EA018756B1 - Антитела к склеростину, композиции, их содержащие, и их применение - Google Patents

Антитела к склеростину, композиции, их содержащие, и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA018756B1
EA018756B1 EA201000559A EA201000559A EA018756B1 EA 018756 B1 EA018756 B1 EA 018756B1 EA 201000559 A EA201000559 A EA 201000559A EA 201000559 A EA201000559 A EA 201000559A EA 018756 B1 EA018756 B1 EA 018756B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
sclerostin
amino acid
antibodies
acid sequence
Prior art date
Application number
EA201000559A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201000559A1 (ru
Inventor
Михаэла Кнайссель
Кристин Халлё
Шоуих Сюй
Беате Дифенбах-Штрайбер
Йозеф Прасслер
Original Assignee
Новартис Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40219404&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA018756(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Новартис Аг filed Critical Новартис Аг
Publication of EA201000559A1 publication Critical patent/EA201000559A1/ru
Publication of EA018756B1 publication Critical patent/EA018756B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/662—Phosphorus acids or esters thereof having P—C bonds, e.g. foscarnet, trichlorfon
    • A61K31/663—Compounds having two or more phosphorus acid groups or esters thereof, e.g. clodronic acid, pamidronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/108—Osteoporosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

В изобретении описаны антитела к склеростину, композиции и способы применения указанных антител для лечения заболевания, связанного с аномалиями в костной ткани, такого как остеопороз.

Description

Настоящее изобретение относится к антителам к склеростину и композициям и способам применения указанных антител для лечения патологического нарушения, опосредуемого склеростином, или связанного с аномалиями в костной ткани заболевания, такого как остеопороз.
Предпосылки создания изобретения
Ген 808Τ кодирует белок склеростин, который представляет собой состоящий из 213 аминокислот секретируемый гликопротеин. Склеростин является представителем надсемейства факторов, включающих цистеиновый узел. Склеростин родственен семейству белков ДАН/Церберус (ΌΑΝ/СетЬетик), которые оказывают непосредственное воздействие на передачу сигналов ВМР путем ингибирования связывания ВМР с рецепторами и, как следствие, ингибирования каскада передачи сигналов (ΑνΧιηКге1с11тег. Мо1. Епбосппок. 18(1), 2004, с. 1-12).
Экспрессия мРНК склеростина выявлена у взрослых людей главным образом в костной ткани и почке. Белок склеростин обнаружен главным образом в костной ткани. В костной ткани его экспрессия ограничена зрелыми и полностью дифференцированными формирующими кость клетками, т.е. остеоцитами.
Склеростин представляет собой эффективный негативный регулятор формирования кости у человека и мышей. Отсутствие экспрессии гена 808Τ приводит к склеростеозу (Ва1етапк и др., Нит Мо1. Оепе!., 10(5), 2001, с. 537-543; Вгипко\\· и др., Ат 1. Нит Оепе!, 68(3), 2001, с. 577-589). Пациенты на протяжении всей жизни страдают разрастанием костной ткани, что приводит к повышенной минеральной плотности и прочности костной ткани. У них не выявлено никаких других эндокринологических аномалий - все осложнения, имеющие место в течение их жизни, связаны с аномальным накоплением костной ткани. У индивидуумов, являющихся гетерозиготными носителями этого рецессивного нарушения, также обнаружена повышенная костная масса (Оагбпег и др., 1. С11п. Епбосппо1 Ме!аЬ., 90(12), 2005, с. 63926395). Этот фенотип можно рекапитулировать у мышей с дефицитом гена 8Θ8Τ и его сверхэкспрессия приводит к остеопении. Кроме того, известно, что болезнь ван Бухема [М1М 239100] - фенотипическая копия склеростеоза - вызывается нарушенной регуляцией гена 8Θ8Τ, связанной с геномной делецией костного энхансера дальнего действия (Ва1етапк и др., 1. Меб. Оепе, 39(2), 2002, с. 91-97; Ьоо!к и др., Оепоте Век, 15(7), 2005, с. 928-935). И, наконец, 8Θ8Τ подвергается в процессе формирования кости негативной регуляции гормоном паращитовидной железы (РТН), фактором формирования кости, роль которого доказана клинически, что позволяет предположить, что анаболическое действие РТН частично может быть обусловлено 8Θ8Τ (Ке11ег и Кпе1кке1 Вопе, 37(2), 2005, с. 148-158).
Склеростин связывает ВМР (белки, участвующие в остеогенезе) и может действовать в качестве антагониста ВМР ш νίΙΐΌ (\Утк1ег и др., ЕМВО 1., 22(23), 2003, с. 6267-6276). Склеростин действует также в качестве негативного регулятора канонического пути передачи сигналов хгп1 (\Утд1екк) либо непосредственно путем связывания с ЕВР5/ЬВР6 (Ь1 и др., 1. Вю1. СЬет., 20, 2005, с. 280(20); 8етеηον, 1. Вю1. СЬет., 19 октября 2006 г., νаη Вехооуеп и др., 1. Вопе М1пет Век, 10 октября 2006 г.), либо косвенно (\\'тк1ег и др., 1. Вю1. СЬет., 28, 2005, 280(4), с. 2498-2502).
Отсутствие экспрессии склеростина приводит к избыточному образованию костной ткани, при этом резорбция кости не нарушается (склеростеоз, болезнь ван Бухема) (Ва1етапк и др., 2001; Вгипко\\· и др., Ат 1. Нит Оепе!, 68(3), 2001, с. 577-589, Ва1етапк и др., 2006; Ьоо!к и др., Оепоте Век, 15(7), 2005, с. 928-935).
Лишь немногие из применяемых в настоящее время путей лечения, связанных со скелетом нарушений, могут приводить к повышению плотности костной ткани, большинство доступных в настоящее время путей лечения направлены, прежде всего, на ингибирование дополнительной резорбции кости, а не на стимуляцию формирования новой костной ткани.
Одним из примеров медикаментозных средств, применяемых для лечения потери костной ткани, является эстроген. Однако не ясно, обладает ли эстроген какими-либо длительными благоприятными действиями. Кроме того, эстроген может приводить к риску повышения возникновения различных типов опухолей, таких как рак молочной железы и эндометрия. Другие современные терапевтические подходы к лечению остеопороза включают применение бисфосфонатов (например, Еокатах™, Ас1опе1™. Вопνίνη™. 2оте1а™, олпадронат, неридронат, скелид, бонефос), гормон паращитовидной железы, кальцилитических средств, кальцимиметиков (например, цинакальцет), статинов, анаболических стероидов, солей лантана и стронция и фторида натрия. Однако с указанными терапевтическими средствами часто связаны нежелательные побочные действия.
Краткое изложение сущности изобретения
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело или функциональный белок, содержащий антигенсвязывающий участок антитела, мишенью которого является полипептид склеростина (8ΕΟ Ш N0: 155), отличающееся/отличающийся тем, что антитело или функциональный белок специфически связывается с полипептидом склеростина и может повышать у млекопитающего по меньшей мере одну из следующих характеристик: образование костной ткани, минеральную плотность костной ткани, содержание минерала в костной ткани, костную массу, качество костной ткани и прочность
- 1 018756 костной ткани.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, обладают способностью аннулировать ингибирование склеростином минерализации костной ткани ίη νίίτο. В родственном варианте осуществления изобретения они обладают способностью аннулировать ингибирование склеростином опосредуемого ^ηΐ-1 пути передачи сигналов. В другом родственном варианте осуществления изобретения они могут нарушать способность склеростина связывать ЬКР6 и могут блокировать ингибирующее действие, которое склеростин при его применении в высоких дозах оказывает на индуцируемое ВМР фосфорилирование 8шаб1. В другом варианте осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, связываются с областью склеростина между аминокислотами 112 и 126 включительно 8ЕЦ ΙΌ N0: 155 (т.е. указанная область состоит из аминокислот 112-126 8ЕЦ ΙΌ N0: 155) и/или областью между аминокислотами 160-174 включительно 8ЕЦ ΙΌ N0: 155 (т.е. указанная область состоит из аминокислот 160-174 8ЕЦ ΙΌ N0: 155) и более конкретно связываются с областью, которая содержит как ΑΚ^^РNΑЮΒ6ΚΑΑΒ (8ЕЕ) ΙΌ N0: 156), так и ВЬУЛ8СКСККЬТВЕН (8ЕО ΙΌ N0: 157).
Склеростин ингибирует опосредуемую \\Щ-1 активацию 8ТЕ (8ирегТорЕ1а5Й, репортер-индикатор канонической передачи сигналов \\Ш) в НЕК293-клетках. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, восстанавливают репортер-индикатор передачи сигнала \\Щ с высокой степенью воспроизводимости.
Установлено, что выявленная с помощью анализа репортера ингибирующая активность антител, предлагаемых в изобретении, в отношении воздействия склеростина на передачу сигналов \\Ш в неостеобластных клетках проявляется в индукции ответов в виде формирования кости в результате ингибирования склеростина ίη νίνο. Так, эксперименты ίη νίνο, проведенные на взрослых грызунах, продемонстрировали, что антитела, предлагаемые в изобретении, значительно усиливают костный анаболизм. Повышение костной массы по эффективности соответствовало уровню, достигаемому при лечении, включающем введение с интервалом в один день очень высоких доз гормона паращитовидной железы (который применяли в качестве положительно контроля).
Таким образом, следующим предпочтительным вариантом осуществления изобретения являются антитела, предлагаемые в изобретении, аффинность которых к склеростину характеризуется значениями, находящимися в нижнем пикомолярном диапазоне, и которые ингибируют воздействие склеростина на передачу сигналов \νηΕ что характеризуется значениями Ι050 около 10 нМ.
Более предпочтительно следующим предпочтительным вариантом осуществления изобретения являются антитела, предлагаемые в изобретении, которые связываются с областью склеростина между аминокислотами 112 и 126 включительно 8ЕЦ ΙΌ N0: 155 (т.е. указанная область состоит из аминокислот 112-126 8ЕЦ ΙΌ N0: 155) и/или областью между аминокислотами 160-174 включительно 8ЕЦ ΙΌ N0: 155 (т.е. указанная область состоит из аминокислот 160-174 8ЕЦ ΙΌ N0: 155) и более конкретно связывается с областью, которая перекрывает, по меньшей мере, следующие полипептиды: АВЬЬРКАЮКОК^^К. (8ЕЕ) ΙΌ N0: 156), так и НЕУА8СКСКНЕ'ЕНЕН (8ЕО ΙΌ N0: 157) соответственно, и аффинность которых к склеростину характеризуется значениями, находящимися в нижнем пикомолярном диапазоне, и которые ингибируют воздействие склеростина на передачу сигналов ^ηΐ, что характеризуется значениями ΙΟ50 около 10 нМ. При оценке на созданной на мышах модели установлено, что указанные антитела обладают способностью повышать костную массу в осевом и добавочном скелете с эффективностью, соответствующей уровню, достигаемому при лечении, включающем подкожное введение с интервалом в один день очень высокой анаболической дозы гормона паращитовидной железы (положительный контроль), и поэтому их можно применять для лечения заболеваний, связанных с аномалиями костной ткани, такими как остеопороз.
Другими вариантами осуществления изобретения являются композиции, содержащие антитела, предлагаемые в изобретении, в сочетании с альтернативными терапевтическими средствами, предназначенными для лечения остеопороза, такими как бисфосфонаты, гормон паращитовидной железы, рилизинг-факторы гормона паращитовидной железы (кальцилитики), нейтрализующие ЬКР4 антитела и нейтрализующие ΌΚΚ-1 антитела.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - воздействие М0Β05813_IдС2лямбда при анализе ^ηΐ-1;
на фиг. 2 - воздействие М0Я05813_IдС2лямбда на индуцируемую ВМР-2 минерализацию в МС3Т3-1Ь-клетках;
на фиг. 3 - воздействие М0Я05813_IдС2лямбда при оценке взаимодействия ЬКР6-808Т с помощью ЕЫ8А;
на фиг. 4 - воздействие М0Β05813_IдС2лямбда при анализе фосфорилирования 8шаб1;
на фиг. 5 - А - воздействие выключения ЬКР4 (δί-РНК) на ингибирующую активность 808Т при анализе \νη(-1 с использованием НЕК293-клеток (черными номерами обозначены относительные уровни активности 8ТЕ в отсутствии 808Т, жирными черными номерами обозначены относительные уровни активности 8ТЕ в присутствии/отсутствии 808Т); Б - специфичность воздействия сверхэкспрессии ЬКР4 на значения ΙΟ50 для 808Т и значения ΙΟ50 для ЭКК1 при анализе \\Щ-1 с использованием НЕК293- 2 018756 клеток; В - специфичность воздействия сверхэкспрессии ЕКР4 на ингибирующую активность 8О8Т и ΠΚΚ1 при анализе νηΙ-1 с использованием С28а2-клеток; Г - специфичность воздействия выключения ЬКР4 (81-РНК) на ингибирующую активность 8О8Т и ΌΚΚ1 при анализе νηΙ-1 с использованием НЕК293-клеток; Д - модуляция активности ΜΟΚ05813 с помощью ЬКР4;
на фиг. 6 - результаты опытов на мышах, ίη νίνο рОСТ (периферическая количественная компьютерная томография) - обработка в течение 2,5 недель ΜΟΚ05813 повышает общее содержание минерала в проксимальном метафизе больше берцовой кости;
на фиг. 7 - результаты опытов на мышах, ίη νίνο рОСТ - обработка в течение 2,5 недель ΜΟΚ05813 повышает общую минеральную плотность костной ткани в проксимальном метафизе большеберцовой кости;
на фиг. 8 - результаты опытов на мышах, ίη νίνο рОСТ- обработка в течение 2,5 недель ΜΟΚ05813 повышает толщину кортикального слоя кости в проксимальном метафизе большеберцовой кости;
на фиг. 9 - результаты опытов на мышах, ίη νίνο рОСТ- обработка в течение 2,5 недель ΜΟΚ05813 повышает объем губчатого вещества кости в проксимальном метафизе большеберцовой кости;
на фиг. 10 - результаты опытов на мышах, ίη νίνο рОСТ- обработка в течение 2,5 недель ΜΟΚ05813 повышает толщину губчатой кости в проксимальном метафизе большеберцовой кости;
на фиг. 11 - результаты опытов на мышах, ίη νίνο рОСТ - обработка в течение 5 недель ΜΟΚ05813 дополнительно повышает общую минеральную плотность костной ткани в проксимальном метафизе большеберцовой кости;
на фиг. 12 - результаты опытов на мышах, ίη νίνο рОСТ - обработка в течение 5 недель ΜΟΚ05813 дополнительно повышает минеральную плотность костной ткани в большеберцовой кости;
на фиг. 13 - результаты опытов на мышах, ех νίνο ΌΕΧΑ (двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия) - обработка в течение 5 недель ΜΟΚ05813 дополнительно повышает минеральную плотность костной ткани в бедренной кости;
на фиг. 14 - результаты опытов на мышах, ех νίνο ΌΕΧΆ - обработка в течение 5 недель ΜΟΚ05813 дополнительно повышает минеральную плотность костной ткани в позвоночнике;
на фиг. 15 - результаты опытов на мышах, ех νίνο гистоморфометрия - обработка в течение 2,5 недель ΜΟΚ05813 повышает скорость формирования кости в добавочном скелете (дистальный метафиз бедренной кости);
на фиг. 16 - результаты опытов на мышах, ех νίνο гистоморфометрия - обработка в течение 2,5 недель ΜΟΚ05813 повышает скорость аппозиции (присоединение новых слоев) в добавочном скелете (дистальный метафиз бедренной кости);
на фиг. 17 - результаты опытов на мышах, ех νίνο гистоморфометрия - обработка в течение 2,5 недель ΜΟΚ05813 повышает минерализацию поверхности в добавочном скелете (дистальный метафиз бедренной кости);
на фиг. 18 - результаты опытов на мышах, ех νίνο гистоморфометрия - обработка в течение 2,5 недель ΜΟΚ05813 повышает скорость формирования кости в осевом скелете (поясничный позвонок);
на фиг. 19 - результаты опытов на мышах, ех νίνο гистоморфометрия - обработка в течение 2,5 недель ΜΟΚ05813 не влияет на резорбцию кости в добавочном скелете (дистальный метафиз бедренной кости) при оценке на поверхности остеокластов;
на фиг. 20 - результаты, полученные с помощью ЕЫ8А. демонстрирующие воздействие ΜΟΒ05813_Iд62лямбда на связывание 8О8Т с ЬКР6. В каждом случае применяли 0,9 нМ 8О8Т;
на фиг. 21 - результаты опытов на мышах, ίη νίνο рОСТ, полученные для варианта, включающего совместную обработку ΜΟΚ05813 и золедроновой кислотой: А - общая минеральная плотность костной ткани, Б - общее содержание минерала в костной ткани, В - толщина кортикального слоя кости и Г - минеральная плотность губчатого вещества кости;
на фиг. 22 - результаты опытов на мышах, ίη νίνο рОСТ, полученные для варианта, включающего обработку ΜΟΚ05813 и предварительную обработку алендронатом (а1еф: А - общая минеральная плотность костной ткани, Б - общее содержание минерала в костной ткани, В - толщина кортикального слоя кости и Г - минеральная плотность губчатого вещества кости;
на фиг. 23 - результаты опытов на мышах, ίη νίνο рОСТ, полученные для варианта, включающего анаболическую совместную обработку ΜΟΚ05813 и (I) антителом к ΌΚΚ1 или (II) РТН: А - общая минеральная плотность костной ткани, Б - общее содержание минерала в костной ткани, В - толщина кортикального слоя кости и Г - минеральная плотность губчатого вещества кости.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенным антителам, прежде всего человеческим антителам, которые специфически связываются со склеростином и ингибируют функциональные свойства склеростина. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, выводят из конкретных последовательностей тяжелых и легких цепей и/или они несут конкретные структурные характеристики, такие как СПК-участки, которые имеют конкретные аминокислотные последовательности. Изобретение относится к выделенным антителам, способам получения указанных антител, иммуноконъюгатов и мультивалентных или мультиспецифических молекул, которые содержат указан- 3 018756 ные антитела, и к фармацевтическим композициям, содержащим антитела, иммуноконъюгаты или биспецифические молекулы, предлагаемые в изобретении. Изобретение относится также к способам применения антител для ингибирования нарушения или состояния, ассоциированного с наличием экспрессии склеростина, например для лечения патологического нарушения, которое опосредуется склеростином или которое ассоциировано с повышенным уровнем склеростина; например, связанного с костной тканью заболевания, такого как остеопороз.
С целью лучшего понимания настоящего изобретения сначала приведены определения некоторых понятий. Дополнительные понятия будут разъяснены при подробном описании изобретения.
Под понятие содержащий подпадает понятие включающий, а также состоящий, например композиция содержащая X может состоять только из X или может включать нечто дополнительное, например включает X + Υ.
Понятие примерно касательно численного значения χ означает, например χ ± 10%.
Слово практически не исключает полностью, например композиция, которая практически свободна от Υ, может быть полностью свободна от Υ. При необходимости слово практически может быть упущено при определении понятия в изобретении.
Понятие иммунный ответ относится к действию, например, лимфоцитов, антигенпрезентирующих клеток, фагоцитов, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых указанными выше клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), результатом которого является избирательное повреждение, деструкция или элиминация из организма-хозяина внедряющихся патогенов, клеток или тканей, зараженных патогенами, раковых клеток, или, как в случае аутоиммунитета или патологического воспаления, здоровых человеческих клеток или тканей.
Понятие склеростин относится к человеческому склеростину, последовательность которого представлена в 8ЕЦ Ш N0: 155, рекомбинантный человеческий склеростин можно получать от фирмы Я&И 8у81ет8 (Миннеаполис, шт. Миннесота, США; 2006 каталожный № 1406-8Т-025). Кроме того, рекомбинантный мышиный склеростин/808Т доступны на коммерческой основе от фирмы Я&И 8у81етз (Миннеаполис, шт. Миннесота, США; 2006 каталожный № 1589-8Т-025). В И8 6395511 и 6803453 и публикациях патентов США 20040009535 и 20050106683 описаны антитела к склеростину в целом.
Понятие антитело в контексте настоящего описания включает полные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. антигенсвязывающий участок) или их одноцепочечные варианты. Встречающееся в естественных условиях антитело представляет собой гликопротеин, который содержит по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, связанные между собой дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначена в контексте настоящего описания как νΗ) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, т.е. СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначена в контексте настоящего описания как Уь) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, т.е. СЬ. νΗ- и Уьобласти можно дополнительно подразделять на области гиперварибельности, которые называют гипервариабельными участками (СИЯ), которые перемежаются с более консервативными участками, которые называют каркасными участками (ЕЯ). Каждая νΗ и Уъ состоит из трех СИЯ и четырех ЕЯ, которые в направлении от аминоконца к карбоксильному концу расположены в следующем порядке: ЕЯ1, СИЯ1, ЕЯ2, СИЯ2, ЕЯ3, СИЯ3, ЕЯ4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, в том числе с различными клетками иммунной системы (например, эффекторными клетками) и первым компонентом (С1с|) классической системы комплемента.
Понятие антигенсвязывающий участок антитела (или просто антигенный центр (область детерминанты) в контексте настоящего описания относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, склеростином). Было установлено, что антигенсвязывающую функцию антитела можно осуществлять с помощью фрагментов полноразмерного антитела. Примерами связывающихся фрагментов, подпадающих под понятие антигенсвязывающий участок антитела, являются ЕаЬ-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из Уь-, νΗ-, С1- и СН1-доменов; Р(аЬ)2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, состоящий из двух ЕаЬфрагментов, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; Еб-фрагмент, состоящий из νΗ- и СШ-доменов; Εν-фрагмент, состоящий из Уь- и Уц-доменов одного плеча антитела; бАЬ-фрагмент (\Уагб и др., №11иге. 341, 1989, с. 544-546), который состоит из Уц-домена; и выделенный гипервариабельный участок (СИЯ).
Кроме того, несмотря на то, что два домена Εν-фрагмента, т.е. Уь и νΗ, кодируются различными генами, их можно соединять с помощью методов рекомбинации синтетическим линкером, который позволяет создавать из них одну белковую цепь, в которой пара Уь- и ^-областей формирует одновалентные молекулы (известные под названием одноцепочечный Εν-фрагмент (8сРу); см., например, В1гб и др., 8с1епсе 242, 1988, с. 423-426; и Ηυβΐοη и др., Ргос. №111. Асаб. 8с1., 85, 1988, с. 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также подпадают под понятие антигенсвязывающий участок антитела. Указанные
- 4 018756 фрагменты антитела получают с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу в отношении возможности их применения, аналогичного применению интактных антител.
Понятие выделенное антитело в контексте настоящего описания относится к антителу, которое практически свободно от других антител с другой антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфически связывается со склеростином, практически свободно от антител, которые специфически связываются с антигенами, отличными от склеростина). Однако выделенное антитело, которое специфически связывается со склеростином, может давать перекрестную реакцию с другими антигенами, такими как молекулы склеростина из других видов. Кроме того, выделенное антитело может быть практически свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ.
Понятие моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела в контексте настоящего описания относится к получению молекул антител одинакового молекулярного состава. Композиция моноклональных антител обладает одинаковой специфичностью связывания и аффинностью в отношении конкретного эпитопа.
Подразумевается, что понятие человеческое антитело в контексте настоящего описания относится к антителам, несущим вариабельные области, в которых как каркасные, так и СПК-участки выводят из последовательностей, имеющих человеческое происхождение. Кроме того, если антитело содержит константную область, то константную область также выводят из таких человеческих последовательностей, например последовательностей человеческой зародышевой линии или мутантных версий последовательностей человеческой зародышевой линии, или антитела, содержащего консенсусные каркасные последовательности, выведенные на основе анализа человеческих каркасных последовательностей, который описан у Кпарр1к и др., 1. Μοί. ΒίοΙ., 296, 2000, с. 57-86.
Человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, могут включать также аминокислотные остатки, которые не кодируются человеческими последовательностями (например, в результате мутаций, интродуцированных путем случайного или сайт-направленного мутагенеза ίη νίΐτο или соматической мутации ίη νίνο). Однако в контексте настоящего описания подразумевается, что понятие человеческое антитело не относится к антителам, в которых последовательности СОК, выведенные из зародышевой линии других млекопитающих, таких как мышь, трансплантированы в человеческие последовательности каркасных участков.
Понятие человеческое моноклональное антитело относится к антителам, обладающим одинаковой специфичностью связывания, которые имеют вариабельные области, в которых как каркасные, так и СПК-участки выводят из человеческих последовательностей. В одном из вариантов осуществления изобретения человеческие моноклональные антитела получают с помощью гибридомы, которая включает Вклетку, полученную из трансгенного животного, кроме человека, например трансгенной мыши, в геноме которой содержится трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитый с иммортализованной клеткой.
Понятие рекомбинантное человеческое антитело в контексте настоящего описания относится ко всем человеческим антителам, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью методов рекомбинации, например, к антителам, выделенным из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным благодаря интродукции генов человеческого иммуноглобулина или которые получены из гибридом, к антителам, выделенным из клетки-хозяина, трансформированной с целью экспрессии человеческого антитела, например, с использованием трансфектомы, к антителам, выделенным из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител, и к антителам, полученным, экспрессированным, созданным или выделенным любыми другими путями, которые включают сплайсинг всего гена человеческого иммуноглобулина или его части посредством лигирования с другими последовательностями ДНК. Указанные рекомбинантные человеческие антитела несут вариабельные области, в которых каркасные и СПК-участки выводят из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения указанные рекомбинантные человеческие антитела можно подвергать мутагенезу ίη νίΐτο (или, когда для получения человеческих последовательностей 1д используют трансгенных животных, соматическому мутагенезу ίη νίνο), и в результате аминокислотные последовательности νΗ- и Уъ-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые хотя и выведены и являются родственными последовательностям νΗ и ν2 человеческой зародышевой линии, могут не встречаться в естественных условиях в популяции антител человеческой зародышевой линии ίη νίνο.
В контексте настоящего описания понятие изотип относится к классу антител (например, 1дМ, 1дЕ, 1дС. такому как 1дС1, 1дС2 или 1дС4), который кодируется генами константной области тяжелой цепи.
Фраза антитело, распознающее антиген и антитело, специфическое в отношении антигена в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо с понятием антитело, которое связывается специфически с антигеном.
В контексте настоящего описания подразумевается, что антитело, которое специфически связывается с полипептидом склеростина, представляет собой антитело, связывание которого с полипептидом
- 5 018756 склеростина характеризуется значением Кс, составляющим 1х 10-8 М или менее, 1х 10-9 М или менее или 1х10'10 М или менее. Антитело, которое дает перекрестную реакцию с антигеном, отличным от склеростина, означает антитело, связывание которого с антигеном характеризуется значением Кс, составляющим 0,5х 10-8 М или менее, 5х 10-9 М или менее или 2х 10-9 М или менее. Антитело, которое не дает перекрестную реакцию с конкретным антигеном, представляет собой антитело, связывание которого с указанным антигеном характеризуется значением Кс, составляющим 1,5х10-8 М или более, или значением Кс, составляющим от 5х10-8 М до 10х10-8 М или 1 х 10-7 М или более. В конкретных вариантах осуществления изобретения те антитела, которые не дают перекрестную реакцию с антигеном, характеризуются практически не выявляемым связыванием с этими белками при оценке с помощью стандартных анализов связывания.
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие антитело, которое блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа передачи сигнала \νηί' относится к антителу, которое восстанавливает индуцируемую νηΐ передачу сигналов в присутствии склеростина при оценке с помощью клеточного (репортерного) анализа 8иретТорР1а5Й (8ТР), что характеризуется значениями 1С50 менее примерно 1 мМ, 100, 20, 10 нМ или менее. Указанный 8ТР-анализ описан более подробно ниже в примерах.
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие антитело, которое блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа минерализации относится к антителу, которое восстанавливает индуцируемую ВМР2 минерализацию в присутствии склеростина при оценке с помощью клеточного анализа, что характеризуется значениями 1С50 менее примерно 1 мМ, 500, 100, 10, 1 нМ или менее. Указанный анализ описан более подробно ниже в примерах.
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие антитело, которое блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью анализа фосфорилирования 8шаб1 относится к антителу, которое восстанавливает индуцируемое ВМР6 фосфорилирование 8шаб1 в присутствии склеростина при оценке с помощью клеточного анализа, что характеризуется значениями 1С50 менее примерно 1 мМ, 500, 100, 10, 1 нМ или менее. Указанный анализ описан более подробно ниже в примерах.
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие антитело, которое ингибирует связывание склеростина с ЬКР-6 относится к антителу, которое ингибирует связывание склеростина с ЬКР-6, что характеризуется значениями 1С50 менее примерно 1 мМ, 500, 100, 10, 5, 3, 1 нМ или менее. Указанный анализ описан более подробно ниже в примерах.
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие антитело, которое усиливает формирование кости, повышает ее массу и плотность относится к антителу, которое обладает способностью усиливать формирование кости, повышать ее массу и плотность на уровне, характерном для обработки с интервалом в один день с использованием высокой анаболической дозы РТН, что описано в примере 10.
Понятие Кажос или Ка в контексте настоящего описания относится к скорости ассоциации взаимодействия конкретного антитела-антигена, а понятие К,18 или К, в контексте настоящего описания относится к скорости диссоциации взаимодействия конкретного антитела-антигена. В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие Кс относится к константе диссоциации, которую получают из соотношения К, к Ка (т.е. К,/Ка) и выражают в молярной концентрации (М). Значения Кс для антител можно определять с помощью методов, хорошо известных в данной области. Метод определения значения Кс антитела представляет собой метод, основанный на резонансе поверхностного плазмона, или метод, основанный на применении биосенсорной системы, такой как система В1асоге®.
В контексте настоящего описания понятие аффинность относится к силе взаимодействия между антителом и антигеном в индивидуальных антигенных сайтах. В каждом антигенном сайте вариабельная область плеча антитела взаимодействует посредством слабых нековалентных сил с антигеном в многочисленных сайтах; причем чем больше взаимодействий, тем сильнее аффинность.
В контексте настоящего описания понятие авидность относится к информативному критерию общей стабильности или силе комплекса антитело-антиген. Она контролируется тремя основными факторами: аффинностью антитела к эпитопу; валентностью и антигена, и антитела; и структурной организацией взаимодействующих участков. В конечном счете, эти факторы определяют специфичность антитела, т.е. вероятность того, что конкретное антитело связывается с определенным антигенным эпитопом.
Для получения зонда, обладающего большей авидностью, можно конструировать димерный конъюгат, создавая тем самым обладающие низкой аффинностью взаимодействия (как в случае зародышевой линии антитела), которые легче выявлять с помощью РАС8. Кроме того, другие методы повышения авидности антигенного связывания предусматривают создание димеров, тримеров или мультимеров любой из представленных в настоящем описании конструкций антител к склеростину. Указанные мультимеры можно создавать, осуществляя ковалентное связывание между индивидуальными модулями, например, путем имитации встречающегося в естественных условиях связывания С-конца с Ν-концом или путем имитации димеров антител, которые объединяются друг с другом через их константные области. Связи, создаваемые на границе раздела Рс/Рс, могут быть ковалентными или нековалентными. Кроме
- 6 018756 того, в гибридах склеростина можно использовать партнеры для димеризации или мультимеризации, отличные от Ес, для создания структур более высокого порядка. Например, можно использовать домены для мультимеризации, такой как домен для тримеризации, описанный у Вогеап (νθ 2004/039841), или домен для пентамеризации, описанный в опубликованной заявке νθ 98/18943.
В контексте настоящего описания понятие перекрестная реактивность относится к антителу или популяции антител, которые связываются с эпитопами на других антигенах. Это может быть обусловлено либо низкой авидностью или низкой специфичностью, либо наличием множества различных антигенов, которые имеют одинаковые или очень сходные эпитопы. Иногда перекрестная реактивность является желательной, когда существует потребность в общем связывании с родственной группой антигенов или при попытке осуществления мечения скрещивающихся видов (кросс-видов), когда последовательность антигенного эпитопа в процессе эволюции не приобретает высокую консервативность.
В контексте настоящего описания понятие высокая аффинность или высокая специфичность касательно антитела изотипа 1дС относится к антителу, для которого значение Кс в отношении антигенамишени составляет 10-8 М или менее, 10-9 М или менее или 10-10 М или менее. Однако высокая аффинность связывания может быть иной для других изотипов антител. Например, высокая аффинность связывания касательно изотипа 1дМ относится к антителу, для которого значение Кс составляет 10-7 М или менее или 10-8 М или менее.
В контексте настоящего описания понятие индивидуум относится к любому человеку или животному, кроме человека. Понятие животное, кроме человека включает всех позвоночных животных, например млекопитающих и животных, не относящихся к млекопитающим, в том числе относится к приматам, кроме человека, овцам, собакам, кошкам, лошадям, коровам, курам, амфибиям, рептилиям и т.д.
В контексте настоящего описания понятие оптимизированная означает, что нуклеотидная последовательность изменена с позиции кодирования аминокислотной последовательности с помощью кодонов, предпочтительных для продуктивных клеток или организмов, как правило, эукариотической клетки, например клетки РюЫа или Тпсйобегта. клетки яичника китайского хомячка (СНО) или человеческой клетки. Оптимизированную нуклеотидную последовательность создают так, чтобы она полностью или максимально возможно сохраняла способность кодировать аминокислотную последовательность и количество остатков, которые кодируются первоначально исходной нуклеотидной последовательностью, которую называют также родительской последовательностью. В контексте настоящего описания оптимизированные последовательности создают так, чтобы они имели кодоны, предпочтительные для клеток млекопитающих, однако предусматривается также оптимизированная экспрессия этих последовательностей в других эукариотических клетках. Аминокислотные последовательности, кодируемые оптимизированными нуклеотидными последовательностями, обозначают также как оптимизированные.
Различные объекты изобретения описаны более подробно в приведенных ниже подразделах.
Стандартные анализы, предназначенные для оценки способности к связыванию антител с склеростином различных видов, известны в данной области и включают, например, ЕЬ1§А, вестерн-блоттинг и РИА. Приемлемые анализы описаны подробно в примерах. Кинетические характеристики связывания (например, аффинность к связыванию) антител также можно определять с помощью стандартных анализов, известных в данной области, таких как В1асоге-анализ. Анализы, предназначенные для оценки воздействий антител на функциональные свойства склеростина (например, связывание с рецептором, предупреждение или облегчение остеолиза), описаны более подробно в примерах.
Таким образом, следует понимать, что антитело, которое ингибирует одну или несколько из видов функциональной активности склеростина (например, биохимическую, иммунохимическую, клеточную, физиологическую или другие виды биологической активности или т.п.), что определяют на основе методик, известных в данной области и представленных в настоящем описании, статистически значимо снижает конкретный вид активности по сравнению с вариантом без антитела (или, например, когда присутствует контрольное антитело с несоответствующей специфичностью). Антитело, которое ингибирует активность склеростина, вызывает статистически значимое снижение оцениваемого параметра по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50, 80 или 90% и в конкретных вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, может ингибировать более чем на 95, 98 или 99% функциональную активность склеростина.
Понятия перекрестно блокирует, перекрестно блокированный и перекрестная блокада в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо, и они относятся к способности антитела или другого связывающего агента оказывать воздействие на связывание других антител или связывающих агентов со склеростином при оценке с помощью стандартного анализа конкурентного связывания.
Способность или степень, с которой антитело или другой связывающий агент может оказывать воздействие на связывание другого антитела или связывающей молекулы со склеростином и, следовательно, можно ли это отнести к перекрестному блокированию согласно изобретению, можно определять с помощью стандартных анализов конкурентного связывания. Одним из приемлемых анализов является применение технологии В1асоге (например, с использованием устройства типа В1Асоге 3000 (фирма
В1асоге, Уппсала, Швеция)), с помощью которого можно оценивать степень взаимодействий на основе метода резонанса поверхностного плазмона. Другим анализом, который применяют для оценки перекре- 7 018756 стного связывания, является подход, основанный на применении ЕЬ1§Л.
Оба метода более подробно описаны в примерах.
Согласно изобретению перекрестно блокирующее антитело или другой связывающий агент, предлагаемый в изобретении, связывается со склеростином при анализе перекрестной блокады с помощью В1Асоге таким образом, что обнаруженное связывание комбинации (смеси) антител или связывающих агентов составляет от 80 до 0,1% (например, от 80 до 4 от максимального теоретического связывания, в частности от 75 до 0,1% (например, от 75 до 4%) от максимального теоретического связывания, и более конкретно от 70 до 0,1% (например, от 70 до 4%) и еще более предпочтительно от 65 до 0,1% (например, от 65 до 4%) от максимального теоретического связывания (как указано выше) двух антител или связывающих агентов, входящих в комбинацию.
Антитело рассматривается как перекрестно блокирующее при анализе с помощью ЕЬ18А, который описан в примерах, если присутствующее в растворимой фазе антитело к склеростину обладает способностью вызывать снижение на уровне от 60 до 100%, в частности от 70 до 100%, и более конкретно от 80 до 100% сигнал обнаружения склеростина (т.е. количество склеростина, связанного сенсибилизированным антителом) по сравнению с сигналом обнаружения склеростина, обнаруженным в отсутствие присутствующего в растворимой фазе антитела к склеростину (т.е. в лунках, применяемых в качестве положительного контроля).
Моноклональные антитела.
Антитела, предлагаемые в изобретении, представляют собой человеческие моноклональные антитела, например, выделенные согласно описанным в примерах методам. Аминокислотные последовательности Ун выделенных антител, предлагаемых в изобретении, представлены в 8ЕО ГО N0: 69-77. Аминокислотные последовательности Уъ выделенных антител, предлагаемых в изобретении, представлены в 8ЕО ГО N0: 80-88 соответственно. Соответствующие предпочтительные полноразмерные аминокислотные последовательности тяжелых цепей антител, предлагаемых в изобретении, представлены в 8Е0 ГО N0: 113-121. Соответствующие предпочтительные полноразмерные аминокислотные последовательности легких цепей антител, предлагаемых в изобретении, представлены в 8Е0 ГО N0: 124-132 соответственно. Другие антитела, предлагаемые в изобретении, включают мутантные аминокислоты, при этом их последовательности еще идентичны по меньшей мере на 60, 70, 80, 90 или 95% в СЭВ-участках, где последовательности СЭВ-участков представлены выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения изобретение относится к мутантным аминокислотным последовательностям, в которых не более 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот в СЭВ-участках изменены в результате мутаций по сравнению с СЭВ-участками, последовательности которых описаны выше.
Кроме того, родительские нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей представлены в 8Е0 ГО N0: 89-90. Родительские нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей представлены в 8Е0 ГО N0: 100-101. Полноразмерные нуклеотидные последовательности легких цепей, оптимизированные для экспрессии в клетках млекопитающих, представлены в 8Е0 ГО N0: 146-154. Полноразмерные нуклеотидные последовательности тяжелых цепей, оптимизированные для экспрессии в клетках млекопитающих, представлены в 8Е0 ГО N0: 135-143. Полноразмерные аминокислотные последовательности легких цепей, кодируемые оптимизированными нуклеотидными последовательностями легких цепей, представлены в 8Е0 ГО N0: 124-132. Полноразмерные аминокислотные последовательности тяжелых цепей, кодируемые оптимизированными нуклеотидными последовательностями тяжелых цепей, представлены в 8Е0 ГО N0: 113-121. Другие антитела, предлагаемые в изобретении, включают мутантные аминокислоты или нуклеиновые кислоты, последовательности которых еще идентичны по меньшей мере на 60, 70, 80, 90 или 95% или более описанным выше последовательностям. В некоторых вариантах осуществления изобретения изобретение относится к мутантным аминокислотным последовательностям, в которых не более 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот в вариабельных областях изменены в результате мутаций по сравнению с вариабельными областями, последовательности которых описаны выше, сохраняя при этом практически такую же терапевтическую активность.
Поскольку каждое их этих антител может связываться со склеростином, то последовательности Ун, Уь, полноразмерной легкой цепи и полноразмерной тяжелой цепи (нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности) могут быть смешаны и совмещены (соответствующим образом подобраны друг к другу) для создания других связывающих молекул антител к склеростину, предлагаемых в изобретении. Связывание склеростина с указанными смешанными и совмещенными антителами можно оценивать с помощью анализов связывания, которые описаны выше и в примерах (например, ЕЬ18А). Когда указанные цепи смешивают и совмещают, то Ун-последовательность из конкретной пары Ун/Уь можно заменять структурно подобной Ун-последовательностью. Аналогично этому последовательность полноразмерной тяжелой цепи из конкретной пары полноразмерная легкая цепь/полноразмерная тяжелая цепь можно заменять структурно подобной последовательностью полноразмерной тяжелой цепи. Аналогично этому Уь-последовательность из конкретной пары Ун/Уъ можно заменять структурно схожей У|-последовательностью. Аналогично этому последовательность полноразмерной легкой цепи из конкретной пары полноразмерная тяжелая цепь/полноразмерная легкая цепь можно заменять структурно подобной последовательностью полноразмерной легкой цепи. Таким обра- 8 018756 зом, одним из объектов изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которое/который содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 69-77; и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 80-88; где антитело специфически связывается со склеростином.
Другим объектом изобретения является:
(I) выделенное моноклональное антитело, содержащее полноразмерную тяжелую цепь, которая включает аминокислотную последовательность, оптимизированную для экспрессии в клетке млекопитающего, которую выбирают из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 113-121; и полноразмерную легкую цепь, которая включает аминокислотную последовательность, оптимизированную для экспрессии в клетке млекопитающего, которую выбирают из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 124-132; или (II) функциональный белок, который содержит его антигенсвязывающий участок.
Другим объектом изобретения является:
(I) выделенное моноклональное антитело, содержащее полноразмерную тяжелую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, оптимизированную для экспрессии в клетке млекопитающего, которую выбирают из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 135-143; и полноразмерную легкую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, оптимизированную для экспрессии в клетке млекопитающего, которую выбирают из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 146-154; или (II) функциональный белок, который содержит его антигенсвязывающий участок.
Еще одним объектом изобретения являются антитела, которые содержат СЭВ1, СЭВ2 и СЭВ3 тяжелых цепей и легких цепей, или их комбинации. Аминокислотные последовательности СЭВ1 Ун антител представлены в 8ЕЦ ГО N0: 1-11. Аминокислотные последовательности СЭВ2 Ун антител представлены в 8ЕЦ ГО N0: 12-22. Аминокислотные последовательности СЭВ3 Ун антител представлены в 8ЕЦ ГО N0: 23-33. Аминокислотные последовательности СГОВ1 Уъ антител представлены в 8ЕЦ ГО N0: 34-44. Аминокислотные последовательности СГОВ2 Уъ антител представлены в 8ЕЦ ГО N0: 45-55. Аминокислотные последовательности СГОВ3 Уъ антител представлены в 8ЕЦ ГО N0: 56-66. СГОВ-участки описывают по системе Кэбота (КаЬа! Е.А. и др., Зссщспеск οί Рго1еш8 οί [тпшпо1ощса1 !п1сгс8(. 5-е изд., изд-во и.8. Перайтеи! οί НеаИй апй Нитап 8егу1сек, МН РиЬйсайоп N0. 91-3242, 1991).
С учетом того, что каждое из указанных антител может связываться со склеростином и что специфичность к связыванию с антигеном обеспечивается, прежде всего, СОРТ-, 2- и 3-участками, последовательности СЭВ1, 2 и 3 Ун и последовательности СЭВ1, 2 и 3 Уъ можно смешивать и совмещать (т.е. можно смешивать и совмещать СОВ из различных антител, хотя каждое антитело должно содержать СГОВ1, 2 и 3 Ун и СЭВ1, 2 и 3 Уъ для создания других направленных против склеростина связывающих молекул, предлагаемых в изобретении. Связывание склеростина с такими смешанными и совмещенными антителами можно тестировать с использованием анализов связывания, которые описаны выше и в примерах (например, ЕБ18Л). Когда смешивают и совмещают СГОВ-последовательности Ун, то последовательности СГОВ1, СГОВ2 и/или СГОВ3 из конкретной последовательности Ун следует замещать структурно сходной(ими) СГОВ-последовательностью(ями). Аналогично этому, когда СГОВпоследовательности Уъ смешивают и совмещают, то последовательности СЭВ1, СГОВ2 и/или СГОВ3 из конкретной последовательности Уъ следует замещать структурно сходной(ими) СГОВпоследовательностью(ями). Как должно быть очевидно обычному специалисту в данной области, новые последовательности Ун и Уъ можно создавать путем замены одной или нескольких последовательностей СГОВ-участка Ун и/или Уъ структурно сходными последовательностями из СГОВ-последовательностей, описанных для моноклональных антител, предлагаемых в настоящем изобретении.
Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок содержат СГОВ1 вариабельной области тяжелой цепи, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 1-11; СГОВ2 вариабельной области тяжелой цепи, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 12-22; СГОВ3 вариабельной области тяжелой цепи, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 23-33; СГОВ1 вариабельной области легкой цепи, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 34-44; СГОВ2 вариабельной области легкой цепи, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 45-55; и СГОВ3 вариабельной области легкой цепи, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 56-66; где антитело специфически связывается со склеростином.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит СГОВ1 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8ЕЦ ГО N0: 3; СГОВ2 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8ЕЦ ГО N0: 14; СГОВ3 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8ЕЦ ГО N0: 25; СГОВ1 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8ЕЦ ГО N0: 36; СГОВ2 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8ЕЦ ГО N0: 47; и СГОВ3 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8ЕЦ ГО N0: 58.
- 9 018756
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит ί.ΌΚ1 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8ЕО ΙΌ N0: 4; ί.ΌΚ2 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 15; СЭКЗ вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 26; ί.ΌΚ1 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 37; ί.ΌΚ2 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 48; и СЭКЗ вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 59.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит ί.ΌΚ1 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 5; ί.ΌΚ2 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 16; СЭКЗ вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 27; ί.ΌΚ1 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 38; ί.ΌΚ2 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 49; и СЭКЗ вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 60.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит ί.ΌΚ1 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 6; ί.ΌΚ2 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 17; СЭКЗ вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 28; ί.ΌΚ1 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 39; ί.ΌΚ2 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 50; и СЭКЗ вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 61.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит СОК! вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 7; СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 18; СЭКЗ вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 29; СЭК1 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 40; СЭК2 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 51; и СЭКЗ вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 62.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит ί.ΌΚ1 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 8; СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 19; СЭКЗ вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: З0; СЭК1 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 41; СЭК2 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 52; и СЭКЗ вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 6З.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит ί.ΌΚ1 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 9; СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 20; СЭКЗ вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: З1; СЭК1 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 42; СЭК2 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 5З; и СЭКЗ вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 64.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит ί.ΌΚ1 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 10; СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 21; СЭКЗ вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: З2; СЭК1 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 4З; СЭК2 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 54; и СЭКЗ вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 65.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 11; СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 22; СЭКЗ вариабельной области тяжелой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: ЗЗ; СЭК1 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 44; СЭК2 вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 55; и СЭКЗ вариабельной области легкой цепи, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 66.
В контексте настоящего описания человеческое антитело содержит вариабельные области тяжелой или легкой цепи или полноразмерные тяжелые или легкие цепи, которые являются продуктом или выведены из конкретной последовательности зародышевой линии, если вариабельные области или полноразмерные цепи получают из системы, в которой в качестве источника последовательностей используют гены иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Для создания одной из таких систем осуществляют иммунизацию трансгенной мыши, несущей человеческие гены иммуноглобулинов, представляю
- 10 018756 щим интерес антигеном или осуществляют скрининг фаговой дисплейной библиотеки человеческих генов иммуноглобулинов представляющим интерес антигеном. Человеческое антитело, которое является продуктом или выведено из последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, можно идентифицировать индивидуально путем сравнения аминокислотной последовательности человеческого антитела и аминокислотных последовательностей иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии и отбора последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, которая является наиболее близкой по последовательности (т.е. имеет самый высокий % идентичности) с последовательностью человеческого антитела. Человеческое антитело, которое является продуктом или выведено из конкретной последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, может иметь различия в аминокислотах по сравнению с последовательностью зародышевой линии, например, в результате встречающихся в естественных условиях соматических мутаций или искусственных сайтнаправленных мутаций. Однако аминокислотная последовательность отобранного человеческого антитела, как правило, по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, и содержит аминокислотные остатки, которые свидетельствуют о том, что человеческое антитело является человеческим, при сравнении с аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов зародышевых линий других видов (например, последовательности мышиной зародышевой линии). В определенных случаях аминокислотная последовательность человеческого антитела может быть по меньшей мере на 60, 70, 80, 90% или по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Как правило, последовательности человеческого антитела, выведенные из конкретной последовательности человеческой зародышевой линии, должны иметь не более 10 аминокислотных различий по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. В определенных случаях человеческое антитело может отличаться не более чем на 5 или даже не более чем на 4, 3, 2 или 1 аминокислоту от аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотные последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии выбирают из группы, включающей последовательности вариабельных областей тяжелых цепей, которые представлены в 8ЕО Ш N0: 67-68 соответственно, последовательности вариабельных областей легких цепей, которые представлены в 8Е0 Ш N0: 78-79 соответственно.
Г омологичные антитела
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, имеет аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой и легкой цепи, нуклеотидные последовательности полноразмерной тяжелой и легкой цепи или вариабельные области тяжелой и легкой цепи, аминокислотные последовательности которых гомологичны аминокислотным и нуклеотидным последовательностям представленных в настоящем описании антител, и при этом антитела сохраняют требуемые функциональные свойства антител к склеростину, предлагаемых в изобретении.
Например, в изобретении предложено выделенное моноклональное антитело (или его функциональный белок, который содержит его антигенсвязывающий участок), которое содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, при этом вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е0 Ш N0: 67-77; вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е0 Ш N0: 78-88; антитело специфически связывается со склеростином и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональный свойств: антитело блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа передачи сигнала \гп1. антитело блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа минерализации или блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке фосфорилирования 8шаб1, или антитело ингибирует связывание склеростина с ЬКР-6, или антитело усиливает формирование кости, повышает ее массу и плотность.
Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело (или его функциональный белок, который содержит его антигенсвязывающий участок), которое содержит полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь, при этом полноразмерная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е0 Ш N0: 111-121; полноразмерная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е0 Ш N0: 122-132; антитело специфически связывается со склеростином и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональный свойств: антитело блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа передачи сигнала ^ηΐ, антитело блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа минерализации или блокирует ингибирующее действие
- 11 018756 склеростина при оценке фосфорилирования 8таб1, или антитело ингибирует связывание склеростина с ЬКР-6, или антитело усиливает формирование кости, повышает ее массу и плотность.
Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело (или его функциональный белок, который содержит его антигенсвязывающий участок), которое содержит полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь, при этом полноразмерная тяжелая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей 8ЕС Ш N0: 133-143; полноразмерная легкая цепь кодируется нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей 8ЕС Ш N0: 144-154; антитело специфически связывается со склеростином и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональный свойств: антитело блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа передачи сигнала \νπΙ. антитело блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа минерализации или блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке фосфорилирования 8таб1, или антитело ингибирует связывание склеростина с ЬКР-6, или антитело усиливает формирование кости, повышает ее массу и плотность.
В различных вариантах осуществления изобретения антитело может обладать одним или несколькими, двумя или более или тремя из описанных выше функциональных свойств. Антитело может представлять собой, например, человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело.
В других вариантах осуществления изобретения аминокислотные последовательности νΗ и/или могут быть идентичны на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% указанным выше последовательностям. В других вариантах осуществления изобретения аминокислотные последовательности νΗ и/или ν2 могут быть идентичны за исключением аминокислотной замены не более чем в 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных положениях. Антитело, имеющее νΗ- и ^-области, имеющие высокую (т.е. 80% или более) степень идентичности с νΗ- и ^-областями, последовательности которых представлены в 8ЕС Ш N0: 67-77 и 8Е0 Ш N0: 78-88 соответственно, можно получать с помощью мутагенеза (например, сайтнаправленного или ПЦР-опосредуемого мутагенеза) молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют 8Е0 Ш N0: 89-99 и 100-110 соответственно, с последующей оценкой кодируемого измененного антитела в отношении сохранения у него функциональной активности (т.е. указанных выше функций) с использованием функциональных анализов, представленных в настоящем описании.
В других вариантах осуществления изобретения аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой цепи и/или полноразмерной легкой цепи могут быть на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны представленным выше последовательностям. Антитело, имеющее полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь, последовательности которых имеют высокую (т.е. 80% или более) степень идентичности с последовательностями полноразмерных тяжелых цепей, которые представлены в любой из 8ЕС Ш N0: 111-121, и с последовательностями полноразмерных легких цепей, которые представлены в любой из 8ЕС Ш N0: 122-132 соответственно, можно получать с помощью мутагенеза (например, сайт-направленного или ПЦР-опосредуемого мутагенеза) молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют 8ЕС Ш N0: 133-134 и 144-154 соответственно, с последующей оценкой кодируемого измененного антитела в отношении сохранения у него функциональной активности (т.е. указанных выше функций) с использованием функциональных анализов, представленных в настоящем описании.
В других вариантах осуществления изобретения нуклеотидные последовательности полноразмерной тяжелой цепи и/или полноразмерной легкой цепи могут быть идентичны на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательностям, представленным в настоящем описании. В других вариантах осуществления изобретения нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и/или полноразмерной легкой цепи могут быть идентичны на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательностям, представленным в настоящем описании.
Согласно настоящему описанию процент идентичности двух последовательностей является функцией количества идентичных положений в последовательностях (т.е. % идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений х 100), принимая во внимание количество брешей и длину каждой бреши, которую необходимо интродуцировать для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно осуществлять с помощью математического алгоритма, который описан ниже в примерах, которые не ограничивают объем изобретения.
Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определять с помощью алгоритма Е. Меуегк и V. МШег (Сотри!. Арр1. ВюксЕ, 4, 988, с. 11-17), который включен в программу АЫСЛ (версия 2.0), с использованием таблицы взвешенных остатков РАМ120, штрафа за длину бреши 12 и штрафа за брешь 4. Кроме того, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определять с помощью алгоритма №еб1етаи и ХУипксН (1. Мо1. Вю1., 48, 1970, с. 444-453), который включен в программу САР, входящую в пакет программ ССС (которая доступна на сайте й!!р://те^те.дсд.сот), с использованием матрицы В1оккот 62 или матрицы РАМ250 и веса бреши 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом или дополнительном варианте белковые по
- 12 018756 следовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять также в качестве запрашиваемой последовательности при осуществлении поиска в доступных научной общественности базах данных, например, в отношении идентичности с родственными последовательностями. Такой поиск можно осуществлять с использованием программы ХВЬА8Т (версия 2.0), разработанной А11ксйи1 и др., 1. Мо1. Βίο1. 215, 1990, с. 403-410. ВЬА8Т-поиск белков можно осуществлять с помощью программы ХВЬА8Т, в которой балл = 50, длина слова = 3, для установления уровня гомологии аминокислотных последовательностей с аминокислотными последовательностями молекул антител, предлагаемых в изобретении. Для создания содержащих бреши линеаризированных последовательностей для целей сравнения можно использовать программу Сарреб ВЬА8Т, описанную у А11ксйи1 и др., Ыис1е1с Ас16к Кек., 25(17), 1997, с. 3389-3402. При применении программ ВЬА8Т и Сарреб ВЬА8Т можно использовать принимаемые по умолчанию параметры, которые применяются в соответствующих программах (например, ХВЬА8Т и ПВЬА8Т) (см. 1ΠΙρ:Ι1\ν\ν\ν.η±ίτι1ιητιί1ι.8ον).
Антитела с консервативными модификациями.
В конкретных вариантах осуществления антитело, предлагаемое в изобретении, имеет вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит последовательности ΟΌΚ1, ΟΌΚ2 и ΟΌΚ3, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит последовательности ΟΌΚ1, ΟΌΚ2 и СЭК3. где одна или нескольких указанных последовательностей СОК представляет собой специфические аминокислотные последовательности, характерные для антител, предлагаемых в настоящем изобретении, или их консервативные модификации, и где антитела сохраняют требуемые функциональные свойства антител к склеростину, предлагаемых в изобретении. Таким образом, в изобретении предложено выделенное моноклональное антитело или функциональный белок, которое/который содержит антигенсвязывающий участок, состоящий из варибельной области тяжелой цепи, которая содержит последовательности СЦК1, СЭК2 и СЦК3, и вариабельной области легкой, которая содержит последовательности СЭКЕ СЭК2 и СЦК3, где аминокислотные последовательности СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи выбраны из группы, включающей 8ЕО ΙΌ N0: 1-11 и их консервативные модификации; аминокислотные последовательности СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи выбраны из группы, включающей 8ЕО ΙΌ N0: 12-22 и их консервативные модификации; аминокислотные последовательности СЭК3 вариабельной области тяжелой цепи выбраны из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 23-33 и их консервативные модификации; аминокислотные последовательности СЭК1 вариабельной области легкой цепи выбраны из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 34-44 и их консервативные модификации; аминокислотные последовательности СЭК2 вариабельной области легкой цепи выбраны из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 45-55 и их консервативные модификации; аминокислотные последовательности СЭК3 вариабельной области легкой цепи выбраны из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 56-66 и их консервативные модификации; и антитело специфически связывается со склеростином и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональный свойств: антитело блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа передачи сигнала \νπΙ антитело блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа минерализации или блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке фосфорилирования 8ша61, или антитело ингибирует связывание склеростина с ЬКР-6, или антитело усиливает формирование кости, повышает ее массу и плотность.
В различных вариантах осуществления изобретения антитело может обладать одним или несколькими, двумя или более или тремя или более из описанных выше функциональных свойств. Антитела могут представлять собой, например, человеческие антитела, гуманизированные антитела или химерные антитела.
В других вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, оптимизированное для экспрессии в клетке, имеет последовательность полноразмерной тяжелой цепи и последовательность полноразмерной легкой цепи, где одна или несколько из указанных последовательностей имеют специфические аминокислотные последовательности, характерные для представленных в настоящем описании антител, или их консервативные модификации, и где антитела сохраняют требуемые функциональные свойства антител к склеростину, предлагаемых в изобретении. Таким образом, в изобретении предложено выделенное моноклональное антитело, оптимизированное для экспрессии в клетке млекопитающего, состоящее из полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи, где аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи выбрана из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 111-121 и их консервативные модификации; и аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи выбрана из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 122-132, и их консервативные модификации; антитело специфически связывается со склеростином и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональный свойств: антитело блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа передачи сигнала νηΐ, антитело блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа минерализации или блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке фосфорилирования 8ша61, или антитело ингибирует связывание склеростина с ЬКР-6, или антитело усиливает формирование кости, повышает ее массу и плотность.
В различных вариантах осуществления изобретения антитело может обладать одним или несколькими, двумя или более или тремя или более из описанных выше функциональных свойств. Антитела мо
- 13 018756 гут представлять собой, например, человеческие антитела, гуманизированные антитела или химерные антитела.
В контексте настоящего описания понятие консервативные модификации последовательностей относится к аминокислотным модификациям, которые не оказывают существенного влияния или не существенно изменяют характеристики связывания антитела, которое содержит указанную аминокислотную последовательность. Указанные консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления или делеции. Модификации можно интродуцировать в антитело, предлагаемое в изобретении, с помощью стандартных методов, известных в данной области, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредуемый мутагенез.
Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком, который имеет сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков со сходными боковыми цепями известны в данной области. Эти семейства включают аминокислотные остатки с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в СЭЯ-участках антитела, предлагаемого в изобретении, можно заменять на другие аминокислотные остатки из одного и того же семейства боковых цепей, и измененное антитело можно оценивать в отношении сохранения им функции с помощью представленных в настоящем описании функциональных анализов.
Антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и антитела к склеростину, предлагаемые в изобретении.
Другим вариантом осуществления изобретения являются антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и различные специфические антитела к склеростину, предлагаемые в изобретении и представленные в настоящем описании. При создании изобретения неожиданно было установлено, что все антитела, описанные в примерах, которые обладают способностью:
(I) блокировать ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа передачи сигнала \νηΐ:
(II) блокировать ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа минерализации:
(III) ингибировать связывание склеростина с ЬЯР-б; и, (IV) усиливать формирование кости, повышть ее массу и плотность, связываются с одним и тем же эпитопом в склеростине с высокой аффинностью, где эпитоп представляет собой конформационный эпитоп, который включает аминокислоты, представленные как в 8ЕС ГО N0: 156, так и в 8ЕС ГО N0: 157. Вне зависимости от какой-либо конкретной модели можно предположить, что аминокислотные последовательности 8ЕС ГО N0: 156 и 8ЕС ГО N0: 157 описывают одну область конформационного эпитопа в полипептиде склеростина, которая распознается антителами, предлагаемыми в изобретении.
Таким образом, дополнительные антитела можно идентифицировать на основе их способности перекрестно конкурировать (например, конкурентно ингибировать связывание статистически значимым образом) с другими антителами, предлагаемыми в изобретении, при оценке с помощью стандартных анализов связывания склеростина. Способность тестируемого антитела ингибировать связывание антител, предлагаемых в настоящем изобретении, с человеческим склеростином демонстрирует, что тестируемое антитело может конкурировать с этим антителом за связывание с человеческим склеростином: не вдаваясь в какую-либо теорию, можно предположить, что такое антитело связывается с таким же или родственным (например, структурно сходным или находящимся в пространственной близости) эпитопом на человеческом склеростине, что и антитело, с которым оно конкурирует. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело, которое связывается с тем же эпитопом на человеческом склеростине, что и антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, представляет собой человеческое моноклональное антитело. Такие человеческие моноклональные антитела можно получать и выделять согласно методам, описанным в примерах.
Сконструированные и модифицированные антитела.
Антитело, предлагаемое в изобретении, можно получать также с использованием антитела, которое имеет одну или несколько указанных в настоящем описании последовательностей νΗ и/или ν^ в качестве исходного материала для создания модифицированного антитела, где модифицированное антитело может иметь измененные свойства по сравнению с исходным антителом. Антитело можно создавать путем модификации одного или нескольких остатков в одной или обеих вариабельных областях (т.е. νΗ и/или νθ, например, в одном или нескольких СЭЯ-участках и/или в одном или нескольких каркасных участках. В дополнительном или альтернативном варианте антитело можно создавать путем модификации остатков в константной(ых) области(ях), например, для изменения эффекторной(ых) функции(ий)
- 14 018756 антитела.
Для осуществления одного из типов конструирования вариабельной области можно применять трансплантацию СОК. Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями в основном посредством аминокислотных остатков, локализованных в шести гипервариабельных участках (СОК) тяжелой и легкой цепи. По этой причине между аминокислотными остатками в СОК индивидуальных антител имеются более существенные различия, чем между последовательностями, локализованными вне СОК. Поскольку последовательности СОК ответственны за большую часть взаимодействий антитело-антиген, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства конкретных встречающихся в естественных условиях антител, путем конструирования экспрессионных векторов, которые содержат последовательности СОК из конкретного встречающегося в естественных условиях антитела, полученные путем трансплантации в последовательности каркасных участков из других антител с другими свойствами (см., например, К^есйтаηη Ь. и др., №1иге, 332, 1998, с. 323-327; 1οηβ5 Р. и др., №1иге, 321, 1986, с. 522-525; Сиееп С. и др., Рюс. ЫаЙ. Асай. 8с1.И.8.А., 86, 1989, с. 10029-10033; И8 5225539 на имя \Ут1ег и И8 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 на имя Спеем с соавт.).
Таким образом, следующим объектом изобретения является выделенное моноклональное антитело или функциональный белок, которое/который содержит антигенсвязывающий участок, содержащий последовательности СОРТ вариабельной области тяжелой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 1-11; последовательности СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 12-22; последовательности СЭК3 вариабельной области тяжелой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 23-33 соответственно; и последовательности СИК1 вариабельной области легкой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 34-44; последовательности СИК2 вариабельной области легкой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 45-55; и последовательности СЭК3 вариабельной области легкой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 56-66 соответственно.
Таким образом, указанные антитела содержат последовательности СОК νΗ и моноклональных антител, кроме того, они могут содержать различные последовательности каркасных участков указанных антител. Указанные последовательности каркасных участков, которые содержат последовательности генов антител зародышевой линии, можно получать из публичных баз данных ДНК или опубликованных ссылок. Например, последовательности ДНК человеческой зародышевой линии генов вариабельных областей тяжелых и легких цепей можно найти в базе данных последовательностей человеческой зародышевой линии ШаБе (доступной в сети Интернет на сайте ^^^.тгс-сре.сат.ас.ик/уЬаБе), а также у КаЬа1 Е.А. и др., ЗедиегсеБ οί РгоЮюб οί Iттиηοίοд^саί [ШегеБ!, 15-е изд., изд-во И.8. ОераПтегИ οί Неа11Н апй Ηитаη 8егуюе5, ΜΗ РиМка!^ №. 91-3242, 1991; Τοιηίίηχοη Ι.Μ. и др., ί. Μοί. Βίοί., 227, 1992, с. 776-798 и Сох ТР.Ь. и др., Еиг. ί. Iттиηοί., 24, 1994, с. 827-836; содержание каждой из которых специально включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Примерами последовательностей каркасных участков, предназначенных для применения в антителах, предлагаемых в изобретении, являются последовательности, структурно подобные последовательностям каркасных участков, которые входят в отобранные антитела, предлагаемые в изобретении, например консенсусные последовательности и/или последовательности каркасных участков, которые входят в моноклональные антитела, предлагаемые в изобретении. Последовательности СИК1, 2 и 3 νΗ и последовательности СИК1, 2 и 3 можно трансплантировать в каркасные участки, которые имеют последовательность, идентичную с последовательностью гена иммуноглобулина зародышей линии, из которого выведена последовательность каркасного участка, или последовательности СИК можно трансплантировать в каркасные участки, которые содержат одну или несколько мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было установлено, что в определенных случаях целесообразно изменять посредством мутации остатки в каркасных участках для поддержания или повышения способности антитела связываться с антигеном (см., например, И8 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 на имя Спеем с соавт.).
Другим типом модификации вариабельной области является мутация аминокислотных остатков в СИК1, СИК2 и/или СИК3 νΗ- и/или У^-областей, которая повышает тем самым одну или несколько способностей к связыванию (например, аффинность) представляющего интерес антитела, что называют созреванием аффинности. Для интродукции мутации(й) и осуществления воздействия на связывание антитела или на другое представляющее интерес функциональное свойство можно применять сайтнаправленный мутагенез или ПЦР-опосредуемый мутагенез, что можно оценивать с помощью анализов ίη νίΐτο или ίη νίνο, описанных ниже в примерах. Можно интродуцировать консервативные модификации (указанные выше). Мутации могут представлять собой аминокислотные замены, добавления или делеции. Кроме того, как правило, изменяют не более 1, 2, 3, 4 или 5 остатков в СИК-участке.
Таким образом, другим вариантом осуществления изобретения являются выделенные моноклональные антитела к склеростину или функциональный белок, которые содержат антигенсвязывающий
- 15 018756 участок, состоящий из вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет ί.ΌΚ1 УН-области, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 1-11, или аминокислотной последовательности, которая имеет 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с 8Е0 ΙΌ N0: 1-11; СБК2 УН-области, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 12-22, или аминокислотной последовательности, которая имеет 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с 8Е0 ΙΌ N0: 12-22; СБК3 УН-области, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 23-33, или аминокислотной последовательности, которая имеет 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с 8Е0 ΙΌ N0: 23-33; СБК1 Унобласти, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 34-44, или аминокислотной последовательности, которая имеет 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с 8Е0 ΙΌ N0: 34-44; СБК2 Ун-области, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 45-55, или аминокислотной последовательности, которая имеет 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с 8Е0 ΙΌ N0: 45-55; СБК3 Уъ-области, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 56-66, или аминокислотной последовательности, которая имеет 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с 8Е0 ΙΌ N0: 56-66.
Трансплантация антигенсвязывающих доменов в альтернативные остовы или каркасы.
Широкое разнообразие остовов или каркасов антител/иммуноглобулинов можно применять, если образовавшийся полипептид включает по меньшей мере один связывающий участок, который специфически связывается со склеростином. Такие остовы или каркасы включают 5 основных идиотипов человеческих иммуноглобулинов или их фрагментов (которые представлены в настоящем описании) и включают иммуноглобулины других видов животных, которые предпочтительно имеют гуманизированные аспекты. Одноцепочечные антитела, например, идентифицированные в представителях верблюжьих, являются наиболее предпочтительными в этом плане. Специалисты в данной области продолжают открывать и создавать новые остовы, каркасы и фрагменты.
Одним из объектов изобретения является создание антител на основе неиммуноглобулиновых остовов с использованием неиммуноглобулиновых каркасов, в которые можно трансплантировать СЭК, предлагаемые в изобретении. Можно применять известные или открытые в будущем неиммуноглобулиновые остовы и каркасы, если они содержат связывающий участок, специфический для белка-мишени, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 155. Указанные соединения обозначены в настоящем описании как полипептиды, содержащие специфический для мишени связывающий участок. Примеры неиммуноглобулиновых остовов дополнительно описаны в разделах ниже (верблюжьи антитела и каркасы, отличные от характерных для антител каркасов).
Верблюжьи антитела.
Белки антител, полученные из представителей семейства двугорбых и одногорбых верблюдов (Сате1и8 Ьас1пат.15 и Са1е1и§ бготабепщ), включая представителей животных Нового Света, таких как различные виды лам (Бата рассο5, Бата Дата и Бата У1сидиа), охарактеризованы в отношении их размера, структурной комплексности и антигенности в отношении человека. Установлено, что некоторые антитела типа ΙβΟ из этого семейства млекопитающих в естественных условиях лишены легких цепей и поэтому отличаются по структуре от типичной состоящей из четырех цепей четвертичной структуры с двумя тяжелыми и двумя легкими цепями, характерной для антител из организма других животных (см. РСТ/ЕР 93/02214 (№0 94/04678, опубликована 3 марта 1994 г.)).
Участок верблюжьего антитела, представляющий собой небольшую индивидуальную вариабельную область, обозначенную как УН, можно создавать с помощью генной инженерии с получением небольшого белка, обладающего высокой аффинностью к мишени, что приводит к образованию низкомолекулярного выведенного из антитела белка, обозначенного как верблюжье нанотело (см. И8 5759808, выданный 2 июня1998 г.; см. также 81у1етаи8 В. и др., I. Βίο1. СБет, 279, 2004, с. 1256-1261; Οιιιηοιι1ίη Μ. и др., №11иге, 424, 2003, с. 783-788; Р1е8сйЬегдег Μ. и др., Вюсспщёа^е СБет, 14, 2003, с. 440-448; Согΐеζ-К,еΐатοζο У. и др., Ιηΐ I. Сансе!·, 89, 2002, с. 456-462 и Баи^егеук М. и др., ΕΜΒ0 I. 17, 1998, с. 35123520). Созданные библиотеки верблюжьих антител и фрагментов антител доступны на коммерческой основе, например, от фирмы АЬ1унх, Рент, Бельгия. Аналогично другим антителам, полученным из видов, кроме человека, аминокислотную последовательность верблюжьего антитела можно изменять рекомбинантно с получением последовательности, в большей степени напоминающей человеческую последовательность, т.е. нанотело можно гуманизировать. Таким путем можно дополнительно понижать естественную низкую антигенность верблюжьих антител для людей.
Верблюжье нанотело имеет молекулярную массу, составляющую примерно 1/10 от молекулярной массы человеческого ΙβΟ, а физический диаметр белка составляет лишь несколько нанометров. Одной из связанных с малым размером особенностей является способность верблюжьих нанотел связываться с антигенными сайтами, которые являются функционально незаметными для более крупных белковых антител, т.е. верблюжьи нанотела можно применять в качестве реагентов, выявляющих антигены, которые
- 16 018756 остаются скрытыми при использовании классических иммунологических методов, и возможно в качестве терапевтических агентов. Таким образом, другой, связанной с малым размером особенностью верблюжьего нанотела, является способность ингибировать связывание со специфическим сайтом в бороздке или узкой расщелине белка-мишени, и поэтому их можно применять в качестве субстанции, более напоминающей по своей функции классическое низкомолекулярное лекарственное средство, чем классическое антитело.
Небольшая молекулярная масса и компактный размер обусловливает также очень высокую термостабильность, стабильность при экстремальных значениях рН и стабильность к протеолитическому расщеплению и низкую антигенность верблюжьих нанотел. Еще одним следствием указанных особенностей является то, что верблюжьи нанотела легко проникают из кровеносной системы в ткани и даже проникают через гематоэнцефалический барьер и их можно применять для лечения заболеваний, поражающих нервную ткань. Нанотела могут облегчать также транспорт лекарственных средств через гематоэнцефалический барьер (см. заявку на патент США 20040161738, опубликованную 19 августа 2004 г.). Эти особенности в сочетании с низкой антигенностью в отношении людей свидетельствуют об их большом терапевтическом потенциале. Кроме того, эти молекулы можно полностью экспрессировать в прокариотических клетках, таких как Е. сой, и экспрессировать в виде слитых белков с бактериофагом, и они являются функционально активными.
Таким образом, отличительным признаком настоящего изобретения является верблюжье антитело или нанотело, обладающее высокой аффинностью к склеростину. В конкретных вариантах осуществления изобретения верблюжье антитело или нанотело получают в естественных условиях в животном из семейства верблюжьих, т.е. оно продуцируется в организме представителя верблюжьих после иммунизации склеростином или его пептидным фрагментом при применении методов, описанных для других антител. В другом варианте верблюжье нанотело к склеростину конструируют, т.е. получают путем отбора, например, из фаговых дисплейных библиотек соответствующим образом мутированных белком верблюжьих нанотел с помощью метода пэннинга с использованием в качестве мишени склеростина, как описано в приведенных в настоящем описании примерах. Сконструированные нанотела можно дополнительно усовершенствовать с помощью генной инженерии таким образом, чтобы время их полужизни в реципиенте составляло от 45 мин до 2 недель.
В конкретном варианте осуществления изобретения верблюжье антитело или нанотело получают путем трансплантации последовательностей СЭВ тяжелой или легкой цепи человеческих антител, предлагаемых в изобретении, в нанотело или в последовательности каркасных участков однодоменного антитела согласно методу, описанному, например, в РСТ/ЕР 93/02214 (νθ 94/04678).
Нехарактерные для антител каркасы.
Известные неиммуноглобулиновые остовы или каркасы включают (но не ограничиваясь только ими) аднектины (фибронектин) (фирма Сотроипб Тйегареийсз, 1пс., Уолтем, шт. Массачусетс), анкирин (фирма Мо1еси1аг Райпегз АС, Цюрих, Швейцария), домены антител (фирма ОотапШ, Ыб. (Кэмбридж, шт. Массачусетс) и аблинкс (АЫупх пу) (Цвинаарде, Бельгия)), липокалин (антикалин) (фирма Р1егй Рго1ео1аЬ АС, Фрейзинг, Германия), небольшие модульные иммунологические фармацевтические агенты (фирма ТгиЫюп РБагтасеийсаН 1пс., Сиэтл, шт. Вашингтон), макситела (фирма Ау1б1а, 1пс. (МаунтинВью, шт. Калифорния), белок А (фирма АГПЫобу АС, Швеция) и аффилин (гамма-кристаллин или убикитин) (фирма 8сб РгоШпз СтЫН, Галле, Германия), миметики белковых эпитопов (фирма Ро1урйог Ь1б., Аллшвиль, Швейцария).
I. Аднектины - фирма Сотроипб Тйегареийсз.
Основой аднектиновых каркасов является домен фибронектина типа III (например, десятый модуль фибронектина типа III (домен 10 Еп3). Домен фибронектина типа III несет 7 или 8 бета-цепей, которые распределены между двумя бета-складками, которые сами упакованы друг напротив друга с образованием ядра белка, и дополнительно содержат петли (аналоги СОВ), которые соединяют бета-цепи друг с другом и являются доступными для растворителя. Известно по меньшей мере три такие петли на каждом крае бета-складчатого сэндвича, при этом край является границей белка, перпендикулярной к направлению бета-цепей (И8 6818418).
Эти каркасы, основой которых является фибронектин, не представляют собой иммуноглобулин, хотя общая укладка очень похожа на укладку наименьшего обладающего функциональной активностью фрагмента антитела, т.е. вариабельной области тяжелой цепи, который содержит полный распознающий антиген компонент в !§С представителей верблюжьих и лам. Благодаря указанной структуре антитело, не представляющее собой иммуноглобулин, имитирует антигенсвязывающие свойства, которые напоминают по природе и аффинности свойства антител. Эти каркасы можно применять для стратегии рандомизации петель и перестановки ш уйго, подобной процессу созревания аффинности антител ш у1уо. Такие молекулы, основой которых является фибронектин, можно применять в качестве каркасов, в которых области петель молекулы можно заменять на СЭВ, предлагаемые в изобретении, с помощью стандартных методов клонирования.
- 17 018756
II. Анкирин - фирма Мо1еси1аг Райпегк.
Технология основана на применении белков, несущих выведенные из анкирина повторяющиеся модули в качестве каркасов для вариабельных областей, которые можно использовать для связывания с различными мишенями. Повторяющийся анкириновый модуль представляет собой состоящий из 33 аминокислот полипептид, который содержит две антипараллельные α-спирали и β-петли. Связывание вариабельных областей максимально оптимизируют на основе доступности для рибосом.
III. Макситела/авимеры - фирма Ανίάίη.
Авимеры получают из встречающегося в естественных условиях содержащего А-домен белка, такого как ЬВР-1. Эти домены используются в естественных условиях для взаимодействий типа белок-белок, и у человека структурной основой более чем 250 белков являются А-домены. Авимеры состоят из нескольких различных мономеров А-домена (2-10), сцепленных с помощью аминокислотных линкеров. Можно создавать авимеры, которые могут связываться с антигеном-мишенью, с использованием методологии, описанной, например, в 20040175756; 20050053973; 20050048512 и 20060008844.
IV. Белок А - фирма АГПЬобу.
Обладающие аффинностью лиганды АГПЬобу® представляют собой небольшие простые белки, состоящие из трехспирального пучка, основой которого является каркас одного из ^О-связывающих доменов белка А. Белок А представляет собой поверхностный белок бактерии 81арЬу1ососсик аигеик. Этот каркасный домен состоит из 58 аминокислот, 13 из которых произвольно использовали для создания библиотек АГйЬобу® с большим количеством вариантов лиганда (см., например, И8 5831012). Молекулы АГйЬойу® напоминают антитела, их молекулярная масса составляет 6 кДа, для сравнения молекулярная масса антител составляет 150 кДа. Несмотря на небольшой размер, сайт связывания молекул АййЬобу® подобен сайту связывания антитела.
V. Антикалины - фирма Р1епк.
Апйсайпк® представляют собой продукты, разработанные компанией Р1епк Рго!еоЬаЬ АО. Их получают из липокалинов, широко распространенной группы небольших и эффективных белков, которые, как правило, принимают участие в физиологическом транспорте или хранении чувствительных к химическим агентам или нерастворимых соединений. Несколько встречающихся в естественных условиях липокалинов обнаружено в тканях или общей воде организма человека.
Их белковая архитектура напоминает структуру иммуноглобулинов с гипервариабельными петлями на вершине жесткого остова. Однако в отличие от антител или их рекомбинантных фрагментов липокалины состоят из одной полипептидной цепи, содержащей 160-180 аминокислотных остатков, т.е. несколько более крупной, чем один домен иммуноглобулина.
Набор из четырех петель, которые образуют связывающий карман, обладает выраженной структурной пластичностью и допускает широкое разнообразие боковых цепей. Таким образом, при использовании соответствующего процесса сайту связывания можно придавать новую форму, предназначенную для распознавания с высокой аффинностью и специфичностью заранее определенных молекул-мишеней различной формы.
Один из белков семейства липокалинов, а именно связывающий билин белок (ВВР) из Р1епк Ьгакк1сае (капустная белянка), использовали для создания антикалинов путем мутагенеза, затрагивающего четыре петли. Одной из заявок на патент, в которых описаны антикалины, приведенной в качестве примера, является РСТ \У0 199916873.
VI. Аффилин (АГййп) - белки фирмы 8сП Рго!ешк.
Молекулы АГййп™ представляют собой небольшие неиммуноглобулиновые белки, которые разработаны с целью достижения специфических аффинностей к белкам и небольшим молекулам. Новые молекулы АГййп™ можно очень быстро отбирать из двух библиотек, основой каждой из которых являются различные полученные из человеческого организма белки-каркасы.
Молекулы АГййп™ не обладают какой-либо структурной гомологией с белками иммуноглобулинов. На фирме 8сП Рго1етк применяют два АГй1т™-каркаса, одним из которых является гаммакристаллин, человеческий структурный белок хрусталика глаза, а другим являются белки суперсемейства убикитина. Оба человеческих каркаса имеют очень малый размер, характеризуются высокой температуростойкостью и практически устойчивы к изменениям значений рН и действию денатурирующих агентов. Указанная высокая стабильность главным образом является результатом расширенной бетаскладчатой конформации белков. Примеры выведенных из гамма-кристаллина белков описаны в \У0 200104144, а примеры убкитиноподобных белков описаны в \У0 2004106368.
VII. Миметики белковых эпитопов (РЕМ).
РЕМ представляют собой имеющие средний размер, циклические, напоминающие пептиды молекулы (ММ 1-2 кДа), которые имитируют вторичные структуры белков типа бета-шпителек, т.е. основную вторичную структуру, участвующую во взаимодействиях типа белок-белок. В более общем случае любой полипептид, имитирующий 3-мерную структуру эпитопа описанных антител, является частью настоящего изобретения. Предпочтительными вариантами являются полипептиды, состоящие из 30-100 аминокислот, которые содержат, по меньшей мере, такие полипептиды, как Е1-Й-Е2, где Е1 обозначает 8Еф Ш
- 18 018756
N0: 156 и Е2 обозначает 8ЕЦ ГО N0: 157 и Ь обозначает полипептидный линкер, который позволяет Е1 и Е2 воспроизводить 3-мерную структуру области, распознаваемой антителами, предлагаемыми в изобретении. В предпочтительном варианте осуществления изобретения Ь обозначает линкер, состоящий из 10-20 аминокислот, выбранный из глицининовых и сериновых остатков. Предпочтительно линкер Ь содержит пептид 6668666686666 (8Е6 ГО N0: Х/8Е6 ГО N0: 158) или 6666866668666686666 (8Е6 ГО Н0:У/8Е6 ГО N0: 159), более предпочтительно линкер Ь практически состоит из 8ЕЦ ГО N0: X или 8Е6 ГО Н0:У.
Указанные полипептиды должны сохранять высокую аффинность к антителам, предлагаемым в изобретении. Эти полипептиды целесообразно также использовать в качестве иммуногенов для получения антител к склеростину.
Указанные полипептиды можно применять также в качестве антагонистов или агонистов склеростина, и поэтому они могут найти применение, подобное применению, которое указано для антител, предлагаемых в настоящем изобретении.
Полипептиды с одной или несколькими аминокислотными заменами или делециями, предпочтительно затрагивающими не менее 1, 2 или 3 аминокислот заменами или делециями в последовательности Е1 и/или Е2, также являются частью изобретения. Эти полипептиды можно также конструировать так, чтобы они обладали удлиненным временем полужизни или улучшенной стабильностью. Прежде всего, слитые конструкции этих полипептидов с сывороточными белками, такими как Ес-фрагменты 1д6 или человеческий сывороточный альбумин, можно создавать таким образом, чтобы они обладали удлиненным временем полужизни, подобно созданию Ес, что описано в следующем параграфе для молекул фрагментов антител, предлагаемых в изобретении.
Конструирование каркасных участков или Ес.
К сконструированным антителам, предлагаемым в изобретении, относятся антитела, в которых сделаны модификации в остатках каркасных участков в νΗ и/или Уь, например, с целью улучшения свойств антитела. Как правило, такие модификации каркасных участков осуществляют для снижения иммуногенности антитела. Например, один из подходов представляет собой обратное мутирование одного или нескольких остатков каркасного участка с получением соответствующей последовательности зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое было подвергнуто соматической мутации, может содержать остатки каркасного участка, отличающиеся от последовательности зародышевой линии, из которой выведено антитело. Такие остатки можно идентифицировать путем сравнения последовательностей каркасных участков антитела с последовательностями зародышевой линии, из которой выведено антитело. Для возвращения последовательностей каркасного участка к исходной конфигурации зародышей линии соматические мутации можно подвергать обратному мутированию с получением последовательности зародышевой линии, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза или ПЦР-опосредуемого мутагенеза. Такие антитела с обратными мутациями подпадают также под объем настоящего изобретения.
Другой тип модификации каркасного участка включает изменение путем мутации одного или нескольких остатков в каркасном участке или даже в одном или нескольких СЭЯ-участках для удаления Тклеточных эпитопов с целью снижения потенциальной иммуногенности антитела. Этот подход обозначают также как деиммунизация, и он описан более подробно в опубликованном И8 20030153043 на имя Сагг с соавт.
В дополнительном или альтернативном варианте, помимо модификаций в каркасных участках, СЭЯ антитела, предлагаемые в изобретении, могут включать модификации в Ес-фрагменте, как правило, для изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела, таких как время полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание Ес-рецептора и/или антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность. Кроме того, антитело, предлагаемое в изобретении, можно модифицировать химически (например, к антителу можно присоединять один или несколько химических фрагментов) или можно модифицировать для изменения его гликозилирования, и в этом случае с целью изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела. Каждый из указанных вариантов осуществления изобретения будет дополнительно описан ниже. Нумерация остатков в Ес-фрагменте соответствует нумерации ЕЙ по Кэботу.
В одном из вариантов осуществления изобретения модифицируют шарнирную область СН1 так, чтобы изменять, например увеличивать или снижать, количество цистеиновых остатков в шарнирной области. Этот подход описан также в И8 5677425 на имя Вобтег с соавт. Количество цистеиновых остатков в шарнирной области СН1 изменяют, например, для облегчения сборки легких и тяжелых цепей или для повышения или снижения стабильности антитела.
В другом варианте осуществления изобретения шарнирную область Ес-фрагмента антитела можно изменять с помощью мутации для снижения биологического времени полужизни антитела. Более конкретно, интродуцируют одну или несколько аминокислотных мутаций в область контакта СН2-СН3доменов шарнирной области Ес-фрагмента для ухудшения связывания антитела с белком А золотистого стафилококка 81арйу1ососсу1 (8рА) по сравнению со связыванием нативной шарнирной области Есфрагмента с 8рА. Этот подход описан более подробно в И8 6165745 на имя \Уагб с соавт.
- 19 018756
В другом варианте осуществления изобретения антитело модифицируют для удлинения биологического времени полужизни. При этом возможно применение различных подходов. Например, можно интродуцировать одну или несколько из следующих мутаций: Т252Б, Т2548, Т256Р, описанных в И8 6277375 на имя \Уагб. В другом варианте для удлинения биологического времени полужизни можно изменять антитело в СН1- или Съ-области путем интродукции связывающегося с рецептором-спасателем эпитопа, полученного из двух петель СН2-домена Рс-фрагмента 1дС, как описано в И8 5869046 и И8 6121022 на имя Ртейа с соавт.
В других вариантах осуществления изобретения Рс-фрагмент изменяют путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток для изменения эффекторных функций антитела. Например, один или несколько аминокислотных остатков можно заменять на другой аминокислотный остаток так, чтобы у такого антитела изменялась аффинность к эффекторному лиганду, но сохранялась антигенсвязывающая способность родительского антитела. Эффекторный лиганд, аффинность к которому изменяют, может представлять собой, например, Рс-рецептор или С1-компонент комплемента. Этот подход описан более подробно в И8 5624821 и И8 5648260, оба на имя \Ут1ег с соавт.
В другом варианте осуществления изобретения один или несколько аминокислотных остатков аминокислотной последовательности можно заменять другим аминокислотным остатком так, чтобы антитело имело измененную способность к С1д-связыванию и/или пониженную комплементзависимую цитотоксичность (СЭС) или чтобы у него отсутствовала СЭС. Этот подход описан более подробно в И8 6194551 на имя Ии8од1е с соавт.
В другом варианте осуществления изобретения один или несколько аминокислотных остатков модифицируют, изменяя тем самым способность антитела к фиксации комплемента. Этот подход описан также в опубликованной заявке РСТ \У0 94/29351 на имя Вобтег с соавт.
В еще одном варианте осуществления изобретения Рс-фрагмент модифицируют для повышения способности антитела вызывать антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (АЭСС) и/или для повышения аффинности антитела к Рсу-рецептору посредством модификации одной или нескольких аминокислот. Этот подход описан более подробно в опубликованной заявке РСТ \У0 00/42072 на имя Рге51а. Кроме того, были картированы сайты связывания человеческого 1дС1 с РсуК1, РсуКП, РсуКШ и РсЯп и описаны варианты с улучшенной способностью к связыванию (см. 8Ые1б§ Я.Ь. и др., 1. Вю1. СЬеп., 276, 2001, с. 6591-6604).
В следующем варианте осуществления изобретения модифицируют гликозилирование антитела. Например, можно создавать агликозилированное антитело (т.е. антитело, в котором отсутствует гликозилирование). Гликозилирование можно изменять, например, для повышения аффинности антитела к антигену. Такие углеводные модификации можно осуществлять путем, например, изменения одного или нескольких сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Например, можно осуществлять одну или несколько аминокислотных замен, которые приводят к элиминации одного или нескольких сайтов гликозилирования каркасного участка вариабельной области, устраняя тем самым гликозилирование в этом сайте. Указанное агликозилирование может повышать аффинность антитела к антигену. Этот подход описан более подробно в И8 5714350 и И8 6350861 на имя Со с соавт.
В дополнительном или альтернативном варианте можно создавать антитело с измененным типом гликозилирования, например гипофукозилированное антитело, которое имеет пониженное количество фукозильных остатков, или антитело с повышенным содержанием разделяющих пополам С1с№1сструктур. Было продемонстрировано, что такие измененные схемы гликозилирования повышают АЭССактивность антител. Указанные углеводные модификации можно осуществлять, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования известны в данной области, и их можно применять в качестве клетокхозяев, в которых экспрессируют рекомбинантные антитела, предлагаемые в изобретении, для получения тем самым антител с измененным гликозилированием. Например, в ЕР 1176195 на имя Напд с соавт. описана линия клеток с функционально нарушенным геном РИТ8, который кодирует фукозилтрансферазу, в результате чего экспрессируемые в такой клеточной линии антитела характеризуются гипофукозилированием. В опубликованной заявке РСТ \У0 03/035835 на имя Ртейа описан вариант линии СНОклеток, Еес13-клетки, с пониженной способностью присоединять фукозу к связанным с Л§п(297) углеводам, что приводит также к гипофукозилированию антител, экспрессируемых в этой клетке-хозяине (см. также 8Ые1б5 КЬ. и др., 1. Вю1. СЬет., 277, 2002, с. 26733-26740). В опубликованной заявке РСТ \У0 99/54342 на имя Итапа с соавт. описаны линии клеток, сконструированные для экспрессии модифицирующих гликопротеин гликозилтрансфераз (например, бета(1,4)-Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (СпТШ)), в результате чего антитела, которые экспрессируются в сконструированных линиях клеток, характеризуются повышенным содержанием разделяющих пополам С1с№1с-структур, что приводит к повышенной АЭСС-активности антител (см. также Итапа и др., №11. Вю1еск, 17, 1999, с. 176-180).
Другой модификацией антител, подпадающей под объем изобретения, является пэгилирование. Антитело можно пэгилировать, например, для удлинения биологического (например, в сыворотке) времени полужизни антитела. Для пэгилирования антитела, как правило, антитело или его фрагмент подвергают
- 20 018756 взаимодействию с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное ПЭГ, в условиях, при которых одна или несколько ПЭГ-групп присоединяется к антителу или фрагменту антитела. Пэгилирование можно осуществлять с помощью реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой ПЭГ (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие полиэтиленгликоль относится к любым формам ПЭГ, которые используют для дериватизации других белков, таким как моно(С1-С10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликольмалеимид. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело, подлежащее пэгилированию, представляет собой агликолизированное антитело. Методы пэгилирования белков известны в данной области, и их можно применять к антителам, предлагаемым в изобретении (см., например, ЕР 0154316 на имя МкЫтига с соавт. и ЕР 0401384 на имя Шпка\\'а с соавт.).
Другой модификацией антител, подпадающей под объем изобретения, является конъюгат или слитый белок, содержащий, по меньшей мере, антигенсвязывающий участок антитела, предлагаемого в изобретении, с сывороточным белком, таким как человеческий сывороточный альбумин или его фрагмент, с целью удлинения времени полужизни образовавшейся молекулы. Такой подход описан, например, у Ва1кте с соавт. в ЕР 0322094.
Другим возможным вариантом является слияние по меньшей мере одного антигенсвязывающего участка антитела, предлагаемого в изобретении, с белками, которые могут связываться с сывороточными белками, такими как человеческий сывороточный альбумин, удлиняя время полужизни образовавшейся молекулы. Такой подход описан у Хунген с соавт. в ЕР 0486525.
Методы создания измененных антител.
Как указано выше, антитела к склеростину, которые имеют последовательности УН и Уъ или последовательности полноразмерной тяжелой и легкой цепи, представленные в настоящем описании, можно применять для создания новых антител к склеростину путем модификации последовательностей полноразмерной тяжелой цепи и/или легкой цепи, последовательностей УН и/или Уъ или присоединенных к ним константных областей. Таким образом, согласно другому объекту изобретения структурные особенности антитела к склеростину, предлагаемого в изобретении, используют для создания структурно родственных антител к склеростину, которые сохраняют по меньшей мере одно из функциональных свойств антител, предлагаемых в изобретении, таких как связывание с человеческим склеростином, а также ингибирование одного или нескольких функциональных свойств склеростина (например, связывание с рецептором, предупреждение или снижение остеолиза).
Например, один или несколько СЭК-участков антител, предлагаемых в настоящем изобретении, или их мутантов можно объединять рекомбинантно с известными каркасными участками и/или другими СЭЕ для создания дополнительных, созданных с использованием рекомбинантной ДНК антител к склеростину, предлагаемых в изобретении, с помощью указанных выше методов. Другие типы модификаций включают модификации, описанные в предыдущем разделе. Исходным материалом для конструирования является одна или несколько последовательностей УН и/или Уъ, представленных в настоящем описании, или один или несколько из их СЭК-участков. Для создания сконструированного антитела не является необходимым фактическое получение (т.е. экспрессия в виде белка) антитела, которое имеет одну или несколько из последовательностей УН и/или Уъ, представленных в настоящем описании, или одного или нескольких их СЭК-участков. Предпочтительно информацию, содержащуюся в последовательности(ях), используют в качестве исходного материала для создания последовательности(ей) второго поколения, выведенной(ых) из исходной(ых) последовательности(ей), и затем получают последовательность(и) второго поколения и экспрессируют в виде белка.
Таким образом, еще одним вариантом осуществления изобретения является способ получения антитела к склеростину, состоящего из последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела, которая содержит последовательность СЭК1, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 1-11, последовательность СЭК2, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 12-22, и/или последовательность СЭК3, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 23-33; последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, которая содержит последовательность СЭКЕ выбранную из группы, включающей 8ЕЭ ΙΌ N0: 34-44, последовательность СЭК2, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ N0: 45-55, и/или последовательность СЭК3, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 56-66; заключающийся в том, что изменяют по меньшей мере один аминокислотный остаток в последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела и/или вариабельной области легкой цепи антитела для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела; и экспрессируют измененную последовательность антитела в виде белка.
Таким образом, другим вариантом осуществления изобретения является способ получения антитела к склеростину, оптимизированного для экспрессии в клетке млекопитающего, которое состоит из полноразмерной последовательности тяжелой цепи антитела, которая имеет последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЭ ΙΌ N0: 111-121; полноразмерной последовательности легкой цепи антитела, которая имеет последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЭ ΙΌ N0: 122-132; заключающийся в том, что изменяют по меньшей мере один аминокислотный остаток в полноразмерной по
- 21 018756 следовательности тяжелой цепи антитела и/или в полноразмерной последовательности легкой цепи антитела для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела; и экспрессируют измененную последовательность антитела в виде белка.
Измененную последовательность антитела можно создавать также путем скрининга библиотек антител, которые имеют фиксированные последовательности СИКЗ, выбранные из группы, включающей 8Е0 1И N0: 23-33, или минимальные имеющие решающие значения связывающие детерминанты, описанные в И8 20050255552, и разнообразные последовательности СИК1 и СИК2. Скрининг можно осуществлять с использованием любого метода скрининга, пригодного для скрининга антител из библиотек антител, такого как технология фагового дисплея.
Для получения и экспрессии измененной последовательности антитела можно применять стандартные методы молекулярной биологии. Антитело, кодируемое измененной(ыми) последовательностью(ями), представляет собой антитело, которое сохраняет одну, несколько или все функциональные свойства антител к склеростину, представленных в настоящем описании, где функциональные свойства представляют собой (но не ограничиваясь только ими) специфическое связывание с человеческим склеростином; и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа передачи сигнала νηΐ. антитело блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа минерализации или блокирует ингибирующее действие склеростина при оценке фосфорилирования 8та01, или антитело ингибирует связывание склеростина с ЬКР-6, или антитело усиливает формирование кости, повышает ее массу и плотность.
Измененное антитело может обладать одним или несколькими, двумя или более или тремя или более из указанных выше функциональных свойств.
Функциональные свойства измененных антител можно оценивать с помощью стандартных анализов, известных в данной области и/или представленных в настоящем описании, таких как описанные в примерах (например, ЕЫ8А).
В конкретных вариантах способов создания антител, предлагаемых в изобретении, мутации можно интродуцировать произвольно или избирательно во всю или в часть кодирующей последовательности антитела к склеростину и полученные в результате модифицированные антитела к склеростину можно подвергать скринингу в отношении связывающей активности и/или других описанных выше функциональных свойств. Методы интродукции мутаций известны в данной области. Например, в опубликованной заявке РСТ \У0 02/092780 на имя 81юг1 описаны методы создания и скрининга мутаций антител с помощью насыщающего мутагенеза, синтетической сборки лигированием или с помощью комбинации этих методов. В опубликованной заявке РСТ \У0 03/074679 на имя Ьахаг с соавт. описаны альтернативные методы, основанные на вычислительном скрининге для оптимизации физико-химических свойств антител.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела, предлагаемые в изобретении.
Следующим объектом изобретения являются молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют антитела, предлагаемые в изобретении. Примерами родительских нуклеотидных последовательностей полноразмерной легкой цепи являются последовательности, представленные в 8ЕО 1И N0: 144-145. Примерами родительских нуклеотидных последовательностей полноразмерной тяжелой цепи являются последовательности, представленные в 8Е0 1И N0: 133-134. Примерами родительских нуклеотидных последовательностей полноразмерной легкой цепи, оптимизированных для экспрессии в клетке млекопитающего, являются последовательности, представленные в 8Е0 1И N0: 146-154. Примерами родительских нуклеотидных последовательностей полноразмерной тяжелой цепи, оптимизированных для экспрессии в клетке млекопитающего, являются последовательности, представленные в 8Е0 1И N0: 135143.
Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточных лизатах или могут представлять собой нуклеиновые кислоты в частично очищенной или практически чистой форме. Нуклеиновую кислоту выделяют или получают ее в практически очищенном виде, когда ее очищают от других клеточных компонентов или других загрязнителей, например других присутствующих в клетке нуклеиновых кислот или белков, с помощью стандартных методов, включая обработку щелочью/ДСН, С§С1бэндинг, хроматографию на колонках, электрофорез в агарозном геле и других методов, хорошо известных в данной области (см. СиггеШ РгоФсоИ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, под ред. Р. Аи5иЬе1 и др., изд-во Сгеепе РиЫЫппд ап, ^11еу 1п1ег5с1епсе, №\ν Уогк, 1987). Нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, может представлять собой, например, ДНК или РНК и может содержать интронные последовательности или не содержать их. В одном из вариантов осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК. Нуклеиновая кислота может присутствовать в векторе, таком как фаговый дисплейный вектор или рекомбинантный плазмидный вектор.
Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, можно получать с помощью стандартных методов молекулярной биологии. Для антител, экспрессируемых гибридомами (например, гибридомами, полученными из трансгенных мышей, которые несут гены человеческих иммуноглобулинов, что будет описано ниже), кДНК, которые кодируют легкие и тяжелые цепи антитела, созданные с использованием
- 22 018756 гибридомы, можно получать с помощью стандартных методов ПЦР-амплификации или клонирования кДНК. Для антител, которые получают из библиотеки генов иммуноглобулинов (например, с помощью метода фагового дисплея), нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, можно выделять из различных фаговых клонов, которые являются компонентами библиотеки.
После получения ДНК-фрагментов, кодирующих Ун- и Уъ-области, эти ДНК-фрагменты можно подвергать дополнительной обработке с помощью стандартных методов рекомбинантной ДНК, например, для превращения генов вариабельной области в гены полноразмерной цепи антитела, в гены ЕаЬфрагмента или в ген ксЕу-фрагмента. При осуществлении этого процесса ДНК-фрагмент, кодирующий Уъ или Ун, функционально связывают с другой молекулой ДНК или фрагментом, кодирующей/кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Понятие функционально связанный в контексте настоящего описания означает, что два ДНК-фрагмента соединяют функциональным образом, в результате чего аминокислотные последовательности, кодируемые двумя ДНК-фрагментами, сохраняются в рамке считывания, или в результате чего белок экспрессируется под контролем требуемого промотора.
Выделенную ДНК, кодирующую Ун-область, можно превращать в ген полноразмерной тяжелой цепи путем функционального связывания ДНК, которая кодирует Ун, с другой молекулой ДНК, которая кодирует константные области тяжелой цепи (Сн1, Сн2 и СН3). Последовательности генов константной области тяжелой цепи известны в данной области (см., например, КаЬа! Е.А. и др., Зециепсек о£ Рго1еш8 о£ 1ттипо1ощса1 1п1еге51 15-е изд., изд-во И.8. Эераг1теп1 о£ ИеаПП апй нитап 8егу1се5, N14 РиЬНсайоп N0. 91-3242, 1991), и ДНК-фрагменты, включающие эти области, можно получать с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константная область может представлять собой константную область 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА, 1дЕ, 1дМ или 1дЭ. Предпочтительно константную область тяжелой цепи выбирают среди 1дС2-изотипов. В случае гена ЕаЬ-фрагмента тяжелой цепи ДНК, кодирующую Ун, можно функционально связывать с другой молекулой ДНК, которая кодирует только константную область СН1 тяжелой цепи.
Выделенную ДНК, кодирующую Уъ-область, можно превращать в ген полноразмерной легкой цепи (а также в ген легкой цепи ЕаЬ-фрагмента) путем функционального связывания ДНК, кодирующей Уъ, с другой молекулой ДНК, которая кодирует константную область легкой цепи, т.е. СЬ. Последовательности человеческих генов константной области легкой цепи известны в данной области (см., например, КаЬа! Е.А. и др., Зециепсек о£ РгсИеиъ о£ 1ттипо1од1са1 1и1еге51, 15-е изд., изд-во И.8. Эераг1теи1 о£ неа11й апй нитап Зегуюек, МИ РиЫюайоп №. 91-3242, 1991), и ДНК-фрагменты, включающие эти области, можно получать с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа- или лямбда-цепи.
Для создания гена ксЕу ДНК-фрагменты, которые кодируют Ун и Уъ, функционально связывают с другим фрагментом, который кодирует гибкий линкер, например который кодирует аминокислотную последовательность (С1у4-8ег)3, в результате чего последовательности Ун и Уъ можно экспрессировать в виде смежного одноцепочечного белка, в котором Уь- и Ун-области соединены гибким линкером (см., например, В1гй и др., 8с1епсе, 242, 1988, с. 423-426; нийоп и др., Ргос. №11. Асай. 8ст И8А, 85, 1988, с. 5879-5883; МсСайейу и др., №1иге, 348, 1990, с. 552-554).
Создание моноклональных антител, предлагаемых в изобретении.
Моноклональные антитела (МАт) можно получать с помощью различных методов, включая общепринятые методы получения моноклональных антител, например, с помощью стандартного метода гибридизации соматических клеток, описанного у КоЫег и М1к1ет, Шипе, 256, 1975, с. 495. Для получения моноклональных антител можно применять многочисленные методики, например трансформацию Влимфоцитов вирусами или онкогенами.
Применяемая для получения гибридом система животного происхождения представляет собой систему, основанную на использовании мышей. Создание гибридомы в мыши является хорошо известной процедурой. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов, предназначенных для слияния, хорошо известны в данной области. Компоненты, участвующие в слиянии (например, клетки мышиной миеломы), и процедуры слияния также хорошо известны.
Химерные или гуманизированные антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получать на основе последовательности мышиного моноклонального антитела, полученного согласно описанному выше методу. ДНК, кодирующую тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов, можно получать из представляющей интерес мышиной гибридомы и создавать так, чтобы она содержала немышиные (например, человеческие) последовательности иммуноглобулинов, с помощью стандартных методов молекулярной биологии. Например, для создания химерного антитела мышиные вариабельные области можно связывать с человеческими константными областями с использованием известных в данной области методов (см., например, И8 4816567 на имя СаЬ111у с соавт.). Для создания гуманизированного антитела мышиные СОВ-участки можно встраивать в человеческий каркасный участок с помощью известных в данной области методов (см., например, И8 5225539 на имя ХУйНег и И8 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 на имя Оиееп с соавт.).
В конкретном варианте осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, пред
- 23 018756 ставляют собой человеческие моноклональные антитела. Такие человеческие моноклональные антитела к склеростину можно создавать с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих фрагменты человеческой, а не мышиной иммунной системы. К этим трансгенным и трансхромосомным мышам относятся мыши, обозначенные в контексте настоящего описания как НиМЛЬ-мыши и КМмыши соответственно, и мышей обеих указанных линий обозначают в контексте настоящего описания как мыши, несущие человеческий !§.
Мыши линии НиМАЬ (НиМАЬ тоике®, фирма Мейагех, Шс.) содержат минилокусы гена человеческого иммуноглобулина, который кодирует неперегруппированные последовательности человеческой тяжелой (μ и γ) и легкой κ-цепи иммуноглобулина, в сочетании с целевыми мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы μ- и κ-цепи (см., например, ЬоиЬегд и др., №1иге. 368(6474), 1994, с. 856859). Таким образом, у мыши снижена способность экспрессировать мышиный ^М или κ-цепь, и в ответ на иммунизацию интродуцированные трансгены человеческой тяжелой и легкой цепи подвергаются переключению класса и соматическому мутированию с образованием обладающего высокой аффинностью человеческого моноклонального ^Ск (ЬоиЬегд N. и др., 1994, выше; обзорная статья ЬоиЬегд К, НапйЬоок ок Е.хрептеп1а1 Ркагтасо1о§у, 113, 1994, с. 49-101; ЬоиЬегд N. и Никхаг Ό., Шеги. Яеу. Iттиηо1., 13, 1995, с. 65-93 и Нагйшд Р. и ЬоиЬегд К, Апп. N. Υ. Асай. 8ск 764, 1995, с. 536-546). Получение и применение мышей линии НиМАЬ и геномные модификации, которые несут такие мыши, описаны также у Тау1ог Ь. и др., №.1с1ею Ас1йк Яекеагсй, 20, 1992, с. 6287-6295; С’Неп I. и др., [п1егпа11опа1 !ттипо1оду 5, 1993, с. 647-656; ТиаШоп и др., Ргос. Асай. 8ск И8А, 94, 1993, с. 3720-3724; С’1ю1 и др., №Циге Сепе1108 4, 1993, с. 117-123; Сйеп I. и др., ЕМВ0 I., 12, 1993, с. 821-830; ТиаШоп и др., I. ]ттипо1., 152, 1994, с. 2912-2920; Тау1ог Ь. и др., [п1егпа11опа1 [ттипо1оду, 1994, с. 579-591 и Είκ1ι\νίΗ Ό. и др., №Циге В1о1ес11по1оду, 14, 1996, с. 845-851, содержание всех публикаций специально полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки (см. также И8 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; все на имя ЬопЬегд и Кау; И8 5545807 на имя 8игаш с соавт.; опубликованные заявки РСТ ΧΧΌ 92103918, ΧΧΌ 93/12227, ΧΧΌ 94/25585, ΧΧΌ 97113852, ΧΧΌ 98/24884 и ХУ0 99/45962, все на имя ЬопЬегд и Кау; и опубликованную заявку РСТ ХУ0 01/14424 на имя Когтап с соавт.).
В другом варианте осуществления изобретения человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, можно получать с использованием мыши, которая несет последовательности человеческого иммуноглобулина на трансгенах и трансхромосомах, например мыши, которая несет трансген человеческой тяжелой цепи и трансхромосому человеческой легкой цепи. Такие мыши, обозначенные в контексте настоящего описания как КМ-мыши, описаны подробно в публикации РСТ ХУ0 02/43478 на имя Шийа с соавт.
В данной области известны также другие системы на основе трансгенных животных, экспрессирующих гены человеческого иммуноглобулина, и их можно применять для получения антител к склеростину, предлагаемых в изобретении. Например, можно использовать другую трансгенную систему, обозначенную как Хепотоике (фирма АЬдешх, Шс.); такие мыши описаны, например, в И8 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963 на имя Кисйейарай с соавт.
Кроме того, в данной области известны также другие транхромосомные системы, созданные на основе животных, для экспрессии генов человеческого иммуноглобулина, и их можно применять для получения антител к склеростину, предлагаемых в изобретении. Например, можно использовать мышей, несущих как трансхромосому человеческой тяжелой цепи, так и трансхромосому человеческой легкой цепи, которые обозначены как ТС-мыши; такие мыши описаны, например, у Топихика и др. Ргос. №111. Асай. 8ск И8А, 97, 2000, с. 722-727. Кроме того, в данной области известны коровы, несущие трансхромосомы человеческой тяжелой и легкой цепи (Кигойта и др., №Циге В1о1ес11по1оду, 20, 2002, с. 889-894) и их можно применять для получения антител к склеростину, предлагаемых в изобретении.
Человеческие моноклональные антитела, предлагаемые в изобретении, можно получать также с использованием методов фагового дисплея для скрининга библиотек генов человеческих иммуноглобулинов. В данной области разработаны такие методы фагового дисплея для выделения человеческих антител (см., например, ϋδ 5223409; 5403484 и 5571698 на имя Ьайпег с соавт.; И8 5427908 и 5580717 на имя Оо\тег с соавт.; И8 5969108 и 6172197 на имя МсСаГГейу с соавт. и И8 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 на имя СпГПШк с соавт.).
Человеческие моноклональные антитела, предлагаемые в изобретении, можно получать также с использованием 8СГО-мышей (мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом), в которых восстанавливали человеческие иммуноциты с тем, чтобы при иммунизации можно было получать человеческий гуморальный иммунный ответ. Такие мыши описаны, например, в ϋδ 5476996 и 5698767 на имя ХУйкоп с соавт.
Создание гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела.
Для создания гибридом, которые продуцируют человеческие моноклональные антитела, предлагаемые в изобретении, можно выделять спленоциты и/или клетки лимфатических узлов из иммунизированных мышей и сливать с соответствующей иммортализованной линий клеток, такой как линия клеток
- 24 018756 мышиной миеломы. Образовавшиеся гибридомы можно подвергать скринингу в отношении производства специфических для антигена антител. Например, суспензии индивидуальных клеток селезеночных лимфоцитов из иммунизированных мышей можно сливать в количестве, составляющем одну шестую часть от количества клеток несекретирующейся мышиной миеломы линии Р3Х63-Ад8.653 (АТСС, СКЬ 1580) с помощью 50% ПЭГ. Клетки высевают примерно из расчета 2х105/лунку в плоскодонные титрационные микропланшеты, затем инкубируют в течение 2 недель в среде для селекции, содержащей 20% фетальной сыворотки (С1опе), кондиционированной среды 653, 5% оригена (фирма 1СЕХ), 4 мМ Ьглутамин, 1 мМ пируват натрия, 5 мМ ΗΕΓΕ8, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанол, 50 ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 50 мкг/мл гентамицина и 1хГАТ (фирма 81дта; ГАТ добавляют через 24 ч после слияния). Примерно через 2 недели клетки можно культивировать в среде, в которой ГАТ заменен на ГТ. Затем индивидуальные лунки можно подвергать скринингу с помощью ЕЫ8А в отношении человеческих моноклональных антител в виде 1дМ и 1дС. После достижения интенсивного роста гибридом осуществляют мониторинг среды, как правило, через 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитела, можно пересевать, вновь подвергать скринингу, и если все еще сохраняется позитивная реакция в отношении человеческого 1дС, то человеческие моноклональные антитела можно субклонировать, по меньшей мере, дважды с использованием ограничивающего разведения. Затем стабильные субклоны можно культивировать ίη У1!го для получения небольших количеств антител в среде для культуры ткани с целью дальнейшей характеризации.
Для очистки человеческих моноклональных антител отобранные гибридомы можно выращивать в 2-литровых вращающихся колбах с целью очистки моноклональных антител. Супернатанты можно фильтровать и концентрировать перед осуществлением аффинной хроматографии с использованием белка А-сефарозы (фирма РНагтас1а, Пискатавей, шт. Нью-Джерси). Элюированный 1дС можно проверять с помощью гель-электрофореза и жидкостной хроматографии высокого разрешения для гарантии чистоты. Буферный раствор можно заменять на ЗФР и концентрацию определять на основе ОП280 с использованием коэффициента экстинкции 1,43. Моноклональные антитела можно разделять на аликвоты и хранить при -80°С.
Создание трансфектом, продуцирующих моноклональные антитела.
Антитела, предлагаемые в изобретении, можно получать также в трансфектоме клетки-хозяина с использованием, например, комбинации методов рекомбинантной ДНК и методов генной трансфекции, которые хорошо известны в данной области (см., например, Моткоп 8., 8с1епсе, 229, 1985, с. 1202). Например, для экспрессии антител или фрагментов антител ДНК, которые кодируют частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, можно получать с помощью стандартных методов молекулярной биологии (например, с помощью ПЦР-амплификации или клонирования кДНК с использованием гибридом, которые экспрессируют представляющее интерес антитело), и ДНК можно встраивать в экспрессионные векторы таким образом, чтобы гены были функционально связаны с контролирующими транскрипцию и трансляцию последовательностями. В этом контексте подразумевается, что понятие функционально связанный означает, что ген антитела встраивают путем лигирования в вектор таким образом, чтобы присутствующие в векторе контролирующие транскрипцию и трансляцию последовательности выполняли свойственные им функции регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Выбранные экспрессионный вектор и контролирующие экспрессию последовательности должны быть совместимы с применяемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно встраивать в различные векторы или, как правило, оба гена встраивают в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антитела встраивают в экспрессионный вектор стандартными методами (например, встраивают путем лигирования комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора, или путем лигирования затупленных концов, если отсутствуют какие-либо сайты рестрикции). Вариабельные области легких и тяжелых цепей антител, предлагаемых в изобретении, можно использовать для создания полноразмерных генов антител любых изотипов путем встраивания их в экспрессионные векторы, которые уже кодируют константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи требуемого изотипа таким образом, чтобы ^-область была функционально связана с СНсегментом(ами) в векторе, а νι-область функционально связана с СЬ-областью в векторе. В другом или дополнительном варианте осуществления изобретения рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в векторе так, чтобы сигнальный пептид был связан в рамке считывания с ^концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из белка, не относящегося к иммуноглобулинам).
Помимо генов цепи антитела рекомбинантные экспрессионные векторы, предлагаемые в изобретении, несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антитела в клетке-хозяине. Подразумевается, что понятие регуляторная последовательность относится к промоторам, энхансерам и другим контролирующим экспрессию элементам (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепи антитела. Указанные регуля
- 25 018756 торые последовательности описаны, например, у Соеббе1 (Сепе Ехргеккюп ТесНпо1оду. МеЛобк ίη Εηζγшо1оду 185, изд-во Асабетк Ргекк, 8ап П1едо, СА 1990). Специалистам в данной области должно быть очевидно, что создание экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, требуемый уровень экспрессии белка и т.д. Регуляторные последовательности для экспрессии в клетках млекопитающих включают вирусные элементы, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, выведенные из цитомегаловируса (СМУ), обезьяньего вируса 40 (8У40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (АбМЬР)) и вируса полиомы. В альтернативном варианте можно использовать невирусные регуляторные последовательности, такие как промотор убикитина или промотор Р-глобина. Кроме того, можно применять регуляторные элементы, состоящие из полученных из разных источников последовательностей, такие как промоторная система 8га, которая содержит последовательности раннего промотора 8У40 и длинный концевой повтор вируса типа 1 человеческого Т-клеточного лейкоза (ТакеЬе Υ, и др., Мо1. Се11, Вю1. 8, 1988, с. 466-472).
Помимо генов цепи антитела и регуляторных последовательностей рекомбинантные экспрессионные векторы, предлагаемые в изобретении, могут нести дополнительные последовательности, например последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, сайты инициации репликации) и гены селектируемых маркеров. Гены селектируемых маркеров облегчают отбор клеток-хозяев, в которые интродуцирован вектор (см., например, И8 №№ 4399216, 4634665 и 5179017, все на имя Ахе1 с соавт.). Например, как правило, ген селектируемого маркера обусловливает устойчивость клетки-хозяина, в которую интродуцирован вектор, к лекарственным средствам, таким как С418, гигромицин или метотрексат. К генам селектируемых маркеров относятся ген дигидрофолатредуктазы (ΌΗΕΚ) (для применения в бНГг-клетках-хозяевах при селекции/амплификации в присутствии метотрексата) и ген пео (для отбора в присутствии С418).
Для экспрессии легких и тяжелых цепей экспрессионным(ыми) вектором(ами), кодирующим(ими) тяжелые и легкие цепи, трансфектируют клетку-хозяина с помощью стандартных методов. Под различные формы понятия трансфекция подпадает широкое разнообразие методов, обычно применяемых для интродукции экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например электропорация, осаждение фосфатом кальция, трансфекция с использованием ДЭАЭ ((диэтиламино)этилцеллюлоза)-декстрана и т.п. Теоретически можно экспрессировать антитела, предлагаемые в изобретении, как в прокариотических, так и в эукариотических клетках-хозяевах. Считается, что следует осуществлять экспрессию в эукариотических клетках, прежде всего в клетках-хозяевах млекопитающих, поскольку указанные эукариотические клетки и, прежде всего, клетки млекопитающих с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, могут обеспечивать сборку и секрецию имеющего правильную укладку и обладающего иммунологической активностью антитела. Установлено, что экспрессия генов антител в прокариотических хозяевах не может эффективно обеспечивать высокие уровни производства активного антитела (Вокк М.А. и \Уооб С.К., Иптипокду Тобау, 6, 1985, с. 12-13).
Клетки-хозяева млекопитающих, предназначенные для экспрессии рекомбинантных антител, предлагаемых в изобретении, представляют собой клетки яичника китайского хомячка (СНО-клетки) (включая СНО-клетки с дефицитом бНГг (бНГг-), описанные у Иг1аиЬ и СБакт, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 77, 1980, с. 4216-4220, которые применяют в сочетании с селектируемым маркером ΌΗΕΚ, например, как описано у К.Г КаиГтап и Р.А. 8Ьагр, Мо1. Вю1., 159, 1982, с. 601-621, клетки миеломы линии N80, С08клетки и 8Р2-клетки. В частности, для применения в сочетании с клетками миеломы N80 используют другую экспрессионную систему, представляющую собой экспрессионную систему С8-гена, как описано в \У0 87/04462, \У0 89/01036 и ЕР 338841. Когда рекомбинантные экспрессионные векторы, кодирующие гены антитела, интродуцируют в клетки-хозяева млекопитающих, то антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для осуществления экспрессии антитела в клетке-хозяине или секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клеткихозяева. Антитела можно выделять из культуральной среды с помощью стандартных методов очистки белков.
Биспецифические молекулы.
Следующим объектом настоящего изобретения являются биспецифические молекулы, содержащие антитело к склеростину или его фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в изобретении. Антитело, предлагаемое в изобретении, или его антигенсвязывающие участки можно дериватизировать или связывать с другой функционально активной молекулой, например с другим пептидом или белком (например, с другим антителом или лигандом рецептора), с получением биспецифической молекулы, которая связывается по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания или молекулами-мишенями. Антитело, предлагаемое в изобретении, фактически можно дериватизировать или связывать более чем с одной другой функционально активной молекулой с образованием мультиспецифических молекул, которые связываются более чем с двумя различными сайтами связывания и/или молекулами-мишенями; подразумевается, что в контексте настоящего описания указанные мультиспецифические молекулы также подпадают под понятие биспецифическая молекула. Для создания биспецифической молекулы, предлагаемой в изо
- 26 018756 бретении, антитело, предлагаемое в изобретении, можно функционально связывать (например, путем химического сочетания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одной или несколькими другими связывающими молекулами, такими как другое антитело, фрагмент антитела, пептид или связывающий миметик, с получением биспецифической молекулы.
Таким образом, настоящее изобретение относится к биспецифическим молекулам, которые имеют по меньшей одну первую специфичность, обладающую способностью к связыванию со склеростином, и вторую специфичность, обладающую способностью к связыванию со вторым эпитопом-мишенью. Например, второй эпитоп-мишень представляет собой второй эпитоп склеростина, отличный от первого эпитопа-мишени. Другим примером является биспецифическая молекула, которая содержит по меньшей мере одну первую специфичность, обладающую способностью к связыванию со склеростином, и вторую специфичность, обладающую способностью к связыванию с эпитопом внутри ΌΚΚ1. Еще одним примером является биспецифическая молекула, которая содержит по меньшей мере одну первую специфичность, обладающую способностью к связыванию со склеростином, и вторую специфичность, обладающую способностью к связыванию с эпитопом внутри ЬВР4.
Кроме того, согласно варианту осуществления изобретения, в котором биспецифическая молекула является мультиспецифической, молекула может дополнительно включать третью специфичность, обладающую способностью к связыванию, в дополнение к первому и второму эпитопу-мишени.
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифические молекулы, предлагаемые в изобретении, содержат в качестве специфичности, обладающей способностью к связыванию, по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела, например ТаЬ, ТаЬ', Т(аЬ')2, Εν или одноцепочечный Εν. Антитело может представлять собой также димер легких цепей или тяжелых цепей или любой его минимальный фрагмент, такой как Εν, или одноцепочечную конструкцию, описанную у Ьайпег и др., И8 № 4946778, содержание которого специально включено в настоящее описание в качестве ссылки.
К другим антителам, которые можно применять в биспецифических молекулах, предлагаемых в изобретении, относятся мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела.
Биспецифические молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получать путем конъюгации компонентов, представляющих собой обладающие способностью к связыванию специфичности, с помощью методов, известных в данной области. Например, каждую обладающую способностью к связыванию специфичность биспецифической молекулы можно создавать по отдельности и затем конъюгировать друг с другом. Когда обладающие способностью к связыванию специфичности представляют собой белки или пептиды, для ковалентной конъюгации можно использовать целый ряд агентов для связывания или перекрестного сшивания. Примерами перекрестно сшивающих агентов являются белок А, карбодиимид, №сукцинимидил-8-ацетилтиоацетат (8ЛТЛ), 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойная кислота) (ΌΤΗΒ), о-фенилендималеимид (οΡΌΜ), №сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (8РЭР) и сульфосукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-8МСС) (см., например, Κορονδ^ и др., 1. Ехр. Мей., 160, 1984, с. 1686; Ьш М.А. и др., Ргос. ИаЙ. Асай. 8с1. И8Л, 82, 1985, с. 8648). Другие методы представляют собой методы, описанные у Раи1и8, Вейппд Бъ. М1й. №. 78, 1985, с. 118-132; Вгеииап и др., 8с1епсе, 229, 1985, с. 81-83) и 61епп1е и др., 1. Iттипο1., 139, 1987, с. 2367-2375). Такие предназначенные для конъюгации агенты, как 8АТА и сульфо-8МСС, оба поступают в продажу от фирмы Р1егсе Сйет1са1 №. (Рокфорд, шт. Иллинойс).
Когда обладающие способностью к связыванию специфичности представляют собой антитела, то их можно конъюгировать с помощью сульфгидрильной связи С-концевых шарнирных областей двух тяжелых цепей. В конкретном варианте осуществления изобретения шарнирную область модифицируют так, чтобы она до конъюгации содержала нечетное количество сульфгидрильных остатков, например один.
В альтернативном варианте обе обладающие способностью к связыванию специфичности можно кодировать в одном и том же векторе и экспрессировать и собирать в одной и той же клетке-хозяине. Этот метод является наиболее целесообразным, когда биспецифическая молекула представляет собой слитый белок, такой как МАт х МАт, МАт х ЕаЬ, ЕаЬ х Е(аЬ')2 или лиганд х ЕаЬ. Биспецифическая молекула, предлагаемая в изобретении, может представлять собой одноцепочечную молекулу, которая содержит одноцепочечное антитело и связывающую детерминанту, или одноцепочечную биспецифическую молекулу, которая содержит две связывающие детерминанты. Биспецифические молекулы могут содержать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Методы получения биспецифических молекул описаны, например, в И8 5260203; 5455030; 4881175; 5132405; 5091513; 5476786; 5013653; 5258498 и 5482858.
Связывание биспецифических молекул с их специфическими мишенями можно подтверждать, например, твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЫ8Л), радиоиммуноанализом (РИА), ЕАС8анализом, биологическим анализом (например, ингибирование роста) или анализом методом вестернблоттинга. Каждый из указанных анализов позволяет выявлять присутствие конкретных представляющих интерес комплексов белок-антитело при использовании меченого реагента (например, антитела), специфического в отношении представляющего интерес комплекса.
- 27 018756
Многовалентные антитела.
Следующим объектом настоящего изобретения являются многовалентные соединения, содержащие по меньшей мере два идентичных или различных антигенсвязывающих участка антител, предлагаемых в изобретении, которые связываются со склеростином. Предпочтительно с учетом тримерной природы склеростина соединения, предлагаемые в изобретении, содержат по меньшей мере три или четыре антигенсвязывающих участка антител.
Антигенсвязывающие участки можно соединять вместе путем белкового слияния или ковалентной или нековалентной связи. В другом варианте можно применять методы связывания, описанные для биспецифических молекул.
Четырехвалентные соединения можно получать, например, путем перекрестного сшивания антител, предлагаемых в изобретении, с антителом, которое связывается с константными областями антител, предлагаемых в изобретении, например с Ес или шарнирной областью.
Тримеризованный домен описан, например, в патенте на имя Вогеап ЕР 1012280В1. Пентамеризованные модули описаны, например, в РСТ/ЕР 97/05897.
Фармацевтические композиции.
Следующим объектом настоящего изобретения является композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая одно или комбинацию моноклональных антител или их антигенсвязывающий(ие) участок(ки), предлагаемые в настоящем изобретении, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут включать одно или комбинацию (например, два или большее количество различных) антител или иммуноконъюгатов или биспецифических молекул, предлагаемых в изобретении. Например, фармацевтическая композиция, предлагаемая в изобретении, может содержать комбинацию антител, которые связываются с различными эпитопами на антигене-мишени или которые обладают дополнительным видом активности.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, можно применять также для совместной терапии, т.е. в сочетании с другими средствами. Например, для совместной терапии можно применять антитело к склеростину, предлагаемое в настоящем изобретении, в сочетании по меньшей мере с одним другим противовоспалительным или антиостеопорозным средством. Примеры терапевтических средств, которые можно применять в совместной терапии, более подробно описаны ниже в разделе, посвященном применению антител, предлагаемых в изобретении. Композиции предпочтительно приготавливают таким образом, чтобы они имели физиологическое значение рН.
В контексте настоящего описания понятие фармацевтически приемлемый носитель включает каждый и все растворители, дисперсионные среды, материалы для нанесения покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, агенты, придающие изотоничность, и замедляющие абсорбцию агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Носитель должен быть пригодным для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения на действующее вещество, т.е. антитело, иммуноконъюгат или биспецифическую молекулу, можно наносить покрытие из материала, защищающего соединение от воздействия кислот и других факторов окружающей среды, которые могут инактивировать соединение.
Фармацевтические соединения, предлагаемые в изобретении, могут включать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Понятие фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет требуемую биологическую активность родительского соединения и не вызывает никаких нежелательных токсикологических действий (см., например, Вегде 8.М., и др., Ч. РНагт. 8сЕ, 66, 1977, с. 1-19). Примерами таких солей являются кислотно-аддитивные соли и соли присоединения оснований. К кислотно-аддитивным солям относятся соли, образованные из нетоксичных неорганических кислот, таких как соляная, азотная, фосфорная, серная, бромисто-водородная, йодисто-водородная, фосфористая кислота и т.п., а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, замещенные фенилом алкановые кислоты, оксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.п. Соли присоединения оснований включают соли, образованные со щелочно-земельными металлами, такими как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также с нетоксичными органическими аминами, такими как Ν,Ν'дибензилэтилендиамин, Ν-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п.
Фармацевтическая композиция, предлагаемая в изобретении, может содержать также фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примерами фармацевтически приемлемых антиоксидантов являются водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВГА), бутилированный гидрокситолуол (БГТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; металлхелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.
Примерами приемлемых водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях, предлагаемых в изобретении, являются вода, этанол, полиолы (такие как глицерин,
- 28 018756 пропиленгликоль, полиэтителенгликоль и т.п.) и их приемлемые смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекций сложные органические эфиры, такие как этилолеат. Требуемую текучесть можно поддерживать, например, с помощью применяемых для нанесения покрытий материалов, таких как лецитин, сохраняя требуемый размер частиц в случае дисперсий, и с помощью поверхностно-активных веществ.
Указанные композиции могут содержать также адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующе вещества. Отсутствие микроорганизмов можно гарантировать как с помощью описанных выше процессов стерилизации, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых средств, таких, например, как парабен, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота и т.п. Может оказаться желательным включать в композиции, придающие изотоничность, агенты, такие как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, можно получать инъецируемую фармацевтическую форму с пролонгированной абсорбцией, например, путем включения агентов, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.
Фармацевтически приемлемые носители представляют собой стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления при необходимости стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Применение таких сред и агентов для фармацевтических действующих веществ известно в данной области. За исключением случая, когда любые из общепринятых сред или агентов не совместимы с действующим веществом, предусматривается их применение в фармацевтических композициях, предлагаемых в изобретении. В композиции можно включать также дополнительные действующие вещества.
Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях приготовления и хранения. Композиция может иметь форму раствора, микроэмульсии, липосомы или иметь другую упорядоченную структуру, пригодную для включения лекарственного средства в высокой концентрации. Носитель может представлять собой растворитель или диспергирующую среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их приемлемые смеси. Требуемую текучесть можно поддерживать, например, с помощью применяемых для нанесения покрытий материалов, таких как лецитин, сохраняя требуемый размер частиц в случае дисперсий, и с помощью поверхностно-активных веществ. Во многих случаях можно включать придающие изотоничность агенты, такие как сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия и т.п. Кроме того, можно получать инъецируемую фармацевтическую форму с пролонгированной абсорбцией, например, путем включения агентов, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеараты и желатин.
Стерильные предназначенные для инъекций растворы можно получать путем включения действующего вещества в требуемом количестве в соответствующий растворитель либо индивидуально, либо при необходимости в сочетании с указанными выше ингредиентами, с последующей стерилизацией микрофильтрацией. Как правило, дисперсии получают включением действующего вещества в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и требуемые другие вышеперечисленные ингредиенты. Методы получения стерильных порошков, предназначенных для приготовления стерильных инъецируемых растворов, представляют собой вакуумную сушку и сушку вымораживанием (лиофилизация), с помощью которых получают порошок действующего вещества в сочетании с любым другим требуемым ингредиентом из предварительно стерилизованного фильтрацией раствора.
Количество действующего вещества, которое можно объединять с носителем для получения формы в виде однократной дозы, должно варьироваться в зависимости от индивидуума, подлежащего обработке, и конкретного пути введения. Количество действующего вещества, которое можно объединять с носителем для получения формы в виде однократной дозы, как правило, представляет собой количество композиции, которое обладает терапевтическим действием. Как правило, количество за исключением случая, когда оно составляет сто процентов, представляет собой количество, составляющее от примерно 0,01 до примерно 99% действующего вещества, от 0,1 до примерно 70% или от примерно 1 до примерно 30% действующего вещества в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
Схему приема лекарственного средства регулируют для получения оптимального требуемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, можно применять однократную болюсную инъекцию, можно вводить несколько разделенных доз в течение определенного промежутка времени или дозу можно пропорционально понижать или повышать в зависимости от конкретной терапевтической ситуации. Наиболее целесообразно приготавливать композиции для парентерального введения в виде стандартных доз лекарственного средства, что облегчает их применение и однородность доз. Под стандартной дозой лекарственного средства в контексте настоящего описания понимают физически дискретные единицы, предназначенные для введения стандартных доз индивидууму, подлежащему лечению; каждая единица содержит предварительно определенное количество действующего вещества, которое согласно расчету должно обладать желаемым терапевтическим действием, в сочетании с требуемыми фармацевтическим носителем. Специфические особенности форм в виде стандартных доз, предлагаемых в изобретении, определяются и непосредственно зависят от индивидуальных характеристик действующего вещества и конкретного терапевтического действия, которое необходимо достигать, и ограничениями, известными в
- 29 018756 области приготовления препаративных форм такого действующего вещества, связанными с лечением чувствительных индивидуумов.
Для введения антитела дозы составляют от примерно 0,0001 до 100 мг/кг и более конкретно от 0,01 до 5 мг/кг веса хозяина. Например, дозы могут составлять 0,3, 1, 3, 5 или 10 мг/кг веса тела или могут находиться в диапазоне от 1 до 10 мг/кг. Пример схемы лечения включает введение один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, один раз каждые четыре недели, один раз в месяц, один раз каждые 3 месяца или один раз каждые 3-6 месяцев. Схемы приема антитела к склеростину, предлагаемого в изобретении, могут включать введение 1 или 3 мг/кг веса тела путем внутривенного применения, при этом антитело вводят с использованием следующих режимов применения: например, каждые 4 недели по 6 доз, затем каждые 3 месяца; каждые три недели; 3 мг/кг веса тела однократно, затем 1 мг/кг веса тела каждые 3 недели.
В некоторых вариантах способа можно вводить два или большее количество моноклональных антител с различными специфичностями связывания, в этом случае доза каждого вводимого антитела находится в указанных диапазонах. Антитело, как правило, вводят многократно. Можно использовать, например, следующие интервалы между каждым введением доз: еженедельно, ежемесячно, каждые три месяца или ежегодно. Интервалы могут также быть нерегулярными в зависимости от определенных в крови уровней антитела к антигену-мишени в организме пациента. В некоторых вариантах способа дозу регулируют с целью достижения концентрации антитела в плазме, составляющей примерно 1-1000 мкг/мл, а в некоторых вариантах способа до достижения концентрации, составляющей примерно 25-300 мкг/мл.
В альтернативном варианте антитело можно вводить в виде формы с замедленным высвобождением, в этом случае требуется меньшая частота введения. Доза и частота введения варьируются в зависимости от времени полужизни антитела в организме пациента. В целом, человеческие антитела обладают наиболее длительным временем полужизни, в порядке снижения этого показателя антитела распределяются следующим образом: гуманизированные антитела, химерные антитела и антитела из организмов, кроме человека. Дозу и частоту введения можно варьировать в зависимости от того, является лечение профилактическим или терапевтическим. При применении в профилактических целях вводят относительно более низкие дозы с относительно редкими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают прием лекарственного средства в течение всей оставшейся жизни. При терапевтическом применении иногда требуется использование относительно высокой дозы с введением через относительно короткие интервалы вплоть до снижения скорости развития заболевания или прекращения его развития или до частичного или полного уменьшения интенсивности симптомов заболевания у пациента. После этого пациента можно переводить на профилактический режим применения.
Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, можно варьировать таким образом, чтобы получать количество действующего вещества, эффективное для достижения требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента, при использовании конкретной композиции и пути введения, и они не должны быть токсичными для пациента. Выбранный уровень доз должен зависеть от различных фармакокинетических факторов, включая активность применяемых конкретных композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, или сложного эфира, соли или амида, пути введения, времени введения, скорости выделения конкретного применяемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, применяемых в сочетании с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, веса, состояния, общего состояния здоровья и предыдущей истории болезни подлежащего лечению пациента и аналогичных хорошо известных в области медицины факторов.
Терапевтически эффективная доза антитела к склеростину, предлагаемого в изобретении, может приводить к уменьшению серьезности симптомов заболевания, повышению частоты и продолжительности бессимптомных периодов заболевания или к предупреждению ухудшения состояния или нетрудоспособности, связанной с поражением болезнью.
Композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить с помощью одного или нескольких путей введения с использованием одного или нескольких различных методов, известных в данной области. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, путь и/или механизм введения должен варьироваться в зависимости от требуемых результатов. Пути введения антител, предлагаемых в изобретении, представляют собой внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, внутрибрюшинный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, с помощью инъекции или инфузии. Под парентеральном введением в контексте настоящего описания понимают пути введения, отличные от энтерального и местного применения, как правило, путем инъекции, и включают (но не ограничиваясь только ими) внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, внутриоболочечную, внутрикапсульную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, подкутикулярную, внутрисуставную, подкапсульную, подпаутинную, интраспинальную, эпидуральную и надчревную инъекцию и инфузию.
В альтернативном варианте антитело, предлагаемое в изобретении, можно вводить непарентеральным путем, таким как местный, эпидермальный путь применения или нанесение на слизистую оболочку,
- 30 018756 например, интраназально, орально, вагинально, ректально, подъязычно или местно.
Действующие вещества можно включать в препаративную форму в сочетании с носителями, которые должны защищать соединение от быстрого высвобождения, например, в случае препаративной формы с контролируемым высвобождением, в том числе такой, как имплантаты, трансдермальные пластыри и микрокапсулированные системы введения. Можно применять биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортороэфиры и полимолочная кислота. Целый ряд методов получения таких препаративных форм запатентован или известен специалистам в данной области (см., например, 8ийатеб апб Соп1го11еб Ве1еаке Эгид Оебуегу 8у51ет5. под ред. ТВ. КоЬпъоп. изд-во Магсе1 Эеккег. Ιπο.. №\ν Уогк, 1978).
Терапевтические композиции можно вводить с помощью известных в данной области медицинских устройств. Например, в одном из вариантов осуществления изобретения терапевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, можно вводить с помощью безыгольного устройства для гиподермальных (подкожных) инъекций, например, с помощью устройств, описанных в ϋδ 5З9916З; 5З8З851; 5З12ЗЗ5; 506441З; 4941880; 4790824 или 4596556. Примерами хорошо известных имплантатов и модулей, которые можно применять в настоящем изобретении, являются описанный в ϋδ 448760З пригодный для имплантации насос для микроинфузии дозированных медицинских препаратов с контролируемой скоростью; описанное в υδ 4486194 терапевтическое устройство для введения медицинских препаратов через кожу; описанный в υδ 44472ЗЗ насос для инфузии медицинских препаратов, предназначенный для введения лекарственных средств с точно установленной скоростью инфузии; описанное в υδ 4447224 пригодное для имплантации устройство для инфузии с изменяющимся потоком, предназначенное для непрерывного введения лекарственного средства; описанная в υδ 44З9196 система для осмотического введения лекарственных средств, снабженная несколькими компартментами в виде камер; и описанная в υδ 4475196 система для осмотического введения лекарственных средств. Указанные патенты включены в настоящее описание в качестве ссылки. Целый ряд других устройств, таких как имплантаты, системы для введения и модули, известны специалистам в данной области.
В конкретных вариантах осуществления изобретения человеческие моноклональные антитела, предлагаемые в изобретении, можно приготавливать в формах, гарантирующих соответствующее распределение ίη у1уо. Например, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) не пропускает многие обладающие высокой гидрофильностью соединения. Для гарантии того, что обладающие терапевтической активностью соединения, предлагаемые в изобретении, пересекут ГЭБ (если это требуется), их можно включать, например, в липосомы. Методы приготовления липосом описаны, например, в υδ 4522811; 5З74548 и 5З99ЗЗ1. Липосомы могут содержать один или несколько фрагментов, которые избирательно транспортируются в определенные клетки или органы, что повышает направленное введение лекарственного средства (см., например, У.У. Капабе, ί. С1ше Рйагтасок, 29, 1989, с. 685). Примерами обеспечивающих направленный перенос молекул являются фолат или биотин (см., например, υδ 5416016 на имя Бо\у с соавт.); маннозиды (υιικζη\\Ή и др., ВюсНет. Вюрйук. Век. Соттип., 15З, 1988, с. 10З8); антитела (Р.6. В1оетап и др., ΕΕΒδ Ьеб., З57, 1995, с. 140; М. 0\\ай и др., АпбткгоЬ. Адейк СйетоШег., З9, 1995, с. 180); обладающий поверхностной активностью рецептор белка А (Вгйсое и др., Ат. ί. Р11у8ю1., 12ЗЗ, 1995, с. 1З4); р120 ^сйге1ег и др., 1. Вю1. СНет., 269, 1994, с. 9090); (см. также К. Кешапеп; М.Ь. Ьаиккапеп, ΕЕΒδ^еΐΐ., З46, 1994, с. 12З; 1.1. К111юп; Ι.Τ Е1б1ег, Iт^ηиηотеΐйобк, 4, 1994, с. 27З).
Применения и способы, предлагаемые в изобретении.
Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять ш νίΙΐΌ и ш у1уо в диагностических и терапевтических целях. Например, эти молекулы можно вводить в клетки в культуре, например, ш νίΐ го или ш у1уо, или индивидууму, например, ш у1уо, для лечения, предупреждения или диагностики различных нарушений. Подразумевается, что понятие индивидуум в контексте настоящего описания относится к человеку и животным, кроме человека. К животным, кроме человека, относятся все позвоночные животные, например млекопитающие и животные, не относящиеся к млекопитающим, в том числе приматы, кроме человека, овцы, собаки, кошки, коровы, лошади, куры, амфибии и рептилии.
Способы наиболее предпочтительно применять для лечения, предупреждения или диагностирования связанных со склеростином нарушений и/или нарушений, связанных с аномальной минеральной плотностью костной ткани, такими, например, как остеопороз.
Изобретение относится также к способам повышения содержания минерала и/или минеральной плотности костной ткани. Композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять также для улучшения результатов ортопедических процедур, хирургической имплантации, замены сустава, косметической хирургии кости и репарации кости, таких как заживление переломов, заживление несращения (перелом кости), замедленное заживление сращения и лицевая реконструкция. Одну или несколько композиций можно вводить до, в течение и/или после процедуры замещения, трансплантации, хирургического вмешательства или репарации.
В контексте настоящего описания связанное со склеростином нарушение включает нарушения, при которых минеральная плотность костной ткани (ВМО) является аномально и/или патологически низкой относительно здоровых индивидуумов. Нарушения, характеризующиеся низкой ВМЭ и/или хрупкостью кости, включают (но не ограничиваясь только ими) первичный и вторичный остеопороз, ос
- З1 018756 теопению, остеомаляцию, несовершенный остеогенез (0^, аваскулярный некроз (остеонекроз), переломы и заживление имплантата (зубные имплантаты и имплантаты тазобедренного сустава), потерю костной ткани из-за других нарушений (например, потерю костной ткани, ассоциированную с ВИЧинфекцией, различными видами рака или артритом). Другие связанные со склеростином нарушения включают (но не ограничиваясь только ими) ревматоидный артрит, остеоартрит, артрит и формирование и/или присутствие остеолитических повреждений.
В контексте настоящего описания связанное со склеростином нарушение включает состояния, ассоциированные или характеризующиеся аберрантными уровнями склеростина. Они включают различные виды рака и остеопорозные состояния (например, остеопороз или остеопения), некоторые из которых имеют значения, перекрывающиеся с понятием связанные со склеростином нарушения, указанным в настоящем описании. Связанные со склеростином виды рака включают миелому (например, множественную миелому с остеолитическими повреждениями), рак молочной железы, рак ободочной кишки, меланому, печеночно-клеточный рак, рак эпителия, рак пищевода, рак головного мозга, рак легкого, рак предстательной железы или рак поджелудочной железы, а также любые их метастазы.
К связанному со склеростином нарушению относятся также почечные и сердечно-сосудистые нарушения, связанные, по меньшей мере, с экспрессией склеростина в почке или сердечно-сосудистой системе. Указанные нарушения включают (но не ограничиваясь только ими) такие почечные нарушения, как болезни клубочков (например, острый и хронический гломерулонефрит, быстро прогрессирующий гломерулонефрит, нефротический синдром, очаговый пролиферативный гломерулонефрит, повреждения клубочков, ассоциированные с системным заболеванием, таким как системная красная волчанка, синдром Гудпасчера, множественная миелома, диабет, поликситозное заболевание почек, поликистозная болезнь почек, неоплазия, болезнь серповидных эритроцитов и хронические воспалительные заболевания), болезни трубчатых костей (например, острый тубулярный некроз и острая почечная недостаточность, поликистозное почечное заболевание губчатой почки, ювенильный нефронофтиз, нефрогенный диабет и ацидоз почечных клубочков), тубулоинтерстициальные заболевания почек (например, пиелонефрит, индуцируемый лекарственными средствами и токсинами тубулоинтерстициальный нефрит, гиперкальцемическая нефропатия и гипокалемическая нефропатия), острая и быстро прогрессирующая почечная недостаточность, хроническая почечная недостаточность, нефролитиаз, подагра, сосудистые заболевания (например, гипертензия и нефросклероз, микроангиопатическая гемолитическая анемия, атероэмболическое заболевание почек, диффузный некроз кортикального слоя и инфаркт почек) или опухоли (например, почечно-клеточная карцинома и нефробластома).
Такие заболевания включают (но не ограничиваясь только ими) такие сердечно-сосудистые заболевания, как ишемическая болезнь сердца (например, стенокардия, инфаркт миокарда и хроническая ишемическая болезнь сердца), гипертензивная болезнь сердца, легочно-сердечная недостаточность, порок клапана сердца (например, ревматическая атака и ревматическое заболевание сердца, эндокардит, пролапс митрального клапана и стеноз аортального клапана), врожденная болезнь сердца (например, обструктивные повреждения клапанов и сосудов, дефект перегородок предсердия или желудочка и атеросклероз открытых протоков), или болезнь миокарда (например, миокардит, застойная кардиомиопатия и гипертрофическая кардиомиопатия).
Когда антитела к склеростину вводят в сочетании с другим средством, то два средства можно вводить последовательно в любом порядке или одновременно.
Согласно другому варианту осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять в качестве вспомогательного средства или адъюванта другой терапии, например терапии, основанной на применении ингибитора резорбции кости, например противоостеопорозной терапии, в частности терапии, в которой применяют кальций, кальцитонин или их аналог или производное, например кальцитонин лосося, угря или человека, кальцилитики, кальцимиметики (например, цинакальцет), стероидной гормон, например эстроген, частичный агонист эстрогена или комбинация эстрогенгестаген, 8ЕВМ (селективный модулятор рецептора эстрогена), например ралоксифен, лазофоксифен, базедоксифен, арзоксифен, ЕС1271, тиболон (Ы\за1®), 8АВМ (селективный модулятор рецептора андрогена), антитело к К.АМ<Ь (такое как деносумаб), ингибитор катепсина К, витамин Ό или его аналог или РТН, фрагмент или производное РТН, например РТН (1-84) (например, Ргеок™), РТН (1-34) (например Еойео™), РТН (1-36), РТН (1-38), РТН (1-31)ΝΗ2 или ΓΤ8 893. Согласно другому варианту осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять в сочетании с другими современными подходами к лечению остеопороза, включающими применение бисфосфонатов (например, Еокатах™ (алендронат), Ас!опе1™ (натрия ризедронат), Вогкйа (ибандроная кислота), 2оте!а™ (золедроновая кислота), Ас1ак1а™/Вес1ак!™ (золедроновая кислота), олпадроната, неридроната, скелида, бонефоса, статинов, анаболических стероидов, солей лантана и стронция и фторида натрия.
В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, можно вводить в сочетании с модулирующим ЬВР4 агентом, например агентом, который модулирует экспрессию или активность ЬВР4, например, в сочетании с нейтрализующим антителом к ЬВР4.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении,
- 32 018756 можно вводить в сочетании с модулирующим ИКК1 агентом, т.е. агентом, который оказывает воздействие или нейтрализует опосредуемое ИКК1 антагонистическое воздействие на передачу сигналов \νηΙ, например, нейтрализующим антителом к ИКК1.
Таким образом, в изобретении предложено применение антитела или функционального белка, предлагаемого в изобретении, в сочетании с (I) золедроновой кислотой, (II) антителом к ИКК, (III) алендронатом, (IV) антителом к ЬКР4, (V) 1РТН и/или (VI) рилизинг-факторами паратиреоидного гормона (кальцилитики), для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патологического нарушения, которое опосредуется склеростином или которое ассоциировано с повышенным уровнем склеростина.
Другим вариантом осуществления изобретения является применение антитела или функционального белка, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патологического нарушения, которое опосредуется склеростином или которое ассоциировано с повышенным уровнем склеростина, где лекарственное средство применяют в сочетании с (I) золедроновой кислотой, (II) антителом к ИКК, (III) алендронатом, (IV) антителом к ЬКР4, (V) 1РТН и/или (VI) рилизинг-факторами паратиреоидного гормона (кальцилитики).
Следующим вариантом осуществления изобретения является применение (I) золедроновой кислоты, (II) антитела к ИКК, (III) алендроната, (IV) антитела к ЬКР4, (V) 1РТН и/или (VI) рилизинг-факторов паратиреоидного гормона (кальцилитики) для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патологического нарушения, которое опосредуется склеростином или которое ассоциировано с повышенным уровнем склеростина, где лекарственное средство применяют в сочетании с антителом или функциональным белком, предлагаемым в изобретении.
Следующим вариантом осуществления изобретения является применение антитела или функционального белка, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патологического нарушения, которое опосредуется склеростином или которое ассоциировано с повышенным уровнем склеростина, где пациенту предварительно вводят (I) золедроновую кислоту, (II) антитело к ИКК, (III) алендронат, (IV) антитело к ЬКР4, (V) 1РТН и/или (VI) рилизингфакторы паратиреоидного гормона (кальцилитики).
Следующим вариантом осуществления изобретения является применение (I) золедроновой кислоты, (II) антитела к ИКК, (III) алендроната, (IV) антитела к ЬКР4, (V) 1РТН и/или (VI) рилизинг-факторов паратиреоидного гормона (кальцилитики) для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патологического нарушения, которое опосредуется склеростином или которое ассоциировано с повышенным уровнем склеростина, где пациенту предварительно вводят антитело или функциональный белок, предлагаемое/предлагаемый в изобретении.
В одном из вариантов вышеуказанных комбинаций 1РТН представляет собой 1РТН(1-34).
В одном из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять для выявления уровней склеростина или количества клеток, которые содержат склеростин. Для этого можно, например, приводить в контакт образец (например, образец ίη У11то) и контрольный образец с антителом к склеростину в условиях, которые дают образоваться комплексу между антителом и склеростином. Любые комплексы, образовавшиеся между антителом и склеростином, выявляют и сравнивают в образце и контроле. Например, можно применять стандартные методы выявления, хорошо известные в данной области, такие как ЕЫ8А и анализы на основе проточной цитометрии, в отношении композиций, предлагаемых в изобретении.
Таким образом, одним из объектов изобретения являются способы выявления присутствия склеростина (например, антигена человеческого склеростина) в образце или оценки количества склеростина, заключающиеся в том, что приводят в контакт образец и контрольный образец с антителом, предлагаемым в изобретении, или его антигенсвязывающим участком, который специфически связывается со склеростином, в условиях, которые позволяют образоваться комплексу между антителом или его фрагментом и склеростином. Затем выявляют образование комплекса, при этом различие в формировании комплекса при использовании образца по сравнению с контрольным образцом является показателем присутствия склеростина в образце.
Под объем изобретения подпадают также наборы, состоящие из композиций (например, антител, человеческих антител и биспецифических молекул), предлагаемых в изобретении, и инструкций по их применению. Набор может содержать также по меньшей мере один дополнительный реагент или одно или несколько дополнительных антител, предлагаемых в изобретении (например, антитело, обладающие дополнительным видом активности, которое связывается с эпитопом на антигене-мишени, отличным от эпитопа первого антитела). Например, такие наборы могут содержать антитело или функциональный белок, предлагаемое/предлагаемый в изобретении, и одно или несколько из следующих соединений: (I) золедроновая кислота, (II) антитело к ИКК, (III) алендронат, (IV) антитело к ЬКР4, (V) 1РТН и/или (VI) рилизинг-факторы паратиреоидного гормона (кальцилитики). В состав набора, как правило, входит этикетка с указанием по применению компонентов набора. Под понятие этикетка подпадает любой письменный или зарегистрированный материал, входящий в набор или иным образом прилагаемый к набору.
Полностью описанное выше изобретение дополнительно проиллюстрировано ниже с помощью
- 33 018756 примеров, которые даны с целью иллюстрации изобретения и не направлены на его ограничение, и формулы изобретения. Специалистам в данной области должны быть очевидны или они могут получать с помощью не более чем стандартных экспериментов многочисленные эквиваленты конкретных представленных в настоящем описании процедур. Такие эквиваленты подпадают под объем настоящего изобретения и формулы изобретения. Содержание всех ссылок, включая выданные патенты и опубликованные заявки на патент, которые процитированы в настоящем описании, включены в него в качестве ссылки.
Примеры
Функциональные анализы.
Анализ щелочной фосфатазы (АБР).
Клетки.
Клетки МС3Т3 1Ь представляют собой клон МС3Т3-1Р-клеток, экспрессирующих 08Е2-1ис. Этот клон получали после стабильной трансфекции клеток линии МС3Т3-ДР (мышиные остеобласты линии МС3Т3-Е1, японский клон, 1р; любезно предоставлен д-ром Т. КоккиЬо, фирма ХохаПБ, Япония) с использованием 8х-08Е2\\1-т0621ис в рсЭХА3.1+.
Культуральная среда.
Клетки МС3Т3 1Ь культивировали согласно общепринятым методам в минимальной поддерживающей среде альфа (МЕМа; фирма ΙηνίΐΓο^η, каталожный № 22561-021), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (ЕС8; фирма Атипеб, каталожный № 2-01Ε100-Ι), 2мМ Ь-глутамином (фирма 61Ьсо, каталожный № 25030-024), 50 ед. пенициллина/50 мкг/мл стрептомицина (фирма Атипеб, каталожный № 4-01Е00-Н) и 10 мМ Нерек (фирма 61Ьсо, каталожный № 15630-056) и 0,75 мг/мл 6418 (фирма 61Ьсо, каталожный № 10131-027) (поддерживающая культуральная среда).
Маточные растворы.
мМ аскорбиновая кислота (фирма Аако Риге С11ет1са1, каталожный № 013-12061) в ЭМЕМ-Бб, 14 нМ ВМР-2 (фирма Κ&Ό, каталожный № 355-ВМ-010) в 5-мМ уксусной кислоте и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА, фирма 8щта, каталожный № А-8806); 1 М β-глицерофосфат (фирма 8щта, каталожный № 69891) в растворе Тироде; раствор Тироде: 9,72 г соли Тироде (фирма 81дта, каталожный № Т2145) и 1 г NаН0з в 1 л Н2О, субстратный буфер для АБР: 25 мМ глицин и 0,5 мМ МдС12, рН 10,5; раствор субстрата для АБР: 5 мг паранитрофенилфосфатата (субстрат 8щта 104, фирма 8щта, каталожный № 50942-200ТАВ) в 3,75 мл субстратного буфера для АБ, рН 10,5; 1 мМ паранитрофенол (фирма 8щта, каталожный № 104-1) в растворе субстрата для АБР.
Анализ.
Для осуществления АБР-анализов клетки МС3Т3 1Ь выращивали в культуральной среде для анализов (соответствует поддерживающей культуральной среде без 6418). Клетки МС3Т3 1Ь высевали в 200 мкл с плотностью 3х 104 клеток/мл в случае, когда индукцию начинали через 72 ч, или 2х 104 клеток/мл, в случае, когда индукцию начинали через 96 ч. Планшеты инкубировали в течение 72 или 96 ч при 37°С и 5% СО2 перед началом индукции с использованием полной среды (путем дополнения культуральной среды 10 мМ Ь-глицерофосфатом (Ь6Р) и 50 мкМ аскорбиновой кислотой (АК)). Подлежащие тестированию антитела разводили полной средой. В лунки добавляли (в трех повторностях) антитело в сочетании с ВМР-2 (0,7 нМ) и склеростином (50 нМ) в конечном объеме 200 мкл полной среды. В каждый планшет включали в трех повторностях 4 внутренних контроля: контроль, включающий только растворитель (БСА), контроль, включающий только ВМР-2 (0,7 нМ), контроль, включающий ВМР-2 + склеростин (ВМР-2 (0,7 нМ) и склеростин (50 нМ)), и контроль, включающий только склеростин (50 нМ). Планшеты инкубировали в течение еще 72 ч при 37°С и 5% СО2. В конце периода индукции анализ прекращали путем удаления среды и добавляли в каждую лунку по 150 мкл раствора субстрата для АБР (свежеприготовленный). Планшеты инкубировали в течение 3-30 мин. Добавляли по 100 мкл 1 М №10Н для прекращения реакции и планшеты встряхивали на шейкере для планшетов (Р1а1е8Йакег). Определяли ОП относительно контрольной пробы (пустышки) при 405 нм и рассчитывали активность АБР в нмоль/мин. Добавляли 50 нМ склеростина для достижения по меньшей мере 70%-ного ингибирования индуцируемого ВМР-2 производства АБР [0,7 нМ ВМР-2].
АЫТ-анализ.
Этот анализ для оценки антител разрабатывали на основе способности склеростина ингибировать опосредуемую \\'Щ1 индукцию репортерного гена 8ТЕ.
Трансфекция НЕК293-клеток.
В день 1 НЕК293-клетки высевали из расчета 1,3-1,4х105 клеток на лунку (в объеме 0,5 мл) в 24луночный обработанный поли-Э-лизином планшет фирмы (ВЭ-ВюСоаБ № 356414) в ЭМЕМ (фирма 61Ьсо, каталожный № 61965-026), содержащий 10% фетальной телячьей сыворотки (ЕС8), 1% Бглутамина (фирма 61Ьсо, каталожный № 25030.024), 1% заменимых аминокислот (фирма 61Ьсо, каталожный № 11140) без антибиотиков. Трансфекцию осуществляли в день 2 с помощью Липофектамина 2000 (фирма ΙηνίύΌ^η, каталожный № 11668-019). Для трансфекции каждой лунки следующее количество плазмид добавляли к конечному объему 50 мкл 0р11МЕМ® Ι (фирма 61Ьсо, каталожный № 31985047): для контрольных лунок (рсЭХА3+, 480 нг; 8ирегТорЕ1а5Й (8ТЕ), 20 нг; ркКБ-СМУ, 0,5 нг), а для
- 34 018756 обработанных νηΙ-1 лунок (рсЭНА^хЩ-Е 20 нг; рсЭНА3+, 460 нг; §ире^ΤοрΕ1а8Й (8ТЕ), 20 нг; рЬКЬСΜУ, 0,5 нг).
Во второй пробирке 1,6 мкл липофектамина 2000 разводили в 50 мкл Οрΐ^ΜΕΜ® Ι и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Содержимое двух пробирок смешивали путем добавления содержимого включающей липид пробирки к содержимому включающей ДНК пробирки и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, давая образоваться комплексу ДНК-липид. Затем комплекс ДНК-липид (100 мкл) добавляли равномерно в лунки и инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 5 ч. В конце 5-часового периода инкубации клетки были готовы к обработке тестируемыми реагентами, такими как 808Т, антитела и т.д.
Оценка зависящего от дозы 808Т ингибирования.
Для построения кривой ингибирования в зависимости от дозы готовили серии с двукратным разведением Г11808Т в среде ΌΜΕΜ, содержащей 10% ЕС8, 1% Ь-глутамина и 1% заменимых аминокислот без антибиотиков, начиная с концентрации 160 нМ. Концентрация маточного раствора Г11808Т составляла 260 мкг/мл в ΌΜΕΜ, дополненной 1% ЕС8. Как правило, каждый вариант условий оценивали с дублированием. Для этой цели приготавливали 1 мл среды каждого варианта условий и добавляли по 450 мкл на лунку после удаления из лунок среды, содержащей смесь для трансфекции. Продолжительность обработки составляла 18-20 ч. В конце периода инкубации осуществляли анализ люциферазы согласно изложенному ниже методу.
Оценка антител к 808Т.
Антитела предварительно смешивали с 808Т перед добавлением в клетки. Для этой цели приготавливали среду ΌΜΕΜ (10% ЕС8, 1% Ь-глутамина и 1% заменимых аминокислот без антибиотиков) с добавлением 20-30 нМ Г11808Т. Затем добавляли различные разведения антител в содержащую 808Т среду согласно протоколу эксперимента. Эти смеси приготавливали за 40 мин до обработки. Каждый вариант среды, как правило, оценивали с дублированием. Для этой цели приготавливали 1 мл среды каждого варианта условий и добавляли по 450 мкл на лунку после удаления из лунок среды, содержащей смесь для трансфекции. Продолжительность обработки составляла 18-20 ч. В конце периода инкубации осуществляли анализ люциферазы согласно изложенному ниже методу.
Анализ люциферазы.
В конце периода инкубации среду удаляли и добавляли 300 мкл 1-кратного буфера для пассивного лизиса клеток (1/Ра551хе Ьукщ ВиГГег) (фирма Рготеда, каталожный № Е194А). Затем люциферазную активность измеряли с помощью системы для оценки люциферазы ЭиаЮ^ (фирма Рготеда, каталожный № Е2940) с использованием 30 мкл лизатов, взятых с дублированием. Анализ осуществляли согласно буклету инструкций, входящему в состав набора. Как правило, применяли по 30 мкл субстрата для люциферазы ЭиаЬбк (люцифераза светлячка; для 8ТЕ) и 30 мкл субстрата для Όιι;·ι1-Ο1ο ЗЮр&бк (люцифераза Кеш11а; для контроля эффективности трансфекции). Люминисцентные сигналы оценивали с помощью устройства типа Μίΐΐιπίδ ЬВ940 (фирма Вег11ю10 ТесНгю^Дек).
Расчет данных.
Рассчитывали соотношение активности люцифераз светлячка и Кен111а. Конечные результаты выражали, принимая величину νηΙ-1 в отсутствие 808Т за 1.
Анализ минерализации.
Клетки.
Клетки МС3Т3 1Ь представляют собой клон МС3Т3-1Р-клеток, экспрессирующих 08Ε2-1ικ:. Этот клон получали после стабильной трансфекции клеток линии 1^0^^3-,^ (мышиные остеобласты линии МС3Т3-Е1, японский клон, 1р; любезно предоставлен д-ром Т. ΚοккиЬο, фирма ШтагГО, Япония) с использованием 8x-Ο8Ε2νι-тΟС21ис в рсЭНА3.1+.
Культуральная среда.
Клетки МС3Т3 1Ь культивировали согласно общепринятым методам в минимальной поддерживающей среде альфа (МЕМа; фирма ΙηνίΙΐΌ^η, каталожный № 22561-021), дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (ЕС8; фирма Атппеб, каталожный № 2-01Е100-1), 2 мМ Ь-глутамином (фирма Οί^ο, каталожный № 25030-024), 50 ед. пенициллина/50 мкг/мл стрептомицина (фирма Атппеб, каталожный № 4-01Е00-Н) и 10 мМ Нерек (фирма Οί^ο, каталожный № 15630-056) и 0,75 мг/мл О418 (фирма Οί^ο, каталожный № 10131-027) (поддерживающая культуральная среда).
Анализ минерализации.
Определяли ассоциированное с матриксом отложение кальция в лунках, содержащих МС3Т3-1Ьклетки, с использованием набора для определения кальция (Са1сшт кН) (фирма Аxοη ЬаЬ, каталожный № АХ0М)012). Клетки высевали из расчета 6/103 клеток/лунку или 2/103 клеток/лунку для повышения чувствительности клеток в 96-луночные планшеты в 100 мкл культуральной среды для анализа (поддерживающая культуральная среда без С418) и инкубировали в течение 3 дней до достижения конфлюэнтности. Затем культуральную среду для анализа заменяли и подлежащие тестированию соединения добавляли в сочетании с 10 мМ Ь-глицерофосфатом (ЬОР; фирма 81дта, каталожный № О9891) и 50 мкМ аскорбиновой кислотой (ΑΚ, фирма \ν;·ι1<ο Риге СБет1са1, каталожный № 013-12061). Перед добавлением
- 35 018756 к клеткам склеростин и РаЬ-фрагменты, подлежащие тестированию, предварительно инкубировали в другом планшете в течение 2 ч при комнатной температуре; тем временем в 96-луночные планшеты для анализа вносили 2,1 или 2,8 нМ ВМР-2 (фирма Κ&Ό 8ук!етк, каталожный № 355-ВМ-010) перед добавлением смеси склеростин-РаЬ. Клетки инкубировали в течение 14 дней и среду для анализа заменяли каждые 3-4 дня. В целом, в конце периода инкубации клетки промывали дважды 200 мкл ЗФР/лунку, добавляли 50 мкл 0,5 М Ηί'Ί в каждую лунку и планшеты выдерживали при -20°С в течение минимум 24 ч. В требуемый момент времени планшеты подвергали оттаиванию при комнатной температуре в течение 2 ч и по 10 мкл содержимого каждой лунки переносили в новый 96-луночный планшет. Затем добавляли рабочий раствор для оценки кальция (Са1сшт ХУогктд 8о1ийоп) (1:5) (200 мкл) и через 5-30 мин планшеты считывали при 595 нм с помощью ридера для микропланшетов.
Величины абсорбции превращали в мкг кальция с помощью стандартной кривой, значение, полученное в контрольной лунке (аскорбиновая кислота и бета-глицерофосфат), вычитали из полученного для каждой лунки значения и конечный результат выражали в виде % индуцируемой ВМР-2 минерализации.
Анализ методом вестерн-блоттинга фосфорилирования 8МАЭ1.
Материалы.
Мышиные остеобласты МС3Т3-Е1 (японский клон, любезно предоставлен д-ром Т. КоккиЬо, фирма №уагйк, Япония).
С3Н10Т1/2-клетки (мезенхимальные клетки мышиного эмбриона; АТСС, каталожный №: ССЬ-226). 8СЬ, негликозилированный, получен из Е. сой (фирма №уагйк, Р8И5257).
15н. 8СЬ негликозилированный, получен из Е. сой (фирма №уагйк, Р8И11274).
11808Т-АРР, гликозилированный, получен из ΗЕК-ЕВNА (фирма №уагйк, ВТР11100). гй8СЬ, гликозилированный, получен из клеток мышиной миеломы (фирма Κ&Ό 8ук!етк, каталожный № 1406-8Т/СР).
Антитело к 11808Т (фирма Κ&Ό 8ук!етк, каталожный № АР1406).
Реагент для экстракции РНокрНо8аГе (фирма №уадеп, каталожный № 71296-3).
Смесь ингибиторов протеаз (Рго!еаке 1пЫЬйог Соск1ай 8е! III) (фирма Са1Ьюсйет, каталожный № 539134).
Система для гель-электрофореза, включающая трис-ацетатный гель NиРАСЕ №уех, 7%, 1,5 мм, 15 лунок (фирма 1пуйгодеп, каталожный № ЕА03585).
трис-Ацетатный с добавлением ДСН рабочий буфер, 20х (фирма 1пуйгодеп, каталожный № ЙА0041).
Антиоксидант NиРАСЕ (фирма 1пуйгодеп, каталожный № ХР0005).
Мембрана для переноса типа 1ттоЬ11оп-Р, 0,45 мкм (фирма Мййроге, каталожный № 1РУИ00010).
Хроматографическая бумага типа ХУайшап (фирма Мегск, каталожный № 3587600).
Модуль ХСе11 8игеЬоск М1ш-Се11 и ХСе11 II В1о! (фирма 1пуйгодеп).
Ридер для микропланшетов типа Vе^каМаx (фирма Висйег).
Культивирование и экстракция клеток.
Клетки МС3Т3-Е1 и С3Н10Т1/2 культивировали согласно общепринятым методам в минимальной поддерживающей среде альфа (МЕМа; фирма Шуйгодеп каталожный № 22561-021) или в среде ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы (фирма Шуйгодеп каталожный № 41965-039) соответственно. Все культуральные среды дополняли 10% фетальной телячьей сыворотки (РС8; фирма ВюСопсер!, каталожный № 2-01Р10-1, партия 204459Р), 2 мМ Ь-глутамином (фирма Шуйгодеп, каталожный № 25030-024), 50 ед. пенициллина/50 мкг/мл стрептомицина (фирма Шуйгодеп, каталожный № 15140-122) и 10 мМ Черек (фирма Шуйгодеп, каталожный № 15630-056) (поддерживающая культуральная среда).
Клетки высевали в поддерживающую культуральную среду в 6-луночные планшеты (3 мл/лунку) и выращивали до конфлюэнтности (при применении 1,4х105 МС3Т3-1Ь-клеток/лунку конфлюэнтность достигалась в день 3; при применении 1,0х105 С3Н10Т1/2 клеток/лунку конфлюэнтность достигалась в день 3). После выращивания в течение ночи в условиях сывороточного голодания в культуральной среде, содержащей 1% РВ8, среду однократно заменяли на свежую среду, содержащую 1% РВ8, ВМР-6 (фирма Κ&Ό 8ук!етк, каталожный № 507-ВР) и субстанцию(ии), подлежащую(ие) тестированию. Перед добавлением к клеткам ВМР-6 и субстанцию(ии), подлежащую(ие) тестированию, предварительно инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, как это описано для фосфо-8тай 1/3/5 в С3Н10Т1/2клетках (^гпк1ег, ЕМВ0 I., 22(23), 2003, с. 6267-6276). Когда осуществляли оценку антител к склеростину, их предварительно инкубировали со склеростином в течение ночи при 4°С, после чего инкубировали с 0,2 нМ ВМР-6 в течение 1 ч при комнатной температуре и, наконец, добавляли к конфлюэнтным клеткам. После обработки в течение соответствующего периода времени клетки отмывали 2 мл охлажденного на льду ЗФР. Затем к клеткам добавляли из расчета 100 мкл/лунку реагент для экстракции Рйокрйо8аГе и разведенную в соотношении 1:200 смесь ингибиторов протеаз (Рго!еаке IηЫЬйо^ Соск1ай), после чего клетки инкубировали на льду в течение 5 мин. Клетки соскабливали с лунок и переносили в микроцентрифужную пробирку. Клеточный экстракт выдерживали на льду в течение 15 мин, интенсивно переме
- 36 018756 шивая каждые 5 мин. Затем клеточный экстракт центрифугировали в течение 5 мин при 16000 д и 4°С. И, наконец, супернатант переносили в новую микроцентрифужную пробирку для определения белков.
Концентрацию белков в клеточном лизате определяли с помощью набора для анализа белков БСА согласно инструкции производителя. БСА применяли в качестве стандарта. Для денатурации клеточный лизат разводили в соотношении 1:2 буфером Лэммли (фирма В|о-Каб, каталожный № 161-0737, содержащим β-меркаптоэтанол (1:20, фирма Мегск, каталожный № 1.12006) свежедобавленный) и кипятили в течение 5 мин при 95°С. После охлаждения образцы хранили при -20°С для дальнейшего применения.
Вестерн-блоттинг.
Антитело к 8таб (Н-465) (фирма 8айа Сгих, каталожный № кс-7153) представляет собой кроличий поликлональный 1дС, образовавшийся к аминокислотам 1-465, которые представляют собой полноразмерный фактор 8таб1 человеческого происхождения. Антитело может распознавать 8таб1, 8таб2, 8таб3, 8таб5 и 8таб8 человеческого, крысиного и мышиного происхождения. Антитело к фосфо-8таб1 (8ег 463/465)/8таб5 (8ег 463/465)/8таб8 (8ег 426/428) (фирма Се11 81дпаШпд, каталожный № 9511) представляет собой кроличий поликлональный 1дС, образовавшийся к синтетическому фосфо-пептиду, соответствующему остаткам, которые окружают 8ег 463/465 человеческого 8таб5. Антитело может выявлять эндогенные уровни 8таб1 только, когда фактор фосфорилирован дважды на серине 463 и серине 465, а также 8таб5 и 8таб8 только, когда они фосфорилированы в эквивалентных сайтах, имеющих происхождение из организма человека, мыши, крысы, норки и шпорцевой лягушки. Антитело не дает перекрестную реакцию с другими родственными 8таб белками.
Систему ХСе11 8игеЬоск М1ш Се11 (фирма 1пуйгодеп) приготавливали согласно инструкции производителя. Образец белка (2 мкг для анализа методом венстерн-блоттинга 8таб, 5 мкг для анализа фосфо8таб) вносили в равном конечном объеме в 7% трис-ацетатный гель типа NиРΑСЕ Иомех в 1х рабочем буфере. Предварительно окрашенный стандарт 8ееВ1ие Р1и§2 (10 мкл, 1:10; фирма 1пуйгодеп, каталожный № ЬС5925) и стандартный белок МадюМагк ХР \Уе51егп (10 мкл, 1:100 (фирма 1пуйгодеп, каталожный № ЬС5602) применяли в качестве маркеров молекулярной массы. Осуществляли электрофоретическую разгонку на геле в течение 75 мин при постоянном напряжении (150 В).
Вкладыши для блоттинга и фильтровальную бумагу пропитывали в 700 мл 1х буфера для переноса типа NиРΑСЕ. Мембрану из ПВДФ, предназначенную для переноса, сначала пропитывали в течение 30 с в метаноле, а затем переносили в 1х буфер для переноса типа NиРΑСЕ (фирма 1пуйгодеп, каталожный № №0006, буфер для переноса: метанол 10:1, свежеприготовленный). Кассеты пластин геля разделяли с помощью ножа для геля, одну предварительно пропитанную фильтровальную бумагу помещали наверх геля и осторожно удаляли все захваченные пузырьки воздуха. Пластину переворачивали обратной стороной вверх на обертку из сарана (8агап) и после удаления пластины предварительно пропитанную мембрану для переноса помещали на гель и удаляли пузырьки воздуха. Вторую предварительно пропитанную фильтровальную бумагу помещали наверх и удаляли пузырьки воздуха. Две пропитанные пластинки вкладышей для блоттинга помещали в катодный сердечник модуля Се11 II В1о1. Сэндвич, состоящий из геля/мембраны, осторожно переворачивали и помещали на вкладыши для блоттинга (при этом гель был расположен наиболее близко к катодному сердечнику). И, наконец, 3 предварительно пропитанных вкладыша для блоттинга помещали на мембранное устройство и наверх помещали анодный сердечник. Модуль для блоттинга заставляли соскальзывать по направляющим рельсам в нижнюю камеру с буфером и гребень (клин) закрепляли в положении согласно инструкции производителя. Модуль для блоттинга заполняли 1 х буфером для переноса типа NиРΑСЕ до тех пор, пока он не покрывал гель/мембранное устройство. Наружную камеру для буфера заполняли 650 мл деионизированной воды и осуществляли перенос белка на ПВДФ-мембрану при постоянном напряжении (30 В) в течение 2 ч.
После блоттинга мембрану сначала промывали в течение 10 мин в 0,05% Твин 20 в ЗФР, а затем блокировали путем осторожного встряхивания в течение 1 ч в 25 мл блокирующего буфера 8ирегВ1оск Т20 при комнатной температуре. Первичное антитело (фосфо-8таб 1/5/8 или 8таб (Н-465)) добавляли к мембране в разведении 1:1000 в блокирующем буфере 8ирегВ1оск Т20 (фирма йегсе, каталожный № 37516) и мембрану инкубировали в течение ночи при 4°С при встряхивании. Затем мембрану трижды отмывали в течение 10 мин 0,05% Твин 20 (фирма Р1ика, каталожный № 93773) в ЗФР перед инкубацией с КР-конъюгированным вторичным антителом (1:1000 в блокирующем буфере 8ирегВ1оск Т20) в течение 60 мин при комнатной температуре при встряхивании. Осуществляли по меньшей мере 3 стадии отмывки по 10 мин каждая, после чего мембрану инкубировали в течение 5 мин с рабочим субстратным раствором 8ирег81дпа1 \Уе51 РетЮ 8иЬ8йа1е ХУогктд 8о1ибоп (фирма йегсе, каталожный № 34095). И, наконец, мембрану помещали в пластиковый карман с визуализирующим агентом Р1иог-8 Ми1б1тадег (фирма Вю-Каб) и фотокамерой. Оптимальное время экспозиции, составляющее 1-2 мин, определяли путем сравнения изображений в течение промежутка времени от 30 с вплоть до 5 мин.
Анализ данных.
Хемилюминисцентную активность определяли с помощью устройства типа ОиапШу 0пе (фирма Вю-Каб) и рассчитывали значения ЕС50 с помощью программного обеспечения ХЬй14. Каждый сигнал фосфо-8таб стандартизовали относительно соответствующего общего 8таб-сигнала.
- 37 018756
ЕМ8А для оценки взаимосвязи 1КР6/склеростин.
Необработанные 96-луночные титрационные микропланшеты сенсибилизировали 100 мкл/лунку ЬКР6/Ее (1 мкг/мл, фирма Κ&Ό 8ув1етв, каталожный № 1505-ЬК), разведенным в ЗФР. В качестве контроля неспецифического связывания (Ν8Β) несколько лунок заполняли 100 мкл/лунку ЗФР. Планшеты закрывали пластиковой пленкой и инкубировали в течение ночи при КТ. После закрытия планшеты отмывали трижды 200 мкл/лунку 0,05% Твин 20 (фирма Е1ика, каталожный № 93773) в ЗФР и лунки блокировали в течение 1 ч при 37°С, добавляя 300 мкл/лунку блокирующего буфера 8ирегВ1оск (фирма Р1егсе, каталожный № 37535) в ТВ8. После инкубации блокирующий раствор удаляли и добавляли 100 мкл/лунку склеростина (из Е. сой, фирма ΝοναΠίβ: 1 -1000 нг/мл), разведенного в 1%-ном растворе БСА в ЗФР. Планшеты инкубировали в течение 2 ч при КТ, затем отмывали трижды, используя по 200 мкл/лунку 0,05% Твин 20 в ЗФР. Затем добавляли 100 мкл/лунку антитела к склеростину (1 мкг/мл), разведенного в 1%-ном растворе БСА в ЗФР, и планшеты инкубировали в течение 2 ч при КТ с последующей трехкратной отмывкой 200 мкл/лунку 0,05% Твин 20 в ЗФР. И, наконец, добавляли 100 мкл/лунку конъюгированного с АЬР антитела к козьему 1дС (1:5000; фирма 8щта, каталожный № А-7888), разведенного в 1%-ном растворе БСА (фирма 8щта, каталожный №: А-7888) в ЗФР, в течение 1 ч при КТ и затем планшеты отмывали трижды, используя по 200 мкл/лунку 0,05% Твин 20 в ЗФР. Для определения АЬР вносили в планшеты в течение 90 мин по 100 мкл/лунку раствора субстрата для АЬР (фирма 8щта, каталожный № 80942) (1 таблетка на 5 мл 1х субстратного буфера на основе диэтаноламина; фирма Р1егсе, каталожный № 34064) и определяли оптическую плотность при 405 нм.
Оценка сверхэкспрессии ШР4 в НЕК293-клетках.
Клетки НЕК293 (АТСС, каталожный № СРБ-1573) культивировали согласно общепринятым методам в среде ЭМЕМ/Е12 (фирма 1пуйгодеи, каталожный № 21331-020), дополненной 10% ЕС8 (фирма ВюСоисер!, каталожный № 2-01Е10-1, партия 204459Р), 2 мМ Ь-глутамином (фирма 1иуйгодеи, каталожный № 25030-024), 100 ед. пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина (фирма 1иу11годеи, каталожный № 15140-122) и 10 мМ НЕРЕ8 (фирма 1иуйгодеи, каталожный № 15630-056). НЕК293-клетки высевали из расчета 5х104 клеток/лунку в 48-луночные планшеты, обработанные поли-Э-лизином, и инкубировали в течение 24 ч до осуществления трансфекции с помощью Липофектамина 2000 (фирма Тиуйгодеи, каталожный № 11668-019). Для трансфекции каждой лунки следующее количество плазмид добавляли до получения конечного объема 25 мкл ОрПМЕМ® I (фирма 01Ьсо, каталожный № 31985-047) и осторожно смешивали: для контрольных лунок (ртахОЕР, 62,5 нг, рс^NА3+, 125 нг; 8ирегТорЕ1авй (8ТЕ) 62,5 нг; несущая люциферазу Кеш11а под контролем промотора 8У40 плазмида, 0,75 нг) и для лунок, обрабатываемых \νπΙ-1 (ртахОЕР, 62,5 нг, рс^NА-\\ηι-1. 62,5 нг; рс^NА3+. 62,5 нг; 8ирегТорЕ1авй (8ТЕ) 62,5 нг; несущая люциферазу Веш11а под контролем промотора 8У40 плазмида, 0,75 нг), и для лунок, обрабатываемых ШР4-\гп1-1 (рс^NА3+-^ΚР4, 62,5 нг, рс^NА3+-νиΐ-1, 62,5 нг; рс^NА3+. 62,5 нг; 8ирегТорЕ1авй (8ТЕ) 62,5 нг; несущая люциферазу Кеш11а под контролем промотора 8У40 плазмида, 0,75 нг). Во второй пробирке 0,8 мкл Липофектамина 2000 разводили до конечного объема 25 мкл ОрйМЕМ® I и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем содержимое двух пробирок смешивали, добавляя содержимое содержащей липид пробирки в содержащую ДНК пробирку, и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, давая образоваться комплексу ДНК-липид. Затем комплекс ДНКлипид (50 мкл) поровну вносили в лунки и инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 5 ч. В конце 5часового периода инкубации клетки были подготовлены к 20-часовой обработке изучаемыми реагентами, такими как 8О8Т, ΌΚΚ1 (фирма Κ&Ό, каталожный № 1096-ЭК), антителами и т.д. Анализ люциферазы осуществляли согласно методу, описанному в разделе Анализ νΟ, но добавляя 150 мкл буфера для пассивного лизиса.
Оценка сверхэкспрессии ШР4 в С28А2-клетках.
С28А2-клетки (получены от Магу ОоИгшд, Нагуагй 1и5(йи1е5 о! Мейюше, Бостон, Массачусетс, США) культивировали в такой же среде, что и НЕК293-клетки (см. выше), за исключением того, что в среде отсутствовал НЕРЕ8, и она включала в виде добавки заменимые аминокислоты (фирма 01Ьсо, каталожный № 11140). С28А2-клетки высевали из расчета 1х105 клеток/лунку в 24-луночные планшеты в среду без антибиотиков и инкубировали в течение ночи перед осуществлением трансфекции с использованием Липофектамина 2000 (фирма 1иуйгодеи, каталожный № 11668-019). Для трансфекции каждой лунки следующее количество плазмид (в целом 600 нг/лунку) добавляли до получения конечного объема 50 мкл ОрПМЕМ® I (фирма 01Ьсо, каталожный № 31985-047) и осторожно смешивали: для контрольных лунок (8ирегТорЕ1авй (8ТЕ) 100 нг; несущая люциферазу Веш11а под контролем промотора 8У40 плазмида, 2 нг и рс^NА3+, 500 нг до баланса) и для лунок, обрабатываемых \νπΙ-1 (плазмида, несущая рс^NА\νπΙ-1, 100 нг; плазмида, несущая ШР5, 100 нг; 8ирегТорЕ1авй (8ТЕ) 100 нг; несущая люциферазу Кеш11а под контролем промотора 8У40 плазмида, 2 нг и рс^NА3+. 300 нг), и для лунок, обрабатываемых ЬКР4\\и1-1 (плазмида, несущая рс^NА-\νηι-1. 100 нг; плазмида, несущая ЬКР5, 100 нг; плазмида, несущая ЬКР4, 100 нг; 8ирегТорЕ1авй (8ТЕ) 100 нг; плазмида, несущая люциферазу Реш11а под контролем промотора 8У40, 2 нг, и рс^NА3+. 200 нг). Во второй пробирке 1,6 мкл Липофектамина 2000 разводили до конечного объема 48,4 мкл ОрДМЕМ® I и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин.
- 38 018756
Затем содержимое двух пробирок смешивали, добавляя содержимое содержащей липид пробирки в содержащую ДНК пробирку, и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, давая образоваться комплексу ДНК-липид. Затем комплекс ДНК-липид (100 мкл) поровну вносили в лунки и инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 2 ч. В конце 2-часового периода инкубации среду для трансфекции заменяли 450 мкл/лунку не содержащей антибиотик средой и клетки инкубировали в течение 24 ч. Затем клетки обрабатывали в течение 20 ч тестируемыми реагентами, такими как 808Т или ИКК1 (фирма В&И, каталожный № 1096-ΌΚ). Анализ люциферазы осуществляли согласно методу, описанному в разделе Анализ \\тИ.
Оценка воздействия выключения (нокдауна) ЕВР4 в нЕК293-клетках.
нЕК293-клетки линии теп1-1/8ТЕ/ВепШа (стабильный клон, полученный в результате стабильной трансфекции нЕК293-клеток (АТСС, каталожный № СВЬ-1573)) экспрессирующей \\п1-1 плазмидой, репортерной плазмидой 8ирегТорЕ1а5Й и несущей люциферазу Веш11а под контролем промотора 8У40 плазмидой культивировали согласно общепринятым методам в среде ЭМЕМ, содержащей 4500 г/л глюкозы (фирма 1пу|1годеп, каталожный № 41965-035), дополненной 10% ЕС8 (фирма Ат1тей, каталожный № 2-0Е100-1), 2 мМ Ь-глутамином (фирма 1пу|1годеп, каталожный № 25030-081), 100 ед./мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина (фирма С1Ьсо, каталожный № 15140-163), 6 мкг/мл пуромицина (фирма 1пу|1годеп, каталожный № ап1-рг-1), 150 мкг/мл зеоцина (фирма 1пу|1годеп, каталожный № 45-0430) и 150 мкг/мл гигромицина (фирма 1пу|1годеп, каталожный № 10687-010). Предназначенные для селекции антибиотики оставляли в среде в течение всех экспериментов по оценке воздействия выключения. Клетки высевали из расчета 0,6х105 клеток/лунку в 24-луночные планшеты, обработанные поли-И-лизином, и давали прикрепиться в течение ночи перед осуществлением трансфекции δί-РНК, мишенью которой является ЬВР4 (81-РНК-ЕВР4), с использованием н1РегЕес1 (фирма О|адеп, каталожный № 301707). Смысловые и антисмысловые последовательности используемых 81-РНК-ЕКР4, представлены ниже:
ЬВР4а: ТАААТТАТСАТААА6ТССТАА/А66АСТТТАТ6АТААТТТАТТ; (8ЕО ГО N0: 160/161), ЬВР4Ь: АТА6Т66ТТАААТААСТССА6/66А6ТТАТТТААССАСТАТТТ; (8ЕО ГО N0: 162/163), ЬВР4с: ТАААТТСТС6Т6АТ6Т6ССАТ/66САСАТСАС6А6ААТТТАТТ; (8ЕО ГО N0: 164/165), ЬВР4й: ТТТСТТАТА6САСА6СТ66ТТ/ССА6СТ6Т6СТАТАА6АААТТ; (8ЕО ГО N0: 166/167), ЬВР4е: ТА6АССТТТССАТССАС6СТ6/6С6Т66АТ66ААА66ТСТАТТ; (8ЕО ГО N0: 168/169). Для трансфекции каждой лунки приготавливали две пробирки Эппендорфа: первая пробирка содержала 0,2 мкл 20 нМ маточного раствора 81-РНК-ЬВР4 или 0,1 мкл 20 нМ маточного раствора двух различных ЬВР4-81-РНК (конечная концентрация Ц-РНК/лунку составляла 6,6 нМ) и 50 мкл 0р11тет, а вторая пробирка содержала 3 мкл ШРегЕес! и 47 мкл 0рйтет. Содержимое второй пробирки добавляли к содержимому первой пробирки, перемешивали в течение короткого периода времени и выдерживали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем 100 мкл этой смеси добавляли в соответствующую лунку и клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 30 ч. Затем смесь для трансфекция удаляли и заменяли свежей не содержащей антибиотик культуральной средой (450 мкл/лунку) и выдерживали в течение еще 24 ч. Перед обработкой 808Т или ИКК1 среду удаляли, заменяли свежей не содержащей антибиотик культуральной средой, которая включала соответствующее разведение 808Т или ИКК1 (фирма В&И, каталожный № 1096-ОК), и клетки инкубировали в течение 20 ч при 37°С в 5% СО2. Затем осуществляли анализ люциферазы согласно методу, описанному в разделе Анализ \νπΙ.
Созданные на животных модели.
Восьмимесячным самкам мышей линии 0Е1/1С (п=16/группу, фирма С11аг1е5 В1уег, Франция) вводили внутривенно дважды в неделю антитело к склеростину АНТИТЕЛО А (25 мг/кг, 11/т1дС2а) (М0В05813) или контрольное антитело (анти-РС-й/т1дС2а). Контрольным группам животных вводили ежедневно подкожно 100 мкг/кг РТн (1-34) или наполнитель (ЗФР). Обработку всех животных осуществляли в течение 2,5 недель. Половину животных (п = 8 особей/группу) умерщвляли в этот момент времени для проведения гистоморфометрического анализа. Обработку остальных животных (п = 8 особей/группу) проводили вплоть до 5 недель.
Массу и геометрическое строение большеберцовой кости животных оценивали в начале периода обработки путем периферической количественной компьютерной томографии (рОСТ) и микрокомпьютерной томографии (т1сгоСТ). Животных поровну разделяли на группы в зависимости от веса тела и общей минеральной плотности большеберцовой кости по данным рОСТ. Изменения минеральной плотности, массы и геометрического строения кости оценивали после обработки в течение 2,5 и 5 недель. Вес тела определяли еженедельно. Животным, которых умерщвляли после 2,5-недельной обработки, вводили две флуорохромные метки для оценки минерализации кости за 10 и 3 дня до аутопсии. При аутопсии получали образцы крови. Оценку с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорциометрии (ИЕХА) осуществляли при аутопсии на вырезанной большеберцовой кости, бедренной кости и поясничном позвонке. Кости фиксировали, дегидратировали и заливали для получения срезов с помощью микротома и для гистоморфометрического анализа динамики формирования костной ткани.
Протокол обработки.
Контрольное антитело: анти-РС-й/т1дС2а, концентрация: 2,5 мг/мл, объем, применяемый для обра
- 39 018756 ботки: 10 мл/кг, наполнитель: 50 мМ цитрат, 140 мМ ИаС1.
Антитело к склеростину: анти-808Т-М0К05813, Б/т1дС2а, 2,45 мг/мл, объем, применяемый для обработки: 10 мл/кг, наполнитель: 50 мМ цитрат, 140 мМ ИаС1.
НРТН (1-34) (фирма ВасНет, Бебендорф, Швейцария): 100 мкг/кг, наполнитель: ЗФР+БСА 0,1%. Обрабатываемые группы (группы обработки).
- Контроль изотипа (ίν) = анти-РС-т1дС2а,
- анти-808Т-М0К05813 (ίν),
- контроль-наполнитель (кс). = ЗФР+БСА 0,1%, 4НРТН (1-34) (кс).
Условия содержания.
Животных содержали группами из 4-5 животных при 25°С при световом цикле 12 ч:12 ч светтемнота. Их кормили стандартным лабораторным кормом, содержащим 0,8% фосфора и 0,75% кальция (ХАРАС 3893.0,25, фирма КйЬа, Базель, Швейцария). Животные имели свободный доступ к корму и воде.
Соответствие закону о защите (благополучии) животных.
Эксперименты на животных осуществляли согласно правилам, установленным в кантоне БазельСити, Швейцария.
Методы.
Периферическая количественная компьютерная томография (рОСТ).
Животных подвергали ингаляционному наркозу (изофлуран, 2,5%) и клали набок. Левую лапу растягивали и фиксировали в таком положении.
Обследовали поперечные срезы костной массы, плотность и геометрическое строение кости в проксимальном метафизе большеберцовой кости на уровне средней части выступа малоберцовой кости и на расстоянии 1,8 мм от проксимального конца большеберцовой кости, что определяли с помощью сканера с широким обзором (сканер-разведчик) с использованием адаптированного устройства 8!га!ес-Ыог1апб ХСТ-2000, снабженного рентгеновской трубкой 0хГогб 50 АМ и коллиматором диаметром 0,5 мм. Для оценки были выбраны следующие установки: размер вокселя (объемный элемент изображения): 0,1х0,1х0,5 мм; скорость сканирования: предварительное (разведывательное) сканирование 10 мм/с; конечное сканирование 3 мм/с, 1 блок, контурный режим 1, режим пиллинга 2; порог плотности кортикального слоя кости: 610 мг/см, внутренний порог: 610 мг/см.
Микрокомпьютерная томография (ткгоСТ).
Животных подвергали ингаляционному наркозу (изофлуран, 2,5%) и клали набок. Левую лапу растягивали и фиксировали в таком положении.
Оценивали структуру губчатого вещества кости в левом проксимальном метафизе большеберцовой кости с помощью устройства 8сапсо у1уаСТ20 (фирма 8сапсо Меб1са1 АС, Швейцария). Неизометрические воксели имели размер 10,5x10,5x10,5 мкм. На основе изображений поперечных срезов обрисовывали компартмент губчатого вещества кости из кортикального слоя кости, выделяя его контур. На всех других срезах границы интерполировали на основе отслеживания определенного представляющего интерес объема. Оценивали 143 среза в области вторичного спонгиоза (начиная с области, расположенной ниже латеральных нижних краев ростовой пластинки). Пороговое значение, которое применяли для трехмерной оценки структурных параметров, составляло 370.
Двухэнергетическая рентгеновская абсорциометрия (ЭЕХА).
Ех νί\Ό оценку с помощью ЭЕХА осуществляли в левой большеберцовой кости, левой бедренной кости и в поясничных позвонках 1-4. Для симуляции мягкой ткани применяли этанол (70%). Оценку осуществляли, используя обычное устройство Но1офс РОК-1000, адаптированное для осуществления измерений на мелких животных. Применяли коллиматор с диаметром 0,9 см и режим с ультравысоким разрешением (междустрочный интервал 0,0254 см, разрешение 0,0127 см).
Мечение флуорохромом.
Применяли ализарин (20 мг/кг, подкожно, в виде комплексона ализарина, фирма Мегск, Дитикон, Швейцария) за 10 дней до аутопсии.
Применяли кальцеин (30 мг/кг, подкожно, фирма Р1ика, Букс, Швейцария) за 3 дня до аутопсии. Гистологическая и гистоморфометрическая оценка.
После иссечения правую бедренную кость и 5-й, и 6-й поясничные позвонки помещали на 24 ч в фиксатор Карновски, дегидратировали в этаноле при 4°С и заливали в смолу (метилметакрилат). С помощью микротома 2050 8ирегси! (фирма КекБей 1ипд, Арнсберг, Германия) получали набор расположенных непоследовательно микротомных срезов толщиной 5 мкм во фронтальной срединной плоскости для оценки формирования кости на основе выявления метки флуорохромом. Срезы оценивали с помощью микроскопа Ьека ИМ (фирма Ьека, Хирбруг, Швейцария), снабженного камерой (80ΚΥ ЭХС950Р, Токио, Япония) и адаптированной программой Онаайте! 600 (фирма Ьека, Кэмбридж, Великобритания). В качестве образца использовали по одному срезу для каждого животного. Микроскопические изображения образцов оцифровывали и оценивали полуавтоматически на экране. Оценивали периметр кости, имеющей одну и две метки, и ширину между мечеными областями (200-кратное увеличение). Рас
- 40 018756 считывали минерализованный периметр (%), скорость присоединения новых минеральных слоев (аппозиция) (мкм/день) (скорректирована для скошенного среза в компартменте губчатого вещества кости) и ежедневную скорость формирования кости (ежедневная скорость формирования кости/периметр кости [мкм/день]). Все параметры оценивали во вторичном спонгиозе дистального метафиза бедренной кости и в одном поясничном позвонке. Второй набор срезов окрашивали устойчивой к действию тартрата кислой фосфатазой (ТВАР). Оценивали поверхность остеокластов относительно поверхности кости (%) во вторичном спонгиозе.
Статистический анализ.
Результаты выражали в виде среднего значения +/-СКО. Статистический анализ осуществляли с помощью ΐ-критерия Стьюдента (двусторонний; неспаренный). Оценивали различие между обработанным вариантом (антитело к склеростину или ЬРТн(1-34)) и контролем (контрольное антитело или ЗФР), *, + р< 0,05, **, ++р < 0,01.
Определение аффинности.
Определение аффинности отобранных ЕаЬ к человеческому склеростину с помощью резонанса поверхностного плазмона (Шатого).
Кинетические константы к^ и к^ определяли на основе оценки связывания с использованием серийных разведений соответствующего ЕаЬ с иммобилизованным посредством ковалентной связи антигеном склеростина с помощью устройства Витого 3000 (фирма Витого, Уппсала, Швеция). Для ковалентной иммобилизации антигена применяли стандартный метод аминового сочетания ЕОС-ЫнЗ. Оценку кинетических параметров осуществляли в ЗФР (136 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 10 мМ №2нР04, 1,76 мМ Кн2Р04, рН 7,4) при скорости потока 20 мкл/мин с использованием концентрации ЕаЬ в диапазоне от 1,5 до 500 нМ. Продолжительность инъекции каждой концентрации составляла 1 мин, после чего следовала 3-минутная фаза диссоциации. Для регенерации применяли 2х5 мкл 10 мМ глицина, рН 1,5. Все сенсограммы получали с помощью предназначенной для оценки программы ВМ, 3.1 (фирма Витого).
Анализ связывания на основе электрохемилюминисценции (ВюУеШ) для оценки аффиности ЕаЬ к связыванию со склеростином в лизатах.
Для оценки аффинности к связыванию со склеростином фрагментов антител в лизатах Е. тоН (ВЕЬэкстракты), связывание анализировали с помощью рабочей станции ВюУейб М-384 8ЕВШ8 (фирма ВгоУеШ Еигоре, Уитни, графство Оксфордшир, Великобритания).
Эксперимент осуществляли в 96-луночных полипропиленовых титрационных микропланшетах и с использованием ЗФР, дополненного 0,5% БСА и 0,02% Твин 20 в качестве буфера для анализа. Биотинилированный человеческий белок склеростин иммобилизовали на стрептавидиновых парамагнитных гранулах типа М-280 (фирма Эупа1) согласно инструкциям поставщика. В лунку добавляли разбавленный из расчета 1:25 маточный раствор гранул. Образцы объемом 100 мкл разведенного ВЕЬ-экстракта и гранул инкубировали в течение ночи при КТ в шейкере. Для выявления использовали антитело к человеческому (ЕаЬ)'2 (фирма ^^аηονа), меченное с помощью ВУ-метки согласно инструкциям поставщика (фирма ВгоУеШ Еигоре, Уитни, Оксфордшир, Великобритания).
С помощью описанного выше метода анализировали произвольно отобранные клоны. Клоны, для которых получены были самые высокие значения, отбирали для дополнительного анализа использованием уравновешивающего титрования раствора.
Определение аффинности ЕаЬ-фрагментов к склеростину с использованием уравновешивающего титрования раствора (ЗЕТ).
Для определения Кс использовали содержащие мономеры фракции ЕаЬ (содержание мономеров по меньшей мере 90%, анализ с использованием гель-фильтрации (8ЕС); 8ирегйех75, фирма Атегбйат Рйагтааа). Определение аффинности на основе электролюминисценции (ЕСЬ) в растворе и оценку данных осуществляли в целом согласно методу, описанному у наепе1 и др., 2005. Постоянное количество ЕаЬ (25 пМ) уравновешивали с использованием различных концентраций (серийные 3-кратные разведения) склеростина человека, мыши или макака-крабоеда (исходная концентрация 500 пМ) в растворе. Добавляли биотинилированный человеческий склеростин (0,5 мкг/мл), сшитый с парамагнитными гранулами (стрептавидиновые гранулы типа М-280, фирма Оупа1), и меченное с помощью ВУ-1ад™ (фирма ВюУеШ Нигере, Уитни, Оксфордшир, Великобритания) антитело к человеческому (ЕаЬ)'2 (фирма ^^аηονа) и смесь инкубировали в течение 30 мин. Затем концентрацию несвязанного ЕаЬ определяли количественно с помощью ЕСЬ с использованием анализатора типа М-8ЕШЕ8® 384 (фирма ВгоУейб Еигоре).
Аффинность улучшенных ЕаЬ-клонов идентифицировали с помощью ЕСЬ на основе широкомасштабного скрининга аффинности с помощью ВюУейб-анализа. После отбора совпадений (хитов) 4 субклона объединяли с помощью этого же метода.
Анализ эффективности ингибирования связывания с рецептором с помощью ВюУсиб™.
Для анализа на основе ВгоУейб™ эффективности ингибирования связывания рекомбинантный человеческий ВМР-2 непосредственно сшивали (ИнЗ/ЕОС-химия) с покрытыми карбоновой кислотой магнитными гранулами М-270 (фирма Эупа1) согласно инструкциям поставщика. Анализ осуществляли в 96-луночных полипропиленовых титрационных микропланшетах (фирма №пс). Добавляли по 50
- 41 018756 мкл/лунку очищенного ЕаЬ в буфере для анализа (ЗФР + 1% Твин 20 (строго) или 0,1% Твин 20 (менее строго) +1% БСА), разведенного путем серийных разведений 1:3 (начальная концентрация: 1000 нМ). Добавляли по 50 мкл/лунку биотинилированного человеческого склеростина (4 нМ) к каждому разведению ЕаЬ. После инкубации в течение 90 мин при встряхивании при 400 об/мин в термомиксере (ТНегтот1хег) Эппендорфа при 22°С добавляли в каждую лунку по 25 мкл сенсибилизированных ВМР-2 гранул (2,7х107 гранул на 1 мл) и разведенный из расчета 1:500 стрептавидин, меченный с помощью Βν-1η§'™ согласно инструкциям поставщика (фирма ВОСенх Еигоре), и инкубировали в течение 30 мин (800 об/мин, 22°С). Выявление осуществляли с помощью рабочей станции В^οVе^^8 М-384 8ЕЯ1Е8® Уогкйабоп (фирма В^οVе^^8 Еигоре). Для определения значений ЕС50 применяли 4-параметрическую логарифмическую модель для подбора фирма ГОВ8).
Получение иммуноглобулинов.
Превращение в человеческий 1д61-формат и человеческий/мышиный 1д62а-формат.
Для экспрессии полноразмерного 1д6 фрагменты вариабельных областей тяжелых (νΗ) и легких (Уь) цепей субклонировали из экспрессионных векторов ЕаЬ в соответствующих рМогрй® 1д-векторах: рМогрй®_й_1д1 и химерный человеческий/мышиный рМогрй®2_й/т_1д2а. Применяли рестриктазы ЕсоЯ1, М£е1, В1р1 для субклонирования фрагмента ^-области в векторах Могрй®_й_1д61 или рМогрй®2_й/т_1д62а, а ЕсоЯУ, В81У1, Ира1 применяли для субклонирования фрагмента νΗ-области в векторах рМогрй®_й_1дк, рМогрй®_й_1дХ и рМогр11®2_11/т_1д/_ соответственно.
Рестриктазы ЕсоЯ1, М£е1 и В1р1 применяли для субклонирования фрагмента ^-области в рМ0ЯРΗ®_й_Iд61: каркас вектора создавали путем расщепления с помощью ЕсоЯ1/В1р1 и выделяли фрагмент размером 6400 пар оснований, в то время как ^-фрагмент (350 пар оснований) получали путем расщепления с помощью М£е1 и В1р1 и последующей очистки. Вектор и вставку лигировали посредством совместимых выступающих концов, созданных с помощью расщепления ЕсоЯ1 и М£е1 соответственно, и через В1р1-сайт. Таким образом разрушали сайты рестрикции и ЕсоЯ1, и М£е1.
Рестриктазы М£е1 и В1р1 применяли для субклонирования фрагмента ^-области в рМ0ЯРΗ®2_й/т_Iд62а. В этих вновь созданных векторах для 1д6 после других модификаций сайт ЕсоЯ1 (который позволяет осуществлять только субклонирование через совместимые выступающие концы) заменяли на сайт М£е1, что позволяет осуществлять с помощью М£е1/В1р1 расщепление как вектора, так и вставки.
Субклонирование фрагмента νι.-области в М0ЯРΗ®_й_Iдκ осуществляли в сайтах ЕсоЯУ и ВмХУЕ а субклонирование в рМ0ЯРΗ®_й_Iдλ и рМ0ЯРΗ®2_й/т_Iдλ осуществляли с помощью ЕсоЯУ и Ира!
Кратковременная экспрессия и очистка человеческого 1д6.
Клетки линии ΗЕΚ293 или ΗΚΒ11 трансфектировали эквимолярным количеством экспрессионных векторов тяжелой и легкой цепей 1д6. Через 4 или 5 дней после трансфекции собирали супернатанты клеточных культур. После доведения значения рН супернатанта до 8,0 и стерилизации фильтрацией раствор подвергали стандартной колоночной хроматографии на белке А (размер пор 20 А, фирма РЕ Вюкук1ет§).
Пример 1. Создание человеческого и рекомбинантного белков склеростина макака-крабоеда.
Полноразмерную кДНК, кодирующую предшественник человеческого склеростина (6епВапк, регистрационный № АЕ326739), особенностью которого является наличие встречающегося в естественных условиях сигнального пептида (ак 1-213, ИРЬ 005002), клонировали в экспрессионном векторе млекопитающих рЯ85а путем инсерции в сайтах рестрикции А§р718 и КЬаЕ Предназначенную для выявления белка и очистки метку (АРР=ЕΕЯΗ) добавляли на С-конец гена.
После подтверждения маломасштабной экспрессии с помощью анализов кратковременной трансфекции в 6-луночных планшетах начинали создание стабильно трансфектированных пулов путем трансфекции четырех пулов (1,0х106 клеток в каждом) липофектином. Через 48 ч после трансфекции начинали отбор трансфектантов, добавляя антибиотик 2еост™ в концентрации 100 мкг/мл. После получения во всех 4 пулов с нормальными титрами роста рекомбинантного белка их оценивали в помощью аналитической аффинной хроматографии (ЖХВР) с использованием антитела к АРР и отбирали являющийся наиболее эффективным продуцентом пул - пул 2 - в отношении адаптации к бессывороточной среде и применяли в дальнейших крупномасштабных опытах. Аналогично осуществляли опыты по крупномасштабной кратковременной экспрессии (10-литровый масштаб) с использованием полиэтиленимина в качестве носителя ДНК-плазмиды в процессе трансфекции и системы биореактора \Уамет™ (С208Р8-Е, Агк-Ло. 100.001, фирма Уаге Вю1ес11) в качестве системы для культивирования. Собирали супернатанты культур в объеме 12-22 л через 7-10 дней после трансфекции и концентрировали путем фильтрации в перекрестном потоке и диафильтрации перед очисткой.
808Т человека и макака-крабоеда очищали с помощью иммуноаффинной хроматографии. В целом, метод состоял в следующем партии по 10-20 л супернатантов культуры ткани концентрировали до 1-2 л с помощью фильтрации в перекрестном потоке (отсечение 10 кДа) и вносили со скоростью 2 мл/мин на 50миллилитровую сефарозную колонку с антителом к АРР, полученную путем сшивания соответствующего моноклонального антитела АЬ1-40/АРР (6Е10-А5) с актированной СХБг сефарозой 4В согласно инст
- 42 018756 рукциям производителя (10 мг антитела на 1 мл смолы). После базовой отмывки ЗФР связанный материал элюировали 100 мМ глицином, рН 2,7, нейтрализовали и стерилизовали фильтрацией. Концентрацию белка определяли с помощью А280 с использованием компьютеризированных факторов абсорбции. Очищенные белки окончательно характеризовали с помощью ДСН-ПААГ, Ν-концевого секвенирования и ЖХ-МС. Аликвоту очищенного человеческого 8О8Т биотинилировали в ЗФР в течение 1 ч при 37°С, используя 1 мМ сульфо-ХН8-1с-биотин (фирма Ирйта; ИР54398А). Избыток реагента затем удаляли путем интенсивного диализа в противотоке ЗФР.
Выведенный из Е. сой человеческий 8О8Т.
Меченный Нй6-протеазой Рге8сЙ5юп 8О8Т (ак 24-213) (№Ь006071, плазмида рХ1504) и 8О8Т (ак 24-213) (№Ь006690, плазмида рХИ15) получали путем повторной укладки (рефолдинга). Любой из плазмид трансфектировали штамм Е. сой Типег (ΌΕ3).
Партию Р8И5257 ферментировали в 20-литровом масштабе (У9405), используя модифицированную ТВ-среду (версия 1аЫ 112). Клетки индуцировали при значении ОП600 3,90 1 мМ ИПТГ и индуцировали в течение 3 ч 30 мин при 37°С. Сбор клеток осуществляли с помощью проточной центрифуги непрерывного действия, что позволяло получать клеточный дебрис, масса которого во влажном состоянии составляла 190 г.
Партию Р8И11274 ферментировали в 20-литровом масштабе в 16 л минимальной среды М9-1, дополненной меченным с помощью 15Ν хлоридом аммония. Клетки индуцировали 1 мМ ИПТГ при достижении значения ОП600 1,5 и собирали при значении ОП600 3,3 с помощью проточной центрифуги непрерывного действия, что позволяло получать клеточный дебрис, масса которого во влажном состоянии составляла 50 г.
Влажный клеточный дебрис, полученный в результате вышеуказанной ферментации, лизировали в 8 об. 50 мМ Трис, рН 8,0 (который содержал по 5 мМ ЭДТК, ДТТ и бензамидин-НС1), используя эмульгатор Авестин (Ауейш) С-50, и центрифугировали в течение 30 мин при 12000 об/мин. Супернатант отбрасывали и образовавшийся дебрис повторно суспендировали в 10 об. буфера для лизиса и вновь центрифугировали. Процесс повторяли еще 3 раза, после чего буфер для лизиса заменяли на воду МИИ-Ог, содержащую 5 мМ ДТТ. Дебрис промывали еще два раза в этих же условиях. Тельцы включения растворяли в 8 М гуанидине-НС1 (который содержал 100 мМ ДТТ, 50 мМ Трис, рН 8 и 5 мМ ЭДТК) в течение 3-4 ч при температуре окружающей среды, затем центрифугировали при 20000 об/мин в течение 30 мин, фильтровали через фильтр с размером отверстий 0,45 мкМ. Рефорлдинг инициировали быстрым растворением с 88 об. (Р8И11274) и 92 об. (Р8И5257) охлажденного буфера для рефолдинга (0,5 М Трис, содержащий 0,9 М аргинин-НС1, 5 мМ С8Н и 0,5 мМ С88С, рН 8). Раствор хранили при 4°С в течение 1 недели. На этой стадии два препарата обрабатывали несколько по разному из-за необходимости удалять Ы§6-метку из препарата (партии) Р8И5257 перед завершением рефолдинга.
Партия Р8И5257.
Разбавленный раствор для укладки подвергали диафильтрации в противотоке 1,5 об. 50 мМ Трис, рН 8, 5 мМ С8Н, 0,5 мМ С88С путем концентрирования в 2 раза, после чего повторно доводили до первоначального объема. Этот процесс повторяли трижды, после чего добавляли протеазу Рге8сЙ5Юп и раствор выдерживали в течение 48 ч при 4°С. Все процессы концентрирования/диафильтрации осуществляли с помощью кассеты для ультрафильтрации типа РеШсоп II с мембраной, отсекающей 10 кДа. И, наконец, раствор концентрировали в 10 раз.
Партия Р8И11274.
Разбавленный раствор для рефолдинга концентрировали в 10 раз. Применяли ЖХ/МС для подтверждения образования всех 4 дисульфидных мостиков до осуществления концентрирования.
Оба препарата подвергали диализу в противотоке 2x10 об. 50 мМ ацетата натрия, рН 5. После последовательной фильтрации через стекловолокно и мембрану с размером отверстий 3,0 мкм для удаления осадившегося белка осуществляли очистку с помощью катионообменной хроматографии высокого разрешения на 8Р-8ер11аго5е™. Колонку уравновешивали буфером для диализа, затем элюировали с использованием градиента 0-1 М №1С1 в таком же буфере, взятом в объеме, соответствующем 20 об. колонки. Склеростин элюировался в виде одного пика с небольшим плечом, которое отбрасывали. В случае Р8И5257 основной пик собирали, концентрировали, подвергая гель-фильтрации с использованием колонки 8ирегбех 75™, уравновешенной 50 мМ Тгй, 150 мМ №С1. В случае Р8И11274 образец получали непосредственно после катионообменной хроматографии.
кДНК 8О8Т обезьяны-крабоеда (су8О8Т) амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР с праймерами, выведенными из последовательности 8О8Т африканской зеленой мартышки (СепВапк, регистрационный № АЕ326742). 5'-праймер (АТССАССТСССАСТСССССТСТСТСТТСТ) (8ЕО II) 170) соответствовал Ν-концу последовательности сигнального пептида и отсутствовал в конечном секретируемом белке; 3'-праймер (ААТСАСССССАССТССАСААССССТАСТАС) (8ЕЦ Ю NО: 171) соответствовал области, которая обладала консервативностью для человека, африканской зеленой мартышки и мыши. Амплифицированный фрагмент субклонировали в сайтах ВатШ/ЕсоШ плазмиды рсЭХА3.1(+) и подтверждали последовательность. Эта плазмида служила также в качестве матрицы для ПЦР-амплификации супо
- 43 018756
808Т, что позволяло добавлять С-концевую АРР-метку и сайты рекомбинации аИВ, предназначенные для конечного клонирования в рИЕ8ТК85а согласно Са1е\\ау-технологии [су808Т-рИЕ8ТК85а]. Экспрессию осуществляли путем крупномасштабной кратковременной трансфекции в 10-литровом масштабе в системе биореактора ^ауе™, продукт собирали через 9 дней после трансфекции и очищали согласно описанному выше методу.
Пример 2. Создание человеческих специфических для склеростина антител с использованием библиотеки ИиСАЕ С0ЕЭ®.
Терапевтические антитела к человеческому склеростину создавали путем селекции клонов, обладающих высокой аффинностью к связыванию, используя в качестве источника антител варианты белков имеющейся в продаже фаговой дисплейной библиотеки Μοη}1ιο8\'5 ΗιΚ’ΛΕ С0ЕЭ®. ΗιΚ’ΛΕ С0ЕЭ® представляет собой библиотеку ЕаЬ-фрагментов (К1'1арр1к и др., 2000), в которой все шесть СИК диверсифицированы путем соответствующих мутаций и в которой применяют технологию Су5И15р1ау™ для связывания ЕаЬ-фрагментов с поверхностью фага (\У0 01/05950, на имя Εοΐιηίηβ, 2001).
Селекция путем пэннинга специфических для склеростина антител из библиотеки.
Для селекции антител, распознающих человеческий склеростин, применяли несколько стратегий пэннинга.
В целом, библиотеку ΗιΚ'ΛΕ С0ЕЭ®, несущую антитело-фаги, разделяли на три пула, которые содержали различные мастер-гены νΗ.
Эти пулы индивидуально подвергали либо:
а) твердофазному пэннингу, при котором антигенами (человеческий и мышиный склеростин) непосредственно сенсибилизировали 96-луночные титрационные микропланшеты типа Μаx^5ο^р (фирма Мшс, Висбаден, Германия), либо
б) иммобилизации и пэннингу в полужидкой фазе, при котором антиген (биотинилированный склеростин) соответственно комплекс фаг-антиген, иммобилизовывали на чистые №А (нейтравидин/авидин)полоски, либо
в) нескольким циклам пэннинга в растворе с использованием биотинилированного склеростина, при котором в каждом случае пэннинга комплекс фаг-антиген иммобилизовывали на стрептавидиновых магнитных гранулах (ПугаЬеаЙБ М-280; фирма Эуга1).
Твердофазный пэннинг с использованием склеростина.
Для первого цикла пэннинга с использованием склеростина лунки планшета Мах^рз сенсибилизировали в течение ночи 300 мкл (5 мкг/мл) человеческого склеростина (полученного в ΗЕК-клетках), разведенного в ЗФР.
После двух стадий отмывки с использованием 400 мкл ЗФР лунки инкубировали с блокирующим буфером, содержащим 5% порошкового молока, разведенного в ЗФР.
Перед селекцией ΗιΚ’ΛΕ С0ЕЭ®-фаги предварительно адсорбировали в блокирующем буфере (5% порошкового молока/ЗФР, 0,5% Твин 20) в течение 2 ч при КТ для того, чтобы избежать неспецифической селекции антител.
После отмывки (2x400 мкл ЗФР) сенсибилизированного и блокированного Ма-х^рр-планшета добавляли сенсибилизированные лунки по 300 мкл предварительно адсорбированных фагов и инкубировали в течение 2 ч при КТ при острожном встряхивании. После указанной инкубации осуществляли 10 циклов отмывки ЗФР и ЗФР/ 0,05% Твин 20 при КТ.
Связанные фаги элюировали, добавляя по 300 мкл 20 мМ ДТТ в 10 мМ Трис/ΗΠ, рН 8,0 на лунку, в течение 10 мин при КТ. Элюат удаляли и добавляли 15 мл клеток Е. отН ТС1Е', выращенных до достижения ОП600 нм 0,6-0,8. Давали произойти заражению Е. отН фагами в течение 45 мин при 37°С без встряхивания. После центрифугирования в течение 5 мин при 4120хд каждый бактериальный дебрис ресуспендировали в 600 мкл среды 2хУТ, высевали на содержащие 2хУТ-СС агаровые пластинки и инкубировали в течение ночи при 30°С. Затем колонии соскабливали с пластинок и фаги подвергали процедуре спасения и амплификации.
Второй и третий циклы селекции осуществляли идентично первому циклу селекции с единственным различием, состоящим в том, что условия отмывки после связывания фага были более строгими. Во втором цикле селекции для некоторых условий пэннинга использовали мышиный склеростин в качестве антигена для обогащения антителами, обладающими перекрестной реактивностью с мышиным склеростином. Для некоторых условий пэннинга для сенсибилизации применяли другую партию человеческого рекомбинантного склеростина (полученного в Е. ^ίί).
Пэннинг в полужидкой фазе с использованием склеростина.
При осуществлении этого типа пэннинга использовали два различных метода: пэннинг в полужидкой фазе с иммобилизацией и стандартную процедуру пэннинга в полужидкой фазе.
В целом, методы состояли в следующем: для пэннинга в полужидкой фазе с иммобилизацией с использованием биотинилированного склеростина 100 мкл антигена сенсибилизировали в течение 2 ч при КТ чистые нейтравидин/авидиновые (И/А) полоски (фирма Р1егсе, уровень активации 100 мл, способность к связыванию 15 пмоль на лунку). N/А-полоски блокировали в течение ночи при 4°С с помощью
- 44 018756
200 мкл СЬет1Ь1оск и отмывали дважды ЗФР.
Блокированный раствор фага (Сйет1Ь1оск/0,05% Твин 20) добавляли в блокированные содержащие МА лунки в течение 30 мин и эту стадию повторяли в течение еще 30 мин для удаления нейтравидин/авидиновых связывающих агентов. Затем предварительно очищенные фаги переносили на биотинилированный склеростин, иммобилизованный на чистых №А-полосках, запечатывали фольгой и инкубировали в течение ночи при КТ при встряхивании.
На следующий день раствор фагов удаляли из сенсибилизированных антигеном лунок и лунки отмывали.
Для стандартного пэннинга в полужидкой фазе блокированные (Сйет1Ь1оск/0,05% Твин 20) предварительно очищенные фаги добавляли в новую предварительно блокированную реакционную пробирку вместимостью 1,5 мл (Сйет1Ь1оск/0,05% Твин 20) и затем добавляли биотинилированный человеческий склеростин до конечной концентрации 100 нМ и инкубировали в течение ночи при КТ при встряхивании.
На следующий день раствор фага-антигена из 1,5-миллилитровой реакционной пробирки добавляли в новые блокированные лунки, содержащие нейтравидин/авидиновые полоски, и давали связываться в течение 30 мин при КТ, а затем отмывали.
При обеих процедурах пэннинга связанные фаги элюировали после отмывки, добавляя 300 мкл 20 мМ ДТТ в 10 мМ Трис/НС1, рН 8,0 на лунку, в течение 10 мин при КТ. Элюат удаляли и добавляли к 15 мл клеток Е. сой ТС1, выращенных до значения ОП600 нм 0,6-0,8. Давали фагу заражать Е. со11 в течение 45 мин при 37°С без встряхивании. После центрифугирования в течение 5 мин при 4120/д каждый бактериальный дебрис ресуспендировали в 600 мкл среды 2/ΥΊζ высевали на агаровые ЬВ-СС-пластинки и инкубировали в течение ночи при 30°С. Затем колонии соскабливали с пластинок и фаги подвергали процедуре спасения и амплификации.
Второй и третий циклы селекции осуществляли идентично первому циклу селекции с единственным различием, состоящим в том, что условия отмывки после связывания фага были более строгими.
Пэннинг в растворе с использованием склеростина.
При осуществлении этого типа пэннинга 200 мкл стрептавидиновых магнитных гранул (ЬупаЬеайк М-280; фирма Эупа1) однократно отмывали ЗФР и блокировали с помощью Сйет1Ь1оск в течение 2 ч при КТ. 500 мкл фагов блокировали с помощью С'НепиЫоск в течение 1 ч при КТ при вращении. Блокированные фаги дважды предварительно адсорбировали на 50 мкл блокированных стрептавидиновых магнитных гранул в течение 30 мин. Содержащий фаги супернатант переносили в новую блокированную 2миллилитровую реакционную пробирку и добавляли различные концентрации человеческого биотинилированного склеростина (см. табл. 5-7) и инкубировали в течение 1 ч при КТ при вращении. К каждому полученному в результате пэннинга пулу добавляли по 100 мкл блокированных стрептавидиновых магнитных гранул и инкубировали в течение 10 мин на роторе. Гранулы собирали с помощью сепаратора частиц (Эупа1 МРС-Е) в течение примерно 2,5 мин и раствор осторожно удаляли.
После циклов отмывки (табл. 2) связанные фаги элюировали, добавляя 300 мкл 20 мМ ДТТ в 10 мМ Трис/НС1, рН 8,0 на лунку, в течение 10 мин при КТ. Элюат удаляли и добавляли к 15 мл клеток Е. со11 ТС1, выращенных до значения ОПб00 нм 0,6-0,8. Давали фагу заражать Е. сой в течение 45 мин при 37°С без встряхивания. После центрифугирования в течение 5 мин при 4120/д каждый бактериальный дебрис ресуспендировали в 600 мкл среды 2/ΥΤ, высевали на агаровые ЬВ-СС-пластинки и инкубировали в течение ночи при 30°С. Затем колонии соскабливали с пластинок и фаги подвергали процедуре спасения и амплификации.
Второй и третий циклы селекции осуществляли идентично первому циклу селекции с единственным различием, состоящим в том, что условия отмывки после связывания фага были более строгими. Во втором и третьем цикле селекции в некоторых вариантах условий пэннинга применяли антиген в более низкой концентрации.
Субклонирование и экспрессия отобранных РаЬ-фрагментов.
Микроэкспрессия отобранных РаЬ-фрагментов.
Для облегчения быстрой экспрессии растворимых РаЬ-фрагментов кодирующие РаЬ вставки отобранных НиСАЬ С0ЬЭ®-фагов субклонировали посредством ХЬа[ и ЕсоЫ из соответствующего дисплейного вектора в предназначенном для Е. сой экспрессионном векторе рМ0ЕРН®Х9_МН (ЯаисйепЬегдег и др., 2003). После трансформации экспрессионными плазмидами клеток Е. со11 ТС1Р устойчивые к хлорамфениколу индивидуальные колонии отбирали и помещали в лунки стерильного 96-луночного титрационного микропланшета, предварительно заполненного 100 мкл среды 2^Т-С'С, и выращивали в течение ночи при 37°С. По 5 мкл на лунку каждой культуры Е. сой ТС-1 переносили в свежий стерильный 96-луночный титрацонный микропланшет, предварительно заполненный 100 мкл среды 2/ΥΤ, дополненной 34 мкг/мл хлорамфеникола и 0,1% глюкозы. Титрационные микропланшеты инкубировали при 30°С при встряхивании при 400 об/мин на шейкере для микропланшетов до тех пор, пока культуры не станут слегка мутными (~2-4 ч), до достижения значения ОП600 нм ~0,5. В эти планшеты для экспрессии добавляли по 20 мкл на лунку среды 2/ΥΤ, дополненной 34 мкг/мл хлорамфеникола и 3 мМ ИПТГ (изопропил-З-Э-тиогалактопиранозид) (конечная концентрация: 0,5мМ ИПТГ), титрационные микро
- 45 018756 планшеты запечатывали проницаемой для газа лентой и инкубировали в течение ночи при 30°С при встряхивании при 400 об/мин.
Получение лизатов целых клеток (ВЕЬ-экстракты).
В каждую лунку планшетов для экспрессии добавляли по 40 мкл ВЕЬ-буфера и инкубировали в течение 1 ч при 22°С на шейкере для титрационных микропланшетов (400 об/мин).
Экспрессия ЕаЬ-фрагментов антител, полученных из библиотеки НиСАЬ О0ЬЭ® в Е. сой и очистка.
Крупномасштабную экспрессию ЕаЬ-фрагментов, кодируемых рМ0ВРН®Х9_ЕаЬ_ЕН, в клетках Е. сой ΤО1 Е осуществляли в культурах во встряхиваемых колбах, используя 750 мл 2Ух-среды, дополненной 34 мкг/мл хлорамфеникола. Культуры встряхивали при 30°С до достижения значения ОП600 нм 0,5. Экспрессию индуцировали, добавляя 0,75 мМ ИПТГ (изопропил-в-О-тиогалактопиранозид), с последующей инкубацией в течение 20 ч при 30°С. Клетки собирали и разрушали с помощью лизоцима и ЕаЬфрагменты выделяли с помощью хроматографии с использованием N^-NΤΑ. Кажущуюся молекулярную массу определяли с помощью гель-фильтрации (8ЕС) с использованием калиброванных стандартов. Концентрацию определяли с помощью УФ-спектрофотометрии (КгеЬк и др., 2001).
Пример 3. Идентификация специфических для склеростина антител, полученных с помощью НиСАЬ®.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А) для выявления связывания со склеростином ЕаЬ-фрагментов при использовании непосредственной сенсибилизации склеростином.
Сенсибилизировали 384-луночные планшеты типа Махйотр (фирма Шпс, Рочестер, шт. Нью-Йорк, США), используя 20 мкл 2,5 мкг/мл антигена (человеческий склеростин - полученный в НЕК-клетках, человеческий склеростин - полученный в клетках Е. сой, и мышиный склеростин), в ЗФР, рН 7,4, в течение ночи при 4°С.
Планшеты блокировали ЗФР/0,05% Твин 20 (ЗФРТ), содержащим 5% порошкообразного молока, в течение 1 ч при КТ. После отмывки лунок ЗФРТ в лунки добавляли ВЕЬ-экстракт, очищенные и полученные с помощью НиСАЬ О0ЬЭ® ЕаЬ-фрагменты или контрольные ЕаЬ-фрагменты, разведенные в ЗФР, и инкубировали в течение 1 ч при КТ. Для выявления первичных антител вносили следующие вторичные антитела: конъюгированный со щелочной фосфатазой (АР) Е(аЬ')2-фрагмент антитела АГйшРиге, козий античеловеческий, антимышиный [§С (фирма 1асккоп [ттипо ВекеагсЬ). Для обнаружения АРконъюгатов использовали флуорогенные субстраты типа АйоРЬок (фирма ВосЬе) согласно инструкциям производителя. Лунки титрационного микропланшета отмывали ЗФРТ трижды в промежутке между всеми стадиями инкубации и трижды после конечной инкубации с вторичным антителом. Флуоресценцию измеряли с помощью планшет-ридера для спектрофлуориметра типа ΤΕСΑN.
Скрининг на основе иммобилизации с использованием биотинилированного склеростина.
Этот тип ЕЫ8А применяли для скрининга полученных с помощью НиСАЬ О0ЬЭ® ЕаЬфрагментов после процедуры пэннинга в растворе.
Сенсибилизировали 384-луночные планшеты типа Махйотр (фирма Шпс, Рочестер, шт. Нью-Йорк, США), используя 20 мкл 5 мкг/мл овечьего античеловеческого ^С, специфического для Еб-фрагмента (фирма Хе Вшбшд 8йе, Бирмингем, Великобритания), разведенного в ЗФР, рН 7,4.
После блокады 3% БСА в ΤВ§, 0,05% Твин 20 в течение 2 ч при КТ добавляли периплазматические экстракты или очищенные полученные с помощью НиСАЬ® О0ЬЬ® ЕаЬ-фрагменты (НиСАЬ®-ЕаЬ) и инкубировали в течение 1 ч при КТ. После пятикратной отмывки планшетов ЗФРТ в лунки добавляли по 20 мкл биотинилированного склеростина для оценки специфического связывания или биотинилированного трансферина для оценки неспецифического связывания.
Затем давали связываться биотинилированному антигену склеростина с иммобилизованными НиСАЬ®-ЕаЬ-фрагментами. И после отмывки инкубировали со стрептавидином (фирма 2утех), конъюгированным со щелочной фосфатазой. Для выявления комплекса АР-стрептавидин использовали флуорогенные субстраты типа АйоРЬок (фирма ВосЬе П1адпокйск, Маннгейм, Германия). Оценивали флуоресценцию при длине волны испускания 535 и длине волны возбуждения 430 нм.
Результаты.
После пэннинга обогащенные фаговые пулы субклонировали из вектора рМ0ВРН® 23-библиотеки (позволяет эффективно презентовать антитело на поверхности фага) в экспрессионный вектор рМ0ВРН®Х9_ЕаЬ_МН, который опосредует периплазматическую экспрессию растворимых ЕаЬ. Отбирали индивидуальные клоны и растворимые ЕаЬ экспрессировали из этих индивидуальных клонов.
В целом, анализировали ~4600 клонов при первичном скрининге, который осуществляли, связывая ЕаЬ-фрагменты, непосредственно полученные из бактериальных лизатов, с человеческим и мышиным склеростином, иммобилизованным на титрационных микропланшетах типа Махйотр, или путем иммобилизации ЕаЬ-фрагментов через антитело к Еб на титрационных микропаланшетах типа Махйотр с последующим связыванием с биотинилированным человеческим склеростином. Выявление осуществляли с помощью ЕЫ8А после мечения с использованием меченного щелочной фосфатазой античеловеческого антитела в виде (ЕаЬ)'2 или с использованием комплекса стрептавидин-щелочная фосфатаза.
- 46 018756
Хиты, полученные в результате первичного скрининга с использованием рекомбинантного склеростина, при которых сигналы превышали в 5 раз фоновый сигнал, дополнительно анализировали в отношении связывания с человеческим склеростином, полученным из НЕК-клеток и Е.со11, и с мышиным склеростином при применении биотинилированного склеростина либо для непосредственной иммобилизации, либо в растворе. Хиты, в которых распознавались все производные склеростина, отбирали и секвенировали.
Характеризация НиСАЬ® С0ЬИ®-РаЬ-фрагментов.
Определение аффинности с помощью В1асоге-анализа.
Для получения дополнительных характеристик антител к склеростину определяли аффинность к человеческому, мышиному склеростину и склеростину макака-крабоеда. Рекомбинантный белок склеростина иммобилизовывали на СМ5-чипе фирма В1асоге и в подвижной фазе вносили РаЬ-фрагменты в различных концентрациях. Для надежного определения моновалентных аффинностей для В1асогеанализа использовали только такие партии РаЬ-фрагментов, в которых с помощью количественной гельфильтрации выявлен уровень мономерной фракции, составляющий >90%.
Определяли с помощью В1асоге-анализа аффинность к рекомбинантному человеческому склеростину, склеростину макака-крабоеда и мышиному склеростину. Аффинность для склеростина человека характеризовалась значениями на уровне от субнаномолярного до порядка 500 нМ, значениями на уровне примерно 5000 нМ для склеростина макака-крабоеда и 4500 нМ для мышиного склеростина.
Пример 3. Идентификация перспективных РаЬ-фрагментов к человеческому склеростину (РаЬфрагментов-кандидатов), которые ингибируют связывание склеростина с иммобилизованным ВМР-2, с помощью устройства типа ВюУеш™.
Все созданные и очищенные РаЬ-фрагменты тестировали с помощью ВюУепк-анализа в отношении способности ингибировать связывание склеростина с рекомбинантным человеческим ВМР-2. Оценивали два различных по строгости варианта условий (0,1% в сравнении с 1% Твин 20 в буферной системе). Установлено, что 9 из 27 фрагментов обладали способностью ингибировать связывание склеростина с иммобилизованным ВМР-2 при использовании строгого варианта буфера.
Пример 4. Обратимое ингибирование склеростином индуцируемого ВМР-2 производства АЬР в МС3 Т3 -клетках.
Конверсии ^С родительских связывающих агентов и характеризация !§С.
кандидата превращали в формат человеческого !дС1 путем субклонирования в экспрессионном векторе рМ0КРН®_Ь_[дС1 и соответствующих конструкциях для легкой цепи серий векторов рМ0КРН®_Ь_[д соответственно. Экспрессию осуществляли путем кратковременной трансфекции клеток НЕК293 или НКВ11 и полноразмерные иммуноглобулины очищали из супернатанта клеточной культуры. Функциональную активность !дС1 после очистки оценивали с помощью ЕЫ8А по связыванию с иммобилизованным человеческим, мышиным склеростином и склеростином макака-крабоеда.
Оценка ^С с помощью первичного биоанализа.
Все очищенные ЫдС титровали и оценивали с помощью АЬР-анализа. Анализ является надежным при оценке ингибирования ВМР-2 склеростином, но отобранные кандидаты могли не обладать способностью ингибировать склеростин во всех экспериментах (активность варьировалась от анализа к анализу, от планшета к планшету, была обнаружена также высокая вариабельность при оценке взятых в трех повторностях лунок). По этой причине можно определять только порядок активности ^С.
Пример 5. Созревание аффинности отобранных РаЬ-фрагментов к склеростину путем параллельного обмена ЬСИК3- и НСИК2-кассет.
Результаты оценки ^С с помощью АЬР-анализа позволили оценить уровень активности только по порядку величины. На основе таких результатов оценки порядка уровня активности были отобраны 4 РаЬ-фрагмента, как имеющие высокую вероятность того, что для них было характерно созревание аффинности. Все отобранные кандидаты были оптимизированы в виде основных (лидирующих) кандидатов в Б-СИК3 и Н-СИК2.
Для повышения аффинности и биологической активности четырех отобранных фрагментов антител ЬСИК3- и НСИК2-области оптимизировали параллельно с помощью кассетного мутагенеза на основе сайт-направленного мутагенеза (Уппекак и др., 1994), при этом каркасные участки сохраняли постоянными. Перед клонированием предназначенных для созревания библиотек все родительские РаЬфрагменты переносили из экспрессионного вектора рМ0КРН®х9_МН с использованием технологии Су5И15р1ау™ в вектор для созревания рМ0КРН®25 с помощью сайтов рестрикции ХЬаЬЕсоКЬ Этот вектор несет белок фага рШ, слитый на Оконце с остатком цистеина, а также С-концевой цистеин, слитый с Р,-цепью антитела, и в результате позволяет презентовать связанные дисульфидным мостиком соответствующие РаЬ-фрагменты на поверхности фага.
Для создания НСИКЗ-библиотек НСИКЗ-область каждого родительского РаЬ вырезали и заменяли состоящей из 590 пар оснований лишней последовательностью. Эта лишняя ДНК облегчает отделение полос, соответствующих векторам с одним расщеплением, от полос, соответствующих дважды расщепленным векторам, и снижает фоновый уровень обладающих высокой аффинностью родительских
- 47 018756
ЕаЬ в процессе пэннинга созревания. На следующей стадии вырезали лишнюю последовательность из кодирующих ЕаЬ плазмид каждого родительского клона и заменяли высокодиверсифицированной кассетой для созревания НСЭЕ2.
Параллельно ЬСЭК3-область пяти из четырех родительских клонов заменяли диверсифицированной кассетой для созревания ЬСЭК3 без промежуточного клонирования лишнего фрагмента.
Размеры библиотек для созревания составляли от 1х107 до 4х108 клонов при фоновом уровне клонирования ниже 1%, и при этом контроль качества, проведенный путем секвенирования, продемонстрировал хорошее качество каждой библиотеки. Только ЬСЭК3-библиотека родительского клона М0К04520 имела небольшой размер (<106) и содержала ряд неправильных клонов, и поэтому ее не включали в пэннинг созревания.
Для каждой из предназначенных для созревания ЬСЭК3- и НСЭК2-библиотеки получали презентующие антитело фаги и определяли титры фагов с помощью точечного титрования.
Стратегии пэннинга для созревания аффинности.
Антителопрезентующие фаги из следующих предназначенных для созревания библиотек подвергали индивидуально пэннингу и скринингу: лидер 1: М0К04518 (созревание Б-СОЕ3), лидер 1: М0К04518 (созревание Н-СОК2), лидер 2: М0К04520 (созревание Н-СОК2), лидер 3: М0К04532 (созревание Ь0ΌΡ3), лидер 3: М0К04532 (созревание Н-СОК2), лидер 4: М0К04799 (созревание Б-СОЕ3), лидер 4: М0К04799 (созревание Н-СЭЕ2).
Для каждой библиотеки лидеров осуществляли три различные процедуры пэннинга. Для каждой стратегии пэннинга применяли условия различной строгости. Для повышения строгости пэннинга и для отбора по признаку повышенных скоростей диссоциации осуществляли интенсивную отмывку и пэннинг проводили с использованием в качестве конкурента очищенного родительского ЕаЬ-фрагмента или растворимого рекомбинантного склеростина. После пэннинга созревания обогащенные фагмидные пулы субклонировали в экспрессионном векторе рМ0КРН®х9_МН. Собирали примерно 2900 индивидуальных клонов и ЕаЬ-фрагменты экспрессировали путем индукции с помощью ИПТГ.
Оценка уровня аффинности и скрининг в отношении улучшенной аффинности с помощью В1оУег18™-анализа.
Для идентификации обладающих улучшенной аффинностью специфических для склеростина ЕаЬфрагментов в бактериальных лизатах ~2900 индивидуальных клонов разводили и оценивали связывание ЕаЬ с биотинилированным человеческим склеростином, иммобилизованным на сенсибилизированных стрептавидином гранулах. Связывание анализировали с помощью рабочей станции ВюУеиз Аогк51а1ю1'1. Для этих клонов были характерны наиболее сильные сигналы, свидетельствующие об улучшенной аффинности, и поэтому их отбирали для дополнительного анализа с помощью уравновешивающего титрования раствора.
Для этой цели отбирали 176 индивидуальных клонов и предварительно определяли аффинность с помощью уравновешивающего титрования раствора (8ЕТ) с использованием 4 точек, применяя систему ВюУепз. На основе этих данных отбирали 24 клона, характеризующихся наиболее высоким уровнем аффинности. Эти ЕаЬ-фрагменты очищали, получая миллиграммовые количества.
Конечные данные об аффиности получали с помощь 8ЕТ с использованием 8 точек, применяя склеростин человека, мыши и макака-крабоеда.
Оценка оптимизированных ЕаЬ-фрагментов с помощью первичного биоанализа.
Оптимизированные ЕаЬ-фрагменты изучали с помощью клеточного АЬР-анализа. Большинство из них оказались неактивными; а при использовании некоторых ЕаЬ обнаружено вариабельное обратимое ингибирование склеростина. По этой причине отобранные клоны превращали в формат человеческого/мышиного Ι§62;·ι и оценивали с помощью такого же анализа. Однако эти клоны в формате человеческого/мышиного Ι§62;·ι не обладали способностью вызывать полное обратимое ингибирование склеростина и при этом не было достигнуто требуемое, соответствующее критериям, значение ЕС50 (<10 нМ). Для наиболее эффективного зрелого кандидата М0К05177 (Уь получена в результате созревания аффинности из родительского М0К04518) обнаружено при применении ЕаЬ в концентрации 50 нМ или человеческого/мышиного Ι§62;·ι в концентрации 140-467 нМ 75-85%-ное восстановление АЬР-сигнала.
Пример 6. Идентификация антител к склеростину из родительских и оптимизированных ЕаЬ и Ι§6 с помощью нового первичного биоанализа.
На основе новых публикаций (Аи и др., ДВС 2005, Не и др., 1ВС 2005, Веζοοуеη и др., А8ВМК 2005, А1ик1ет и др., ДВС 2005), в которых продемонстрировано, что склеростин оказывает прямое или косвенное воздействие на передачу сигнала \\ηΙ, был разработан новый функциональный биоанализ.
Этот анализ основан на способности склеростина ингибировать опосредуемую \νη(-1 активацию 8ТЕ в НЕК293-клетках.
С помощью этого анализа тестировали все ЕаЬ-фрагменты, идентифицированные в процессе начального скрининга, плюс все ЕаЬ-фрагменты, идентифицировованные при созревании аффинности. Выявлена повышенная аффинность созревших ЕаЬ-фрагментов, что выражалось в повышенной активности и эффективности при оценке с помощью ^ηί-1-анализа.
- 48 018756
Оценка всех родительских ЕаЬ-фрагментов позволила идентифицировать два дополнительных антитела, перспективных в качестве матриц для дальнейшего созревания аффинности. На фиг. 1 представлены данные об активности М0Я05813_IдС2лямбда, одного из наиболее активных антител, идентифицированных с помощью \\п1-1-анализа.
Пример 7. Характеризация родительских ЕаЬ и ЕаЬ с созревшей аффинностью с помощью других биоанализов.
Оценка активности родительских ЕаЬ и ЕаЬ с созревшей аффинностью с помощью анализа минерализации.
Анализ минерализации основан на способности МСЗТЗ-клеток формировать минерализованный матрикс, что свидетельствует об их способности к остеогенной дифференцировке. Сильная минерализация (> 1 мкг отложившегося кальция на лунку (96-луночный формат)) обнаружена через 14 дней при использовании всех изученных концентраций ВМР-2. Добавление склеростина в возрастающих концентрациях индуцировало в зависимости от дозы ингибирование индуцированной ВМР-2 (2,1 нМ) минерализации (Ιϋ50: 120 нМ) (данные не представлены).
На фиг. 2 представлены приведенные в качестве примера данные о минерализации в присутствии М0К0581З_ЕаЬ. Антитело обладало способностью восстанавливать индуцированную ВМР-2 минерализацию максимум до 80% от начального ответа, в то время как ЕаЬ к лизоциму, который применяли в качестве отрицательного контроля, не обладал эффективностью.
Оценка активности родительских ЕаЬ и ЕаЬ с созревшей аффинностью в отношении взаимодействия ЬКР6/склеростин с помощью ΕυδΛ.
Анализ с помощью ЕЬКА взаимодействия ЬКР6/склеростин основан на способности склеростина связываться с ЬКР6. Для дополнительной характеризации полученных ЕаЬ-фрагментов с помощью этого анализа оценивали отобранные ЕаЬ и Ι§0. В присутствии антитела к склеростину фирмы Β&Ό (1000 нг/мл = ~7 нм) связывание склеростина (0,9 нМ) с ЬКР6 ингибировалось на 68% по сравнению с контролем (данные не представлены).
Антитело М0В0581З_[дС2лямбда ингибировало связывание склеростина с ЬВР6 вплоть до 90% при применении в концентрации 90 нМ, в то время как антитело к лизоциму в виде ^С, которое применяли в качестве отрицательного контроля, не оказывало воздействия на связывание склеростина с ЬВР6 (фиг. З).
Оценка активности родительских ЕаЬ и ЕаЬ с созревшей аффинностью с помощью фосфо^таб1анализа.
Фосфо^таб1-анализ (вестерн-блоттинг) основан на способности ВМР-6 индуцировать фосфорилирование δтаб1 в течение 15 мин при оценке на клетках линии МСЗТЗ-Е1. Антитело М0В05З18_[дС2лямбда ингибировало действие склеростина на индуцированное ВМР-6 фосфорилирование δтаб1, что характеризовалось значением ЕС50 115 нМ, и восстанавливало фосфорилирование δтаб1 максимум до 66% относительно индуцированного ВМР-6 фосфорилирования. Применяемое в качестве отрицательного контроля антитело к лизоциму в виде ^С ЦдС С) не обладало никаким действием (фиг. 4).
Пример 8. Воздействие ЬВР4, нового взаимодействующего с δ0δΤ компонента, на активность антитела к δ0δΤ.
За исключением κί-РНК, мишенью которой является ЬВР4, мРНК, вызывающие выключение ЬКР4 не влияли на δΤЕ-активность в отсутствии δ0δΤ. Однако они снижали способность δ0δΤ ингибировать δΤЕ-активность на уровне 10-З0%. Это подтверждено для всех пяти изученных κί-РНК при их индивидуальном применении (фиг. 5А) или при применении в различных комбинациях (данные не представлены). Сверхэкспрессия ЬКР4 снижала значения Ιί.'50 δ0δΤ в 5 и 16 раз соответственно при анализе на НЕК-клетках и при с28а2 кирейорДакй-анализе (фиг. 5Б и В). Это явление оказалось специфическим в том плане, что сверхэкспрессия ЬВР4 не влияла на ΙΟ50 ЭКК1. Выключение ЬВР4 (κί-РНК) снижало ингибирующее действие δ0δΤ в отношении индуцированного \νπΙ-1 δΤЕ, но не снижало ингибирующую активность в отношении ЭКК1 (фиг. 5Г). В свою очередь, присутствие ЬКР4 снижало действие антитела к δ0δΤ, при этом значение ЕС50 М0В0581З_[дС2а повышалось с 17,2 до З0 нМ (фиг. 5Д). Эти данные позволяют предположить, что ЬВР4 облегчает действие δ0δΤ.
Пример 9. Новые антитела с созревшей аффинностью.
Для повышения аффинности и биологической активности двух новых отобранных фрагментов антител на основе биоанализов ЬСОКЗ- и НСОВ2-области оптимизировали параллельно с помощью кассетного мутагенеза на основе сайт-направленного мутагенеза (У1гпекак и др., 1994), при этом каркасные участки сохраняли постоянными. Перед клонированием предназначенных для созревания библиотек все родительские ЕаЬ-фрагменты переносили из экспрессионного вектора рМ0ВРН®х9_МН с использованием технологии СукО1кр1ау™ в вектор для созревания рМ0ВРН®25 с помощью сайтов рестрикции ХЬаЕЕсоВЕ Этот вектор несет белок фага рШ, слитый на Оконце с остатком цистеина, а также Сконцевой цистеин, слитый с Еб-цепью антитела, и в результате позволяет презентовать связанные дисульфидным мостиком соответствующие ЕаЬ-фрагменты на поверхности фага.
- 49 018756
Для создания НСЦК2-библиотек НСЦК2-область каждого родительского РаЬ вырезали и заменяли состоящей из 590 пар оснований лишней последовательностью. Эта лишняя ДНК облегчает отделение полос, соответствующих векторам с одним расщеплением, от полос, соответствующих дважды расщепленным векторам, и снижает фоновый уровень обладающих высокой аффинностью родительских РаЬ в процессе пэннинга созревания. На следующей стадии вырезали лишнюю последовательность из кодирующих РаЬ плазмид каждого родительского клона и заменяли высокодиверсифицированной кассетой для созревания НСЭК2.
Параллельно ЬСОК3-область пяти из четырех родительских клонов заменяли диверсифицированной кассетой для созревания ЬСОК3 без промежуточного клонирования лишнего фрагмента.
Размеры библиотек для созревания составляли от 2х107 до 2х108 клонов при фоновом уровне клонирования ниже 1%, и при этом контроль качества, проведенный путем секвенирования, продемонстрировал хорошее качество каждой библиотеки. Для каждой из предназначенных для созревания ЬСОК3- и НСПК2-библиотеки получали презентующие антитело фаги и определяли титры фагов с помощью точечного титрования.
Стратегии пэннинга для дополнительного созревания аффинности.
Антителопрезентующие фаги из следующих предназначенных для созревания библиотек подвергали индивидуально пэннингу и скринингу: лидер 1: М0К04525 (созревание Ь-СОК3), лидер 1: М0К04525 (созревание Н-СЦК2), лидер 2: М0К04529 (созревание Ь-СОК3), лидер 2: М0К04529 (созревание НСОК2).
Для каждой библиотеки лидера или пула осуществляли три различные процедуры пэннинга, для каждой стратегии пэннинга применяли условия различной строгости. Для повышения строгости пэннинга и для отбора по признаку повышенных скоростей диссоциации осуществляли интенсивную отмывку и пэннинг проводили с использованием в качестве конкурента растворимого рекомбинантного белка склеростина с применением более длительного периода инкубации и периодов отмывки.
После пэннинга обогащенные фагмидные пулы субклонировали в экспрессионном векторе рМ0КРН®х9_МН. Собирали примерно 1600 индивидуальных клонов и РаЬ-фрагменты экспрессировали путем индукции с помощью ИПТГ.
Уровни аффинности для производных обоих родительских РаЬ-фрагментов удовлетворяли принятому для человеческого склеростина критерию (< 100 пМ). Наибольший уровень перекрестной реактивности производных обоих родительских РаЬ-фрагментов со склеростином макака-крабоеда и мышиным склеростином (< 500 пМ) удовлетворял принятым критериям. При использовании М0К04525 получено большее количество клонов, обладающих более высокой аффинностью к склеростину всех трех видов.
Пример 10. Характеризация антител к склеростину в опытах ш νί\Ό.
Восьмимесячным самкам мышей линии 0Р1ЛС (п=16 особей/группу, фирма СНаг1ек Кгуег, Франция) вводили внутривенно дважды в неделю антитело к склеростину М0К05813 (24,5 мг/кг, т1дС2а) или применяемое в качестве контроля изотипа антитело (анти-РС-т1дС2а). Контрольным группам животных вводили ежедневно подкожно 100 мкг/кг РТН (1-34) или наполнитель (ЗФР). Обработку всех животных осуществляли в течение 2,5 недель. Половину животных (п = 8 /группу) умерщвляли в этот момент времени для проведения гистоморфометрического анализа. Этим животным вводили флуорохромные маркеры за 10 и 3 дня до осуществления аутопсии с целью гистоморфометрического анализа динамики образования костной ткани. Обработку остальных животных (п = 8 особей/группу) проводили вплоть до 5 недель.
У животных оценивали изменения массы, плотности и геометрического строения кости. Проведенные с помощью периферической количественной компьютерной томографии (рОСТ) опыты ш νί\Ό продемонстрировали, что М0К05177 обладало сильным анаболическим действием в отношении проксимальной области большеберцовой кости престарелых мышей, повышая содержание минерала (фиг. 6) и плотность костной ткани (фиг. 7). Анаболическая активность в отношении кости имеет место как в кортикальном слое кости (фиг. 8), так и в компартменте кости, представляющем собой губчатое вещество кости (фиг. 9). Эти данные позволяют предположить, что обнаруженное ингибирующее действие М0К05813 на активность склеростина, продемонстрированное в репортерном анализе передачи сигнала \\п! с использованием неостеобластных клеток, транслируется в индукцию ответов в виде формирования кости посредством ингибирования склеростина ш νί\Ό. Повышение анаболического ответа кости у мышей сопоставимо с анаболическим действием на кость высокой дозы НРТН (1-34).
МкгоСТ-анализ продемонстрировал увеличение объема губчатой кости (фиг. 9), связанное в основном с утолщением структур губчатой кости, что согласуется с анаболическим действием в отношении кости (фиг. 10).
Минеральная плотность костной ткани повышалась также у животных, которых обрабатывали в течение периода времени, составляющего вплоть до 5 недель (фиг. 11). Минеральная плотность костной ткани, которую оценивали ех νί\Ό с помощью ВЕХА, увеличивалась в добавочном скелете (большеберцовая кость, бедренная кость) и осевом скелете (поясничный позвонок) (фиг. 12-14). Это действие было сопоставимо с обнаруженным в группе животных, которых применяли в качестве положительного кон
- 50 018756 троля, ежедневно подвергавшихся обработке 100 мкг/кг БРТН (1-34).
Гистоморфометрические анализы динамики формирования кости, основанные на применении в качестве маркера флуорохрома, продемонстрировали, что масса костной ткани возрастала в результате существенного повышения скорости формирования костной ткани в добавочном скелете (фиг. 15) и осевом скелете (фиг. 18). Это действие было сопоставимо с обнаруженным при применении высокой дозы РТН (1-34). Повышение скорости формирования костной ткани было связано также как с повышением скорости аппозиции (фиг. 16), так и с минерализацией поверхности (фиг. 17). Репарация кости не возрастала в результате обработки, что продемонстрировано при оценке поверхности остеокластов (фиг. 19).
Пример 11. Скрининг антител, которые перекрестно блокируют связывающие склеростин антитела, предлагаемые в настоящем изобретении.
Β^асο^е-анализ перекрестного блокирования.
Ниже описан в целом приемлемый Β^асο^е-анализ, предназначенный для определения того, обладает ли антитело или другой связывающий агент способностью перекрестно блокировать антитело, предлагаемое в изобретении, или обладают ли антитела, предлагаемые в изобретении, способностью осуществлять перекрестную блокаду. Очевидно, что этот анализ можно применять с использованием любых связывающих склеростин агентов, представленных в настоящем описании.
Устройство для Β^асο^е-анализа (например, ΒΙΑ^ιό 3000) эксплуатировали согласно рекомендациям производителя.
Склеростин можно сшивать, например, с СМ5-чипом ΒίίκοΐΌ с помощью общепринятого аминового сочетания, например аминового сочетания Ε^С-NН§, с целью создания сенсибилизированной склеростином поверхности. Для получения поддающихся измерению уровней связывания, как правило, 200-800 резонансных единиц склеростина можно сшивать с чипом (такое количество позволяет получать поддающиеся измерению уровни связывания и в то же время достигается при применяемых концентрациях тестируемого реагента).
Альтернативным вариантом присоединения склеростина к В^^ге-чипу является применение меченой версии склеростина, например меченного на №конце или на С-конце с помощью Н18 склеростина. В этом формате антитело к НЬ можно сшивать с Β^асο^е-чипом, а затем меченный с помощь Н18 склеростин следует пропускать через поверхность чипа, где он захватывается антителом к НЬ.
Два антитела, способность которых к перекрестному блокированию друг друга подлежит оценке, для создания тестируемой смеси смешивали, используя стехиометрическое количество сайтов связывания, например, в молярном соотношении 1:1, в приемлемом буфере. Применяемый буфер, как правило, представляет собой буфер, который обычно используют в химии белков, такой, например, как ЗФР (136 мМ №С1, 2,7 мМ ΚΟ, 10 мМ №2НР04, 1,76 мМ ΚН2РΟ4, рН 7,4). Для расчета концентраций в пересчете на сайты связывания принимали, что молекулярная масса антитела представляет собой общую молекулярную массу антитела, деленную на количество сайтов связывания мишени (т.е. склеростина) в указанном антителе.
Концентрация каждого антитела в тестируемой смеси должна быть достаточно высокой для того, чтобы гарантировать насыщение сайтов связывания для антитела на молекулах склеростина, которые связаны с В^то ге-чипом. Антитела в смеси присутствовали в одинаковой молярной концентрации (в пересчете на связывание) и указанная концентрация, как правило, находилась в диапазоне 1,0-1,5 мМ (в пересчете на сайты связывания).
Приготавливали также индивидуальные растворы, содержащие индивидуальные различные антитела. Применяемый для приготовления этих индивидуальных растворов буфер представлял собой такой же буфер, взятый в такой же концентрации, который применяли для приготовления тестируемой смеси.
Тестируемую смесь пропускали через сенсибилизированный склеростином В^^ге-чип и регистрировали связывание. Затем связанные антитела удаляли обработкой чипа, например, кислотой, например 30 мМ НС1, в течение примерно 1 мин. Важно, чтобы молекулы склеростина, связанные с чипом, не повреждались.
Затем раствор, содержащий только первое антитело, пропускали через сенсибилизированную склеростином поверхность и регистрировали связывание. После чего чип обрабатывали для полного удаления связанного антитела, не повреждая связанный с чипом склеростин, например, с помощью описанной выше обработки кислотой.
Затем раствор, содержащий только второе антитело, пропускали через сенсибилизированную склеростином поверхность и регистрировали уровень связывания.
Максимальное теоретическое связывание можно определять как сумму уровня связывания склеростина каждым антителом по отдельности. Затем эту величину сравнивали с фактическим связыванием, полученным при применении смеси антител. Если фактическое связывание оказывалось ниже, чем теоретическое связывание, то это свидетельствует о том, что два антитела перекрестно блокировали друг друга.
Анализ перекрестного блокирования с помощью ΕΌΙδΑ.
Перекрестное блокирование антитела к склеростину или другого связывающего склеростин агента можно выявлять также с помощью ΕΕΙδΑ-анализа.
- 51 018756
Общий принцип ЕЫ8А-анализа заключался в том, что сенсибилизировали с помощью антитела к склеростину лунки планшета для ЕЫ8А. Затем в раствор добавляли избыточное количество второго потенциально обладающего способностью к перекрестному блокированию антитела к склеростину (т.е. не связанное с планшетом для ЕЫ8А). Затем в лунки добавляли ограниченное количество склеростина.
Антитело, которое применяли для сенсибилизации лунок, и находящееся в растворе антитело могут конкурировать за связывание с ограниченным количеством молекул склеростина. Затем планшет отмывали для удаления склеростина, который не связался с применяемым для сенсибилизации антителом, а также для удаления второго находящегося в фазе раствора антитела и любых комплексов, образовавшихся между вторым находящимся в фазе раствора антителом и склеростином. Затем количество связанного склеростина оценивали с использованием соответствующего предназначенного для выявления склеростина реагента. Находящееся в растворе антитело, которое обладает способностью перекрестно блокировать применяемое для сенсибилизации антитело, должно вызывать снижение количества молекул склеростина, которое может связываться с применяемым для сенсибилизации антителом, относительно количества молекул склеростина, которое применяемое для сенсибилизации антитело может связывать в отсутствие второго находящегося в фазе раствора антитела.
Этот анализ более подробно описан также ниже на примере двух антител, обозначенных как Ат-Х и Ат-Υ. В случае, когда Ат-Х выбрано в качестве иммобилизованного антитела, им сенсибилизировали лунки планшета для ЕЫ8А, после чего планшет блокировали приемлемым блокирующим раствором для минимизации неспецифического связывания реагентов, которые добавляли после этого. Избыточное количество Ат-Υ после этого добавляли в планшет для ЕЫ8А так, чтобы количество молей в пересчете на сайты связывания склеростина антитела Ат-Υ на лунку по меньшей мере в 10 раз превышало количество молей в пересчете на сайты связывания склеростина антитела Ат-Х, применяемого для сенсибилизации планшета для ЕЫ8Л. Затем добавляли склеростин так, чтобы количество молей склеростина, добавленное в лунку, было по меньшей мере в 25 раз ниже количества молей в пересчете на сайты связывания склеростина антитела Ат-Х, применяемого для сенсибилизации каждой лунки. После приемлемого периода инкубации планшет для ЕЫ8А отмывали и добавляли реагент для выявления склеростина для измерения количества склеростина, специфически связанного с применяемым для сенсибилизации антителом к склеростину (в данном случае Ат-Х). В качестве фонового сигнала в этом анализе определяли сигнал, полученный в лунках с применяемым для сенсибилизации антителом (в данном случае Ат-Х), вторым находящимся в фазе раствора антителом (в данном случае Ат-Υ), только буфером для склеростина (т.е. без склеростина) и реагентами для выявления склеростина. В качестве сигнала, представляющего собой положительный контроль, в этом анализе определяли сигнал, полученный в лунках с применяемым для сенсибилизации антителом (в данном случае Ат-Х), только буфером для второго находящегося в фазе раствора антитела (т.е. без второго находящегося в фазе раствора антитела), склеростином и реагентами для выявления склеростина. Необходимо осуществлять ЕЫ8А-анализ так, чтобы сигнал, представляющий собой положительный контроль, превышал по меньшей мере в 6 раз фоновый сигнал.
Для того чтобы избежать любых артефактов (например, существенно различающихся аффинностей Ат-Х и Ат-Υ к склеростину), являющихся результатом того, какое из антител выбрано в качестве применяемого для сенсибилизации антитела и какое в качестве второго (конкурирующего) антитела, анализ перекрестного блокирования необходимо осуществлять в двух форматах: 1) формат, когда Ат-Х представляет собой антитело, применяемое для сенсибилизации планшета для ЕЫ8А, и Ат-Υ представляет собой конкурирующее антитело, которое находится в растворе, и 2) второй формат, когда Ат-Υ представляет собой антитело, применяемое для сенсибилизации планшета для ЕЫ8А, и Ат-Х представляет собой конкурирующее антитело, которое находится в растворе.
Пример 12. Применение ЕЫ8А для выявления воздействия М0Я05813_IдС2лямбда на связывание 808Т с ЬКР6.
Оценка взаимодействия ЬКР6/склеростин с помощью ЕЫ8А.
Необработанные 96-луночные титрационные микропланшеты сенсибилизировали 100 мкл/лунку ЬКР6/Рс (1 мкг/мл, фирма Κ&Ό 8ук!етк, каталожный № 1505-ЬК), разведенным в ЗФР. В качестве контроля неспецифического связывания (N88) несколько лунок заполняли 100 мкл/лунку ЗФР. Планшеты закрывали пластиковой пленкой и инкубировали в течение ночи при КТ. После сенсибилизации планшеты отмывали 3 раза 200 мкл/лунку 0,05% Твин 20 (фирма Р1ика, каталожный № 93773) в ЗФР и лунки блокировали в течение 1 ч при 37°С, добавляя 300 мкл/лунку блокирующего буфера 8ирегВ1оск (фирма Р1егсе, каталожный № 37535) в ТВ8. После инкубации блокирующий раствор удаляли и добавляли 100 мкл/лунку склеростина (из Е. сой, фирма №уагЦк; 1-1000 нг/мл), разведенного в 1% БСА в ЗФР. Планшеты инкубировали в течение 2 ч при КТ перед 3-кратной отмывкой с использованием 200 мкл/лунку 0,05% Твин 20 в ЗФР. После этого добавляли из расчета 100 мкл/лунку антитела к склеростину (1 мкг/мл), разведенного в 1% БСА в ЗФР, и планшеты инкубировали в течение 2 ч при КТ перед 3-кратной отмывкой с использованием 200 мкл/лунку 0,05% Твин 20 в ЗФР. И, наконец, добавляли 100 мкл/лунку конъюгированного с АЬР антикозьего Ат в виде ЦС (1:5000; фирма 81дта, каталожный № А-7888), разведенного в 1% БСА (фирма 81дта, каталожный № А-7888) в ЗФР, в течение 1 ч при КТ и затем планшеты отмывали трижды с использованием 200 мкл/лунку 0,05% Твин 20 в ЗФР. Для выявления АЬР в
- 52 018756 планшеты добавляли в течение 90 мин 100 мкл/лунку раствора субстрата для ЛЬР (фирма 81дта, каталожный № 80942) (1 таблетка на 5 мл буфера для субстрата на основе диэтаноламина, 1х; фирма Р1егсе, каталожный № 34064) и определяли оптическую плотность при 405 нм.
Оценка активности в отношении взаимодействия ЬКР6/склеростин родительского антитела и РаЬфрагментов с созревшей аффинностью с помощью ЕЫ8А.
Оценка взаимодействия ЬКР6/склеростин с помощью ЕЫ8Л основана на способности склеростина связываться с ЬКР6. Для дополнительной характеризации полученных РаЬ-фрагментов отобранные РаЬфрагменты и ЦС оценивали с помощью указанного анализа. В присутствии антитела к склеростину фирмы Κ&Ό (1000 нг/мл = ~7нМ), связывание склеростина (0,9 нМ) с ЬКР6 ингибировалось на 68% по сравнению с контролем (данные не представлены). Антитело М0К.05813_[дС2лямбда ингибировало связывание склеростина с ЬКР6 на уровне вплоть до 90% при применении в концентрации 90 нМ, в то время как антитело к лизоциму в виде ЦС, которое применяли в качестве отрицательного контроля, не оказывало воздействие на связывание склеростина с ЬКР6 (фиг. 20).
Пример 13. Комбинированная обработка с использованием М0К05813.
М0К05813 + золендроновая кислота.
Восьмимесячных самок мышей линии 0Р1ДС (п=10/группу, фирма СЬаг1е8 К1уег, Франция) подвергали овариэктомии для индукции потери костной ткани в результате депривации эстрогена или оставляли в интактном состоянии. Животным вводили дважды в неделю внутривенно антитело к склеростину М0К05813 (24 мг/кг, Ь/т1дС2а) или контрольное антитело (обработанные анти-РС-Ь/т1дС2а, интактные и 0УХ (овареэктомированные) контрольные группы). Животным в дополнительных группах вводили либо однократно только золендроновую кислоту (100 мкг/кг), либо золендроновую кислоту в сочетании с антителом к склеростину М0К05813. Обработку антителом осуществляли в течение 3,5 недель (7 обработок).
Массу и геометрическое строение большеберцовой кости у животных оценивали до овариэктомии с помощью периферической количественной компьютерной томографии (рОСТ). Животных распределяли равномерно на группы на основе веса тела и общей минеральной плотности большеберцовой кости. Изменения минеральной плотности, массы и геометрического строения кости оценивали в конце периода обработки.
Результаты выражали в виде средних значений +/- СКО. Статистический анализ осуществляли с помощью К81 (серии 1999 г. для \Утбо\У5, фирма Поташ МапиГасШппд Согр., США). Данные подвергали одностороннему дисперсионному анализу (ΑN0VΑ). Однородность дисперсий оценивали с помощью Р-критерия Левена, а различие между группами оценивали с помощью критерия Дуннета с поправкой Бонферрони. Оценивали достоверность различий между обработанными группами и обработанной контрольным антителом 0УХ-группой (р<0,05*, р<0,01**).
Индуцируемую овариэктомией потерю костной ткани можно блокировать обработкой антителом у престарелых мышей (фиг. 21). Когда антитело применяли в сочетании с однократной внутривенной инъекцией бисфосфоната золендроновой кислоты, потеря костной ткани блокировалась и индуцировалось наращивание кости, о чем свидетельствовало увеличение общего содержания минерала в костной ткани (фиг. 21А) и плотности (фиг. 21Б), а также увеличение толщины кортикального слоя кости (фиг. 21В) и минеральной плотности губчатого вещества кости (фиг. 21Г).
М0К05813 + предварительная обработка алендронатом.
4,5-месячным самкам мышей линии 0Р1ДС (п=10/группу, фирма СЬаг1е8 К|уег, Франция) вводили дважды в неделю внутривенно антитело к склеростину М0К05813 (10 мг/кг, Ь/т1дС2а) или контрольное антитело (обработанные анти-РС-т1дС2а, интактные и 0УХ контрольные группы). Животных из дополнительных групп предварительно обрабатывали в течение 7 недель алендронатом (4 мкг/кг/день; 5 дней/неделю) до введения либо контрольного антитела, либо антитела к склеростину М0К05813. Обработку антителами осуществляли в течение 3,5 недель (7 обработок).
Массу и геометрическое строение большеберцовой кости у животных оценивали до начала обработки антителами с помощью периферической количественной компьютерной томографии (рОСТ). Животных распределяли равномерно на группы на основе веса тела и общей минеральной плотности большеберцовой кости. Изменения минеральной плотности, массы и геометрического строения кости оценивали в конце периода обработки.
Результаты выражали в виде средних значений +/- СКО. Статистический анализ осуществляли с помощью К81 (серии 1999 г. для \Утбо\\'5, фирма Потаю МапиГасШппд Согр., США). Данные подвергали одностороннему дисперсионному анализу (АЫ0УА). Однородность дисперсий оценивали с помощью Р-критерия Левена, а различие между группами оценивали с помощью критерия Дуннета с поправкой Бонферрони. Оценивали достоверность различий между предварительно обработанными алендронатом группами и группами, которые не подвергали предварительной обработке (р<0,05*, р<0,01**).
Длительная обработка бисфосфонатом алендроната не оказывала отрицательного воздействия на анаболическую роль в отношении кости антитела к склеростину М0К05813, о чем свидетельствовало увеличение общего содержания минерала в костной ткани (фиг. 22А) и плотности (фиг. 22Б), а также
- 53 018756 увеличение толщины кортикального слоя кости (фиг. 22В) и минеральной плотности губчатого вещества кости (фиг. 22Г). Благодаря персистентному антирезорбтивному действию бисфосфоната, продолжающемуся после периода введения, обнаружено увеличение общего содержания минерала в костной ткани (фиг. 22А) и толщины кортикального слоя кости (фиг. 22В).
М0К05813 + ΌΚΚ1 или ЬРТЫ.
Шестимесячным самкам бестимусных мышей (п=8/группу) вводили дважды в неделю внутривенно наполнитель, антитело к склеростину М0К05813 (10, 20 и 40 мг/кг, Ι§02), антитело к ΌΚΚ1 (10 мг/кг, ΙβΟΙ), ИРТЫ (1-34) (100 мкг/кг) или их комбинации. Обработку антителами осуществляли в течение 4 недель (8 обработок).
Массу и геометрическое строение большеберцовой кости у животных оценивали до начала обработки антителами с помощью периферической количественной компьютерной томографии (рОСТ). Животных распределяли равномерно на группы на основе веса тела и общей минеральной плотности большеберцовой кости. Изменения минеральной плотности, массы и геометрического строения кости оценивали в конце периода обработки.
Результаты выражали в виде средних значений +/- СКО. Статистический анализ осуществляли с помощью К81 (серии 1999 г. для ΧνίιΠολνδ, фирма Οοιηηίη Μаηиίасΐи^^ηд Согр., США). Данные подвергали одностороннему дисперсионному анализу (ЛН0УА). Однородность дисперсий оценивали с помощью Е-критерия Левена, а различие между группами оценивали с помощью критерия Дуннета с поправкой Бонферрони. Оценивали достоверность различий между обработанными антителами группами и группой, обработанной наполнителем (р<0,05*, р<0,01**).
Анаболическое воздействие на кость антитела к склеростину М0К05813 повышалось с увеличением дозы (фиг. 23). Совместная обработка с антителом к ΌΚΚ1 приводила к более выраженному увеличению общего содержания минерала в костной ткани (фиг. 23А) и плотности (фиг. 23Б) и толщине кортикального слоя кости (фиг. 23В), а также к синергетическому увеличению минеральной плотности губчатого вещества кости (фиг. 23Г). Совместная обработка с НРТЧ (1-34) приводила к синергетическому увеличению всех оцениваемых параметров (фиг. 23А-Г).
Ссылки.
Аνз^аη-Κ^еΐсЬте^ О., Шией Л.1, Сотрагай'е дегетк апа1уз1з οί Не ещЙ-тетЬегей ппд сузйпе 1<ηοΙ^ηΐηίηίηβ Ьοηе тο^рйοдеηеΐ^с ргокш айадοшзΐз, Μοί Еп^сйшЕ, 18(1), 2004, с. 1-12.
Аи8иЬе1 Е.М., Вгей К., Κίη§8ΐοη К.Е., Μοο^е Ό.Ό., 8е1йтап БС., 8ιιιί11ι БА., 8ΐπ.ι1ι1 К., Синей РгоЮге1з ίη Μοίесиίа^ Вккду, изд-во ν^5, №\ν ΥοιΈ США, 1998.
Βаίетаη8 V., ЕЬейпд М., Ра!е1 К, Vаη Ηυί Е., 01δοη Р., Экз/ед! М., Басха С., νιρίδ V., Vаη Иеп Епйе 1., '№Шет8 Р., Раез-А1уез А.Е., Ηίίί 8., Виегю М., Катοз Е.Б, Тасгей Р., Э|ккегз Е.С., 81га1ак1з С., Бтйра1йпет К., Уюкегу В., Еοе^ηζίе^ Ό., Vаη Ηυί V., ^стазей Ьοηе йепзйу ίη зс1е^οзΐеοз^з йие ΐο 1Не йеПскпсу οί а ηονеί зесге1ей ргокт (808Т), Ηιιιη Μοί Сенек, 10(5), 2001, с. 537-543.
Βаίетаη8 V., Ра!е1 К, ЕЬейпд М., Vаη Ηυί Е., νιρίδ V., Бас/а С., Экз/ед! М., Э|ккегз Е.С., Ш1йет1пд Р., V^11етз Р.Б, УегНец БВ., БтйрашШет К., Уккегу В., Еοе^ηζίе^ Ό., Vаη Ηυί V., Iйеηΐ^П^саί^οη οί а 52 кЬ йеίеί^οη йονηзΐ^еат οί 1Не 808Т депе ίη райейз \\ίΐ1ι уап Висйет й1зеазе. ί. Мей Сене, 39(2), 2002, с. 91-97.
Βπ.ιη1<ο\ν М.Е., Сагйпег БС., Vаη №зз ί., Раерег В^., Κονасеν^сй В.К., Рго11 8., 8Щйег БЕ., Ζ1ιηο Б., 8аЬο Р.Б, Ей Υ., Айзсй К.8., СШей Б., Οοί^Γΐ Т., Тасгей Р., Са1аз Ό., Штерта Η., Ве1дйкп Р., Ми111дап ί., Βοηе йузр1аз1а зс1е^οзΐеοз^з гезиИз Ггот ίοδδ οί Ше 808Т депе ргойпсЕ а ηονеί сузйпе ^οΐ^οηΠώί^ ргаΐβίη, Ат 1. Ηιιιιι Сепе!, 68(3), 2001, с. 577-589.
СНеп В.Р., Ηηί Т., Еxр^езз^οη уесЮгз ίοτ зГГ^п11у ри^^ί^саί^οη апй гайк1аЬейпд οί р^οΐе^π8 изтд Езсйегкйа той аз Ηοβΐ, Сеге, 139, 1994, с. 73-75.
СНеп Υ., V^езтаηη С., Еий С., Б1 В., Сйг1з11пдег О;., МсКау Р., йе Соз А.М., Боттам ШВ., 8е1есίίοη апй апа1уз1з οί ап οрί^т^ζей айЕУЕСЕ ηηΐίόοά\·: сгуз!а1 зйийиге οί ап а£йй1у-таШгей ЕаЬ ίη сстр1ех \\ί11ι ап11деп, 1. Μο1. Вю1., 293, 1999, с. 865-881.
Сагйгег БС., уап Βеζοο^^еη К.Б., Мегмз В., Штйу КА., Ботлк С^., Штепта Η., Ве1дйкп Р., Рарарοи1οз 8.Е., Βοηе ттега1 йеηз^ιу ίη зс1е^οзΐеοз^з; айейей тйМйиа1з апй деге сатегз, ί. С1т Еп^сн^ Ме!аЬ, 90(12), 2005, с. 6392-6395.
Ηаеηе1 С., 8а1/дег М., Иейа Ииса!а Ό., Οзΐеηйο^р К. и Вгоскз В., С’йга1еп/а1кп οί Ηί§1ι АПйй1у Ай1^Шез Ьу Е1есί^οсйет^1ит^ηезсеηсе-Βазей Ес.|шНЬпит Иракц Апа1 Втсйет, 339(1), 2005, с. 182-184.
Ке11ег Η., Кпе1ззе1 М., 808Т 1з а 1агде1 депе ίοτ РТЧ ίη Ьοηе, Βοηе, 37(2), 2005, с. 148-158.
Кпарр1к А., Се Б., ^геддет А., Раск Р., Е1зсйет М., Vе11пйοίе^ С., Щезз А., Vο11е ί., Р1иск1йип А. и Уйпеказ В., Еи11у зуп1Не11с йитаηсοтЬ^ηаΐο^^а1 πηΐιΕοάν йЬгагкз ^иСАк®) Ьазей οη ц-юйики сοη8еηзиз апй СИКз ^аηйοт^ζей \νί11ι ΐ^^ηис1еοΐ^йез, ί. Μο1 Вк1., 296, 2000, с. 57-86.
КгеЬз В., КаисйепЬетдег К., КейТей 8., ΕοΐΚ С., Тезаг М., Т1ютаззеп Е., Саο М., Эге1ег Т., Е1зсйет Ό., ^зз А., Шде Б., Кпарр1к А., Магде! М., Раск Р., Мепд Х.р., 8сЫет К., 8οЫетайη Р., V^ηΐе^ 1., Vο11е ί. и Кге1хзсНтаг Т., Шдйййгоидйрй депега1кп апй епдтееппд οί ^есοтЬ^πаηΐ Нитап ай^^ез, ί. Iттиηο1 Мейюйз, 254, 2001. с. 67-84.
Б1 X., Ζ1κ·ιη§ Υ., Капд Η., Бш V., Бш Р., Ζ1κ·ιη§ 1., Чатз 8.Е., Vи Ό., 8с1егозйп Ьтйз ΐο БКР5/6 апй
- 54 018756 айадошхез сапошса1 тей з1дпа11пд. I. Вю1. Сйет., 20, 280(20), 2005, с. 19883-19887.
Ьойтпд С, №уе1 тейобз Гог б1зр1аутд (ро1у)рерйбез/рго!е1И8 оп Ыайепорйаде райю1ез У1а б1зи1йбе Ыопбз. УО 01/05950, 2001.
Ьоо!з С.С., Кпе1ззе1 М., Ке11ег Н., Варйз! М., Сйапд Т, Со11ейе КМ., Оусйагепко Ό., Р1а)/ег-Рпск I., ВиЫт Е.М., Сепотю бе1ейоп оГ а 1опд-гапде Ыопе епйапсег иизгедикИез зс1егозййп Уап Висйет б1зеазе. Сепоте Вез, 15(7), 2005, с. 928-935.
Боте КМ., НоШдег Р., Ут1ег С., М1т1ск1пд зотайс йурегтйайоп: аГйпйу та!игайоп оГ апйЫоб1ез б1зр1ауеб оп ЫаЫепорйаде изтд а Ыас(ег1а1 тййог зйат, к Мо1. Вю1., 260, 1996, с. 359-368.
ВаисйепЫегдег В., Вогдез Е., Тйотаззеп-Уо1Г Е., Вот Е., Абаг В., УатуУ., Ма1ка М., Сйитакоу I., Ко1хег 8., ВезгШхку Ό., Кпарр1к А., ВейГей 8., Ргазз1ег к, 1игу К., Уа1бйегг Ό., Ваиег 8., Кге1хзс11таг Т., Уауоп А. и Во!йе С., Нитап сотЫта1опа1 ЕаЫ ЫЫгагу у1е1бтд зресШс апб Гипсйопа1 апйЫоб1ез адатз! Йе йитап йЫгоЫ1аз! дготей ГасЮг гесерйг 3, I. Вю1. Сйет., 278(40), 2003, с. 38194-38205.
8етепоу М.У., Не X., ЬВР5 тйайопз йпкеб !о Ыдй Ыопе тазз б1зеазез саизе гебисеб ЬВР5 Ытбтд апб ЫЫЫЮоп Ыу 8О8Т, I. Вю1. Сйет., 19 октября 2006 г.
уап Вехооцеп В.Ь., 8уепззоп кР. ЕеГйпд Ό., УЧззег А., уап бег Ногз! С., Кагрейеп М., Циах Р.Н., Упе11пд Н., Рарарои1оз 8.Е., Теп Эцке Р., Ьотей С.У., тей Ыи! по! ВМР 81дпа1тд 1з Шуойеб т Йе Iпй^Ыйо^у Асйоп оГ 8с1егоз!шт оп ВМР-8йти1а!еб Вопе Еогтайоп, 2006.
Уйпеказ В., Се Ь., Р1иск!йип А., 8сйпе1бег К.С., Уе11пйоГег С., Могопеу 8.Е., Тппис1еойбе рйозрйогат1бйез: 1беа1 геадейз Гог !йе зуййез1з оГ т1хеб ойдопис1еойбез Гог гапбот тйадепез1з, Шс1е1с Лабз Вез., 22(25), 1994, с. 5600-5607.
Утк1ег ΌΌ., 8ййег1апб М.К., Сеодйедап кС., Уи С., Науез Т., 8койег кЕ., 8йрек!ог Ό., .Топаз М., Коуасеуйй В.В., 8йеЫтд-Натр!оп К., Арр1еЫу М., к Вопе Мтег Вез, Вгипкоте М.Е., ЬаЙат кА., Оз!еосу!е сойго1 оГ Ыопе ГогтаНоп у1а зскгозйшп, а поуе1 ВМР айадошз!, 2003, к Вопе Мтег Вез, 10 октября 2006 г.
ЕМВО I. 22(23):6267-6376. Уйк1ег ΌΌ., 8ййег1апб М.8., О)а1а Е., Тигсой Е., Сеодйедап кС., 8йрек!ог Ό., 8койег кЕ., Уи С., ЬаЙат кА., 8с1егоз11п1п ЫЫЫйоп оГ тей-3а-тбисеб С3Н10Т1/2 се11 бйГегепйайоп 1з тбйес! апб теб1а!еб Ыу Ыопе тогрйодепейс рго!етз, I. Вю1. Сйет., 28, 280(4), 2005, с. 2498-24502.

Claims (25)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые связывают полипептид склеростина, содержащие:
    (а) вариабельную область тяжелой цепи СЭВк включающую аминокислотную последовательность, которая состоит из 8ЕЦ Ю NО: 4;
    (Ы) вариабельную область тяжелой цепи СОВ2, включающую аминокислотную последовательность, которая состоит из 8ЕЦ Ю NО: 15;
    (с) вариабельную область тяжелой цепи СОВ3, включающую аминокислотную последовательность, которая состоит из 8ЕЦ Ю NО: 26;
    (б) вариабельную область легкой цепи СЭВк включающую аминокислотную последовательность, которая состоит из 8ЕЦ Ю NО: 37;
    (е) вариабельную область легкой цепи СОВ2, включающую аминокислотную последовательность, которая состоит из 8ЕЦ Ю NО: 48; и (Г) вариабельную область легкой цепи СОВ3, включающую аминокислотную последовательность, которая состоит из 8ЕЦ Ю NО: 59.
  2. 2. Антитело или антигенсвязывающий участок по п.1, отличающиеся тем, что:
    а) связывают полипептид склеростина с К менее 1 нМ;
    Ы) блокируют ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа передачи сигнала тей;
    с) блокируют ингибирующее действие склеростина при оценке с помощью клеточного анализа минерализации;
    б) ингибируют взаимодействие ЬВР6/склеростин при оценке с помощью анализа ингибирования в растворе или
    е) блокируют ингибирующее действие склеростина на индуцируемое ВМР6 фосфорилирование 8таб1 при оценке с помощью клеточного функционального анализа.
  3. 3. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из предшествующих пунктов, где антитело или его антигенсвязывающий участок имеют ^50:
    а) менее 100 нМ при оценке с помощью клеточного анализа передачи сигнала теп! в клеточных линиях НЕК293 в присутствии склеростина;
    Ы) менее 500 нМ при оценке с помощью анализа индуцируемой ВМР2 минерализации в клетках МС3Т3 в присутствии склеростина;
    с) менее 10 нМ при оценке взаимодействия ЬВР6/склеростин с помощью ЕЫ8А или
    б) менее 500 нМ при оценке с помощью анализа индуцируемого ВМР6 фофорилирования 8таб1 в
    - 55 018756 клеточной линии МС3Т3-Е1 в присутствии склеростина.
  4. 4. Антитело или его антигенсвязывающий участок по одному из предыдущих пунктов, которые содержат:
    a) аминокислотную последовательность Ун полипептида, которая идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕО ГО N0: 70; или
    b) аминокислотную последовательность Уъ полипептида, которая идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 81.
  5. 5. Антитело или его антигенсвязывающий участок по одному из предыдущих пунктов, которые содержат:
    a) аминокислотную последовательность Уъ полипептида, которая идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 81; и
    b) аминокислотную последовательность Ун полипептида, которая идентична по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 70.
  6. 6. Антитело или его антигенсвязывающий участок по одному из предыдущих пунктов, которые содержат аминокислотную последовательность Уъ полипептида, включающую аминокислотную последовательность, которая представлена в 8Е0 ГО N0: 81, и аминокислотную последовательность Ун полипептида, включающую аминокислотную последовательность, которая представлена в 8Е0 ГО N0: 70.
  7. 7. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из предыдущих пунктов, которые содержат полноразмерную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, идентичную по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 114.
  8. 8. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из предшествующих пунктов, которые содержат полноразмерную аминокислотную последовательность легкой цепи, идентичную по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 125.
  9. 9. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.7 или 8, содержащие:
    a) полноразмерную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, идентичную по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 114; и
    b) полноразмерную аминокислотную последовательность легкой цепи, идентичную по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 125.
  10. 10. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из предшествующих пунктов, содержащие полноразмерную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную в 8Е0 ГО N0: 114, и полноразмерную аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную в 8ЕО ГО N0: 125.
  11. 11. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из предшествующих пунктов, где указанное антитело является человеческим или гуманизированным антителом.
  12. 12. Антитело по п.11, которое является IдΜ, ЦЕ или ЦС изотипом.
  13. 13. Антитело по п.12, которое является ЦС1 или ЦС2 изотипом.
  14. 14. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий участок по одному из пп.1-13 в сочетании с одним или несколькими фармацевтическими приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями.
  15. 15. Фармацевтическая композиция по п.14, дополнительно содержащая другие действующие вещества.
  16. 16. Выделенная полинуклеотидная последовательность, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий участок по одному из пп.1-13.
  17. 17. Клонирующий или экспрессионный вектор, содержащий одну или несколько полинуклеотидных последовательностей по п.16.
  18. 18. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая один или несколько клонирующих или экспрессионных векторов по п.17.
  19. 19. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего участка, заключающийся в том, что:
    a) экспрессируют антитело или его антигенсвязывающий участок в клетке с помощью одного или более клонирующих или экспрессирующих векторов по п.17 и
    b) выделяют антитело или его антигенсвязывающий участок из клетки.
  20. 20. Набор для диагностики патологического нарушения, которое опосредуется склеростином или которое ассоциировано с повышенным уровнем склеростина, содержащий антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-13.
  21. 21. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-13 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патологического нарушения, которое опосредуется склеростином или которое ассоциировано с повышенным уровнем склеростина.
  22. 22. Применение антитела или антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-13 с (I) золедроновой кислотой, (II) антителом к ΌΚΚ, (III) алендронатом, ЦУ) антителом к БВР4, (У) ЕРТн и/или (УТ) рилизинг-факторами паратиреоидного гормона (кальцилитики) для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патологического нарушения, которое опосредуется склеростином или которое ассоциировано с повышенным уровнем склеростина.
    - 56 018756
  23. 23. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-13 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патологического нарушения, которое опосредуется склеростином или которое ассоциировано с повышенным уровнем склеростина, в котором лекарственное средство применяют в сочетании с (I) золедроновой кислотой, (II) антителом к ЭКК, (III) алендронатом, (IV) антителом к ЬКР4, (V) 11РТН и/или (VI) рилизинг-фактором паратиреоидного гормона (кальцилитики).
  24. 24. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-13 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения патологического нарушения, которое опосредуется склеростином или которое ассоциировано с повышенным уровнем склеростина, в котором пациенту предварительно вводят (I) золедроновую кислоту, (II) антитело к ЭКК, (III) алендронат, (IV) антитело к ЬЯР4, (V) 11РТН и/или (VI) рилизинг-факторы паратиреоидного гормона (кальцилитики).
  25. 25. Применение по одному из пп.21-24, в котором патологическое расстройство представляет собой первичный и вторичный остеопороз, остеопению, остеомаляцию, несовершенный остеогенез (0Ц, аваскулярный некроз (остеонекроз), переломы и заживление имплантата (зубные имплантаты и имплантаты тазобедренного сустава), потерю костной ткани, ассоциированную с ВИЧ-инфекцией, рак или артрит.
EA201000559A 2007-10-12 2008-10-10 Антитела к склеростину, композиции, их содержащие, и их применение EA018756B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07118414 2007-10-12
EP08151911 2008-02-25
EP08161342 2008-07-29
PCT/EP2008/063691 WO2009047356A1 (en) 2007-10-12 2008-10-10 Compositions and methods for use for antibodies against sclerostin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201000559A1 EA201000559A1 (ru) 2010-10-29
EA018756B1 true EA018756B1 (ru) 2013-10-30

Family

ID=40219404

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201000559A EA018756B1 (ru) 2007-10-12 2008-10-10 Антитела к склеростину, композиции, их содержащие, и их применение

Country Status (36)

Country Link
US (3) US7879322B2 (ru)
EP (2) EP2586796B1 (ru)
JP (3) JP2011502470A (ru)
KR (2) KR20130029452A (ru)
CN (1) CN101821291B (ru)
AR (1) AR068767A1 (ru)
AU (1) AU2008309514B2 (ru)
BR (1) BRPI0817879A2 (ru)
CA (1) CA2702005C (ru)
CL (1) CL2008003004A1 (ru)
CO (1) CO6270368A2 (ru)
CR (1) CR11313A (ru)
CU (1) CU23869B1 (ru)
CY (2) CY1114872T1 (ru)
DK (2) DK2586796T3 (ru)
EA (1) EA018756B1 (ru)
ES (2) ES2614328T3 (ru)
GT (1) GT201000085A (ru)
HK (1) HK1143173A1 (ru)
HN (1) HN2010000674A (ru)
HR (2) HRP20140161T1 (ru)
HU (1) HUE031995T2 (ru)
IL (1) IL204510A (ru)
LT (1) LT2586796T (ru)
MA (1) MA31760B1 (ru)
MX (1) MX2010003915A (ru)
MY (1) MY152282A (ru)
NZ (1) NZ584158A (ru)
PE (1) PE20091221A1 (ru)
PL (2) PL2586796T3 (ru)
PT (2) PT2203478E (ru)
SI (2) SI2203478T1 (ru)
TN (1) TN2010000140A1 (ru)
TW (1) TWI489993B (ru)
WO (1) WO2009047356A1 (ru)
ZA (1) ZA201001789B (ru)

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040009535A1 (en) * 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
BRPI9915679B8 (pt) 1998-11-27 2021-05-25 Darwin Discovery Ltd composições e métodos para aumentar a mineralização óssea
RS20050934A (en) 2003-06-16 2008-04-04 Celltech R. & D. Inc., Antibodies specific for sclerostin and methods fo r increasing bone mineralization
US8461155B2 (en) * 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
WO2007053577A2 (en) 2005-10-31 2007-05-10 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
US7723477B2 (en) * 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
EP3345607B1 (en) 2006-12-29 2022-10-26 Ossifi-Mab LLC Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
US8680019B2 (en) * 2007-08-10 2014-03-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin Type III binding-domain libraries
US8470966B2 (en) 2007-08-10 2013-06-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
JP5781762B2 (ja) * 2007-08-10 2015-09-24 プロテリックス、インク ユニバーサルｉｉｉ型フィブロネクチン結合ドメインのライブラリ
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
TWI489993B (zh) * 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
CA2705923A1 (en) 2007-11-16 2009-05-22 Nuvelo, Inc. Antibodies to lrp6
DK2708559T3 (en) 2008-04-11 2018-06-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of repeatedly binding two or more antigen molecules
RU2579897C2 (ru) * 2008-09-26 2016-04-10 Онкомед Фармасьютикалс, Инк. Агенты, связывающие рецептор "frizzled", и их применение
AR075715A1 (es) * 2009-03-05 2011-04-20 Novartis Ag Formulacion de anticuerpo liofilizado
WO2010115932A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Novartis Ag Combination for the treatment of bone loss
WO2011037791A1 (en) * 2009-09-25 2011-03-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Antagonists of pcsk9
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
KR20130043102A (ko) 2010-04-01 2013-04-29 온코메드 파마슈티칼스, 인크. 프리즐드-결합 작용제 및 그의 용도
AU2011237679B2 (en) 2010-04-07 2014-11-06 Abbvie Inc. TNF-alpha binding proteins
BR112012026098A2 (pt) * 2010-04-16 2016-11-22 Novartis Ag métodos e composições para melhorar a osseointegração de implante.
US9290573B2 (en) 2010-05-06 2016-03-22 Novartis Ag Therapeutic low density lipoprotein-related protein 6 (LRP6) multivalent antibodies
JP2013527762A (ja) 2010-05-06 2013-07-04 ノバルティス アーゲー 治療的低密度リポタンパク質関連タンパク質６（ｌｒｐ６）抗体の組成物および使用方法
DK3195880T3 (da) 2010-05-14 2020-03-02 Amgen Inc Højkoncentrerede anti-sclerostin-antistofformuleringer
US9403882B2 (en) 2010-06-07 2016-08-02 Joshua Rabbani Sulfation of Wnt pathway proteins
US9493541B2 (en) 2010-06-07 2016-11-15 Joshua Rabbani Antibodies specific for sulfated sclerostin
US11167011B2 (en) 2010-06-07 2021-11-09 Enzo Biochem, Inc. Methods for treating bone loss using sclerostin peptides
US9617323B2 (en) 2010-06-07 2017-04-11 Joshua Rabbani Sulfonated sclerostin, antibodies, epitopes and methods for identification and use therefor
WO2012028683A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Novartis Ag Antibody gel system for sustained drug delivery
WO2012058393A2 (en) * 2010-10-27 2012-05-03 Amgen Inc. Dkk1 antibodies and methods of use
EP3111954B1 (en) 2010-11-05 2019-04-03 Novartis Ag Methods of treating ankylosing spondylitis using anti-il-17 antibodies
TWI812066B (zh) 2010-11-30 2023-08-11 日商中外製藥股份有限公司 具有鈣依存性的抗原結合能力之抗體
MX2013010011A (es) 2011-03-01 2014-10-24 Amgen Inc Agentes de unión biespecífica.
MA35009B1 (fr) 2011-03-25 2014-04-03 Amgen Inc Cristaux d'anticorps anti-sclérotine et formulations de ceux-ci
ES2685479T3 (es) 2011-04-19 2018-10-09 Amgen Inc. Método para el tratamiento de la osteoporosis
EP2702408A1 (en) 2011-04-29 2014-03-05 Novartis AG Methods of treating squamous cell carcinoma related applications
SI2739311T1 (en) * 2011-08-04 2018-07-31 Amgen Inc. Method for the treatment of bone defect defects
US10307167B2 (en) 2012-12-14 2019-06-04 Corquest Medical, Inc. Assembly and method for left atrial appendage occlusion
US10314594B2 (en) 2012-12-14 2019-06-11 Corquest Medical, Inc. Assembly and method for left atrial appendage occlusion
US10813630B2 (en) 2011-08-09 2020-10-27 Corquest Medical, Inc. Closure system for atrial wall
CA2853357A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Abbvie Inc. Immunobinders directed against tnf
TW201323441A (zh) 2011-10-24 2013-06-16 Abbvie Inc 抗ｔｎｆ之雙特異性免疫結合物
MX2014004977A (es) * 2011-10-24 2014-09-11 Abbvie Inc Inmunoaglutinantes dirigidos contra esclerostina.
AU2012332263A1 (en) 2011-11-04 2014-05-22 Novartis Ag Low density lipoprotein-related protein 6 (LRP6) - half life extender constructs
JP6363954B2 (ja) 2011-12-28 2018-07-25 アムジエン・インコーポレーテツド 抗スクレロスチン抗体の使用による歯槽骨消失の治療方法
EP3626267A1 (en) * 2012-07-05 2020-03-25 UCB Pharma, S.A. Treatment for bone diseases
AU2013334790A1 (en) 2012-10-23 2015-04-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using Wnt pathway-binding agents
US20140142689A1 (en) 2012-11-21 2014-05-22 Didier De Canniere Device and method of treating heart valve malfunction
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US20150307625A1 (en) * 2012-11-29 2015-10-29 Bayer Healthcare Llc MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ACTIVATED PROTEIN C (aPC)
CN104936618A (zh) 2012-11-29 2015-09-23 拜尔健康护理有限责任公司 针对活化蛋白c的人源化单克隆抗体及其用途
WO2014118705A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Novartis Ag Methods of treating chronic kidney disease-mineral and bone disorder using sclerostin antagonists
CN105073195A (zh) 2013-02-04 2015-11-18 昂科梅德制药有限公司 使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法及对该治疗的监测
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
CA2907422C (en) * 2013-03-20 2021-08-31 Genzyme Corporation Methods for treating osteogenesis imperfecta
WO2014155278A2 (en) 2013-03-26 2014-10-02 Novartis Ag Methods of treating autoimmune diseases using il-17 antagonists
US9566443B2 (en) 2013-11-26 2017-02-14 Corquest Medical, Inc. System for treating heart valve malfunction including mitral regurgitation
WO2015087187A1 (en) * 2013-12-10 2015-06-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-sclerostin antibodies
US9763911B2 (en) 2013-12-12 2017-09-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research Prostacyclin compositions for regulation of fracture repair and bone formation
US10842626B2 (en) 2014-12-09 2020-11-24 Didier De Canniere Intracardiac device to correct mitral regurgitation
MA41142A (fr) * 2014-12-12 2017-10-17 Amgen Inc Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
CA2978976C (en) * 2015-03-13 2024-05-14 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-sclerostin antibody, antigen binding fragment and medical use thereof
US11077187B2 (en) 2015-11-17 2021-08-03 Oklahoma Medical Research Foundation Epitope of optimized humanized monoclonal antibodies against activated protein C and uses thereof
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
EP3496744A1 (en) 2016-08-08 2019-06-19 Amgen Inc. Method of improving connective tissue attachment using anti-sclerostin antibodies
KR20190096409A (ko) * 2016-12-21 2019-08-19 메레오 바이오파마 3 리미티드 불완전 골형성증 치료에서의 항-스클레로스틴 항체의 용도
EA201991514A1 (ru) * 2016-12-21 2019-12-30 Сефалон, Инк. Антитела, которые специфически связываются с ил-15, и их применение
WO2018115879A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Mereo Biopharma 3 Limited Use of anti-sclerostin antibodies in the treatment of osteogenesis imperfecta
WO2018139623A1 (en) * 2017-01-30 2018-08-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-sclerostin antibodies and methods of use
CN108866002A (zh) * 2017-05-12 2018-11-23 上海复旦张江生物医药股份有限公司 用于sost蛋白或抗体筛选的细胞株及其制备方法和应用
KR20200034748A (ko) 2017-07-27 2020-03-31 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드 Sost 항체 약학적 조성물 및 그의 용도
CN107817350B (zh) * 2017-10-26 2019-09-06 成都医学院第一附属医院 一种肺癌筛查试剂盒
SG11202008206TA (en) 2018-03-30 2020-09-29 Amgen Inc C-terminal antibody variants
GB201810746D0 (en) 2018-06-29 2018-08-15 Mereo Biopharma 3 Ltd Use of sclerostin antagonist
JP7425041B2 (ja) 2018-08-10 2024-01-30 アムジエン・インコーポレーテツド 抗体医薬製剤を作製する方法
CN114364694B (zh) * 2019-07-12 2024-05-10 国立大学法人京都大学 靶向usag-1分子的用于牙齿再生治疗的中和抗体
MX2022001805A (es) 2019-08-12 2022-06-08 Amgen Inc Formulaciones de anticuerpos anti-esclerostina.
TR201920272A1 (tr) * 2019-12-15 2021-06-21 Uludamar Altay Dental i̇mplantlar, greft materyalleri̇ ve prf i̇le osseoi̇ntegrasyonun artirilmasi i̇çi̇n bi̇r terapöti̇k kompozi̇syon ve bunun lokal kullanim yöntemleri̇
CN112070678B (zh) * 2020-08-10 2023-04-11 华东交通大学 一种批量蛋白质印迹膜条倾斜矫正和分割方法及系统
KR102472582B1 (ko) * 2020-08-20 2022-11-30 한림대학교 산학협력단 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 진단 및 치료 방법
CN113354724A (zh) * 2021-04-28 2021-09-07 蒋青 骨硬化蛋白及其在制备治疗或预防阿尔兹海默症的相关产品上应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006119062A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Ucb Pharma S.A. Sclerostin epitopes

Family Cites Families (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US6455275B1 (en) 1980-02-25 2002-09-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA construct for producing proteinaceous materials in eucaryotic cells
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
AU612370B2 (en) 1987-05-21 1991-07-11 Micromet Ag Targeted multifunctional proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH059615A (ja) 1991-07-01 1993-01-19 Sumitomo Metal Mining Co Ltd スポンジＣｄの回収方法
ES2313867T3 (es) 1991-12-02 2009-03-16 Medical Research Council Produccion de anticuerpos anti-auto de repertorios de segmentos de anticuerpo expresados en la superficie de fagos.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
EP2192131A1 (en) 1992-08-21 2010-06-02 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
ES2309999T3 (es) 1996-10-28 2008-12-16 University Of Lausanne Metodo para la oligomerizacion de peptidos.
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
WO1998056906A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Thoegersen Hans Christian Trimerising module
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
AU776049B2 (en) 1998-10-09 2004-08-26 United Kingdom Research And Innovation Method for generating diversity
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
BRPI9915679B8 (pt) 1998-11-27 2021-05-25 Darwin Discovery Ltd composições e métodos para aumentar a mineralização óssea
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
KR101155191B1 (ko) 1999-01-15 2012-06-13 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
PT1144607E (pt) 1999-07-20 2009-04-22 Morphosys Ag Novos métodos para apresentar (poli)peptídeos/ proteínas em partículas bacteriofágicas através de ligações dissulfureto
US6984720B1 (en) 1999-08-24 2006-01-10 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
US7220840B2 (en) 2000-06-16 2007-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator protein
WO2002002641A1 (en) 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
EP1381631B1 (en) * 2001-04-24 2010-10-13 Bayer Corporation Human anti timp-1 antibodies
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
CA2467521A1 (en) 2001-11-16 2003-07-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
AU2003276430A1 (en) 2002-06-14 2003-12-31 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
FR2840910B1 (fr) 2002-06-17 2004-08-27 Rhodia Chimie Sa Composition silicone pour la realisation d'un ensemble comprenant plusieurs elements en silicone reticules par polyaddition adherant fermement les uns aux autres
US20040065598A1 (en) 2002-06-17 2004-04-08 Ross David Justin Address disambiguation for mail-piece routing
AU2003277828B2 (en) 2002-10-29 2009-06-04 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
RS20050934A (en) 2003-06-16 2008-04-04 Celltech R. & D. Inc., Antibodies specific for sclerostin and methods fo r increasing bone mineralization
US8461155B2 (en) 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
WO2005069970A2 (en) 2004-01-20 2005-08-04 Kalobios, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
US7737190B2 (en) 2005-03-24 2010-06-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process to prepare stable trifluorostyrene containing compounds grafted to base polymers using a solvent/water mixture
US20060264576A1 (en) 2005-03-24 2006-11-23 Roelofs Mark G Process to prepare stable trifluorostyrene containing compounds grafted to base polymers
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
DE102006002221A1 (de) 2005-11-11 2007-05-24 Micronas Gmbh Integrierter elektronischer Schaltkreis
JP5688829B2 (ja) * 2005-11-11 2015-03-25 敏一 吉川 示差的な糖尿病の予知・診断方法および糖尿病予知・診断用キット
DOP2006000277A (es) 2005-12-12 2007-08-31 Bayer Pharmaceuticals Corp Anticuerpos anti mn y métodos para su utilización
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
EP2460828A3 (en) 2006-11-10 2012-08-08 UCB Pharma, S.A. Antibodies and diagnostics
US20100036091A1 (en) 2006-11-10 2010-02-11 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
EP3345607B1 (en) 2006-12-29 2022-10-26 Ossifi-Mab LLC Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
EP2131860B1 (en) * 2007-03-20 2013-12-18 Eli Lilly & Company Anti-sclerostin antibodies
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
TWI489993B (zh) * 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
US20110044978A1 (en) 2007-12-14 2011-02-24 Amgen Inc. Method for treating bone fracture

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006119062A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Ucb Pharma S.A. Sclerostin epitopes

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H.Z. KE ET AL.: "BONE ANABOLISM ACHEIVED BY REDUCING SCLEROSTIN BIOAVAILABILITY WITH AN ANTI-sclerostin antibody", 36TH INTERNATIONAL SUN VALLEY WORKSHOP ON SKELETAL TISSUE BIOLOGY, 30 July 2006 (2006-07-30), page 02.08.2006, XP002469781, the whole document *
I. KYOJI: "Physiological function of osteocytes", CLINICAL CALCIUM, vol. 17, no. 10, 1 October 2007 (2007-10-01), pages 1554-1558, XP008088787, abstract *
OMINSKY M.S. ET AL.: "SCLEROSTIN MONOCLONAL ANTIBODY TREATMENT INCREASES BONE STRENGTH IN AGED OSTEOPENIC OVARIECTOMIZED RATS", JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH, NEW YORK, NY, US, vol. 21, no. 1, 18 September 2006 (2006-09-18), page S44PRES1161, XP008078247, ISSN: 0884-0431, the whole document *
VAN BEZOOIJEN R.L. ET AL.: "BONE MORPHOGENETIC PROTEINS AND THEIR ANTAGONISTS: THE SCLEROSTIN PARADIGM", JOURNAL OF ENDOCRINOLOGICAL INVESTIGATION, KURTIS, MILAN, IT, vol. 28, no. 8, 2005, pages 15-17, XP008078167, ISSN: 0391-4097 *
WARMINGTON K. ET AL.: "SCLEROSTIN ANTAGONISM IN ADULT RODENTS, VIA MONOCLONAL ANTIBODY MEDIATED BLOCKADE, INCREASES BONE MINERAL DENSITY AND IMPLICATES SCLEROSTIN AS A KEY REGULATOR OF BONE MASS DURING ADULTHOOD", JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH, NEW YORK, NY, US, vol. 19, 5 October 2004 (2004-10-05), pages S56-S57, ABSTRACT, XP009072609, ISSN: 0884-0431, the whole document *
WARMINGTON K. ET AL.: "SCLEROSTIN MONOCLONAL ANTIBODY TREATMENT OF OSTEOPOROTIC RATS COMPLETELY REVERSES ONE YEAR OF OVARIECTOMY-INDUCED SYSTEMIC BONE LOSS", JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH, NEW YORK, NY, US, vol. 20, no. 9, 25 September 2005 (2005-09-25), pages S22-PRES1082, XP008078248, ISSN: 0884-0431, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
PT2203478E (pt) 2014-02-25
CY1118691T1 (el) 2017-07-12
JP2013153757A (ja) 2013-08-15
LT2586796T (lt) 2017-02-27
CN101821291A (zh) 2010-09-01
HK1143173A1 (en) 2010-12-24
PE20091221A1 (es) 2009-09-11
ES2448542T3 (es) 2014-03-14
US8486661B2 (en) 2013-07-16
HRP20170347T1 (hr) 2017-08-11
CO6270368A2 (es) 2011-04-20
PL2203478T3 (pl) 2014-05-30
CY1114872T1 (el) 2016-12-14
AU2008309514A1 (en) 2009-04-16
DK2203478T3 (da) 2014-02-10
BRPI0817879A2 (pt) 2014-06-17
MA31760B1 (fr) 2010-10-01
MY152282A (en) 2014-09-15
CN101821291B (zh) 2013-04-10
SI2586796T1 (sl) 2017-04-26
KR101268675B1 (ko) 2013-06-25
EP2203478A1 (en) 2010-07-07
CL2008003004A1 (es) 2009-06-26
US20110052592A1 (en) 2011-03-03
JP2016121170A (ja) 2016-07-07
SI2203478T1 (sl) 2014-03-31
MX2010003915A (es) 2010-04-30
ES2614328T3 (es) 2017-05-30
HN2010000674A (es) 2013-02-04
CR11313A (es) 2010-05-06
ZA201001789B (en) 2011-12-28
JP2011502470A (ja) 2011-01-27
EP2203478B1 (en) 2013-11-20
TN2010000140A1 (en) 2011-09-26
CU23869B1 (es) 2013-03-27
EP2586796B1 (en) 2016-12-07
JP6401196B2 (ja) 2018-10-03
KR20100074271A (ko) 2010-07-01
CU20100059A7 (es) 2012-06-29
GT201000085A (es) 2014-03-14
PL2586796T3 (pl) 2017-05-31
EA201000559A1 (ru) 2010-10-29
EP2586796A1 (en) 2013-05-01
US8246953B2 (en) 2012-08-21
US7879322B2 (en) 2011-02-01
US20120276591A1 (en) 2012-11-01
TWI489993B (zh) 2015-07-01
DK2586796T3 (en) 2017-02-13
CA2702005C (en) 2016-06-14
JP5913181B2 (ja) 2016-04-27
US20090130113A1 (en) 2009-05-21
PT2586796T (pt) 2017-03-15
KR20130029452A (ko) 2013-03-22
CA2702005A1 (en) 2009-04-16
HUE031995T2 (en) 2017-08-28
WO2009047356A1 (en) 2009-04-16
HRP20140161T1 (hr) 2014-03-28
NZ584158A (en) 2011-10-28
IL204510A (en) 2013-01-31
AU2008309514B2 (en) 2011-06-23
AR068767A1 (es) 2009-12-02
TW200922621A (en) 2009-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA018756B1 (ru) Антитела к склеростину, композиции, их содержащие, и их применение
JP6353500B2 (ja) Ｄｋｋ１抗体およびその使用方法
EA027071B1 (ru) АНТИТЕЛО К ActRIIB И СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО КОМПОЗИЦИЯ
CN100595210C (zh) 淀粉样β(1-42)蛋白寡聚体、其衍生物及抗体、其制备方法和用途
EA019397B1 (ru) Антигенсвязывающие белки il-17 рецептора а
UA126657C2 (uk) ОДНОЛАНЦЮГОВА КОНСТРУКЦІЯ АНТИТІЛА ДО BCMA І CD3&lt;font face=&#34;Symbol&#34;&gt;e&lt;/font&gt;
EA026129B1 (ru) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ ЧЕЛОВЕКА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF И ИХ КОМПЛЕКСАМИ
EA020465B1 (ru) ИЗОЛИРОВАННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ErbB3, НАБОРЫ И КОМПОЗИЦИИ, ИХ СОДЕРЖАЩИЕ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
TW201622746A (zh) 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
EA015538B1 (ru) Композиции и способы применения антител к dickkopf-1 и/или -4
EA022796B1 (ru) Антитело, способное связывать тимусный стромальный лимфопоэтин, нуклеиновая кислота, его кодирующая, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин, гибридома, способ получения антитела и его применение
JP2008054682A (ja) オステオプロテゲリン結合性蛋白および受容体
JP2009001566A (ja) オステオプロテゲリン結合性蛋白および受容体
JP2018504893A (ja) Ｂｍｐ６を標的とする抗体のための組成物および方法
UA103297C2 (ru) Способ лечения заболевания, связанного с иммунитетом, путем одновременного нацеливания на il-17a и il-17f антител-антагонистов
EA019636B1 (ru) Связывающие белки, включающие антитела, производные антител и фрагменты антител, которые специфически связываются с cd154, и их применения
EA024492B1 (ru) Антитела, специфически связывающиеся с baffr, и их применение
JP2019530428A (ja) 抗トランスサイレチン抗体
JP2019532617A (ja) 抗トランスサイレチン抗体
US7514240B2 (en) EGR-EGFR complex
US20050175609A1 (en) Placental growth factor as a target for the treatment of osteoporosis
US11174322B2 (en) Antibodies and peptides to treat HCMV related diseases
JP2011153106A (ja) 抗ｔｒｐｖ２抗体
WO2021155132A1 (en) De novo stable, modular pd-1 binding proteins and oligomeric variants
EA039579B1 (ru) Способы и композиции антител, направленных против bmp6

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM