的互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点，则为平末端连接)。本文所述抗体的轻链和重链可变区可以通过下述方法用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因：将所述基因插入到已经编码所希望同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段有效连接载体内的CH区段并且VL区段有效连接载体内的CL区段。额外地或备选地，重组表达载体可以编码信号肽，其方便抗体链从宿主细胞的分泌。可以将抗体链基因克隆到载体中使得信号肽与抗体链基因的氨基端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体还可以携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)，其控制抗体链基因的转录或翻译。此类调节序列描述于例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA1990)。本领域技术人员将明白表达载体的设计，包括调节序列的选择，可以依赖于此类因素，诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白质表达水平，等等。哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，诸如启动子和/或增强子，其来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))，和多瘤病毒。备选地，可以使用非病毒调节序列，诸如遍在蛋白启动子或P珠蛋白启动子。此外，调节元件包括不同来源的序列，诸如SRa启动子系统，其含有来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复的序列(Takebe，Y.等人，1988 Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除了抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体可以携带额外的序列，诸如调节宿主细胞中载体复制的序列(例如复制起点)和可选择标记基因。可选择标记基因方便已经导入载体的宿主细胞的选择(参见，例如，Axel等人的美国专利号4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，通常，可选择标记基因对已经导入载体的宿主细胞赋予对药物(诸如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞，使用氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染入宿主细胞中。术语“转染”的多种形式意在包括常用于向原核或真核宿主细胞中导入外源DNA的多种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。在理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。讨论了抗体在真核细胞，尤其哺乳动物宿主细胞中的表达，因为此类真核细胞，尤其哺乳动物细胞，比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠的和免疫活性抗体。已经报导抗体基因的原核表达对于产生高产量的活性抗体是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.，1985Immunology Today 6：12-13)。
用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，使用DH FR可选择标记，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp，1982Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，对于使用NSO骨髓瘤细胞，另一表达系统是显示于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足以允许抗体在宿主细胞中表达或者将抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中的一段时间来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。
双特异性分子
另一方面，本发明描述了包含本发明的抗硬骨素抗体或其片段的双特异性或多特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合区可以被衍生或连接到另一功能分子，例如，另一肽或蛋白质(例如，另一抗体或受体的配体)以产生双特异性分子，其结合至少两个不同的结合位点或靶分子。实际上可以将本发明的抗体衍生或连接到一个以上的其它功能分子以产生结合两个以上不同的结合位点和/或靶分子的多特异性分子；此类多特异性分子也意在被本文使用的术语“双特异性分子”包括。为了产生本发明的双特异性分子，可以将本发明的抗体功能连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其它方法)到一个或多个其它结合分子，诸如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，从而产生双特异性分子。
因此，本发明包括双特异性分子，其包含至少一种对硬骨素的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性。例如，第二靶表位是不同于所述第一靶表位的另一硬骨素表位。另一实例是包含至少一种对硬骨素的第一结合特异性和对Dkk-1内的表位的第二结合特异性的双特异性分子。另一实例是包含至少一种对硬骨素的第一结合特异性和对LRP4内的表位的第二结合特异性的双特异性分子。
此外，对于双特异性分子是多特异性的本发明，除了所述第一和第二靶表位外，所述分子能还包括第三结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体或其抗体片段，包括如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv。抗体还可以是轻链或重链二聚体，或者其任何最小片段，诸如Ladner等人的美国专利号4,946,778中描述的Fv或单链构建体，将其内容明确引入本文作为参考。
可以用于本发明的双特异性分子的其它抗体是鼠的、嵌合的和人源化的单克隆抗体。
可使用本文已知的方法通过缀合组分结合特异性来制备本发明的双特异性分子。例如，可以分别地产生双特异性分子的每种结合特异性，然后将它们相互连接。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可以用于共价连接。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，以及硫代琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC)(参见例如Karpovsky等人，1984J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等人，1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其它方法包括Paulus，1985Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等人，1985Science 229：81-83，和Glennie等人，1987J.Immunol.139：2367-2375中描述的那些。缀合剂是SATA和硫代SMCC，它们都可以从PierceChemical Co.(Rockford，IL)得到。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两个重链的C-端铰链区的巯基键合而缀合。在一个特定的实施方案中，修饰铰链区以在缀合前含有奇数个巯基，例如，一个巯基。
备选地，可以在相同载体中编码两种结合特异性并在相同的宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2或配体×Fab融合蛋白时，该方法尤其有用。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或者包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法在例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中描述。
双特异性分子与它们的特定靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测试法(REA)、FACS分析、生物测试法(例如，生长抑制)，或者蛋白质印迹测试法证实。这些测试法的每一种通常通过使用对目的复合体特异的标记试剂(例如，抗体)检测具体目的蛋白质-抗体复合体的存在。
多价抗体
另一方面，本发明提供了包含本发明抗体的至少两个相同或不同抗原结合部分的多价化合物。优选地，考虑到硬骨素的三聚性质，本发明的化合物提供了抗体的至少三个或四个抗原结合部分。所述抗原结合部分可通过蛋白质融合或共价或非共价连接而连接在一起。备选地，已对双特异性分子描述了连接方法。例如可通过使本发明抗体的抗体与结合本发明抗体恒定区的抗体(例如，Fc或铰链区)进行交联而获得四价化合物。
例如在Borean专利EP 1012280B1中描述了三聚化结构域。例如在PCT/EP97/05897中描述了五聚化模块。
药物组合物
在另一方面，本发明提供了组合物(例如药物组合物)，其包含本发明单克隆抗体或其抗原结合部分中的一种或组合及一同配制的可药用载体。此类组合物可以包括本发明的(例如，两种或多种不同的)抗体或免疫缀合物或双特异性分子之一或组合。例如，本发明的药物组合物可以包含结合靶抗原上不同表位或者具有互补活性的抗体的组合。
本发明的药物组合物还可以在联合治疗中施用，即联合其它药剂。例如所述联合治疗可以包括本发明抗硬骨素抗体和至少一种其它抗炎症或抗骨质疏松剂。可以用于联合治疗中的治疗剂实例在下面关于本发明抗体用途的小节中更详细地描述。优选在生理pH下配制该组合物。
本文所用的“可药用载体”包括生理相容的任何和所有溶剂、分散剂、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。所述载体应当适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮施与(例如通过注射或输注)。取决于施与途径，活性化合物(即抗体、免疫缀合物或双特异性分子)可以包被在材料中，以保护化合物不受可能失活该化合物的酸和其它自然条件的影响。
本发明药物化合物可以包括一种或多种可药用盐。“可药用盐”指保持了亲本化合物所期望的生物活性并且不赋予任何不期望的毒理学作用的盐(参见Berge，S.M.等人，1977，J.Pharm.Sci.，66：1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些从诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等无毒无机酸以及诸如脂肪族的单和二羧酸、苯取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族酸和芳香族磺酸等无毒有机酸衍生的盐。碱加成盐包括从诸如钠、钾、镁、钙等碱土金属，以及从诸如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二羟乙基胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒有机胺类衍生的盐。
本发明的药物组合物还可以包括可药用抗氧化剂。可药用抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油可溶的抗氧化剂，诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙需的来自上面列举的那些的其它成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，无菌粉末的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，该方法从其先前无菌过滤过的溶液中产生活性成分和任何其它所需成分的粉末。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于受治疗的受试者、具体施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，以百分比计，该量将为约0.01％至约99％活性成分、约0.1％至约70％，或约1％至约30％活性成分与可药用载体组合。
调节剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施与单一大丸剂(single bolus)，可以随时间施与几个分份剂量，或者可以根据治疗情况的紧迫性成比例地减小或增加剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以容易施与和剂量统一。如本文所用的剂量单位形式指适宜作为待治疗受试者的单一剂量的物理上分散的单位；每个单位含有预定量的活性成分，所述量经计算以与所需的药物载体结合产生所希望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格由如下决定并且直接依赖于：活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果，以及在配制该活性化合物用于治疗个体的敏感性时本领域固有的限制。
对于施与抗体，剂量在大约0.0001至100mg/kg宿主体重、并且更通常为0.01至5mg/kg宿主体重的范围。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重、或者在1至10mg/kg的范围。示例性治疗方案采取每周施与一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或者每3-6个月一次。本发明抗硬骨素抗体的剂量方案包括经静脉内施与1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中使用下列剂量方案之一来给予抗体：每四周一次进行六次给药、然后每三个月一次；每三周一次；3mg/kg体重一次、然后1mg/kg体重每三周一次。
在一些方法中，同时或顺次施与两种或多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在这种情况下，施与的每种抗体的剂量都在所示范围内。抗体通常多次施与。两个单剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每三月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过检测患者中针对靶抗原的抗体的血液水平来指示。在一些方法中，调整剂量来实现大约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中为约25-300μg/ml。
备选地，抗体可以以持续释放制剂来施与，在这种情况下，需要较低频率的施用。剂量和频率依赖于抗体在患者中的半寿期而不同。一般而言，人抗体显示最长的半寿期、然后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施与的剂量和频率可以依赖于治疗是预防性或治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以相对稀的间隔施与相对低的剂量。一些患者在其余生持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量，直至疾病的进展得到降低或终止、或者直到患者显示部分或完全的疾病症状改善。此后，可以给患者施与预防方案。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，从而获得对特定患者、组合物和施用模式而言可以有效完成期望治疗反应、但对患者无毒的活性成分的量。所选剂量水平依赖于多种药物代谢动力学因素，包括采用的特定本发明组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施与时间、采用的特定化合物的排泄率、治疗持续时间、与采用的特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康、以及先前的治疗史等医疗领域熟知的因素。
“治疗有效剂量的”本发明抗硬骨素抗体可以导致疾病症状的严重性下降、无疾病症状期的频率和持续时间的增加、或者预防由于疾病困扰导致的损害或残疾。
本发明的组合物可以通过一种或多种施与途径使用本领域已知的一种或多种不同方法来施与。如熟练技术人员将理解的，施与途径和/或模式依赖于期望结果而不同。本发明抗体的施与途径包括静脉内的、肌内的、皮内的、腹膜内的、皮下的、脊髓的或其它肠胃外的施与途径，例如通过注射或输注。本文所用词语“肠胃外的施用”表示肠道和局部施与之外的施与模式，通常通过注射进行，并且包括但不限于静脉内的、肌内的、动脉内的、鞘膜内的、囊内的、眶内的、心内的、皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的、硬脑膜外的、以及胸骨内的注射和输注。
备选地，本发明的抗体可以通过非肠胃外的途径施与，诸如局部的、表皮的或粘膜的施与途径，例如鼻内的、经口的、阴道的、经直肠的、舌下的、或局部的。
活性化合物可以用避免化合物快速释放的载体制备，诸如控释制剂，包括埋植剂、经皮的贴片和微囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多制备此类制剂的方法都获得了专利，或者通常为本领域技术人员已知。参见，例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，纽约，1978。
治疗性组合物可以用本领域已知的医疗装置来施与。例如，在一个实施方案中，本发明的治疗性组合物可以用无针头皮下注射装置来施与，其中所述装置诸如美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中所示的装置。可用于本发明的公知的埋植剂和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其显示以可控速率分发药物的可植入性微输注泵；美国专利号4,486,194，其显示通过皮肤施与药物的治疗性装置；美国专利号4,447,233，其显示以精确输注速率呈递药物的医疗输注泵；美国专利号4,447,224，其显示用于持续递送药物的、可变流量的可植入的输注装置；美国专利号4,439,196，其显示具有多室区间的渗透性药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其中显示渗透性药物递送系统。这些专利引入本文作为参考。本领域技术人员公知许多其它的此类埋植剂、递送系统和模块。
在某些实施方案中，可以将本发明的人单克隆抗体配制以确保在体内的适当分布。例如，血-脑屏障(BBB)排除了许多高亲水的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够穿过BBB(如需要的话)，可以将它们配制在例如脂质体中。制备脂质体的方法参见例如美国专利4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可以包含一个或多个可以选择性转运进入特定细胞或器官中、并因此可以增强靶向药物递送的结构部分(参见，例如V.V.Ranade，1989J.Cline Pharmacol.29：685)。示例性靶向部分包括叶酸盐或生物素(参见例如Low等人的美国专利5,416,016)、甘露糖苷(Umezawa等，1988Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)、抗体(P.G.Bloeman等，1995FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，1995Antimicrob.Agents Chernother.39：180)、表面活性剂A蛋白受体(Briscoe等，1995Am.J.Physiol.1233：134)、p120(Schreier等，1994J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen，1994FEBSLett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler，1994Imrnunomethods 4：273。
本发明的用途和方法
本发明的抗体具有体外和体内的诊断和治疗用途。例如，这些分子可以施用于在培养中(例如体外或体内)或在受试者中(例如体内)的细胞来治疗、预防或诊断多种病症。如本文所用，术语“受试者”旨在包括人和非人的动物。非人的动物包括所有脊柱动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行类动物。
该方法尤其适合治疗、预防或诊断硬骨素相关疾病和/或异常骨矿质密度疾病，例如骨质疏松症。
本发明还提供了用于增加骨矿质含量和/或矿质密度的方法。本发明的组合物还可用于改善矫形外科过程、牙科过程、移植外科、关节置换、骨嫁接、骨整容外科和骨修复(诸如骨折愈合、骨不连合愈合、连接迟缓愈合)以及面部重建的结果。可在该过程、置换、嫁接、手术或修复之前、期间和/或之后施与一种或多种组合物。
如本文所使用的，“硬骨素相关病症”包括其中骨矿质密度(BMD)相对于健康受试者不正常和/或病理上低的病症。由低BMD和/或骨易碎性表征的疾病包括但不限于：原发性和继发性骨质疏松症、骨质减少、骨软化、成骨不全(OI)、缺血性坏死(骨坏死)、骨折和植入物愈合(牙种植体和髋植入物)、由于其它病症的骨丧失(例如，与HIV感染、癌症和关节炎相关)。其它“硬骨素相关病症”包括但不限于：类风湿性关节炎、骨关节炎、关节炎，以及溶骨性病变的形成和/或存在。
如本文所使用的，“硬骨素相关病症”包括与异常的硬骨素水平相关或由其表征的疾病。这些包括癌症和骨质疏松病症(例如，骨质疏松或骨质减少)，其中的一些与本文定义的“硬骨素相关病症”重叠。硬骨素相关癌症可包括骨髓瘤(例如，伴随溶骨性病变的多发性骨髓瘤)、乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤、肝细胞癌、上皮癌、食道癌、脑癌、肺癌、前列腺癌或胰癌，及其任何转移瘤。
“硬骨素相关病症”还可包括至少由硬骨素在肾脏和在心血管中表达而引起的肾病及心血管疾病。所述病症包括但不限于诸如以下的肾病：肾小球疾病(例如，急性和慢性肾小球性肾炎、急进性肾小球性肾炎、肾病综合征、局灶增生性肾小球肾炎、与全身疾病相关的肾小球损害，所述全身疾病诸如系统性红斑狼疮、古德帕斯彻氏综合征、多发性骨髓瘤、糖尿病、多囊肾病、瘤形成、镰刀形红细胞病，以及慢性炎症)、肾小管疾病(例如，急性肾小管坏死和急性肾衰竭、多囊肾病、髓质海绵肾、髓质囊性病、肾原性糖尿病，以及肾小管性酸中毒)、小管间质性疾病(例如，肾盂肾炎、药和毒素诱导的小管间质性肾炎、高钙性肾病，以及低钾血症性肾病)、急性和急进性肾衰竭、慢性肾衰竭、肾结石、痛风、血管疾病(例如，高血压和肾硬化、微血管病性溶血性贫血、动脉粥样硬化栓塞肾病、扩散皮层的坏死以及肾梗塞)，或肿瘤(例如，肾细胞癌和肾胚细胞瘤)。
所述疾病还包括但不限于诸如以下的心血管疾病：缺血性心脏病(例如，心绞痛、心肌梗死，以及慢性缺血性心脏病)、高血压心脏病、肺心病、心脏瓣膜病(例如，风湿热和风湿性心脏病、心内膜炎、二尖瓣脱垂以及主动脉瓣狭窄)、先天性心脏病(例如，瓣和血管堵塞性损害、房或室中隔缺损、以及久存性动脉导管)，或心肌病(例如，心肌炎、充血型心肌病，以及肥厚型心肌病)。
当将抗硬骨素抗体与另一试剂一起施与时，该两者可以任一顺序(即顺次)或同时施与。
根据本发明的一个进一步的实施方案，可将本发明的抗体作为其它治疗的附加物或佐药应用，所述其它治疗例如使用骨吸收抑制剂(例如在骨质疏松治疗中)的治疗，尤其是应用以下的治疗：钙，降钙素或其类似物或衍生物，例如鲑鱼、鳗鱼或人降钙素，钙受体拮抗剂(calcilytics)，calcimimetics(例如，cinacalcet)，类固醇激素，例如雌激素，部分雌激素激动剂或雌激素-孕酮联合，SERM(选择性雌激素受体调节剂)例如雷洛昔芬、拉索昔芬、bazedoxifene、阿佐昔芬、FC1271、替勃龙
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SARM(选择性雄激素受体调节剂)，RANKL抗体(诸如denosumab)，组蛋白酶K抑制剂，维生素D或其类似物或PTH，PTH片段或PTH衍生物，例如PTH(1-84)(诸如PreosTM)、PTH(1-34)(诸如ForteoTM)、PTH(1-36)、PTH(1-38)、PTH(1-31)NH2或PTS 893。根据另一实施方案，可与另一目前的骨质疏松治疗方法联合应用本发明的抗体，所述方法包括双膦酸盐(例如，FosamaxTM(阿伦膦酸盐)、ActonelTM(利塞膦酸钠)、BonvivaTM(伊班膦酸)、ZometaTM(唑来膦酸)、AclastaTM/ReclastTM(唑来膦酸)、奥帕膦酸盐、奈立膦酸盐、替鲁膦酸钠片、骨膦)，他汀类药物，合成代谢类固醇、镧和锶盐和氟化钠。
在一个特定实施方案中，可将本发明的抗体与LRP4调节剂联合施与，所述LRP4调节剂即调节LRP4表达或活性的试剂，例如LRP4中和抗体。
在另一个特定实施方案中，可将本发明的抗体与DKK1调节剂联合施与，所述DKK1调节剂即干扰或中和DKK1介导的对Wnt信号传导的拮抗作用的试剂，例如DKK1中和抗体。
因此，本发明还提供了本发明的抗体或功能蛋白和(i)唑来膦酸，(ii)抗DKK1抗体，(iii)阿伦膦酸盐，(iv)抗LRP4抗体，(v)hPTH和/或(vi)甲状旁腺激素释放剂(calcilytics)在制备治疗由硬骨素介导的或与升高水平的硬骨素相关的病理病症的药物中的用途。
在另一实施方案中，本发明还提供了本发明的抗体或功能蛋白在制备治疗由硬骨素介导的或与升高水平的硬骨素相关的病理病症的药物中的用途，其中该药物与(i)唑来膦酸，(ii)抗DKK1抗体，(iii)阿伦膦酸盐，(iv)抗LRP4抗体，(v)hPTH和/或(vi)甲状旁腺激素释放剂(calcilytics)联合使用。
在另一实施方案中，本发明还提供了(i)唑来膦酸，(ii)抗DKK1抗体，(iii)阿伦膦酸盐，(iv)抗LRP4抗体，(v)hPTH和/或(vi)甲状旁腺激素释放剂(calcilytics)在制备治疗由硬骨素介导的或与升高水平的硬骨素相关的病理病症的药物中的用途，其中该药物与本发明的抗体或功能蛋白联合使用。
在另一实施方案中，本发明还提供了本发明的抗体或功能蛋白在制备治疗由硬骨素介导的或与升高水平的硬骨素相关的病理病症的药物中的用途，其中所述患者已预先施与了(i)唑来膦酸，(ii)抗DKK1抗体，(iii)阿伦膦酸盐，(iv)抗LRP4抗体，(v)hPTH和/或(vi)甲状旁腺激素释放剂(calcilytics)。
在另一实施方案中，本发明还提供了(i)唑来膦酸，(ii)抗DKK1抗体，(iii)阿伦膦酸盐，(iv)抗LRP4抗体，(v)hPTH和/或(vi)甲状旁腺激素释放剂(calcilytics)在制备治疗由硬骨素介导的或与升高水平的硬骨素相关的病理病症的药物中的用途，其中所述患者已预先施与了本发明的抗体或功能蛋白。
在上述联合的一个实施方案中，所述hPTH是hPTH(1-34)。
在一个实施方案中，本发明的抗体可用于检测硬骨素的水平，或者含有硬骨素的细胞水平。这可以例如，通过将样品(诸如体外样品)和对照样品与抗硬骨素抗体在允许抗体和硬骨素之间形成复合体的条件下接触而完成。检测抗体和硬骨素之间形成的任何复合体并在样品和对照中比较。例如，可以使用本发明的组合物进行本领域公知的标准检测方法，诸如ELISA和流式细胞测试法。
因此，一方面，本发明还提供了检测样品中硬骨素(例如，人硬骨素抗原)的存在，或测量硬骨素的量的方法，其包括使样品、对照样品与本发明的抗体或其特异结合硬骨素的抗原结合部分在允许所述抗体或其部分与硬骨素之间形成复合体的条件下接触。然后检测复合体的形成，其中样品与对照样品相比复合体形成的差异表明在该样品中存在硬骨素。
本发明的范围内还包括试剂盒，其由本发明的组合物(例如，抗体、人抗体和双特异性分子)和使用说明书组成。试剂盒可以还含有至少一种额外试剂，或者一种或多种本发明的额外抗体(例如，具有互补活性的抗体，其结合靶抗原上不同于第一种抗体的表位)。例如，此类试剂盒可包含本发明的抗体或功能蛋白以及以下这些的一种或多种：(i)唑来膦酸，(ii)抗DKK1抗体，(iii)阿伦膦酸盐，(iv)抗LRP4抗体，(v)hPTH和/或(vi)甲状旁腺激素释放剂(calcilytics)。试剂盒通常包括指示该试剂盒内含物预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上提供或试剂盒提供或附随该试剂盒提供的任何书面或录音材料。
已经充分地描述了本发明，通过下面的实施例和权利要求书进一步阐明本发明，所述实施例是说明性的并且不意在进一步限定。本领域技术人员将认识或能够利用常规实验确定本文所述的具体方法的许多等同形式。所述等同形式在本发明和权利要求书的范围内。将整个申请中引用的所有参考文献，包括授权的专利和公布的专利申请的内容通过引用的方式合并入本申请。
实施例
功能测试法
碱性磷酸酶测试法(ALP)
细胞
MC3T31b细胞是MC3T3-JP细胞的一个克隆，其表达OSE2-luc。在应用pcDNA3.1+中的8x-OSE2wt-mOG2luc稳定转染MC3T3-JP(MC3T3-E1小鼠成骨细胞，日本克隆，Jp；由Dr.T.Kokkubo，Novartis，Japan惠赠)后得到这一克隆。
细胞培养
将MC3T3-1b细胞常规地培养于补充有10％胎牛血清(FCS；AmimedCat#2-01F100-I)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco Cat#25030-024)、50IU青霉素/50μg/ml链霉素(Amimed Cat#4-01F00-H)和10mM Hepes(GibcoCat#15630-056)以及0.75mg/ml G418(Gibco Cat#10131-027)的极限必需培养基α(MEMα；Invitrogen，Cat#22561-021)(维持培养基)中。
储存溶液
在DMEM-LG中的10mM抗坏血酸(Wako Pure ChemicalCat#013-12061)，在5mM乙酸中的14nM BMP-2(R&DCat#355-BM-010)，和0.1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma Cat#A-8806)；蒂罗德溶液(Tyrode solution)中的1M β-甘油磷酸盐(Sigma Cat#G9891)；蒂罗德溶液：在1L H2O中9.72g Tyrode盐(Sigma Cat#T2145)和1g NaHCO3，ALP底物缓冲液：25mM甘氨酸和0.5mM MgCl2，pH 10.5；ALP底物溶液：在3.75ml ALP底物缓冲液中的5mg磷酸对硝基苯酯(Sigma 104底物，Sigma Cat#50942-200TAB)，pH 10.5；在ALP底物溶液中的1mM对硝基苯酚(Sigma Cat#104-1)。
测试法：
对于ALP测试法，将MC3T31b细胞培养于测试培养基中(相应于缺乏G418的维持培养基)。如果在72小时后开始诱导，则以3x104个细胞/ml接种在200μl，或如果在96小时后开始诱导，则以2x104个细胞/ml接种。在37℃和5％CO2中温育该板72小时或96小时，然后应用完全培养基(通过给培养基补充10mM b-甘油磷酸盐(bGP)和50μM抗坏血酸(AA))开始诱导。用完全培养基稀释待测试的抗体。以200μl完全培养基的终体积将抗体与BMP-2(0.7nM)和硬骨素(50nM)加入到孔中(一式三份)。对于每一个板，一式三份地包括4个内部对照：溶剂对照(BSA)、BMP-2对照(0.7nM)、BMP-2+硬骨素(BMP-2(0.7nM)和硬骨素(50nM))以及硬骨素对照(50nM)。在37℃和5％CO2中再温育该板72小时。在温育期的终点，通过移除培养基并添加150μl ALP底物溶液(新鲜制备)至每一孔而终止测试。将该板温育3-30分钟。加入100μl 1M NaOH以终止该反应并且使该板在板振荡器(Plateshaker)上振荡。在405nm针对空白读出OD，并以nmol/分钟计算ALP活性。应用50nM硬骨素以达到至少70％抑制BMP-2诱导的ALP产生[0.7nM BMP-2]。
WNT-测试法
建立这一测试法以基于硬骨素抑制Wnt1所介导的诱导STF报告基因的能力来测试抗体。
HEK293细胞的转染
在第1天，将HEK293细胞以每孔1.3-1.4x105个细胞的密度接种(以0.5ml体积)在24孔聚D-赖氨酸板(BD-BioCoat#356414)上，接种于含有10％胎牛血清(FCS)、1％L-谷氨酰胺(Gibco，Cat#25030.024)、1％非必需氨基酸(Gibco，cat#11140)、无抗生素的DMEM(Gibco，Cat#61965-026)中。用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Cat#11668-019)在第二天进行转化。对于每一待转化的孔，将以下量的质粒添加到50μl
Figure GPA00001091835000571
(Gibco，Cat#31985-047)的终体积中：对照孔(pcDNA3+，480ng；SuperTopFlash(STF)20ng；phRL-CMV，0.5ng)和Wnt1处理的孔(pcDNA-wnt1，20ng；pcDNA3+，460ng；SuperTopFlash(STF)20ng；phRL-CMV，0.5ng)。
在第二个管中，将1.6μl Lipofectamine 2000稀释于50μl
Figure GPA00001091835000572
中，并在室温温育5分钟。通过将脂质管中的内容物添加到DNA管中混合两个管的内容物，并在室温温育30分钟，以允许形成DNA-脂质复合物。然后均匀地将DNA-脂质复合物(100μl)添加到孔中，并在37℃在5％CO2中温育5小时。在5小时温育的终点，细胞具备了用测试试剂(诸如SOST、抗体等)处理的条件。
建立SOST-剂量依赖抑制
为建立剂量抑制曲线，从160nM开始制备rhSOST在含有10％FCS、1％L-谷氨酰胺和1％非必需氨基酸、无抗生素的DMEM中的系列两倍稀释液。储存的rhSOST的浓度是在含1％FCS的DMEM中的260μg/ml。每一条件常规地一式两份地测试。因此，对于每一条件制备1ml培养基，并且在从孔中移除含有转染混合物的培养基后，将450μl加入到每一孔中。处理时间为18-20小时。在温育的终点，如下进行萤光素酶测试法。
抗SOST抗体的测试
在加入到细胞之前，预先使抗体与SOST混合。为这一目的，制备含有20至30nM rhSOST的DMEM培养基(10％FCS、1％L-谷氨酰胺和1％非必需氨基酸、无抗生素)。然后，将测试抗体的不同稀释液加入到根据实验设计的含有SOST的培养基中。在处理前40分钟制备这些混合物。常规地对每一条件进行一式两份地测试。为此目的，对于每一条件制备1ml培养基，并且在从孔中移除含有转染混合物的培养基后，将450μl加入到每一孔中。处理时间为18-20小时。在温育的终点，如下进行萤光素酶测试法。
萤光素酶测试法
在温育的终点，移除培养基，并加入300μl 1X被动性裂解缓冲液(Passive Lysis Buffer)(Promega，Cat#E194A)，以裂解细胞。然后应用30μl裂解产物使用Dual-Glo Luciferase System(Promega，Cat#E2940)一式两份地测量萤光素酶活性。根据试剂盒中提供的说明书小册子进行该测试法。一般地，使用30μl Dual-Glo萤光素酶(萤火虫萤光素酶，用于STF)以及30μlDual-Glo终止和Glo(海肾(Renilla)萤光素酶；用于转染效率的对照)底物。应用Mithras LB940仪器(Berthold Technologies)测量光信号。
数据计算
计算萤火虫对海肾萤光素酶的比值。通过将无SOST的Wnt1值设置为1来表示终结果。
矿化测试法
细胞
MC3T31b细胞是MC3T3-JP细胞的一个克隆，其表达OSE2-luc。在应用pcDNA3.1+中的8x-OSE2wt-mOG2luc稳定转染MC3T3-JP(MC3T3-E1小鼠成骨细胞，日本克隆，Jp；由Dr.T.Kokkubo，Novartis，Japan惠赠)后得到这一克隆。
细胞培养
将MC3T3-1b细胞常规地培养于补充有10％胎牛血清(FCS；AmimedCat#2-01F100-I)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco Cat#25030-024)、50IU青霉素/50μg/ml链霉素(Amimed Cat#4-01F00-H)和10mM Hepes(GibcoCat#15630-056)以及0.75mg/ml G418(Gibco Cat#10131-027)的极限必需培养基α(MEMα；Invitrogen，Cat#22561-021)(维持培养基)中。
矿化测试法
应用钙试剂盒(Axon Lab，Cat#AXON0012)在MC3T3-1b细胞中确定细胞中基质相关的钙沉积。以6x103个细胞/孔或2x103个细胞/孔接种细胞，以改善在96孔板中的100μl测试培养基(无G418的维持培养基)中的细胞反应性，并且温育3天以达到汇合。然后更换测试培养基，并且加入待测试化合物以及10mM b-甘油磷酸盐(bGP；Sigma Cat#G9891)和50μM抗坏血酸(AA；Wako Pure Chemical Cat#013-12061)。在加入到细胞之前，使硬骨素和待测试的Fab在独立的板中在室温预温育2小时，同时在获得硬骨素-Fab混合物之前，给予测试的96孔板2.1或2.8nM BMP-2(R&DSystems，Cat#355-BM-010)。温育细胞14天，并且每3-4天更换测试培养基。简而言之，在温育终点，用200μl PBS/孔洗涤细胞两次，往每孔加入50μl 0.5M HCl并且在-20℃冷冻板最少24小时。在适当的时间，在室温解冻板2小时，并且将每孔10μl转移至新96孔板。然后加入钙工作液(1∶5)(200μl)，并且在5-30分钟后，在微量板读数器中在595nm处读数。
根据标准曲线将吸光度转化为μg钙，从每一数据孔减去对照孔(抗坏血酸和β-甘油磷酸盐)值，并且将最后的结果表示为BMP-2诱导的矿化％。
SMAD1磷酸化蛋白质印迹法
材料
MC3T3-E1小鼠成骨细胞(日本克隆，由Dr.T.Kokkubo，Novartis，Japan惠赠)
C3H10T1/2细胞(小鼠胚间充质细胞；ATCC，目录号：CCL-226)
SCL非糖基化的，衍生自大肠杆菌(Novartis，PSU5257)
15N SCL非糖基化的，衍生自大肠杆菌(Novartis，PSU11274)
hSOST-APP，糖基化的，衍生自HEK-EBNA(Novartis，BTP11100)
rhSCL，糖基化的，衍生自小鼠骨髓瘤细胞(R&D Systems，目录号：1406-ST/CF)
抗hSOST抗体(R&D Systems，目录号：AF1406)
PhosphoSafe提取试剂(Novagen，目录号：71296-3)
蛋白酶抑制剂Cocktail SetIII(Calbiochem，目录号：539134)
NuPAGE Novex Tris-醋酸盐凝胶7％1.5mm，15孔(Invitrogen，目录号：EA03585)
Tris-醋酸盐SDS电泳缓冲液20x(Invitrogen，目录号：LA0041)
NuPAGE抗氧化剂(Invitrogen，目录号：NP0005)
Immobilon-P转移膜0.45um(Millipore，目录号：IPVH00010)
Wattman色层分析纸(Merck，目录号：3587600)
XCell SureLock Mini-Cell和XCell II印迹组件(Invitrogen)
VersaMax微量板读数器(Bucher)
细胞培养和提取
常规地分别在极限必需培养基α(MEMα；Invitrogen，Cat#22561-021)或含高葡萄糖的DMEM(Invitrogen，Cat#41965-039)中培养MC3T3-E1和C3H10T1/2细胞。所有培养基均补充以10％胎牛血清(FCS；BioConceptCat#2-01F10-I，批次：Z04459P)、2mM L-谷氨酰胺(InvitrogenCat#25030-024)、50IU青霉素/50ug/ml链霉素(InvitrogenCat#15140-122)和10mM Hepes(Invitrogen Cat#15630-056)(维持培养基)。
将细胞接种于6孔板中的维持培养基(3ml/孔)中，并且使其生长直到汇合(1.4x105个MC3T3-1b细胞/孔在第3天达到汇合；1.0x105个C3H10T1/2细胞/孔在第3天达到汇合)。在含有1％FBS的培养基中血清消耗过夜后，由补充以1％FBS、BMP-6(R&D Systems，Cat#507-BP)和待测试物质的新鲜培养基更换培养基。在将它们添加至细胞之前，在室温预温育BMP-6和待测试物质1小时，因为其已被描述为在C3H10T1/2中的磷酸化-Smad 1/3/5(Winkler，EMBO J.，2003，22(23)：6267-76)。当测试抗酯、α生育酚，等等；和金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸，等等。
可以用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)，和其合适的混合物，植物油，诸如橄榄油，和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣材料，在分散液的情况中保持所需颗粒大小，以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。
这些组合物还可以包含佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。预防微生物的出现可以通过同上文的灭菌程序，以及通过引入各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、酚山梨酸等)来确保。组合物中可能还需要包括等渗试剂(诸如糖、氯化钠等)。此外，可以通过加入延缓吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
可药用载体包括无菌水溶液或分散液，和用于临时制备无菌可注射的溶液或分散液的无菌粉末。将此类介质和试剂用于药物活性物质的用途为本领域已知。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则可在本发明药物组合物中应用这些介质和试剂。补充的活性化合物也能掺入到组合物中。
治疗组合物通常在生产和储存条件下必须是无菌和稳定的。组合物可制成适合高药物浓度的溶液、微乳剂、脂质体或其它有序结构。载体可以是溶剂或分散媒介，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如可通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散液的情况下保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。在许多情况下，组合物中可以包括等渗剂(例如糖)、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可以通过在组合物中包括延缓吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来延长可注射组合物的吸收。
无菌注射溶液可以通过在合适溶剂中掺入所需量的活性化合物和所需上述列举成分的一个或组合，接着进行无菌微量过滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体制备分散体，所述载体含有基本分散介质和所硬骨素抗体时，在与0.2nM BMP-6在室温温育1小时和最终添加至汇合细胞之前，将它们与硬骨素在4℃预温育过夜。在适当的处理时间后，用2ml冰冷的PBS洗涤细胞。然后往细胞中加入100μl/孔PhosphoSafe提取试剂和1∶200稀释的蛋白酶抑制剂Cocktail，然后在冰上温育5分钟。从孔中刮离细胞并转移至微离心管。使细胞提取物在冰上保持15分钟，通过每5分钟的涡旋振荡步骤打断。随后，在4℃以16000g离心细胞提取物5分钟。最后，将上清液转移至新鲜微离心管中用于蛋白质测定。
应用BCA蛋白质测试试剂盒根据生产商的说明书确定细胞裂解物中的蛋白质浓度。应用BSA作为标准品。为了变性，将细胞裂解物以1∶2稀释于Laemmli缓冲液(Bio-Rad，Cat#161-0737，含有新添加的β-巯基乙醇(1∶20，Merck，Cat#1.12006))，并且在95℃煮沸5分钟。冷却后，在-20℃储存样本直到以后使用。
蛋白质印迹分析
Smad(H-465)抗体(Santa Cruz，目录号：sc-7153)是兔多克隆IgG，其针对代表人源全长Smad1的氨基酸1-465而产生。其应当识别人源、大鼠来源和小鼠来源的Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和Smad8。磷酸化-Smad1(Ser463/465)/Smad5(Ser463/465)/Smad8(Ser426/428)抗体(CellSignalling，Cat#9511)是兔多克隆IgG，其针对相应于人mad5Ser463/465的周围残基的合成磷酸化肽而产生。只有当Smad1的丝氨酸463和丝氨酸465双磷酸化时，其才能检测Smad1的内源水平；以及只有人、小鼠、大鼠、貂和爪蟾(xenopous)来源的等价位点上磷酸化时，其才能检测Smad5和Smad8的内源水平。该抗体不会与其它Smad-相关蛋白交叉反应。
根据生产商的说明书制备XCell SureLock Mini Cell系统(Invitrogen)。以相等的终体积将蛋白质样品(对于Smad蛋白质印迹分析用2μg蛋白质、对于磷酸化-Smad蛋白质印迹分析用5μg蛋白质)上样至1x电泳缓冲液中的7％NuPAGE Novex Tris-醋酸盐凝胶中。应用SeeBlue Plus2预染色标准品(10μl，1∶10；Invitrogen，目录号LC5925)和MagicMark XP蛋白质印迹蛋白标准品(10μl，1∶100；Invitrogen，Cat#；LC5602)用作分子量标记。恒压(150V)电泳凝胶75分钟。
将印迹衬垫和滤纸浸泡在700ml 1x NuPAGE转移缓冲液中。将PVDF转移膜后显在甲醇中浸泡30秒，然后转移至1x NuPAGE转移缓冲液(Invitrogen，Cat#NP0006，新鲜制备的转移缓冲液∶甲醇10∶1)。用凝胶刀分离凝胶盒板，将一张预浸泡的滤纸置于凝胶的顶部，并小心地移除任何气泡。在赛纶塑料纸(Saran wrap)上翻转板，并且在移除板后，将预浸泡的滤膜置于凝胶上并且移除任何气泡。将第二张预浸泡的滤纸置于顶部并移除任何气泡。将两个经浸泡的编结衬垫放置入Cell II印迹组件的阴极核心中。小心地拿起凝胶/膜三明治并置于印迹衬垫上(凝胶与阴极核心最接近)。最后，将3个预浸泡的印迹衬垫置于膜部件上，并且在顶部加上阳极核心。往印迹组件中灌入1x NuPAGE转移缓冲液，直到覆盖凝胶/膜部件。用650ml去离子水装满外缓冲液室，并且恒压(30V)使蛋白质转移至PVDF膜，进行两小时。
在印迹之后，首先用在PBS中的0.05％吐温20洗涤膜10分钟，然后在室温在25ml SuperBlock T20封闭缓冲液中在温和地振荡下封闭1小时。以在SuperBlock T20封闭缓冲液(Pierce，Cat#37516)中1∶1000的稀释液将一抗(磷酸化-Smad 1/5/8或Smad(H-465))加到膜上，并在振荡下在4℃温育膜过夜。然后用PBS中的0.05％吐温20(Fluka，Cat#93773)洗涤膜3次，历时10分钟，然后在振荡下在室温中用RP缀合的二抗(在SuperBlock T20封闭缓冲液中1∶1000)温育60分钟。至少洗涤3次，每次10分钟，然后将膜用SuperSignal West Femto底物工作液(Pierce，Cat#34095)温育5分钟。最后，将该膜置于塑料袋中，并用Fluor-S MultiImager(Bio-Rad)和摄像机成像。通过比较30秒至5分钟曝光时间的图象，确定了1至2分钟的最佳曝光时间。
数据分析
应用Quantity One(Bio-Rad)测量化学发光活性，并应用XLfit4软件计算EC50值。通过其相应的总Smad信号归一化每一磷酸化-Smad信号。
LRP6/硬骨素ELISA
用100μl/孔的稀释于PBS中的LRP6/Fc(1μg/ml，R&D Systems，Cat#1505-LR)包被未处理的96孔微量滴定板。作为非特异性结合(NSB)的对照，少量孔装有100μl/孔的PBS。用塑料膜覆盖该板并且在室温温育过夜。包被后，用200μl/孔的在PBS中的0.05％吐温20(Fluka，Cat#93773)洗涤板3次，并通过添加300μl/孔的在TBS中的SuperBlock封闭缓冲液(Pierce，Cat#37535)在37℃封闭孔1小时。温育后，移除封闭液并添加100μl/孔的稀释于1％BSA的PBS溶液中的硬骨素(衍生自大肠杆菌，Novartis；1-1000ng/ml)。在室温温育板2小时，然后用200μl/孔的在PBS中的0.05％吐温20洗涤3次。然后加入100μl/孔的稀释于1％BSA的PBS溶液中的抗硬骨素抗体(1μg/ml)，并在室温温育2小时，然后用200μl/孔的在PBS中的0.05％吐温20洗涤3次。最后，加入100μl/孔的稀释于1％BSA(Sigma目录号：A-7888)PBS溶液中的ALP缀合的抗山羊IgG Ab(1∶5000；SigmaCat#A-7888)，在室温历时1小时，然后用200μl/孔的在PBS中的0.05％吐温20洗涤3次。为确定ALP，将100μl/孔的ALP底物(Sigma，Cat#S0942)溶液(每5ml二乙醇胺底物缓冲液1×中1片；Pierce，Cat#34064)加入板中90分钟，并在405nm处测量光密度。
在HEK293细胞中过量表达LRP4
常规地将HEK293细胞(ATCC Cat#CRL-1573)培养于补充有10％FCS(BioConcept Cat#2-01F10-I，lot.Z04459P)、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen Cat#25030-024)、100IU青霉素/100μg/ml链霉素(InvitrogenCat#15140-122)和10mM HEPES(Invitrogen Cat#15630-056)的DMEM/F12(Invitrogen Cat#21331-020)中。将Hek293细胞以5x104个细胞/孔接种于聚D-赖氨酸48孔板中，并温育24小时，然后应用Lipofectamine2000(Invitrogen Cat#11668-019)进行转染。对于每一待转染的孔，如果添加质粒的话，将以下量的质粒加入到25μl
Figure GPA00001091835000631
(Gibco，Cat#31985-047)的终体积中并温和地混合；对于对照孔(pmaxGFP，62.5ng，pcDNA3+，125ng；SuperTopFlash(STF)62.5ng；SV40-驱动的海肾萤光素酶质粒，0.75ng)；对于Wnt1处理孔(pmaxGFP，62.5ng，pcDNA-wnt1，62.5ng；pcDNA3+，62.5ng；SuperTopFlash(STF)62.5ng；SV40-驱动的海肾萤光素酶质粒，0.75ng)，以及对于LRP4-Wnt1处理孔(pcDNA3+-LRP4，62.5ng，pcDNA3+-wnt1，62.5ng；pcDNA3+，62.5ng；SuperTopFlash(STF)62.5ng；SV40-驱动的海肾萤光素酶质粒，0.75ng)。在第二个管中，将0.8μl Lipofectamine 2000稀释于终体积25μl
Figure GPA00001091835000641
中，并在室温温育5分钟。通过将脂质管中的内容物添加到DNA管中混合两个管的内容物，并在室温温育30分钟，以允许形成DNA-脂质复合物。然后均匀地将DNA-脂质复合物(50μl)添加到孔中，并在37℃在5％CO2中温育5小时。在5小时温育的终点，细胞可以用诸如SOST、DKK1(R&D Cat#1096-DK)和抗体等的测试试剂处理20小时。如在“Wnt-测试法”中所描述的那样进行萤光素酶测试，但添加150μl被动裂解缓冲液。
在C28A2细胞中过量表达LRP4
将C28a2细胞(来自Mary Goldring，Harvard Institutes of Medicine，Boston，MA，US)培养于与HEK293(见上述)相同的培养基，但是没有HEPES而补充了非必需氨基酸(Gibco Cat#11140)。将C28a2细胞以1x105个细胞/孔接种在24孔板中的无抗生素培养基中，并温育过夜，然后用Lipofectamine 2000(Invitrogen Cat#11668-019)进行转染。对于每一待转染的孔，将以下量的质粒(总共600ng/孔)添加到50μl
Figure GPA00001091835000642
(Gibco，Cat#31985-047)的终体积中并温和地混合：对于对照孔(SuperTopFlash(STF)100ng；SV40-驱动的海肾萤光素酶质粒，2ng和pcDNA3+，500ng用于补偿)和对于Wnt1处理孔(pcDNA-wnt1质粒，100ng；LRP5质粒，100ng；SuperTopFlash(STF)100ng；SV40-驱动的海肾萤光素酶质粒，2ng和pcDNA3+，300ng)以及对于LRP4-Wnt1处理孔(pcDNA-wnt1质粒，100ng；LRP5质粒，100ng；LRP4质粒，100ng；SuperTopFlash(STF)100ng；SV40-驱动的海肾萤光素酶质粒，2ng和pcDNA3+，200ng)。在第二个管中，将1.6μl Lipofectamine 2000稀释于48.4μl
Figure GPA00001091835000643
中，并在室温温育5分钟。通过将脂质管中的内容物添加到DNA管中混合两个管的内容物，并在室温温育30分钟，以允许形成DNA-脂质复合物。然后均匀地将DNA-脂质复合物(100μl)添加到孔中，并在37℃在5％CO2中温育2小时。在2小时温育的终点，用450μl/孔无抗生素培养基更换转染培养基，并温育细胞24小时。然后用诸如SOST或DKK1(R&DCat#1096-DK)的测试试剂处理细胞20小时。如在“Wnt-测试法”中所描述的那样进行萤光素酶测试。
在HEK293细胞中敲低LRP4
将Wnt1/STF/Renilla Hek293细胞(从用Wnt1表达质粒、SuperTopFlash报告质粒和SV40-驱动的海肾萤光素酶质粒稳定转染的Hek293细胞(ATCC Cat#CRL-1573)得到的稳定克隆)常规地培养于补充有10％FCS(Amimed Cat#2-0F100-I)、2mM L-谷氨酰胺(InvitrogenCat#25030-081)、100IU/ml青霉素/100μg/ml链霉素(GibcoCat#15140-163)、6μg/ml嘌呤霉素(Invitrogen Cat#ant-pr-1)、150μg/mlzeocin(Invitrogen  Cat#45-0430)和150μg/ml潮霉素(InvitrogenCat#10687-010)的DMEM 4500g/L葡萄糖(Invitrogen Cat#41965-035)中。在敲低实验过程中，省去选择性抗生素。将细胞以0.6x105个细胞/孔接种于聚D-赖氨酸24孔板中，并使其贴壁过夜，然后用HiPerFect(QiagenCat#301707)进行LRP4siRNA的转染。所使用的LRP4siRNA的有义和反义序列如下：
LRP4a：TAAATTATCATAAAGTCCTAA/AGGACTTTATGATAATTTATT；(SEQ ID NOs：160/161)
LRP4b：ATAGTGGTTAAATAACTCCAG/GGAGTTATTTAACCACTATTT；(SEQ ID NOs：162/163)
LRP4c：TAAATTCTCGTGATGTGCCAT/GGCACATCACGAGAATTTATT；(SEQ ID NOs：164/165)
LRP4d：TTTCTTATAGCACAGCTGGTT/CCAGCTGTGCTATAAGAAATT；(SEQ ID NOs：166/167)
LRP4e：TAGACCTTTCCATCCACGCTG/GCGTGGATGGAAAGGTCTATT；(SEQ ID NOs：168/169)
对于每一待转染的孔，准备两个eppendorf管，第一个含有0.2μl 20nM的LRP4siRNA之一的储存液或0.1μl 20nM的两种不同LRP4siRNA的储存液(每孔siRNA的终浓度是6.6nM)和50μl Optimem；以及第二管含有3μl HiPerFect和47μl Optimem。将第二管的内容物添加到第一管，短暂地涡旋振荡并且在室温静置10分钟。然后将100μl这一混合物加入各个孔中，并且在37℃在5％CO2中温育细胞30小时。然后，移除转染混合物并且更换为新鲜的无抗生素培养基(450μl/孔)，并再温育24小时。在SOST或DKK1处理前，移除培养基，更换为含有SOST或DKK1(R&D Cat#1096-DK)适当稀释液的无抗生素培养基，并在37℃在5％CO2中温育细胞20小时。如在“Wnt-测试法”中所描述的那样进行萤光素酶的确定。
动物模型
每周两次地给8个月大的雌OF1/IC小鼠(n＝16只/组，Charles River，France)静脉内施与抗硬骨素抗体ANTIBODY A(25mg/kg，h/mIgG2a)(MOR05813)或对照抗体(抗PC-h/mIgG2a)。对照组每天皮下接受100微克/kg PTH(1-34)或PBS载剂。所有动物的治疗持续2.5周。在这一时间点处死一半的动物(n＝8只/组)用于组织形态测定分析。继续处理剩余的动物(n＝8只/组)直至5周。
通过外周定量计算机断层扫描(pQCT)和微计算机断层扫描(微CT)在处理开始时测量动物的胫骨质量和几何结构。根据体重和胫骨总骨矿质密度(如通过pQCT测量的那样)将动物均匀地分配到每组中。在处理2.5周和5周后评估骨矿质密度、质量和几何结构的改变。每周一次地监测体重。在尸体剖检10天和3天之前给在处理2.5周后即处死的动物施与两次荧光染料标记用于标记骨矿化。在尸体剖检时对离体的胫骨、股骨和腰椎进行双能X-线吸收仪(DEXA)测量。固定骨、脱水并包埋用于切片机切片以及骨形成动力学的组织形态测定分析。
处理方案
对照抗体：抗PC-h/mIgG2a，
浓度：2.5mg/ml，施用体积：10ml/kg
载剂：50mM Citrat，140mM NaCl
抗硬骨素抗体：抗SOST-MOR05813，h/mIgG2a，
浓度：2.45mg/ml，施与体积：10ml/kg
载剂：50mM Citrat，140mM NaCl
hPTH(1-34)(Bachem，Bubendorf，Switzerland)100μg/kg
载剂：PBS+BSA 0.1％
处理组：
1同种型对照iv.＝抗PC-mIgG2a
2抗SOST-MOR05813iv.
3载剂对照sc.＝PBS+BSA 0.1％
4hPTH(1-34)sc.
维持条件
将动物以每组4-5只动物关养在25℃，光-暗周期为12:12小时。给它们喂以含有0.8％磷和0.75％钙的标准实验室食物(NAFAG 3893.0.25，Kliba，Basel，Switzerland)。无限制地提供食物和水。
动物福利声明
根据在瑞士巴塞尔城州(Canton of Basel-City，Switzerland)有效的规定进行动物实验。
方法
外周定量计算机断层扫描(pQCT)
在吸入麻醉(异氟烷，2.5％)的情况下侧位放置动物。伸长左腿并固定在这一位置。
在中腓骨头和距胫骨近侧端1.8mm末梢的水平在胫骨近端干骺端中监测横剖面骨质量、密度和几何结构，如应用合适的装配有Oxford 50AMX-光管和0.5mm直径的平行光管的探查扫描所确定的那样。对测量选择以下设置：三维象素大小：0.1x0.1x0.5mm；扫描速度：探查性图象10mm/s；终扫描3mm/s，1区段，轮廓模型1，脱壳模型(peel mode)5；皮层阈值：610mg/cm3，内部阈值610mg/cm3。
微计算机断层扫描(微CT)
在吸入麻醉(异氟烷，2.5％)的情况下侧位放置动物。伸长左腿并固定在这一位置。
应用Scanco vivaCT20(Scanco Medical AG，Switzerland)在左胫骨近端干骺端评估骨松质结构。非等距三维象素具有10.5x10.5x10.5μm的大小。从横剖面图象，通过跟踪其等高线从骨密质描绘骨松质区室的轮廓。在所有其它切片中，基于跟踪限定感兴趣的体积而插入边界。评估了次松质骨区域内(从生长面侧面较低边缘的下面开始)的143个切片。对于结构参数的尺寸评估，应用了370的阈值。
双能X-线吸光测定(DEXA)
在左胫骨、左股骨上以及在腰椎1-4中进行间接体内DEXA测量。应用乙醇(70％)用作软组织模拟物。应用适于测量小动物的规则HologicQDR-1000仪进行测量。应用具有0.9cm直径的平行光管和超高分辨模型(行距0.0254cm，分辨率0.0127cm)。
荧光染料标记：
在尸体剖检前10天使用茜素(20mg/kg，皮下，茜素络合酮，Merck，Dietikon，Switzerland)。
在尸体剖检前3天使用钙荧光素(30mg/kg，皮下，Fluka，Buchs，Switzerland)。
组织学和组织形态测定术
解剖后，将右股骨和腰椎5-6置于Karnovsky固定剂中24小时，在乙醇中在4℃脱水，并包埋在树脂(甲基丙烯酸甲脂)中。应用Microtome 2050Supercut(Reichert Jung，Arnsberg，Germany)，在正面身体中段平面切下一组5μm厚的非连续切片，用于评估基于荧光染料标记的骨形成。应用配以相机(SONY DXC-950P，Tokyo，Japan)和相适应的Quantimet 600软件(Leica，Cambridge，United Kingdom)的Leica DM显微镜(Leica，Heerbrugg，Switzerland)检查切片。每一动物取样一个切片。数码化标本的显微图象并在屏幕上半自动地评估。测量(X200放大)骨周长、单和双标记的骨周长以及标记中间的宽度。计算矿化的周长值(百分比)、矿质覆着率(微米/天)(对骨松质区室中的切面倾斜进行校正)以及每天的骨形成率值(每天的骨形成率/骨周长[微米/天])。在股骨远端干骺端的次松质骨中和在一个腰椎中评估所有参数。耐酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色另一组切片。
在次松质骨中评估每骨表面的破骨细胞表面(％)。
统计分析
结果表示为平均值+/-SEM。应用Student t检验(双尾的；非配对的)进行统计分析。相对于对照(对照抗体或PBS)测试处理(抗硬骨素抗体或hPTH(1-34))的差异，＊，+p＜0.05，＊＊，++p＜0.01。
亲和性确定
应用表面等离子共振(Biacore)确定所选择的抗人硬骨素Fab的亲和性
应用BIAcore 3000仪(BIAcore，Uppsala，Sweden)，用各个Fab系列稀释液与共价固定的抗原硬骨素的结合来确定动力学常数Kon和koff。对于共价抗原固定，应用标准EDC-NHS胺耦联化学。应用1.5-500nM浓度范围的Fab以20μl/分钟的流速在PBS(136mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa2HPO4，1.76mM KH2PO4pH 7.4)中测量动力学。每一浓度的注入时间是1分钟，随后是3分钟的解离期。将2x5μl 10mM甘氨酸pH 1.5用于再生。应用BIA评估软件3.1(BIAcore)拟合所有敏感克(sensograms)。
基于电化学发光(BioVeris)的结合分析，用于在细胞裂解物中测量结合 硬骨素的Fab的亲和性
为测量结合硬骨素的在大肠杆菌裂解液(BEL提取物)中的抗体片段的亲和性，通过BioVeris M-384
Figure GPA00001091835000691
工作站(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)分析结合。
在96孔聚丙烯微量滴定板中进行该实验，将补充有0.5％BSA和0.02％吐温20的PBS用作测试缓冲液。根据供应商的说明书将生物素化的人硬骨素蛋白固定在M-280链亲和素顺磁珠(Dynal)上。每孔加入珠子储存溶液的1∶25稀释液。使100μl稀释的BEL提取物和珠子在摇床上在室温温育过夜。为了检测，应用根据供应商的说明书(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)用BV-tagTM标记的抗人(Fab)’2(Dianova)。
应用上述方法分析随机挑选的克隆。选择得到最高值的克隆用于在溶液平衡滴定中进一步分析。
应用溶液平衡滴定(SET)确定Fab对硬骨素的亲和性
对于KD确定，应用Fab的单体片段(至少90％单体含量，由分析SEC分析；Superdex75，Amersham Pharmacia)。基本上如Haenel等，2005描述的那样进行在溶液中的基于电化学发光(ECL)的亲和性确定和数据评估。在溶液中用不同浓度的(系列3n稀释)未标记的人、小鼠或猕猴(cynomolgus)硬骨素(开始浓度：500pM)平衡Fab(25pM)的恒定量。加入与顺磁珠(M-280链亲和素，Dynal)耦联的生物素化的人硬骨素(0.5μg/ml)和BV-tagTM(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)标记的抗人(Fab)’2抗体(Dianova)，并温育30分钟。随后，通过应用
Figure GPA00001091835000701
384分析仪(BioVeris Europe)的ECL测定来量化未结合的Fab的浓度。
通过基于ECL的高通量亲和性筛选BioVeris测试法鉴定亲和性改良的Fab克隆。在命中选择后，通过同样的方法巩固4个亚克隆。
应用BioVerisTM的受体结合抑制潜能测试法
为进行基于BioVerisTM的结合抑制潜能测试法，根据供应商的说明书将重组人BMP-2与羧酸M-270磁珠(Dynal)直接耦联(NHS/EDC化学)。在96孔聚丙烯微量滴定板(Nunc)中进行这一测试法。在1∶3的稀释步骤中稀释50μl/孔的在测试缓冲液(PBS+1％吐温20(严格)或0.1％吐温20(较不严格)+1％BSA)中的纯化Fab(开始浓度：1000nM)。将50μl/孔的生物素化的人硬骨素(4nM)加入每一Fab稀释液中。在Eppendorf热混合仪(Thermomixer)上在400转/分钟，22℃振荡下温育90分钟后，往每一孔加入25μl BMP-2包被的珠子(2.7E07个珠子/ml)以及1∶500稀释的用BV-tagTM根据供应商的说明书(BioVeris Europe)标记的链亲和素，并温育30分钟(800rpm，22℃)。通过BioVeris M-384
Figure GPA00001091835000702
工作站(BioVerisEurope)进行检测。为测定EC50，应用4-参数对数拟合模型(XLfit，IDBS)。
免疫球蛋白的产生
转化为人IgG1形式和人/小鼠IgG2a形式
为表达全长IgG，将重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域片段从Fab表达载体亚克隆至合适的
Figure GPA00001091835000703
Ig载体：_h_Ig1和嵌合的人/小鼠
Figure GPA00001091835000705
2_h/m_Ig2a。应用限制性酶EcoRI、MfeI、BlpI将VH结构域片段亚克隆至
Figure GPA00001091835000711
_h_IgG1或
Figure GPA00001091835000712
2_h/m_IgG2a，以及应用EcoRV、BsiWI、HpaI将VL结构域片段分别亚克隆至
Figure GPA00001091835000713
_h_Igκ、
Figure GPA00001091835000714
_h_Igλ和
Figure GPA00001091835000715
2_h/m_Igλ载体。
应用限制性酶EcoRI、MfeI和BlpI将VH结构域片段亚克隆至
Figure GPA00001091835000716
_h_IgG1：通过EcoRI/BlpI消化并提取6400bp片段产生载体骨架，而通过用MfeI和BlpI消化及随后纯化产生VH片段(350bp)。通过分别由EcoRI和MfeI消化所产生的相容悬突，以及通过BlpI位点来连接载体和插入片段。由此，破坏了EcoRI和MfeI限制性位点。
应用限制性酶MfeI和BlpI将VH结构域片段亚克隆至
Figure GPA00001091835000717
2_h/m_IgG2a。在这一新产生的IgG载体中，通过其它修饰，由MfeI位点代替了EcoRI位点(其仅允许通过相容悬突亚克隆)，由此允许用MfeI/BlpI消化载体和插入片段。
通过EcoRV和BsiWI位点将VL结构域片段亚克隆至
Figure GPA00001091835000718
_h_Igκ，而应用EcoRV和HpaI亚克隆至
Figure GPA00001091835000719
_h_Igλ和
Figure GPA000010918350007110
2_h/m_Igλ。
人类IgG的瞬时表达和纯化
用等摩尔量的IgG重链和轻链表达载体转染HEK293或HKB11细胞。在转染后4或5天，收获细胞培养上清液。在将上清液的pH调节至pH 8.0并无菌过滤后，使该溶液进行标准蛋白A柱层析(Poros 20A，PEBiosystems)。
实施例1：产生人和猕猴(cyno)重组硬骨素蛋白
将编码包含天然信号肽(aa 1-213，NPL 005002)的人硬骨素前体(GenBank登录号AF326739)的全长cDNA通过插入到限制性位点Asp718和Xba1中而克隆至哺乳动物表达载体pRS5a。在该基因的C端添加蛋白质检测和纯化标签(APP＝EFRH)。
在瞬时6孔板转染测试法中的小量表达验证之后，通过用lipofection转染4个库(每个为1.0x10E6细胞)开始稳定转染库的产生。转染48小时后，通过以100μg/ml的浓度添加抗生素ZeocinTM开始转染子的选择。一旦所有四个库重新正常生长，通过在抗APP HPLC上的分析亲和层析评估重组蛋白质滴度，并且选择产量最高的库(库2)用于适应无血清培养基，并且进一步放大。同时，还应用聚乙烯亚胺作为转染期间的质粒DNA的运载体，以及应用WaveTM生物反应器系统(C20SPS-F，Art.-No.100.001，WaveBiotech)作为培养系统进行10L规模的大规模瞬时表达试验。转染后7-10天收集12-22升细胞培养上清液，并且通过交叉流过滤和膜渗滤浓缩，然后纯化。
通过免疫亲和层析纯化人和猕猴SOST。简而言之，通过交叉流过滤(截止值10kDa)将10-20L组织培养上清液的量浓缩为1-2L并且以2ml/分钟施加于50ml抗APP琼脂糖凝胶柱，所述柱通过将专利的单克隆抗Ab1-40/APP(6E10-A5)与CNBr活化的琼脂糖凝胶4B根据生产商的说明书耦联(10mg抗体/ml树脂)而制得。在用PBS基线洗涤后，用100mM甘氨酸，pH 2.7洗脱中和并无菌过滤。应用计算的吸收系数通过A280确定蛋白质浓度。最后通过SDS-PAGE、N-端测序和LC-MS表征纯化的蛋白。应用1mM磺基-NHS-lc-生物素(Uptima；UP54398A)在37℃在PBS中生物素化经纯化的人SOST的等分试样1小时。然后通过针对PBS的充分透析移除过量的试剂。
大肠杆菌衍生的人SOST
通过重折叠产生His6-PreScission标记的SOST aa24-213(NPL006071，质粒pXI504)和SOST aa24-213(NPL006690，质粒pXI515)。用任一质粒转化大肠杆菌Tuner(DE3)。
应用改良的TB培养基(版本lab 112)在20升规模(V9405)发酵PSU5257批次。应用1mM IPTG在3.90的OD600诱导细胞，并在37℃诱导3小时30分钟。应用连续流离心进行收集，得到重190g的湿细胞沉淀。
在16L补充有15N-标记的氯化铵的最小M9-1培养基中以20升的规模发酵PSU11274批次。一旦达到1.5的OD600，则用1mM IPTG诱导细胞，并在3.3的OD600应用连续流离心收集，得到50g的湿细胞沉淀。
应用Avestin C-50乳化剂将来自上述发酵的湿细胞沉淀裂解于8体积的50mM Tris pH 8.0(含有5mM的每一EDTA、DTT和苄脒-HCl)，并在12000转/分钟离心30分钟。丢弃上清液，将得到的沉淀重悬浮于10体积的裂解缓冲液中，并再次离心。再重复这一步骤3次，随后用含有5mMDTT的Milli-Q水替换裂解缓冲液。在这一条件下再洗涤该沉淀2次。室温将包涵体溶解于8M胍-HCl(含有100mM DTT、50mM Tris pH 8和5mM EDTA)中3-4小时，然后20000转/分钟离心30分钟，过滤通过0.45uM膜。通过用88体积(PSU11274)和92体积(PSU5257)冷冻的重折叠缓冲液(含有0.9M精氨酸-HCl、5mM GSH和0.5mM GSSG pH 8的0.5MTris)快速稀释起始重折叠。在4℃储存该溶液1周。在这一阶段，稍微不同地处理两个制备物，因为需要在完成重折叠之前从PSU5257移除his6-标签。
PSU5257
将稀释的折叠溶液针对1.5体积的50mM Tris pH 8、5mM GSH、0.5mM GSSG渗滤，浓缩2倍，然后稀释回最初的体积。重复3次，之后加入PreScission蛋白酶并将溶液在4℃静置48小时。所有的浓缩/渗滤均应用具有10KDa截止值膜的Pellicon II超滤盒完成。最后，浓缩该溶液10倍。
PSU11274
将稀释的重折叠溶液浓缩10倍。在浓缩前应用LC-MS确认所有4个二硫键的形成。
然后针对2x10体积的50mM醋酸钠pH 5透析两个制备物。在连续过滤通过玻璃棉及3.0μm膜以移除沉淀的蛋白质后，应用SP-SepharoseTM高效阳离子交换层析进行纯化。用透析缓冲液平衡柱，并且随后用在超过20柱体积的相同缓冲液中的0-1M NaCl梯度洗脱。作为具有轻微肩的单一峰洗脱硬骨素，将其丢弃。在PSU5257的情况下，收集主峰，浓缩，应用Superdex 75TM柱进行大小排阻色谱，用50mM Tris、150mM NaCl平衡。对于PSU11274，阳离子交换后直接提供样本。
应用基于非洲绿猴SOST序列(GenBank登录号AF326742)的引物通过RT-PCR扩增猕猴SOST cDNA(cySOST)。5’引物(ATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTTGT)(SEQ ID NO：170)对应于信号肽序列的N端，并且其不在最后分泌的蛋白中；3’引物(AATCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACTAG)(SEQ ID NO：171)对应于在人、非洲绿猴和小鼠中保守的区域。将扩增的片段亚克隆至pcDNA3.1(+)的Bam HI/Eco RI位置，并确认序列。这一质粒进一步用作PCR扩增猕猴-SOST的模板，以添加C端APP标签及attB重组位点，用于最后根据Gateway技术克隆至pDESTRS5a[cySOST-pDESTRS5a]。
通过在WaveTM生物反应器系统中以10L规模大量瞬时转染进行表达，在转染后9天收获并如上述那样纯化。
实施例2：从HuCAL 
Figure GPA00001091835000741
文库产生人硬骨素特异性抗体
通过选择具有高结合亲和性的克隆产生针对人硬骨素蛋白的治疗抗体，将可商购的噬菌体展示文库MorphoSys HuCAL
Figure GPA00001091835000742
文库用作抗体变体蛋白的来源。
HuCAL
Figure GPA00001091835000743
文库是Fab文库(Knappik等，2000)，其中所有的6个CDR都通过合适的突变而多样化，并且其应用了CysDisplayTM技术用于将Fab与噬菌体表面连接(WO01/05950，
Figure GPA00001091835000744
等，2001)。
通过从文库淘选硬骨素特异性抗体来进行选择
为选择识别人硬骨素的抗体，应用了数种淘选策略。
概括起来，将HuCAL
Figure GPA00001091835000745
抗体-噬菌体分为包含不同VH主基因的3个库。
使这些库单个地进行：
a)固相淘选，其中将抗原(人和小鼠硬骨素)直接包被在Maxisorp 96孔微量滴定板(Nunc，Wiesbaden，Germany)上，或
b)捕获及半溶液淘选，其中将抗原(生物素化的硬骨素)分别以噬菌体-抗原复合物捕获在N/A干净片条上；或
c)应用生物素化硬骨素的溶液淘选，其中对于每一淘选库通过链亲和素珠子(Dynabeads M-280；Dynal)捕获噬菌体-抗原复合物。
·通过硬骨素的固相淘选
对于通过硬骨素的第一轮淘选，用300μl(5μg/ml)稀释于PBS中的人硬骨素(在HEK细胞中产生)包被Maxisorp板的孔过夜。在用400μl PBS洗涤两次后，用含有稀释于PBS的5％奶粉的封闭缓冲液温育孔。
在选择之前，在室温使HuCAL
Figure GPA00001091835000751
噬菌体在封闭缓冲液(5％奶粉/PBS，0.5％吐温20)中预吸附2小时，以避免非特异性的抗体选择。
在洗涤(2x400μl PBS)经包被和封闭的Maxisorp板后，将300μl预吸附的噬菌体添加到经包被的孔中，并在室温温育2小时，同时温柔地振荡。这一温育后，在室温用PBS和PBS/0.05％吐温20洗涤10个循环。
通过在室温往每孔添加300μl在10mM Tris/HCl pH 8.0中的20mMDTT，历时10分钟，从而洗脱结合的噬菌体。移走该洗脱液，并添加到15ml生长至0.6-0.8OD600nm的大肠杆菌TG1F+细胞。在37℃无振荡地使噬菌体感染大肠杆菌45分钟。4120xg离心5分钟后，将细菌沉淀分别重悬于600μl 2xYT培养基中，在LB-CG琼脂板上涂板，并在30℃温育过夜。然后从板上刮下克隆，并获得及扩增噬菌体。
以与第一轮选择相同的方式进行第二轮和第三轮选择，唯一的不同在于噬菌体结合之后的洗涤条件更严格。在第二轮选择中，对于某些淘选条件，应用小鼠硬骨素作为抗原以富集小鼠交叉反应性抗体。对于某些淘选条件，包被另一批次的人重组硬骨素(在大肠杆菌中产生)。
·通过硬骨素半溶液淘选
对于这一类淘选，进行了两种不同的方法：捕获半溶液淘选和标准半溶液淘选方案。
具体而言，对于用生物素化硬骨素的捕获半溶液淘选，室温将100μl抗原包被在NeutrAvidin(N/A)干净片条(来自Pierce，活化水平100μl，结合能力15pmol/孔)上2小时。在4℃用200μl Chemiblock封闭该N/A片条过夜，并用PBS洗涤两次。
将经封闭的噬菌体溶液(Chemiblock/0.05％吐温20)添加到经封闭的N/A孔中30分钟，并且再重复这一步骤30分钟，以移除NeutrAvidin结合剂。然后将预清洁的噬菌体转移至固定在N/A干净片条上的生物素化的硬骨素上，用箔密封并在室温及振荡下温育过夜。
第二天，从抗原包被的孔中移除噬菌体溶液并洗涤该孔。
对于标准半溶液淘选，将经封闭的(Chemiblock/0.05％吐温20)、预洁净的噬菌体添加到新的经预封闭的1.5ml反应管中(Chemiblock/0.05％吐温20)，然后添加生物素化的人硬骨素至100nM的终浓度，并在室温及振荡下温育过夜。
第二天，将来自所述1.5ml反应管的噬菌体-抗原溶液添加到新的经封闭的NeutrAvidin片条孔中，并使其在室温结合30分钟，然后洗涤。
对于两种淘选方法，通过在室温往每孔添加300μl在10mM Tris/HClpH 8.0中的20mM DTT，历时10分钟，从而洗脱结合的噬菌体。移走该洗脱液，并添加到15ml生长至0.6-0.8OD600nm的大肠杆菌TG1细胞。在37℃无振荡地使噬菌体感染大肠杆菌45分钟。4120xg离心5分钟后，将细菌沉淀分别重悬于600μl 2xYT培养基中，在LB-CG琼脂板上涂板，并在30℃温育过夜。然后从板上刮下克隆，并获得及扩增噬菌体。
以与第一轮选择相同的方式进行第二轮和第三轮选择，唯一的不同在于噬菌体结合之后的洗涤条件更严格。
·通过硬骨素的溶液淘选
对于这一类型的淘选，用PBS洗涤200μl链亲和素磁珠(DynabeadsM-280；Dynal)一次，并在室温用Chemiblock封闭2小时。在室温及旋转下用Chemiblock封闭500μl噬菌体1小时。针对50μl经封闭的链亲和素磁珠预吸附经封闭的噬菌体两次，每次30分钟。将噬菌体上清液转移至新的经封闭的2ml反应管中，加入不同浓度的人生物素化的硬骨素(参见表5、6和7)，并在室温及旋转下温育1小时。往每一淘选库中加入100μl经封闭的链亲和素磁珠，并在旋转器上温育10分钟。应用颗粒分离器(DynalMPC-E)收集珠子约2.5分钟，并小心地移除溶液。
在洗涤循环(表2)后，通过在室温往每孔添加300μl在10mM Tris/HClpH 8.0中的20mM DTT，历时10分钟，从而洗脱结合的噬菌体。移走该洗脱液，并添加到15ml生长至0.6-0.8OD600nm的大肠杆菌TG1F+细胞。在37℃无振荡地使噬菌体感染大肠杆菌45分钟。4120xg离心5分钟后，将细菌沉淀分别重悬于600μl 2xYT培养基中，在LB-CG琼脂板上涂板，并在30℃温育过夜。然后从板上刮下克隆，并获得及扩增噬菌体。
以与第一轮选择相同的方式进行第二轮和第三轮选择，唯一的不同在于噬菌体结合之后的洗涤条件更严格。在第二和第三轮选择中，对于一些淘选条件，降低了抗原的浓度。
亚克隆并表达所选择的Fab片段
微量表达所选择的Fab片段
为促进快速表达可溶的Fab，通过XbaI和EcoRI从各个展示载体将所选择的HuCAL噬菌体中编码Fab的插入片段亚克隆至大肠杆菌表达载体
Figure GPA00001091835000772
X9_MH(Rauchenberger等，2003)中。在将表达质粒转化至大肠杆菌TG1F-细胞后，将氯霉素抗性单克隆挑选至预装有100μl 2xYT-CG培养基的无菌96孔微量滴定板的孔中，并在37℃培养过夜。将5μl每一大肠杆菌TG-1培养物转移至新鲜的无菌96孔微量滴定板中，所述微量滴定板每孔预装有100μl补充有34μg/ml氯霉素和0.1％葡萄糖的2xYT培养基。在微板振荡器上以400rpm振荡及30℃温育该微量滴定板，直到该培养物轻微混浊(～2-4小时)，具有～0.5的OD600nm。往这些表达板中每孔加入20μl补充有34μg/ml氯霉素和3mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)的2xYT培养基(终浓度：0.5mM IPTG)，用可透气带密封微量滴定板，并且在400rpm振荡下在30℃温育过夜。
产生全细胞裂解产物(BEL提取物)：往表达板的每一孔中加入40μlBEL缓冲液，并在微量滴定板振荡器(400rpm)上在22℃温育1小时。
在大肠杆菌中表达和纯化
Figure GPA00001091835000773
-Fab抗体
在摇瓶培养中应用750ml补充有34μg/ml氯霉素的2xYT培养基更大规模地在大肠杆菌TG1 F-细胞中表达由
Figure GPA00001091835000774
X9_Fab_MH编码的Fab片段。在30℃振荡培养物直到OD600nm达到0.5。通过添加0.75mMIPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导Fab表达，并在30℃再培养20小时。收集细胞，用溶菌酶裂解，并将Fab片段分离至Ni-NTA层析。通过具有标定标准品的大小排阻色谱法(SEC)确定表观分子量。通过UV-分光测光法(Krebs等，2001)确定浓度。
实施例2：硬骨素特异性抗体的鉴定
用于通过直接包被的硬骨素检测结合硬骨素的Fab的酶联免疫吸附测 定法(ELISA)
在4℃用20μl在PBS(pH 7.4)中的2.5μg/ml抗原(人硬骨素-在HEK细胞中产生，人硬骨素-在大肠杆菌中产生，以及小鼠硬骨素)包被Maxisorp(Nunc，Rochester，NY，USA)384孔板过夜。
在室温用含有5％奶粉的PBS/0.05％吐温20(PBST)封闭该板1小时。在用PBST洗涤孔后，将稀释于PBS中的BEL-提取物、纯化的HuCAL
Figure GPA00001091835000782
Fab和对照Fab添加到孔中，并在室温温育1小时。为检测一抗，应用了以下二抗：碱性磷酸酶(AP)缀合的AffiniPure F(ab’)2片段，山羊抗人、抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)。为检测AP-缀合物，根据生产商的说明书应用荧光底物，例如AttoPhos(Roche)。在所有的温育步骤之间，用PBST洗涤微量滴定板的孔3次，并且在最后用二抗温育后洗涤5次。在ECAN Spectrafluor板读数器上测量荧光。
应用生物素化的硬骨素的捕获筛选
应用这一类型的ELISA在前述溶液淘选之后筛选HuCAL
Figure GPA00001091835000783
Fab。
用20μl 5μg/ml的稀释于PBS，pH 7.4中的Fd片段特异性绵羊抗人IgG(The Binding Site，Birmingham，UK)包被Maxisorp(Nunc，Rochester，NY，USA)384孔板。
在用3％BSA的TBS溶液、0.05％吐温20在室温封闭2小时后，加入周质提取物或纯化的HuCALFab，并在室温温育1小时。在用PBST洗涤该板5次后，往每一孔加入20μl生物素化的硬骨素用于特异性结合，或加入生物素化的Transferin用于非特特异性结合。
然后，使得生物素化的抗原硬骨素与捕获的
Figure GPA00001091835000791
-Fab片段结合。洗涤后，用与碱性磷酸酶缀合的链亲和素(Zymex)温育。为检测AP-链亲和素，根据生产商的说明书(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)应用荧光底物，例如AttoPhos(Roche)。记录在430nm处激发的在535nm处的荧光发射。
结果：
淘选后，将富集的噬菌体库从
Figure GPA00001091835000792
23文库载体(其允许有效的抗体展示在噬菌体表面)亚克隆至X9_Fab_MH表达载体，其介导可溶Fab的周质表达。挑选单克隆并从这些单克隆表达可溶Fab。在初级筛选中总共分析了～4600个克隆，其通过使直接来自细菌裂解液的Fab与固定在Maxisorp微量滴定板上的人和小鼠硬骨素结合，或通过抗Fd抗体将Fab捕获至maxisorp微量滴定板并随后结合生物素化的人硬骨素，从而完成所述初级筛选。在用碱性磷酸酶标记的抗人(Fab)’2抗体标记，或应用链亲和素碱性磷酸酶后，在ELISA中完成检测。
对在重组硬骨素初级筛选中获得的比背景信号＞5倍的命中物进一步分析与人HEK和大肠杆菌硬骨素和小鼠硬骨素的结合，所述硬骨素是直接包被的或在溶液中使用生物素化的硬骨素。选择识别所有硬骨素衍生物的命中物并测序。
Figure GPA00001091835000794
Fab的表征
应用Biacore测定亲和性
为进一步表征抗硬骨素抗体，测定了对人、小鼠和猕猴硬骨素的亲和性。将重组硬骨素蛋白固定在CM5Biacore芯片上，并以不同浓度在流动相中应用Fab。为可靠地确定单价亲和性，仅应用下述这种Fab批次用于Biacore测量：其在定性大小排阻色谱法中显示出≥90％的单体级分。
在Biacore中测定对重组人、猕猴和小鼠硬骨素的亲和性。对人硬骨素的亲和性为纳摩尔以下至超过500nM，对于猕猴硬骨素的亲和性为纳摩尔以下至约5000nM，以及对于小鼠硬骨素的亲和性为纳摩尔以下至4500nM。
实施例3：应用BioVerisTM装置鉴定抑制硬骨素与固定的BMP-2结合的抗人硬骨素Fab候选者
在基于BioVeris的结合抑制潜能测试法中测试所有产生并纯化的Fab抑制硬骨素与重组人BMP-2结合的能力。测试了两个不同的严格条件(在缓冲液系统中0.1％对1％吐温20)。在严格缓冲条件下，27个Fab中的9个能够抑制硬骨素与固定的BMP-2结合。
实施例4：在MC3T3细胞中逆转硬骨素对BMP-2诱导的ALP产生的抑制
亲本结合剂的IgG转换和IgG的表征
将21个候选者转化为人IgG形式，这是通过分别亚克隆至
Figure GPA00001091835000801
_h_IgG1表达载体和相应的
Figure GPA00001091835000802
_h_Ig载体系列轻链构建体而完成的。通过瞬时转染HEK293或HKB11细胞进行表达，从细胞培养物上清液中纯化全长免疫球蛋白。纯化后通过与固定的人、小鼠和猕猴硬骨素的ELISA评估IgG1的功能。
在初级生物测试法中的IgG
在ALP测试法中滴定和测试所有经纯化的hIgG。该测试法就BMP-2硬骨素抑制而言是可靠的，但是所选择的候选者并不能在所有实验中均显示出硬骨素抑制(测试与测试的活性差异，板与板的差异，在一式三份孔内的高差异)。因此仅有IgG的活性排序是可能的。
实施例5：通过LCDR3和HCDR2盒的平行交换进行所选择的抗硬骨素Fab的亲和性成熟
在ALP测试法中对IgG的测试结果仅允许排序。从这一排序中高风险地选择了4个Fab用于亲和性成熟。选择所有的候选者以优化为在L-CDR3和H-CDR2中的单一榜样(lead)候选者。
为了增加所述4个选定的抗体片段的亲和性和生物学活性，通过应用定向诱变的盒诱变(Virnekas等，1994)平行地优化LCDR3和HCDR2区，由此保持构架区恒定。在克隆成熟文库之前，通过XbaI/EcoRI限制性位点将所有亲本Fab片段从表达载体
Figure GPA00001091835000803
x9_MH转移至CysDisplayTM成熟载体25。这种载体提供N端与半胱氨酸残基融合的噬菌体蛋白pIII以及与Fd抗体链融合的C端半胱氨酸，由此允许各个Fab片段在噬菌体表面上的二硫键连接展示。
为产生HCDR2文库，切下每一亲本Fab的HCDR2区，并替代以590bp填充序列。这种DNA填充物有利于从双消化载体条带中分离单一消化载体并在成熟淘选过程中减弱高亲和性亲本Fab的背景。在接下来的步骤中，从每个亲本克隆的编码Fab的质粒中切掉所述填充序列并替代以高度多样化的HCDR2成熟盒。
平行地，将4个亲本克隆的LCDR3的5区域替代以高度多样化的LCDR3成熟盒，不需中间克隆填充序列。
成熟文库的大小为1x107至4x108个克隆，克隆背景低于1％，并且通过测序的质量控制显示了每一文库的高质量。仅有亲本克隆MOR04520的LCDR3文库具有低的大小(＜106)和许多不正确的克隆，并且因此其不包括在成熟淘选中。
对于每一LCDR3和HCDR2成熟文库，制备抗体展示噬菌体并且通过斑点滴定确定噬菌体滴度。
用于亲和性成熟的淘选策略
使来自以下成熟文库的抗体展示噬菌体进行独立的淘选和筛选：
榜样1：MOR04518(L-CDR3成熟)
榜样1：MOR04518(H-CDR2成熟)
榜样2：MOR04520(H-CDR2成熟)
榜样3：MOR04532(L-CDR3成熟)
榜样3：MOR04532(H-CDR2成熟)
榜样4：MOR04799(L-CDR3成熟)
榜样4：MOR04799(H-CDR2成熟)
对于每一榜样文库进行3种不同的淘选。对于每一淘选策略，应用了不同的严格条件。为增加淘选严格性以及为了选择改进的解离速率，进行了深度洗涤以及与纯化的亲本Fab或与可溶重组硬骨素的竞争。在成熟淘选后，将富集的噬菌粒库亚克隆至
Figure GPA00001091835000821
x9_MH表达载体。选择了约2900个单个克隆，并且用IPTG诱导Fab表达。
BioVerisTM亲和性排序和筛选改进的亲和性
为鉴定亲和性改进的硬骨素特异性Fab，稀释～2900个单一克隆的细菌裂解液，并且检查与生物素化人硬骨素结合的Fab，其中所述的生物素化人硬骨素固定在用链亲和素包被的珠子上。用BioVeris工作站分析该结合。给出最高信号的那些克隆表明改进的亲和性，并且因此选择它们用于通过溶液平衡滴定进一步分析。
为这一目的，选择了176个单一克隆并且在BioVeris通过4-点溶液平衡滴定(SET)确定初始亲和性。从这些数据中，选择了24个显示出最佳亲和性的克隆。以mg规模纯化这些Fab。
应用8-点SET测量法和人、小鼠及猕猴硬骨素确定终亲和性。
在初级生物测试法中优化的Fab
在细胞ALP测试法中测试经优化的Fab。它们中的大多数都是没有活性的，并且用某些Fab观察到硬骨素抑制的可变逆转。因此将选择的克隆转化为人/小鼠IgG2a形式，并且在相同的测试法中测试。但是在人/小鼠IgG2a形式中的这些克隆也不能完全逆转硬骨素抑制并且不能达到需要的EC50(＜10nM)标准。最佳的成熟候选者MOR05177(从亲本MOR04518成熟的VL)在50nM Fab或在140-467nM人/小鼠IgG2a时显示出ALP信号的75-85％恢复。
实施例6：在新的初级生物测试法中从亲本和优化的Fab及IgG鉴定抗硬骨素抗体
基于新的出版物(Wu等，JBC 2005，He等，JBC 2005，Bezooyen等，ASBMR 2005，Winkler等JBC 2005)开发了新的功能生物测试法，所述新的出版物显示了硬骨素直接或间接影响Wnt信号。
这一测试法基于硬骨素在HEK293中抑制Wnt1介导的STF活化的能力。
这一测试法中测试了在初始筛选中鉴定的所有Fab和在亲和性成熟中鉴定的所有Fab。显而易见的是成熟Fab增加的亲和性在wnt-1测试法中反映为增加的潜能和效力。
对所有亲本Fab的测试鉴定了两种进一步的抗体作为用于额外亲和性成熟的有希望的模板。图1显示了MOR05813_IgG2λ的活性，MOR05813_IgG2λ是在wnt-1测试法中鉴定的最有效的抗体之一。
实施例7：在其它生物测试法中表征亲本和亲和性成熟的Fab
在矿化测试法中亲本和亲和性成熟的Fab的活性
矿化测试法基于MC3T3细胞形成矿化基质的能力，其表明它们进行成骨分化的能力。在所有测试的BMP-2浓度中，14天后测量到强的矿化(每个孔(96孔形式)中沉积＞1μg钙)。添加增加浓度的硬骨素诱导剂量依赖性的对BMP-2(2.1nM)诱导的矿化作用的抑制(IC50：120nM)(数据未给出)。
图2显示了MOR05813_Fab存在下的矿化实例。该抗体能够使BMP-2诱导的矿化最大恢复至初始反应的80％，而用作阴性对照的抗溶菌酶Fab没有作用。
在LRP6/硬骨素ELISA中亲本和亲和性成熟Fab的活性
LRP6/硬骨素ELISA是基于硬骨素结合LRP6的能力。为进一步表征所产生的Fab，在这一测试法中测试了所选择的Fab和IgG。在存在来自R&D 的抗硬骨素抗体(1000ng/ml＝～7nM)的情况下，与对照相比68％抑制了硬骨素(0.9nM)与LRP6结合(数据未给出)。
MOR05813_IgG2λ在90nM时抑制硬骨素与LRP6的结合达90％，而用作阴性对照的抗溶菌酶IgG对硬骨素与LRP6的结合没有影响(图3)。
在磷酸化-Smad1测试法中亲本和亲和性成熟Fab的活性
磷酸化-Smad1测试法(蛋白质印迹)是基于BMP-6在15分钟内诱导MC3T3-E1细胞中Smad1磷酸化的能力。MOR05318_IgG2λ以115nM的EC50抑制硬骨素对BMP-6诱导的Smad1磷酸化的作用，并且使Smad1磷酸化最大恢复至BMP-6诱导的磷酸化的66％。阴性对照抗溶菌酶IgG(IgG C)没有作用(图4)。
实施例8：新的SOST相互作用配偶体LRP4对抗SOST抗体活性的影响
除了LRP4siRNA e之外，LRP4mRNA敲低没有在缺乏SOST的情况下影响STF活性。然而，其确实降低了SOST抑制STF活性的能力，减少了10％至30％。对于单独(图5)或以不同组合(数据未给出)测试的所有5个siRNA而言都确实如此。在HEK和c28a2supertopflash测试法中，过量表达的LRP4分别使SOST IC50减少了5倍和16倍(图5B和C)。这一效果是特异性的，因为过量表达的LRP4对DKK1IC50没有影响。LRP4(siRNA)敲低降低了SOST对Wnt-1所诱导的STF的抑制作用，而其没有降低DKK1的抑制作用(图5D)。依次地，LRP4通过使MOR05813_IgG2a EC50从17.2nM升高至30nM而降低抗SOST抗体的作用(图5E)。这些数据暗示LRP4使SOST作用的促进剂。
实施例9：新成熟
为增加基于从生物测试法中得到的结果新选择的两个抗体片段的亲和性和生物活性，通过应用直接诱变的盒诱变(Virnekas等，1994)平行地优化LCDR3和HCDR2区域，由此保持构架区恒定。在克隆成熟文库之前，通过XbaI/EcoRI限制性位点将所有亲本Fab片段从表达载体
Figure GPA00001091835000841
x9_MH转移至CysDisplayTM成熟载体25。这种载体提供N端与半胱氨酸残基融合的噬菌体蛋白pIII以及与Fd抗体链融合的C端半胱氨酸，由此允许各个Fab片段在噬菌体表面上的二硫键连接展示。
为产生HCDR2文库，切下每一亲本Fab的HCDR2区，并替代以590bp填充序列。这种DNA填充物有利于从双消化载体条带中分离单一消化载体并在成熟淘选过程中减弱高亲和性亲本Fab的背景。在接下来的步骤中，从每个亲本克隆的编码Fab的质粒中切掉所述填充序列并替代以高度多样化的HCDR2成熟盒。
平行地，将4个亲本克隆的LCDR3的5区域替代以多样化的LCDR3成熟盒，不需中间克隆填充序列。
成熟文库的大小为2x107至2x108个克隆，克隆背景低于1％，并且通过测序的质量控制显示了每一文库的高质量。对于每一LCDR3和HCDR2成熟文库，制备抗体展示噬菌体并且通过斑点滴定确定噬菌体滴度。
额外亲和性成熟的淘选策略
使来自以下成熟文库的抗体展示噬菌体进行独立的淘选和筛选：
榜样1：MOR04525(L-CDR3成熟)
榜样1：MOR04525(H-CDR2成熟)
榜样2：MOR04529(L-CDR3成熟)
榜样2：MOR04529(H-CDR2成熟)
对于每一榜样或库文库进行3种不同的淘选。对于每一淘选策略，应用了不同的严格条件。为增加淘选严格性以及为了选择改进的解离速率，在延长的温育和洗涤期间进行与可溶重组硬骨素蛋白的竞争。
在淘选后，将富集的噬菌粒库亚克隆至
Figure GPA00001091835000851
x9_MH表达载体。选择了约1600个单克隆，并且用IPTG诱导Fab表达。
对于两个亲本Fab的衍生物而言，满足了对人硬骨素＜100pM的亲和性标准。对于两个亲本Fab的衍生物，满足了与猕猴硬骨素和与小鼠硬骨素＜500pM的必须的交叉反应性。在更多克隆中产生的MOR04525具有对所有三个物种更高的亲和性。
实施例10：在体内研究中表征抗硬骨素抗体
每周两次地给8个月大的雌OF1/IC小鼠(n＝16只/组，Charles River，France)静脉内施与抗硬骨素抗体MOR05813(24.5mg/kg，mIgG2a)或同种型对照抗体(抗PC-mIgG2a)。对照组每天皮下地接受100微克/kgPTH(1-34)或载剂(PBS+0.1％BSA)。对于所有的动物持续处理2.5周。在这一时间点处死一半的动物(n＝8只/组)用于组织形态测定分析。这些动物在组织形态测定评估骨形成动态学的尸体剖检之前10天和3天获得荧光染料标记。继续处理剩余的动物(n＝8只/组)直到5周。
监测这些动物骨质量、密度和几何结构的改变。体内外周定量计算机计算机断层扫描[pQCT]证明MOR05177是成年小鼠胫骨近端中的强骨合成代谢剂，其增加骨矿质含量(图6)和密度(图7)。骨合成代谢作用发生在皮质(图8)和网状骨质(图9)的骨区室中。这些数据表明在非成骨细胞中的Wnt信号报告测试法中观察到的MOR05813对硬骨素作用的抑制转化为在体内由于抑制硬骨素而诱导骨形成反应。在小鼠中骨合成代谢反应的幅度与由高剂量hPTH(1-34)诱导的骨合成代谢相当。
微CT分析证实骨小梁容积的增加(图9)主要与骨小梁结构的增厚相关，这与骨合成代谢一致(图10)。
在处理达5周的动物中骨矿质密度进一步增加(图11)。通过DEXA间接体内评估的骨矿质密度在四肢(胫骨、股骨)和轴(腰椎)骨中都增加了(图12-14)。其效果与在每天用100微克/kg hPTH(1-34)处理的阳性对照组中测量的效果相当。
基于组织形态测定荧光染料标记的骨形成动态分析证实骨质量获得是由于四肢(图15)和轴骨(图18)中骨形成率的大量升高。其效果与高剂量PTH(1-34)的效果相当。骨形成率的升高与矿质沉积率(图16)和表面矿化(图17)两者的升高相关。该处理没有增加骨吸收，如通过破骨细胞表面测量证实的那样(图19)。
实施例11：筛选交叉阻断组合硬骨素的本发明抗体的抗体
Biacore交叉阻断测试法
以下一般性地描述了合适的Biacore测试法，其用于测定抗体或其它结合剂是否交叉阻断或能够交叉阻断根据本发明的抗体。应当理解，可应用本文描述的任何硬骨素结合剂来进行该测试法。
根据生产商建议的顺序组装Biacore机器(例如BIAcore 3000)。
可通过常规使用的胺耦联化学(例如，EDC-NHS胺耦联)方式将硬骨素与例如CM5Biacore芯片耦联，以产生硬骨素包被的表面。为获得可测量水平的结合，一般可将200-800共振单位的硬骨素与芯片耦联(这一量给出可测量水平的结合，并且同时容易通过所使用的测试试剂的浓度饱和)。
使硬骨素附着BIAcore芯片的替代方法使通过应用“标记”形式的硬骨素，例如，N端或C端His标记的硬骨素。在该形式中，可将抗His抗体耦联至Biacore芯片，然后可使His标记的硬骨素通过芯片表面并被抗His抗体捕获。
在合适的缓冲液中以化学计量的量(例如，1比1摩尔比)的结合位点混合待评估其彼此交叉阻断能力的两个抗体，以产生测试混合物。所应用的缓冲液一般为在蛋白质化学中通常使用的缓冲液，诸如PBS(136mMNaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4，pH 7.4)。当计算基于结合位点的浓度时，假设抗体的分子量为抗体总分子量除以该抗体上靶(即硬骨素)结合位点的数目。
在测试混合物中每一抗体的浓度应当高到足以保证饱和结合在BIAcore芯片中的硬骨素分子上对该抗体的结合位点。在混合物中的抗体具有相同的摩尔浓度(基于结合而言)并且浓度一般为1.0mM至1.5mM(基于结合位点而言)。
还制备了含有分别的抗体的独立溶液。用于这些独立溶液的缓冲液应当与测试混合物中所用的缓冲液相同，并且浓度也相同。
使测试混合物通过硬骨素包被的BIAcore芯片，并且记录结合。随后通过例如用酸(诸如30mM HCl)处理该芯片约1分钟移除结合的抗体。很重要的是不损坏与芯片结合的硬骨素分子。
然后仅使第一抗体的溶液通过该硬骨素包被的表面并且记录结合。随后，处理该芯片以移除所有结合的抗体，而不损坏与芯片结合的硬骨素，例如通过上述酸处理而完成。
然后仅使第二抗体的溶液通过该硬骨素包被的表面并且记录结合的量。
最大理论结合可定义为每一抗体分别地结合硬骨素的总和。然后将其与测量的抗体混合物的实际结合相比较。如果实际结合比理论结合更低，则该两个抗体彼此交叉阻断。
基于ELISA的交叉阻断测试法
还可通过应用ELISA测试法检测抗硬骨素抗体或另一硬骨素结合剂的交叉阻断。
ELISA测试法的一般原理涉及将抗硬骨素抗体包被在ELISA板的孔上。然后以溶液形式(即没有与ELISA板结合)添加过量的第二、潜在地交叉阻断的抗硬骨素抗体。然后添加限制量的硬骨素至该孔中。
包被在孔上的抗体和溶液中的抗体将竞争结合有限数量的硬骨素分子。然后洗涤板以移除没有结合在包被抗体上的硬骨素，并同时移除第二溶液相抗体，以及在第二溶液相抗体和硬骨素之间形成的任何复合物。然后应用合适的硬骨素检测试剂测量结合的硬骨素的量。溶液中能够交叉阻断包被抗体的抗体将能够使得包被抗体能结合的硬骨素分子数目相对于包被抗体在不存在第二、溶液相抗体的情况下能够结合的硬骨素分子数量减少。
以下对称为Ab-X和Ab-Y的两个抗体更详细地进一步描述这一测试法。在选择Ab-X作为固定抗体的情况下，将其包被在ELISA板的孔上，随后用合适的封闭溶液封闭该板，以最小化随后添加的试剂的非特异性结合。然后将过量的Ab-Y添加到ELISA板上，使得每孔Ab-Y硬骨素结合位点的摩尔数比每孔所用的Ab-X硬骨素结合位点的摩尔数至少高10倍，所述Ab-X是在包被ELISA板期间所使用的。然后加入硬骨素，使得每孔添加的硬骨素的摩尔数比用于包被每孔的Ab-X硬骨素结合位点摩尔数至少低25倍。在合适的温育期间后，洗涤ELISA板并添加硬骨素检测试剂，以测量被包被的抗硬骨素抗体(在这一情况下是Ab-X)特异性结合的硬骨素量。这一测试法的背景信号定义为在用包被抗体(在这一情况下是Ab-X)、第二溶液相抗体(在这一情况下是Ab-Y)、仅用硬骨素缓冲液(即没有硬骨素)和硬骨素检测试剂的孔中得到的信号。该测试法的阳性对照信号定义为在用包被抗体(在这一情况下是Ab-X)、仅用第二溶液相抗体缓冲液(即，没有第二溶液相抗体)、硬骨素和硬骨素检测试剂的孔中得到的信号。需要如此地进行ELISA测试法，以使得具有比背景信号高至少6倍的阳性对照信号。
为避免由于选择哪个抗体用作包被抗体以及哪个抗体用作第二(竞争)抗体所造成的任何人为结果(例如，Ab-X和Ab-Y之间对硬骨素显著不同的亲和性)，需要在两个形式中进行交叉阻断测试法：1)形式1：Ab-X是包被在ELISA板上的抗体，并且Ab-Y是在溶液中的竞争抗体，以及2)形式2：Ab-Y是包被在ELISA板上的抗体，并且Ab-X是在溶液中的竞争抗体。
实施例12：ELISA检测MOR05813_IgG2λ对SOST结合LRP6的影响
LRP6/硬骨素ELISA
用100μl/孔稀释于PBS中的LRP6/Fc(1μg/ml，R&D Systems，Cat#1505-LR)包被未处理的96孔微量滴定板。作为非特异结合(NSB)的对照，少数孔装有100μl/孔的PBS。用塑料膜覆盖该板，并在室温温育过夜。包被后，用200μl/孔的PBS中的0.05％吐温20(Fluka，Cat#93773)洗涤板3次，并通过添加300μl/孔的在TBS中的SuperBlock封闭缓冲液(Pierce，Cat#37535)在37℃封闭孔1小时。温育后，移除封闭溶液，并且添加100μl/孔的稀释于1％BSA的PBS溶液中的硬骨素(大肠杆菌衍生，Novartis；1-1000ng/ml)。在室温温育该板2小时，随后用200μl/孔的在PBS中的0.05％吐温20洗涤3次。然后，加入100μl/孔的稀释于1％BSA的PBS溶液中的抗硬骨素抗体(1μg/ml)，并且在室温温育板2小时，随后用200μl/孔的在PBS中的0.05％吐温20洗涤3次。最后，加入100μl/孔的稀释于1％BSA(Sigma目录号：A-7888)的PBS溶液中的ALP缀合的抗山羊IgGAb(1∶5000；Sigma Cat#A-7888)，在室温历时1小时，然后用200μl/孔的在PBS中的0.05％吐温20洗涤板3次。为测定ALP，往板中加入100μl/孔的ALP底物(Sigma，Cat#S0942)溶液(每5ml二乙醇胺底物缓冲液1x中1片；Pierce，Cat#34064)，历时90分钟，并且在405nm处测量光密度。
在LRP6/硬骨素ELISA中亲本及亲和性成熟Fab的活性
LRP6/硬骨素ELISA是基于硬骨素与LRP6结合的能力。为进一步表征所产生的Fab，在这一测试法中测试了所选择的Fab和IgG。在来自R&D的抗硬骨素抗体的存在下(1000ng/ml＝～7nM)，与对照相比使硬骨素(0.9nM)与LRP6的结合抑制了68％(数据未显示)。MOR05813_IgG2λ在90nM抑制硬骨素与LRP6的结合达90％，而用作阴性对照的抗溶菌酶IgG对硬骨素与LRP6的结合没有影响(图20)。
实施例13：应用MOR05813的共治疗
MOR05813+唑来膦酸
切除9个月大雌性OF1/IC小鼠(n＝10只/组，Charles River，France)的卵巢，以通过减少雌激素而诱导骨丧失，或未受损地保持原样。每周两次地给动物静脉内施与抗硬骨素抗体MOR05813(24mg/kg，h/mIgG2a)或对照抗体(抗PC-h/mIgG2a，原样和OVX对照组)。其它的组接受单次仅施与唑来膦酸(100μg/kg)或与抗硬骨素抗体MOR05813联合地施与。抗体治疗持续3.5周(施与7次)。
在切除卵巢前通过外周定量计算机断层扫描(pQCT)测量动物的胫骨质量和几何结构。根据体重和胫骨总骨矿质密度将动物均匀地分配到组中。在治疗期终点评估骨矿质密度、质量和几何结构的改变。
结果表示为均值+/-SEM。应用RS1(用于Windows的系列1999，Domain Manufacturing Corp.，USA)进行统计分析。对数据进行单向方差分析(ANOVA)。通过Levene F-检验及应用Bonferroni修正的Dunnett检验的组间差异来测试方差等式。测试治疗组与对照抗体治疗的OVX组之间差异的显著性(p＜.05＊，p＜.01＊＊)。
成年小鼠中卵巢切除所诱导的骨丧失可被抗体治疗阻断(图21)。当与单次静脉内注射双膦酸盐化合物唑来膦酸联合使用抗体时，阻断了骨丧失并且诱导了骨增加，如通过骨总矿质含量(图21A)和密度(图21B)的增加，以及皮质厚度(图21C)和骨松质矿质密度(图21D)的增加所表明的那样。
MOR05813+阿伦膦酸盐预治疗
每周两次地给4.5个月大的雌性OF1/IC小鼠(n＝10只/组，CharlesRiver，France)静脉内施与抗硬骨素抗体MOR05813(10mg/kg，h/mIgG2a)或对照抗体(抗PC-h/mIgG2a，原样和OVX对照组)。其它的组在获得对照抗体或抗硬骨素抗体MOR05813之前，接受7周的阿伦膦酸盐预治疗(4μg/kg/天；5天/周)。抗体治疗持续3.5周(施与7次)。
在抗体治疗开始之前通过外周定量计算机断层扫描(pQCT)测量动物的胫骨质量和几何结构。根据体重和胫骨总骨矿质密度将动物均匀地分配到组中。在治疗期终点评估骨矿质密度、质量和几何结构的改变。
结果表示为均值+/-SEM。应用RS1(用于Windows的系列1999，Domain Manufacturing Corp.，USA)进行统计分析。对数据进行单向方差分析(ANOVA)。通过Levene F-检验及应用Bonferroni修正的Dunnett检验的组间差异来测试方差等式。测试阿伦膦酸盐预治疗组与未获得预治疗组之间差异的显著性(p＜.05＊，p＜.01＊＊)。
用双膦酸盐化合物阿伦膦酸盐的长期治疗对抗硬骨素MOR05813的骨合成代谢作用没有负面影响，如通过骨总矿质含量(图22A)和密度(图22B)的增加，以及皮质厚度(图22C)和骨松质矿质密度(图22D)的增加所反映的那样。由于双膦酸盐化合物在施与期间之外持续的抗吸收特性，观察到了总骨矿质含量(图22A)和皮质厚度(图22C)的增加。
MOR05813+DKK1或hPTH
每周两次地给6个月大小的雌性裸小鼠(n＝8只/组)静脉内施与载剂、抗硬骨素抗体MOR05813(10、20和40mg/kg，IgG2)、抗Dkk1抗体(10mg/kg，IgG1)、hPTH(1-34)(100微克/kg)或它们的组合。抗体治疗持续4周(8次施与)。
在治疗之前通过外周定量计算机断层扫描(pQCT)测量动物的胫骨质量和几何结构。根据体重和胫骨总骨矿质密度将动物均匀地分配到组中。在治疗期终点评估骨矿质密度、质量和几何结构的改变。
结果表示为均值+/-SEM。应用RS1(用于Windows的系列1999，Domain Manufacturing Corp.，USA)进行统计分析。对数据进行单向方差分析(ANOVA)。通过Levene F-检验及应用Bonferroni修正的Dunnett检验的组间差异来测试方差等式。对于各组，测试与载剂治疗组的差异显著性(p＜.05＊，p＜.01＊＊)。
施与抗硬骨素MOR05813增加骨合成作用(图23)。与抗Dkk1抗体共治疗导致总骨矿质含量(图23A)和密度(图23B)以及皮质厚度(图23C)的改进的升高，以及骨松质矿质密度的协同升高(图23D)。与hPTH(1-34)共治疗导致所有测量参数的协同升高(图23A-D)。
参考文献
Avsian-Kretchmer O，Hsueh AJ(2004)Comparative genomic analysis ofthe eight-membered ring cystine knot-containing bone morphogeneticprotein antagonists.Mol Endocrinol 18(1)：1-12.
Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.，(1998)Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，New York，USA
Balemans W，Ebeling M，Patel N，Van Hul E，Olson P，Dioszegi M，LaczaC，Wuyts W，Van Den Ende J，Willems P，Paes-Alves AF，Hill S，Bueno M，Ramos FJ，Tacconi P，Dikkers FG，Stratakis C，Lindpaintner K，Vickery B，Foernzler D，Van Hul W.(2001)Increased bone density in sclerosteosis isdue to the deficiency of a novel secreted protein(SOST).Hum Mol Genet.10(5)：537-43
Balemans W，Patel N，Ebeling M，Van Hul E，Wuyts W，Lacza C，DioszegiM，Dikkers FG，Hildering P，Willems PJ，Verheij JB，Lindpaintner K，Vickery B，Foernzler D，Van Hul W.(2002)Identification of a 52kbdeletion downstream of the SOST gene in patients with van Buchemdisease.J Med Gene 39(2)：91-7.
Brunkow ME，Gardner JC，Van Ness J，Paeper BW，Kovacevich BR，ProllS，Skonier JE，Zhao L，Sabo PJ，Fu Y，Alisch RS，Gillett L，Colbert T，Tacconi P，Galas D，Hamersma H，Beighton P，Mulligan J(2001)Bonedysplasia sclerosteosis results from loss of the SOST gene product，a novelcystine knot-containing protein.Am J Hum Genet 68(3)：577-89.
Chen，B.P.，Hai，T.Expression vectors for affinity purification andradiolabeling of proteins using Escherichia coli as host.Gene 139，73-75.1994
Chen，Y.，Wiesmann，C.，Fuh，G.，Li，B.，Christinger，H.W.，McKay，P.，deVos，A.M.，Lowman，H.B.(1999).Selection and analysis of an optimizedanti-VEGF antibody：crystal structure of an affinity-matured Fab incomplex with antigen.J.Mol.Biol.293，865-881
Gardner JC，van Bezooijen RL，Mervis B，Hamdy NA，Lowik CW，Hamersma H，Beighton P，Papapoulos SE.(2005)Bone mineral density insclerosteosis；affected individuals and gene carriers.J Clin EndocrinolMetab 90(12)：6392-5
Haenel C，Satzger M，Della Ducata D，Ostendorp R and Brocks B(2005)Chraterization of High Affinity Antibodies byElectrochemiluminescence-Based Equilibrium Titration.Anal Biochem339(1)：182-4
Keller H，Kneissel M.(2005)SOST is a target gene for PTH in bone.Bone37(2)：148-58.
Knappik，A.，Ge，L.，Honegger，A.，Pack，P.，Fischer，M.，Wellnhofer，G.，Hoess，A.，Wolle，J.，Pluckthun ，A.，and Virnekas，B.(2000).Fully synthetichuman combinatorial antibody libraries()based on modularconsensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides.J MolBiol 296，57-86.
Krebs，B.，Rauchenberger，R.，Reiffert，S.，Rothe，C.，Tesar，M.，Thomassen，E.，Cao，M.，Dreier，T.，Fischer，D.，Hoss，A.，Inge，L.，Knappik，A.，Marget，M.，Pack，P.，Meng，X.Q.，Schier，R.，Sohlemann，P.，Winter，J.，Wolle，J.，and  Kretzschmar，T.(2001).High-throughput generation andengineering of recombinant human antibodies.J Immunol Methods 254，67-84.
Li X，Zhang Y，Kang H，Liu W，Liu P，Zhang J，Harris SE，Wu D(2005)Sclerostin binds to LRP5/6and antagonizes canonical Wnt signaling.J BiolChem.20；280(20)：19883-7
Figure GPA00001091835000941
，C.(2001).Novel methods for displaying(poly)peptides/proteins onbacteriophage particles via disulfide bonds.WO 01/05950.
Loots GG，Kneissel M，Keller H，Baptist M，Chang J，Collette NM，Ovcharenko D，Plajzer-Frick I，Rubin EM.(2005)Genomic deletion of along-range bone enhancer misregulates sclerostin in Van Buchem disease.Genome Res 15(7)：928-35
Low，N.M.，Holliger，P.，Winter，G.(1996).Mimicking somatichypermutation：affinity maturation of antibodies displayed onbacteriophage using a bacterial mutator strain.J.Mol.Biol.260，359-368
Rauchenberger，R.，Borges，E.，Thomassen-Wolf，E.，Rom，E.，Adar，R.，Yaniv，Y.，Malka，M.，Chumakov，I.，Kotzer，S.，Resnitzky，D.，Knappik，A.，Reiffert，S.，Prassler，J.，Jury，K.，Waldherr，D.，Bauer，S.，Kretzschmar，T.，Yayon，A.，and Rothe，C.(2003).Human combinatorial Fab Library yieldingspecific and functional antibodies against the human fibroblast growthfactor receptor 3.J Biol Chem.278(40)：38194-38205
Semenov MV，He X.LRP5 mutations linked to high bone mass diseasescause reduced LRP5 binding and inhibition by SOST.J Biol Chem.2006Oct 19；
van Bezooijen RL，Svensson JP，Eefting D，Visser A，van der Horst G，Karperien M，Quax PH，Vrieling H，Papapoulos SE，Ten Dijke P，LowikCW(2006)Wnt but not BMP Signaling is Involved in the Inhibitory Actionof Sclerostin on BMP-Stimulated Bone Formation.
Virnekas B，Ge L，Pluckthun A，Schneider KC，Wellnhofer G，MoroneySE(1994)Trinucleotide phosphoramidites：ideal reagents for the synthesisof mixed oligonucleotides for random mutagenesis.Nucleic Acids Res.22(25)：5600-5607
J Bone Miner Res 2006 Oct 10 Winkler DG，Sutherland MK，GeogheganJC，Yu C，Hayes T，Skonier JE，Shpektor D，Jonas M，Kovacevich BR，Staehling-Hampton K，Appleby M，Brunkow ME，Latham JA.(2003)Osteocyte control of bone formation via sclerostin，a novel BMPantagonist.
EMBO J 22(23)：6267-76 Winkler DG，Sutherland MS，Ojala E，TurcottE，Geoghegan JC，Shpektor D，Skonier JE，Yu C，Latham JA(2005)Sclerostin inhibition of Wnt-3a-induced C3H10T1/2cell differentiation isindirect and mediated by bone morphogenetic proteins.J Biol Chem.28；280(4)：2498-502
序列表
<110>诺瓦提斯公司
<120>抗硬骨素抗体的组合物和应用方法
<130>52279
<160>171
<170>PatentIn版本3.2
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1               5
<210>32
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>32
Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr
1               5
<210>33
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>33
Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr
1               5
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>34
Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Phe Tyr Val His
1               5                   10
<210>35
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>35
Trp Val Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Gly
            20
<210>36
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>36
Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Phe Tyr Val His
1               5                  10
<210>37
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>37
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser
1               5                  10
<210>38
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>38
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser
1               5                  10
<210>39
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>39
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser
1               5                  10
<210>40
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>40
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser
1               5                  10
<210>41
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>41
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser
1               5                   10
<210>42
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>42
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser
1               5                   10
<210>43
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>43
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser
1               5                   10
<210>44
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>44
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser
1               5                   10
<210>45
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>45
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser
1               5                  10
<210>46
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>46
Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser
1               5                   10
<210>47
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>47
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser
1               5                   10
<210>48
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>48
Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser
1               5                   10
<210>49
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>49
Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser
1               5                   10
<210>50
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>50
Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser
1               5                   10
<210>51
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>51
Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser
1               5                  10
<210>52
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>52
Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser
1               5                   10
<210>53
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>53
Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser
1               5                   10
<210>54
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>54
Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser
1               5                   10
<210>55
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>55
Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser
1               5                   10
<210>56
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>56
Gly Ser Trp Ala Gly Ser Ser Gly Ser Tyr
1               5                   10
<210>57
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>57
Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr
1               5                   10
<210>58
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>58
Ala Ser Trp Thr Gly Val Glu Pro Asp Tyr
1               5                   10
<210>59
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>59
Gln Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Glu
1               5                   10
<210>60
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>60
Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr
1               5                   10
<210>61
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>61
Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr
1               5                   10
<210>62
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>62
Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr
1               5                   10
<210>63
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>63
Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr
1               5                   10
<210>64
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>64
Ser Thr Tyr Asp Gly Pro Gly Leu Ser Glu
1               5                   10
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>65
Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr
1               5                   10
<210>66
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>66
Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr
1               5                   10
<210>67
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>67
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Phe Ile Ser Gly Asp Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Thr Phe Met His Gly His Leu Gly Gly Gly Leu Ser Met Asp
            100                 105                 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>68
<211>117
<212>PRT
<213>智人
<400>68
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
            20                  25                  30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>69
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>69
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Phe Ile Ser Gly Asp Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Thr Phe Met His Gly His Leu Gly Gly Gly Leu Ser Met Asp
            100                 105                 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>70
<211>117
<212>PRT
<213>智人
<400>70
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
            20                  25                  30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>71
<211>116
<212>PRT
<213>智人
<400>71
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
            20                  25                  30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Thr Gly Val His Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210>72
<211>116
<212>PRT
<213>智人
<400>72
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
            20                  25                  30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Gly Asn Trp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210>73
<211>116
<212>PRT
<213>智人
<400>73
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
            20                  25                  30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Thr Thr His Gln Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210>74
<211>116
<212>PRT
<213>智人
<400>74
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
            20                  25                  30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Thr Asn Arg Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210>75
<211>117
<212>PRT
<213>智人
<400>75
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
            20                  25                  30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>76
<211>116
<212>PRT
<213>智人
<400>76
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
            20                  25                  30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Thr Pro Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210>77
<211>116
<212>PRT
<213>智人
<400>77
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His
            20                  25                  30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Val Ile Thr Pro Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210>78
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>78
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Phe Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Ala Gly Ser Ser Gly Ser
                85                  90                  95
Tyr Val Phe Gly Gly Arg Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
            100                 105                 110
<210>79
<211>113
<212>PRT
<213>智人
<400>79
Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile
            20                  25                  30
Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Glu Ser
                85                  90                  95
Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
Gln
<210>80
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>80
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Phe Tyr Val
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Thr Gly Val Glu Pro Asp
                85                  90                  95
Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
            100                 105                 110
<210>81
<211>113
<212>PRT
<213>智人
<400>81
Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile
            20                  25                  30
Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Gly Ser
                85                  90                  95
Tyr Leu Ser Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
Gln
<210>82
<211>113
<212>PRT
<213>智人
<400>82
Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile
            20                  25                  30
Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gl n Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Glu Ser
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Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
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Gln
<210>83
<211>113
<212>PRT
<213>智人
<400>83
Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile
            20                  25                  30
Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
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    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Glu Ser
                85                  90                  95
Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
Gln
<210>84
<211>113
<212>PRT
<213>智人
<400>84
Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile
            20                  25                  30
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Glu Ser
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Gln
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<211>113
<212>PRT
<213>智人
<400>85
Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile
            20                  25                  30
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Gln
<210>86
<211>113
<212>PRT
<213>智人
<400>86
Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile
            20                  25                  30
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Gln
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<211>113
<212>PRT
<213>智人
<400>87
Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile
            20                  25                  30
Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
    50                  55                  60
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Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
Gln
<210>88
<211>113
<212>PRT
<213>智人
<400>88
Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Asp Gly Pro
                85                  90                  95
Gly Leu Ser Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
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Gln
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<211>372
<212>DNA
<213>智人
<400>89
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<211>351
<212>DNA
<213>智人
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<212>DNA
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<213>智人
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<213>智人
<400>99
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<213>智人
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<400>108
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<400>109
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<211>339
<212>DNA
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<400>110
gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc   60
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<210>111
<211>469
<212>PRT
<213>智人
<400>111
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Phe Ile Ser Gly Asp Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Phe Met His Gly His Leu Gly Gly Gly Leu
        115                 120                 125
Ser Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
145                 150                 155                 160
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
                165                 170                 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
            180                 185                 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
        195                 200                 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr
    210                 215                 220
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr
225                 230                 235                 240
Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
                245                 250                 255
Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
            260                 265                 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
        275                 280                 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
    290                 295                 300
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Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu
                325                 330                 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala
            340                 345                 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
        355                 360                 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
    370                 375                 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385                 390                 395                 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
                405                 410                 415
Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
            420                 425                 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
        435                 440                 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210>112
<211>462
<212>PRT
<213>智人
<400>112
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
        115                 120                 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
    130                 135                 140
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
145                 150                 155                 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
                165                 170                 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
            180                 185                 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
        195                 200                 205
Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
    210                 215                 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val
225                 230                 235                 240
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
                245                 250                 255
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            260                 265                 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
        275                 280                 285
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
    290                 295                 300
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Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
        435                 440                 445
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<212>PRT
<213>智人
<400>113
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
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Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
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<212>PRT
<213>智人
<400>114
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
        115                 120                 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
    130                 135                 140
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
145                 150                 155                 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
                165                 170                 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
            180                 185                 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
        195                 200                 205
Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
    210                 215                 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val
225                 230                 235                 240
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
                245                 250                 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
            260                 265                 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
        275                 280                 285
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
    290                 295                 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val
305                 310                 315                 320
Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
                325                 330                 335
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
            340                 345                 350
Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
        355                 360                 365
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
    370                 375                 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
385                 390                 395                 400
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp
                405                 410                 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
            420                 425                 430
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
        435                 440                 445
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>115
<211>461
<212>PRT
<213>智人
<400>115
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Val Thr Gly Val His Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
                85                  90                  95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
    130                 135                 140
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
                165                 170                 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
            180                 185                 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
        195                 200                 205
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
    210                 215                 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu
225                 230                 235                 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
                245                 250                 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
            260                 265                 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
        275                 280                 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
    290                 295                 300
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                325                 330                 335
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            340                 345                 350
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        355                 360                 365
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    370                 375                 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385                 390                 395                 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
                405                 410                 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
            420                 425                 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        435                 440                 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>116
<211>461
<212>PRT
<213>智人
<400>116
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Val Ile Gly Asn Trp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
                85                  90                  95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
    130                 135                 140
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
                165                 170                 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
            180                 185                 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
        195                 200                 205
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
    210                 215                 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu
225                 230                 235                 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
                245                 250                 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
            260                 265                 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
        275                 280                 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
    290                 295                 300
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                325                 330                 335
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            340                 345                 350
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        355                 360                 365
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    370                 375                 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385                 390                 395                 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
                405                 410                 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
            420                 425                 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        435                 440                 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>117
<211>461
<212>PRT
<213>智人
<400>117
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Val Thr Thr His Gln Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
                85                  90                  95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
    130                 135                 140
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
                165                 170                 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
            180                 185                 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
        195                 200                 205
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
    210                 215                 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu
225                 230                 235                 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
                245                 250                 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
            260                 265                 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
        275                 280                 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
    290                 295                 300
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                325                 330                 335
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            340                 345                 350
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        355                 360                 365
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    370                 375                 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385                 390                 395                 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
                405                 410                 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
            420                 425                 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        435                 440                 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>118
<211>465
<212>PRT
<213>智人
<400>118
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Ala Thr Asn Arg Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
                85                  90                  95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
    130                 135                 140
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
145                 150                 155                 160
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
                165                 170                 175
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
            180                 185                 190
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
        195                 200                 205
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
    210                 215                 220
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
225                 230                 235                 240
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
                245                 250                 255
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
            260                 265                 270
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
        275                 280                 285
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
    290                 295                 300
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
305                 310                 315                 320
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
                325                 330                 335
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
            340                 345                 350
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
        355                 360                 365
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
    370                 375                 380
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
385                 390                 395                 400
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
                405                 410                 415
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
            420                 425                 430
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
        435                 440                 445
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
    450                 455                 460
Lys
465
<210>119
<211>462
<212>PRT
<213>智人
<400>119
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
        115                 120                 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
    130                 135                 140
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
145                 150                 155                 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
                165                 170                 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
            180                 185                 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
        195                 200                 205
Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
    210                 215                 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val
225                 230                 235                 240
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
                245                 250                 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
            260                 265                 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
        275                 280                 285
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
    290                 295                 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val
305                 310                 315                 320
Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
                325                 330                 335
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
            340                 345                 350
Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
        355                 360                 365
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
    370                 375                 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
385                 390                 395                 400
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp
                405                 410                 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
            420                 425                 430
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
        435                 440                 445
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>120
<211>461
<212>PRT
<213>智人
<400>120
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Val Ile Thr Pro Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
                85                  90                  95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
    130                 135                 140
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
                165                 170                 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
            180                 185                 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
        195                 200                 205
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
    210                 215                 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu
225                 230                 235                 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
                245                 250                 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
            260                 265                 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
        275                 280                 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
    290                 295                 300
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                325                 330                 335
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            340                 345                 350
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        355                 360                 365
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    370                 375                 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385                 390                 395                 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
                405                 410                 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
            420                 425                 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        435                 440                 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>121
<211>461
<212>PRT
<213>智人
<400>121
Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1               5                   10                  15
Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Val Ile Thr Pro Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
                85                  90                  95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
    130                 135                 140
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
                165                 170                 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
            180                 185                 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
        195                 200                 205
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
    210                 215                 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu
225                 230                 235                 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
                245                 250                 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
            260                 265                 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
        275                 280                 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
    290                 295                 300
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
                325                 330                 335
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
            340                 345                 350
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
        355                 360                 365
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
    370                 375                 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385                 390                 395                 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
                405                 410                 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
            420                 425                 430
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
        435                 440                 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>122
<211>130
<212>PRT
<213>智人
<400>122
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val
            20                  25                  30
Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly
        35                  40                  45
Ser Phe Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
    50                  55                  60
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly
                85                  90                  95
Thr Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Ala Gly
            100                 105                 110
Ser Ser Gly Ser Tyr Val Phe Gly Gly Arg Thr Lys Leu Thr Val Leu
       115                 120                 125
Gly Gln
    130
<210>123
<211>237
<212>PRT
<213>智人
<400>123
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly
            20                  25                  30
Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp
        35                  40                  45
Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser
            100                 105                 110
Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp
                165                 170                 175
Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln
            180                 185                 190
Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu
        195                 200                 205
Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly
    210                 215                 220
Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230                 235
<210>124
<211>234
<212>PRT
<213>智人
<400>124
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val
            20                  25                  30
Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly
        35                  40                  45
Ser Phe Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
    50                  55                  60
Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly
                85                  90                  95
Thr Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Thr Gly
            100                 105                 110
Val Glu Pro Asp Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
        115                 120                 125
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
    130                 135                 140
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
145                 150                 155                 160
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
                165                 170                 175
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
            180                 185                 190
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
        195                 200                 205
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
    210                 215                 220
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230
<210>125
<211>237
<212>PRT
<213>智人
<400>125
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly
            20                  25                  30
Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp
        35                  40                  45
Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
            100                 105                 110
Tyr Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp
                165                 170                 175
Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln
            180                 185                 190
Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu
        195                 200                 205
Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly
    210                 215                 220
Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230                 235
<210>126
<211>237
<212>PRT
<213>智人
<400>126
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly
            20                  25                  30
Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp
        35                  40                  45
Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser
            100                 105                 110
Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp
                165                 170                 175
Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln
            180                 185                 190
Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu
        195                 200                 205
Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly
    210                 215                 220
Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230                 235
<210>127
<211>237
<212>PRT
<213>智人
<400>127
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly
            20                  25                  30
Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp
        35                  40                  45
Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser
            100                 105                 110
Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro
    130                 135                 140
Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp
                165                 170                 175
Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln
            180                 185                 190
Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu
        195                 200                 205
Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly
    210                 215                 220
Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230                 235
<210>128
<211>237
<212>PRT
<213>智人
<400>128
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly
            20                  25                  30
Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp
        35                  40                  45
Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
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Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser
            100                 105                 110
Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
        115                 120                 125
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Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
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Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp
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Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln
            180                 185                 190
Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu
        195                 200                 205
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    210                 215                 220
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225                 230                 235
<210>129
<211>237
<212>PRT
<213>智人
<400>129
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly
            20                  25                  30
Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp
        35                  40                  45
Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
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                85                  90                  95
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            100                 105                 110
Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
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Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro
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225                 230                 235
<210>130
<211>237
<212>PRT
<213>智人
<400>130
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly
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Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp
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    50                  55                  60
Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
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            100                 105                 110
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225                 230                 235
<210>131
<211>237
<212>PRT
<213>智人
<400>131
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly
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Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp
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    50                  55                  60
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Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
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145                 150                 155                 160
Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp
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Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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<210>132
<211>237
<212>PRT
<213>智人
<400>132
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Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val
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                165                 170                 175
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Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu
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    210                 215                 220
Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230                 235
<210>133
<211>1410
<212>DNA
<213>智人
<400>133
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ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct   540
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc   600
agcagcgtgg tgacagtgcc ctccagcaac ttcggcaccc agacctacac ctgcaacgta   660
gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacagttg agcgcaaatg ttgtgtcgag   720
tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa   780
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg   840
agccacgaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat   900
gccaagacaa agccacggga ggagcagttc aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc   960
accgttgtgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa  1020
ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aagggcagcc ccgagaacca  1080
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc  1140
tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag  1200
ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc cttcttcctc  1260
tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc  1320
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt  1380
aaatga                                                             1386
<210>143
<211>1386
<212>DNA
<213>智人
<400>143
atggcttggg tgtggacctt gccattcctg atggcagctg cccaaagtgt ccaggcccag    60
gtgcagctgg tcgagagcgg cggagggctg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc   120
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<212>DNA
<213>智人
<400>144
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<210>145
<211>714
<212>DNA
<213>智人
<400>145
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<210>146
<211>705
<212>DNA
<213>智人
<400>146
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<212>DNA
<213>智人
<400>147
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<212>DNA
<213>智人
<400>149
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<212>DNA
<213>智人
<400>150
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<210>151
<211>714
<212>DNA
<213>智人
<400>151
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<211>714
<212>DNA
<213>智人
<400>152
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<211>714
<212>DNA
<213>智人
<400>153
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<212>DNA
<213>智人
<400>154
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<210>155
<211>213
<212>PRT
<213>智人
<400>155
Met Gln Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu Val Cys Leu Leu Val His Thr
1               5                   10                  15
Ala Phe Arg Val Val Glu Gly Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp
            20                  25                  30
Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro
        35                  40                  45
Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg
    50                  55                  60
Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys
65                  70                  75                  80
Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser
                85                  90                  95
Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala
            100                 105                 110
Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser
        115                 120                 125
Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val
    130                 135                 140
Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg
145                 150                 155                 160
Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gln
                165                 170                 175
Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gln Lys Gly
            180                 185                 190
Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ala Lys Ala Asn Gln Ala Glu
        195                 200                 205
Leu Glu Asn Ala Tyr
    210
<210>156
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>156
Ala Arg Leu Leu Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg
1               5                   10
<210>157
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>157
Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu Thr Arg Phe His
1               5                   10                  15
<210>158
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>蛋白接头序列
<400>158
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1               5                   10
<210>159
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>蛋白接头序列
<400>159
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly
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<213>人工的
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<220>
<223>RT-PCR引物
<400>171
aatcaggccg agctggagaa cgcctactag    30

Claims (41)

1.分离的抗体，其与硬骨素多肽结合，包含
(a)重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成；
(b)重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2由SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成；
(c)重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3由SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列组成；
(d)轻链可变区CDR1，所述轻链可变区CDR1由SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列组成；
(e)轻链可变区CDR2，所述轻链可变区CDR2由SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列组成；和
(f)轻链可变区CDR3，所述轻链可变区CDR3由SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1的抗体，其包含SEQ ID NO：70所示的VH多肽氨基酸序列。
3.根据权利要求1的抗体，其包含SEQ ID NO：81所示的VL多肽氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项的抗体，其中所述抗体以小于1nM的KD与所述硬骨素多肽结合。
5.根据权利要求1-3任一项的抗体，其中所述抗体在基于细胞的Wnt信号测试法中阻断硬骨素的抑制作用。
6.根据权利要求1-3任一项的抗体，其中所述抗体具有小于100nM的IC50，这是在硬骨素的存在下在HEK293细胞系中的基于细胞的Wnt信号测试法中测量的。
7.根据权利要求1-3任一项的抗体，其中所述抗体在基于细胞的矿化测试法中阻断硬骨素的抑制作用。
8.根据权利要求1-3任一项的抗体，其中所述抗体具有小于500nM的IC50，这是在硬骨素的存在下在MC3T3细胞中的BMP2诱导的矿化测试法中测量的。
9.根据权利要求1-3任一项的抗体，其中所述抗体在溶液抑制测试法中抑制LRP6/硬骨素相互作用。
10.根据权利要求1-3任一项的抗体，其中所述抗体具有小于10nM的IC50，这是在LRP6/硬骨素ELISA中测量的。
11.根据权利要求1-3任一项的抗体，其中所述抗体在基于细胞的功能测试法中阻断硬骨素对BMP6诱导的Smad1磷酸化的抑制作用。
12.根据权利要求1-3任一项的抗体，其中所述抗体具有小于500nM的IC50，这是在硬骨素的存在下在MC3T3-E1细胞系中的BMP6 Smad1磷酸化测试法中测量的。
13.根据权利要求1-3任一项的抗体，其包含与SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH多肽氨基酸序列。
14.根据权利要求1-3任一项的抗体，其包含与SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL多肽氨基酸序列。
15.根据权利要求1-3任一项的抗体，其包含由SEQ ID NO：81所示氨基酸序列组成的VL多肽序列和由SEQ ID NO：70所示氨基酸序列组成的VH多肽序列。
16.根据权利要求1-3任一项的抗体，其包含与SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的全长重链氨基酸序列。
17.根据权利要求1-3任一项的抗体，其包含与SEQ ID NO：125所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的全长轻链氨基酸序列。
18.根据权利要求1-3任一项的抗体，其包含SEQ ID NO：114所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：125所示的轻链氨基酸序列。
19.根据权利要求1-3任一项的抗体，其包含与SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH多肽氨基酸序列和与SEQ IDNO：81所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL多肽氨基酸序列。
20.包含权利要求1-3任一项的抗体的药物组合物。
21.根据权利要求20的药物组合物，其与一种或多种可药用赋形剂、稀释剂或载体联合。
22.根据权利要求21的药物组合物，其包含至少一种其它活性组分。
23.编码权利要求1的抗体的分离的多核苷酸序列。
24.包含权利要求23中一个或多个多核苷酸序列的克隆载体或表达载体。
25.根据权利要求24的载体，其中所述载体包含核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH多肽氨基酸序列和与SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL多肽氨基酸序列。
26.包含权利要求25的载体的宿主细胞。
27.生产抗体的方法，其包括
(a)在培养条件下培养包含克隆载体或表达载体的宿主细胞，其中所述克隆载体或表达载体含有编码权利要求1-3任一项的抗体的多核苷酸，所述培养条件为(i)其中所述载体表达所述多核苷酸；和(ii)其中所述多核苷酸翻译成所述抗体；
并且(b)分离所述抗体。
28.包含权利要求1-3任一项的抗体的诊断试剂盒。
29.鉴定表达硬骨素的细胞或组织的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与权利要求1-3任一项的抗体接触，其中所述抗体还包含可检测标记。
30.根据权利要求29的方法，其中所述标记是放射性的、磁的或化学发光的标记。
31.根据权利要求30的方法，其中所述化学发光的标记是荧光标记；所述磁的标记是顺磁的标记。
32.权利要求1-3任一项所述的抗体的用途，用于制备在哺乳动物中增加骨形成、骨矿质密度、骨矿质含量、骨质量、骨品质和骨强度中的至少一种的药物。
33.根据权利要求32的用途，其中所述患者患有选自原发性和继发性骨质疏松症、骨质减少、骨软化、成骨不全、缺血性坏死、骨折愈合、植入物愈合和由于其它病症的骨丧失的疾病或病症。
34.根据权利要求33的用途，其中所述骨丧失是由于HIV感染、癌症或关节炎引起的骨丧失。
35.根据权利要求32的用途，其中所述抗体包含与SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH多肽氨基酸序列。
36.根据权利要求32的用途，其中所述抗体包含与SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL多肽氨基酸序列。
37.根据权利要求32的用途，其中所述抗体包含与SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH多肽氨基酸序列和与SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL多肽氨基酸序列。
38.根据权利要求37的用途，其中所述抗体包含SEQ ID NO：70所示的VH多肽氨基酸序列和SEQ ID NO：81所示的VL多肽氨基酸序列。
39.根据权利要求32的用途，其中所述药物与选自双膦酸盐、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素释放剂、阿伦膦酸盐、LRP4中和抗体和DKK-1中和抗体的额外药剂联合使用。
40.根据权利要求39的用途，其中所述额外药剂是双膦酸盐，并且其中所述双膦酸盐是唑来膦酸。
41.根据权利要求39的用途，其中所述额外药剂是甲状旁腺激素，并且其中所述甲状旁腺激素是hPTH(1-34)。
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Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040009535A1 (en) * 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
BRPI9915679B8 (pt) 1998-11-27 2021-05-25 Darwin Discovery Ltd composições e métodos para aumentar a mineralização óssea
RS20050934A (en) 2003-06-16 2008-04-04 Celltech R. & D. Inc., Antibodies specific for sclerostin and methods fo r increasing bone mineralization
US8461155B2 (en) * 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
WO2007053577A2 (en) 2005-10-31 2007-05-10 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
US7723477B2 (en) * 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
EP3345607B1 (en) 2006-12-29 2022-10-26 Ossifi-Mab LLC Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
US8680019B2 (en) * 2007-08-10 2014-03-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin Type III binding-domain libraries
US8470966B2 (en) 2007-08-10 2013-06-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
JP5781762B2 (ja) * 2007-08-10 2015-09-24 プロテリックス、インク ユニバーサルｉｉｉ型フィブロネクチン結合ドメインのライブラリ
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
TWI489993B (zh) * 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
CA2705923A1 (en) 2007-11-16 2009-05-22 Nuvelo, Inc. Antibodies to lrp6
DK2708559T3 (en) 2008-04-11 2018-06-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of repeatedly binding two or more antigen molecules
RU2579897C2 (ru) * 2008-09-26 2016-04-10 Онкомед Фармасьютикалс, Инк. Агенты, связывающие рецептор "frizzled", и их применение
AR075715A1 (es) * 2009-03-05 2011-04-20 Novartis Ag Formulacion de anticuerpo liofilizado
WO2010115932A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Novartis Ag Combination for the treatment of bone loss
WO2011037791A1 (en) * 2009-09-25 2011-03-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Antagonists of pcsk9
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
KR20130043102A (ko) 2010-04-01 2013-04-29 온코메드 파마슈티칼스, 인크. 프리즐드-결합 작용제 및 그의 용도
AU2011237679B2 (en) 2010-04-07 2014-11-06 Abbvie Inc. TNF-alpha binding proteins
BR112012026098A2 (pt) * 2010-04-16 2016-11-22 Novartis Ag métodos e composições para melhorar a osseointegração de implante.
US9290573B2 (en) 2010-05-06 2016-03-22 Novartis Ag Therapeutic low density lipoprotein-related protein 6 (LRP6) multivalent antibodies
JP2013527762A (ja) 2010-05-06 2013-07-04 ノバルティス アーゲー 治療的低密度リポタンパク質関連タンパク質６（ｌｒｐ６）抗体の組成物および使用方法
DK3195880T3 (da) 2010-05-14 2020-03-02 Amgen Inc Højkoncentrerede anti-sclerostin-antistofformuleringer
US9403882B2 (en) 2010-06-07 2016-08-02 Joshua Rabbani Sulfation of Wnt pathway proteins
US9493541B2 (en) 2010-06-07 2016-11-15 Joshua Rabbani Antibodies specific for sulfated sclerostin
US11167011B2 (en) 2010-06-07 2021-11-09 Enzo Biochem, Inc. Methods for treating bone loss using sclerostin peptides
US9617323B2 (en) 2010-06-07 2017-04-11 Joshua Rabbani Sulfonated sclerostin, antibodies, epitopes and methods for identification and use therefor
WO2012028683A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Novartis Ag Antibody gel system for sustained drug delivery
WO2012058393A2 (en) * 2010-10-27 2012-05-03 Amgen Inc. Dkk1 antibodies and methods of use
EP3111954B1 (en) 2010-11-05 2019-04-03 Novartis Ag Methods of treating ankylosing spondylitis using anti-il-17 antibodies
TWI812066B (zh) 2010-11-30 2023-08-11 日商中外製藥股份有限公司 具有鈣依存性的抗原結合能力之抗體
MX2013010011A (es) 2011-03-01 2014-10-24 Amgen Inc Agentes de unión biespecífica.
MA35009B1 (fr) 2011-03-25 2014-04-03 Amgen Inc Cristaux d'anticorps anti-sclérotine et formulations de ceux-ci
ES2685479T3 (es) 2011-04-19 2018-10-09 Amgen Inc. Método para el tratamiento de la osteoporosis
EP2702408A1 (en) 2011-04-29 2014-03-05 Novartis AG Methods of treating squamous cell carcinoma related applications
SI2739311T1 (en) * 2011-08-04 2018-07-31 Amgen Inc. Method for the treatment of bone defect defects
US10307167B2 (en) 2012-12-14 2019-06-04 Corquest Medical, Inc. Assembly and method for left atrial appendage occlusion
US10314594B2 (en) 2012-12-14 2019-06-11 Corquest Medical, Inc. Assembly and method for left atrial appendage occlusion
US10813630B2 (en) 2011-08-09 2020-10-27 Corquest Medical, Inc. Closure system for atrial wall
CA2853357A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Abbvie Inc. Immunobinders directed against tnf
TW201323441A (zh) 2011-10-24 2013-06-16 Abbvie Inc 抗ｔｎｆ之雙特異性免疫結合物
MX2014004977A (es) * 2011-10-24 2014-09-11 Abbvie Inc Inmunoaglutinantes dirigidos contra esclerostina.
AU2012332263A1 (en) 2011-11-04 2014-05-22 Novartis Ag Low density lipoprotein-related protein 6 (LRP6) - half life extender constructs
JP6363954B2 (ja) 2011-12-28 2018-07-25 アムジエン・インコーポレーテツド 抗スクレロスチン抗体の使用による歯槽骨消失の治療方法
EP3626267A1 (en) * 2012-07-05 2020-03-25 UCB Pharma, S.A. Treatment for bone diseases
AU2013334790A1 (en) 2012-10-23 2015-04-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using Wnt pathway-binding agents
US20140142689A1 (en) 2012-11-21 2014-05-22 Didier De Canniere Device and method of treating heart valve malfunction
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US20150307625A1 (en) * 2012-11-29 2015-10-29 Bayer Healthcare Llc MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ACTIVATED PROTEIN C (aPC)
CN104936618A (zh) 2012-11-29 2015-09-23 拜尔健康护理有限责任公司 针对活化蛋白c的人源化单克隆抗体及其用途
WO2014118705A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Novartis Ag Methods of treating chronic kidney disease-mineral and bone disorder using sclerostin antagonists
CN105073195A (zh) 2013-02-04 2015-11-18 昂科梅德制药有限公司 使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法及对该治疗的监测
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
CA2907422C (en) * 2013-03-20 2021-08-31 Genzyme Corporation Methods for treating osteogenesis imperfecta
WO2014155278A2 (en) 2013-03-26 2014-10-02 Novartis Ag Methods of treating autoimmune diseases using il-17 antagonists
US9566443B2 (en) 2013-11-26 2017-02-14 Corquest Medical, Inc. System for treating heart valve malfunction including mitral regurgitation
WO2015087187A1 (en) * 2013-12-10 2015-06-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-sclerostin antibodies
US9763911B2 (en) 2013-12-12 2017-09-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research Prostacyclin compositions for regulation of fracture repair and bone formation
US10842626B2 (en) 2014-12-09 2020-11-24 Didier De Canniere Intracardiac device to correct mitral regurgitation
MA41142A (fr) * 2014-12-12 2017-10-17 Amgen Inc Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
CA2978976C (en) * 2015-03-13 2024-05-14 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-sclerostin antibody, antigen binding fragment and medical use thereof
US11077187B2 (en) 2015-11-17 2021-08-03 Oklahoma Medical Research Foundation Epitope of optimized humanized monoclonal antibodies against activated protein C and uses thereof
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
EP3496744A1 (en) 2016-08-08 2019-06-19 Amgen Inc. Method of improving connective tissue attachment using anti-sclerostin antibodies
KR20190096409A (ko) * 2016-12-21 2019-08-19 메레오 바이오파마 3 리미티드 불완전 골형성증 치료에서의 항-스클레로스틴 항체의 용도
EA201991514A1 (ru) * 2016-12-21 2019-12-30 Сефалон, Инк. Антитела, которые специфически связываются с ил-15, и их применение
WO2018115879A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Mereo Biopharma 3 Limited Use of anti-sclerostin antibodies in the treatment of osteogenesis imperfecta
WO2018139623A1 (en) * 2017-01-30 2018-08-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-sclerostin antibodies and methods of use
CN108866002A (zh) * 2017-05-12 2018-11-23 上海复旦张江生物医药股份有限公司 用于sost蛋白或抗体筛选的细胞株及其制备方法和应用
KR20200034748A (ko) 2017-07-27 2020-03-31 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드 Sost 항체 약학적 조성물 및 그의 용도
CN107817350B (zh) * 2017-10-26 2019-09-06 成都医学院第一附属医院 一种肺癌筛查试剂盒
SG11202008206TA (en) 2018-03-30 2020-09-29 Amgen Inc C-terminal antibody variants
GB201810746D0 (en) 2018-06-29 2018-08-15 Mereo Biopharma 3 Ltd Use of sclerostin antagonist
JP7425041B2 (ja) 2018-08-10 2024-01-30 アムジエン・インコーポレーテツド 抗体医薬製剤を作製する方法
CN114364694B (zh) * 2019-07-12 2024-05-10 国立大学法人京都大学 靶向usag-1分子的用于牙齿再生治疗的中和抗体
MX2022001805A (es) 2019-08-12 2022-06-08 Amgen Inc Formulaciones de anticuerpos anti-esclerostina.
TR201920272A1 (tr) * 2019-12-15 2021-06-21 Uludamar Altay Dental i̇mplantlar, greft materyalleri̇ ve prf i̇le osseoi̇ntegrasyonun artirilmasi i̇çi̇n bi̇r terapöti̇k kompozi̇syon ve bunun lokal kullanim yöntemleri̇
CN112070678B (zh) * 2020-08-10 2023-04-11 华东交通大学 一种批量蛋白质印迹膜条倾斜矫正和分割方法及系统
KR102472582B1 (ko) * 2020-08-20 2022-11-30 한림대학교 산학협력단 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 진단 및 치료 방법
CN113354724A (zh) * 2021-04-28 2021-09-07 蒋青 骨硬化蛋白及其在制备治疗或预防阿尔兹海默症的相关产品上应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006119107A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Ucb Pharma S.A. Sclerostin binding agents

Family Cites Families (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US6455275B1 (en) 1980-02-25 2002-09-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA construct for producing proteinaceous materials in eucaryotic cells
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
AU612370B2 (en) 1987-05-21 1991-07-11 Micromet Ag Targeted multifunctional proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH059615A (ja) 1991-07-01 1993-01-19 Sumitomo Metal Mining Co Ltd スポンジＣｄの回収方法
ES2313867T3 (es) 1991-12-02 2009-03-16 Medical Research Council Produccion de anticuerpos anti-auto de repertorios de segmentos de anticuerpo expresados en la superficie de fagos.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
EP2192131A1 (en) 1992-08-21 2010-06-02 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
ES2309999T3 (es) 1996-10-28 2008-12-16 University Of Lausanne Metodo para la oligomerizacion de peptidos.
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
WO1998056906A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Thoegersen Hans Christian Trimerising module
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
AU776049B2 (en) 1998-10-09 2004-08-26 United Kingdom Research And Innovation Method for generating diversity
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
BRPI9915679B8 (pt) 1998-11-27 2021-05-25 Darwin Discovery Ltd composições e métodos para aumentar a mineralização óssea
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
KR101155191B1 (ko) 1999-01-15 2012-06-13 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
PT1144607E (pt) 1999-07-20 2009-04-22 Morphosys Ag Novos métodos para apresentar (poli)peptídeos/ proteínas em partículas bacteriofágicas através de ligações dissulfureto
US6984720B1 (en) 1999-08-24 2006-01-10 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
US7220840B2 (en) 2000-06-16 2007-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator protein
WO2002002641A1 (en) 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
EP1381631B1 (en) * 2001-04-24 2010-10-13 Bayer Corporation Human anti timp-1 antibodies
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
CA2467521A1 (en) 2001-11-16 2003-07-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
AU2003276430A1 (en) 2002-06-14 2003-12-31 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
FR2840910B1 (fr) 2002-06-17 2004-08-27 Rhodia Chimie Sa Composition silicone pour la realisation d'un ensemble comprenant plusieurs elements en silicone reticules par polyaddition adherant fermement les uns aux autres
US20040065598A1 (en) 2002-06-17 2004-04-08 Ross David Justin Address disambiguation for mail-piece routing
AU2003277828B2 (en) 2002-10-29 2009-06-04 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
RS20050934A (en) 2003-06-16 2008-04-04 Celltech R. & D. Inc., Antibodies specific for sclerostin and methods fo r increasing bone mineralization
US8461155B2 (en) 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
WO2005069970A2 (en) 2004-01-20 2005-08-04 Kalobios, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
US7737190B2 (en) 2005-03-24 2010-06-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process to prepare stable trifluorostyrene containing compounds grafted to base polymers using a solvent/water mixture
US20060264576A1 (en) 2005-03-24 2006-11-23 Roelofs Mark G Process to prepare stable trifluorostyrene containing compounds grafted to base polymers
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
DE102006002221A1 (de) 2005-11-11 2007-05-24 Micronas Gmbh Integrierter elektronischer Schaltkreis
JP5688829B2 (ja) * 2005-11-11 2015-03-25 敏一 吉川 示差的な糖尿病の予知・診断方法および糖尿病予知・診断用キット
DOP2006000277A (es) 2005-12-12 2007-08-31 Bayer Pharmaceuticals Corp Anticuerpos anti mn y métodos para su utilización
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
EP2460828A3 (en) 2006-11-10 2012-08-08 UCB Pharma, S.A. Antibodies and diagnostics
US20100036091A1 (en) 2006-11-10 2010-02-11 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
EP3345607B1 (en) 2006-12-29 2022-10-26 Ossifi-Mab LLC Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
EP2131860B1 (en) * 2007-03-20 2013-12-18 Eli Lilly & Company Anti-sclerostin antibodies
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
TWI489993B (zh) * 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
US20110044978A1 (en) 2007-12-14 2011-02-24 Amgen Inc. Method for treating bone fracture

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006119107A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Ucb Pharma S.A. Sclerostin binding agents

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Robert F. Balint et al..Antibody engineering by parsimonious mutagenesis.《Gene》.1993,第137卷109-118. *

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