EA015538B1 - Композиции и способы применения антител к dickkopf-1 и/или -4 - Google Patents

Композиции и способы применения антител к dickkopf-1 и/или -4 Download PDF

Info

Publication number
EA015538B1
EA015538B1 EA200801679A EA200801679A EA015538B1 EA 015538 B1 EA015538 B1 EA 015538B1 EA 200801679 A EA200801679 A EA 200801679A EA 200801679 A EA200801679 A EA 200801679A EA 015538 B1 EA015538 B1 EA 015538B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
amino acid
antibodies
binding
sequence
Prior art date
Application number
EA200801679A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801679A1 (ru
Inventor
Джанин Шулок
Фэн Кон
Марк Фишман
Сет Эттенберг
Михаэль Бардрофф
Мариель Донзо
Штефани Урлингер
Original Assignee
Новартис Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Новартис Аг filed Critical Новартис Аг
Publication of EA200801679A1 publication Critical patent/EA200801679A1/ru
Publication of EA015538B1 publication Critical patent/EA015538B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)

Abstract

В изобретении описаны антитела и фрагменты, которые обладают способностью связываться с белком-мишенью Dickkopf (DKK1), а также способы применения и наборы, предназначенные для лечения клетки-мишени, прежде всего клетки, ассоциированной с остеолитическим состоянием.

Description

Настоящее изобретение относится к композициям и способам применения антитела к Όίο1<1<ορΓ-1 (ΌΚΚ1), антитела к ΌΚ1<1<ορΓ-4 (ΌΚΚ4) или их обоих для лечения связанных с ΌΚΚ аномалий плотности костной ткани, метаболизма, диабета, различных форм рака и т.п.
Предпосылки создания изобретения
Путь передачи сигнала \¥п1 принимает участие в контроле эмбрионального развития и в неопластических процессах. Внеклеточные белки \Уп1 ответственны за рост и дифференцировку многих типов клеток, включая, в частности, рост, дифференцировку и регуляцию остеобластов, остеокластов и адипоцитов.
Многие формы рака ассоциированы с костными тканями и могут приводить к остеобластическим (остеогенным) повреждениям, которые могут иметь место, например, при раке предстательной железы, или к остеолитическим повреждениям, которые могут иметь место при раке легкого, раке молочной железы и множественной миеломе (см., например, Т1ап и др., Νο\ν Епд1апб 1. Меб. 349, 2003, с. 2483-2494).
Представители семейства генов XV п1 кодируют секретируемые гликопротеины, необходимые для различных процессов развития (Реб1 и др., 1. Βίο. СЬет. 274, 1999, с. 19465-19472). Белки-представители семейства νηΐ инициируют путь передачи сигнала, важный для роста и дифференцировки остеобластов, который приводит к отложению костной ткани. Помимо формирования костной ткани резорбция костной ткани является продолжением нормального процесса, осуществляемого клетками, которые называют остеокластами. В противоположность этому лиганд рецептора-активатора ядерного фактора-каппа Β (ΚΆΝΚΒ) представляет собой конечный медиатор осуществляемой остеокластами резорбции костной ткани, при этом он играет основную роль в патогенезе постменопаузального остеопороза, а также в потере костной ткани, ассоциированной с ревматоидным артритом, метастатическим раком, множественной миеломой, терапией с использованием ингибиторов ароматазы и терапией, основанной на депривации андрогена (см., например, Бе\\зескт Ехрей. Θρίη. ΒίοΙ. ТЬег. 6, 2006, с. 1041-1050). Остеопротегрин (ОРО), который экспрессируется остеобластами, ингибирует Κ.ΛΝΚΡ. снижая тем самым активность и формирование остеокластов. Баланс между анаболическим формированием костной ткани и аналитической резорбцией костной ткани регулирует нормальную плотность костной ткани, в повышение уровня одного или другого процесса снижает плотность костной ткани или приводит к повышенной потери костной ткани соответственно.
νηΐ связывается и проявляет действие через другие белки клеточной поверхности, и передача сигнала νηΐ может принимать участие в неопластических процессах. Кроме того, генетические изменения могут воздействовать на комплекс клеточных белков, известный как аденоматозный полипозный коли, в котором участвует белок β-катенин, и эти комплексы обнаружены в клетках пациентов, страдающих такими заболеваниями, как человеческий рак ободочной кишки, меланомы и печеночно-клеточные карциномы, что свидетельствует о том, что аберрации путей передачи сигнала νηΐ ответственны за развитие указанных и возможно других типов рака у человека (Реб1 и др., 1. Βίο. СЬет. 274, 1999, с. 19465-19472).
Известно по меньшей мере два семейства белков, которые ингибируют передачу сигнала νηΐ, а именно семейство секретируемых белков, родственных белку ΡτίζζΚ, и семейство белков ОюккорГ (ΌΚΚ). ΌΚΚ-семейство по современным сведениям состоит из 4 представителей, а именно ΌΚΚ1 (человеческая ДНК, рег. номер ΝΜ_012242; РВТ, рег. номер 094907), ΌΚΚ2 (человеческая, рег. номер ΝΜ_014421; РВТ, рег. номер ΝΡ_055236), ΌΚΚ3 (человеческая, рег. номер ΝΜ_015881; РВТ, рег. номер ЛЛР88744) и ΌΚΚ4 (человеческая, рег. номер ΝΜ_014420; РВТ, рег. номер Ν₽_055235).
ΌΚΚ1 представляет собой секретируемый ингибитор пути передачи сигнала νηί/β-катенина (см., например, заявку на патент США 2005-0079173 на имя №ейт8; заявку на патент США 2004-0234515 на имя МсСаййу). ΌΚΚ1 обладает способностью ингибировать индуцируемую νηΐ дупликацию оси, и генетический анализ свидетельствует о том, что ΌΚΚ1 действует против хода пути передачи сигнала, ингибируя передачу сигнала νηΐ. ΌΚΚ1 также важен для развития скелета, что продемонстрировано по его воздействию на потерю костных структур в куриных и обезьяньих эмбрионах после их контакта с высокими уровнями ΌΚΚ1 (Т1ап и др., №\ν Епд1апб 1. Меб. 349, 2003, с. 2483-2494). Повышенные уровни ΌΚΚ1 в сыворотке ассоциированы с раком предстательной железы, а повышенные уровни ΌΚΚ1 и Κ.ΛΝΚΡ в плазме костного мозга и периферической крови пациентов, страдающих множественной миеломой, ассоциированы с присутствием локальных повреждений костной ткани (см., например, Т1ап, 2003, ОМ1М, рег. номер 605189). ΌΚΚ1 играет также роль в адипогенезе, хондрогенезе, пролиферации желудочно-кишечного эпителия, потере костной ткани, ассоциированной с ревматизмом, и инициации формирования волосяного фолликулярного плакода (ОМ1М, рег. номер 605189).
ΌΚΚ4 охарактеризован недостаточно полно, но, по-видимому, он также представляет собой секретируемый ингибитор νηΐ-пути. Установлено, что ΌΚΚ4 откладывается в бляшках пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, и экспрессируется в мышце. Роль νηΐ в развитии мышечной ткани пока не известна, поэтому можно предположить, что ΌΚΚ4 играет роль ингибитора развития мышечной ткани.
- 1 015538
Таким образом, существует необходимость в разработке композиций и способов лечения рака и аномальной плотности костной ткани, основанных на применении таких агентов, которые оказывают воздействие или нейтрализуют опосредуемое ΌΚΚ1 и/или ΌΚΚ4 антагонистическое воздействие на путь передачи сигнала \¥п1.
Краткое изложение сущности изобретения
Вариантом осуществления настоящего изобретения является антитело или его антигенсвязывающий участок, который избирательно связывается и нейтрализует полипептид ΌΚΚ1 и/или ΌΚΚ4 или его фрагмент. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело представляет собой антитело, нейтрализующее ΌΚΚ1/4. В различных вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий участок антитела, нейтрализующего ΌΚΚ1/4, не связывается с ΌΚΚ2 или ΌΚΚ3.
В одном варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий участок имеет иммуноглобулиноподобный каркас, такой как каркасный участок (остов), выбранный, например, из человеческого, гуманизированного, гуманированного, акульего, верблюжьего каркаса, и/или они могут представлять собой также рекомбинантные, химерные антитела или антитела с трансплантированными СЭК. Например, под объем изобретения подпадает технология, направленная на минимизацию человеческого гуморального иммунного ответа на мышиное антитело (технология получения гуманированных антител, разработанная фирмой 1<а1оЬю5. или технология получения гуманизированных антител, разработанная фирмой РОЬ). Кроме того, антигенсвязывающие участки, специфические для ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4, могут присутствовать также и в структуре, не имеющей иммуноглобулиноподобного каркаса, включая, например, организацию в таких типах остовов, как аденектин, фибриноген, полученные из анкирина повторы и т.д.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело к ΌΚΚ1 отличается наличием антигенсвязывающего участка, специфического для белка-мишени ΌΚΚ1, и антитело или его функциональный фрагмент связывается с ΌΚΚ1 или его фрагментом. Согласно родственному варианту осуществления изобретения антитело к ΌΚΚ4 отличается наличием антигенсвязывающего участка, специфического для белка-мишени ΌΚΚ4, и антитело или его функциональный фрагмент связывается с ΌΚΚ4 или его фрагментом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий участок связывается с полипептидом ΌΚΚ1 и ΌΚΚ4, но не связывается с полипептидом ΌΚΚ2 или ΌΚΚ3.
В другом варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий участок является моноклональным. В следующем варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий участок является поликлональным. В различных вариантах осуществления изобретения антитело к ΌΚΚ1 или его антигенсвязывающий участок связывается с пептидами, состоящими из 30 смежных аминокислот полипептида ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4.
В родственном варианте осуществления изобретения связывание ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 определяют по меньшей мере с помощью одного анализа, выбранного из группы, включающей анализ ингибирования антагонистического действия ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 в отношении транскрипции, обусловленной передачей сигнала XV п1; определение аффинности с помощью резонанса поверхностного плазмона, твердофазный иммуноферментный анализ связывания; основанный на электрохемилюминесценции анализ связывания; ЕМЛТ (анализ связывания, основанный на технологии флуорометрического микрообъемного анализа); 8ЕТ (уравновешивающее титрование раствора); 8РК (резонанс поверхностного плазмона); ЛЬР, ТорР1а8Й, определение в сыворотке крови концентрации биомаркеров, таких как остеокальцин (ОСЫ), нитрогенный пропептид проколлагена типа 1 (Ρ1ΝΡ) и остеопротегерин (ОРС), и определение связывания с рецептором(ами), расположенным(и) на клеточной поверхности, такими как Βπζζίοά (Ρζ), ЬКР (ЬРР5/6) или 1<гетеп (1<гт). В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело к ΌΚΚ1 или его антигенсвязывающий участок обладает по меньшей мере одним из следующих свойств: селективность в отношении ΌΚΚ1, которая по меньшей мере в 103, 104 или 105 раз выше, чем в отношении человеческого ΌΚΚ2 или ΌΚΚ3; связывание с ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4, характеризующее значением Κοη (константа ассоциации) менее 100 нМ, 50 нМ, 10 нМ, 1,0 нМ, 500 пМ, 100 пМ, 50 пМ или 10 пМ; и имеет скорость диссоциации с ΌΚΚ1 менее 10-2, 10-3, 10-4 или 10-5 с-1.
В родственном варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, конкурирует с ΌΚΚ1 и/или ΌΚΚ4 за связывание с ШР5/6. В родственном варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, конкурирует с ΌΚΚ1 и/или ΌΚΚ4 за связывание с Κηη.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок любого из указанных выше антител или функциональных фрагментов этих антител и их аминокислотные последовательности. Таким образом, конкретными вариантами осуществления изобретения являются выделенные аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 2-20 и 40-72 и консервативные или гуманированные варианты указанных последовательностей.
Кроме того, конкретными дополнительными вариантами осуществления изобретения являются аминокислотные последовательности 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 2-20, 65-72 и консервативные или гуманированные варианты указанных последовательностей, которые являются выделенными антигенсвязывающими участками, каждый из которых представляет собой Н-СЭКЗ.
- 2 015538
В родственном варианте осуществления изобретения выделенный антигенсвязывающий участок представляет собой Н-СГОК2-участок. аминокислотная последовательность которого выбрана из 8ЕС ГО N0: 2-20. 57-64 их консервативных или гуманированных вариантов. В еще одном родственном варианте осуществления изобретения выделенный антигенсвязывающий участок представляет собой консенсусный Н-СЭВ2-участок. последовательность которого выбрана из группы. включающей 8ЕС ГО N0: 40. имеющей аминокислотную последовательность ΟΙδΟδΟδΥΤΥΥΑΟδνΚΕ. 8Е0 ΙΌ N0: 41. имеющей аминокислотную последовательность ΟΙδΥΥΟΟΝΤΥΥΑΌδνΚΕ. и 8Е0 ГО N0: 42. имеющей аминокислотную последовательность ΟΙδΥΥΟΟδΤΥΥΑΟδνΚΕ. и консервативных или гуманированных вариантов аминокислотных остатков указанных последовательностей.
Конкретным вариантом осуществления изобретения является новая последовательность. представленная в 8Е0 ГО N0: 2-5. 8-11. 20. 49-56 и их консервативных или гуманированных вариантах. которые содержат выделенный антигенсвязывающий участок. представляющий собой Н-СГОК1-участок.
В родственном варианте осуществления изобретения выделенный антигенсвязывающий участок представляет собой консенсусный Н-СОК1 -участок. который имеет аминокислотную последовательность. выбранную из группы. включающей аминокислотные последовательности (указанные в виде однобуквенного кода аминокислот) 6ΕΤΕ88Υ6ΜΤ (δ ЕС ГО N0: 43). бЕТТОетСМТ (δ ЕС ГО N0: 44). 6ЕТЕ§1\теМТ (НЕС) ГО N0: 45). 6ΕΤΕ88Υ№ΜΤ (8Ер ГО N0: 46). 6ΕΤΕ88ΥΑΜΤ (8Ер ГО N0: 47). ΟΕΤΕδδΥΟΜδ (8ЕС ΙΌ N0: 48) и консервативные или гуманированные варианты любой из указанных последовательностей.
Другим вариантом осуществления изобретения являются аминокислотные последовательности. представляющие собой выделенные антигенсвязывающие участки. которые несут Ь-С0К3-участок. указанные аминокислотные последовательности выбраны из 8ЕС ΙΌ N0: 21-39. 89-96 и консервативных или гуманированных вариантов указанных последовательностей. В еще одном родственном варианте осуществления изобретения выделенный антигенсвязывающий участок представляет собой Ь-С0К1-участок. аминокислотная последовательность которого выбрана из 8ЕС ΙΌ N0: 21-39. 73-80 и консервативных или гуманированных вариантов указанных последовательностей. В еще одном родственном варианте осуществления изобретения выделенный антигенсвязывающий участок представляет собой Ь-СОКЗучасток. аминокислотная последовательность которого выбрана из 8ЕС ΙΌ N0: 21-39. 81-88 и консервативных или гуманированных вариантов указанных последовательностей.
В конкретных вариантах осуществления изобретения выделенный антигенсвязывающий участок представляет собой вариабельную область легкой цепи. которая имеет аминокислотную последовательность. выбранную из 8ЕС ГО N0: 21-39 и консервативных или гуманированных вариантов указанных последовательностей.
Другим вариантом осуществления изобретения является нуклеотидная последовательность. выбранная из группы. включающей 8ЕС ГО N0: 97-103. В родственном варианте осуществления изобретения каждая из указанных нуклеотидных последовательностей кодирует аминокислотную последовательность. и консервативные или гуманированные варианты указанных кодируемых аминокислотных последовательностей также подпадают под объем настоящего изобретения. В другом родственном варианте осуществления изобретения любая нуклеотидная последовательность. представленная в 8ЕС ГО N0: 97100. кодирует антигенсвязывающую легкую цепь. В другом родственном варианте осуществления изобретения любая нуклеотидная последовательность. представленная в 8ЕС ГО N0: 101-103. кодирует антигенсвязывающую тяжелую цепь. Согласно другому родственному варианту осуществления изобретения каждую из указанных нуклеотидных последовательностей дополнительно оптимизируют для экспрессии в клетке. Предпочтительными клетками являются (но не ограничиваясь только ими). например. клетки китайского хомячка (например. СН0-клетки). клетки бакуловирусов. дрожжей. бактерий. миеломы и/или Н. 8ар1еп8.
Предпочтительно последовательности оптимизируют для экспрессии и для получения и клинического применения. Для клинического применения подлежащими оптимизации характеристиками являются (но не ограничиваясь только ими). например. время полужизни. фармакокинетические (ФК) параметры. антигенность. эффекторная функция. клиренс ЕеКп и ответ пациента. включая антителообусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ΑΌΟΟ) или комплементзависимую цитотоксичность (СОС).
Следующим вариантом осуществления изобретения является антигенсвязывающий участок. содержащий тяжелую цепь. которая кодируется нуклеотидной последовательностью. выбранной из группы. включающей 8ЕС ГО N0: 101-103. Родственным вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок. содержащий легкую цепь. которая кодируется нуклеотидной последовательностью. выбранной из группы. включающей 8ЕС ГО N0: 97-100. Еще одним родственным вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок. содержащий легкую цепь. которая кодируется нуклеотидной последовательностью. выбранной из группы. включающей 8ЕС ГО N0: 97-100. и тяжелую цепь. которая кодируется нуклеотидной последовательностью. выбранной из группы. включающей 8ЕС ГО N0: 101-103.
- 3 015538
Конкретным вариантом осуществления изобретения является нуклеотидная последовательность, выбранная из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 104-110. В родственном варианте осуществления изобретения каждая из указанных нуклеотидных последовательностей кодирует аминокислотную последовательность, и консервативные или гуманированные варианты указанных аминокислотных последовательностей также подпадают под объем настоящего изобретения. В другом родственном варианте осуществления изобретения каждая из нуклеотидных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 104-107 кодирует антигенсвязывающую легкую цепь. В другом родственном варианте осуществления изобретения каждая из нуклеотидных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 108-110 кодирует антигенсвязывающую тяжелую цепь. В следующем родственном варианте осуществления изобретения каждую из указанных нуклеотидных последовательностей оптимизируют для экспрессии и/или для клинического применения.
Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий тяжелую цепь, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 108-110. Другим родственным вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий легкую цепь, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 104-107. Следующим родственным вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий легкую цепь, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 104-107, и тяжелую цепь, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 108-110.
Другим вариантом осуществления изобретения является аминокислотная последовательность, выбранная из группы, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 111-117 и консервативные варианты указанных последовательностей. В родственном варианте осуществления изобретения каждая из 8ЕС ΙΌ N0: 111-114 обозначает антигенсвязывающую легкую цепь. В другом варианте осуществления изобретения каждая из 8ЕС ΙΌ N0: 115-117 обозначает антигенсвязывающую тяжелую цепь. В другом родственном варианте осуществления изобретения аминокислотную последовательность оптимизируют для экспрессии и/или для клинического применения.
Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 115-117, а также консервативные варианты указанных последовательностей. Родственным вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий легкую цепь, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 111-114, а также консервативные варианты указанных последовательностей. Следующим родственным вариантом осуществления изобретения является выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 115-117, а также консервативные варианты указанных последовательностей, и легкую цепь, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 111-114, а также консервативные варианты указанных последовательностей.
Другим вариантом осуществления изобретения является нуклеотидная последовательность, выбранная из группы, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 120, 121, и/или выделенный антигенсвязывающий участок, содержащий вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи, кодируемую соответствующими нуклеотидными последовательностями. В родственном варианте осуществления изобретения каждая из указанных нуклеотидных последовательностей кодирует аминокислотную последовательность, и консервативные или гуманированные варианты указанных аминокислотных последовательностей также подпадают под объем настоящего изобретения. В другом родственном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 120 кодирует антигенсвязывающую легкую цепь. Еще в одном родственном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 121 кодирует антигенсвязывающую тяжелую цепь. В следующем родственном варианте осуществления изобретения каждую из указанных нуклеотидных последовательностей дополнительно оптимизируют для экспрессии и/или для клинического применения.
Конкретным вариантом осуществления изобретения является аминокислотная последовательность, выбранная из группы, включающей 8ЕС ΙΌ N0: 118, 119 и консервативных или гуманированных вариантов этих последовательностей. Родственным вариантом осуществления изобретения является антигенсвязывающая вариабельная область легкой цепи, представленная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 118. Другим родственным вариантом осуществления изобретения является антигенсвязывающая вариабельная область тяжелой цепи, представленная в 8ЕС ΙΌ N0: 119. В следующем родственном варианте осуществления изобретения аминокислотную последовательностей оптимизируют для экспрессии и/или для клинического применения.
В других вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность идентична по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% СЭК-участкам, представленным в 8ЕЦ ΙΌ N0: 239. В родственном варианте осуществления изобретения аминокислотная последовательность идентична по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности, представленной в 8ЕС ΙΌ N0: 111-120. Следующим родственным вариантом осуществления изобретения является нуклеотидная
- 4 015538 последовательность, идентичная по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности, представленной в БЕЦ ГО N0: 97-110 и 120, 121.
В конкретном варианте осуществления изобретения любое из вышеуказанных выделенных антител представляет собой 1дС. В родственном варианте осуществления изобретения любое из вышеуказанных выделенных антител представляет собой 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4. В другом варианте осуществления изобретения антитело представляет собой 1дЕ, 1дМ, Ι§Ό или 1дА. Родственным вариантом осуществления изобретения является композиция моноклонального или поликлонального антитела. В следующих вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой химерное, гуманизированное, гуманированное, рекомбинантное антитело и др. Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенное человеческое или гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент, антигенсвязывающий участок которого является специфическим в отношении эпитопа ΌΚΚ1, и антитело или его функциональный фрагмент связывается с ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 или в другом варианте блокирует связывание ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 с рецептором, находящимся на клеточной поверхности (например, с такими рецепторами, как ШР5/6. 1<гстсп. Ετίζζίθά). В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело или его фрагмент обладает способностью предупреждать, лечить или уменьшать интенсивность развития остеолитических повреждений. В других вариантах осуществления изобретения композиция, предлагаемая в изобретении, которая содержит антитело к ΌΚΚ, обладает способностью предупреждать, лечить или уменьшать интенсивность ассоциированного с ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 рака или другого заболевания.
Родственным вариантом осуществления изобретения является выделенное человеческое или гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент, антигенсвязывающий участок которого является специфическим в отношении эпитопа-мишени ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4, и эпитоп содержит 6 или большее количество аминокислотных остатков полипептидного фрагмента, содержащего домены СУБ1линкер-СУБ2 ΌΚΚ1 и/или ΌΚΚ4. В родственном варианте осуществления изобретения эпитоп представляет собой конформационный эпитоп. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эпитоп локализован в СУБ2-домене. В конкретном варианте осуществления изобретения эпитоп содержит модифицированный аминокислотный остаток. В родственном варианте осуществления изобретения эпитоп содержит по меньшей мере один гликозилированный аминокислотный остаток.
Функциональные фрагменты представляют собой Εν- и ЕаЬ-фрагменты (включая одноцепочечные версии, такие как 8θΕν), а также другие антигенсвязывающие участки антитела, включая участки, сцепленные с неиммуноглобулиновым каркасом и состоящими только из тяжелых цепей антителами, такими как верблюжьи и акульи антитела и нанотела. В родственном варианте осуществления изобретения выделенное описанное выше антитело представляет собой 1дС. В другом родственном варианте осуществления изобретения описанное выше выделенное антитело представляет собой 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4. В другом варианте осуществления изобретения антитело представляет собой 1дЕ, 1дМ или 1дА. Родственным вариантом осуществления изобретения является композиция поликлонального антитела.
Другим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одно из любых указанных выше антител или функциональных фрагментов или консервативных вариантов и фармацевтически приемлемый носитель или экспициент.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является трансгенное животное, несущее ген, который кодирует указанные выше антитела или их функциональные фрагменты.
Конкретным вариантом осуществления изобретения является способ лечения нарушения или состояния, ассоциированного с экспрессией ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4. В контексте настоящего описания понятия ассоциированные с ΌΚΚ1 заболевания или ассоциированные с ΌΚΚ4 заболевания включают (но не ограничиваясь только ими) остеолитические повреждения - прежде всего остеолитические повреждения, ассоциированные в миеломой, прежде всего множественной миеломой, или раком костной ткани, молочной железы, ободочной кишки, меланоцитов, гепатоцитов, эпителия, пищевода, головного мозга, легкого, предстательной железы или поджелудочной железы, или его метастазами; потерей костной ткани, ассоциированной с трансплантацией. Другие заболевания или нарушения представляют собой (но не ограничиваясь ими), например, остеосаркому, рак предстательной железы, печеночно-клеточную карциному (НСС), миелому, включая множественную миелому, диабет, ожирение, мышечную атрофию, болезнь Альцгеймера, остеопороз, остеопению, ревматизм, колит и/или нежелательную потерю волос. Способ заключается в том, что вводят индивидууму, который нуждается в этом, в эффективном количестве любую из указанных выше фармацевтических композиций.
В родственном варианте осуществления изобретения подлежащее лечению нарушение или состояние представляет собой аномальную плотность костной ткани. В другом родственном варианте осуществления изобретения подлежащая лечению аномальная плотность костной ткани представляет собой наличие остеолитического повреждения у индивидуума.
В другом варианте осуществления изобретения подлежащее лечению нарушение или состояние представляет собой остеопорозное состояние, такое как остеолитическое повреждение, ассоциированное с раком. В родственном варианте осуществления изобретения подлежащий лечению рак представляет собой миелому, например множественную миелому, или рак костной ткани, молочной железы, ободочной кишки, меланоцитов, гепатоцитов, эпителия, пищевода, головного мозга, легкого, предстательной
- 5 015538 железы или поджелудочной железы или его метастазы. В других вариантах осуществления изобретения остеопорозное состояние представляет собой остеопороз, или остеопению, или остеосаркому.
В конкретных вариантах осуществления изобретения любой из указанных выше способов предусматривает также введение химиотерапевтического агента. В родственном варианте осуществления изобретения химиотерапевтический агент представляет собой противораковый агент. В другом родственном варианте осуществления изобретения химиотерапевтический агент представляет собой антиостеопорозный агент.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является способ лечения клетки-мишени, который заключается в том, что блокируют взаимодействие ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 с клеткой с помощью любого из указанных выше антител или их функциональных фрагментов. В целом клетка-мишень содержит рецептор, с которым связывается ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка-мишень представляет собой остеобласт, при этом лечение с использованием композиции нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4, предлагаемой в изобретении, должно усиливать пролиферацию и стимулировать формирование костной ткани. В другом варианте осуществления изобретения клетка-мишень представляет собой мышечную клетку, при этом лечение должно противодействовать мышечной атрофии.
В родственном варианте осуществления изобретения способ дополнительно предусматривает то, что пациента, в организме которого присутствуют клетки-мишени, лечат химиотерапевтическим агентом или облучением. В родственном варианте осуществления изобретения в любом из указанных выше способов после введения или приведения с контакт дополнительно предусматривается обнаружение уменьшения интенсивности или замедление развития остеолитического повреждения.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является способ выявления ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 в сыворотке. Указанный способ заключается в том, что выявляют ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 с помощью любого из вышеуказанных антител или фрагментов антител, дополнительно содержащих выявляемую метку. Метка представляет собой радиоактивную, флуоресцентную, магнитную, парамагнитную или хемилюминесцентную метку.
В другом варианте осуществления изобретения любое из вышеуказанных человеческих или гуманизированных антител или фрагментов антител является синтетическим.
Следующим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая любое из вышеуказанных антител или функциональных фрагментов этих антител и дополнительный терапевтический агент. Дополнительный терапевтический агент можно выбирать из группы, включающей противораковый агент; антиостеопорозный агент; антибиотик; антиметаболический агент; антидиабетический агент; противовоспалительный агент; антиангиогенный агент; фактор роста и цитокин.
Изобретение относится также к способу предупреждения или лечения пролиферативных болезней или таких заболеваний, как рак, у млекопитающего, прежде всего у человека, с помощью комбинации фармацевтических агентов, включающей:
(а) агент, нейтрализующий ΌΚΚ1/4, предлагаемый в изобретении; и (б) одно или несколько фармацевтических действующих веществ;
где по меньшей мере одно из фармацевтических действующих веществ представляет собой противораковый терапевтический агент.
Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей:
(а) нейтрализующее антитело к ΌΚΚ1/4;
(б) фармацевтическое действующее вещество и (в) фармацевтически приемлемый носитель;
где по меньшей мере одно из фармацевтических действующих веществ представляет собой противораковый терапевтический агент.
Настоящее изобретение относится также к поступающей в продажу упаковке или продукту, которые содержат:
(а) фармацевтический препарат нейтрализующего антитела к ΌΚΚ1/4 и (б) фармацевтический препарат фармацевтического действующего вещества для одновременного, сопутствующего, раздельного или последовательного применения;
где по меньшей мере одно из фармацевтических действующих веществ представляет собой противораковый терапевтический агент.
Конкретным вариантом осуществления изобретения является антитело, которое имеет первую аминокислотную последовательность, представляющую собой тяжелую цепь, выбранную из 8Еф ГО N0: 220, и последовательность, которая идентична по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности СБЯ-участков, где СБЯ-участки имеют последовательность, представленную в 8Еф ГО N0: 2-20; и вторую аминокислотную последовательность, представляющую собой легкую цепь, выбранную из 8Еф ГО N0: 21-39, и последовательность, которая идентична по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности СБЯ-участков, где СБЯ-участки имеют последовательность, представленную в 8Еф ГО N0: 21-39.
- 6 015538
И еще одним вариантом осуществления изобретения является иммуноконъюгат, состоящий из первого компонента, который представляет собой антитело или его фрагмент, как они описаны выше, и второй компонент, имеющий вторую аминокислотную последовательность. Например, иммуноконъюгат представляет собой цитотоксин, или иммуноконъюгат представляет собой связывающий белок или антитело, которое обладает специфичностью к связыванию с мишенью, отличной от ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4. Например, мишенью для специфического связывания, отличной от ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4, является опухолевый антиген или ассоциированный с опухолью белок, находящийся на поверхности раковой клетки.
В конкретных вариантах осуществления изобретения любое из описанных выше антител представляет собой биспецифическое антитело.
Другим вариантом осуществления изобретения является набор, в состав которого входят любые указанные выше антитела или фрагменты антител. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор содержит также фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. В других родственных вариантах осуществления изобретения любое из входящих в состав набора вышеуказанных антител присутствует в виде стандартной дозы. В другом варианте осуществления изобретения набор представляет собой диагностический набор для ЕБ18А. В родственном варианте осуществления изобретения набор содержит инструкции по применению любого из вышеуказанных антител для введения индивидууму.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - график, на котором продемонстрирована несущественная потеря меченного с помощью Н15-§1гер ΌΚΚ1 из гранул, покрытых 81тер-Тас1т, выявленная при сравнении неотмытых гранул с гранулами после отмывки НиСЛЬ® в условиях различной строгости;
на фиг. 2 - столбиковая диаграмма, иллюстрирующая результаты анализа активности \Уп1 с использованием 100 мкл реагента, представляющего собой Впдй1-С1о-люциферазу, который проводили согласно методу, описанному в примере 3;
на фиг. 3 - график, иллюстрирующий результаты, полученные с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А). Флуоресценцию оценивают с помощью планшет-ридера типа ТЕСЛЫ 8рес1гаПног и результаты представляют в виде кривых связывания;
на фиг. 4 - график, иллюстрирующий результаты стандартного ^п13а-зависимого ТСЕ/ЬЕЕ 1исрепортерного анализа, описанного в примере 6;
на фиг. 5 - график, иллюстрирующий результаты, полученные с помощью усовершенствованной версии ТСЕ/ЬЕЕ 1ис-репортерного анализа, которые свидетельствуют о значительно повышенной чувствительности к ΌΚΚ1, опосредуемой совместной экспрессией с корецептором белка Егетеп;
на фиг. 6А - график, иллюстрирующий результаты анализа связывания антитела к ΌΚΚ1/4 с ΌΚΚ1, проведенного методом резонанса поверхностного плазмона;
на фиг. 6Б - таблица рассчитанных значений аффинности к связыванию и кинетических данных;
на фиг. 7 А - схематическое изображение полноразмерного и укороченного ΌΚΚ1 для применения в картировании эпитопов;
на фиг. 7Б - данные о связывании антитела, предлагаемого в изобретении, с белками и фрагментами ΌΚΚ1, представленными на фиг. 7А;
на фиг. 8 - график, иллюстрирующий связывание антитела к ΌΚΚ1/4 по данным конкурентного ЕБ18А;
на фиг. 9 - график, иллюстрирующий ассоциированную с антителом к ΌΚΚ1/4 реактивацию регулируемой \Уп1 транскрипции гена, расположенного по ходу пути (передачи сигнала);
на фиг. 10 - график, иллюстрирующий, что антитело к ΌΚΚ1/4 аннулирует ингибируемую ΌΚΚ1 секрецию АЬР;
на фиг. 11 - график, иллюстрирующий воздействие антитела к ΌΚΚ1/4 на ксенотрансплантаты ίη νίνο;
на фиг. 12 - график, иллюстрирующий ассоциированное с антителом к ΌΚΚ1/4 увеличение плотности костной ткани ίη νίνο;
на фиг. 13 - график, на котором приведено сопоставление антиостеолитической эффективности ΖοιικΙα и антитела к ΌΚΚ1/4;
на фиг. 14 - график, иллюстрирующий зависимость от дозы эффективности антитела к ΌΚΚ1/4 в отношении анаболизма костной ткани.
- 7 015538
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенным антителам к ΌΚΚ1/4, прежде всего человеческим антителам, которые специфически связываются с ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 и ингибируют функциональные свойства ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело к ΌΚΚ1/4 не обладает специфической способностью к связыванию с ΌΚΚ2 или ΌΚΚ3. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, выведены из конкретных последовательностей тяжелых и легких цепей и/или содержат конкретные структурные особенности, такие как ΟΌΒ-участки. содержащие конкретные аминокислотные последовательности. Изобретение относится к выделенным антителам, способам получения указанных антител, иммуноконъюгатов и биспецифических молекул, которые содержат указанные антитела, и к фармацевтическим композициям, содержащим антитела, иммуноконъюгаты или биспецифические молекулы, предлагаемые в изобретении. Изобретение относится также к способам применения антител для ингибирования нарушения или состояния, ассоциированного с ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4. Соответствующие заболевания и нарушения представляют собой (но не ограничиваясь только ими) остеолитические повреждения, прежде всего остеолитические повреждения, ассоциированные в миеломой, прежде всего множественной миеломой, или раком костной ткани, молочной железы, ободочной кишки, меланоцитов, гепатоцитов, эпителия, пищевода, головного мозга, легкого, предстательной железы или поджелудочной железы, или его метастазами; потерей костной ткани, ассоциированной с трансплантацией. Другие заболевания или нарушения представляют собой (но не ограничиваясь только ими), например, остеосаркому, рак предстательной железы, печеночно-клеточную карциному (НСС), миелому, включая множественную миелому, диабет, ожирение, мышечную атрофию, болезнь Альцгеймера, остеопороз, остеопению, ревматизм, колит и/или нежелательную потерю волос.
С целью лучшего понимания настоящего изобретения сначала приведены определения некоторых понятий. Дополнительные понятия будут разъяснены при подробном описании изобретения.
Понятие иммунный ответ относится к действию, например, лимфоцитов, антигенпрезентирующих клеток, фагоцитов, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых указанными выше клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), результатом которого является избирательное повреждение, деструкция или элиминация из организма-хозяина внедряющихся патогенов, клеток или тканей, зараженных патогенами, раковых клеток, или, как в случае аутоиммунитета или патологического воспаления, здоровых человеческих клеток или тканей.
Понятие путь трансдукции сигнала относится к биохимической взаимосвязи между различными молекулами трансдукции сигнала, которые играют роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. В контексте настоящего описания фраза рецептор клеточной поверхности (рецептор, расположенный на поверхности клетки) включает, например, молекулы и комплексы молекул, которые обладают способностью получать сигнал и обладают способностью передавать указанный сигнал через плазматическую мембрану клетки. Примером рецептора клеточной поверхности в контексте настоящего описания является рецептор, с которым связывается молекула белка ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4. К таким рецепторам клеточной поверхности относятся (но не ограничиваясь только ими) Επζζίοά (Ρζ), НКР (ЬКР5 и ЬВРб) и «гсшсн (Κηη).
В контексте настоящего описания понятие антитело относится к поликлональным антителам, моноклональным антителам, гуманизированным антителам, одноцепочечным антителам и их фрагментам, таким как РаЬ, Р(аЬ')2, Ρν и другие фрагменты, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию родительского антитела. Само по себе понятие антитело может относиться к иммуноглобулину, или гликопротеину, или их фрагменту, или участку, или к конструкции, содержащей антигенсвязывающий участок, который находится в модифицированном иммуноглобулиноподобном каркасе, или к антигенсвязывающему участку, который находится в конструкции, имеющей остов или каркас не иммуноглобулинового типа.
В контексте настоящего описания понятие моноклональное антитело относится к композиции антитела, содержащей гомогенную популяцию антител. Понятие не ограничено видами или источниками антитела, также подразумевается, что понятие не ограничено методом его получения. Под понятие подпадают полные иммуноглобулины, а также их фрагменты, такие как РаЬ, Р(аЬ')2, Ρν и другие, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию антитела. В контексте настоящего изобретения можно использовать моноклональные антитела из любых видов млекопитающих. Однако на практике антитела, как правило, представляют собой крысиные или мышиные антитела благодаря доступности линий крысиных или мышиных клеток, которые можно применять для создания требуемых гибридных клеточных линий или гибридом, которые применяют для получения моноклональных антител.
В контексте настоящего описания понятие поликлональное антитело относится к композиции антитела, содержащей гетерогенную популяцию антител. Поликлональные антитела часто получают из объединенной сыворотки, полученной из организма иммунизированных животных или отобранных людей.
В контексте настоящего описания понятие одноцепочечные антитела относится к антителам, полученным путем определения связывающих доменов (и легких, и тяжелых цепей) связывающегося антитела и введения сцепляющего фрагмента, который обеспечивает сохранение связывающей функции. Эти формы, в сущности, представляют собой радикально сокращенное антитело, которое несет только часть
- 8 015538 вариабельной области, необходимой для связывания с антигеном. Определение и конструирование одноцепочечных антител описано в И8 4946778 на имя Ьабпег и др.
Встречающееся в естественных условиях антитело представляет собой гликопротеин, который содержит по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, связанные между собой дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначена в контексте настоящего описания как УН) и константной области тяжелой цепи. Константная области тяжелой цепи состоит из трех доменов, т.е. СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначена в контексте настоящего описания как Уь) и константной области легкой цепи. Константная области легкой цепи состоит из одного домена, т.е. Сь. УН- и Уь-области можно дополнительно подразделять на области гипервариабельности, которые называют гипервариабельными участками (СЭЯ), которые перемежаются с более консервативными участками, которые называют каркасными участками (ГК.). Каждая УН и Уъ состоит из трех СЭК. и четырех ГК, которые в направлении от аминоконца к карбоксильному концу расположены в следующем порядке: ГК1, СЭК1, ГК2, СЭК2, ГК3, СЭК3, ГК4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, в том числе с различными клетками иммунной системы (например, эффекторными клетками) и первым компонентом (С1с|) классической системы комплемента.
Понятие антигенсвязывающий участок антитела (или просто антигенный центр (область детерминанты)) в контексте настоящего описания относится к белковой последовательности, которая связывается с мишенью, например, представляет собой один или несколько СЭК. Понятие относится, например, к полноразмерному антителу, одному или нескольким фрагментам антитела и/или СЭК на каркасе не иммуноглобулинового типа, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, ΌΚΚ1). Антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться посредством фрагментов полноразмерного антитела. Примерами связывающихся фрагментов, подпадающих под понятие антигенсвязывающий участок антитела, являются ГаЬ-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из Уъ-, УН-, Съ- и СН1-доменов; Г(аЬ)2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, состоящий из двух ГаЬ-фрагментов, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; Гб-фрагмент, состоящий из УН- и СН1-доменов; Γν-фрагмент, состоящий из Уъ- и УН-доменов одного плеча антитела; бАЬ-фрагмент (^агб и др., №Шге. 341, 1989, с. 544-546), который состоит из УН-домена; и выделенный гипервариабельный участок (СЭК).
В контексте настоящего описания понятие антиген или эпитоп используют взаимозаменяемо, и они относятся к полипептидной последовательности на белке-мишени, которая специфически распознается антигенсвязывающим участком антитела, фрагмента антитела или их эквивалентами. Антиген или эпитоп содержат по меньшей мере 6 аминокислот, которые могут быть смежными или несмежными в последовательности-мишени. Конформационный эпитоп может содержать несмежные остатки и необязательно может содержать встречающиеся в естественных условиях или синтетическим путем модифицированные аминокислотные остатки. Модификации остатков включают (но не ограничиваясь ими): фосфорилирование, гликозилирование, ПЭГилирование, убикитинизацию, фуранилизирование и т.п.
Кроме того, хотя два домена Γν-фрагмента, т.е. Уь и УН, кодируются различными генами, их можно соединять с помощью методов рекомбинации синтетическим линкером, который позволяет создавать из них одну белковую цепь, в которой пара Уь- и УН-областей формирует одновалентные молекулы, известные под названием одноцепочечный Γν-фрагмент (5сГу) (см., например, Впб и др., 8с1епсе 242, 1988, с. 423-426; Нийоп и др., Ргос. №111. Асаб. 8сг 85, 1988, с. 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также подпадают под понятие антигенсвязывающий участок антитела. Указанные фрагменты антитела получают с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу в отношении возможности их применения, аналогичного применению интактных антител.
Как указано в настоящем описании, консервативные варианты включают идентифицированные аминокислотные остатки в любой последовательности, прежде всего консервативные замены, которые хорошо известны обычному специалисту в области конструирования белков.
Понятие выделенное антитело в контексте настоящего описания относится к антителу, которое практически свободно от других антител с другой антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с ΌΚΚ1, практически свободно от антител, которые специфически связываются с антигенами, отличными от ΌΚΚ1). Однако выделенное антитело, которое специфически связывается с ΌΚΚ1, может давать перекрестную реакцию с другими антигенами, такими как молекулы ΌΚΚ1 из других видов или представители другого семейства, такого как ΌΚΚ4, или родственные паралоги. Кроме того, выделенное антитело может быть практически свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ.
Подразумевается, что понятие человеческое антитело в контексте настоящего описания относится к антителам, несущим вариабельные области, в которых как каркасные, так и СЭК-участки выведены из последовательностей человеческого происхождения. Кроме того, если антитело содержит константную
- 9 015538 область, то константную область также выводят из таких человеческих последовательностей, например из последовательностей человеческой зародышевой линии или мутантных версий последовательностей человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, могут включать также аминокислотные остатки, которые не кодируются человеческими последовательностями (например, в результате мутаций, интродуцированных путем случайного или сайт-направленного мутагенеза ίη νίΐτο или соматической мутации ίη νΐνο). Однако не подразумевается, что понятие человеческое антитело в контексте настоящего описания относится к антителам, в которых последовательности СОЯ, выведенные из зародышевой линии других млекопитающих, таких как мышь, трансплантированы в человеческие последовательности каркасных участков. Понятие человеческое моноклональное антитело относится к антителам, которые обладают одинаковой специфичностью связывания, имеют вариабельные области, в которых как каркасные участки, так и СПК-участки выводят из человеческих последовательностей. В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональные антитела получают с помощью гибридомы, которая включает В-клетку, полученную из трансгенного животного кроме человека, например трансгенной мыши, в геноме которой содержится трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитый с иммортализованной клеткой.
В контексте настоящего описания понятие гуманизированные антитела означает, что по меньшей мере часть каркасных участков иммуноглобулина выведена из человеческих последовательностей иммуноглобулина. Гуманизированные антитела представляют собой антитела, СПК-последовательности которых выведены из зародышевой линии других видов, прежде всего видов млекопитающих, например мыши, которые трансплантированы в последовательности человеческих каркасных участков. Примером такой технологии является технология гуманизации, разработанная фирмой РОЬ.
В контексте настоящего описания понятие гуманированные антитела относится к антителам, которые связываются с тем же эпитопом, но отличаются их последовательностью. Примером такой технологии является получение гуманированных антител с помощью технологии гуманирования, разработанной фирмой Ка1оЬю8, при использовании которой антигенсвязывающий участок получают, например, с помощью мутации, а не с помощью консервативных аминокислотных замен.
Понятие рекомбинантное человеческое антитело в контексте настоящего описания относится ко всем человеческим антителам, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью методов рекомбинации, например к антителам, выделенным из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным благодаря интродукции генов человеческого иммуноглобулина, или полученным из гибридомы, к антителам, выделенным из клетки-хозяина, трансформированного с целью экспрессии человеческого антитела, например, с использованием трансфектомы, к антителам, выделенным из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител, и к антителам, полученным, экспрессированным, созданным или выделенным любыми другими путями, которые включают сплайсинг последовательности всего гена человеческого иммуноглобулина или его части посредством лигирования с другими последовательностями ДНК. Указанные рекомбинантные человеческие антитела несут вариабельные области, в которых каркасные и С'ПК-участки выводят из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения указанные рекомбинантные человеческие антитела можно подвергать мутагенезу ίη νίίτο (или, когда для получения человеческих последовательностей 1д используют трансгенных животных, соматическому мутагенезу ίη νΐνο), и в результате аминокислотные последовательности νΗ- и Уьобластей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые хотя и выведены и являются родственными последовательностям νΗ и ν£ человеческой зародышевой линии, могут не встречаться в естественных условиях в популяции антител человеческой зародышевой линии ίη νΐνο.
В контексте настоящего описания понятие изотип относится к классу антител (например, 1дА, Ι§Ό, 1дМ, 1дЕ, 1дС. такому как 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4), которые кодируются генами константной области тяжелой цепи.
Фразы антитело, распознающее антиген и антитело, специфическое в отношении антигена в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо с понятием антитело, которое специфически связывается с антигеном. В контексте настоящего описания антитело, которое специфически связывается с человеческим ΌΚΚ1, означает антитело, связывание которого с человеческим ΌΚΚ1 характеризуется значением Кс, составляющим 5х10-9 М или менее, 2х10-9 М или менее либо 1 х 10-10 М или менее. Антитело, которое дает перекрестную реакцию с антигеном, отличным от человеческого ΌΚΚ1, означает антитело, связывание которого с антигеном характеризуется значением Κο, составляющим 5х10-8 М или менее, 5х10-9 М или менее либо 2х10-9 М или менее. Антитело, которое не дает перекрестную реакцию с конкретным антигеном, означает антитело, связывание которого с антигеном характеризуется значением Κο, составляющим 1,5х 10-8 М или более, или значением Κο, составляющим 5-10х 10-8 М или 1х 10-7 М или более. В конкретных вариантах осуществления изобретения те антитела, которые не дают перекрестную реакцию с антигеном, представляют собой антитела, которые характеризуются практически не выявляемым связыванием с указанными белками при оценке с помощью стандартных анализов связывания.
- 10 015538
В контексте настоящего описания антитело, которое ингибирует связывание ΌΚΚ1 с рецептором клеточной поверхности, таким как ΒΚΡ, Ρζ или Кгт, относится к антителу, ингибирование которым связывания ΌΚΚ1 с рецептором, характеризуется значением Кс, составляющим 1 нМ или менее, 0,75 нМ или менее, 0,5 нМ или менее либо 0,25 нМ или менее.
В контексте настоящего описания понятие остеолиз относится к снижению плотности костной ткани, что является результатом различных механизмов действия, включая, например, пониженную активность остеобластов, повышенную активность остеокластов. Таким образом, остеолиз обусловлен механизмами, которые в целом воздействуют на плотность минерального вещества костной ткани. В контексте настоящего описания подразумевается, что антитело, которое ингибирует остеолитическую активность, относится к антителу, которое ингибирует снижение плотности костной ткани либо путем усиления формирования костной ткани, либо путем блокирования резорбции костной ткани.
Подразумевается, что понятие Кажос или Ка в контексте настоящего описания относится к скорости ассоциации взаимодействия конкретного антитела-антигена, а понятие КЛ8 или К,| в контексте настоящего описания относится к скорости диссоциации взаимодействия конкретного антителаантигена. В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие Кс относится к константе диссоциации, которую получают на основе соотношения К,| и Ка (т.е. К4/Ка) и выражают в молярной концентрации (М). Значения Кс для антител можно определять с помощью методов, хорошо известных в данной области. Метод определения значения Кс антитела представляет собой метод, основанный на резонансе поверхностного плазмона, РМАТ, или метод, основанный на применении биосенсорной системы, такой как система В1асоге®.
В контексте настоящего описания понятие аффинность относится к силе взаимодействия между антителом и антигеном в индивидуальных антигенных сайтах. В каждом антигенном сайте вариабельная область плеча антитела взаимодействует через слабые нековалентные силы с антигеном в многочисленных сайтах; чем больше взаимодействий, тем сильнее аффинность.
В контексте настоящего описания понятие авидность относится к информативному критерию общей стабильности или силе комплекса антитело-антиген. Она контролируется тремя основными факторами: аффинностью антитела к эпитопу; валентностью и антигена, и антитела; и структурной организацией взаимодействующих участков. В конечном счете эти факторы определяют специфичность антитела, т.е. вероятность того, что конкретное антитело связывается с определенным антигенным эпитопом.
Для получения зонда, обладающего большей авидностью, можно конструировать димерный конъюгат (две молекулы 1^1-1, сшитые с РАС8-маркером), создавая тем самым обладающие низкой аффинностью взаимодействия (как в случае зародышевой линии антитела), которые легче выявлять с помощью РАС8. Кроме того, другие методы повышения авидности антигенного связывания предусматривают создание димеров или мультимеров любой из представленных в настоящем описании содержащих фибронектин конструкций антител к ЭКК1 или ИКК4. Указанные мультимеры можно создавать, осуществляя ковалентное связывание между индивидуальными модулями, например, путем имитации встречающегося в естественных условиях связывания С-конца с Ν-концом или путем имитации димеров антител, которые объединяются друг с другом через их константные области. Связи, создаваемые на границе раздела Рс/Рс, могут быть ковалентными или нековалентными. Кроме того, в гибридах ИКК1 или ИКК4 можно использовать партнеров для димеризации или мультимеризации, отличных от Рс, для создания структур более высокого порядка.
В контексте настоящего описания понятие перекрестная реактивность относится к антителу или популяции антител, которые связываются с эпитопами на других антигенах. Это может быть обусловлено либо низкой авидностью или низкой специфичностью, либо наличием множества различных антигенов, которые имеют одинаковые или очень сходные эпитопы. Иногда перекрестная реактивность является желательной, когда существует потребность в общем связывании с родственной группой антигенов или при попытке осуществления мечения скрещивающихся видов (кросс-видов), когда последовательность антигенного эпитопа в процессе эволюции не приобретает высокую консервативность.
В контексте настоящего описания понятие высокая аффинность или высокая специфичность касательно антитела изотипа 1дС относится к антителу, для которого значение Кс в отношении антигенамишени составляет 10-8 М или менее, 10-9 М или менее либо 10-10 М или менее. Однако высокая аффинность связывания может быть иной для других изотипов антител.
Например, высокая аффинность связывания касательно изотипа 1дМ относится к антителу, для которого значение Кс составляет 10-7 М или менее или 10-8 М или менее.
В контексте настоящего описания понятие индивидуум относится к любому человеку или животному кроме человека.
Понятие животное кроме человека включает всех позвоночных животных, например млекопитающих и животных, не относящихся к млекопитающим, таких как приматы кроме человека, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рептилии и т. д.
В контексте настоящего описания понятие оптимизированная означает, что нуклеотидная последовательность изменена в отношении кодирования аминокислотной последовательности с помощью кодонов, предпочтительных для продуктивных клеток или организмов, и/или нуклеотидная последователь
- 11 015538 ность изменена для удаления скрытых донорских или акцепторных сайтов сплайсинга. Таблицы оптимизированных кодонов хорошо известны в данной области для широкого разнообразия видов. Последовательности донорских или акцепторных сайтов сплайсинга также известны в данной области, а скрытые сайты сплайсинга можно идентифицировать, например, анализируя данные о транскрипции или экспрессии. Продуктивные клетки включают (но не ограничиваясь ими) прокариотические клетки, такие как, например, клетки бакуловирусов или бактерий (Ε.οοίί). или эукариотические клетки, например клетку дрожжей (например, РюЫа), клетку яичника китайского хомячка (СНО), клетку миеломы или человеческую клетку. Оптимизированную нуклеотидную последовательность создают так, чтобы она полностью или максимально возможно сохраняла способность кодировать аминокислотную последовательность и количество остатков, которые кодируются первоначально исходной нуклеотидной последовательностью, которую называют также родительской последовательностью. В контексте настоящего описания оптимизированные последовательности создают так, чтобы они имели кодоны, предпочтительные для продуктивных клеток, однако предусматривается также оптимизированная экспрессия этих последовательностей в других эукариотических и прокариотических клетках. Аминокислотные последовательности, кодируемые оптимизированными нуклеотидными последовательностями, необязательно обозначают также как оптимизированные.
В родственных вариантах осуществления изобретения полипептидные последовательности композиций нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4, предлагаемых в изобретении, и нуклеотиды, которые их кодируют, предпочтительно оптимизируют для производства и клинического применения. Характеристики, которые можно оптимизировать для клинического применения, включают (но не ограничиваясь только ими), например, время полужизни, фармакокинетические (ФК) параметры, антигенность, эффекторную функцию, клиренс ЕеЕп и ответ пациента, включая антителообусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (АЭСС) или комплементзависимую цитотоксичность (СЭС).
В контексте настоящего описания ассоциированные с ΌΚΚ1 болезни или ассоциированные с ΌΚΚ4 болезни включают (но не ограничиваясь только ими) остеолитические повреждения, прежде всего остеолитические повреждения, ассоциированные с миеломой, прежде всего множественной миеломой, или раком костной ткани, молочной железы, ободочной кишки, меланоцитов, гепатоцитов, эпителия, пищевода, головного мозга, легкого, предстательной железы или поджелудочной железы, или его метастазами; потерей костной ткани, ассоциированной с трансплантацией. Другие заболевания или нарушения представляют собой (но не ограничиваясь только ими), например, остеосаркому, рак предстательной железы, печеночно-клеточную карциному (НСС), миелому, включая множественную миелому, диабет, ожирение, мышечную атрофию, болезнь Альцгеймера, остеопороз, остеопению, ревматизм, колит и/или нежелательную потерю волос.
В контексте настоящего описания лечение представляет собой вмешательство, осуществляемое с целью предупреждения развития или изменения патологии нарушения. Таким образом, понятие лечение относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Пациенты, которые нуждаются в лечении, включают пациентов, которые уже имеют нарушение, а также пациентов, у которых нарушение можно предупреждать. При лечении опухоли (например, при раке) терапевтический агент может непосредственно снижать патологию опухолевых клеток или придавать опухолевым клеткам более высокую чувствительность к лечению другими терапевтическими агентами, например облучением и/или химиотерапией. Патология рака включает все явления, которые подвергают риску здоровье пациента. Она включает (но не ограничиваясь только ими) аномальный или неконтролируемый рост клеток, метастазы, воздействие на нормальную функцию соседних клеток, аномальные уровни высвобождение цитокинов или других секретируемых продуктов, подавление или ухудшение воспалительного или иммунологического ответа и т.д.
Лечение пациентов, страдающих клиническими, биохимическими, радиологическими или субъективными симптомами болезни, такой как остеолиз, может представлять собой облегчение некоторых или всех указанных симптомов или снижение предрасположенности к заболеванию.
В целом композиция нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4, предлагаемая в изобретении, обладает способностью предупреждать, лечить или облегчать связанные с \Уп1 заболевания, ассоциированные с ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 или с ними обоими, но не болезни, ассоциированные с ΌΚΚ2, ΌΚΚ3 или другими модуляторами \Уп1-пути.
В следующих подразделах различные объекты изобретения описаны более подробно.
\Уп1-путь представляет собой основной регулятор дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (М8С) в остеобласты. Он является важным фактором выживания для активных остеобластов. О1сккорГ-1 (ΌΚΚ1) представляет собой антагонист Уп1-пути, который главным образом экспрессируется в костной ткани взрослых особей, и его повышающая регуляция характерна для страдающих миеломой пациентов с остеолитическими повреждениями. Нейтрализующие антитела к ΌΚΚ1/4 являются истинным анаболическим агентом, действие которого проявляется в повышении остеобластической активности с одновременным снижением остеокластической активности. В отличие от современных лекарственных средств, таких как РТН (гормон околощитовидных желез), которые поступают в продажу в качестве анаболических агентов, они действительно повышают уровень маркеров, ассоциированных как с остео
- 12 015538 бластами, так и с остеокластами.
В изобретении предложены поликлональные и моноклональные антитела, отобранные по признаку связывания с ΌΚΚ1. Аффинность связывания предпочтительного антитела с человеческим ΌΚΚ1 составляет менее 10 пМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к ΌΚΚ1 обладают перекрестной реактивностью с ΌΚΚ4 (Κ,ι ~300 пМ), но не с ΌΚΚ2 (по данным анализа аффинности).
Путем картирования установлено, что предпочтительный эпитоп антитела к ΌΚΚ1 или антитела к ΌΚΚ4 локализован в домене Су§-2 (ак 189-263), который, как известно, ответствен за связывание и с ЬКР6, и с 1<гсшсп. В одном из вариантов осуществления изобретения эпитоп включает по меньшей мере 6 и максимум 30 аминокислотных остатков из домена Су§-2 полипептида ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4. В конкретном варианте осуществления изобретения эпитоп включает участок, состоящий по меньшей мере из 6 смежных аминокислот. В других вариантах осуществления изобретения предпочтительный сайт связывания является нелинейным, т. е. включает несмежные аминокислотные остатки. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывание зависит от Ν-гликозилирования. Предсказанным является только один сайт Ν-гликозилирования на остатке 256 в домене Су§-2.
Согласно настоящему изобретению нейтрализующее антитело к ΌΚΚ1 блокирует взаимодействие ΌΚΚ1 с ЬКРб, что доказано как с помощью ЕЫ§А, так и с помощью анализа связывания с клеточной поверхностью. Как и ожидалось, оно эффективно нейтрализует подавляющую νηί активность ΌΚΚ1, что характеризуется значением ЕС50 ниже 1 нМ ίη νίίτο.
В качестве модели ίη νίίτο дифференцировки остеобластов мышиные клетки линии 10Т1/2 обрабатывают \У1'И3Л для стимуляции секреции щелочной фосфатазы (АР), маркера активности остеобластов. ΌΚΚ1 блокирует производство АР при использовании этой модели, а антитела, предлагаемые в изобретении, полностью аннулируют указанное ингибирование.
В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, обладает линейно зависящими от дозы фармакокинетическими характеристиками (АИС) в организме мышей, при этом зависящее от дозы время полужизни составляет для мышей 35-96 ч при использовании дозы 20200 мкг/мышь.
При использовании интратибиальной (внутри большеберцовой кости) модели метастазов остеолитической опухоли предстательной железы установлено, что антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют индуцируемое опухолью повреждение кортикального слоя кости. При оценке воздействия на трабекулярную кость при использовании этой модели были получены неожиданные результаты, заключающиеся в том, что и имплантаты опухоли, и имплантаты-имитаторы вызывали механическое повреждение кости, что приводило к первоначальному разрастанию переплетенной костной ткани с последующем ее ремоделированием, приводящим к снижению видимого объема кости. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, снижает производство переплетенной костной ткани в большеберцовой кости как с имплантами опухоли, так и с имплантами-имитаторами и ингибирует снижение объема опухоли при ремоделировании.
В родственных вариантах осуществления изобретения изменения маркеров костной ткани (остеокальцин, 8ΚΑΝΚΕ, ОРС, АР, ТКАР) применяют для демонстрации клинических воздействий антител, предлагаемых в изобретении, на связанные с костной тканью заболевания и для предсказания клинических результатов лечения с использованием фармацевтически эффективных уровней нейтрализующих антител к ΌΚΚ1, предлагаемых в изобретении. 1<гш связывается с ΌΚΚ примерно в той же области, что и ЕКР. 1<гш необходим для ингибирования передачи сигнала νηί посредством взаимодействия ΌΚΚ с ЕКР. Комплекс Κηη-ΟΚΚ-Ε/Р должен быть интернализован для деактивации νηί-пути.
Композиция нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4, предлагаемая в изобретении, предпочтительно связывается с ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4, блокируя их взаимодействие с ЬКР и/или 1<гш. нейтрализуя тем самым воздействие ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 на путь передачи сигнала νηί. Реактивация νηί-пути происходит только при ограничении уровня ΌΚΚ1 и/или ΌΚΚ4.
Стандартные анализы, предназначенные для оценки способности к связыванию антител с ΌΚΚ1 различных видов, известны в данной области, и они включают, например, ЕЫ§А, Вестерн-блоттинг и РИА. Приемлемые анализы описаны подробно в примерах. Кинетические характеристики связывания (например, аффинность к связыванию) антител можно также оценивать стандартными анализами, известными в данной области, такими как В1асоге-анализ, ВюУсгЕ §ЕТ-анализ, ЕМАТ, анализ хемилюминесценции и/или §РК-анализы, которые позволяют оценивать ингибирование сигнала или анализировать высвобождение. Анализы, предназначенные для оценки воздействия антител на функциональные свойства ΌΚΚ1, более подробно описаны в примерах.
Таким образом, подразумевается, что способность антитела ингибировать одно или несколько указанных функциональных свойств ΌΚΚ1 (например, биохимическую, иммунохимическую, клеточную, физиологическую или другие виды биологической активности или т. п.) при оценке с помощью методологий, известных в данной области и представленных в настоящем описании, относится к статистически значимому снижению конкретной активности относительно активности, имеющей место в отсутствие антитела (или, например, когда присутствует контрольные антитела или антитело с несоответствующей специфичностью). Антитело, которое ингибирует активность ΌΚΚ1, вызывает статистически значимое
- 13 015538 снижение оцениваемого параметра по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50, 80 или 90%, и в конкретных вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, может ингибировать более чем на 95, 98 или 99% функциональную активность ΌΚΚ1.
Представители Б1сккорГ-семейства.
Правильный костный метаболизм опосредуется сложной сетью регуляторных путей и взаимосвязей между остеобластами, остеокластами и окружающей стромой. Нарушение баланса этих регуляторных механизмов обусловливает остеолитические состояния, такие как остеопороз, индуцируемые опухолью остеолитические повреждения, потеря костной ткани, индуцируемая почечными и печеночными трансплантатами, потеря костной ткани, индуцируемая противогормональной химиотерапией. Эти состояния могут сопровождаться серьезными симптомами, включая костную боль, переломы, компрессию позвоночника и снижение подвижности. Большинство разрешенных к применения или находящихся в настоящее время на стадии клинических исследований путей лечения оказывают воздействие главным образом путем ингибирования функции остеокластов. Например, бифосфонаты, такие как золендроновая кислота (ΖοιηοΙα). являются в настоящее время стандартными средствами ухода и лечения, и их действие заключается в ингибировании функции и выживания остеокластов. Хотя бифосфонаты в целом являются эффективными, у некоторых пациентов не достигается выраженного ответа или они прекращают применение этих лекарственных средств из-за токсичности для почек или остеонекроза (Магко^!!/, 2003, Яидд1его, 2004). Кроме того, известно большое количество проходящих клиническое испытание лекарственных препаратов, мишенью которых является развитие остеокластов, например, таких препаратов, как нейтрализующие антитела к ЯАКХЬ и М-С8Б, или функция остеокластов, например, таких препаратов, как ингибиторы катепсина Κ.
Стимуляция активности остеокластов представляет собой новый механизм лечения остеолитического заболевания. νηΐ-путь играет основную роль в дифференцировке и активности остеобластов, причем антагонисты из семейства ЭюккорГ (ΌΚΚ) идентифицированы прежде всего в качестве ключевых регуляторов этого процесса ίη νίΙΐΌ (см. обзор ΚτίδΗηαη, 2006). νηΐ является имеющим решающее значение фактором выживания и дифферецировки остеобластов ίη νίΙΐΌ. Клиническое подтверждение роли νηΐ-пути можно получать путем мутаций корецептора νηΐ ЬЯР5. Инактивирующие мутации ЬЯР5 приводят к остеопорозному-псевдоглиомному синдрому (0РР0) (Άί, 2005), в то время как активирующие мутации приводят к созданию большой костной массы (Воубещ 2002). Обнаружено, что указанные активирующие мутации находятся во внеклеточном домене и, как установлено, нарушают связывание антагонистов νηΐ с представителями семейства БюккорГ (ΌΚΚ).
Опубликованы данные о сверхэкспрессии ΩΚΚ1 в клетках миеломы у пациентов с повреждениями кости, но она не выявлена в здоровых плазматических клетках или плазматических клетках пациентов, не страдающих повреждениями кости (Τίαη, 2004; РоШои, 2006). Указанная сверхэкспрессия ΩΚΚ1 в клетках миеломы может нарушать нормальный баланс между остеобластами и остеокластами, блокируя дифференцирвку остеобластов и усиливая в результате этого резорбцию кости. Кроме того, установлено, что применение некоторых противоопухолевых средств лечения миеломы, например применение дексаметазона, приводит к повышающей регуляции ΩΚΚ1 (0йηака, 2004). Таким образом, нейтрализующее антитело к ΩΚΚ1 должно приводить к реактивации νηΐ-пути при остеолитических повреждениях, не оказывая воздействия на передачу сигнала νηΐ в других тканях, в которых уровни ΩΚΚ1 относительно низки или в которых основную роль играют другие антагонисты. Как установлено, у взрослых особей высокий уровень экспрессии ΩΚΚ1 происходит только в кости (Ь1, 2006), это позволяет предположить, что ΩΚΚ1 играет основную роль в регуляции метаболизма костной ткани у взрослых.
У трансгенных мышей, у которых происходит сверэкспрессия νηΐ1 в ткани молочной железы, развиваются карциномы молочной железы (Т8икато1о, 1988), а у ~90% людей, страдающих колоректальными видами рака, обнаружена мутация либо в АРС, либо в β-катенине, двух цитоплазматических компонентах νηΐ-пути (Могт, 1997; Яо^ащ 2000). Эти данные позволяют выдвинуть концепцию о том, что активация νηΐ-пути может приводить к повышенному риску возникновения или развития опухолей. Кроме того, обнаружена понижающая регуляция ΩΚΚ при колоректальных опухолях и маланомах, это позволяет предположить, что они могут играть роль в подавлении опухолей.
К полипептидам БЕХ, предлагаемым в изобретении, относятся ΩΚΚ1 (8ЕО 1Б N0: 1) и ΩΚΚ4 (8ЕО 1Б N0: 124), а также ΩΚΚ2 (8Еф 1Б N0: 122) и ΩΚΚ3 (8Еф 1Б N0: 123). Представители семейства ΩΚΚ несут два СУ8-домена (СУ81 и СУ82), представленных в табл. А далее. Белки ΩΚΚ содержат кислотный ^концевой сигнальный пептид, два СУ8-домена, содержащих кластеры остатков цистеина, разделенных дивергентной линкерной областью, и потенциальный С-концевой сайт N гликозилирования. СУ82-домен в ΩΚΚ4 обладает липидсвязывающей функцией и может облегчать взаимодействие νΗΤ/ΩΚΕ на плазматической мембране (0М1М, рег. номер 605417).
- 14 015538
Таблица А
Перечень представителей семейства ΌΚΚ1
ЫЭКК1 11РКК2 ПРККЗ ЬРКК4
МОКЬСАТЬЬС ЬЬЬАААУРТА РАРАРТАТЗА РУКРВРАЬЗУ РОЕЕАТШЕМ
11РКК1
11РКК2 ЬРККЗ 11РКК4
100 -Μ ΜΑΑΘΑΑΟΑΤΚ УРУАМУАААЬ 06НРЬЪСУ5А ТЬНЗУЬМЗИА -М ААЬМНЗКЮЗЗ ССЬЪЫЛАУЬ ...-МУЕЗЗО ΙΟ33ΕΑΚΡΝ3 РКЕУЕЕЬМЕР ТОНКРЕЗАУЕ ΕΜΕΆΕΕΆΆΑΚ АЗЗЕУНЬАЫЬ ΡΡ8ΥΗΝΕΤΝΤ
ЬРКК1
ЬРКК2 ЬРККЗ
ПРКК4
101
ХКЫЬРРРЬВВ
ΙΚ3...зьсо ΡΤΚνΟΝΝΤΙΗ ------МУАА
АА6НРВЗАУЗ ЕТ..РСОААЫ УНВЕ1НК1ТЫ УЬЬВЬЗНЬСЗ
ΑΆΡβΙΙ,ΥΡβ. взас.муосъ №тоомурзе РЬОАЬУЬРРЫ
..ΟΝΚΥ0ΤΙΡ ΑΓ60ΞΚΚΒΚΝ ТУХТЗУСРЕЕ Ы1ЙЗ£АРЬНС
150 РОЛЕЙ РСЗЗР
ΝΥΟΡΥ
ΙΛ30ΆΥ
ОР.Р.5Н ЗОНЕ
АККОЗ ;рСЬ5Е
151
СУ51
200
11РКК1 ПРКК2 ПРККЗ ЫЖК4
ЕЕССТРЕУСА ЗРТЙОСРАОУ ОЮЬАСНККК КЕСМЙНАМСС ΡΒΝΥΟΚΝΟΙΟ
КЕСЕУСЕУСН ЗРНОВЗЗА. ..СМУСЕККК ККСНКРВМСС РЗТЕСИИСХС
ЕРСОРЗМУСО ~
РАЗНО УТСОРСЕООК МЬСТКРЗЕСС СРОЬСУНСНС
ТРСИТЙКРСЬ ОРКР....ЕК РРСАТСКОЬЙ ВйСОКРАМСС РВТЬСУНРУС
СУ8 1
ИРКК1
ЬЮКК2 ЬРККЗ
11РКК4
201 250
Ц53Р0М..НР ΕΟΕΙ...ΕΕΤ ΙΤΕ3Ρ0Ν0Η. ЗТЬР.ОУЗКВ ТТЬЗЗКМУНТ Х^УТЕЗ..1Ь ТРН1РАЬРОТ ΕΗΕΡΕΝΗΟΗΥ ЗПНРЬСИОЬШ СКРНТКМЗН1 ’А..................... Т
ЕРАТРХЬ ЕНСЬРЕОРСТ .НАЕСТТСН. . РУОЕИОРКР. ΚΡ3ΙΚΚ300Ε
СУЗ 2
МЗКК1
ЫЖК2 ИРККЗ 11РКК4
251
КО0ЕОЗУ|СЬЙ ЗЗРСАЗЗЪСС А. .ρήρηξκι скруькевду сткнквк КСНЕОРРЕЬР. ЗЗРСХЕВРСС А. .КНРИТК1 СКРУЬНОСЕУ СТКрйКК
300
КЙЗМСТ10ΡΝ ОЕРСрРдьСС АРОКаьЪРРУ стрьруёоеь снрразеьър
КС0Е6Е5СЬК ТГРССРаЕСС А..РНРИТК1 СКРУЬЬЕООУ сзвнснк...
ИРКК1 11РКК2 ИРККЗ НРКК4
301
...В.ЗНВЬЕ ХРОЙСУСОЕС ЬЗСВ10КРНН ОАЗЮЗЗЕШТ фЕН
..С.ЗНВЬЕ 1ЮЙСРСАКС ЬЗСКУНКР.А ТУЗЗКАЕЬНУ С0К1·
КРТГУСЗйР
ОКХЕКЬ--________________________________ОРНЗНЗЬУТУ с
,.РТАОАРЕ ХРрЕСРСВРС ЬЪСКЗОЬТЗМ К.ОНАКЬЙУ С
350
СУ8 2
РХТИЕЬЕРРО АЬРВСРСАЗС ЬЬС.
351
400
ИРКК1
ЫЭКК2 ЬРККЗ ИРКК4
0РВЕ1Ы.РКЕ УРРЕУЕУВЗР МЕЕУКОЕРЕР ЬЕКЗЬТЕЕМА ЪВЕРАААААА
401
11РКК1 1ЮКК2 ърккз ИРКК4
ЬЪЭЗЕЕ!
(ЗЕО (5Е0 (ЗЕО (ЗЕО
ХР ш
ΙΡ
ΙΡ
N0: 1) N0:122} N0:123}
N0:124)
Антитела к ΌΚΚ1 и ΌΚΚ4.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, обладают специфичностью в отношении человеческого белка ΌΚΚ. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой нейтрализующее антитело к ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4, действие которого отличается от модификаций ХУт-пути, которые связаны с усилением развития опухолей. ХУп1-путь регулируется сложной сетью внеклеточных лигандов, рецепторов и антагонистов, при этом ΌΚΚ1 является только одним из них. Из-за ограниченной экспрессии ΌΚΚ1 в организме взрослых особей и его более высокой функциональной активности по сравнению с другими антагонистами ХУШ мало вероятно, что нейтрализующее антитело к ΌΚΚ1 может приводить к повсеместной активации передачи сигнала ХУп1 или к онкогенезу. Это предположение дополнительно подтверждено двумя фактами: во-первых, активирующие мутации ЬКР5 (ингибирующие связывание ΌΚΚ) индуцируют фенотип повышенной костной массы, но не приводят к заметному повышению риска развития рака (Мооп, 2004), а у мышей, гетерозиготных по молчащему аллелю ΌΚΚ1, или мышей линии ЭонЫсойдс с пониженными уровнями ΌΚΚ, обнаружен фенотип повышенной костной массы, но отсутствуют сведения о повышенной скорости образования опухолей (МасОопаИ, 2004).
- 15 015538
Антитело к ΌΚΚ1 оказывает позитивное действие на индуцируемое миеломой остеолитическое заболевание, не повышая риск онкогенеза бе ηονο. Следует ожидать, что такое антитело можно применять в сочетании с противоопухолевыми химиотерапевтическими агентами и, по-видимому, с лекарственными средствами, препятствующими резорбции кости, которые ингибируют функцию остеокластов.
Поликлональные антитела.
Антитела, предлагаемые в изобретении, могут представлять собой поликлональные антитела, прежде всего человеческие поликлональные антитела. Поликлональные антитела получают из объединенной сыворотки иммунизированных животных или отобранных людей.
Моноклональные антитела.
Антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно представляют собой человеческие моноклональные антитела, например, выделенные и имеющие охарактеризованную структуру антитела, которые описаны, в частности, в примерах 1-8. Конкретные аминокислотные последовательности УН антител представлены, например, в 8ЕО ΙΌ N0: 2-20. Конкретные аминокислотные последовательности Уъ антител представлены, например, в 8Е0 ΙΌ N0: 21-39.
Аминокислотную последовательность УН антитела можно оптимизировать с целью экспрессии в клетке млекопитающего, такая последовательность представлена, например, в 8Е0 ΙΌ N0: 119. Аминокислотную последовательность У|, антитела можно оптимизировать с целью экспрессии в клетке млекопитающего, такая последовательность представлена, например, в 8Е0 ΙΌ N0: 118. Аналогично этому, последовательности можно оптимизировать для экспрессии, например, в клетках дрожжей, бактерий, китайского хомячка и других клетках, в зависимости от того, какая система экспрессии является предпочтительной для подлежащей оптимизации характерной особенности. Другие антитела, предлагаемые в изобретении, включают мутантные аминокислоты, но при этом СЭЯ-участки идентичны по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% СОЯ-участкам, представленным в указанных выше последовательностях.
Кроме того, родительские нуклеотидные последовательности полноразмерной легкой цепи представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 97-100. Родительские нуклеотидные последовательности полноразмерной тяжелой цепи представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 101-103. Оптимизированные нуклеотидные последовательности полноразмерной легкой цепи, оптимизированные для экспрессии в клетке млекопитающего, представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 104-107. Оптимизированные нуклеотидные последовательности полноразмерной тяжелой цепи, оптимизированные для экспрессии в клетке млекопитающего, представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 108-110. Аминокислотные последовательности полноразмерной легкой цепи, кодируемые оптимизированными нуклеотидными последовательностями легкой цепи, представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 111-114. Аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой цепи, кодируемые оптимизированными нуклеотидными последовательностями тяжелой цепи, представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 115-117. Другие антитела, предлагаемые в изобретении, включают мутантные аминокислоты или нуклеиновые кислоты, но при этом их последовательности идентичны по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% описанным выше последовательностям.
Поскольку каждое их этих антител может связываться с ΌΚΚ1, то последовательности УН, Уъ, полноразмерной легкой цепи и полноразмерной тяжелой цепи (нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности) могут быть смешаны и совмещены (соответствующим образом подобраны друг к другу) для создания других связывающих молекул антител к ΌΚΚ1, предлагаемых в изобретении. Связывание ΌΚΚ1 с указанными смешанными и совмещенными антителами можно оценивать с помощью анализов связывания, которые описаны выше и в примерах (например, ЕЫ8А). Когда указанные цепи смешивают и совмещают, то УН-последовательность из конкретной пары УН/УЪ можно заменять структурно подобной УН-последовательностью. Аналогично этому последовательность полноразмерной тяжелой цепи из конкретной пары полноразмерная легкая цепь/полноразмерная тяжелая цепь можно заменять структурно подобной последовательностью полноразмерной тяжелой цепи. Аналогично этому Уъ-последовательность из конкретной пары УН/УЪ можно заменять структурно схожей Уъпоследовательностью. Аналогично этому последовательность полноразмерной легкой цепи из конкретной пары полноразмерная тяжелая цепь/полноразмерная легкая цепь можно заменять структурно подобной последовательностью полноразмерной легкой цепи. Последовательности УН, Уъ, полноразмерной легкой цепи и полноразмерной тяжелой цепи антител, предлагаемых в настоящем изобретении, наиболее пригодны для смешения и совмещения, поскольку в этих антителах применяют последовательности УН, Уь, полноразмерной легкой цепи и полноразмерной тяжелой цепи, выведенные из одних и тех же последовательностей зародышевой линии, поэтому они обладают структурным сходством.
Таким образом, одним из объектов изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащий УН-область, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 2-20 и 119; и Уъ-область, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей 8Е0 ΙΌ N0: 21-39 и 118; где антитело специфически связывается с ΌΚΚ1.
- 16 015538
Примерами комбинаций тяжелой и легкой цепей являются
УН-область, имеющая аминокислотную последовательность БЕЦ ΙΌ N0: 2, и Уъ-область, имеющая аминокислотную последовательность БЕЦ ΙΌ N0: 21; или
УН-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 3, и Уь-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 22; или
УН-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 4, и Уъ-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 23; или УН-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 5, и Уъ-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 24; или УН-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 6, и Уъ-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 25; или УН-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 7, и Уъ-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 28; или УН-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 8, и Уъ-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 29; или УН-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 9, и Уъ-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 30; или УН-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 10, и Уъ-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 31; или УН-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 11, и Уъ-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 32; или УН-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 12, и Уь-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 33; или УН-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 119, и Уь-область, имеющая БЕЦ ΙΌ N0: 118.
Другим объектом изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащий полноразмерную тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей БЕЦ ΙΌ N0: 115-117; и полноразмерную легкую цепь, аминокислотная последовательность которой выбрана из группы, включающей БЕЦ ΙΌ N0: 111-114.
Так, примерами комбинаций полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи являются соответственно БЕЦ ΙΌ N0: 115 и БЕЦ ΙΌ N0: 111; или БЕЦ ΙΌ N0: 116 и БЕЦ ΙΌ N0: 112; или БЕЦ ΙΌ N0: 117 и БЕЦ ΙΌ N0: 113; или БЕЦ ΙΌ N0: 117 и БЕЦ ΙΌ N0: 114.
Другим объектом изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащий полноразмерную тяжелую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая выбрана из группы, включающей БЕЦ ΙΌ N0: 101-103; и полноразмерную легкую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая выбрана из группы, включающей БЕЦ ΙΌ N0: 97-100.
Так, примерами нуклеотидов, которые кодируют полноразмерные тяжелые и легкие цепи соответственно, которые можно объединять, включают БЕЦ ΙΌ N0: 101 и 97; или БЕЦ ΙΌ N0: 102 и 98; или БЕЦ ΙΌ N0: 103 и 99; или БЕЦ ΙΌ N0: 103 и 100.
Следующим объектом изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, оптимизированные для экспрессии в клетке, которые содержат полноразмерную тяжелую цепь, нуклеотидная последовательность которой выбрана из группы, включающей БЕЦ ΙΌ N0: 108-110; и полноразмерную легкую цепь, нуклеотидная последовательность которой выбрана из группы, включающей БЕЦ ΙΌ N0: 104-107.
Следующим объектом изобретения являются антитела, которые содержат СОКТ, СЭК2 и СЭК3 тяжелой и легкой цепи антител или их комбинации. Аминокислотные последовательности С'ПК1 УН антител представлены в БЕЦ ΙΌ N0: 2-5, 8-11, 20 и 49-56. Аминокислотные последовательности СЭК2 УН антител представлены в БЕЦ ΙΌ N0: 2-20 и 57-64. Аминокислотные последовательности СЭК3 УН антител представлены в БЕЦ ΙΌ N0: 2-20 и 65-72. Аминокислотные последовательности СЭК1 У|. антител представлены в БЕЦ ΙΌ N0: 21-39 и 73-80. Аминокислотные последовательности СЭК2 У|. антител представлены в БЕЦ ΙΌ N0: 21-39 и 81-88. Аминокислотные последовательности СЭК3 У|. антител представлены в БЕЦ ΙΌ N0: 21-39 и 89-96. СПК-участки описывают по системе Кэбота (1<аЬа1 Е.А. и др., Бециепсек οί РгсЛеиъ οί Ιιηιηιιποίοβίοαΐ К-ЦегеМ, 5-ое изд., изд-во и.Б. Эсраг1тсп1 οί НеаПП апб Нитап БеМсек, МН РиЫюайоп N0. 91-3242, 1991).
С учетом того, что каждое из указанных антител может связываться с ΌΚΚ1 и что специфичность к связыванию с антигеном обеспечивается прежде всего СОРТ-, 2- и 3-участками, последовательности СОРТ, 2 и 3 УН и последовательности СОК1, 2 и 3 У|. можно смешивать и совмещать, т.е. можно смешивать и совмещать СОК из различных антител, хотя каждое антитело должно содержать СПКС 2 и 3 УН и С'ПКС 2 и 3 Уъ для создания других направленных против ΌΚΚ1 связывающих молекул, предлагаемых в изобретении. Связывание ΌΚΚ1 с такими смешанными и совмещенными антителами можно тестировать с использованием анализов связывания, которые описаны в примерах (например, ЕЫБА). Когда смешивают и совмещают СПК-последовательности УН, то последовательности С'ПКС СПК2 и/или СПК3 из конкретной последовательности УН следует замещать структурно сходной(ими) СПКпоследовательностью(ями). Аналогично этому, когда СПК-последовательности У|. смешивают и совмещают, то последовательности СОРТ, СПК2 и/или СЭК3 из конкретной последовательности У|. следует замещать структурно сходной(ими) СПК-послудовательностью(ями). Кроме того, последовательности СОК1, СЭК2 и/или СЭК3 из конкретной последовательности УН или У|. можно специфически или произвольно подвергать мутации, создавая антитела, аффинность или характеристики связывания которых можно тестировать. Как должно быть очевидно обычному специалисту в данной области, новые последовательности УН и V можно создавать путем замены одой или нескольких последовательностей СПКучастка УН и/или V,. структурно сходными последовательностями из СОК-последовательностей, описанных для моноклональных антител, предлагаемых в настоящем изобретении.
- 17 015538
Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок содержат ί.ΌΡ1 Унобласти, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 2-5; 8-11, 20 и 49-56; СЭК2 Ун-области, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 2-20 и 57-64; СЭК3 Ун-области, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 2-20 и 65-72; СЭК1 Унобласти. который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы 8ЕЦ ΙΌ N0: 21-39 и 73-80; ί.ΌΡ2 Ун-области, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы 8Е0 ΙΌ N0: 21-39 и 81-88; и СЭК3 Ун-области, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы 8Е0 ΙΌ N0: 21-39 и 89-96, где антитело специфически связывается с ΌΚΚ1.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело состоит из ί.ΌΡ1 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2; СЭК2 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 6; СЭК3 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 7; СЭК1 Уъ-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 21; СЭК2 Уъ-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 22; и СЭК3 Уь-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 23.
В другом варианте осуществления изобретения антитело состоит из ί.ΌΡ1 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 3; СЭК2 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 12; СЭК3 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 13; СЭК1 Уь-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 24; ί.ΌΡ2 Уь-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 25; и СЭК3 Уьобласти, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 26.
В еще одном варианте осуществления изобретения антитело состоит из ί.ΌΡ1 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ПЭ N0: 4; С1ЭК2 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 14; СЭК3 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 15; СЭК1 Уъ-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 27; ί.ΌΡ2 Уъ-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 28; и СЭК3 Уь-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 29.
В следующем варианте осуществления изобретения антитело состоит из СОК! Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 5; СЭК2 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 16; СЭК3 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 17; СЭК1 Уь-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 30; СЭК2 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 31; и СЭК3 Уь-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 32.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело состоит из ί.ΌΚ1 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 8; СЭК2 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 18; СЭК3 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 19; СЭК1 Уъ-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 33; СЭК2 Уъ-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 34; и СЭК3 Уь-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 35.
В другом варианте осуществления изобретения антитело состоит из ί.ΌΚ1 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 9; СЭК2 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 10; СЭК3 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 11; СЭК1 Ун-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 36; ί.ΌΚ2 Уь-области, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 37; и СЭК3 Уьобласти, имеющего последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 38.
Согласно настоящему описанию человеческое антитело содержит вариабельные области тяжелой (Ун) или легкой (Уь) цепи или полноразмерную тяжелую или легкую цепи, которые являются продуктом или выведены из последовательности конкретной зародышевой линии, если вариабельные области или полноразмерные цепи антитела получают из системы, основанной на применении генов иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Для создания таких систем осуществляют иммунизацию трансгенной мыши, несущей человеческие гены иммуноглобулинов, с использованием представляющего интерес антигена или осуществляют скрининг презентируемой фагом библиотеки человеческих генов иммуноглобулинов с использованием представляющего интерес антигена. Человеческое антитело, которое является продуктом или выведено из последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, можно идентифицировать индивидуально путем сравнения аминокислотной последовательности человеческого антитела и аминокислотных последовательностей иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии и отбора последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, которая является наиболее близкой по последовательности (т.е. имеет самый высокий % идентичности) с последовательностью человеческого антитела. Человеческое антитело, которое является продуктом или выведено из конкретной последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, может иметь различия в аминокислотах по сравнению с последовательностью зародышевой линии, например, в результате встречающихся в естественных условиях соматических мутаций или
- 18 015538 преднамеренной интродукции сайт-направленной мутации. Однако аминокислотная последовательность отобранного человеческого антитела, как правило, по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, и содержит аминокислотные остатки, которые идентифицируют, что человеческое антитело является человеческим, при сравнении с аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов зародышевых линий других видов (например, последовательности мышиной зародышевой линии). В определенных случаях аминокислотная последовательность человеческого антитела может быть по меньшей мере на 60, 70, 80, 90 или по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Как правило, человеческое антитело, выведенное из конкретной последовательности человеческой зародышевой линии, должно иметь не более 10 аминокислотных различий по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. В определенных случаях человеческое антитело может иметь не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 аминокислотное различие по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии.
Гомологичные антитела.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, имеет аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой и легкой цепи, нуклеотидные последовательности полноразмерной тяжелой и легкой цепи или вариабельные области тяжелой и легкой цепи, аминокислотные последовательности которых гомологичны аминокислотным последовательностям представленных в настоящем описании антител, и при этом антитела сохраняют требуемые функциональные свойства композиции нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4, предлагаемой в изобретении. Например, в изобретении предложено выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые содержат Ун-область и Уь-область, где Ун-область содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей БЕр ΙΌ N0: 2-20 и 119; Уъ-область содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей БЕр ΙΌ N0: 21-39 и 118; антитело специфически связывается с ΌΚΚ1 и/или ΌΚΚ4, и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело нейтрализует связывание белка ΌΚΚ1 с ЬКР6, Ρζ и/или Игт, или антитело нейтрализует связывание белка ΌΚΚ4 с ЬКР, Ρζ и/или Κηη.
Другим примером изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые содержат полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь, где полноразмерная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей БЕр ΙΌ N0: 115-117; полноразмерная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей БЕр ΙΌ N0: 111-114; антитело специфически связывается с ΌΚΚ1 и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка ΌΚΚ1 с рецептором ΌΚΚ1 или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или уменьшая интенсивность симптомов, облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака.
Другим примером изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые содержат полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь, где полноразмерная тяжелая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей БЕр ΙΌ N0: 101-103; полноразмерная легкая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей БЕр ΙΌ N0: 97-100; антитело специфически связывается с ΌΚΚ1 и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка ΌΚΚ1 с рецептором ΌΚΚ1 или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака.
Другим примером изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, оптимизированные для экспрессии в клетке, которые содержат полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь, где полноразмерная тяжелая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей БЕр ΙΌ N0: 108-110; полноразмерная легкая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последова
- 19 015538 тельности, выбранной из группы, включающей БЕР ΙΌ ΝΟ: 104-107; антитело специфически связывается с ΌΚΚ1 и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка ΌΚΚ1 с рецептором ΌΚΚ1 или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака.
Следующим примером изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, оптимизированные для экспрессии в клетке, которые содержат УН-область и Уь-область, где полноразмерная тяжелая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности БЕР ΙΌ ΝΟ: 121; полноразмерная легкая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности БЕР ΙΌ ΝΟ: 120; антитело специфически связывается с ΌΚΚ1, и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка ΌΚΚ1 с рецептором ΌΚΚ1 или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака.
В различных вариантах осуществления изобретения антитело может обладать одним или несколькими, двумя или более или тремя из описанных выше функциональных свойств. Антитело может представлять собой, например, человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело.
Согласно настоящему описанию процент гомологии двух аминокислотных последовательностей эквивалентен проценту идентичности двух последовательностей. Процент идентичности двух последовательностей является функцией количества идентичных положений в последовательностях (т.е. % гомологии=количество идентичных положений/общее количество положенийх100), принимая во внимание количество брешей и длину каждой бреши, которую необходимо интродуцировать для оптимального сравнительного анализа первичной структуры двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно осуществлять с помощью математического алгоритма, описанного ниже в примерах, которые не ограничивают объем изобретения.
Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определять с помощью алгоритма Е. Меуегк и V. МШег (Сотри!. Арр1. ВюксЕ, 4, 988, с. 11-17), который включен в программу ΑΕ№Ν (версия 2.0), с использованием таблицы взвешенных остатков РАМ120, штрафа за длину бреши 12 и штрафа за брешь 4. Кроме того, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определять с помощью алгоритма №ей1етап и νιιηκΗι (I. Мо1. ΒίοΙ. 48, 1970, с. 444-453), который включен в программу САР, входящую в пакет программ ССС (которая доступна на сайте бйр://тетете.дсд.сот), с использованием матрицы В1о88от 62 или матрицы РАМ250 и веса бреши 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
В другом или дополнительном варианте белковые последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять также в качестве запрашиваемой последовательности при осуществлении поиска в общественных базах данных, например, в отношении идентичности с родственными последовательностями. Такой поиск можно осуществлять с использованием программы ХВЬАБТ (версия 2.0), разработанной А11ксНи1 и др., I. Мо1. Вю1. 215, 1990, с. 403-410. ВЬАБТ-поиск белков можно осуществлять с помощью программы ХВЬАБТ, в которой балл = 50, длина слова = 3, для установления уровня гомологии аминокислотных последовательностей с аминокислотными последовательностями молекул антител, предлагаемых в изобретении. Для создания содержащих бреши линеаризированных последовательностей для целей сравнения можно использовать программу Саррей ВЬАБТ, описанную у А11кс1ш1 и др., Ν^Κκ Ас1йк Кек. 25(17), 1997, с. 3389-3402. При применении программ ВЬАБТ и Саррей ВЬАБТ можно использовать принимаемые по умолчанию параметры, которые применяются в соответствующих программах (например, ХВЬАБТ и ХВЬАБТ) (см. 1Шр://\\л\лу.псЫ.п11п.пй1.доу).
Антитела с консервативными модификациями.
В конкретных вариантах осуществления антитело, предлагаемое в изобретении, имеет УН-область, которая содержит последовательности СЭК.1, СЭК2 и СОКЗ, и Уъ-область, которая содержит последовательности СГОКЬ СЭК2 и СОК3, где одна или нескольких указанных последовательностей СОК представляет собой специфические аминокислотные последовательности, характерные для антител, предлагаемых в настоящем изобретении, или их консервативные модификации, и где антитела сохраняют требуемые функциональные свойства композиции нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4, предлагаемой в изобретении. Таким образом, в изобретении предложено выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, состоящий из УН-области, которая содержит последовательности СПК1, 0ΌΡ2 и СОК3, и Уь-области, которая содержит последовательности СОК1, 0ΌΡ2 и СОК3, где 0ΌΡ1 УНобласти имеет последовательности, содержащие аминокислотные последовательности, которые выбраны из группы, включающей аминокислотные последовательности БЕР ΙΌ ΝΟ: 2-5, 8-11, 20, 49-56 и их кон
- 20 015538 сервативные модификации; СЭК2 ^-области имеет последовательности, содержащие аминокислотные последовательности, которые выбраны из группы, включающей аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2-20, 57-64 и их консервативные модификации; СЭК3 ^-области имеет последовательности, содержащие аминокислотные последовательности, которые выбраны из группы, включающей аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2-20, 65-72 и их консервативные модификации; СЭК1 области имеет последовательности, содержащие аминокислотные последовательности, которые выбраны из группы, включающей аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 21-39, 73-80 и их консервативные модификации; СЭК2 VI-области имеет последовательности, содержащие аминокислотные последовательности, которые выбраны из группы, включающей аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 21-39, 81-88 и их консервативные модификации; СЭК3 ^-области имеет последовательности, содержащие аминокислотные последовательности, которые выбраны из группы, включающей аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 21-39, 89-96 и их консервативные модификации; антитело специфически связывается с ΌΚΚ1; и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка ΌΚΚ1 с рецептором ΌΚΚ1 или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака.
В различных вариантах осуществления изобретения антитело может обладать одним или несколькими, двумя или более или тремя или более из описанных выше функциональных свойств. Антитела могут представлять собой, например, человеческие антитела, гуманизированные антитела или химерные антитела.
В других вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, имеет последовательность полноразмерной тяжелой цепи и последовательность полноразмерной легкой цепи, где одна или несколько из указанных последовательностей имеет специфические аминокислотные последовательности, характерные для представленных в настоящем описании антител или их консервативные модификации, и где антитела сохраняют требуемые функциональные свойства композиции нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4, предлагаемой в изобретении. Таким образом, в изобретении предложено выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, состоящий из полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи, где полноразмерная тяжелая цепь имеет аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 115-117 и их консервативные модификации; и полноразмерная легкая цепь имеет аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 111-114 и их консервативные модификации; антитело специфически связывается с ΌΚΚ1; и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка ΌΚΚ1 с рецептором ΌΚΚ1 или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака.
В различных вариантах осуществления изобретения антитело может обладать одним или несколькими, двумя или более или тремя или более из описанных выше функциональных свойств. Антитела могут представлять собой, например, человеческие антитела, гуманизированные антитела или химерные антитела.
В других вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, оптимизированное для экспрессии в клетке, имеет последовательность ^-области и последовательность ν^ области, где одна или несколько из указанных последовательностей имеют специфические аминокислотные последовательности, характерные для представленных в настоящем описании антител, или их консервативные модификации, и где антитела сохраняют требуемые функциональные свойства композиции нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4, предлагаемой в изобретении. Таким образом, в изобретении предложено выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, состоящий из νΗобласти и ^-области, где ^-область имеет аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 119 и ее консервативные модификации; и ^.-область имеет аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 118 и ее консервативные модификации; антитело специфически связывается с ΌΚΚ1; и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка ΌΚΚ1 с рецептором ΌΚΚ1 или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака.
В различных вариантах осуществления изобретения антитело может обладать одним или несколькими, двумя или более или тремя или более из описанных выше функциональных свойств. Антитела могут представлять собой, например, человеческие антитела, гуманизированные антитела или химерные антитела.
- 21 015538
В контексте настоящего описания понятие консервативные модификации последовательностей относится к аминокислотным модификациям, которые не оказывают существенного влияния или не существенно изменяют характеристики связывания антитела, которое содержит указанную аминокислотную последовательность. Указанные консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления или делеции. Модификации можно интродуцировать в антитело, предлагаемое в изобретении, с помощью стандартных методов, известных в данной области, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредуемый мутагенез.
Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком, который имеет сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков со сходными боковыми цепями известны в данной области. Эти семейства включают аминокислотные остатки с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в СЭК-участках антитела можно заменять на другие аминокислотные остатки из одного и того же семейства боковых цепей, и измененное антитело можно оценивать в отношении сохранения им функции с помощью представленных в настоящем описании функциональных анализов.
Антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и композиция нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4, предлагаемая в изобретении.
Другим вариантом осуществления изобретения являются антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и композиция различных нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4, предлагаемая в изобретении. Такие дополнительные антитела можно идентифицировать по их способности к перекрестной конкуренции (например, способности к статистически значимому конкурентному ингибированию связывания) с другими антителами, предлагаемыми в изобретении, при оценке с помощью стандартных анализов связывания ΌΚΚ1. Способность тестируемого антитела ингибировать связывание антител, предлагаемых в настоящем изобретении, с человеческим ΌΚΚ1 демонстрирует, что тестируемое антитело может конкурировать с антителом за связывание с человеческим ΌΚΚ1; согласно одной из возможных теорий такое антитело может связываться с тем же или родственным (например, структурно подобным или находящимся в пространственной близости) эпитопом на человеческом ΌΚΚ1, что и антитело, с которым оно конкурирует. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело, которое связывается с тем же эпитопом на человеческом ΌΚΚ1, что и антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, представляет собой человеческое моноклональное антитело. Указанные человеческие моноклональные антитела можно получать и выделять согласно описанным в примерах методам.
Верблюжьи и другие состоящие из тяжелых цепей антитела.
Белки антител, полученные из представителей семейства двугорбых и одногорбых верблюдов (Сате1и§ Ьас1папи5 и Са1е1и§ бготабегшк), включая представителей животных Нового Света, таких как различные виды лам (Бата рассок, Бата д1ата и Бата уБийна), охарактеризованы в отношении их размера, структурной комплексности и антигенности в отношении человека. Установлено, что некоторые антитела типа 1дС из этого семейства млекопитающих в естественных условиях лишены легких цепей и поэтому отличаются по структуре от типичной состоящей из четырех цепей четвертичной структуры с двумя тяжелыми и двумя легкими цепями, характерной для антител из организма других животных (см. РСТ/ЕР93/02214 (№О 94/04678, опубликовано 3 марта 1994 г.)).
Участок верблюжьего антитела, представляющий собой небольшую индивидуальную вариабельную область, обозначенную как УНН, можно создавать с помощью генной инженерии с получением небольшого белка, обладающего высокой аффинностью к мишени, что приводит к образованию низкомолекулярного выведенного из антитела белка, обозначенного как верблюжье нанотело (см. Б8 5759808, выданный 2 июня 1998 г.; см. также 81у1етап§ В. и др., Б Вю1. Сйет., 279, 2004, с. 1256-1261; Энтоийп М. и др., ЫаЬиге, 424, 2003, с. 783-788; Р1ексйЬегдег М. и др. Вюсон)ида1е Сйет., 14, 2003, с. 440-448; Сог1ех-Ке1атохо У. и др., Ιηΐ. Б Сапсег, 89, 2002, с. 456-462; и Баи^егеук М. и др., ЕМВО Б, 17, 1998, с. 3512-3520). Созданные библиотеки верблюжьих антител и фрагментов антител доступны на коммерческой основе, например, от фирмы АЬ1упх, Гент, Бельгия. Аналогично другим антителам, полученным из видов кроме человека, аминокислотную последовательность верблюжьего антитела можно изменять рекомбинантно с получением последовательности в большей степени, напоминающей человеческую последовательность, т.е. нанотело можно гуманизировать. Таким образом, естественную низкую антигенность верблюжьих антител для людей можно дополнительно понижать.
Верблюжье нанотело имеет молекулярную массу, составляющую примерно 1/10 от молекулярной массы человеческого 1дС, а физический диаметр белка составляет лишь несколько нанометров. Одной из связанных с малым размером особенностей является способность верблюжьих антител связываться с антигенными сайтами, которые являются функционально незаметными для более крупных белковых ан
- 22 015538 тител, т.е. верблюжьи нанотела можно применять в качестве реагентов, выявляющих антигены, которые остаются скрытыми при использовании классических иммунологических методов, и возможно в качестве терапевтических агентов. Таким образом, другой связанной с малым размером особенностью верблюжьего нанотела, является способность ингибировать связывание со специфическим сайтом в бороздке или узкой расщелине белка-мишени, и поэтому их можно применять в качестве субстанции, более напоминающей по своей функции классическое низкомолекулярное лекарственное средство, чем классическое антитело.
Небольшая молекулярная масса и компактный размер обусловливает также очень высокую термостабильность, стабильность при экстремальных значениях рН и стабильность к протеолитическому расщеплению и низкую антигенность верблюжьих нанотел. Еще одним следствием указанных особенностей является то, что верблюжьи нанотела легко проникают из кровеносной системы в ткани и даже проникают через гематоэнцефалический барьер и их можно применять для лечения заболеваний, поражающих нервную ткань. Нанотитела могут облегчать также транспорт лекарственных средств через гематоэнцефалический барьер (см. заявку на патент США 20040161738, опубликованную 19 августа 2004 г). Эти особенности в сочетании с низкой антигенностью в отношении людей свидетельствуют об их большом терапевтическом потенциале. Кроме того, эти молекулы можно полностью экспрессировать в прокариотических клетках, таких как Е.со11, и экспрессировать в виде слитых белков с бактериофагом, и они являются функционально активными.
Таким образом, отличительным признаком настоящего изобретения является верблюжье антитело или нанотело, обладающее аффинностью к ИКК1. В конкретных вариантах осуществления изобретения верблюжье антитело или нанотело получают в естественных условиях в животном из семейства верблюжьих, т.е. оно продуцируется в организме представителя верблюжьих после иммунизации ИКК1 или его пептидным фрагментом при применении методов, описанных для других антител. В другом варианте нейтрализующее верблюжье антитело к ИКК1/4 конструируют, т.е. получают путем отбора, например, из фаговых дисплейных библиотек соответствующих образом мутированных белком верблюжьих нанотел с помощью метода пэннинга с использованием в качестве мишени ИКК1 и/или ИКК4, как описано в приведенных в настоящем описании примерах. Сконструированные нанотела можно дополнительно усовершенствовать с помощью генной инженерии таким образом, чтобы время из полужизни в реципиенте составляло от 45 мин до 2 недель.
Кроме верблюжьих антител, антитела, состоящие из тяжелых цепей, встречаются в естественных условиях в других животных, включая (но не ограничиваясь только ими), например, определенные виды акул и рыб-собак (см., например, публикацию РСТ XVО 03/014161). Хотя вариабельные области, выведенные из таких антител, состоящих из тяжелых цепей, можно применять согласно изобретению, для применения согласно изобретению и/или для клинического применения на людях предпочтительно осуществляют оптимизацию, гуманизацию, гуманирование и т.п. антител, выведенных из представителей верблюжьих, которые состоят из тяжелых цепей, и/или последовательностей их вариабельных областей
Сконструированные и модифицированные антитела.
Антитело, предлагаемое в изобретении, можно получать с использованием антитела, которое имеет одну или несколько указанных в настоящем описании последовательностей УН и/или Уь, в качестве исходного материала для создания модифицированного антитела, где модифицированное антитело может иметь измененные свойства по сравнению с исходным антителом. Антитело можно создавать путем модификации одного или нескольких остатков в одной или обеих вариабельных областях (т.е. УН и/или Уь), например, в одном или нескольких СИК-участках и/или в одном или нескольких каркасных участках. В дополнительном или альтернативном варианте антитело можно создавать путем модификации остатков в константной(ых) области(ях), например, для изменения эффекторной(ых) функции(ий) антитела.
Для осуществления одного из типов конструирования вариабельной области можно применять трансплантацию СИК. Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями в основном посредством аминокислотных остатков, локализованных в шести гипервариабельных участках (СИК) тяжелой и легкой цепи. По этой причине между аминокислотными остатками в СИК индивидуальных антител имеются более существенные различия, чем между последовательностями, локализованными вне СИК. Поскольку последовательности СИК ответственны за большую часть взаимодействий антитело-антиген, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства конкретных встречающихся в естественных условиях антител, путем конструирования экспрессионных векторов, которые содержат последовательности СИК из конкретного встречающегося в естественных условиях антитела, полученные путем трансплантации в последовательности каркасных участков из других антител с другими свойствами (см., например К1есЬтапп Ь. и др., №1иге 332, 1998, с. 323-327; 1опе§ Р. и др., №11иге. 321, 1986, с. 522-525; Оиееп С. и др., Ргос. №ΐ1. Асай. 8ее. И8А, 86, 1989, с. 10029-10033; И8 5225539 на имя Χνίπ^Γ и И8 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 на имя Онееп с соавторами).
Таким образом, следующим объектом изобретения является выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые содержат последовательности СИК1 вариабельной области тяжелой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2-5, 8-11, 20, 49-56; последовательность СИК2, которые содержат аминокис
- 23 015538 лотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 2-20 и 57-64; последовательности СИЯ3, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 2-20 и 65-72 соответственно; и последовательности СЭЯ1 вариабельной области легкой цепи, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 21-39 и 73-80; последовательность СИЯ2, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 21-39 и 81-88; и последовательности СИЯ3, которые содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 21-39 и 89-96 соответственно. Таким образом, указанные антитела содержат последовательности СОЯ νΗ и Уъ моноклональных антител, кроме того, они могут содержать различные последовательности каркасных участков указанных антител.
Указанные последовательности каркасных участков, которые содержат последовательности генов антител зародышевой линии, можно получать из публичных баз данных ДНК или опубликованных ссылок. Например, последовательности ДНК человеческой зародышевой линии генов вариабельных областей тяжелых и легких цепей можно найти в базе данных последовательностей человеческой зародышевой линии УЬаке (доступной в Интернете на сайте те^^.шгс- сре.сат.ас.ик/уЬаке), а также у 1<аЬа1 Е.А. и др., 8ес.|иепсе5 о£ РгсИеиъ о£ 1ттипо1ощса1 1Шеге51 15-е изд., изд-во И.8. Иерайтеп! о£ НеаИЬ апб Нитап §егуюе8, МН РиЫюайоп №. 91-3242, 1991; ТотНщоп 1.М. и др., 1. £о1. Вю1. 227, 1992, с. 776-798; и Сох РР.Ь. и др., Еиг. 1. 1ттипо1. 24, 1994, с. 827-836; содержание каждой из которых специально включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Примером последовательностей каркасных участков, предназначенных для применения в антителах, предлагаемых в изобретении, являются последовательности, структурно подобные последовательностям каркасных участков, которые входят в отобранные антитела, предлагаемые в изобретении, например, консенсусные последовательности и/или последовательности каркасных участков, которые входят в моноклональные антитела, предлагаемые в изобретении. Последовательности СИЯ1, 2 и 3 УН и последовательности СИЯ1, 2 и 3 Уъ можно трансплантировать в каркасные участки, которые имеют последовательность, идентичную с последовательностью гена иммуноглобулина зародышей линии, из которого выведена последовательность каркасного участка, или последовательности СИЯ можно трансплантировать в каркасные участки, которые содержат одну или несколько мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было установлено, что в определенных случаях целесообразно изменять посредством мутации остатки в каркасных участках для поддержания или повышения способности антитела связываться с антигеном (см., например, И8 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 на имя Цнееп с соавторами).
Другим типом модификации вариабельной области является мутация аминокислотных остатков в СИЯ1, СИЯ2 и/или СИЯ3 УН- и/или Уъ-областей, которая повышает тем самым одну или несколько способностей к связыванию (например, аффинность) представляющего интерес антитела, что называют созреванием аффинности. Для интродукции мутации(й) и воздействия на связывание антитела или на другое представляющее интерес функциональное свойство можно применять сайт-направленный мутагенез или ПЦР-опосредуемый мутагенез, что можно оценивать с помощью анализов ш ν 11го или ш угуо, описанных ниже в примерах. Можно интродуцировать консервативные модификации (указанные выше). Мутации могут представлять собой аминокислотные замены, добавления или делеции. Кроме того, как правило, изменяют не более 1, 2, 3, 4 или 5 остатков в СИЯ-участке.
Таким образом, другим вариантом осуществления изобретения является композиция выделенных нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4 или их антигенсвязывающих участков, которые состоят из УН-области, содержащей СИЯ1 УН-области, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 2-5, 8-11, 20, 49-56 или аминокислотной последовательности с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с 8ЕЦ ГО N0: 2-5, 8-11, 20, 49-56; СИЯ2 УН-области, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 2-20 и 57-64, или аминокислотной последовательности с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с 8ЕЦ ГО N0: 220 и 57-64; СИЯ3 УН-области, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 2-20 и 65-72, или аминокислотной последовательности с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с 8ЕЦ ГО N0: 2-20 и 65-72; СИЯ1 Уь-области, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 21-39 и 73-80, или аминокислотной последовательности с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с 8ЕЦ ГО N0: 21-39 и 73-80; СИЯ2 Уь-области, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 21-39 и 81-88, или аминокислотной последовательности с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с 8ЕЦ ГО N0: 21-39 и 81-88; СИЯ3 Уьобласти, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 21-39 и 89-96, или аминокислотной последовательности с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с 8ЕЦ ГО N0: 21-39 и 89-96.
- 24 015538
К созданным антителам. предлагаемым в изобретении. относятся также антитела. в которых сделаны модификации в остатках каркасных участков в νΗ и/или νΣ. например. с целью улучшения свойств антитела. Как правило. такие модификации каркасных участков осуществляют для снижения иммуногенности антитела. Например. один из подходов представляет собой обратное мутирование одного или нескольких остатков каркасного участка с получением соответствующей последовательности зародышевой линии. Более конкретно. антитело. которое было подвергнуто соматической мутации. может содержать остатки каркасного участка. отличающиеся от последовательности зародышевой линии. из которой выведено антитело. Такие остатки можно идентифицировать путем сравнения последовательностей каркасных участков антитела с последовательностями зародышевой линии. из которой выведено антитело. Для возвращения последовательностей каркасного участка к исходной конфигурации зародышей линии соматические мутации можно подвергать обратному мутированию с получением последовательности зародышевой линии. например. с помощью сайт-направленного мутагенеза или ПЦР-опосредуемого мутагенеза. Такие антитела с обратными мутациями подпадают также под объем настоящего изобретения.
Другой тип модификации каркасного участка включает изменение путем мутации одного или нескольких остатков в каркасном участке или даже в одном или нескольких СЭК-участках для удаления Τклеточных эпитопов с целью снижения потенциальной иммуногенности антитела. Этот подход обозначают также как деиммунизация. и он описан более подробно в опубликованном υδ 20030153043 на имя Сагг с соавторами.
В дополнительном или альтернативном варианте помимо модификаций в каркасных участках или СЭК. антитела. предлагаемые в изобретении. могут включать модификации в Тс-фрагменте. как правило. для изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела. таких как время полужизни в сыворотке. фиксация комплемента. связывание Тс-рецептора и/или антителообусловленная клеточнозависимая цитотоксичность. Кроме того. антитело. предлагаемое в изобретении. можно модифицировать химически (например. к антителу можно присоединять один или несколько химических фрагментов) или можно модифицировать для изменения его гликозилирования. и в этом случае с целью изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела. Каждый из указанных вариантов осуществления изобретения будет дополнительно описан ниже. Нумерация остатков в Тс-фрагменте соответствует ЕИиндексу или нумерации Кэбота.
В одном из вариантов осуществления изобретения модифицируют шарнирную область СН1 так. чтобы изменять. например увеличивать или снижать. количество цистеиновых остатков в шарнирной области. Этот подход описан также в υδ 5677425 на имя Войтег с соавторами. Количество цистеиновых остатков в шарнирной области СН1 изменяют. например. для облегчения сборки легких и тяжелых цепей или для повышения или снижения стабильности антитела.
В другом варианте осуществления изобретения шарнирную область Тс-фрагмента антитела можно изменять с помощью мутации для снижения биологического времени полужизни антитела. Более конкретно. интродуцируют одну или несколько аминокислотных мутаций в область контакта СН2-СН3доменов шарнирной области Тс-фрагмента для ухудшения связывания антитела с протеином Α золотистого стафилококка 8!арйу1ососсу1 (8ρΑ) по сравнению со связыванием нативной шарнирной области Тсфрагмента с δρΑ. Этот подход описан более подробно в υδ 6165745 на имя \Уагй с соавторами.
В другом варианте осуществления изобретения антитело модифицируют для удлинения биологического времени полужизни. При этом возможно применение различных подходов. Например. можно интродуцировать одну или несколько из следующих мутаций: Τ252Τ. Τ254δ. Τ256Τ. описанных в υδ 6277375 на имя \Уагй. В другом варианте для удлинения биологического времени полужизни можно изменять антитело в СН1- или Сь-области путем интродукции связывающегося с рецепторомспасателем эпитопа. полученного из двух петель СН2-домена Тс-фрагмента ΙβΟ. как описано в υδ № 5869046 и 6121022 на имя Ргейа с соавторами.
В других вариантах осуществления изобретения Тс-фрагмент изменяют путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток для изменения эффекторных функций антитела. Например. один или несколько аминокислотных остатков можно заменять на другой аминокислотный остаток так. чтобы у такого антитела изменялась аффинность к эффекторному лиганду. но сохранялась антигенсвязывающая способность родительского антитела. Эффекторный лиганд. аффинность к которому изменяют. может представлять собой. например. Тс-рецептор или Сь-компонент комплемента. Этот подход описан более подробно в υδ № 5624821 и 5648260. оба на имя \Уш1ег с соавторами.
В другом варианте осуществления изобретения один или несколько аминокислотных остатков аминокислотной последовательности можно заменять другим аминокислотным остатком так. чтобы антитело имело измененную способность к С1с.|-связыванию и/или пониженную комплементзависимую цитотоксичность (СЭС) или ее отсутствие. Этот подход описан более подробно в υδ 6194551 на имя Ишоще с соавторами.
В другом варианте осуществления изобретения один или несколько аминокислотных остатков изменяют. изменяя тем самым способность антитела к фиксации комплемента. Этот подход описан также в опубликованной заявке РСТ \У0 94/29351 на имя Войтег с соавторами.
- 25 015538
В еще одном варианте осуществления изобретения Ес-фрагмент модифицируют для повышения способности антитела вызывать антителообусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (АЭСС) и/или для повышения аффинности антитела к Есу-рецептору посредством модификации одной или нескольких аминокислот. Этот подход описан более подробно в опубликованной заявке РСТ νθ 00/42072 на имя Ргейа. Кроме того, были картированы сайты связывания человеческого 1дС1 с ЕсуК1, ЕсуКН, ЕсуКШ и ЕсКп, и описаны варианты с улучшенной способностью к связыванию (см. §Ые1Й5 К.Ь. и др., ί. ΒίοΙ. СИет. 276, 2001, с. 6591-6604).
В следующем варианте осуществления изобретения модифицируют гликозилирование антитела. Например, можно создавать агликозилированное антитело (т.е. антитело, в котором отсутствует гликозилирование). Гликозилирование можно изменять, например, для повышения аффинности антитела к антигену. Такие углеводные модификации можно осуществлять путем, например, изменения одного или нескольких сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Например, можно осуществлять одну или несколько аминокислотных замен, которые приводят к элиминации одного или нескольких сайтов гликозилирования каркасного участка вариабельной области, устраняя тем самым гликозилирование в этом сайте. Указанное агликозилирование может повышать аффинность антитела к антигену. Этот подход описан более подробно в И8 № 5714350 и 6350861 на имя Со с соавторами.
В дополнительном или альтернативном варианте можно создавать антитело с измененным типом гликозилирования, например, гипофукозилированное антитело, которое имеет пониженное количество фукозильных остатков, или антитело с повышенным содержанием разделяющих пополам С1с№1сструктур. Было продемонстрировано, что такие измененные схемы гликозилирования повышают АЭССактивность антител. Указанные углеводные модификации можно осуществлять, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования известны в данной области и их можно применять в качестве клетокхозяев, в которых экспрессируют рекомбинантные антитела, предлагаемые в изобретении, для получения тем самым антител с измененным гликозилированием. Например, в ЕР 1176195 на имя Напд с соавторами описана линия клеток с функционально нарушенным геном ЕИТ8, который кодирует фукозилтрансферазу, в результате чего экспрессируемые в такой клеточной линии антитела характеризуются гипофукозилированием. В опубликованной заявке РСТ νθ 03/035835 на имя Ргейа описан вариант линии СНОклеток, Ьес13-клетки, с пониженной способностью присоединять фукозу к связанным с А§п(297) углеводам, что приводит также к гипофукозилированию антител, экспрессируемых в этой клетке-хозяине (см. также 81не1Й5 К.Ь. и др., 1. ΒίοΙ. СИет. 277, 2002, с. 26733-26740). В опубликованной заявке РСТ νθ 99/54342 на имя Итапа с соавторам, описаны линии клеток, сконструированные для экспрессии модифицирующих гликопротеин гликозилтрансфераз (например, бета(1,4)/-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (СпТ111)), в результате чего антитела, которые экспрессируются в сконструированных линиях клеток, характеризуются повышенным содержанием разделяющих пополам С1с№с-структур, что приводит к повышенной АЭСС-активности антител (см. также Итапа и др., №11. Вю1ес11. 17, 1999, с. 176180).
Другой модификацией антител, подпадающей под объем изобретения, является пэгилирование. Антитело можно пэгилировать, например, для удлинения биологического (например, в сыворотке) времени полужизни антитела. Для пэгилирования антитела, как правило, антитело или его фрагмент подвергают взаимодействию с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное ПЭГ, в условиях, при которых одна или несколько ПЭГ-групп присоединяется к антителу или фрагменту антитела. Пэгилирование можно осуществлять с помощью реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой ПЭГ (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие полиэтиленгликоль относится к любым формам ПЭГ, которые используют для дериватизации других белков, таким как моно(С1-С10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликольмалеимид. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело, подлежащее пэгилированию, представляет собой агликолизированное антитело. Методы пэгилирования белков известны в данной области, и их можно применять к антителам, предлагаемым в изобретении (см., например, ЕР 0154316 на имя Νίδΐιίιηιιη с соавторами и ЕР 0401384 на имя Шпка\уа с соавторами).
Неиммуноглобулиновые каркасы.
Можно применять широкое разнообразие остовов или каркасов антитела/иммуноглобулина при условии, что образующийся полипептид включает по меньшей мере один связывающий участок, который является специфическим для белка-мишени. Такие остовы или каркасы включают пять основных идиотипов человеческих иммуноглобулинов или их фрагментов (например, которые представлены в настоящем описании), и включают иммуноглобулины других видов животных, которые предпочтительно имеют гуманизированные компоненты. Состоящие только из тяжелых цепей антитела, которые идентифицированы в представителях верблюжьих и/или акульих, в этом плане являются особенно интересными. Специалисты в данной области продолжают выявлять и создавать новые остовы, каркасы и фрагменты.
- 26 015538
Один из объектов изобретения относится к созданию антител на неиммуноглобулиновой основе с использованием неиммуноглобулиновых каркасов, в которые можно трансплантировать СОЯ, предлагаемые в изобретении. Можно применять известные неиммуноглобулиновые каркасы или те, которые будут обнаружены в дальнейшем, если они содержат связывающий участок, специфический для белкамишени, последовательность которого представлена в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 или 122. Такие соединения обозначены в контексте настоящего описания как полипептиды, содержащие специфический для мишени связывающий участок. Известные неиммуноглобулиновые остовы или каркасы включают (но не ограничиваясь только ими) аднектины (фибронектин) (фирма Сотроипб Тйегареийск, Мс., Уолтем, шт. Массачусетс), анкирин (фирма Мо1еси1аг Райпегк АС, Цюрих, Швейцария), домены антител (фирма Эотапйк, Иб (Кэмбридж, шт. Массачусетс)) и аблинкс (АЫ1упх ш) (Цвинаарде, Бельгия), липокалин (антикалин) (фирма Р1еп8 Рго!ео1аЫ АС, Фрейзинг, Германия), небольшие модульные иммунологические фармацевтические агенты (фирма ТгиЫюп Рйагтасеийсак Шс., Сиэтл, шт. Вашингтон), макси-тела (фирма Аν^б^а, Ечс. (Маунтин-Вью, шт. Калифорния)), протеин А (фирма АГйЫобу АС, Швеция) и аффилин (гаммакристаллин или убикитин) (фирма 8сй РгоШпк СтЫН, Галле, Германия).
(Ι) Аднектины - фирма Сотроипб Тйегареийск.
Основой аднектиновых каркасов является домен фибронектина типа ΙΙΙ (например, десятый модуль фибронектина типа ΙΙΙ (домен 10 Рп3)). Домен фибронектина типа ΙΙΙ несет 7 или 8 β-цепей, которые распределены между двумя β-складками, которые сами упакованы друг напротив друга с образованием ядра белка, и дополнительно содержат петли (аналоги СЭЯ), которые соединяют β-цепи друг с другом и являются доступными для растворителя. Известно по меньшей мере три таких петли на каждом крае βскладчатого сэндвича, при этом край является границей белка, перпендикулярной к направлению βцепей (И8 6818418).
Эти каркасы, основой которых является фибронектин, не представляют собой иммуноглобулин, хотя общая укладка очень похожа на укладку наименьшего обладающего функциональной активностью фрагмента антитела, т.е. вариабельной области тяжелой цепи, который содержит полный распознающий антиген компонент в ЦС представителей верблюжьих и лам. Благодаря указанной структуре антитело, не представляющее собой иммуноглобулин, имитирует антигенсвязывающие свойства, которые напоминают по природе и аффинности свойства антител. Эти каркасы можно применять для стратегии рандомизации петель и перестановки ш уйго, подобной процессу созревания аффинности антител ш νί\Ό. Такие молекулы, основой которых является фибронектин, можно применять в качестве каркасов, в которых области петель молекулы можно заменять на СЭЯ, предлагаемые в изобретении, с помощью стандартных методов клонирования.
(ΙΙ) Анкирин - фирма Мо1еси1аг Райпегк.
Технология основана на применении белков, несущих выведенные из анкирина повторяющиеся модули в качестве каркасов для вариабельных областей, которые можно использовать для связывания с различными мишенями. Повторяющийся анкириновый модуль представляет собой состоящий из 33 аминокислот полипептид, который содержит две антипараллельные α-спирали и β-петли. Связывание вариабельных областей максимально оптимизируют на основе доступности для рибосом.
(ΙΙΙ) Макси-тела/авимеры - фирма Λνί6ίη.
Авимеры получают из встречающегося в естественных условиях содержащего А-домен белка, такого как ЬЯР-1. Эти домены используются в естественных условиях для взаимодействий типа белок-белок, и у человека структурной основой более чем 250 белков являются А-домены. Авимеры состоят из нескольких различных мономеров А-домена (2-10), сцепленных с помощью аминокислотных линкеров. Можно создавать авимеры, которые могут связываться с антигеном-мишенью, с использованием методологии, описанной, например, в 20040175756; 20050053973; 20050048512 и 20060008844.
ДУ) Протеин А - фирма АГПЫобу.
Обладающие аффинностью лиганды АГйЫобу® представляют собой небольшие простые белки, состоящие из трехспирального пучка, основой которого является каркас одного из ЦС-связывающих доменов протеина А. Протеин А представляет собой поверхностный белок бактерии 81ар11у1ососси8 аигеик. Этот каркасный домен состоит из 58 аминокислот, 13 из которых произвольно использовали для создания библиотек АГйЫобу® с большим количеством вариантов лиганда (см., например, И8 5831012). Молекулы АГйЫобу® напоминают антитела, их молекулярная масса составляет 6 кДа, для сравнения молекулярная масса антител составляет 150 кДа. Несмотря на небольшой размер, сайт связывания молекул АГйЫобу® подобен сайту связывания антитела.
(У) Антикалины - фирма Р1епк.
Апйсайпк® представляют собой продукты, разработанные компанией Р1еЙ8 Рго1еоЬаЫ АС. Их получают из липокалинов, широко распространенной группы небольших и эффективных белков, которые, как правило, принимают участие в физиологическом транспорте или хранении чувствительных к химическим агентам или нерастворимых соединений. Несколько встречающихся в естественных условиях липокалинов обнаружено в тканях или общей воде организма человека.
- 27 015538
Их белковая архитектура напоминает структуру иммуноглобулинов с гипервариабельными петлями на вершине жесткого остова. Однако в отличие от антител или их рекомбинантных фрагментов липокалины состоят из одной полипептидной цепи, содержащей 160-180 аминокислотных остатков, т.е. несколько более крупной, чем один домен иммуноглобулина.
Набор из четырех петель, которые образуют связывающий карман, обладает выраженной структурной пластичностью и допускает широкое разнообразие боковых цепей. Таким образом, при использовании соответствующего процесса сайту связывания можно придавать новую форму, предназначенную для распознавания с высокой аффинностью и специфичностью заранее определенных молекул-мишеней различной формы.
Один из белков семейства липокалинов, а именно связывающий билин белок (ВВР) из Р1ег15 Ьгакщсае (капустная белянка), использовали для создания антикалинов путем мутагенеза, затрагивающего четыре петли. Одной из заявок на патент, в которых описаны антикалины, приведенной в качестве примера, является РСТ ν0 199916873.
(У!) Аффилин (ЛГГШп) - белки фирмы БсП РгсИеиъ.
Молекулы ЛГГШп™ представляют собой небольшие неиммуноглобулиновые белки, которые разработаны с целью достижения специфических аффинностей к белкам и небольшим молекулам. Новые молекулы ЛГГШп™ можно очень быстро отбирать из двух библиотек, основой каждой из которых являются различные полученные из человеческого организма белки-каркасы.
Молекулы ЛГГШп™ не обладают какой-либо структурной гомологией с белками иммуноглобулинов. На фирме Бс11 РгсИепъ применяют два ЛГГШп™-каркаса, одним из которых является гаммакристаллин, человеческий структурный белок хрусталика глаза, а другим являются белки суперсемейства убикитина. Оба человеческих каркаса имеют очень малый размер, характеризуются высокой температуростойкостью и практически устойчивы к изменениям значений рн и действию денатурирующих агентов. Указанная высокая стабильность главным образом является результатом расширенной бетаскладчатой конформации белков. Примеры выведенных из гамма-кристаллина белков описаны в ν0 200104144, а примеры убкитиноподобных белков описаны в ν0 2004106368.
Методы создания антител.
Как указано выше, антитела к ΌΚΚ1, которые имеют последовательности Ун и У|, или последовательности полноразмерной тяжелой и легкой цепи, представленные в настоящем описании, можно применять для создания новых антител к ΌΚΚ1/4 путем модификации последовательностей полноразмерной тяжелой цепи и/или легкой цепи, последовательностей Ун и/или Уъ или присоединенных к ним константных областей. Таким образом, согласно другому объекту изобретения структурные особенности антитела к ΌΚΚ1, предлагаемого в изобретении, используют для создания структурно родственных антител к ΌΚΚ1/4, которые сохраняют по меньшей мере одно из функциональных свойств антител, предлагаемых в изобретении, таких как связывание с человеческим ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 или с ними обоими, а также ингибирование одного или нескольких функциональных свойств ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 или их обоих.
Например, один или несколько СПК-участков антител, предлагаемых в настоящем изобретении, или их мутантов можно объединять рекомбинантно с известными каркасными участками и/или другими СПК для создания дополнительных, созданных с использованием рекомбинантной ДНК антител к ΌΚΚ1, предлагаемых в изобретении, с помощью указанных выше методов. Другие типы модификаций включают модификации, описанные в предыдущем разделе. Исходным материалом для метода конструирования является одна или несколько последовательностей Ун и/или Уъ, представленных в настоящем описании, или один или несколько из их СПК-участков. Для создания сконструированного антитела не является необходимым фактическое получение (т.е. экспрессия в виде белка) антитела, которое имеет одну или несколько из последовательностей Ун и/или Уъ, представленных в настоящем описании, или одного или нескольких их СПК-участков. Предпочтительно информацию, содержащуюся в последовательности(ях), используют в качестве исходного материала для создания последовательности(ей) второго поколения, выведенной(ых) из исходной(ых) последовательности(ей), и затем получают последовательность(и) второго поколения и экспрессируют в виде белка.
Таким образом, еще одним вариантом осуществления изобретения является способ получения антитела к ΌΚΚ1, состоящего из последовательности Ун-области, которая содержит последовательность СПК1, выбранную из группы, включающей БЕр ΙΌ N0: 2-5, 8-11, 20, 49-56, последовательность СПК2, выбранную из группы, включающей БЕр ГО N0: 2-20 и 57-64, и/или последовательность СПК3, выбранную из группы, включающей БЕр ГО N0: 2-20 и 65-72; и последовательности Уъ-области антитела, которая содержит последовательность СПК1, выбранную из группы, включающей БЕр ГО N0: 21-39 и 73-80, последовательность СПК2, выбранную из группы, включающей БЕр ГО N0: 21-39 и 81-88, и/или последовательность СПК3, выбранную из группы, включающей БЕр ГО N0: 21-39 и 89-96; заключающийся в том, что изменяют по меньшей мере один аминокислотный остаток в последовательности Ун-области антитела и/или Уъ-области антитела для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела и экспрессируют измененную последовательность антитела в виде белка.
- 28 015538
Таким образом, следующим вариантом осуществления изобретения является способ получения антитела к ΌΚΚ1, состоящего из последовательности полноразмерной тяжелой цепи антитела, которая содержит последовательность, выбранную из группы, включающей 8Еф ГБ N0: 115-117; и последовательности полноразмерной легкой цепи антитела, которая содержит последовательность, выбранную из группы, включающей 8Еф ГБ N0: 111-114; заключающийся в том, что изменяют по меньшей мере один аминокислотный остаток в последовательности полноразмерной тяжелой цепи антитела и/или последовательности полноразмерной легкой цепи антитела для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела и экспрессируют измененную последовательность антитела в виде белка.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является способ получения композиции нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4, оптимизированных для экспрессии в млекопитающих, которые состоят из последовательности Ун-области антитела, которая имеет последовательность 8Еф ГБ N0: 119; и последовательности Уь-области антитела, которая имеет последовательность 8Еф ГБ N0: 118; заключающийся в том, что изменяют по меньшей мере один аминокислотный остаток в последовательности Унобласти антитела и/или в последовательности Уъ-области антитела для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела и экспрессируют измененную последовательность антитела в виде белка.
Для получения и экспрессии измененной последовательности антитела можно применять стандартные методы молекулярной биологии. Антитело, кодируемое измененной(ыми) последовательностью(ями), представляет собой антитело, которое сохраняет одну, несколько или все функциональные свойства композиций нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4, представленных в настоящем описании, где функциональные свойства представляют собой (но не ограничиваясь только ими) специфическое связывание с человеческим ΌΚΚ1; и антитело обладает по меньшей мере одним из следующих функциональных свойств: антитело ингибирует связывание белка ΌΚΚ1 с рецептором ΌΚΚ1, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолиза, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов остеолитических повреждений, или антитело ингибирует связывание рецептора ΌΚΚ1, предупреждая или облегчая интенсивность симптомов рака. Измененное антитело может область одним или несколькими, двумя или более или тремя или более из указанных выше функциональных свойств.
Функциональные свойства измененных антител можно оценивать с помощью стандартных анализов, известных в данной области и/или представленных в настоящем описании, таких как описанные в примерах (например, ЕЫ8А).
В конкретных вариантах способов создания антител, предлагаемых в изобретении, мутации можно интродуцировать произвольно или избирательно во всю или в часть кодирующей последовательности антитела к ΌΚΚ1 и полученные в результате модифицированные антитела к ΌΚΚ1 можно подвергать скринингу в отношении связывающей активности и/или других описанных выше функциональных свойств. Методы интродукции мутаций известны в данной области. Например, в опубликованной заявке РСТ ν0 02/092780 на имя 81юг1 описаны методы создания и скрининга мутаций антител с помощью насыщающего мутагенеза, синтетической сборки лигированием или с помощью комбинации этих методов. В опубликованной заявке РСТ ν0 03/074679 на имя Ьахаг с соавторами описаны альтернативные методы, основанные на вычислительном скрининге для оптимизации физико-химических свойств антител.
Константная область Ес-фрагмента антитела имеет решающее значение в отношении времени полужизни в плазме и эффекторных функций, т.е. таких видов активности, как антителообусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (АБСС) или комплементзависимая цитотоксичность (СБС).
Можно создавать специфические мутации Ес-фрагмента для изменения эффекторной функции и/или времени полужизни в сыворотке (см., например, технологию фирмы Хенсон описанную, например, в ν0 2004029207).
Одним из путей изменения эффекторной функции и времени полужизни в сыворотке является трансплантация вариабельной области фрагмента антитела с использованием Ес-фрагмента, который обладает соответствующей эффекторной функцией. Изотипы !дС1 или ΙβΟ4 можно отбирать для достижения способности уничтожать клетки, а изотип ΙβΟ2 можно применять для получения молчащих или нейтрализующих антител (не обладающих способностью уничтожать клетки).
Молчащие антитела с продолжительным временем полужизни в плазме можно получать путем химерного слияния вариабельных областей антитела с сывороточным белком, таким как ЧСА (человеческий сывороточный альбумин), или связывания белка с указанным сывороточным белком, получая слияние ЧСА - связывающий белок.
Эффекторные функции можно изменять также, модулируя схему гликозилирования антитела. На фирмах С1усаг1 (например, И8 6602684), Вю\\'а (например, И8 6946292) и СеметесЬ (например, ν0 03/035835) созданы линии клеток млекопитающих, продуцирующих антитела с усиленной или ослабленной эффекторной функцией. Для усиления АБСС-активности можно применять прежде всего нефукозилированные антитела. На фирме С1усоП разработаны также линии клеток дрожжей, которые обладают способностью продуцировать специфические гликоформы антител.
- 29 015538
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела, предлагаемые в изобретении.
Следующим объектом изобретения являются молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют антитела, предлагаемые в изобретении. Примерами родительских нуклеотидных последовательностей полноразмерной легкой цепи являются последовательности, представленные в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 97-100. Примерами родительских нуклеотидных последовательностей полноразмерной тяжелой цепи являются последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 101-103. Примерами родительских нуклеотидных последовательностей полноразмерной легкой цепи, оптимизированных для экспрессии в клетке, являются последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 104-107. Примерами родительских нуклеотидных последовательностей полноразмерной тяжелой цепи, оптимизированных для экспрессии в клетке, являются последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 108-110.
Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточных лизатах или могут представлять собой нуклеиновые кислоты в частично очищенной или практически чистой форме. Нуклеиновую кислоту выделяют или получают ее в практически очищенном виде, когда ее очищают от других клеточных компонентов или других загрязнителей, например других присутствующих в клетке нуклеиновых кислот или белков, с помощью стандартных методов, включая обработку щелочью/ДСН, С§С1-бэндинг, хроматографию на колонках, электрофорез в агарозном геле и других методов, хорошо известных в данной области (см. Сштеп! РгоФсок ш Мо1еси1аг Вю1оду, под ред. Р. Лн5нЬе1 и др., изд-во Сгеепе РиЬШЫпд апй \νίΚ\· Iπΐе^8с^еπсе, №\ν Уогк, 1987). Нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, может представлять собой, например, ДНК или РНК и может содержать интронные последовательности или не содержать их. В одном из вариантов осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК.
Нуклеиновая кислота может присутствовать в векторе, таком как фаговый дисплейный вектор или рекомбинантный плазмидный вектор.
Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, можно получать с помощью стандартных методов молекулярной биологии. Для антител, экспрессируемых гибридомами (например, гибридомами, полученными из трансгенных мышей, которые несут гены человеческих иммуноглобулинов, что будет описано ниже), кДНК, которые кодируют легкие и тяжелые цепи антитела, созданные с использованием гибридомы, можно получать с помощью стандартных методов ПЦР-амплификации или клонирования кДНК. Для антител, которые получают из библиотеки генов иммуноглобулинов (например, с помощью метода фаговой презентации), нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, можно выделять из различных фаговых клонов, которые являются компонентами библиотеки.
После получения ДНК-фрагментов, кодирующих УН- и Уъ-области, эти ДНК-фрагменты можно подвергать дополнительной обработке с помощью стандартных методов рекомбинантной ДНК, например, для превращения генов вариабельной области в гены полноразмерной цепи антитела, в гены РаЬфрагмента или в ген ксРу-фрагмента. При осуществлении этого процесса ДНК-фрагмент, кодирующий Уь или УН, функционально связывают с другой молекулой ДНК или фрагментом, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Понятие функционально связанный в контексте настоящего описания означает, что два ДНК-фрагмента соединяют функциональным образом, в результате чего аминокислотные последовательности, кодируемые двумя ДНК-фрагментами, сохраняются в рамке считывания, или в результате чего белок экспрессируется под контролем требуемого промотора.
Выделенную ДНК, кодирующую УН-область, можно превращать в ген полноразмерной тяжелой цепи путем функционального связывания ДНК, которая кодирует УН, с другой молекулой ДНК, которая кодирует константные области тяжелой цепи (СН1, СН2 и СН3). Последовательности генов константной области тяжелой цепи известны в данной области (см., например, КаЬа! Е.Л. и др., 8ес.|иепсе5 о£ РгоЮпъ о£ [ттипо1о§1са1 Шегей, 15-е изд., изд-во И.8. Эераг1теп1 о£ Неа1111 апй Нитап Бегущее, МН РиЫюайоп №. 91-3242, 1991) и ДНК-фрагменты, включающие эти области, можно получать с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константная область может представлять собой константную область ЦС1, Ι^2, Ι^3, Ι^4, Ι§Λ, Ι^Ε, ЦМ или Ι^Ό. Для гена тяжелой цепи РаЬ-фрагмента ДНК, кодирующую УН, можно функционально связывать с другой молекулой ДНК, которая кодирует только константную область СН1 тяжелой цепи.
Выделенную ДНК, кодирующую Уь-область, можно превращать в ген полноразмерной легкой цепи (а также в ген легкой цепи РаЬ-фрагмента) путем функционального связывания ДНК, кодирующей Уъ, с другой молекулой ДНК, которая кодирует константную область легкой цепи, т.е. Сь.
Последовательности человеческих генов константной области легкой цепи известны в данной области (см., например, КаЬа! Е.Л. и др., 8ес.|иепсе5 о£ РгоЮпъ о£ Iттипо1од^са1 Ιπίοκδΐ, 15-е изд., изд-во и.8. ИераПтеп! о£ НеаИй апй Нитап Бегущее, МН РиЬНсаНоп №. 91-3242, 1991) и ДНК-фрагменты, включающие эти области, можно получать с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа- или лямбда-цепи.
Для создания гена ксРу ДНК-фрагменты, которые кодируют УН и Уъ, функционально связывают с другим фрагментом, который кодирует гибкий линкер, например который кодирует аминокислотную последовательность (С1у4-8ег)3, в результате чего последовательности УН и Уъ можно экспрессировать в
- 30 015538 виде смежного одноцепочечного белка. в котором и ^-области соединены гибким линкером (см.. например. В1гй и др.. δ^ι^ 242. 1988. с. 423-426; Ник!оп и др.. Ргос. №!1. Αсай. δα. υδΑ 85. 1988. с. 5879-5883; ΜοΟιβο^ и др.. Хпиге 348. 1990. с. 552-554).
Производство моноклональных антител. предлагаемых в изобретении.
Моноклональные антитела (МАт) можно получать с помощью различных методов. включая общепринятые методы получения моноклональных антител. например. с помощью стандартного метода гибридизации соматических клеток. описанного у КоЫег и Μίΐ^ίη. №1Ц.1ге 256. 1975. с. 495. Для получения моноклональных антител можно применять многочисленные методики. например трансформацию Влимфоцитов вирусами или онкогенами.
Применяемая для получения гибридом система животного происхождения представляет собой систему. основанную на использовании мышей. Создание гибридомы в мыши является хорошо известной процедурой. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов. предназначенных для слияния. хорошо известны в данной области. Компоненты. участвующие в слиянии (например. клетки мышиной миеломы). и процедуры слияния также хорошо известны.
Химерные или гуманизированные антитела. предлагаемые в настоящем изобретении. можно получать на основе последовательности мышиного моноклонального антитела. полученного согласно описанному выше методу. ДНК. кодирующую тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов. можно получать из представляющей интерес мышиной гибридомы и создавать так. чтобы она содержала немышиные (например. человеческие) последовательности иммуноглобулинов. с помощью стандартных методов молекулярной биологии. Например. для создания химерного антитела мышиные вариабельные области можно связывать с человеческими константными областями с использованием известных в данной области методов (см.. например. υδ 4816567 на имя СаЫ11у с соавторами). Для создания гуманизированного антитела мышиные СЭК-участки можно встраивать в человеческий каркасный участок с помощью известных в данной области методов (см.. например. υδ 5225539 на имя ХУШег и υδ 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 на имя Онееп с соавторами).
В конкретном варианте осуществления изобретения антитела. предлагаемые в изобретении. представляют собой человеческие моноклональные антитела. Такие человеческие моноклональные антитела к ΌΚΚ1 можно создавать с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей. несущих фрагменты человеческой. а не мышиной иммунной системы. К этим трансгенным и трансхромосомным мышам относятся мыши. обозначенные в контексте настоящего описания как ΗиΜΑЬ-мыши и ΚΜ-мыши соответственно. и мышей обеих указанных линий обозначают в контексте настоящего описания как мыши. несущие человеческий Ι§.
Мыши линии ΗиΜΑЬ (ΉιιΜΛό тоике®. фирма Μейа^еx. Ιπα) содержат мини-локусы гена человеческого иммуноглобулина. который кодирует неперегруппированные последовательности человеческой тяжелой (μ и γ) и легкой κ-цепи иммуноглобулина. в сочетании с целевыми мутациями. которые инактивируют эндогенные локусы μ- и κ-цепи (см.. например. ЬопЬегд и др.. №-11иге 368(6474). 1994. с. 856-859). Таким образом. у мыши снижена способность экспрессировать мышиный ΙμΜ или κ-цепь. и в ответ на иммунизацию интродуцированные трансгены человеческой тяжелой и легкой цепи подвергаются переключению класса и соматическому мутированию с образованием обладающего высокой аффинностью человеческого моноклонального Ι§Οκ (ЬопЬегд N. и др.. 1994. выше; обзорная статья ЬопЬегд N.. НапйЬоок ок Ехрептеп!а1 Ркагтасо1о§у 113. 1994. с. 49-101; ЬопЬегд N. и Никхаг Ό.. Шет. Кеу. Штипок 13. 1995. с. 65-93 и Нагйшд Т. и ЬопЬегд N.. Ληη. N. Υ. Λсай. δα. 764. 1995. с. 536-546). Получение и применение мышей линии ΗиΜΛЬ и геномные модификации. которые несут такие мыши. описаны также у Τау1о^ Ь. и др.. №.1с1ею Αα^ Кекеагск 20. 1992. с. 6287-6295; С1еп I. и др.. Iηΐетаΐ^оηа1 Штипо1о§у 5.
1993. с. 647-656; ^аИ^п и др.. Ргос. №!1. Λсай. δα. υδΑ 94. 1993. с. 3720-3724; С1ю1 и др.. №1Ц.1ге Сепейск 4. 1993. с. 117-123; С1еп I. и др.. ΕΜΒ0 I. 12. 1993. с. 821-830; Мкт и др.. I. Штипок 152.
1994. с. 2912-2920; Τау1о^ Ь. и др.. Iηΐетаΐ^оηа1 Штипо1о§у. 1994. с. 579-591; и ТкШйй Ό. и др.. №1Ц.1ге В|о1ес1то1оду 14. 1996. с. 845-851. содержание всех публикаций специально полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки (см. также υδ 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; все на имя ЬопЬег§ и Юу; υδ 5545807 на имя 8игат с соавторами; опубликованные заявки РСТ \\'0 92103918. \\'0 93/12227. \\'0 94/25585. \\'0 97113852. \У0 98/24884 и \У0 99/45962. все на имя ЬопЬегд и 1<ау; и опубликованную заявку РСТ \¥0 01/14424 на имя 1<огтап с соавторами).
В другом варианте осуществления изобретения человеческие антитела. предлагаемые в изобретении. можно получать с использованием мыши. которая несет последовательности человеческого иммуноглобулина на трансгенах и трансхромосомах. например. мыши. которая несет трансген человеческой тяжелой цепи и трансхромосому человеческой легкой цепи. Такие мыши. обозначенные в контексте настоящего описания как ΚΜ-мыши. описаны подробно в публикации РСТ \¥0 02/43478 на имя Шнйа с соавторами.
В данной области известны также другие системы на основе трансгенных животных. экспрессирующих гены человеческого иммуноглобулина. их можно применять для получения антител к ΌΚΚ1.
- 31 015538 предлагаемых в изобретении. Например, можно использовать другую трансгенную систему, обозначенную как Χοηοιηοιίδο (фирма АЬдешх, Ιηο.); такие мыши описаны, например, в И8 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963 на имя Κπο^Γίαραΐί с соавторами.
Кроме того, в данной области известны также другие транхромосомные системы, созданные на основе животных, для экспрессии генов человеческого иммуноглобулина, и их можно применять для получения антител к ΌΚΚ1, предлагаемых в изобретении. Например, можно использовать мышей, несущих как трансхромосому человеческой тяжелой цепи, так и трансхромосому человеческой легкой цепи, которые обозначены как ТС-мыши; такие мыши описаны, например, у ΤοιηίζιιΚα и др. Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 97, 2000, с. 722-727. Кроме того, в данной области известны коровы, несущие трансхромосомы человеческой тяжелой и легкой цепи (Κιποπνα и др., №11иге ΒίοΚ№ηο1οβ\· 20, 2002, с. 889-894) и их можно применять для получения антител к ΌΚΚ1, предлагаемых в изобретении.
Человеческие моноклональные антитела, предлагаемые в изобретении, можно получать также с использованием методов фаговой презентации для скрининга библиотек генов человеческих иммуноглобулинов. В данной области разработаны такие методы фаговой презентации для выделения человеческих антител (см., например, И8 5223409; 5403484 и 5571698 на имя Ьабвег с соавторами; И8 5427908 и 5580717 на имя Όο\\όγ с соавторами; и8 5969108 и 6172197 на имя МсСаГГеПу с соавторами и И8 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 на имя СпГййв с соавторами).
Человеческие моноклональные антитела, предлагаемые в изобретении, можно получать также с использованием 8СШ-мышей (мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом), в которых восстанавливали человеческие иммуноциты с тем, чтобы при иммунизации можно было получать человеческий гуморальный иммунный ответ. Такие мыши описаны, например, в И8 5476996 и 5698767 на имя ΧνίΓοη с соавторами.
Скрининг библиотек человеческих антител можно применять для идентификации антитела, предлагаемого в изобретении. Выбор методов скрининга включает (но не ограничиваясь только ими), например, применение фаговой презентации (фирма ΜοιρΗο^δ), различных типов библиотек (например, библиотеки НиСа1 фирмы ΜοΓρΗοδλ'δ), метод созревания аффинности и дополнительную оптимизацию кодонов последовательности.
Создание человеческих моноклональных антител к ΌΚΚ1.
В качестве антигена применяют очищенный рекомбинантный человеческий ΌΚΚ1, полученный из Е.^Г, бакуловируса или клеток линии ΗЕΚ-ЕВNА, или очищенный рекомбинантный человеческий ΌΚΚ1, конъюгированный с гемоцианином лимфы улитки (ΚΕΗ).
Полностью человеческие моноклональные антитела к ΌΚΚ1 получают с использованием линий ΗΟο7, Ηί'.'ο12 и НС'о17 трансгенных НиМаЬ-мышей и линии ΚΜ трансгенных трансхромосомных мышей, в каждой из указанных линий экспрессируются гены человеческого антитела. В каждой из указанных линий мышей эндогенную мышиную легкую каппа-цепь можно разрушать в гомозиготе с помощью метода, описанного у СНеи и др., ЕМВ0 1. 12, 1993, с. 811-820, а эндогенный мышиный ген тяжелой цепи можно разрушать в гомозиготе согласно методу, описанному в примере 1 опубликованной заявки РСТ \Х0 01109187. Эти линии мышей несут трансген человеческой легкой каппа-цепи, т.е. Κ№5, описанный у ИзЬтебб и др., №Циге В^οΐесЬηο1ο§у 14, 1996, с. 845-851, и трансген НСо7 человеческой тяжелой цепи, описанный в И8 5545806; 5625825 и 5545807. Линия НСо12 несет трансген Ηί'.’ο12 человеческой тяжелой цепи, описанный в примере 2 опубликованной заявки РСТ \Х0 01/09187. Линия НС'о17 несет трансген НС'о17 человеческой тяжелой цепи. Линия ΚNΜ содержит трансхромосому 8С20, описанную в опубликованной заявке РСТ \Х0 02/43478.
Для создания полностью человеческих моноклональных антител к ΌΚΚ1, НиМаЬ-мышей и 1<Ммышей иммунизируют очищенным рекомбинантным ΌΚΚ1, полученным из Е.тоН, или конъюгатом ΌΚΚ1-ΚΕΗ в качестве антигена. Общие схемы иммунизации НиМаЬ-мышей описаны у Γοη№Γ§ N. и др., №1Ц.1ге 368 (6474), 1994, с. 856-859; ИзЬтебб Ό. и др., №1Ц.1ге Βίο^1ιηο1οβ\· 14, 1996, с. 845-851 и в опубликованной заявке РСТ \Х0 98/24884. При первой инфузии антигена возраст мышей составляет 6-16 недель. Очищенный рекомбинантный препарат (5-50 мкг) антигена ΌΚΚ1 (например, очищенный из трансфектированных клеток Е.тоН, экспрессирующих ΌΚΚ1) применяют для иммунизации НиМаЬмышей и ΚΜ-мышей внутрибрюшинно, подкожно (8с) или путем инъекции в подушечку лапы.
Трансгенных мышей иммунизируют дважды антигеном в полном адъюванте Фрейнда или адъюванте Риби либо внутрибрюшинно (ГР), либо подкожно (8с), либо в подушечку лапы (ГР), с последующей через 3-21 ΙΓ-, 8с- или ГР-иммунизацией (в целом вплоть до 11 иммунизации) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда или адъюванте Риби. Мониторинг иммунного ответа осуществляют путем взятия крови из ретроорбитального сплетения. Для скрининга плазмы используют ЕЫ8А, и для слияния используют мышей, которые имеют достаточно высокие титры человеческого иммуноглобулина к ΌΚΚ1. Мышей подвергают внутривенной ревакцинации антигеном за 3 и 2 дня перед умерщвлением и удаляют селезенку. Как правило, осуществляют 10-35 слияний для каждого антигена. Мышей иммунизируют несколькими дозами каждого антигена. Всего 82 мыши линий Η№7, Η№12, Ηί'.'ο17 и ΚΜ иммунизируют ΌΚΚ1.
- 32 015538
Для отбора НиМаЬ- или ЫМ-мышей, продуцирующих антитела, которые связываются с ΌΚΚ1, можно оценивать сыворотку иммунизированных мышей с помощью ЕЫ8А согласно методу, описанному у РЫ1\и1б Ό. и др., 1996. В целом метод состоит в следующем. Титрационные микропланшеты сенсибилизируют очищенным рекомбинантным ΌΚΚ1 из Е.сой в количестве 1-2 мкг/мл в ЗФР, 50 мкл/лунку, инкубируют при 4°С в течение ночи, затем блокируют, добавляя по 200 мкл/лунку 5%-ной куриной сыворотки в ЗФР/Твин (0,05%). Разведения плазмы, полученной из иммунизированных ΌΚΚ1 мышей, добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 1-2 ч при температуре окружающей среды. Планшеты отмывают ЗФР/Твин и затем инкубируют с козьим поликлональным антителом к человеческому Гс-фрагменту 1дС, конъюгированным с пероксидазой из хрена (НКР), в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки планшеты проявляют с помощью субстрата АВТ8 (фирма 81дта, А-1888, 0,22 мг/мл) и анализируют с помощью спектрофотометра при ОП 415-495 нм. Мышей, у которых обнаружены самые высокие титры антител к ΌΚΚ1, применяют для слияния. Осуществляют слияния и супернатанты гибридом тестируют в отношении активности антител к ΌΚΚ1 с помощью ЕЫ8А.
Мышиные спленоциты, выделенные из НиМаЬ-мышей и ΚМ-мышей, сливают с помощью ПЭГ с линий клеток мышиной миеломы согласно стандартным протоколам. Затем образовавшиеся гибридомы подвергают скринингу в отношении производства специфических для антигена антител. Суспензии индивидуальных клеток селезеночных лимфоцитов из иммунизированных мышей сливают с одной четвертой от общего количества клеток несекретирующейся мышиной миеломы линии 8Р2/0 (АТСС, СКЬ 1581) с использованием 50% ПЭГ (фирмы 8фта). Клетки высевают примерно из расчета 1х105/лунку в плоскодонный титрационный микропланшет, затем инкубируют в течение примерно 2 недель в среде для селекции, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 10% кондиционированной среды Р388Э1 (АТСС, СКЬ Т1В-63), 3-5% оригена (фирма ЮЕЫ) в среде ЭМЕМ (фирма Меб1а1есй, СКЬ 10013, с высоким содержанием глюкозы, Ь-глутамина и пирувата натрия), дополненной 5 мМ НЕРЕ8, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанолом, 50 мг/мл гентамицина и 1хГАТ (гипоксантин-аминоптерин-тимидин) (фирма 81дта, СКЬ Р-7185). Через 1-2 недели клетки культивируют в среде, в которой ГАТ заменен на ГТ. Затем индивидуальные лунки оценивают с помощью ЕЬ18А в отношении человеческих моноклональных антител к ΌΚΚ1 в виде 1дС. После достижения интенсивного роста гибридом осуществляют мониторинг среды, как правило, через 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитела, пересевают, вновь подвергают скринингу и, если все еще сохраняется позитивная реакция в отношении человеческого Юд, то человеческие моноклональные антител к ΌΚΚ1 субклонируют по меньшей мере дважды с использованием ограничивающего разведения. Затем стабильные субклоны культивируют ίη νίΐΐΌ для получения небольших количеств антител в среде для культуры ткани для дальнейшей характеризации.
Иммунизация мышей человеческим 1д.
Когда для получения человеческих антител, предлагаемых в изобретении, применяют несущих человеческий 1д мышей, таких мышей можно иммунизировать очищенным или обогащенным препаратом антигена ΌΚΚ1 и/или рекомбинантного ΌΚΚ1 или слитого белка ΌΚΚ1 согласно методу, описанному у ЬопЬегд N. и др., №11иге 368 (6474), 1994, с. 856-859; ЕЫ1\\з1б Ό. и др., №11иге Вю!есйпо1оду 14, 1996, с. 845-851; и опубликованных заявках РСТ \УО 98/124884 и \УО 01/14424. При первой инфузии антигена возраст мышей может составлять 6-16 недель. Например, очищенный или рекомбинантный препарат (5-50 мкг) антигена ΌΚΚ1 можно использовать для иммунизации несущих человеческий 1д мышей путем внутрибрюшинной инъекции.
Подробные процедуры получения полностью человеческих моноклональных антител к ΌΚΚ1 описаны выше. Обобщение опыта применения различных антигенов позволило установить, что ответ у трансгенных мышей получают, когда первоначально осуществляют внутрибрюшинную (1Р) иммунизацию антигеном в одном адъюванте Фрейнда с последующими 1Р-иммунизациями каждые две недели (в целом вплоть до 6) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. Однако эффективностью могут обладать и адъюванты, отличные от адъювантов Фрейнда. Кроме того, установлено, что целые клетки могут обладать высокой иммуногенностью в отсутствие адъюванта. Иммунный ответ можно оценивать в процессе осуществления протокола иммунизации с использованием образцов плазмы, получаемых при взятии крови из ретроорбитального сплетения. Плазму можно подвергать скринингу с помощью ЕЫ8А, и мышей, которые имеют достаточно высокие титры человеческого иммуноглобулина к ΌΚΚ1, можно использовать для слияния. Мышей можно ревакцинировать путем внутривенной инъекции антигена за 3 дня до умерщвления и удалять селезенку. Ожидается, что для каждого варианта иммунизации необходимо осуществлять 2-3 слияния. Как правило, каждым антигеном иммунизируют от 6 до 24 мышей. Как правило, используют линии и НСо7, и НСо12. Кроме того, оба трансгена НСо7 и НСо12 можно размножать в одной мыши, которая несет два различных трансгена человеческой тяжелой цепи (НСо7/НСо12).
Создание гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела.
Для создания гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела, предлагаемые в изобретении, можно выделять спленоциты и/или клетки лимфатических узлов из иммунизированных мышей и сливать с соответствующей иммортализованной линий клеток, такой как линия мышиной миеломы. Образовавшиеся гибридомы можно подвергать скринингу в отношении производства специфиче
- 33 015538 ских для антигена антител. Например, суспензии индивидуальных клеток селезеночных лимфоцитов из иммунизированных мышей можно сливать в количестве, составляющем одну шестую часть от количества клеток несекретирующейся мышиной миеломы линии Р3Х63-Ад8.653 (АТСС, СКЕ 1580) с помощью 50% ПЭГ. Клетки высевают примерно из расчета 2х105/лунку в плоскодонные титрационные микропланшеты, затем инкубируют в течение 2 недель в среде для селекции, содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки, 18% кондиционированной среды 653, 5% оригена (фирма №ΕΝ), 4 мМ Ь-глутамин, 1 мМ пируват натрия, 5 мМ НЕРЕБ, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанол, 50 ед./мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, 50 мг/мл гентамицина и 1хГАТ (фирма Б1дта; ГАТ добавляют через 24 ч после слияния). Примерно через 2 недели клетки можно культивировать в среде, в которой ГАТ заменен на ГТ. Затем индивидуальные лунки можно подвергать скринингу с помощью ЕЫБА в отношении человеческих моноклональных антител в виде ^М и Ι§Ο. После достижения интенсивного роста гибридом осуществляют мониторинг среды, как правило, через 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитела, можно пересевать, вновь подвергать скринингу и, если все еще сохраняется позитивная реакция в отношении человеческого Юд, то человеческие моноклональные антитела можно субклонировать по меньшей мере дважды с использованием ограничивающего разведения. Затем стабильные субклоны можно культивировать ίη νΐΐΐΌ для получения небольших количеств антител в среде для культуры ткани для дальнейшей характеризации.
Для очистки человеческих моноклональных антител отобранные гибридомы можно выращивать в 2-литровых вращающихся колбах с целью очистки моноклональных антител. Супернатанты можно фильтровать и концентрировать перед осуществлением аффинной хроматографии с использованием протеина А-сефарозы (фирма Рбагтас1а, Пискатавей, шт. Нью-Джерси). Элюированный ^С можно проверять с помощью гель-электрофореза и жидкостной хроматографии высокого разрешения для гарантии чистоты. Буферный раствор можно заменять ЗФР и концентрацию определять при ОП280 с использованием коэффициента экстинкции 1,43. Моноклональные антитела можно разделять на аликвоты и хранить при -80°С.
Создание трансфектом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела.
Антитела, предлагаемые в изобретении, можно получать также в трансфектоме клетки-хозяина с использованием, например, комбинации методов рекомбинантной ДНК и методов генной трансфекции, которые хорошо известны в данной области (см., например, Моткоп Б., Бс1епсе 229, 1985, с. 1202).
Например, для экспрессии антител или фрагментов антител ДНК, которые кодируют частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, можно получать с помощью стандартных методов молекулярной биологии (например, с помощью ПЦР-амплификации или клонирования кДНК с использованием гибридом, которые экспрессируют представляющее интерес антитело) и ДНК можно встраивать в экспрессионные векторы таким образом, чтобы гены были функционально связаны с контролирующими транскрипцию и трансляцию последовательностями. В этом контексте подразумевается, что понятие функционально связанный означает, что ген антитела встраивают путем лигирования в вектор таким образом, чтобы присутствующие в векторе контролирующие транскрипцию и трансляцию последовательности выполняли свойственные им функции регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Выбранные экспрессионный вектор и контролирующие экспрессию последовательности должны быть совместимы с применяемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно встраивать в различные векторы или, как правило, оба гена встраивают в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антитела встраивают в экспрессионный вектор стандартными методами (например, встраивают путем лигирования комплементарных сайтов рестрикции во фрагмент гена антитела или в вектор, или путем лигирования затупленных концов, если отсутствуют какие-либо сайты рестрикции). Вариабельные области легких и тяжелых цепей антител, предлагаемых в изобретении, можно использовать для создания полноразмерных генов антител любых изотипов путем встраивания их в экспрессионные векторы, которые уже кодируют константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи требуемого изотипа, таким образом, чтобы УН-область была функционально связана с СН-областью(ями) в векторе, а Уъ-область функционально связана с Съ-областью в векторе. В другом или дополнительном варианте рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в векторе так, чтобы сигнальный пептид был связан в рамке считывания с Ν-концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из белка, не относящегося к иммуноглобулинам).
Помимо генов цепи антитела рекомбинантные экспрессионные векторы, предлагаемые в изобретении, несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антитела в клетке-хозяине. Подразумевается, что понятие регуляторная последовательность относится к промоторам, энхансерам и другим контролирующим экспрессию элементам (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепи антитела. Указанные регуляторные последовательности описаны, например, у Соеййе1 (Сепе Ехргеккюп Тесйпо1оду. МеФойк ш Епгуто1оду 185, изд-во Асайетю Ргекк, Бап Э1едо, СА 1990). Специалистам в данной области должно
- 34 015538 быть очевидно, что создание экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, требуемый уровень экспрессии белка и т. д. Регуляторные последовательности для экспрессии в клетках млекопитающих включают вирусные элементы, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, выведенные из цитомегаловируса (СМУ), обезьяньего вируса 40 (ОВ-40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (АбМЬР)) и вируса полиомы. В альтернативном варианте можно использовать невирусные регуляторные последовательности, такие как промотор убикитина или промотор Р-глобина. Кроме того, можно применять регуляторные элементы, состоящие из полученных из разных источников последовательностей, такие как промоторная система Бга, которая содержит последовательности раннего промотора 0В-40 и длинный концевой повтор вируса типа 1 человеческого Т-клеточного лейкоза (ТакеЬе Υ. и др., Мо1. Се11. Βίοί. 8, 1988, с. 466-472).
Помимо генов цепи антитела и регуляторных последовательностей рекомбинантные экспрессионные векторы, предлагаемые в изобретении, могут нести дополнительные последовательности, например, последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, сайты инициации репликации) и гены селектируемых маркеров. Гены селектируемых маркеров облегчают отбор клеток-хозяев, в которые интродуцирован вектор (см., например, ИБ 4399216, 4634665 и 5179017, все на имя Ахе1 с соавторами). Например, как правило, ген селектируемого маркера обусловливает устойчивость клетки-хозяина, в которую интродуцирован вектор, к лекарственным средствам, таким как С418, гигромицин или метотрексат. К генам селектируемых маркеров относятся ген дигидрофолатредуктазы (ПНЕК) (для применения в бЫг- клетках-хозяевах при селекции/амплификации в присутствии метотрексата) и ген пео (для отбора в присутствии С418).
Для экспрессии легких и тяжелых цепей экспрессионным(ми) вектором(ами), кодирующим(ми) тяжелые и легкие цепи, трансфектируют клетку-хозяина с помощью стандартных методов. Под различные формы понятия трансфекция подпадает широкое разнообразие методов, обычно применяемых для интродукции экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорация, осаждение фосфатом кальция, трансфекция с использованием ДЭАЭ ((диэтиламино)этилцеллюлоза)декстрана и т.п. Теоретически можно экспрессировать антитела, предлагаемые в изобретении, как в прокариотических, так и в эукариотических клетках-хозяевах. Обсуждается экспрессия в эукариотических клетках, прежде всего в клетках-хозяевах млекопитающих, поскольку указанные эукариотические и прежде всего клетки млекопитающих, с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, могут обеспечивать сборку и секрецию имеющего правильную складчатость антитела и его способность к связыванию с антигеном. Установлено, что экспрессия генов антител в прокариотических хозяевах не может эффективно обеспечивать высокие уровни производства активного антитела (Вокк М.А. и \Уоой С.К., Iттиηο1ο§у Тобау 6, 1985, с. 12-13).
Клетки-хозяева млекопитающих, предназначенные для экспрессии рекомбинантных антител, предлагаемых в изобретении, представляют собой клетки яичника китайского хомячка (СН0-клетки, включая СН0-клетки с дефицитом бЫг (бЫг-)), описанные у Иг1аиЬ и Сйакт, Ргос. №11. Асаб. Бс1. ИБА 77, 1980, с. 4216-4220, которые применяют в сочетании с селектируемым маркером ОНЕК, например, как описано у К.1. НаиРтап и Р.А. Бйагр, Мо1. Вю1. 159, 1982, с. 601-621, клетки миеломы линии N50, С0Б-клетки и БР2-клетки. В XV0 87/04462, XV0 89/01036 и ЕР 338841 описана другая экспрессионная система, представляющая собой экспрессионную систему СБ-гена, предназначенную прежде всего для применения с клетками миеломы линии Ж0. Когда рекомбинантные экспрессионные векторы, кодирующие гены антитела, интродуцируют в клетки-хозяева млекопитающих, то антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для осуществления экспрессии антитела в клетке-хозяине или секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела можно выделять из культуральной среды с помощью стандартных методов очистки белков.
Фармацевтические композиции.
Следующим объектом настоящего изобретения является композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая одну композицию нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4 или их комбинацию или их антигенсвязывающий(е) участок(ки), предлагаемые в настоящем изобретении, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут включать одно или комбинацию (например, два или большее количество различных) антител или иммуноконъюгатов или биспецифических молекул, предлагаемых в изобретении. Например, фармацевтическая композиция, предлагаемая в изобретении, может содержать комбинацию антител (или иммуноконъюгатов или биспецифических антител), которые связываются с различными эпитопами на антигене-мишени, или которые обладают дополнительным видом активности.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, можно применять также для совместной терапии, т. е. в сочетании с другими агентами. Например, для совместной терапии можно применять антитело к ΌΚΚ1, предлагаемое в настоящем изобретении, в сочетании по меньшей мере с одним другим противовоспалительным или антиостеопорозным агентом. Примеры терапевтических агентов, которые можно применять в совместной терапии, более подробно описаны ниже в разделе, посвященном
- 35 015538 применению антител, предлагаемых в изобретении.
В контексте настоящего описания понятие фармацевтически приемлемый носитель включает каждый и все растворители, дисперсионные среды, материалы для нанесения покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, агенты, придающие изотоничность, и замедляющие абсорбцию агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Носитель должен быть пригодным для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения на действующее вещество, т.е. антитело, иммуноконъюгат или биспецифическую молекулу, можно наносить покрытие из материала, защищающего соединение от воздействия кислот и других факторов окружающей среды, которые могут инактивировать соединение.
Фармацевтические соединения, предлагаемые в изобретении, могут включать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Понятие фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет требуемую биологическую активность родительского соединения и не вызывает никаких нежелательных токсикологических действий (см., например, Вегде 8.М., и др., I. РИагт. 8сг 66, 1977,
с. 1-19). Примерами таких солей являются кислотно-аддитивные соли и соли присоединения оснований. К кислотно-аддитивным солям относятся соли, образованные из нетоксичных неорганических кислот, таких как соляная, азотная, фосфорная, серная, бромисто-водородная, йодисто-водородная, фосфористая кислота и т. п., а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, замещенные фенилом алкановые кислоты, оксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т. п. Соли присоединения оснований включают соли, образованные с щелочно-земельными металлами, такими как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также с нетоксичными органическими аминами, такими как Ν,Ν'-дибензилэтилендиамин, Ν-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п.
Фармацевтическая композиция, предлагаемая в изобретении, может содержать также фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примерами фармацевтически приемлемых антиоксидантов являются водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия и т.п.; жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВГА), бутилированный гидрокситолуол (БГТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; металлхелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т. п.
Примерами приемлемых водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях, предлагаемых в изобретении, являются вода, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их приемлемые смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и пригодные для инъекций сложные органические эфиры, такие как этилолеат. Требуемую текучесть можно поддерживать, например, с помощью применяемых для нанесения покрытий материалов, таких как лецитин, сохраняя требуемый размер частиц в случае дисперсий, и с помощью поверхностно-активных веществ.
Указанные композиции могут содержать также адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующе вещества. Отсутствие микроорганизмов можно гарантировать как с помощью описанных выше процессов стерилизации, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, таких, например, как парабен, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота и
т. п. Может оказаться желательным включать в композиции придающие изотоничность агенты, такие как сахара, хлорид натрия и т. п. Кроме того, можно получать инъецируемую фармацевтическую форму с пролонгированной абсорбцией, например, путем включения агентов, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.
Фармацевтически приемлемые носители представляют собой стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления при необходимости стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Применение таких сред и агентов для фармацевтических действующих веществ известно в данной области. За исключением случая, когда любые из общепринятых сред или агентов не совместимы с действующим веществом, предусматривается их применение в фармацевтических композициях, предлагаемых в изобретении. В композиции можно включать также дополнительные действующие вещества.
Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях приготовления и хранения. Композиция может иметь форму раствора, микроэмульсии, липосомы или иметь другую упорядоченную структуру, пригодную для включения лекарственного средства в высокой концентрации. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их приемлемые смеси. Требуемую текучесть можно поддерживать, например, с помощью применяемых для нанесения покрытий материалов, таких как лецитин, сохраняя требуемый размер частиц в случае дисперсий, и с помощью поверхностно-активных веществ. Во многих случаях можно включать придающие изотоничность агенты, такие как сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия и т.п. Кроме того, можно получать инъецируемую фармацевтическую форму с про
- 36 015538 лонгированной абсорбцией, например, путем включения агентов, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.
Стерильные предназначенные для инъекций растворы можно получать путем включения действующего вещества в требуемом количестве в соответствующий растворитель либо индивидуально, либо в случае необходимости в сочетании с указанными выше ингредиентами, с последующей стерилизацией микрофильтрацией. Как правило, дисперсии получают включением действующего вещества в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и требуемые другие вышеперечисленные ингредиенты. Методы получения стерильных порошков, предназначенных для приготовления стерильных инъецируемых растворов, представляют собой вакуумную сушку и сушку вымораживанием (лиофилизация), с помощью которых получают порошок действующего вещества в сочетании с любым другим требуемым ингредиентом из предварительно стерилизованного фильтрацией раствора.
Количество действующего вещества, которое можно объединять с носителем для получения формы в виде однократной дозы, должно варьироваться в зависимости от индивидуума, подлежащего обработке, и конкретного пути введения. Количество действующего вещества, которое можно объединять с носителем для получения формы в виде однократной дозы, как правило, представляет собой количество композиции, которое обладает терапевтическим действием. Как правило, количество за исключением случая, когда оно составляет 100%, представляет собой количество, составляющее от примерно 0,01 до примерно 99% действующего вещества, от 0,1 до примерно 70% или от примерно 1 до примерно 30% действующего вещества в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
Схему приема лекарственного средства регулируют для получения оптимального требуемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, можно применять однократную болюсную инъекцию, можно вводить несколько разделенных доз в течение определенного промежутка времени или дозу можно пропорционально понижать или повышать в зависимости от конкретной терапевтической ситуации. Наиболее целесообразно приготавливать композиции для парентерального введения в виде стандартных доз лекарственного средства, что облегчает их применение и однородность доз. Под стандартной дозой лекарственного средства в контексте настоящего описания понимают физически дискретные единицы, предназначенные для введения стандартных доз индивидууму, подлежащему лечению; каждая единица содержит предварительно определенное количество действующего вещества, которое согласно расчету должно обладать желаемым терапевтическим действием, в сочетании с требуемыми фармацевтическим носителем. Специфические особенности форм в виде стандартных доз, предлагаемых в изобретении, определяются и непосредственно зависят от индивидуальных характеристик действующего вещества и конкретного терапевтического действия, которое необходимо достигать, и ограничениями, известными в области приготовления препаративных форм такого действующего вещества, связанными с лечением чувствительных индивидуумов.
Для введения антитела дозы составляют от примерно 0,0001 до 200 мг/кг и более конкретно от 0,01 до 50 мг/кг веса хозяина. Например, дозы могут составлять 0,3, 1, 3, 5 или 10 мг/кг веса тела, или могут находиться в диапазоне от 1 до 20 мг/кг. Пример схемы лечения включает введение один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, один раз каждые четыре недели, один раз в месяц, один раз каждые 3 месяца или один раз каждые 3-6 месяцев. Схемы приема антитела к ΌΚΚ1, предлагаемого в изобретении, могут включать введение 1 или 3 мг/кг веса тела путем внутривенного или подкожного применения, при этом антитело вводят с использованием следующих режимов применения: например, каждые 4 недели по 6 доз, затем каждые 3 месяца; каждые три недели; 3 мг/кг веса тела однократно, затем 1 мг/кг веса тела каждые 3 недели.
В некоторых вариантах способа можно вводить два или большое количество моноклональных антител с различными специфичностями связывания, в этом случае доза каждого вводимого антитела находится в указанных диапазонах. Антитело, как правило, вводят многократно. Можно использовать, например, следующие интервалы между каждым введением доз: еженедельно, ежемесячно, каждые три месяца или ежегодно. Интервалы могут также быть нерегулярными в зависимости от определенных в крови пациента уровней антитела к антигену-мишени или уровней некоторых биомаркеров, таких как 0СЫ, 0РС или РЮТ. В некоторых вариантах способа дозу регулируют с целью достижения концентрации антитела в плазме, составляющей примерно 1-1000 мкг/мл, а в некоторых вариантах способа до достижения концентрации, составляющей примерно 25-300 мкг/мл.
В альтернативном варианте антитело можно вводить в виде формы с замедленным высвобождением, в этом случае требуется меньшая частота введения. Доза и частота введения варьируются в зависимости от времени полужизни антитела в организме пациента. В целом человеческие антитела обладают наиболее длительным временем полужизни, в порядке снижения этого показателя антитела распределяются следующим образом: гуманизированные антитела, химерные антитела и антитела из организмов кроме человека. Доза и частота введения может варьироваться в зависимости от того, является лечение профилактическим или терапевтическим. При применении в профилактических целях вводят относительно более низкие дозы с относительно редкими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают прием лекарственного средства в течение всей оставшейся жизни. При терапевтическом применении иногда требуется использование относительно высокой дозы с введением
- 37 015538 через относительно короткие интервалы вплоть до снижения скорости развития заболевания или прекращения его развития или до частичного или полного уменьшения интенсивности симптомов заболевания у пациента. После этого пациента можно переводить на профилактический режим применения.
Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, можно варьировать таким образом, чтобы получать количество действующего вещества, эффективное для достижения требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента, при использовании конкретной композиции и пути введения, и они не должны быть токсичными для пациента. Выбранный уровень доз должен зависеть от различных фармакокинетических факторов, включая активность применяемых конкретных композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, или сложного эфира, соли или амида, пути введения, времени введения, скорости выделения конкретного применяемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, применяемых в сочетании с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, веса, состояния, общего состояния здоровья и предыдущей истории болезни подлежащего лечению пациента и аналогичных хорошо известных в области медицины факторов.
Терапевтически эффективная доза антитела к ΌΚΚ1, предлагаемого в изобретении, может приводить к уменьшению серьезности симптомов заболевания, повышению частоты и продолжительности бессимптомных периодов заболевания или к предупреждению ухудшения состояния или нетрудоспособности, связанной с поражением болезнью.
Композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить с помощью одного или нескольких путей введения с использованием одного или нескольких различных методов, известных в данной области. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, путь и/или механизм введения должен варьироваться в зависимости от требуемых результатов. Пути введения антител, предлагаемых в изобретении, представляют собой внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, внутрибрюшинный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, с помощью инъекции или инфузии. Под парентеральным введением в контексте настоящего описания понимают пути введения, отличные от энтерального и местного применения, как правило, путем инъекции, и включают (но не ограничиваясь только ими) внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, внутриоболочечную, внутрикапсульную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, подкутикулярную, внутрисуставную, подкапсульную, подпаутинную, интраспинальную, эпидуральную и надчревную инъекцию и инфузию.
В альтернативном варианте антитело, предлагаемое в изобретении, можно вводить непарентеральным путем, таким как местный, эпидермальный путь применения или нанесение на слизистую оболочку, например интраназально, орально, вагинально, ректально, подъязычно или местно.
Действующие вещества можно включать в препаративную форму в сочетании с носителями, которые должны защищать соединение от быстрого высвобождения, например, в случае препаративной формы с контролируемым высвобождением, в том числе, такой как имплантаты, трансдермальные бляшки и микрокапсулированные системы введения. Можно применять биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортороэфиры и полимолочная кислота. Целый ряд методов получения таких препаративных форм запатентован или известен специалистам в данной области (см., например, БийаШеб апб Соп!го11еб Ке1еа§е Эгид ОеШ'егу Буйепъ, под ред. !К. КоШпкоп, изд-во Магсе1 Эеккег, Шс., №\ν Уогк, 1978).
Терапевтические композиции можно вводить с помощью известных в данной области медицинских устройств. Например, в одном из вариантов осуществления изобретения терапевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, можно вводить с помощью безыгольного устройства для гиподермальных (подкожных) инъекций, например, с помощью устройств, описанных в ЦБ 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 или 4596556. Примерами хорошо известных имплантатов и модулей, которые можно применять в настоящем изобретении, являются описанный в ЦБ 4487603 пригодный для имплантации насос для микроинфузии дозированных медицинских препаратов с контролируемой скоростью; описанное в ЦБ 4486194 терапевтическое устройство для введения медицинских препаратов через кожу; описанный в ЦБ 4447233 насос для инфузии медицинских препаратов, предназначенный для введения лекарственных средств с точно установленной скоростью инфузии; описанное в ЦБ 4447224 пригодное для имплантации устройство для инфузии с изменяющимся потоком, предназначенное для продолжительного введения лекарственного средства; описанная в ЦБ 4439196 система для осмотического введения лекарственных средств, снабженная несколькими компартментами в виде камер; и описанная в ЦБ 4475196 система для осмотического введения лекарственных средств. Указанные патенты включены в настоящее описание в качестве ссылки. Целый ряд других устройств, таких как имплантаты, системы для введения и модули, известны специалистам в данной области.
В конкретных вариантах осуществления изобретения человеческие моноклональные антитела, предлагаемые в изобретении, можно приготавливать в формах, гарантирующих соответствующее распределение Ш νί\Ό. Например, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) не пропускает многие обладающие высокой гидрофильностью соединения. Для гарантии того, что обладающие терапевтической активностью соединения, предлагаемые в изобретении, пересекут ГЭБ (если это требуется) их можно включать,
- 38 015538 например, в липосомы. Методы приготовления липосом описаны, например, в И8 4522811, 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать один или несколько фрагментов, которые избирательно транспортируются в определенные клетки или органы, что повышает направленное введение лекарственного средства (см., например, У.У. Вапабе, ί. С1ше Рйагтасо1. 29, 1989, с. 685). Примерами обеспечивающих направленный перенос молекул являются фолат или биотин (см., например, И8 5416016 на имя Ьоте с соавторами); маннозиды (Ытеха^а и др., ВюсНет. Вюрйук. Век. Соттип. 153, 1988, с. 1038); антитела (Р.6. В1оетап и др., РЕВ8Ье11. 357, 1995, с. 140; Μ. 0\νηίκ и др., АпбтюгоЬ. Адеп1к СНегпобюг. 39, 1995, с. 180); обладающий поверхностной активностью рецептор протеина А (Впксое и др., Ат. ί. Рйукю1. 1233, 1995, с. 134); р120 (8сбге1ег и др., 1. Вю1. СНет. 269, 1994, с. 9090) (см. также Κ. Кетапеп; М.Ь. Ьаиккапеп, РЕВ8 Ьеб. 346, 1994, с. 123; 1.1. К111юп; Ι.Ι. Р1б1ег, Иптипотебюбк 4, 1994, с. 273).
Комбинации.
Изобретение относится также к способу предупреждения или лечения пролиферативных заболеваний или болезней, таких как рак, у млекопитающего, прежде всего у человека, с помощью комбинации фармацевтических агентов, которая включает:
(а) композицию нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4 и (б) одно или несколько фармацевтических действующих веществ.
Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей:
(а) композицию нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4;
(б) фармацевтическое действующее вещество и (в) фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение относится также к поступающей в продажу упаковке или продукту, которые содержат:
(а) фармацевтический препарат композиции нейтрализующего антитела к ΌΚΚ1/4 и (б) фармацевтический препарат фармацевтического действующего вещества для одновременного, сопутствующего, раздельного или последовательного применения.
Фармацевтические действующие вещества.
Понятие фармацевтические действующие вещества применяют в широком смысле, под это понятие подпадают многие действующие вещества с различными механизмами действия. Комбинации некоторых из указанных нейтрализующих антител к ^ΚΚ1/4/композиций могут повышать эффективность противораковой терапии. Как правило, фармацевтические действующие вещества классифицируют в зависимости от их механизма действия. Многие доступные агенты представляют собой антиметаболиты путей развития опухолей или вступают во взаимодействие с ДНК опухолевых клеток. Известны агенты, которые ингибируют ферменты, такие как топоизомераза Ι и топоизомераза ΙΙ, или антимитотические агенты.
Под фармацевтическим действующим веществом подразумевается прежде всего любое фармацевтическое действующее вещество, отличное от композиции нейтрализующего антитела к ΌΚΚ1/4 или его производного. К нему относятся (но не ограничиваясь только ими):
Ι) ингибитор ароматазы;
ΙΙ) антиэстроген, антиандроген или агонист гонадорелина;
ΙΙΙ) ингибитор топоизомеразы Ι или ингибитор топоизомеразы ΙΙ;
ГУ) обладающий активностью в отношении микротрубочек агент, алкилирующий агент, противоопухолевый антиметаболит или производное платины;
У) соединение, оказывающее направленное воздействие/снижающее активность белковой или липидной киназы или активность белковой или липидной фосфатазы, другое антиангиогенное соединение или соединение, которое индуцирует процессы дифференцировки клеток;
УГ) моноклональные антитела;
УП) ингибитор циклооксигеназы, бифосфонат, ингибитор гепараназы, модификатор биологического ответа;
УШ) ингибитор онкогенных изоформ Вак;
ΙΧ) ингибитор теломеразы;
X) ингибитор протеазы, ингибитор матричных металлопротеиназ, ингибитор метионинаминопептидазы или ингибитор протеосомы;
ΧΙ) агенты, применяемые для лечения гематологических злокачественных заболеваний, или соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность Р11-3;
ΧΙΙ) ингибитор н8Р90;
ΧΙΙΙ) антипролиферативные антитела;
ΧΙΥ) ингибитор гистондеацетилазы (нИАС);
ХУ) соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность/функцию сериновой/треониновой киназы тТ0В;
ХУ!) антагонист рецептора соматостатина;
ХУЛ) противолейкозное соединение;
ХУШ) подходы, с помощью которых повреждают опухолевые клетки;
- 39 015538
ΧΙΧ) ЕОС-связующее вещество;
XX) ингибитор рибонуклеотидредуктазы;
ΧΧΙ) ингибитор 8-аденозилметиониндекарбоксилазы;
ΧΧΙΙ) моноклональное антитело к УЕСЕ или УЕСЕЯ;
ΧΧΙΙΙ) агенты, применяемые для фотодинамической терапии;
ΧΧΙΛ^ ангиостатический стероид;
ΧΧ^) входящие в состав имплантата кортикостероиды;
ΧΧ'ΫΙ) антагонист АТ1-рецептора и
ΧΧ^Ι) ингибитор АСЕ.
Понятие ингибитор ароматазы в контексте настоящего описания относится к соединению, которое подавляет продуцирование эстрогенов, т.е. превращение субстратов - андростендиона и тестостерона в эстрон и эстрадиол соответственно. К таким ингибиторам относятся (но не ограничиваясь только ими) стероиды, прежде всего атаместан, экземестан и форместан, а также, в частности, нестероидные средства, прежде всего аминоглютетимид, роглетимид, пиродоглютетимид, трилостан, тестолактон, кетоконазол, ворозол, фадрозол, анастрозол и летрозол. Экземестан имеется на рынке под названием ΛЯ0МА8IN; форместан - под названием ^ЕNТΛЯ0N; фадрозол под названием АЕЕМА; анастрозол под названием АЯIМI^ЕX; летрозол под названием ЕЕМАЯА или ЕЕМАЯ и аминоглютетимид под названием 0ЯIМЕТЕN.
Предлагаемую в изобретении комбинацию, содержащую фармацевтическое действующее вещество, представляющее собой ингибитор аромататазы, наиболее целесообразно использовать для лечения опухолей с положительными рецепторами гормонов, например опухолей молочной железы.
Понятие антиэстроген в контексте настоящего описания относится к соединению-антагонисту, которое ослабляют действие эстрогенов на уровне их рецепторов. К таким антиэстрогенам относятся (но не ограничиваясь только ими) тамоксифен, фулвестрант, ралоксифен и ралоксифена гидрохлорид. Тамоксифен можно использовать, например, в виде его имеющегося на рынке препарата, такого, например, как N0^УΛ^ЕX; ралоксифена гидрохлорид имеется на рынке под названием ЕУ!8ТА. Фулвестрант можно использовать в составе фармацевтической композиции, описанной в И8 4659516, или его можно использовать, например, в виде его имеющегося на рынке препарата, такого как ЕΛ8^0^ЕX. Предлагаемую в изобретении комбинацию, содержащую фармацевтическое действующее вещество, представляющее собой антиэстроген, наиболее целесообразно использовать для лечения опухолей с положительными рецепторами эстрогенов, например опухолей молочной железы.
Понятие антиандроген в контексте настоящего описания относится к любой субстанции, которая обладает способностью ингибировать биологическое действие андрогенных гормонов, и к ним относятся (но не ограничиваясь только ими) бикалутамид (СА80^ЕX), который можно использовать в составе фармацевтической композиции, описанной, например, в И8 4636505.
Под понятием агонист гонадорелина в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) абареликс, госерелин и госерилина ацетат. Госерелин описан в И8 4100274, и он имеется в продаже под названием Ζ0^Λ^ЕX™. Абареликс можно использовать в составе фармацевтической композиции, описанной, например, в И8 5843901.
Под понятием ингибитор топоизомеразы Ι в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) топотекан, гиматекан, иринотекан, камптотецин и его аналоги, 9-нитрокамптотецин и макромолекулярные конъюгаты камптотецина РНи-166148 (соединение А1 в \У0 99/17804). Иринотекан можно использовать, например, в виде его имеющегося на рынке препарата, например, препарата, выпускаемого под товарным знаком САМРТ08АЯ. Топотекан можно использовать, например, в виде его имеющегося на рынке препарата, например, препарата, выпускаемого под товарным знаком НУСАМТГН.
Под ингибиторами топоизомеразы ΙΙ в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) антрациклины, такие как доксорубицин, включая его липосомную композицию, такую, например, как СΛЕ^ΥX, даунорубицин, включая его липосомную композицию, такую, например, как ^ΛυN080МЕ. эпирубицин, идарубицин и неморубицин; антрахиноны митоксантрон и лозоксантрон; и подофиллотоксины этопозид и тенипозид. Этопозид имеется на рынке под названием ЕТ0Р0РН08; тенипозид под названием УМ 26-ВЯ[8Т0Е; доксорубицин под названием Λ^ЯIΒ^А8ТIN или Λ^ЯIΛМΥСIN; эпирубицин под названием ЕАΚМ0ЯυΒIСIN; идарубицин под названием 2АУЕО08; и митоксантрон под названием N0УАNТЯ0N.
Под обладающим активностью в отношении микротрубочек агентом подразумеваются стабилизирующие микротрубочки, дестабилизирующие микротрубочки и ингибирующие полимеризацию микротрубочек агенты, включая (но не ограничиваясь только ими) таксаны, например, паклитаксел и доцетаксел, алкалоиды барвинка, например винбластин, прежде всего винбластина сульфат; винкристин, прежде всего винкристина сульфат, а также винорелбин; дискодермолиды; кахицин и его эпотилонизированные производные, например эпотилон В или его производные. Паклитаксел имеется на рынке под названием ТΛX0^; доцетаксел под названием ТΛX0ТЕЯЕ; винбластина сульфат под названием УШВРАЗТ^ Я.Р; и винкристина сульфат под названием ЕΛЯМI8ТIN. К ним относятся также дженерики
- 40 015538 паклитаксела, а также различные лекарственные формы паклитаксела. Дженериками паклитаксела является (но не ограничиваясь только им) бетаксолола гидрохлорид. Различные лекарственные формы паклитаксела включают (но не ограничиваясь только ими) альбуминовые наночастицы паклитаксела, имеющиеся в продаже под названием АВЯАХАМЕ; 0ХХ0С СУТ0ТАХ. Дискодермолид можно получать, например, с помощью метода, описанного в И8 5010099. К указанным агентам относятся также производные эпотилона, которые описаны в И8 6194181, ν0 98/10121, ν0 98/25929, ν0 98/08849, ν0 99/43653, ν0 98/22461 и ν0 00/31247. Наиболее предпочтительными являются эпотилон А и/или В.
Под алкилирующим агентом в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан или нитрозомочевина (ВСИи или С11абе1) или темозоламид (ТЕМ0БАЯ). Циклофосфамид можно использовать, например, в виде его имеющегося на рынке препарата, например, препарата, выпускаемого под товарным знаком С¥СЬ08ТГЫ; а ифосфамид можно использовать в виде препарата, выпускаемого под товарным знаком Н0Ь0ХА№
Под противоопухолевыми антиметаболитами подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) 5-фторурацил (5-ФУ); капецитабин; гемцитабин; деметилирующие ДНК агенты, такие как 5-азацитидин и децитабин; метотрексат; эдатрексат; и антагонисты фолевой кислоты, такие, например, как (но не ограничиваясь только им) пеметрексед. Капецитабин можно использовать, например, в виде его имеющегося на рынке препарата, например, препарата, выпускаемого под товарным знаком ХЕЬ0БА; а гемцитабин можно использовать в виде препарата, выпускаемого под товарным знаком ΟΗΜΖΛΡ.
Под соединением платины в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) карбоплатин, цисплатин, цисплатина, оксалиплатин, сатраплатин и содержащие платину соединения, такие как ΖΌ0473. Карбоплатин можно использовать, например, в виде его имеющегося на рынке препарата, например, препарата, выпускаемого под товарным знаком САЯВ0РЬАТ; а оксалиплатин можно использовать в виде препарата, выпускаемого под товарным знаком Е^0XΛΤIN.
Под соединениями, оказывающими направленное воздействие/снижающими активность белковой или липидной киназы; или активность белковой или липидной фосфатазы; или другими антиангиогенными соединениями в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) ингибиторы протеинтирозинкиназы и/или серин- и/или треонинкиназы либо ингибиторы киназы липидов, например:
Ι) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность рецепторов сосудистого эндотелиального фактора роста (УЕСЕ), например соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность УЕСЕ, прежде всего соединения, которые ингибируют рецептор УЕСЕ, такие как (но не ограничиваясь только ими) 7Нпирроло[2,3-б]пиримидиновые производные (АЕЕ788); ВАУ 43-9006; изохолиновые производные, описанные в ν0 00/09495, например (4-трет-бутилфенил)-4-пиридин-4-илметилизохинолин-1-иламин (ААЬ881); и
ΙΙ) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность рецепторов тромбоцитарного фактора роста (РБСЕЯ), например соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность РБСЕЯ, прежде всего соединения, которые ингибируют рецептор РБСЕ, например №фенил-2-пиримидинаминовые производные, например иматиниб, 8И101, 8И6668 и СЕВ-111;
ΙΙΙ) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность рецепторов фактора роста фибробластов (ЕСЕЯ);
ГУ) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность рецептора 1 инсулиноподобного фактора роста (ЮЕ-1Я), например соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность ЮГ-Ш, прежде всего соединения, которые ингибируют ЮЕ-1Я. К таким соединениям относятся (но не ограничиваясь только ими) соединения, описанные в ν0 02/092599, и их производные, такие как 4-амино-5-фенил-7-циклобутилпирроло[2,3-б]пиримидиновые производные (АЕV541);
У) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность семейства рецепторных тирозинкиназ Тгк;
У!) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность семейства рецепторных тирозинкиназ Ах1;
УП) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность рецептора с-Ме!;
УШ) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность рецепторной тирозинкиназы Яе!;
ΙΧ) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность рецепторной тирозинкиназы 1<П/8СЕЯ;
Х) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность рецепторных тирозинкиназ с-Κίΐ (представителей семейства РБСЕЯ), например соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность семейства рецепторных киназ с-Κίΐ, прежде всего соединения, которые ингибируют рецептор с-Κίΐ, например иматиниб;
- 41 015538
XI) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность представителей семейства ЛЫ и продуктов их генного слияния, например киназы ВСЯ-ΑΜ, например соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность представителей семейства е-ЛЫ и продуктов их генного слияния, например Ы-фенил-2пиридинаминовое производное, например иматиниб, ΡΌ180970, Л6957, М8С680410 или ΡΌ173955 фирмы РагкеОаой; ВМ8354825;
XII) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность представителей протеинкиназы С (РКС) и семейства сериновых/треониновых киназ ЯаГ, представителей семейства МЕК, 8ЯС, 1ЛК, ЕЛК, ΡΌΚ и Яаз/МЛРК или семейства киназ Р1(3) или семейства киназ, родственных Р1(3)-киназам, и/или представителей семейства циклинзависимых киназ (СОК), и прежде всего стауроспориновые производные, описанные в И8 5093330, например мидостаурин; примерами других соединений являются, например, иСЫ-01; сафингол; ΒΑΥ 43-9006; бриостатин 1; перифосин; илмофосин; ЯО318220 и ЯО320432; 6Θ6976; Ιδίδ3521; ΕΥ333531/ΕΥ379196; изохинолиновые производные, например, описанные в \УО 00/09495; ΕΤΙ; РЭ184352 или ΟΑΝ697, ингибитор Р13К;
XIII) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность протеинтирозинкиназ, такие как иматиниба мезилат (СЬЕЕУЕС); тирфостин или пиримидиламинобензамид и их производные (ΑΜΝ107). Тирфостин представляет собой предпочтительно низкомолекулярное соединение (Мг<1500) или его фармацевтически приемлемую соль, прежде всего соединение, выбранное из класса бензилиденмалонитрила или 8-арилбензолмалонитрила или из класса бисубстратных хинолиновых производных, более предпочтительно любое соединение, выбранное из группы, включающей тирфостин Α23/Κ6-50810, Α6 99, тирфостин Α6 213, тирфостин Α6 1748, тирфостин Α6 490, тирфостин В44, (+) энантиомер тирфостина В44, тирфостин Α6 555, Α6 494, тирфостин Α6 556; Α6957 и адафостин, адамантиловый эфир (4-{[(2,5-дигидроксифенил)метил]амино}бензойной кислоты, №С 680410, адафостин);
XIV) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность рецепторных киназ семейства эпидермального фактора роста (ЕСЕЯ, ЕгЬВ2, ЕгЬВ3, ЕгЬВ4 в виде гомо- или гетеродимеров), например соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность представителей семейства рецепторов эпидермального фактора роста, прежде всего соединения, белки или антитела, которые ингибируют активность представителей семейства ЕСЕ-рецепторных тирозинкиназ, например ЕСЕ-рецептора, ЕгЬВ2, ЕгЬВ3 и ЕгЬВ4, или связываются с ЕСЕ или ЕСЕ-родственными лигандами, и прежде всего соединения, белки или моноклональные антитела, которые в целом и конкретно описаны в XVО 97/02266, например, соединение из примера 39, или в ЕР 0564409, \ν() 99/03854, ЕР 0520722, ЕР 0566226, ЕР 0787722, ЕР 0837063, И8 5747498, №О 98/10767, XV О 97/30034, XVО 97/49688, XVО 97/38983, в частности в XV О 96/30347, например, соединение, обозначенное как СР 358774, в ^О 96/33980, например, соединение ΖΌ 1839; и в ^О 95/03283, например, соединение 2М105180, например трастузумаб (НЕЯСЕРТШ®), цетиксимаб, иресса, О8Е774, О 1033, ЕКВ-569, С^-2016, Е1.1, Е2.4, Е2.5, Е6.2, Е6.4, Е2.11, Е6.3 или Е7.6.3, и 7Н-пирроло[2,3б]пиримидиновые производные, которые описаны XVО 03/013541, эрлотиниб и гефитиниб. Эрлотиниб можно использовать, например, в виде его имеющегося на рынке препарата, например препарата, выпускаемого под товарным знаком ΤΑЯСЕVΑ, а гефитиниб можно использовать в виде препарата, выпускаемого под товарным знаком IЯЕ88Α, человеческие моноклональные антитела против рецептора эпидермального фактора роста, включая ΑΒX-ЕСЕЯ; и
XV) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность/функцию серин/треонинкиназы тТОЯ, прежде всего соединения, белки или антитела, которые оказывают направленное воздействие/ингибируют представителей семейства киназы тТОЯ, например, ΡΑΌ, ЯΑ^001, ССЕ779, ЛВТ578, 8ЛЯ543, рапамицин и их производные и/или аналоги, АР23573 и АР23841 фирмы Απαύ, эверолимус (СЕЯΤIСΑN) и сиролимус. СЕЯΤIСΑN (эверолимус, ΡΑΩ) представляет собой находящийся на стадии исследования новый ингибитор сигнала пролиферации, который предупреждает пролиферацию Т-клеток и клеток гладких мышц сосудов.
При использовании понятия антитело подразумевают интактные моноклональные антитела, нанотела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела, образованные по меньшей мере из двух интактых антител, и фрагменты антител, если они обладают требуемой биологической активностью.
Под соединениями, оказывающими направленное воздействие, снижающие или ингибирующими активность белковой или липидной фосфататазы в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) ингибиторы фосфатазы 1, фосфатазы 2Α, ΡΤЕN или СЭС25, например, окадайная кислота или ее производные.
Под моноклональными антителами в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) бевацизумаб, цетуксимаб, трастузумаб, ибритумомаба тиуксетан, деносумаб, антитело к СЭ40, антитело к СМ-С8Е, а также тоситумомаб и йод I131. Бевацизумаб можно использовать, например, в виде его имеющегося на рынке препарата, например препарата, выпускаемого под товарным знаком ΑνΑδΉΝ; цетуксимаб можно использовать в виде препарата, выпускаемого под товарным знаком ЕЯΒIΤυX; трастузумаб можно использовать в виде препарата, выпускаемого под товарным знаком
- 42 015538
НЕКСЕРТШ; ритуксимаб можно использовать в виде препарата, выпускаемого под товарным знаком МАВТНЕКА; ибритумомаба тиуксетан можно использовать в виде препарата, выпускаемого под товарным знаком ХЕУиЕШ; антитело к КАПХЕ под названием деносумаб (АМС 162), антитело к 0Ό40 под названием НСЭ122 (заявка на патент США 2002-0106371), а тоситумомаб и йод Ι131 можно использовать в виде препарата, выпускаемого под товарным знаком ВЕХХАК.
Под другими антиангиогенными соединениями в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) соединения, обладающие иным механизмом действия, например, отличным от способности ингибировать киназы белков или липидов, например талидомид (ТНАЕС)\П1)) и Т№-470.
Под соединениями, которые индуцируют процессы дифференцировки клеток в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) ретиноевая кислота, α-, γ- или δтокоферол или α-, γ- или δ-токотриенол.
Под ингибитором циклооксигеназы в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) ингибиторы Сох-2, например 5-алкилзамещенная 2-ариламинофенилуксусная кислота и ее производные, такие как целекоксиб (СЕЕЕВКЕХ), рофекоксиб (УЮХХ), эторикоксиб, валдекоксиб, или 5-алкил-2-ариламинофенилуксусная кислота, например, 5-метил-2-(2'-хлор-6'фторанилино)фенилуксусная кислота, лумиракоксиб.
Под бисфосфонатами в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) этридоновая, клодроновая, тилудроновая, памидроновая, алендроновая, ибандроновая, резидроновая и золедроновая кислота. Этридоновую кислоту можно использовать в виде препарата, выпускаемого под товарным знаком ^I^КΟNЕ^; клодроновую кислоту - под товарным знаком ΒΟNЕΕΟБ; тилудроновую кислоту - под товарным знаком БЕЕЕГО; памидроновую кислоту под товарным знаком АКЕША; алендроновую кислоту - под товарным знаком ΕΟБΑМΑX; ибандроновую кислоту под товарным знаком ΒΟN^КΑNΑТ; резидроновую кислоту - под товарным знаком АСТО^Ь; а золедроновую кислоту - под товарным знаком ΖΟМЕТΑ.
Под ингибитором гепараназы в контексте настоящего описания подразумеваются соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие расщепление гепаринсульфата. Понятие относится (но не ограничиваясь только им) к ΡI 88.
Под модификатором биологического ответа в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) лимфокин или интерфероны, например интерферон γ.
Под ингибитором онкогенных изоформ Как в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) Н-Как, Κ-Как или Ν-Как, т.е. соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие онкогенную активность Как, например, ингибитор фарнезилтрансферазы (ΕΉ), например Ь-744832, ΌΚ8Ο557 или К115777 (2АКПЕБТКА).
Под ингибитором теломеразы в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность теломеразы. Соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность теломеразы, прежде всего представляют собой соединения, которые ингибируют рецептор теломеразы, например теломестрин.
Под ингибитором матриксной металлопротеиназы или (ингибитором ММР) в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) относящиеся к пептидометикам и непептидометикам коллагеновые ингибиторы; производные тетрациклина, например, гидроксаматный относящийся к пептидометикам ингибитор батимастат; и его обладающий биологической доступностью при оральном введении аналог маримастат (ВВ-2516), приномастат (АС3340), метастат (№С 683551), ВМБ 279251, ВАУ 12-9566, ТАА211, ММП70В или АА1996.
Под ингибитором метионинаминопептидазы в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность метионинаминопептидазы. Соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность метионинаминопептидазы, представляют собой, например, бенгамид или его производное.
Под ингибитором протеосомы в контексте настоящего описания подразумеваются соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность протеосомы. Соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность протеосомы, представляют собой (но не ограничиваясь только ими) РБ-341; МЕ-Ν 341, бортезомиб или велкад (Уе1сайе).
Под агентом, применяемым для лечения гематологических злокачественных заболеваний в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) ингибиторы ЕМБ-подобной тирозинкиназы, например, соединения, оказывающие направленное воздействие, снижающие или ингибирующие активность рецепторных ЕМБ-подобных тирозинкиназ (Е1!-3К); интерферон, 1-Ь-Эарабинофуранзилцитоцин (ага-с) и бисульфан и ингибиторы АЕК, например, соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность киназы анапластической лимфомы.
- 43 015538
Под соединениями, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность Е11-3 в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) соединения, белки или антитела, которые ингибируют Е11-3, например Мбензоилстауроспорин, мидостаурин, производное стауроспорина, 8И11248 и МБ№18.
Под понятием ингибиторы Н8Р90 в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют присущую Н8Р90 АТФазную активность; расщепляя, оказывая направленное воздействие, снижая или ингибируя белки-мишени Н8Р90 через протеосомный путь убикитина. Соединения, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют присущую Н8Р90 АТФазную активность, прежде всего представляют собой соединения, белки или антитела, которые ингибируют АТРазную активность Н8Р90, например 17-аллиламино,17-деметоксигелданамицин (17ААС), производное гелданамицина; другие соединения, родственные гелданамицину; радицикол и ингибиторы НИАС.
Под понятием антипролиферативное антитело в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) трастузумаб (НЕЯСЕРТЕЫ), трастузумаб-ЭМЕ эрлотиниб (ТАЯСЕУА), бевацизумаб (АУА8ТЕЫ), ритуксимаб (Я1ТИХА^, РЯ064553 (антитело к СИ40) и антитело 2С4. Под антителами подразумеваются, например, интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела, образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител, если они обладают требуемой биологической активностью.
Под ингибитором НИАС в контексте настоящего описания подразумеваются соединения, которые ингибируют гистондеацетилазу и которые обладают антипролиферативной активностью. К ним относятся (но не ограничиваясь только ими) соединения, описанные в \У0 02/22577, в частности Мгидрокси-3[4-[[(2-гидроксиэтил)[2-(1Н-индол-3-ил)этил]амино]метил] фенил]-2Е-2-пропенамид и Мгидрокси-3-[4[[[2-(2-метил-1Н-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2Е-2-пропенамид и их фармацевтически приемлемые соли (ЬВН589). К ним относятся также субероиланилидгидроксамовая кислота (8АНА); пиридин3-илметиловый эфир [4-(2-аминофенилкарбамоил)бензил]карбаминовой кислоты и его производные; масляная кислота, пироксамид, трихостатин А, оксамфлатин, апицидин, депсипептид; депудецин и трапоксин.
Под соединением, которое оказывает направленное воздействие, снижает или ингибируют активность/функцию сериновой/треониновой киназы тТ0Я в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) соединения, белки или антитела, которые оказывают направленное воздействие/ингибируют представителей семейства киназы тТ0Я, например ЯАИ, ЯАИ001, СС1779, АВТ578, 8АК543, рапамицин и его производные/аналоги, АР23573 и АР23841 фирмы Апаб, эверолимус (СЕЯТ1СА^ и сиролимус (КАРАМИИЕ), СС1-779 и АВТ578. СЕЯТIСАN (эверолимус, ЯАИ) представляет собой находящийся на стадии исследования новый ингибитор сигнала пролиферации, который предупреждает пролиферацию Т-клеток и клеток гладких мышц сосудов.
Под антагонистом рецептора соматостатина в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) агенты, которые оказывают направленное воздействие, лечат или ингибируют рецептор соматостатина, например, остреорид и 80М230.
Под противолейкозным соединением в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) Ага-С, пиримидиновый аналог, представляющий собой 2'-αгидроксирибозное (арабинозид) производное дезоксицитидина. К ним относятся также пуриновый аналог гипоксантина, 6-меркаптопурин (6-МР) и флударабина фосфат.
Под подходами, с помощью которых повреждают опухолевые клетки подразумеваются такие подходы, как ионизирующее излучение. Понятие ионизирующее излучение, упомянутое выше и ниже, означает ионизирующее излучение, которое представляет собой либо электромагнитные лучи, такие как рентгеновские лучи и гамма-лучи; либо частицы, такие как альфа-, бета- и гамма-частицы. Ионизирующее излучение применяют для лучевой терапии (но их сфера применения не ограничена указанной), и оно хорошо известно в данной области (см. Не11тап, Сапсег, 4-е изд., т. 1, под ред. Иеуйа и др., с. 248275, 1993).
Под ΕΌΟ-связующим веществом в контексте настоящего описания подразумевается (но не ограничиваясь только ими) класс иммунодепрессантов, которые модулируют рециркуляцию лимфоцитов, например, ЕТУ720.
Под ингибитором рибонуклеотидредуктазы в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) аналоги пиримидиновых или пуриновых нуклеозидов, включая (но не ограничиваясь только ими) флударабин и/или ага-С; 6-тиогуанин; 5-ФУ; кладрибин; 6-меркаптопурин, прежде всего в сочетании с ага-С при лечении АЬЬ (острый лимфолейкоз); и/или пентостатин. Примерами ингибиторов рибонуклеотидредуктазы являются, в частности, гидроксимочевина или 2-гидрокси-1Низоиндол-1,3-дионовые производные, такие как РЬ-1, РЬ-2, РЬ-3, РЬ-4, РЬ-5, РЬ-6, РЬ-7 или РЬ-8 (см. Nаπάу и др., Ас1а 0псо1одюа, 33, 8, 1994, с. 953-961).
Под ингибиторами 8-аденозилметионинодекарбоксилазы в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) соединения, описанные в И8 5461076.
- 44 015538
Под моноклональными антителами к УЕСЕ или УЕСЕК в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) соединения, описанные в νθ 98/35958, например 1-(4хлоранилино)-4-(4-пиридилметил)фталазин или его фармацевтически приемлемая соль, например сукцинат, или в νθ 00/09495, νθ 00/27820, νθ 00/59509, νθ 98/11223, νθ 00/27819 и ЕР 0769947; соединения, описанные в РгехгеИ и др., Сапсег Кек, 59, 1999, с. 5209-5218; Уиап и др., Ргос. Νη11. Асай. 8сЕ И8А, 93, 1996, с. 14765-14770; 2Ии и др., Сапсег Кек, 58, 1998, с. 3209-3214 (1998); и у Μοι^ίί и др., ^Χοο! РаМ, 27, 1, 1999, с. 14-21, в νθ 00/37502 и νθ 94/10202; ΑNСIО8ТΑТIN, описанный у О'КеШу и др., Се11, 79, 1994, с. 315-328; ЕИООЗТАТШ, описанный у О'КеШу и др., Се11, 88, 1997, с. 277-285; амиды антраниловой кислоты; ΖΌ4190; ΖΌ6474; 8И5416; 8и6668; бевацизумаб; или антитела к УЕСЕ или антитела к рецептору УЕСЕ, например, гИиМАЬ и КНИЕаЬ; аптамер УЕСЕ, например, макугон; ингибиторы ЕЬТ-4; ингибиторы ЕЬТ-3; антитело к УЕСЕК-2 в виде 1дС1; ангиозим (КР1 4610); и авастан.
Под фотодинамической терапией в контексте настоящего описания подразумевается терапия, в которой используют определенные химические вещества, которые известны как фотосенсибилизирующие агенты, которые применяют для лечения или предупреждения рака. Примером фотодинамической терапии является (но не ограничиваясь только им) лечение такими агентами, как У18иОУИЕ и порфимер натрия.
Под ангиостатическим стероидом в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) агенты, которые блокируют или ингибируют ангиогенез, такие, например, как анекорват, триамцинолон, гидрокортизон, 11-а-эпигидрокортизол, кортексолон, 17-а-гидроксипрогестерон, кортикостерон, дезоксикортикостерон, тестостерон, эстрон и дексаметазон.
Под входящими в состав имплантата кортикостероидами в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) такие агенты, как флуцинолон и дексаметазон.
Под антагонистами АТ1-рецептора в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) такие агенты, как ИЮУА№
Под ингибитором АСЕ в контексте настоящего описания подразумеваются (но не ограничиваясь только ими) СЧВАСЕИ беназеприл, эназеприл (КОТЕ^ЕИ), каптоприл, эналаприл, фосиноприл, лисиноприл, моексиприл, хинаприл, рамиприл, периндоприл и трандолаприл.
Другие фармацевтические действующие вещества представляют собой (но не ограничиваясь только ими) растительные алкалоиды, гормональные агенты и антагонисты, модификаторы биологического ответа, предпочтительно лимфокины или интерфероны, антисмысловые олигонуклеотиды или производные олигонуклеотидов; или смеси агентов или агенты с другим или неизвестным механизмом действия.
В каждом случае при цитировании заявок на патенты или научных публикаций, прежде всего касательно соответствующих заявляемых соединений и конечных продуктов, описанных в действующих образцах, сущность конечных продуктов, фармацевтических препаратов, а также формулы изобретения включены в настоящее описание при ссылке на указанные публикации. В настоящее описание включены также соответствующие стереоизомеры, а также соответствующие кристаллические модификации, например, сольваты и полиморфы, которые описаны в указанных публикациях. Соединения, которые применяют в качестве действующих веществ в сочетании с представленными в настоящем описании соединениями, можно получать и применять согласно процитированным документам соответственно.
Данные о структуре действующих веществ, обозначенных кодовыми номерами, непатентованными названиями или торговыми наименованиями, можно получить в последнем издании стандартного справочника ТИе Мегск 1пйех либо в базах данных, например, в международных патентных базах данных, например, в 1М8 \νοιΉ РиЬ1юа1юпк, или в публикациях, упомянутых выше и ниже. Их соответствующее содержание включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Следует понимать, что при ссылке на компоненты (а) и (б) подразумеваются также фармацевтически приемлемые соли любой из активных субстанций. Если активные субстанции, представляющие собой компоненты (а) и (б), имеют, например, по меньшей мере один основный центр, то они могут образовывать кислотно-аддитивные соли. При необходимости можно получать также соответствующие кислотно-аддитивные соли, которые имеют дополнительный основный центр. Активные субстанции, которые имеют кислотную группу, например СООН, могут образовывать соли с основаниями. Активные субстанции, представляющие собой компоненты (а) и/или (б) или их фармацевтически приемлемые соли, можно применять также в форме гидрата, или они могут включать другие растворители, применяемые для кристаллизации.
Таким образом, одним из объектов настоящего изобретения является способ предупреждения или лечения пролиферативных заболеваний или болезней, которые инициируются постоянным ангиогенезом, у больного млекопитающего, предпочтительно человека, заключающийся в том, что пациента одновременно или последовательно обрабатывают взятой в эффективном количестве комбинацией, которая содержит:
(а) композицию нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4 и (б) фармацевтическое действующее вещество.
- 45 015538
Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является фармацевтический препарат, содержащий:
(а) композицию нейтрализующих антител к ΌΚΚ1/4 и (б) одно или несколько фармацевтических действующих веществ, выбранных из группы, включающей ингибитор ароматазы; антиэстроген; антиандроген; агонист гонадорелина; ингибитор топоизомеразы Ι; ингибитор топоизомеразы ΙΙ; проявляющий активность в отношении микротрубочек агент; алкилирующий агент; противоопухолевый антиметаболит; соединение платины; соединение, оказывающее направленное воздействие/снижающее активность белковой или липидной киназы или активность белковой или липидной фосфатазы, антиангиогенное соединение; соединение, индуцирующее процессы дифференцировки клеток; моноклональные антитела; ингибитор циклооксигеназы; бисфосфонат; ингибитор гепараназы; модификатор биологического ответа; ингибитор онкогенных изоформ Как; ингибитор теломеразы; ингибитор протеазы, ингибитор матричной металлопротеиназы, ингибитор метионинаминопептидазы; ингибитор протеосомы; агенты, которые оказывают направленное воздействие, снижают или ингибируют активность Е11-3; ингибитор Н8Р90; антипролиферативные антитела; ингибитор НЭЛС; соединение, которое оказывает направленное воздействие, снижает или ингибирует активность/функцию сериновой/треониновой киназы тТОК; антагонист рецептора соматостатина; противолейкозное соединение; подходы, с помощью которых повреждают опухолевые клетки; ЕЭС-связующее вещество; ингибитор рибонуклеотидредуктазы; ингибитор 8-аденозилметиониндекарбоксилазы; моноклональное антитело к УЕСГ или УЕСГК; агенты, применяемые для фотодинамической терапии; ангиостатический стероид; входящие в состав имплантата кортикостероиды; антагонист АТ1-рецептора; и ингибитор АСЕ.
Любую комбинацию компонентов (а) и (б), способ лечения теплокровного животного, предусматривающий введение указанных двух компонентов, фармацевтическую композицию, содержащую указанные два компонента, которая предназначена для одновременного, раздельного или последовательного применения, применение комбинации для замедления развития или лечения пролиферативного заболевания, или для приготовления фармацевтического препарата, предназначенного для указанных целей или поступающего в продажу продукта, содержащего комбинацию компонентов (а) и (б), как они все упомянуты или определены выше, следует рассматривать далее как комбинацию, предлагаемую в изобретении (т.е. это понятие относится к каждому из указанных вариантов осуществления изобретения, которые при необходимости могут заменять это понятие).
Одновременное применение можно осуществлять, например, с использованием одной фиксированной комбинации двух или большего количества действующих веществ, или можно вводить одновременно два или большее количество действующих веществ в виде независимых препаратов. Последовательное применение (введение) предпочтительно подразумевает введение одного (или большего количества) компонентов комбинации в один момент времени, другого компонента в другой момент времени, т. е. путем постоянного поэтапного применения, предпочтительно таким образом, что комбинация обладает более высокой эффективностью по сравнению с введением индивидуальных соединений независимо друг от друга (прежде всего обладает синергетическим действием). Раздельное применение (введение) предпочтительно означает введение компонентов комбинации независимо друг от друга в различные моменты времени, предпочтительно означает, что компоненты (а) и (б) вводят таким образом, чтобы измеряемые уровни обоих соединений в крови не перекрывались (не присутствовали в одно и то же время).
Можно также применять комбинации двух или большего количества последовательных, раздельных или одновременных введений, предпочтительно таким образом, чтобы входящие в комбинацию компоненты-лекарственные средства обладали совместным терапевтическим действием, превышающим действие, обнаруживаемое при независимом введении входящих в комбинацию компонентовлекарственных средств с временными интервалами, слишком большими для проявления совместного воздействия на их терапевтическую эффективность, при этом предпочтительным является синергетическое действие.
Понятие замедление развития в контексте настоящего описания означает введение комбинации пациентам на фазе, предшествующей развитию заболевания или на ранней фазе его развития, первого проявления или рецидива заболевания, подлежащего лечению, где у пациентов, например, диагностирована предварительная форма соответствующего заболевания или где пациенты имеют состояние, например, в процессе медицинского лечения или состояние, являющееся результатом осложнения, при котором вероятно развитие соответствующего заболевания.
Понятие совместная терапевтическая активность или совместное терапевтическое действие означает, что соединения можно применять раздельно (путем постоянного поэтапного введения, в частности путем конкретного последовательного введения) с такими временными интервалами, которые предпочтительны для осуществления лечения теплокровного животного, прежде всего человека, но они еще оказывают (предпочтительно синергетическое) взаимное действие (совместное терапевтическое действие). Наличие этого факта среди прочего можно определять путем анализа уровней в крови, свидетельствующих о том, что оба соединения присутствуют в крови человека, подлежащего лечению, по меньшей мере, в течение определенных интервалов времени.
- 46 015538
Понятие фармацевтически эффективное предпочтительно относится к количеству, которое обладает терапевтическими или в более широком смысле также и профилактическим действием в отношении развития пролиферативного заболевания.
Понятие предназначенная для продажи упаковка или продукт в контексте настоящего описания относится прежде всего к состоящему из частей (компонентов) набору, в том смысле, что указанные выше компоненты (а) и (б) можно применять в виде определенных доз независимо или использовать различные фиксированные комбинации с различными количествами компонентов (а) и (б), т.е. одновременно или в различные моменты времени. Кроме того, под этими понятиями подразумевается предназначенная для продажи упаковка, содержащая (в частности, в виде объединенного продукта) компоненты (а) и (б) в качестве действующих веществ, в сочетании с инструкциями по их одновременному, последовательному (путем постоянного поэтапного введения, предпочтительно зависимого от времени последовательного применения) или (что является менее предпочтительным) раздельного применения для замедления развития или для лечения пролиферативного заболевания. Части состоящего из частей набора затем можно применять, например, одновременно или постоянно поэтапно, т. е. в различные моменты времени и с одинаковыми или различными временными интервалами касательно каждой части состоящего из частей набора. Наиболее предпочтительно временные интервалы выбирают таким образом, чтобы действие на подлежащее лечению заболевание при совместном применении частей было выше, чем действие, которое можно получать при применении только одного из входящих в комбинацию компонентов (а) и (б) (что можно определять с помощью стандартных методов). Соотношение общих количеств компонента (а) комбинации и компонента (б) комбинации, вводимых в виде объединенного препарата, может варьироваться, например, для того, чтобы удовлетворять потребностям субпопуляции пациентов, подлежащих лечению, или потребностям индивидуального пациента, которые варьируются в зависимости от конкретного заболевания, возраста, пола, веса тела и т.д. пациентов. Предпочтительно получают по меньшей мере одно благоприятное действие, например, общее повышение эффективности комбинации компонентов (а) и (б), в частности действие, превышающее аддитивное, в результате для достижения которого можно использовать более низкие дозы каждого из входящих к комбинацию лекарственных средств соответственно, чем переносимые дозы в случае лечения только индивидуальными лекарственными средствами без их объединения, получают дополнительные благоприятные действия, например уменьшение побочных действий или объединенное терапевтическое действие при использовании неэффективных доз одного или обоих компонентов (входящих в комбинацию партнеров) (а) и (б), и наиболее предпочтительно выраженный синергизм входящих в комбинацию компонентов (а) и (б).
Как в случае применения комбинации компонентов (а) и (б), так и в случае применения предназначенной для продажи упаковки, можно использовать также любую комбинацию для одновременного, последовательного или раздельного применения, т.е. компоненты (а) и (б) можно вводить одновременно в один и тот же момент времени, затем вводить только один компонент, обладающий меньшей токсичностью для хозяина, либо постоянно, например в течение более 3-4 недель, путем ежедневной обработки, в более отдаленный момент времени и затем вводить другой компонент или комбинацию обоих компонентов в еще более отдаленный момент времени (последовательные курсы совместной терапии для оптимального противоракового действия) или т.п.
Комбинацию, предлагаемую в изобретении, можно применять в сочетании с другими путями лечения, например хирургическим вмешательством, гипертермией и/или лучевой терапией.
Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять общепринятыми путями, и их можно применять для энтерального, такого как оральное или ректальное, и парентерального введения млекопитающим, включая человека, используя ингибитор УЕСЕ в терапевтически эффективном количестве и по меньшей мере одно фармацевтическое действующее вещество индивидуально или в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, прежде всего пригодными для энтерального или парентерального введения.
Фармацевтические композиции содержат от 0,00002 до примерно 100%, прежде всего, например, в случае растворов для инфузии, готовых к применению, от 0,0001 до 0,02%, или, например, в случае концентратов для инъекций или инфузий или прежде всего парентеральных препаратов от примерно 0,1 до примерно 95%, предпочтительно от примерно 1 до примерно 90%, более предпочтительно от примерно 20 до примерно 60% действующего вещества (в каждом случае в мас.%). Фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, могут представлять собой, например, стандартную дозу, например в форме ампул, пузырьков, драже, таблеток, инфузионных пакетов или капсул.
Эффективная доза каждого компонента комбинации, применяемая в препарате, предлагаемом в настоящем изобретении, может варьироваться в зависимости от применяемого конкретного соединения или фармацевтических композиций, пути введения, состояния, подлежащего лечению, и серьезности состояния, подлежащего лечению. Обычный специалист в данной области, такой как лечащий врач, клиницист или ветеринар, легко может определять эффективное количество каждого действующего вещества, необходимого для предупреждения, лечения или замедления развития состояния.
Тирфостины, прежде всего адафостин, предпочтительно вводят теплокровному животному, прежде всего человеку, в дозе, составляющей примерно 1-6000 мг/день, более предпочтительно 25-5000 мг/день,
- 47 015538 наиболее предпочтительно 50-4000 мг/день. Если не указано иное, соединение предпочтительно вводят от 1 до 5, прежде всего от 1 до 4 раз в день.
Фармацевтические препараты для комбинированной терапии, предназначенные для энтерального или парентерального введения, представляют собой, например, препараты в виде стандартных доз, такие как таблетки с сахарным покрытием, капсулы или суппозитории, а также ампулы. Если не указано иное, то эти препараты приготавливают известными методами, например, обычными методами смешения, гранулирования, нанесения покрытия, растворения или лиофилизации. Должно быть очевидно, что содержание каждого компонента комбинации в отдельной дозе каждой лекарственной формы необязательно должно представлять собой эффективное количество, поскольку необходимое эффективное количество может быть достигнуто с помощью нескольких стандартных доз. Специалисту в данной области должно быть очевидно, как определять соответствующие фармацевтически эффективные количества компонентов комбинации.
Предпочтительно соединения или их фармацевтически приемлемые соли вводят в виде фармацевтического препарата для орального введения в форме таблетки, капсулы или сиропа; или при необходимости в виде парентеральных инъекций.
При приготовлении композиций для орального введения можно применять любые фармацевтически приемлемые среды, такие как вода, гликоли, масла, спирты, корригенты, консерванты, красители. Фармацевтически приемлемые носители включают крахмалы, сахара, микрокриталллические целлюлозы, разбавители, гранулирующие агенты, замасливатели, связующие агенты, разрыхлители.
Растворы, а также суспензии действующих веществ и прежде всего изотонические водные растворы или суспензии, можно применять для парентерального введения действующего вещества, что является возможным, например, в случае лиофилизированных композиций, которые содержат действующее вещество индивидуально или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, например, маннитом, для приготовления указанных растворов или суспензий перед применением. Фармацевтические композиции можно стерилизовать, и/или они могут содержать эксципиенты, например, консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты и/или эмульгаторы, солюбилизаторы, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы, и их приготавливают известными методами, например, с использованием традиционных процессов растворения и лиофилизации. Указанные растворы или суспензии могут содержать повышающие вязкость субстанции, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливинилпирролидон или желатин. Суспензии в масле содержат такой масляный компонент, как растительные, синтетические или полусинтетические масла, которые традиционно применяют для инъекций.
Придающий изотоничность агент можно выбирать из известных в данной области соединений, таких как маннит, декстроза, глюкоза и хлорид натрия. Препарат для инфузии можно разбавлять водной средой. Применяемое в качестве разбавителя количество водной среды выбирают, исходя из требуемой концентрации действующего вещества в растворе для инфузии. Растворы для инфузии могут содержать другие эксципиенты, которые обычно применяют в препаратах для внутривенного введения, такие как антиоксиданты.
Настоящее изобретение относится также к комбинированному препарату, в контексте настоящего описания это понятие относится также к состоящему из частей набору в том смысле, что указанные выше компоненты (а) и (б) комбинации можно применять независимо друг от друга или применять в виде различных фиксированных комбинаций с различными количествами в комбинации компонентов (а) и (б), т. е. одновременно или в различные моменты времени. Компоненты состоящего из частей набора затем можно, например, вводить одновременно или постоянно поэтапно, т. е. в различные моменты времени и с одинаковыми или различными временными интервалами между введениями каждой части состоящего из частей набора. Соотношение общих количеств компонента (а) комбинации и компонента (б) комбинации, которые используют в комбинированном препарате, могут варьироваться, например, для того, чтобы удовлетворять потребностям субпопуляции пациентов, подлежащих лечению, или потребностям индивидуального пациента с учетом серьезности любых побочных действий, возникающих у пациента.
Применения и способы, предлагаемые в изобретении.
Антитела (и иммуноконъюгаты и биспецифические молекулы), предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять ш ν 11го и ш νί\Ό в диагностических и терапевтических целях. Например, эти молекулы можно вводить в клетки в культуре, например, ш ν Иго или ш νίνΌ, или индивидууму, например, ш νίνΌ, для лечения, предупреждения или диагностики различных заболеваний. Подразумевается, что понятие индивидуум в контексте настоящего описания относится к человеку и животным кроме человека. К животным кроме человека относятся все позвоночные животные, например млекопитающие и животные, не относящиеся к млекопитающим, в том числе приматы кроме человека, овцы, собаки, кошки, коровы, лошади, куры, амфибии и рептилии. Способы наиболее предпочтительно применять для лечения больных людей, которые страдают нарушением, ассоциированным экспрессией ΌΚΚ1. Когда антитела к ΌΚΚ1 вводят в сочетании с другим агентом, то их вводят либо в любом порядке, либо одновременно.
- 48 015538
В одном из вариантов осуществления изобретения антитела (и иммуноконъюгаты и биспецифические молекулы), предлагаемые в изобретении, можно применять для выявления уровней ИКК1 или уровней клеток, которые содержат ИКК1. Для этой цели можно, например, приводить в контакт образец (такой как образец ш уПго) и контрольный образец с антителом к ИКК1 в условиях, которые обеспечивают образование комплекса между антителом и ИКК1. Выявляют и сравнивают в образце и контроле любые комплексы, образовавшиеся между антителом и ИКК1. Например, стандартные методы обнаружения, хорошо известные в данной области, такие как (но не ограничиваясь только ими) ЕЫ8Л, ΜΛΕΌΙ и анализ методом проточной цитометрии, можно применять с использованием композиций, предлагаемых в изобретении.
Таким образом, одним из объектов изобретения являются также способы выявления присутствия ИКК1 (например, человеческого антигена ИКК1) в образце или измерения количества ИКК1, которое содержится в находящемся в контакте с антителом, предлагаемым в изобретении, или его антигенсвязывающим участком, специфично связывающимся с ИКК1, в образце и в контрольном образце в условиях, которые позволяют образоваться комплексу между антителом или его участком и ИКК1. Затем выявляют образование комплекса, при этом различие в образовании комплекса между образцом по сравнению с контролем свидетельствует о присутствии ИКК1 в образце.
Под объем изобретения подпадают также наборы, содержащие композиции (например, антитела, человеческие антитела, иммуноконъюгаты и биспецифические молекулы), предлагаемые в изобретении, и инструкции по применению. В состав набора может входить также по меньшей мере один дополнительный реагент или одно или несколько дополнительных антител, предлагаемых в изобретении (например, антитело, обладающее дополнительным видом активности, которое связывается с эпитопом на антигене-мишени, отличным от эпитопа первого антитела). В состав набора, как правило, входит этикетка с указанием по применению компонентов набора. Под понятие этикетка подпадает любой письменный или зарегистрированный материал, входящий в набор или иным образом прилагаемый к набору.
Полностью описанное выше изобретение дополнительно проиллюстрировано ниже с помощью примеров, которые даны с целью иллюстрации изобретения и не направлены на его ограничение, и формулы изобретения. Специалистам в данной области должны быть очевидны или они могут получать с помощью не более чем рутинных экспериментов многочисленные эквиваленты конкретных представленных в настоящем описании процедур. Такие эквиваленты подпадают под объем настоящего изобретения и формулы изобретения. Содержание всех ссылок, включая выданные патенты и опубликованные заявки на патент, которые процитированы в настоящем описании, включены в него в качестве ссылки.
Примеры
Пример 1. Создание специфических в отношении человеческого ИКК1 антител с использованием библиотеки НиСЛЬ СΟ^^®.
Терапевтические антитела к человеческому белку ИКК1 создают путем селекции клонов, обладающих высокой аффинностью к связыванию, используя в качестве источника антител варианты белков имеющейся в продаже фаговой дисплейной библиотеки Могр1ю8у5 НиСЛЬ СΟ^^®. НиСЛЬ СΟ^^® представляет собой библиотеку РаЬ-фрагментов (Кпарр1к и др., 1. Мо1. Вю1., 296, 2001, с. 57-86; КгеЬк и др., I. Тттипо1. Ме11юЙ5 254, 2001, с. 67-84; КаискепЬегдег и др., 1. Вю1. Скет. 278(40), 2001, с. 3819438205), в которой все шесть СИК диверсифицированы с помощью соответствующей мутации и в которой применяют технологию СуГОйрИу™ для связывания РаЬ-фрагментов с поверхностью фага (νΟ 01/05950 на имя Ьбкшпд, 2001).
Общие процедуры. Спасение фагмид, амплификация и очистка фага.
Библиотеку НиСЛЬ СΟ^^® амплифицируют в стандартной обогащенной бактериальной среде (2хУТ), содержащей 34 мкг/мл хлорамфеникола и 1% глюкозы (2хУТ-СС). После заражения клеток (значение ОП600нм составляет 0,5) фагами-хелперами УС8М13 (инкубация смеси клеток и фагов в течение 30 мин при 37°С без встряхивания с последующей инкубацией в течение 30 мин при 37°С со встряхиванием при 250 об/мин) клетки центрифугируют (4120хд; 5 мин; 4°С), ресуспендируют в 2хУТ/34 мкг/мл хлорамфеникола/50 мкг/мл канамицина/0,25 мМ ИПТГ (изопропилтиогалактозид) и выращивают в течение ночи при 22°С. В конце указанного периода клетки удаляют центрифугированием и фаги осаждают из супернатанта с помощью ПЭГ, ресуспендируют в ЗФР/20% глицерина и хранят при -80°С.
Амплификацию фага между двумя цикла пэннинга осуществляют следующим образом: клетки штамма Е.со11 ТС1, находящиеся на середине логарифмической фазы, заражают фагами, элюируют после отбора белком ИКК1 и высевают на ЬВ-агар, дополненный 1% глюкозы и 34 мкг/мл хлорамфеникола (ЬВ-СС-планшеты). После инкубации пластинок в течение ночи при 30°С бактериальные колонии соскабливают с поверхности агара и применяют для инокуляции 2хУТ-СС-бульона до достижения значения ОП600нм 0,5, затем добавляют фаги-хелперы УС8М13 для осуществления описанного выше продуктивного заражения.
- 49 015538
Предварительные эксперименты по пэннингу в растворе с использованием магнитных 81гер-ТасОпгранул (гранулы, сенсибилизированные стрептавидином-тактином).
Известно, что 81гер-метка II обладает низкой аффинностью в отношении матрикса 81гер-Тас!ш (Кс ~1 мкМ по данным Уо55 и 8кегга, Рго!еш Епд. 10, 1997, с. 975-982), поэтому осуществляют предварительный эксперимент по оценке возможности применения сенсибилизированных 8!гер-Тас1ш гранул Мад8!гер для иммобилизации антигена в процессе селекций антитела и для того, чтобы избежать потерю антигена в процессе пэннинга.
Для этой цели 8 мг Мад8бер-гранул инкубируют с 46 мкг меченного с помощью Н15-81гер ΌΚΚ1 в течение 1 ч при комнатной температуре и образец разделяют по четырем пробиркам Эппендорфа, в которые предварительно добавляют блокирующий агент. Одна пробирка служит в качестве положительно го контроля (без отмывки), а три остальных образца отмывают с использованием различных по строгости условий, которые описаны в разделе, касающемся метода осуществления пэннинга библиотеки НиСАЬ СОЬИ®. Обнаружение связывания меченного с помощью Н15-8!гер ΌΚΚ1 с Мад81гер-гранулами (81герТасбп-сенсибилизированные магнитные гранулы, полученные от фирмы 1ВА, Геттинген, Германия) осуществляют на фирме ВюУегб с использованием козьего антитела к ΌΚΚ1 и меченного с помощью рубидия козьего идентифицирующего антитела.
Как показано на фиг. 1, не обнаружено никакой существенной потери меченного с помощью Н1581гер ΌΚΚ1 из 81гер-Тас!ш-сенсибилизированных гранул при сравнении неотмытых гранул с гранулами, отмытыми с использованием различных по строгости условий НиСАЬ®. Таким образом, меченный с помощью Н15-8!гер ΌΚΚ1, вероятно, можно применять для пэннинга в растворе с использованием 81герТасбп-сенсибилизированных магнитных гранул (Мад8!гер-гранулы).
Селекция путем пэннинга специфических в отношении ΌΚΚ1 антител из библиотеки.
Для селекции антител, распознающих человеческий ΌΚΚ1, применяют две стратегии пэннинга.
В целом полученные с помощью фаговой библиотеки НиСАЬ СОЬЭ® антитела разделяют на 4 пула, которые содержат различные комбинации мастер-генов УН (пул 1 содержит УН1/5 λκ; пул 2 содержит УН3 λκ; пул 3 содержит УН2/4/6 λκ; и пул 4 содержит УН1-6 λκ). Эти пулы по отдельности подвергают двум циклам пэннинга в растворе с использованием меченного с помощью Н15-81гер ΌΚΚ1, иммобилизованного на магнитных 81герТас!ш-гранулах (гранулы Меда 81гер; фирма 1ВА), а для третьего цикла селекции используют либо меченный с помощью Н15-8!гер ΌΚΚ1, иммобилизованный на магнитных 81герТас!ш-гранулах, либо меченный с помощью АРР человеческий белок ΌΚΚ1, иммобилизованный на стрептавидиновых гранулах (ИупаЬеабк® стрептавидиновые гранулы типа М-280; фирма Иупа1), с биотинилированным антителом к АРР.
В частности, для пэннинга в растворе с использованием меченного с помощью Н15-8!гер ΌΚΚ1, сшитого с магнитными 8!герТас1т-гранулами, используют следующий протокол: подготавливают предварительно обработанные блокирующим агентом пробирки (1,5-миллилитровые пробирки Эппендорфа) путем обработки 1,5 мл 2/реагента Сйет^В^ОСΚЕΚ, разведенного в соотношении 1:1 ЗФР, в течение ночи при 4°С. Предварительно блокированные гранулы получают путем следующей обработки: 580 мкл (28 мг гранул) магнитных 81герТас1ш-гранул однократно отмывают 580 мкл ЗФР и ресуспендруют в 580 мкл 1/С’11е1шВкОС’1<ЕР (разведенного одним объемом 1/ЗФР). Блокаду гранул осуществляют в предварительно блокированных пробирках в течение ночи при 4°С.
Для каждого варианта пэннинга фаговые частицы, разведенные в ЗФР до конечного объема 500 мкл, смешивают с 500 мкл 2/0^11^600^^/0,1% Твин и выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре на вращающемся круге. Предварительную адсорбцию фаговых частиц для удаления 81герТасбп или связанных с гранулами фагов осуществляют дважды: 160 мкл блокированных магнитных 81герТас!ш-гранул (4 мг) добавляют к блокированным фаговым частицам и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре на вращающемся круге. После разделения гранул с помощью магнитного устройства (типа Иупа1 МРС-Е) содержащий фаги супернатант (~1,1 мл) переносят в свежую, обработанную блокирующим реагентом реакционную пробирку и предварительную адсорбцию повторяют с использованием 160 мкл блокированных гранул в течение 30 мин. Затем меченный с помощью Н15-81гер ΌΚΚ1 в концентрации либо 400 нМ, либо 100 нМ добавляют к блокированным фаговым частицам в свежую, обработанную блокирующим реагентом 1,5-миллилитровую реакционную пробирку, инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре на вращающемся круге.
Иммобилизуют комплексы фаг-антиген с использованием либо 320 мкл, либо 160 мкл блокированных магнитных 81герТас!ш-гранул, добавленных к 400 или 100 нМ пулов, полученных при пэннинге фагов, соответственно, которые затем инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре на вращающемся круге. Фаговые частицы, связанные с магнитными 8!герТас1т-гранулами, вновь собирают с помощью магнитного сепаратора для частиц.
Затем гранулы отмывают семь раз с помощью ЗФР/0,05% Твина (ЗФРТ), затем вновь отмывают еще трижды только ЗФР. Элюцию фаговых частиц из магнитных 8!герТас!т-гранул осуществляют, добавляя в каждую пробирку по 200 мкл 20 мМ ДТТ в 10 мМ Трис-НС1, рН 8,0, в течение 10 мин. Элюат собирают и гранулы отмывают однократно 200 мкл ЗФР и ЗФР-элюат добавляют к ДТТ-элюату. Этот образец
- 50 015538 элюата используют для заражения 14 мл культуры Е.соб ТС-1, выращенной до достижения значения ОП600нм 0,6-0,8.
После заражения и последующего центрифугирования в течение 10 мин при 5000 об/мин каждый бактериальный дебрис ресуспендируют в 500 мкл 2/УТ-среды, высевают на содержащие 2/УТ-СС агаровые пластинки и инкубируют в течение ночи при 30°С. На следующее утро образовавшиеся колонии соскабливают с пластинок и получают фаг путем описанной выше процедуры спасения и амплификации.
Второй цикл пэннинга в растворе с использованием меченного с помощью Шк-8бер ΌΚΚ1 осуществляют согласно протоколу первого цикла за исключением того, что используют уменьшенные количества антигена (50 и 10 нМ) и соответствующим образом изменяют строгость процедуры отмывки.
Две различные стратегии пэннинга применяют для третьего цикла селекции: амплифицированный фаг, полученный в процессе второго цикла пэннинга, разделяют на пулы и подвергают двум различным условиям пэннинга. Первую половину полученного фага применяют для стандартной стратегии пэннинга с использованием человеческого меченного с помощью Ы18-8бер ΌΚΚ1, иммобилизованного на 81герТасбп-гранулах, как описано выше (количество антигена составляет 10 или 1 нМ соответственно).
Вторую вариацию пэннинга для третьего цикла селекции осуществляют с использованием человеческого меченного с помощью АРР ΌΚΚ1. Меченный с помощью АРР белок ΌΚΚ1 в конечной концентрации 50 или 10 нМ смешивают с 1 мл предварительно осветленных, полученных в процессе второго цикла фаговых частиц, и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч на вращающемся круге. Параллельно инкубируют 8 мг предварительно блокированных стрептавидиновых гранул типа ИупаЬеабк М-280 (фирма Эупа1) с 40 мкг биотинилированного мышиного антитела к АРР в течение 30 мин при комнатной температуре на вращающемся круге с последующими двумя стадиями отмывки с использованием ЗФРТ. Ранее сформированные комплексы, которые состоят из фагов-антител, связанных с меченным с помощью АРР ΌΚΚ1, иммобилизуют с использованием сенсибилизированных антителом к АРР стрептавидиновых магнитных гранул типа М-280 в течение 30 мин при комнатной температуре. Элюцию и амплификацию фагов осуществляют согласно описанному ранее методу.
Субклонирование и экспрессия растворимых РаЬ-фрагментов.
Кодирующие РаЬ вставки отобранных с помощью библиотеки ниСАЬ С0БЭ® фагмид субклонируют в экспрессионном векторе рМ0ВРн®Х9_РаЬ_Рн для достижения быстрой и эффективной экспрессии растворимых РаЬ. Для этой цели плазмидную ДНК отобранных клонов расщепляют рестриктазами XЬаГ и ЕсоМ, вырезая тем самым кодирующую РаЬ вставку (отрА-УЬСЬ и рбоА-Рб). Затем эту вставку клонируют в расщепленном с помощью XЬаГ/ЕсοВГ экспрессионном векторе рМ0ВРн®Х9_РаЬ_Рн.
Белки РаЬ-фрагментов экспрессируют из указанного вектора, и в результате они несут две Сконцевые метки (РЬАб™ и 6/Шк соответственно), предназначенные как для выявления, так и для очистки.
Микроэкспрессия полученных из ниСАЬ С0БЭ® РаЬ-фрагментов антител в Е.соб.
Для получения достаточных количеств белка, кодируемого каждым из полученных выше клонов, отбирают устойчивые к хлорамфениколу индивидуальные колонии бактерий после субклонирования отобранных РаЬ-фрагментов в экспрессионном векторе рМ0ВРн®Х9_РаЬ_Рн. Затем каждую из указанных колоний используют для инокуляции лунок стерильного 96-луночного титрационного микропланшета, каждая лунка содержит 100 мкл 2/УТ-С6-среды, и бактерии выращивают в течение ночи при 37°С. Образец (5 мкл) каждой культуры Е.соб ТС-1 переносят на свежий стерильный 96-луночный титрационный микропланшет, предварительно заполненный из расчета 100 мкл 2/УТ-среды, дополненной 34 мкг/мл хлорамфеникола и 0,1% глюкозы, на лунку. Титрационные микропланшеты инкубируют при 30°С при встряхивании при 400 об/мин в шейкере для микропланшетов до легкого помутнения культур (~2-4 ч), при этом ОП600нм составляет примерно 0,5.
Для экспрессии в формате указанных планшетов в лунку добавляют 20 мкл 2/УТ-среды, дополненной 34 мкг/мл хлорамфеникола и 3 мМ ИПТГ (изопропил-в-Э-тиогалактопиранозид) (конечная концентрация 0,5 мМ ИПТГ), титрационные микропланшеты запечатывают с помощью проницаемой для газа ленты и инкубируют в течение ночи при 30°С при встряхивании при 400 об/мин.
Получение лизатов полных клеток (ВЕЬ-экстракты).
В каждую лунку планшетов для экспрессии добавляют 40 мкл ВЕЬ-буфера (2/ВВ8/ЭДТК: 24,7 г/л борной кислоты, 18,7 г №С1/л, 1,49 г ЭДТК/л, рн 8,0), содержащего 2,5 мг/мл лизоцима, и планшеты инкубируют в течение 1 ч при 22°С в шейкере для микропланшетов (400 об/мин). ВЕЬ-экстракты применяют для анализа связывания с помощью РМАТ (см. пример 2).
Экспрессия микрограммовых количеств РаЬ-фрагментов антител, полученных из библиотеки ниСАЬ С0БЭ® в Е.соб, и очистка.
Экспрессию РаЬ-фрагментов, кодируемых рМ0ВРн®Х9_РаЬ_Рн, в клетках Е.соб Т61 Р осуществляют в 50-миллилитровых пластиковых пробирках. Для этой цели предварительные культуры, инокулированные индивидуальными клонами, выращивают в 2/УТ-С0-среде в течение ночи при 30°С. На следующее утро по 50 мкл каждой предварительной культуры применяют для инокуляции 25 мл 2/УТ
- 51 015538 среды. дополненной 34 мкг/мл хлорамфеникола. 1 мМ ИПТГ и 0.1% глюкозы. в стерильных 50-миллилитровых пробирках и инкубируют в течение ночи при 30°С. Собирают клетки Е.сой. клеточный дебрис замораживают и. наконец. разрушают с помощью Вид Вик!ег (фирма №гадеп). ТаЬфрагменты выделяют с помощью N^-NΤΛ-агарозы (фирма 01адеп. Гильден. Германия).
Экспрессия миллиграммовых количеств ТаЬ-фрагментов антител. полученных из библиотеки ΗиСΑ^ С0ЬО® в Е.сой. и очистка.
Экспрессию ТаЬ-фрагментов. кодируемых ρΜ0КРΗ®X9_ТаЬ_ТΗ. в клетках ТС1 Т осуществляют в культурах во встряхиваемых колбах. используя 750 мл 2Υх-среды. дополненной 34 мкг/мл хлорамфеникола. Культуры встряхивают при 30°С до достижения значения ОП600нм 0.5. Экспрессию индуцируют. добавляя 0.75 мМ ИПТГ. с последующей инкубацией в течение 20 ч при 30°С. Клетки разрушают с помощью лизоцима и ТаЬ-фрагменты выделяют с помощью хроматографии с использованием Μ^ΤΑ (фирма 01адеп. Гильден. Германия). Концентрации белков определяют с помощью УФспектрофотометрии (Ш^Ьк и др.. 2001).
Пример 2. Идентификация специфических в отношении ΌΚΚ1 ΗиСΑ^®-антител.
ВЕЬ-экстракты индивидуальных клонов Е.сой. отобранных с помощью описанных выше стратегий пэннинга. анализируют с помощью технологии флуориметрического микрообъемного анализа (Т1иоготе!пс Μ^с^оνо1ите Ακκην Τесйηо1оду (ΡΜΑΤ™. анализатор типа 8200 Се11и1аг Ье1ес11оп δуκΐет. фирма Λρρ1^ей Вюкук!етк. Фостер Ситу. шт. Калифорния). для идентификации клонов. кодирующих специфические для ΌΚΚ1 ТаЬ-фрагменты. Анализатор системы ТΜΛΤ™ 8100 ΗΤδ представляет собой флуоресцентный макроконфокальный высокопроизводительный инструмент для скрининга. с помощью которого автоматически осуществляют нерадиоактивное обнаружение типа смешивай-и-читай (т1х-апй-геай) с использованием живых клеток или гранул (Μι гадКа I. Вюто1. δс^ееη^ηд. 4(4). 1999. с. 193-204).
Выявление связывания ΌΚΚ1 с ТаЬ-фрагментами из бактериальных лизатов с помощью метода анализа связывания. основанного на технологии флуориметрического микрообъемного анализа (ΕΜΑΤ).
Для выявления связывания ΌΚΚ1 с ТаЬ-фрагментами антител из лизатов Е.сой (ВЕЬ-экстракты) связывание анализируют с помощью системы клеточного обнаружения ТΜΛΤ 8200 (фирма Λρρ1^ей Вюкук(етк). Для сшивания меченного с помощью Η^κ-δ(^еρ ΌΚΚ1 с гранулами типа Μ-450 Ехроху (фирма Ьупа1) образец объемом 300 мкл Μ-450 Ероху-гранул (1.2х108 гранул) переносят в реакционную пробирку и улавливают магнитным сепаратором для частиц. Супернатант удаляют и частицы промывают четырежды. используя каждый раз по 1 мл 100 мМ натрий-фосфатного буфера. рН 7.4. Для нанесения покрытия из антигена 60 мкг меченного с помощью ШкСТгер ΌΚΚ1 добавляют в суспензию гранул в 150 мкл 100 мМ натрий-фосфатного буфера. рН 7.4. Суспензию. содержащую антиген-гранулы. инкубируют в течение 16 ч при комнатной температуре на вращающемся круге. Затем гранулы с нанесенным на них покрытием трижды промывают ЗФР и ресуспендируют в конечном объеме 250 мкл ЗФР.
Для каждого 384-луночного планшета готовят смесь. содержащую 20 мл ЗФР. который включает 3% БСА. 0.005% Твин-20. 4 мкл гранул с покрытием из ΌΚΚ1 (1.9х106 гранул) и 4 мкл идентифицирующего антитела Су5™. Образец этого раствора объемом 45 мкл вносят в каждую лунку 384-луночного черного/с прозрачным дном ТΜΛΤ-планшета (фирма Λρρ1^ей Вюкук(етк). Содержащий ТаЬ-фрагменты ВЕЬ-экстракт (5 мкл) добавляют в каждую лунку. ТΜΛΤ-планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение ночи. На следующее утро планшеты анализируют с помощью системы клеточного обнаружения типа 8200 Се11и1аг Ье1ес1юп δуκΐет (фирма Λρρ1^ей Вюкук(етк).
Получают позитивные клоны и анализируют последовательности легких и тяжелых цепей клонов. которые дают позитивные специфические сигналы при осуществлении ТΜΛΤ. Выявлено 57 уникальных (не чрезмерных) клонов антител к ΌΚΚ1. которые обладают достаточно выраженной способностью к связыванию с человеческим ΌΚΚ1. Эти клоны экспрессируют. очищают и оценивают в отношении аффинности и функциональных свойств.
Определение аффинности на наномолярном уровне с помощью резонанса поверхностного плазмона (8РК).
С использованием указанных клонов осуществляют кинетический δРЯ-анализ на СΜ5-чипе (фирма В1асоге. Швеция). сенсибилизированном с плотностью ~400 КЬ (относительные единицы) либо рекомбинантным человеческим ΌΚΚ1. либо мышиным ΌΚΚ1 (фирма К&Ь кук1ет). либо ΌΚΚ1 яванского макака (макак-крабоед) в 10 мМ №-ацетатном буфере. рН 4.5 с использованием стандартного аминового сочетания Ε^С-NΗδ. Сопоставимое количество сывороточного человеческого альбумина (ЧСА) иммобилизуют на применяемой в качестве стандарта проточной ячейке. ЗФР (136 мМ №С1. 2.7 мМ 1<С1. 10 мМ №-ьНР0+ 1.76 мМ ХН2Р04. рН 7.4) применяют в качестве рабочего буфера. Препараты ТаЬ наносят в виде серий концентраций от 16 до 500 нМ со скоростью потока 20 мкл/мин. Устанавливают продолжительность фазы ассоциации 60 с. фазы диссоциации 120 с. Суммарные данные об аффинности (в нМ) в отношении ΌΚΚ1 человека. мыши и яванского макака. полученные с использованием указанного метода. представлены ниже в табл. 1.
- 52 015538
Таблица 1
Аффинность к связыванию отобранных ГаЬ с ΌΚΚ1 человека, мыши и яванского макака
Антитело Ко [нм] ϋΚΚΙ человека Ко [нМ] ϋΚΚΙ мыши* Ко [нМ] ОКК1 макака*
МОК04470 3,2 ±2,0 3,6 1,7
МОК04516 2,6 ± 0,7 2,4 1,9
МОК.04454 3,2 ± 0,4 6 2,7
МОК04456 7,9 ± 0,9 11,6 8,1
МОК04461 7,6 ± 3,3 12,8 7,3
МОК04455 1,6 ±0,3 н/о 1,5
* однократное измерение
н.о.: не определяли
Пример 3. Идентификация перспективных ГаЬ-фрагментов (ГаЬ-фрагментов-кандидатов) антител к человеческому ΌΚΚ1 на основе ингибирования антагонистической активности ΌΚΚ1 в отношении \УЩ.
Полученные 57 различных специфических в отношении ΌΚΚ1 антител, отобранных из библиотеки НиСАЬ С0Ь0®, применяют для получения очищенного антитела, у которого затем определяют способность ингибировать антагонистическую активность человеческого ΌΚΚ1 в отношении \УЩ. Из изученных антител 17 антител-кандидатов являются функционально активными, что видно из фиг. 2 и 4.
Функциональную активность каждого из ГаЬ-фрагментов, полученных из НиСАЬ®, оценивают с помощью анализа репортерного гена люциферазы. Двенадцать сайтов связывания ТСБ/ЬеГ клонируют против хода транскрипции относительно репортерного гена люциферазы, придавая гену люциферазы чувствительность к ТСГ/ЬеЬ Канонические белки \УЩ приводят к стабилизации бета-катенина, активируя тем самым транскрипцию ТСБ/ЬеГ и приводя к образованию белка люциферазы. Добавление белка ΌΚΚ1 блокирует активность ХУик а также транскрипцию гена люциферазы. Следовательно, уровни люциферазы, продуцируемые соответствующими клетками, должны коррелировать со способностью отобранных ГаЬ блокировать действие ΌΚΚ1.
Стабильная восприимчивая к ТСБ/ЬеГ репортерная клеточная линия ΗЕΚ293Τ/17-12х8ΤГ.
Биологические анализы осуществляют с использованием стабильной репортерной линии клеток почки человеческого эмбриона ΗЕΚ293Τ/17-12х8ΤГ. Клетки культивируют в среде ИМЕМ с высоким содержанием глюкозы (фирма ΙηνίΐΓο^η), содержащей 10% ГС8 (фирмы РАN или ВюУЫйакег) и 1 мкг/мл пуромицина (фирма ΒΌ В^Леисе®, до достижения 90%-ной конфлюэнтности. Затем клетки трипсинизируют, подсчитывают их количество и разводят в культуральной среде без пуромицина до концентрации 4х105 клеток на мл. Затем клетки высевают в белый плоскодонный 96-луночный планшет (фирма ί'.'οΓηίη§; 100 мкл клеточной суспензии на лунку) и инкубируют при 37°С и 5% С02 в течение ночи. На следующий день готовят среду для анализа: 500 нг/мл ^ΚΚ1-АРР добавляют в кондиционированную среду (СМ) \Уш3а. Разводят в СМ-среде ГаЬ-фрагменты антитела к ΌΚΚ1, полученного с помощью НиСАЬ® (конечная концентрация 20 мкг/мл), и козье антитело к человеческому ΌΚΚ1 (фирма К&И 8у§1ет®, которое применяют в качестве положительного контроля (конечная концентрация 1,5 мкг/мл).
Среду объемом 60 мкл удаляют из каждой лунки планшета для анализа, не нарушая прикрепившиеся клетки, и заменяют на 60 мкл тестируемого или контрольного антитела, разведенного в СМ. Клетки инкубируют в течение еще 24 ч и в каждую лунку добавляют по 100 мкл реагента для люциферазы ВпдЫ-С®. После 5-минутой инкубации определяют люминесценцию с помощью люмометра (типа Сеп^Рго, фирма Тесап). Результаты, полученные с использованием двадцати из пятидесяти семи ГаЬфрагментов, представлены на фиг. 2. Уровень экспрессирумой люциферазы является мерой уровня присутствующего антитела.
Пример 4. Количественный анализ аффинности к связыванию: идентификация перспективных ГаЬфрагментов антител к человеческому ΌΚΚ1, которые ингибируют антагонистическую активность ΌΚΚ1 в отношении \УЩ.
Определение аффинности.
Для получения дополнительных характеристик антител к ΌΚΚ1 определяют их аффинность к ΌΚΚ1 человека, яванского макака и мыши. Рекомбинантный белок ΌΚΚ1 иммобилизуют на чипе типа СМ5 Вхаотге и в подвижной фазе вносят в различных концентрациях ГаЬ-фрагменты. Для надежного определения моновалентных аффинностей для Β^асο^е-анализа используют только такие партии ГаЬфрагментов, в которых с помощью гель-фильтрации выявлен уровень мономерной фракции, составляющий >90%.
Суммарные данные об аффинности связывания с ΌΚΚ1 человека, мыши и яванского макака представлены в табл. 2. Установлено, что все 17 изученных ГаЬ-фрагментов обладают аффинностью связывания с человеческим ΌΚΚ1, составляющей менее 100 нМ. Кроме того, 9 клонов продуцирует антитела, аффинность которых составляет менее 10 нМ. Во всех изученных вариантах аффинность связывания с ΌΚΚ1 яванского макака и мыши оказалась идентична аффинности с человеческим ΌΚΚ1.
- 53 015538
Таблица 2
Данные об аффинности связывания отобранных ЕаЫ с ΌΚΚ1 человека, мыши и яванского макака
Антитело Κϋ [нм] ОКК1 человека Κϋ [нМ] ПКК1 мыши* Κϋ [нМ] ΏΚΚ1 макака*
МОК.04480 1,0 ±0,0 2 н.о.
ΜΟΒΌ4455 1,6 ±0,3 Н.О. 1,5
МОК04516 2,6 ±0,7 2,4 1,9
МОК04470 3,2 ±2,0 3,6 1,7
МОК04454 3,2 ± 0,4 6 2,7
МОК.04483 5,5 ± 0,7 Н.О. н.о.
МОК04466 6,5 ± 2,1 н.о. н.о.
МОК04461 7,6 ± 3,3 12,8 7,3
МОК04456 7,9 ± 0,9 11.6 8,1
МОК04462 16,5 ±2,1 Н.О. Н.О.
МОК.04447 22* н.о. н.о.
МОК.04469 36 ±0,0 н.о. н.о.
МОК04482 36 ±5,7 н.о. н.о.
МОК04468 41,5 ±21,9 н.о. н.о.
МОК04476 44* н.о. н.о.
МОК04481 65* н.о. н.о.
МОК04503 93* н.о. н.о.
* одно измерение н.о.: не определяли
Определение ЕС50.
Данные об эффективной концентрации клонов антител, которые обладают наиболее высокой аффинностью к ΌΚΚ1, вызывающей 50%-ное ингибирование, представлены в табл. 3. Данные свидетельствуют о том, что эффективные концентрации ЕС50 составляют от 39 до 95 нМ, с медианным значением от 58 до 83 нМ.
Таблица 3
Эффективная концентрация отобранных ЕаЫ-фрагментов, вызывающая 50%-ное ингибирование
Антитело Репортерный анализ люциферазной активности, ЕС5о (нМ)
МОВ.04470 58
МОК04516 42
МОК04454 83
МОК04456 95
МОК04461 57
МОК04455 39
Пример 5. Созревание аффинности отобранных ЕаЫ-фрагментов антител к ΌΚΚ1 путем параллельной замены кассет ЬСОЯ3 и НСЭЕ2.
Для оптимизации аффинности родительского пула представленных в настоящем описании ЕаЫфрагментов антитела к ΌΚΚ1 удаляют ЬСПЯ3, каркасный участок 4 и константную область легкой цепи (405 пар оснований) каждого родительского ЕаЫ-фрагмента с помощью ВрП и 8рЫ, и заменяют спектром диверсифицированных ЬСОЯ3 в сочетании с каркасным участком 4 и константной областью. Образец массой 0,5 мкг несущего пул вектора лигируют с 3-кратным молярным избытком фрагмента-вставки, которая несет диверсифицированные ЬСОЯ3.
С использованием аналогичного подхода НСЭВ2 диверсифицируют с помощью сайтов Χ^Ι и ВккНП, а соединяющие каркасные участки оставляют без изменений. Для повышения эффективности клонирования родительский НСЭВ2 заменяют состоящей из 590 пар оснований лишней последовательностью перед встраиванием диверсифицированной кассеты НСОЯ2.
Полученные в результате лигирования смеси 11 различных библиотек используют для электропорации 4 мл клеток Е.со11 Т0Р 10 Е' (фирма Iπν^ΐ^οдеπ, Карлсбад, шт. Калифорния, США), получая от 2х107 до 2х108 независимых колоний. Амплификацию библиотек осуществляют согласно ранее описанному методу (ЯаисйепЫегдег и др., I. Вю1. Сйет. 278(40), 2003, с. 38194-38205). Для контроля качества произвольно отбирают по несколько клонов из каждой библиотеки и секвенируют (фирма 8едш8егуе, Фатерштеттен, Германия) с использованием праймеров СЕЯ84 (УЪ) и 0САЕ_8ед_Нр (УН).
Отбор кандидатов для созревания аффинности.
Отбирают 6 кандидатов (родительских ЕаЫ-фрагментов) для процедуры созревания аффинности, которые характеризуются следующими свойствами: аффинность к человеческому ΌΚΚ1 менее 10 нМ с выраженной перекрестной реактивностью к ΌΚΚ1 яванских макак и мышей, ЕС50 менее 100 нМ, уровень
- 54 015538 экспрессии ЕаЬ в Е.со11 от высокого до среднего и отсутствие агрегации ЕаЬ после очистки.
В процессе опытов по измерению аффинности стало очевидно, что клон М0К04480 является очень нестабильным при высоких разведениях. По этой причине М0К04480 исключен из списка кандидатов на осуществление созревания аффинности, несмотря на его наиболее высокую аффинность (1 нМ) и наименьшее значение ЕС50 (7 нМ) из всех оцененных ЕаЬ-фрагментов. Аффинность М0К04483 к человеческому ΌΚΚ1 составляет 5,5 нМ, но обладает перекрестной реактивностью к мышиному ΌΚΚ1, а М0К04453 содержит наиболее высокую пропорцию агрегатов ЕаЬ после очистки. По этим параметрам эти два антитела также исключены из кандидатов для осуществления созревания.
После тщательной оценки всех доступных данных отбирают шесть кандидатов для осуществления созревания (М0К04454, М0К04455, М0К04456, М0К04461, М0К04470 и М0К04516). Характеристики указанных кандидатов перечислены в табл. 4.
Таблица 4
Характеристики отобранных ЕаЬ-фрагментов
Антитело Κϋ [нМ] ϋΚΚΙ человека Κϋ [нМ] ϋκκι* мыши Κϋ [нМ] ϋΚΚΙ* макака ЕС5о [нМ] Перекрестная реактивность к мышиному ОКК1 Уровень экспрессии ЕаЬ Гмг/л] Результаты гельфильтрации
ΜΘΚ04470 3,2 ±2,0 3,6 1,7 58 ++ 32,8 #
МОК04516 2,6 ± 0,7 2,4 1,9 42 ++ 1,5
МОК04454 3,2 ± 0,4 6 2,7 83 -н- 17,8
МОК04456 7,9 ± 0,9 11,6 8,1 95 +4- 10,7
МОК04461 7,6 ± 3,3 12,8 7,3 57 ++ 12 #
МОК04455 1,6 ±0,3 н,о> 1.5 39 ++ 9 а
* одно измерение
н.о.: не определяли # содержание мономеров > 90%
Создание отобранных библиотек ЕаЬ-фрагментов для созревания аффинности.
Для получения клонов антител к ΌΚΚ1, обладающих повышенной аффинностью и ингибирующей активностью, отобранные клоны ЕаЬ-фрагментов М0К04454, М0К04455, М0К04456, М0К04461, М0К04470 и М0К4516, описанные в предыдущем примере, подвергают дополнительным циклам диверсификации и селекции, т.е. процессу, известному как созревание аффинности.
Для этой цели СОК-участки диверсифицируют, используя соответствующие применяемые для созревания кассеты ЬСОК3 и НСОК2, которые создавали ранее с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием трех нуклеотидов (Уппекак и др., №с1ею Ас1бк Кек. 22, 1994, с. 5600-5607; №§у и др., №1иге Мебюте 8, 2002, с. 801-807). В табл. 5 приведенные последовательности ЬСОК3 родительских клонов М0К04454, М0К04455, М0К04456, М0К061, М0К04470 и М0К4516.
Таблица 5
Последовательности ЬСОК3 отобранных ЕаЬ-фрагментов
Антитело УЬ Последовательность ССПКЗ 8Е<2 ГО ΝΟ:
МОК04454 К.1 Ι.ΟΥΥΟΜΡΡ 21
МОК 044 5 5 К1 90ΥΠ5ΙΡΜ 22
МОК04456 КЗ ΟΟΥΟΟΕΡΙ 23
МОК04470 Ь2 08ΥΑ8ΟΝΤΚν 25
МОВ.04461 Ь2 ЗТТОМТУОГ 24
МОК04516 Ы ΑδΡϋΜΟδΡΝν 26
В табл. 6 приведены последовательности НСЭК2 родительских клонов М0К04454, М0К04455, М0К04456, М0К061, М0К04470 и М0К4516.
Таблица 6
Последовательности НСЭК2 отобранных ЕаЬ-фрагментов
Антитело УН Последовательность НСОК2 8ЕЦ ГО ΝΟ:
МОК04454 НЗ ΟΟ8ΗΜϋΚΡΡΟΥνΡΑΡ 2
МОК04455 НЗ ΗΥΜϋΗ 3
МОК.04456 НЗ ΤΙΥΜϋΥ 4
МОК04461 НЗ ΜΟ1ΟΓ.ΟΥ 5
МОК04470 НЗ НОГОРОН 6
МОК04516 Н5 ΟΙΡΡΚΜΚΟΡϋΥ 7
- 55 015538
ГаЬ-фрагменты из экспрессионного вектора рМОКРН®Х9_ГаЬ_ГН субклонируют в фагмидном векторе рМОКРН®25 (см. И8 6753136). Этот вектор несет белок фага ρΙΙΙ, слитый на Ν-конце с остатком цистеина, а также С-концевой цистеин, слитый с Гб-цепью антитела, и в результате позволяет презентовать связанные дисульфидным мостиком соответствующие ГаЬ-фрагменты на поверхности фага. Для оптимизации как аффинности, так и эффективности родительских ГаЬ-фрагментов используют параллельно две различные стратегии.
Создают пять фаговых библиотек ГаЬ-фрагментов антител, в которых ЬСЭК3 пяти из шести родительских клонов заменяют спектром индивидуальных последовательностей СЭК3 легких цепей. Созревание с помощью ЬСЭК3 клона МОК04454 не осуществляют, поскольку этот клон имеет дополнительный сайт рестрикции ВрП в СЭК-участках, а для процедуры клонирования библиотек используют рестриктазу ВрП.
Параллельно НСЭК2-участок каждого родительского клона заменяют спектром индивидуальных последовательностей СЭК2 тяжелой цепи. Последовательность, кодирующую каждый родительский ГаЬ, вырезают и заменяют состоящей из 590 пар оснований лишней последовательностью. Эта лишняя ДНК облегчает отделение полос векторов с одним расщеплением от полос дважды расщепленных векторов и снижает фоновый уровень обладающих высокой аффинностью родительских ГаЬ в процессе пэннинга созревания. На следующей стадии вырезают лишнюю последовательность из кодирующих ГаЬ плазмид каждого родительского клона и заменяют высокодиверсифицированной кассетой для созревания НСЭК2.
С помощью стандартных процедур клонирования создают большие библиотеки для созревания аффинности, состоящие более чем из 2х107 членов, и диверсифицированными клонами трансформируют электрокомпетентные клетки Е.соН ТОР10Г' (фирма 1пуйгодеп). Презентующие ГаЬ-фрагменты фаги получают согласно методу, описанному выше в примере 1.
Создают четыре предназначенных для созревания пула с целью облегчения последующего процесса селекции: пул 1а состоит из ЬСЭК3-библиотек МОК04470 и МОК04516; пул 1б состоит из НСЭЕ2библиотек МОК04470 и МОК04516; пул 2а состоит из ЬСЭК3-библиотек МОК04454, МОК04455, МОК04456 и МОК04461; а пул 2б состоит из НСЭКЗ-библиотек МОК04454, МОК04455, МОК04456 и МОК04461.
Пэннинг каждого пула осуществляют в растворе, используя понижающиеся количества меченного с помощью Н1к-81гер ΌΚΚ1 и иммобилизации фага-антигена на 81гер-ТасПп-гранулах. Параллельно каждый пул используют для пэннинга с использованием понижающихся количеств биотинилированного ΌΚΚ1, иммобилизованного на сенсибилизированных нейтравидином планшетах. Для повышения строгости пэннинга и для отбора улучшенных скоростей диссоциации, анализ осуществляют в условиях конкуренции с использованием очищенных родительских ГаЬ-фрагментов, а также немеченого антигена, в процессе пролонгированного периода инкубации.
Непосредственно после пэннинга обогащенные фагмидные пулы субклонируют в экспрессионном векторе рМОКРН®Х9_ГН. Отбирают примерно 2300 индивидуальных клонов и экспрессию ГаЬфрагментов индуцируют с помощью ИПТГ.
Стратегии пэннинга для анализа созревания.
Процедуры пэннинга четырех пулов антител осуществляют с использованием меченного с помощью Н1к-81гер ΌΚΚ1 и биотинилированного меченного с помощью Н1к-81гер ΌΚΚ1 в растворе с использованием двух или трех циклов соответственно. Для каждой стратегии пэннинга для повышения строгости применяют анализ в условиях конкуренции с использованием очищенных родительских белков ГаЬфрагментов или немеченого с помощью с АРР ΌΚΚ1, а также низких концентраций антигена и интенсивной отмывки.
Пэннинг в растворе не несущего Н1к-81гер-метку ΌΚΚ1 осуществляют с использованием двух циклов селекции в целом согласно стандартному протоколу, описанному в примере 1. Отличием от указанных процедур является применение пониженных количеств антигена (концентрация снижена с 5 до 1 нМ), высокая строгость процедуры отмывки либо с использованием конкурента или без него и пролонгированные периоды инкубации антител-фагов в присутствии антигена.
Для первого цикла отбора с использованием биотинилированного ΌΚΚ1 лунки сенсибилизированного нейтравидином планшета отмывают дважды 300 мкл ЗФР. Лунки блокируют 2х реагентом ^етВ^^Е^ (фирма Сйешкоп, Темекула, шт. Калифорния), разведенным в соотношении 1:1 ЗФР (блокирующий буфер). Перед осуществлением селекции НиСАЬ СОЬЭ®-фаги блокируют также одним объемом блокирующего буфера, содержащего 0,1% Твин-20, в течение 30 мин при комнатной температуре. Препараты блокированного фага переносят в виде аликвот объемом по 100 мкл в лунки сенсибилизированного нейтравидином планшета и выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре. Эту стадию предварительной адсорбции повторяют еще один раз. Блокированные и предварительно очищенные препараты фагов инкубируют с 5 нМ биотинилированным ΌΚΚ1 в течение 2 ч при 22°С на вращающемся круге. Параллельно добавляют ГаЬ, ΛРР-^ΚΚ1 или осуществляют опыт без конкурента и образцы инкубируют в течение ночи при 4°С на вращающемся круге.
- 56 015538
Комплексы антиген-фаг иммобилизуют на лунках сенсибилизированного нейтравидином планшета в течение 20 мин при комнатной температуре. После стадий интенсивной отмывки связанные фаговые частицы элюируют, добавляя 200 мкл 20 мМ ДТТ в 10 мМ Трис, рн 8,0 на лунку, в течение 10 мин при комнатной температуре. Элюат удаляют и добавляют к 14 мл клеток Е.со11 ТО1, выращенных до достижения значения ОП600нм 0,6-0,8. Лунки промывают один раз 200 мкл ЗФР и этот раствор также добавляют к клеткам Е.со11 ТО1. Фаговое заражение Е.со11 осуществляют в течение 45 мин при 37°С без встряхивания. После центрофугирования в течение 10 мин при 5000 об/мин бактериальный дебрис ресуспендируют в 500 мкл 2хУТ-среды, высевают на покрытые 2хУТ-СС агаровые пластинки и инкубируют в течение ночи при 30°С. Колонии собирают, соскабливая их с поверхности пластинок, и фаговые частицы спасают и амплифицируют согласно описанному выше методу.
Второй и третий цикл селекции осуществляют аналогично описанному выше первому циклу селекции за исключением того, что условия отмывки являются более строгими и концентрация антигена составляет 1 и 0,1 нМ соответственно.
Основанный на использовании электрохемилюминесценции (ВюУепз) анализ связывания РаЬфрагментов с ΌΚΚ1.
Для выявления обладающих улучшенной аффинностью фрагментов специфических для ΌΚΚ1 антител в лизатах Е.сой (ВЕЬ-экстракты), применяют рабочую станцию ВюУейз М-384 БЕКГЕБ® (фирма ВюУеи8 Еигоре, Уитни, Оксфордшир, Великобритания). Анализ осуществляют в 96-луночных полипропиленовых титрационных микропланшетах и с использованием ЗФР, дополненного 0,5% БСА и 0,02% Твин-20, в качестве буфера для анализа. Биотинилированный человеческий ΌΚΚ1 иммобилизуют на стрептавидиновых парамагнитных гранулах типа М-280 (фирма Эупа1) согласно инструкциям поставщика. В лунку добавляют разбавленный из расчета 1:25 маточный раствор гранул. Образцы объемом 100 мкл разведенного ВЕЬ-экстракта и гранул инкубируют в течение ночи при комнатном температуре в шейкере. Для выявления используют антитело к человеческому Р(аЬ)'2 (фирма ^^аηονа), меченное с помощью ВУ-метки™ согласно инструкциям поставщика (фирма ВюУепз Еигоре, Уитни, Оксфордшир, Великобритания).
Анализируют набор, состоящий примерно из 2300 произвольно отобранных клонов, с помощью описанного выше метода. Поднабор из 160 клонов, для которых получены самые высокие значения, дополнительно анализируют с использованием уравновешивающего титрования раствора.
Определение аффинности на пикомолярном уровне с использованием уравновешивающего титрования раствора (БЕТ).
Для определения используют содержащие мономеры фракции РаЬ (содержание мономеров по меньшей мере 90%, анализ с использованием гель-фильтрации (БЕС); Бирегбех75, фирма Атегзйат РЬагтааа). Определение аффинности на основе электролюминесценции (ЕСЬ) в растворе и оценку данных осуществляют в целом согласно методу, описанному у Наепе1 и др., 2005. Постоянное количество РаЬ уравновешивают с использованием различных концентраций (серийные 3-кратные разведения) человеческого ΌΚΚ1 (исходная концентрация 4 нМ) в растворе. Добавляют биотинилированный человеческий ΌΚΚ1, сшитый с парамагнитными гранулами (стрептавидиновые гранулы типа М-280, фирма ϋνпа1), и меченное с помощью ВУ-метки™ (фирма ВюУейз Еигоре, Уитни, Оксфордшир, Великобритания υΚ) антитело к человеческому Р(аЬ)'2 (фирма О|апо\'а) и смесь инкубируют в течение 30 мин. Затем концентрацию несвязанного РаЬ определяют количественно с помощью ЕСЬ с использованием анализатора типа М-БЕШЕБ® 384 (фирма ВюУейз Еигоре).
Для этой цели отбирают 160 индивидуальных клонов и очищают на №-№ГА-агарозе в микрограммовом формате. Предварительно определяют аффинность с помощью уравновешивающего титрования раствора (БЕТ) с использованием 4 точек на анализаторе типа ВюУепз. На основе этих данных отбирают 20 клонов, обладающих аффинностью. Эти РаЬ-фрагменты очищают в микрограммовом формате. Клон М0К04950 исключают из опытов по определению аффиности и дальнейшей оценки из-за частичной агрегации РаЬ, что определяют с помощью гель-фильтрации. Конечные данные об аффинности определяют для двух независимых партий каждого клона РаЬ с использованием 8-точечного БЕТ и ΌΚΚ1 человека, мыши и яванского макака.
Определение аффиности к ΌΚΚ1 мыши и яванского макака осуществляют в целом согласно описанному выше методу, используя вместо человеческого ΌΚΚ1 мышиный ΌΚΚ1 (фирма Κ&Ό Буз!етз) и ΌΚΚ1 яванского макака в качестве анализируемого вещества в растворе. Для определения свободного РаЬ используют биотинилированный человеческий ΌΚΚ1, сшитый с парамагнитными гранулами. Аффинность рассчитывают согласно Наепе1 и др., Апа1. ВюсЬет. 339, 1, 2005, с. 182-184.
С использованием описанных выше условий анализа определяют аффинность антитела к ΌΚΚ1 в растворе РаЬ-фрагментов с оптимизированной аффинностью. Аффинность определяют для М0К04910 и М0К04946, установлено, что значения ΚΌ, характеризующие связывание с человеческим ΌΚΚ1, составляют менее 30 пМ, для ΌΚΚ1 мыши и яванского макака от 36 до 42 пМ. Другие семь антител характеризуются аффинностью ко всем трем антигенам на уровне ниже 100 пМ. Клон М0К04950 не обладает способностью связываться с биотинилированным ΌΚΚ1. Данные об аффинности обобщены в табл. 7.
- 57 015538
Таблица 7
Аффинность ЕаЬ-фрагментов
Аффинность [пМ]: уравновешивающее титрование раствора *
антитело человеческий БКК1 ϋΚΚΙ макака мышиный ϋΚΚΙ
МОК04913 38 ± 8 51 ± 10 44 ± 48
МОК04946 25 ±9 36 ±9 41 ± 15
МОК04907 114 ± 7 170 ± 35 167 ± 68
МОК04945 69 ± 18 80 ±31 74 ±21
МОК04914 94 ± 5 140 ±3 200 ±261
МОК.04920 53 ± 37 50 ± 20 40 ± 30
МОК04954 110 ±54 112 ±25 36 ±4
МОК04952 100 ± 12 58 ± 17 71 ± 34
МОК04948 57 ± 8 67 ± 17 65 ±25
МОК04910 24 ± 3 37 ± 11 42 ±38
ΜΟΚΌ4921 большая вариабельность от партии к партии
МОК04947 32 ± 19 58 ±35 30± 17
МОК04951 136 ± 120 62 ±2 132 ±90
МОК04918 110-690 236 ±23 550-3144
МОК04919 64 # 132 # 1114
МОК04949 30 ±23 55 ±35 65 ± 36
МОК04922 90 # 70 # 50 #
МОВ.04911 140 # 190 4 650 а
МОВ.04950 отсутствие связывания
*: осуществляют по меньшей мере два независимых измерения с использованием двух различных партий
ЕаЬ-фрагментов #: только одно измерение
Пример 6. Характеристики ЕаЬ-фрагментов к человеческому ΌΚΚ1 с оптимизированной аффинностью.
Технология твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А).
Определяют специфичность связывания зрелых ЕаЬ-фрагментов в присутствии 50% человеческой сыворотки (ЧС). Серийными разведениями человеческого рекомбинантного биотинилированного ΌΚΚ1 в ТВ 8 сенсибилизируют покрытые нейтравидином титрационные микропланшеты в течение 2 ч при комнатной температуре, используя концентрацию ΌΚΚ1 от 8 до 125 нг на лунку. После сенсибилизации антигеном лунки блокируют ТВ8/0,05% Твин (ТВ8-Т), дополненным 1% БСА, в течение 1 ч при комнатной температуре. Очищенные указанные выше ЕаЬ-фрагменты, разведенные либо в ТВ8/4% БСА, либо в ТВ8/50% Н8 (человеческая сыворотка) до конечной концентрации 1 мкг/мл, добавляют в сенсибилизированные и блокированные лунки и планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Для обнаружения используют антитело к ЕЬАС, конъюгированное со щелочной фосфатазой (АР) (разведение 1:5000 в ТВ8Т) и флуорогенный субстрат АЦоРНох (фирма ЯосЬе).
После каждой инкубации лунки титрационных микропланшетов отмывают пять раз ТВ8Т за исключением последней стадии инкубации с меченым вторичным антителом, когда отмывку осуществляют трижды.
Флуоресценцию оценивают с помощью планшет-ридера для спектрофлуориметра фирмы ТЕСАК Примеры кривых связывания представлены на фиг. 3. В табл. 8 обобщены данные об активности связывания оптимизированных ЕаЬ-фрагментов к ΌΚΚ1 в присутствии 50% человеческой сыворотки в сравнении с активностью связывания в присутствии 4% БСА, составляющей от 83 до 100%. Установлено, что медианное значение составляет 93%, таким образом, ЕаЬ-фрагменты к ΌΚΚ1 полностью связываются с мишенью в присутствии человеческой сыворотки.
- 58 015538
Таблица 8
Активность связывания ЕаЬ-фрагментов
Антитело Активность связывания в присутствии/ 50% человеческой сыворотки в сравнении с 4% БСА (%)
МОК04945 89 ±6
МОК.049Ю 84 ±4
МОК.04946 93 ±2
МОК.04913 89 ± 9
МОК.04920 90 ±7
МОК04948 100 ± 15
МОК04952 100 ±5
ΜΟΚΌ4921 93*
МОК04914 83*
МОК04907 > 83*
МОК.04954 > 83*
МОК04937 95*
* одно измерение
Репортерный клеточный анализ люциферазы в присутствии человеческой сыворотки с использованием клеточной линии И2О8.
Для дополнительной оценки специфичности связывания оптимизированных ЕаЬ-фрагментов к ΌΚΚ1 репортерный клеточный анализ люциферазы повторяют в присутствии 15% человеческой сыворотки с использованием клеточной линии остеосаркомы И2О8. Клетки И2О8 (АТСС Νο. НТВ-96) выращивают согласно протоколу поставщика (АТСС, Манассас, шт. Виргиния, США). Клетки трипсинизируют, подсчитывают их количество и разводят в культуральной среде (среда МсС/у 5а/10% ФТС) до концентрации 2х105 клеток/мл. Для каждого образца, содержащего 2х104 клеток, приготавливают раствор в виде смеси 0,075 мкг ρТΑ-^υС-12x8иρе^ТορЕ1акИ и 0,004 мкг рйКЬ-8У40. Их смешивают в конечном объеме 9,8 мкл ОРТ1-МЕМ. Затем добавляют 0,2 мкл реагента для трансфекции ЕпСЕИЕ 6 (фирма ^сИе, Маннгейм, Германия). Предназначенную для трансфекции смесь инкубируют в течение непродолжительного периода времени и затем перемешивают с предварительно приготовленными клетками. Затем клетки высевают из расчета 100 мкл на лунку белых плоскодонных 96-луночных планшетов для культуры клеток и инкубируют при 37°С и 5% СО2 в течение ночи. На следующий день 75 мкл среды удаляют из каждой лунки планшета для анализа и заменяют 10 мкл разведений ЕаЬ-фрагментов НиСАЬ®-антител (от 10 до 0,01 мкг/мл, разведение в бессывороточной культуральной среде), в каждую лунку добавляют 15 мкл либо 70% ФТС, либо человеческой сыворотки и 50 мкл кондиционированной среды Vηί3а, содержащей 600 нг/мл ^ΚΚ1-ΑРР.
В качестве отрицательного контроля вместо разведений антитела добавляют бессывороточную среду. Для получения максимального сигнала люциферазной активности добавляют контроли, содержащие 10 мкл бессывороточной среды вместо разведений антитела и 50 мкл СМ Vηί3а без ^ΚΚ1-ΑРР. После инкубации в течение 24 ч при 37°С, 5% СО2 оценивают люминесценцию с помощью системы для анализа люциферазы ЭиаЮк (фирма Рготеда, Мэдисон, шт. Висконсин, США) согласно инструкциям производителя.
В табл. 9 представлены данные об ингибирующей активности оптимизированных ЕаЬ-фрагментов к ΌΚΚ1 в присутствии 15% человеческой сыворотки (в сравнении с ингибирующей активностью в присутствии 15% ФТС). Полученные данные свидетельствуют о том, что активность в присутствии сыворотки составляет от 26 до 90%, медианное значение 70-74%. Эти данные демонстрируют, что созданы клоны ЕаЬфрагментов антител к ΌΚΚ1, которые функционируют в присутствии человеческой сыворотки.
- 59 015538
Таблица 9
Ингибирующая активность ЕаЬ-фрагментов
Антитело Репортерный анализ люциферазы, без Кгетеп; активность в присутствии 15% человеческой сыворотки (%)
МОК.04945 74%
МО К.04910 90%
МОК04946 60%
МОК04913 88%
МОК04920 75%
МОК04948 70%
МОК04952 60%
МОК04921 26%
МОК04914 80%
МОК04907 54%
МОК04954 55%
ΜΟΚΌ4937 84%
Определение значений ЕС50 ЕаЬ-фрагментов к ΌΚΚ1 с оптимизированной аффинностью с помощью репортерного клеточного анализа люциферазы.
Оценку ЕаЬ-фрагментов с улучшенной аффинностью проводят с помощью стандартного Vηΐ3азависимого ТСЕ/ЬЕЕ 1ис-репортерного анализа с использованием 10 нМ ΌΚΚ1 для ингибирования экспрессии люциферазы. Установлено, что при использовании этого анализа не всегда можно определять значения ЕС50, поскольку его чувствительность является слишком низкой. Это связано с очень высокой крутизной кривых ингибирования и сходными значениями ЕС50 для всех изученных ЕаЬ-фрагментов, что показано на фиг. 4.
Разработана усовершенствованная версия ТСЕ/ЬЕЕ 1ис-репортерного анализа. ΌΚΚ1 связывается с трансмембранными белками ^степИ и -2, и это взаимодействие приводит к выраженному синергетическому ингибированию передачи сигнала VIII (Мао и др., №1иге: 417, 2002, с. 664-67). Поэтому кДНК Юетеп совместно трансфектируют с ТСЕ/ЬЕЕ 1ис при осуществлении репортерного анализа. Созданный Vηΐ3а-зависимый репортерный анализ характеризуется существенно более высокой чувствительностью к ΌΚΚ1, связанной с совместной экспрессией корецепторного белка Ьгетеп. При использовании этого анализа 0,33 нМ ΌΚΚ1 достаточно для индукции полного ингибирования пути передачи сигнала VIII. Титрование ЕаЬ (при использовании 10 концентраций) повторяют с использованием 0,33 нМ ΌΚΚ1 и получают сигмовидные кривые ингибирования (фиг. 5), с помощью которых можно рассчитывать значения ЕС50.
Таким образом, с помощью описанного выше анализа определяют значения ЕС50 ЕаЬ-фрагментов к ΌΚΚ1 с оптимизированной аффинностью. Как видно из табл. 10, значения ЕС50, полученные с помощью указанного метода, составляют от 0,2 до 5,6 нМ.
Таблица 10
Значения ЕС50 ЕаЬ-фрагментов
Антитело ТСГ/ЬЕЕ 1ис-анализ в присутствии Кгетеп: ЕСзо [нМ]
МОН.04913 0,5
МОК04946 0,2
МОК.04907 0,9
МОК04945 0,5
МОК.04914 1,1
МОК04920 1,8
МОК04954 1,3
МОК04952 0,6
МОК04948 0,5
МОК.04910 0,3
МОК.04921 0,7
МОК04947 1,7
МОК04951 2,2
МОК04919 2,7
МОК04949 5,3
МОК04922 2
МОК04911 5,6
- 60 015538
Анализ последовательностей ЕаЬ-фрагментов с оптимизированной аффинностью.
Определяют нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей (νΗ и νθ всех двадцати ЕаЬ-фрагментов. Аминокислотные последовательности гипервариабельных участков (СОЯ) представлены в табл.11 А и 11Б.
Таблица 11А
Аминокислотные последовательности СОЯ тяжелых цепей
Антитело УН НСРК1 8Ε<} ТО ΝΟ: НСОК1 НСОК.2 ЧГ.р 1ϋ N0: Η0ϋΚ2 Η0ϋΕ3 ЗЕО Ю N0: НСРКЗ
Р МОК.04455 УНЗ ΟΡΤΡ88ΥΟΜ8 3 \ννδΟ18α8Ο8ΥΤΥΥΑΟ8νΚα 3 ηυμοη 3
1 МОК04918 УНЗ ΟΡΤΡ88ΥΟΜ8 49 \УУ8С18ЕК.СУУ1РУАО8УКО 57 ΗΥΜϋΗ 65
Р МОК.04456 УНЗ ΟΡΤΡΝΝΥΟΜΤ 4 Ύν8Ο18Ο8Ο8ΥΤΥΥΑϋ3νΚΟ 4 ΤΙ Υ ΜΟΥ 4
2 МОК.04907 УНЗ ΟΡΤΡΝΝΥΟΜΤ 8 \νν30150808ΥΤΥΥΑϋεν ко 8 ΤΙΥΜϋΥ 8
3 МОЙ.04946 УНЗ ΟΡΤΡΝΝΥΟΜΤ 10 ννν 8ΟΙ3Ο8Ο 8ΥΤΥΥΑ08УКО 10 ΤΙΥΜϋΥ 10
4 МОК.04949 УНЗ ΟΡΤΡΝΝΥΟΜΤ 50 ΐνν8ΟΙ8Ο3Ο8ΥΤΥΥΑΡ8νΚΟ 58 ΤΙΥΜϋΥ 66
5 МОК04913 УНЗ ΟΡΤΡΝΝΥΟΜΤ 9 \¥ν8ΟΙ8Ο8Ο8ΥΤΥΥΑΟ8νΚΟ 9 ΤΙΥΜϋΥ 9
Р МОК04461 УНЗ ΟΡΤΡ88ΥΎΜ8 5 1Υν8ΟΙ8Υ8Ο8ΝΤΗΥΑΟ8νΚΟ 5 ΜΟΙΟίβΥ 5
6 МОВ.04911 УНЗ ОРТР88У1УМ8 51 \νν8ΟΙΕΗΚΚ.ΚΑΟΟΑΤ8ΥΑΑ8νΚΟ 59 ΜΟΙϋΕΟΥ 67
7 МОК.04922 УНЗ ΟΡΤΡ88Υ\νΜ8 52 \νν8ΜΙΕΗΚΤΚΟ6ΤΤΟΥΑΑΡνΚΟ 60 ΜαιουοΥ 68
8 МОК049Ю УНЗ 6ΡΤΡ88ΥΐνΜ5 11 ΐνν8ΟΙ8Υ8Ο3ΝΤΗΥΑΟ8νΚΟ 11 МОЮЬОУ 11
9 МОК.04948 УНЗ ΟΡΤΓ83ΥΨΜ8 13 νν3ΟΙ8Υ8Ο3ΝΤΗΥΑΟ8νΚΟ 13 МОТОЪОУ 13
10 ΜΟΒΌ4919 УНЗ ΟΡΤΡ88Υ\¥Μ8 53 ΐνν80Ι3Υ8Ο8ΝΤΗΥΑΟ8νΚ0 61 МОЮЬйУ 69
11 МОК04921 УНЗ ΟΡΤΡ88ΥΎΜ8 12 ν/ν8ΟΙ8Υ8Ο3ΝΤΗΎΑΟ8νΚΟ 12 ΜΟΙΟΕΟΥ 12
Р МОК04470 УНЗ ΟΡΤΡ58ΥΥίΜ8 6 ХУУ ЗУ 133ϋ583ΤΥ Υ ΑΡ3 УКО 6 НОЮРОН 6
12 МОК.04914 УНЗ ΟΡΤΡ88Υ1ΥΜ5 14 \νν3νΐ33β838ΤΥΥΑΟ8νΚΟ 14 НОТОРРН 14
13 МОК04945 УНЗ ΟΡΤΡ88ΥΥ9Μ8 16 χνν8ν188ϋ338ΤΥΥΑΟ3νκθ 16 НОТОРОН 16
14 МОК04951 УНЗ ΟΡΤΡ88Υν9Μ8 54 \νν8νΐ88ϋ888ΤΥΥΑΟ8νΚΟ 62 НОЮРОН 70
15 ΜΟΚΌ4952 УНЗ ΟΡΤΓ88Υ\νΜ8 55 \Υν8νΐ88Ο883ΤΥΥΑΟ8νΚΟ 63 ΗΟΙΟΡϋΗ 71
16 МОК04950 УНЗ ΟΡΤΡδδΥλΥΜΒ 56 5νν8νΐΕΗΚ8ΡΟ3ΑΤΡΥΑΑ3νΚΟ 64 ΗΟΙΟΓΟΗ 72
17 МОК.04954 УНЗ ОЕТРЗЗУЛУМЗ 18 ΧννδνίΕΗΚυΚΟΟΤΤΥΥΑΑδνΚΟ 18 ΗΟΙϋΡϋΗ 18
18 МОК.04920 УНЗ ΟΡΤΡ88ΥΧΥΜ8 15 \νν83ΙΕΗΚΟΑΟΥΤΓνγΑΑθνΚΟ 15 ΗΟΙϋΡϋΗ 15
Р МОК.04516 УН5 ΟΥ8ΡΤΝΥΥΙΟ 7 ΨΜ6ΙΙΥΡΤΟ8ΥΤΝΥ8Ρ8Γ0Ο 7 ΟΙΡΡΚΜΚ-ΟΡϋΥ 7
19 МОК04947 УН5 ΟΥ8ΡΤΝΥΥΙΟ 19 ™ΟΠΥΡΟΤ8ΥΤΙΥ8Ρ5ΡΟΟ 19 ΟΙΡΡΚΜΚΟΡϋΥ 19
Таблица 11 Б
Аминокислотные последовательности СОЯ легких цепей
МОК-антитело, № ντ. НСОК.1 8Εζ> ГО ΝΟ; НСЭК.2 8Ε0 ГО ΝΟ: ΙιΟϋΚ3 3Ε0 ТО ΝΟ: Примечание
Ρ 04455 κι ΚΛ50ΟΙ5ΝΥ1.Η 22 ЫЛУСЛЗМЬОЗ 22 ΟΟΥϋδίΡΜ 22
1 0491« κι ΚΑ80ΟΙ8ΝΥΕΗ 73 ΙΧΙΥΟΑ8ΝΕ<}8 81 <Χ>Υϋ8ΙΡΜ 89
Ρ 04456 КЗ КАЗОМЬРЗРУЬА 23 ЬЩУСАЗИКАТ 23 ΟΟΥΟβΕΡΙ 23
2 04907 КЗ ΚΑ80ΝΕΕ8ΡΥΙ.Α 27 ίΕΙΥ6Α8ΝΚΑΤ 27 ООУЪЗЕРТ 27
3 ¢4946 КЗ ΚΑ8ΟΝίΡ3ΡΥΕΑ 29 ΙίΙΥΟΑΒΝΚΑΤ 29 ООУЬТЕРЬ 29
4 04949 КЗ ΚΑ3ΟΝΕΡ8ΡΥΕΑ 74 ΙΛ.ΙΥΟΑ8ΝΚΑΤ 82 ΟΟΥΕΡΡΕ 90
5 04913 КЗ КАЗОЫЬРЗРУЕА 28 Ι.ΕΙΥ0Α8ΝΡΑΤ 2« ΟΟΥΜΤΕΡί 2« мутация РЗУ4
Ρ 04461 Е2 τοτΒδϋνοαΡΝΥνβ 24 ΕΜΙΗΟΟ3ΝΚΡ8 24 ΚΤ'Λ'ϋΜΤΥϋΡ 24
6 0491 1 Ь2 ΤΟΤ83ϋνθΟΡΝΥν3 75 ΕΜΙΗΟΟ8ΝΚ.Ρ8 83 8Ι\νθΜΤνϋΡ 91
7 04922 Ь2 ΤΟΤ88ϋνθΟΡΝΥν3 76 ΕΜΙΗϋΟ3ΝΚΡ8 84 ЗТТОМТУОЕ 92
8 04910 Ъ2 Τ0Τ350ν06ΡΝΥν3 30 ΕΜΙΗΟ68ΝΒ.Ρ8 30 08νϋν8Ρ1ΤΑ 30
9 04948 Ь2 ΤΟΤ83ϋνθΟΡΝΥν5 32 ΕΜΙΗΟΟ8ΝΚΡ8 32 ОТАУЕЧЕЯЕР 32
10 04919 Ь2 ΤΟΤ88θνΟΟΡΝΥν8 77 ΕΜΙΗΟΟ8ΝΚΡ3 85 Ο3\νονσροορ 93
11 04921 Ь2 ΤΟΤ33ϋνθΟΡΝΥν8 31 ΕΜΙΗϋΟ8ΝΚΡ8 31 ОТЗУАТЗРЕЗБ 31
Ρ 04470 Ь2 ΤΟΤ88ϋΕΟΟΥΝΥν8 25 ΕΜΙΥΟνΝΝΚΡΒ 25 <?3ΥΑ8ΟΝΤΚν 25
12 04914 Ь2 ΤΟΤ88ΟΕ00ΥΝΥν3 33 ΕΜΙΥΡνΝΝΒΡΚ 33 08ΥΤΥΤΡ18Ρ 33
13 04945 Ь2 ΤΟΤδΒΟΕΟΟΥΝΥΥδ 35 ΕΜΙΥΟΥΝΝΚΡ3 35 ΟΤΥϋΟΙΚΕΒΑ 35
- 61 015538
МОК-антитело, № V,. НСОК.1 8Ε<2 ΙΟ )9Ο: НСПК2 8ΕΟ Ю ΝΟ: ЬСРКЗ 8Ε<3 ΙΟ ΝΟ: Примечание
14 04951 Ь2 ТОТЗЗОЬСОУЙУУЗ 78 ίΜΙΥΟνΝΝΚ,ΡΒ 86 ΟΒΥΟΡΡΣΟνν 9+
15 04952 Ь2 тогавоьссУйУУБ 79 ίΜΙΥΟνΝΝΚ,Ρδ 87 08ΥΟ8ΡΤϋ8ν 95
16 04950 Ь2 Τ6Τ88Ο1ΌΟΥΝΥν8 80 ίΜΙΥΡνΝΝΚΡδ 88 08ΥΑ8ΟΝΤΚν 96
17 04954 12 ΓατδδΟίΟΟΥΝγνκ 37 ίΜΙΥϋνΝΝΚΡδ 37 08ΥΑ8ΟΝΤΚν 37
18 04920 Ь2 ΤΟΤ5ΒΟίΟΟΥΝΥν5 34 ίΜΙΥϋνΝΝΚΡδ 34 08ΥΑ8ΟΝΤΚν 34 точковая мутация НСОК2
Р 04516 Ы 86588ΝΙΟ88ΡνΝ 26 Εί1ΟΜΝ8ΝΚ.Ρ8 26 ΑδΡΟΜΟΒΡΝν 26 потенциальные сайты Νгликозилирования
19 04947 Ь1 86588ΝΙΟ88ΡνΝ 38 Εί16ΝΝ8ΝΚΡ8 38 Α8ΡϋΜΟ8ΡΝν 38 потенциальный сайт Νгликозилирования
консенсусная последовательность 1 ΚΑδΟχχχχχΥχ 131 ЬЫУСАВЫххх 132 ΟΟΥχχχΡχ 133
консенсусная последовательность 2 ΤΟΤ88ΟΥΟΟΡΝΥν8 134 ЬМ1хОххЬ1КР5> 135 χχλνϋχχχχχ 136
Анализ последовательностей позволил установить, что из пять из шести родительских (Р) ЕаЬфрагментов получают потомков с улучшенной аффинностью. Клоны М0Я04461 и М0Я04470 можно оптимизировать в НСЭЯ2, а также в ЬСЭЯ3. М0Я04454 представляет собой потомка с не оптимизированными свойствами. Кроме того, обнаружен высокий уровень гомологии между различными родительскими антителами, что видно при сравнении консенсусной 1 и консенсусной 2 последовательностей различных СОЯ, представленных в табл. 11Б. Аналогичные консенсусные последовательности можно получать для родительских последовательностей, представленных в табл. 10А, с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области.
Кроме того, установлено, что клон М0Я04920 несет мутацию в НСЭЯ2-участке (замена остатка 8ег на С1у в положении 73 согласно системе нумерации, опубликованной Нопеддег и Р1иск£Ъип, 1. Мо1. Вю1. 309, 3, 2003, с. 657-670), что отличает его от конструкции НиСАЬ®.
Установлено, что клон М0Я04913 имеет точечную мутацию в каркасном участке 4 легкой каппацепи (замена Ьук на Акп в положении 148). Не предполагается, что мутация в этом положении может оказывать воздействие на способность антитела к связыванию, мутация возвращает состав зародышевой линии/НиСАЬ® из-за конверсии 1дС, что позволяет получать антитело М0Я05145.
Клон М0Я04947 имеет потенциальный сайт гликозилирования в БСЭК2. Этот сайт не удаляют, поскольку клон М0Я04947 отобран в качестве только одного из кандидатов-дублеров.
Пример 7. Производство НиСАЬ®-иммуноглобулинов.
Превращение в ЦС-формат.
Для экспрессии полноразмерного иммуноглобулина (1д) фрагменты вариабельной области тяжелой (УН) и легкой (Уь) цепей субклонируют с использованием экспрессионных векторов рМ0ЯРН®Х9_ЕН ЕаЬ в сериях векторов либо рМ0КРН®_Б_1д, либо рМ0ЯРН®2_Б_1д для человеческого 1дС1 и человеческого 1дС4. Для человеческого 1дС2 можно использовать другие векторы. Рестриктазы ЕсоЯ1, МГе1 и В1р1 применяют для субклонирования фрагмента УН-области в рМ0ЯРН®_Б_1дС1 и рМ0ЯРН®_Б_1дС4. Рестриктазы МГе1 и В1р1 применяют для субклонирования фрагмента УН-области в рМ0ЯРН®2_Н_1дС1Г и рМ0ЯРН®2_11_1дС4. Субклонирование фрагмента Уь-области в рМ0ЯРН®_Б_1дк и рМ0ЯРН® 2_11_1§к осуществляют с использованием сайтов ЕсоЯУ и Вк1У1, а субклонирование в рМ0ЯРН®_11_1д/. и рМ0ЯРН®2_11_1д/.2 осуществляют с использованием ЕсоЯУ и Нра1.
Кратковременная экспрессия и очистка человеческого 1дС.
Клетки НЕЕ293 трансфектируют эквимолярным количеством экспрессионных векторов для тяжелой и легкой цепи 1дС. Через 4 или 5 дней после трансфекции собирают супернатанты клеточных культур. После доведения значения рН супернатанта до 8,0 и стерилизации фильтрацией раствор подвергают стандартной колоночной хроматографии на протеине А (тип Рогок 20 А, фирма РЕ Вюкук1етк).
Превращение родительских ЕаЬ-фрагментов в 1дС-форматы.
Параллельно с началом экспериментов по созреванию аффинности клоны М0Я04454, М0Я04456 и М0Я04470 клонируют в экспрессионных векторах рМ0ЯРН®_Н_1дС1 и рМ0ЯРН®_Н_1дС4. Для создания экспрессионных векторов для 1дС2 можно применять другие конструкции. Маломасштабную экспрессию осуществляют путем кратковременной трансфекции ΗЕΚ293-клеток и полноразмерные иммуноглобулины очищают из супернатантов клеточной культуры.
- 62 015538
С помощью гель-фильтрации установлено, что антитела находятся в мономерной форме. Оценка с использованием Vπΐ3а-зависимого репортерного анализа подтвердила, что белки являются функциональными.
Пример 8. Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности генов, оптимизированные для экспрессии.
Для повышения уровни экспрессии в клетках млекопитающих интродуцируют изменения в тяжелые и легкие цепи РаЬ-фрагментов, представленных в настоящем описании, путем оптимизации наиболее часто встречающихся кодонов для экспрессии в клетке. Известно, что несколько отрицательных цисактивных мотивов снижают экспрессию у млекопитающих. Предлагаемый в настоящем изобретении процесс оптимизации предусматривает удаление отрицательных цис-активных сайтов (такие как сайты сплайсинга или поли(Л)-сигналы), которые оказывают отрицательное воздействие на экспрессию. Предлагаемый в настоящем изобретении процесс оптимизации предусматривает также повышение содержания СС для удлинения времени полужизни мРНК.
Вариабельные области тяжелой и легкой цепей оптимизируют, используя клон РаЬ-фрагмента ΜΟΒ04945 (родительская полноразмерная нуклеотидная последовательность легкой цепи представлена в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 98, а родительская полноразмерная нуклеотидная последовательность тяжелой цепи представлена в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 102), выделенный путем селекции с использованием фаговой презентации. Затем нуклеотидные последовательности, кодирующие каждую полную легкую и тяжелую цепь этого и других клонов, оптимизируют с помощью указанных процедур.
Процесс оптимизации УН- и Уь-цепей ΜΟΒ04945.
Для оптимизации нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности каждой из Уь- и УН-цепей с целью экспрессии в клетках млекопитающих адаптируют наиболее часто встречающиеся кодоны, смещая их в сторону кодонов генов млекопитающих. Кроме того, количество областей с очень высоким (> 80%) или очень низким (< 30%) содержанием СС уменьшают или, если это возможно, элиминируют. В другом варианте оптимизация для экспрессии в бактериях, дрожжах или бакуловирусах предусматривает адаптацию наиболее часто встречающихся кодонов, смещая их в сторону соответствующих генов.
В процессе оптимизации для экспрессии в клетках млекопитающих избегают присутствия следующих обладающих цис-активностью мотивов последовательностей: внутренние ТАТА-боксы, хи-сайты и сайты проникновения в рибосому, богатые ЛТ или богатые СС участки последовательностей, элементы последовательности мотива, приводящего к нестабильности РНК (ЛКЕ), элементы ингибирующей РНК последовательности (ΙΝ8), элементы чувствительной к цАМФ (СК8) последовательности, последовательности повторов и вторичные структуры РНК, донорские и акцепторные сайты сплайсинга, включая криптические сайты и точки разветвления. Помимо вышеуказанного в процессе оптимизации нуклеотидной последовательности У|-цепи избегают интродукции сайтов М1ц! и НтйШ. Помимо вышеуказанного в процессе оптимизации нуклеотидной последовательности УН-цепи избегают интродукции сайтов Μ1νΙ и ВйЕП.
Аминокислотные последовательности оптимизированных для экспрессии УН- и Уъ-цепей ΜΟΒ04945.
Адаптируют наиболее часто встречающиеся кодоны для получения более высоких уровней и более стабильной экспрессии в клетках млекопитающих полученных оптимизированных аминокислотных последовательностей УН- и Уь-цепей описанного выше клона ΜΟΒ04945 (см. пример 15).
Ниже в табл. 12А показаны смысловые и антисмысловые (Л8) нуклеотидные последовательности вариабельной области легкой цепи (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 120) и полученная оптимизированная для экспрессии аминокислотная (обозначена как ЛЛ) последовательность вариабельной области легкой цепи (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 118).
- 63 015538
Таблица 12А Нуклеотидные смысловая и антисмысловая последовательности и аминокислотные последовательности Уь-цепи, оптимизированные для экспрессии
М1и! ЕсоР.У ВвСЫ!
АССССТТССаАТАТСССССТСАСССА6ССС0ССАСС6ТСТСС<ЗеСА6СССТабССА6АеС (смысловая)
----------_---+---------+----------μ---------+----------μ тссссААсастАТАасоасАСтосатс0басватсасАСАссссстсс0еАССС5(зтстс(з (аз)
Т__К__С__Р__1_А__Ь__т__о__₽__А__3__ν__3__Ο__3__Р__С__О__8__ (АА) руин ВзСЫ! Весы!
АТСАССАТСАССТСТАССееСАССАССАСССАССТССССеССТАСААСТАССТеТССТСС(смысловая)
---------+---------+---------+---------+---------+----------ь
ТАСТССТАСТСеАСАТОССССТаОТССТС(ЗСТСЗ(ЗАССССССаАТатТ<ЗАТССАСА<заАСС {АЗ)
I__Т__I__3__с__т__а__Т__Ξ__3__О__Ь О д__Υ__Ν Υ V 8 И (АА)
ТАТСАССАССАССССбССААСССССССААССТСАТСАТСТАССАССТСААСААСАСАССТ(смысловая)
121 ---------+---------+---------+---------+·---------+---------+
АТАСТсатсотаооссссттсссааааттсоАСТАстАаАтостасАсттаттотстссА (аз)
Υ__Д о Н Р д К А__₽__К__Ь М I__Ύ__И__V к Н__Н__Р__ (АА)
Ηΐη£ΐ
АОСаССдТеТССААСАСАТТСАСССССАаСААСАССаССААСАСССССАСССТСАССАТС (смысловая)
101 —----+ ---+- и--------+---------- + - ------+> - - + тсссс<зсАСАдоттстстАА5тссссд'тсоттстсдсс5ттэтсасдатсдвАСтд<зтАс ( аз } а V 8 N К__У__3__С__8__К__8__С__И__Т_А_8__Ь__Т__I__ (АА)
РвЫ
ТСТОаССТбСАддСТдАОбАгаАдеССОАСТАСТАСТдССАВАССТАСдАССАСАТСААд ( Смыслова я)
241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
АаАссбСАсатссеАСтсстдстссасстсАтдАтдАсадтстоеАТбСтоатстАОТтс (аз)
О Ь РАЕ Ό Е А Р Υ Υ С 0 Т Υ Р О I К (АА)
ΗιηάΙΙΙ ст«тссдссетатттдссеассаААСАААсстт (смысловая) (зео ιρ νο: 120) 301 ---------+’----------и---------!---САСАаосддСАСАААСсдсссссттетттсдАА (аз)
Ь__з А V У__е__О__е__Т__К__Ь__(АА) (НЕС ΙΡ ΝΟ: 110)
Далее в табл. 12Б показаны смысловые и антисмысловые (А8) нуклеотидные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (8Е0 ΙΌ N0: 121) и полученная оптимизированная для экспрессии аминокислотная (обозначена как АА) последовательность вариабельной области тяжелой цепи (8Е0 ΙΌ N0: 119).
- 64 015538
Таблица 12Б Нуклеотидные смысловая и антисмысловая последовательности и аминокислотные последовательности УН-цепи, оптимизированные для экспрессии
М1у1
Ηίηίΐ вести Ρνυΐι
ОАбтссАттенбАОтосАаасссАедтесАОстастооАОАассосасАсаАСТССТосА (смысловая) ΐ ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
СТСАаСТААСССТСАССТССаОЕТССАССТССАССАССТСТСаСССССТССТСАССАССТ (Α5) а ν о а ο ν ο__ι·__ν_β__е__α__β_β__ь__у_о_ (αα) взснг всстоссоасАссстоАаАстсАастстсссассАасаосттсАссттсАССАОстАста (смысловая)
ССеАСССССаТССОАСТСТаАСТССАСАССССССТСССССААСТСбААСТСаТССАТСЗАС (АЗ) _Р_е_О_В Ь В_Ъ_В_САЛ_8_С_Г_Т_Р_8_В Υ И (АА)
В®Ь«Т ВЗЁНТ Вс11
САТаАССТСОСТОАОаСАОСССССТаССААСаСССТеСАСТСОСТСТСССТСАТСАаСАЕ (смысловая)
121 ---------г---------+---------+---------+---------+---------+
СТАСТСОАСССАСТСССТСССОСОАССОТТСССООАССТСАСССАСАббСАСТАОТССТС (АЗ)
М 8 К V в о_А_РОК_О_Ь_ЕНУ 5 V I_8_3_ (АА)
ССАТАОСАОСАОСАССТАСТАСОССОАТАвСОТСААОООССбСТТСАССАТСАСССООСА (смысловая)
181 - — * — + - — - — + — --------н — ------- - +-----------,
ОСТАТСОТСОТССТОСАТОАТОССССТАТСОСАСТТССССОССААеТООТАбТСООСССТ (АЗ) _ϋ_3_3_3_Т Υ Υ А Р_ЗУКОВ__Р__Т_Т__3 К Р (АА) рвы вэрмх
СААСАОСААеААСАСССТОТАССТа<2АбАТОААСАОССТОАСАОССОАО<ЗАСАСССССОТ (смысловая)
241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
ОТТСТССТТСТТСТОбОАСАТбОАСОТСТАСТТОТСОСАСТСТСОбСТССТСТСОССССА (АЗ)
Н 3_К_Ы_Т_Ιι Υ Ιι_йММЗЬКАЕРТ_А V (АА)
В8СМ1 ВяСТИ ВВСТ?! В8СЕ1Т.
аТАСТАСТОТСССАООСАССаСАТСаАСТТССАССАСТеаСОССАОООСАСССТОатСАС (смысловая)
01 — — — — - + --------- + - — — - — — — — + — — 1 +---------+---------+
САТСАТОАСАСааТСССТССССТАОСТСААССТОСТСАССССООТССССТСаСАССАСТО (АЗ)
Υ Υ__С А В Н__С__I__Р__Р Р н н о_о__О Т Ъ V т
С (смысловая) (ЗЕО ΙΡ ΝΟ: 121)
361 <3 (АЗ) _ (АА) (ЗЕО 10 НО; 119)
Из схем, полученных до и после оптимизации, можно рассчитать в процентах количество кодонов последовательностей для каждой из родительских последовательностей и оптимизированных генов соответственно и проанализировать уровень качества класса соответствующих нуклеотидных последовательностей, кодирующих УН- и У|,-цепи. В контексте настоящего описания под понятием уровень качества подразумевается, что применяемые для кодирования данной аминокислоты наиболее часто встречающиеся кодоны в требуемой системе экспрессии соответствуют 100, а остальным кодоном придается уровень качества в зависимости от частоты их встречаемости (8Иагр Р.М., Ь1, νΚ, Иис1е1с Ас1йк Кек. 15 (3), 1987).
Кроме того, индекс адаптации кодонов (СА1) представляет собой значение, которое характеризует насколько хорошо кодоны нуклеотидной последовательности соответствуют предпочтительным наиболее часто встречающимся кодонам организма-мишени. Принято, что максимальное значение СА1 состав
- 65 015538 ляет 1,0, таким образом, значение САI > 0,9 рассматривается как обеспечивающее высокий уровень экспрессии. Установлено, что значение САI для Уь-цепи перед оптимизацией составляет 0,73, а после оптимизации значение САI составляет 0,95. Аналогично этому, установлено, что значение САI для Ун-цепи перед оптимизацией составляет 0,74, а после оптимизации значение САI составляет 0,98 в оптимизированных конструкциях, содержание ОС Уь-цепи повышается с 51% в родительской последовательности клона М0К04945 до 62% в оптимизированной последовательности, полученной из М0К04945. Как видно из фиг. 9А и 9Б, содержание ОС в Ун-цепи повышается с 54% в родительской последовательности клона М0К04945 до 64% в оптимизированной последовательности, полученной из М0К04945.
Оптимизация для экспрессии полноразмерных легких цепей и тяжелых цепей клонов М0К04910, М0К04945, М0К04946 и М0К05145.
Процесс оптимизации применяют для каждой из родительских полноразмерных нуклеотидных последовательностей легких цепей клонов М0К04910 (БЕр ΙΌ N0: 97), М0К04945 (БЕр ΙΌ N0: 98), М0К04946 (БЕр ΙΌ N0: 99) и М0К05145 (БЕр ΙΌ N0: 100) и родительских полноразмерных нуклеотидных последовательностей тяжелых цепей клонов М0К04910 (БЕр ΙΌ N0: 101), М0К04945 (БЕр ΙΌ N0: 102), М0К04946 (БЕр ΙΌ N0: 103) и М0К05145 (БЕр ΙΌ N0: 103).
Процесс оптимизации применяют для конструирования каждой из следующих нуклеотидных последовательностей легких цепей, ассоциированных с указанными родительскими клонами: для клона М0К04910 оптимизированная нуклеотидная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 104; для клона М0К04945 оптимизированная нуклеотидная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 105; для клона М0К04946 оптимизированная нуклеотидная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 106, для клона М0К05145 оптимизированная нуклеотидная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 107. Кроме того, процесс оптимизации применяют для конструирования каждой из следующих нуклеотидных последовательностей тяжелых цепей, ассоциированных с указанными родительскими клонами: для клона М0К04910 оптимизированная нуклеотидная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 108; для клона М0К04945 оптимизированная нуклеотидная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 109; для клона М0К04946 оптимизированная нуклеотидная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 110 и для клона М0К05145 оптимизированная нуклеотидная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 110.
Оптимизированные нуклеотидные последовательности легких цепей ассоциированы со следующими оптимизированными аминокислотными последовательностями легких цепей: для клона М0К04910 оптимизированная аминокислотная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 111; для клона М0К04945 оптимизированная аминокислотная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 112; для клона М0К04946 оптимизированная аминокислотная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 113 и для клона М0К05145 оптимизированная аминокислотная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 114. Оптимизированные нуклеотидные последовательности тяжелых цепей ассоциированы со следующими оптимизированными аминокислотными последовательностями тяжелых цепей: для клона М0К04910 оптимизированная аминокислотная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 115; для клона М0К04945 оптимизированная аминокислотная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 116; для клона М0К04946 оптимизированная аминокислотная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 117 и для клона М0К05145 оптимизированная аминокислотная последовательность представлена в БЕр ΙΌ N0: 117.
Перечень нуклеотидных и полипептидных последовательностей рассматриваемых полноразмерных последовательностей легких и тяжелых цепей представлен в табл. 13А и 13Б. В табл. 13А представлены оптимизированные нуклеотидные последовательности и кодируемые ими полипептиды. Эти нуклеотидные последовательности оптимизируют, удаляя латентные сайты сплайсинга, которые распознаются системами экспрессии млекопитающих. В табл. 13Б представлены родительские нуклеотидные последовательности клонов, перечисленных в табл. 13А.
- 66 015538
Таблица 13А
Последовательности легких (ЬС) и тяжелых (НС) цепей - оптимизированные
- 67 015538
ААТСТТТТТТСТССТТАТСТСССТТа<ЗТАССАаСАСАААССА<ЗОТСАА<ЗаАССаССТСТАТТААТТТАТ<3(ЗТеСТТСТААТ сатасААСтеесютссса(ЗсссатгттАзса<зстстеаАТСС0асАса<ЗАТтттАссст<ЗАССАттАасАасстб<ЗААССт СААаАСТТТСССОТаТАТТАТТаССАЗСАСТАТСТТАСТСТТССТСТТАССТТТСаССАСССТАСХЗАААетССАаАТСААА СОААСТСТСаСТаСАССАТСТХЗТСТТСАТСТТСССаССАТСТОАТОАССАСТТаАААТСТСОААСТСССТСТСТтетНТСС СТССТСААТААСТТСТАТСССАСАаАСОССАААОТАСАСТС6АА<МТССАТААСССССТССААТС(3®ЗТААСТСССАССАЗ АСТСТСАСА0АССА13<ЗАСАССААаОАСАаСАССТАСАаССТСА<ЗСА0САСССТеАС<ЗСТ5А<ЗСАААаСАСАСТАС<ЗАСААА САСАААаТСТАСВССТСССААвТСАСССАТСАССвССГдАОСТСасССаТСАСАААаАОСТТСААСАСОаСАОАСТСТТАС
ЬС4946 (ΒΗζ>898) полипептид 8Е() ГО N0: 113
1ЛУЬТО'ЗРАТЬЗЬЗРОЁНАТЬЗСКАЗОКЬРЗРУ1АНУООкРСОАРКЬЫУ13АЗЫКАТаУРАЕЕЗ<33133СТРЕТЕТ103ЬЕР ЕОЕАУУУСООУЬтьрьтраосткуЕхкктУААРЗУЕХРРрзоЕськзстАЗУУсььныртрКЕАКУОЫКУПЫАЬОзаызсЕ ЗУТЕОРЗКРЗТУЗЪЗЗТЬТЬЗКАОУЕКНКУУАСЕУТНОаЬЗЗРУТКЗРПНСЕС
ЬС (оптимизированная) 5145 нуклеотидов £Εζ> Ю N0: 100
ОАТАТССТаСТаАСССА13АОСССаССаАСССТОАаССТСТСТСсаО<ЗССААС13ТаС<ЗАСССТаАССТССАОАССёА<ЗССА0 ААТСТТТТТТСТССТТАТСТеССТТОеТАССАЗСАОАААССА<3(ЗТСААаСАССХК«ТСТАТТААТТТАТОетеСТТСТААТ СаТОСААСТСааСТСССОССасСТТТТАОС03СТСТССАТССС0САСС(ЗАТТТТАСССТБАССАТТАССАОССТО<ЗААССТ СААОАСТТТОСаОТ(ЗТАТТАТТСССАССА0ТАТАТСАСТСТТССТСТТАССТТТОСССАе(5аТАСОАААОТССАОАТСААА С<ЗААСТСТСССТССАССАТСТСТСТТСАТСТТССССССАТСТСАТОАОСАСТТОАААТСТСОААСТ13ССТСТСТТСТ13ТаС СТ<ЗСТОААТААСТТСТАТСССАОАСАСЮССАААаТАСАеТаОААаеТ0САТААСаСССТССААТгаЗеТААСТСССА(ЗСА13 АСТбТСАСАОАаСАООАСАаСААабАСАвСАССГАСАОССТСАОСАаСАСССТаАСаСТОАОСАААаСАОАСТАСОАОААА САСАААСТСТАС0ССТССОААОТСАСССАТСАО(ЗвССТСАОСТСССССБТСАСААА<ЗАаСТТСААСАОба(ЗАОАСТетТАЗ
ЬС5145 (ВНС>901) полипептид 8Εζ) ГО N0: 114
ОХУЬТОЗРАТЬЗЬЗРаЕКАТЬЗСКАЗОНЬГЗРУЪАИУООКРСОАРкЪЫУаАЗЫКАТОУРАКГЗЕЗСЗеТПРТЬТХЗЗЪЕР ЕОЕАУТУСООУМТЪРЬТГСоаТКУЕ1ККТУААР0УР1РРР5ОЕОЬК0<ЗТАЗУУСЕЬННЕУ₽КЕАКУОНКУЕНАЬО30ЫЗОЕ ЗУТЕООЗКОЗТУЗиЗЗТЬТЕЗКАОУЕКНКУУАСЕУТНОбЬЗЗРУТКЗРЫЕбЕС
НС (оптимизированная) 4910 нуклеотидов 8Е<2 ГО N0: 101
САСЗСАСАСОТССАЛТТССТССАААОССССССССОССТЗСТОСААСССССССССАСССТССЗТСТОАССТСССОЗСССТСС ссдтттАссттттсттсттАттхзоАтотсттстаэтссоссААосссстаскзААааатстсоАатзаотоАссаб'ТАТсгст ТАТТСТаоТАЗСААТАСССАТТАТОССЗеАТАСССТОАААСССССТТТТАССАТТТСАССТОАТААТТССАААААСАСССТС ТАТСТССАААТБААСАЕССТОССТаССаААОАТАСаССССТОТАТТАТТСССССССТАТСОСТАТТСАТСТТСАТТАТТСС 6ОССАА0ССАСССТССТСАСС0ТСТССТСАеССТССАССАА0<3<ЗСССАТС(3<ЗТСТТСССССТ®ЗСАСССТССТССАА(ЗАОС АССТСТССССССАСАССОССССТ&ЗССТаССТаеТСАА&ЭАСТАСТТССССЗААССОТТС-АСОСТСТСОТООААСТСАЭЗС ссссгбАССАОССзасстссАаАССТТССсоастетсстАСАатсстсАоаАстстАстссстсАССАесатсстоАссате СССТССАаСАаСТТСО<ЗСАСССАОАССТАСАТСТ0СААС<ЗТаААТСАСААасССА(ЗСААСАССАА(Зат<3<ЗАСААаАСАатт ОАОСССАААТСТТаТ0АСААААСТСАСАСАТаСССАСОЗТасССАаСАССТ0ААСТССТС<ЗСО0ОАССОТСАОТСТТССТС ТТССССССААААСССААОСЗАСАСССТСАТаАТСТСССаСАССССТаАЗОТСАСАТССОТССТааТСЕАСОТаАОССАССЗАА ОАСССТ(ЗА(ЗОТСААСТТСААСТС0ТАСаТ0САСССОТТ&ЭАСвтаСАТААТаССААОАСААА(ЗССеаЗ(ЭСА<30АССА<ЭТАС ААСАССАССТАСССТСТаСТСАССаТССТСАССбТССТОСАССАССАСТаССТОААТаССААааАСТАСААаТОСААСОТС ТССААСАААаСССТСССАаСССССАТСаА0ААААССАТСТССАААСССАААСОаСАбССССОА<ЗААССАСАавТСТАСАСС СТОСССССАТССССЗОА(ЗаА<ЗАТеАССААОААССАС13ТСА13С СТОАССТСССТаОТСАААСКЗСТТ СТАТССС АЙСОАСАТС оссатаоАатезаАОАасААтааесАасссзаАОААСААСТАСААСАсаАсасстсссстастЕЕАСтссаАсссстссттс ТТССТСТАТАССААОСТСАСССТОаАСААОАССАООТОССАОСАЖОаААСОТСТТСТСАТОСТССетаАТОСАТОАаССТ СТССАСААССАСТАСАСССАОААСАОССТСТСССТаТСССССаОТАААТОА
НС4910 (ΒΗζ?880) полипептид 8Е(} ГО ΝΟ: 115
ОУЗЬУЕЗбааъУОРааЗЬКЕЗСААЗОЕТРЗЗУИМЗИУКОАРСЗКаЪЕНУЗёТзУЗСЗНТНУАПЗУКОНРТЬЗКОЫЗКМТЬУЬ омыв ькаебтаууусанмсΐоьсгиаоетьντνδδазткорзуррьарз зкзтз&зтааьссьукоυρρερутузииз саъ ТЗНУНТЕРАУЪОЗЗаЬУЗЬЗЗУУТУРЗЗЗЬСТОТУТСНУИНКРЗИТКТОККУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЕЬаСРЗУРЬРР РКРКПТЬМ13ЕТРЕУТСУУУПУ5НЕОРЕУКЕЯНУУР6УЕУНЫАКТКРКЕЕаУНЗТУКУУЗУЬТУШ0ОИЬЫОКЕУКСКУЗМ КАЬРАР1ЕКТ15КАКСК!РКЕР0УУТЬРРЗНЕЕМТК№У8ЬТС1.УК<ЗРУРЗО1АУЕИЕЗНаОРЕМЖКТТРРУЪР31ХЗЗРЕЬ
- 68 015538 ¥ЗКЬТУПК8ЕИОО0ЫУРЗСЗУМНЕА1ЛКНУТОК8ЕЗЬ8Р0К
НС (оптимизированная) 4945 нуклеотидов 8Ер ГО N0: 102
САСССАСАССТССААТТССТ0аАААОС00Са0СС0ССТ0аТ0СААСС000СаЗСАеССТ0С0ТСТ0А0СТ0С0С00ССТСС С0АТТТАССТТТТСТТСТТАТТССАТ0ТСТТСССТ0 ОСССААОССССТС<3<ЗАА0(ЗОТСТССАСТ6(36Т<ЗА6ССТТАТСТ ст ТСТаАТТСТАОСТСТАССТАТТАТССааАТАаСатаАААСССаОТТТТАССАТТТСАСОТСАТААТТСОАААААСАСССТО ТАТСТ0САААТ0ААСАСССТСССТСС0аАА0АТАССКЮСатаТАТТАТТ<ЗС<ЗСаССТСАТа0ТАТТ0АТТТТ0АТСАТТ0а ССССААСЗаСАСССТаСТСАСССТСТССТСАаССТССАССААОаОСССАТСаОТСТТСССССТаОСАСССТССТССААОАОС АССТСТаа€ОССАСАССа<ЗСССТ<ЗСаСТаССТСЮТСАА(ЗаАСТАСТТССССйААСС(ЗСТСАСС5ОТСТССТССААСТСА(ЗСС ССССТСАССАССОСССТССАСАССТТСССООСТСТССТАСАСТССТСАСаАСТ СТАСТСС СТСА0СА8С0ТС0Т0АСССТС СССТССА0СА0СТТ0®ЗСАСССАеАССТАСАТСТ0СААС0Т0ААТСАСААаСССАОСААСАССААСЮТаСАСАА0АаАСТТ ОАбСССАААТСТТеТОАСААААСТСАСАСАТЕСССАСССТаСССАаСАССТСААСТССтаОССССАССаТСАСТСТТССТС ТТССССССААААСССААбСАСАСССТСАТОАТСТССССЮАССССТаАаСТСАСАТаСаТОСТОЗТССАааТЕАОССАССАА ОАСсстсАеатсААСттсААСтастАсатссАсаасатаодлстосАТААтассААОАСАААсссссаооАеоАасАатАС ААСАаСАССТАССОТ0Та<ЗТСАСССТССТСАССХЗТССТ6САССА60АСТОаСТаААТОеСААСЗаАСТАСААетаСААааТС ТССААСАААаСССТСССАОСССССАТССАОААААССАТСТССАААОССАААОЗОСАаССССаАОААССАСАССТОТАСАСС СТаСССССАТССССОСАааАОАТаАССААОААССАааТСАаССТОАССТЗССТЕСТСАААаЗСТТСТАТСССАСЗСОАСАТС ОССОТЗОАСТабОАаАОаААТОаОСАОСССОАСААСААСТАСААОАССАССЗССТСССетаСТООАСТССаАСЗСЗСТССТТС ТГССТСТАТАаСААССТСАСС0таЗАСААСАеСАОаТ00САССАОа<ЮААСаТСТТСТСАтеСТСССТ<ЗАТаСАТ6А<ЗССТ СТаСАСААССАСТАСАСОСАОААаАаССТСТСССТаТССССОвЭТАААТОА
НС4945 (ВН0892) полипептид ЗЕО ГО N0: 116
ОУОЬУЕЗааСЬУОРОеЗЬЕЬЗСААЗОРТГЗбУНМЗНУЕОАРаКОЬЕИУЗУХЗЗОЗЗЗТУУАПЗУКаЕРПЗЕОЫЗККТЬУЬ ОМКЗЬЕАЕРТАУГГСАЕНаЮРПННаДОТЬУТУЗЗАЗТКбРЗУРРЬАРЗЗКЗТЗЙСТААЬаСЬУКИУГРЕРУТУЗНКЗаАЬ ТЗОУНТРРАУЬОЗЗОЬУЗЬЗЗУУТУРЗЗЗЬОТОТУТСКУМНКРЗИТКУОККУЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕЬЬОСРбУРЬРР РКРКОТЬМТЗЕТРЕУТСУУУПУЗНЕОРЕУКРЫЙУУОаУЕУНЫАКТКРКЕЕОУЫЗТУЕУУЗУЬТУЬНаОИШакЕУКСКУЗИ КАЪРАРIЕКТ ХЗКАКООРКЕРОУУТЬРРЗЕЕЕМТКМОУЗЬТСЬУКеЕУРЗОТ АУЕЙЕ 3Ν0Ο Ρ ΕΝΗΪΚΤΤΡ РУЬОЗ 003 ЕРО УЗКЬТУПКЗКНООСНУРЗСдУМНЕАЪНИНУТОКЗЬЗЬЗРОК
НС (оптимизированная) 4946=5145 нуклеотидов 8Е0 ГО ΝΟ: 103
САОСТССАССТССТСОАОАСССОСООАСОАСТСеТССАОССТаесаОСАСССТЕАаАСТОАССТОТОССаССАОС
О0СТТСАаСТТСААСААСТАСО0САТОАССТб0ОТ0А00СА60ССССТ0ОСААС0ОССТООАОТОО0ТОТССаОС АТСАбСОССАССООСАССТАСАССТАСТАСОСССАСАОСОТбААОООСАОСТТСАССАТСАаСССОСАСААСАвС ААОААСАСССТОТАССТССАОАТСААСАаССТОАОАОССбАСаАСАСССССатаТАСТАСТбТОССССЙАССАТС тАСАта<ЗАСТАСтааа<зссА(зоасАссстс(зтсАСС<зтстсстсАОССтссАССААасасссАТс<30тсттсссс стеосАссстсстссААаАССАССтстасаассАСАСсабссстооастасстсотсААааАСТАСттсссссАА ссйотоАсоотстсатаадАстсАсасассстоАССАОсеосотосАСАСсттсссаастатсстАСАОтсстсА <ЗСАСТСТАСТСССТСА<ЗСАССаТССТаАССаТ<ЗСССТССА<ЗСА<ЗСТТа0(ЗСАСССА<ЗАССТАСАТСТаСААС(ЗТС ААТСАСАА0СССАССААСАССААаОТааАСАА0А0А0ТТаАаСССАААТСТТ0Т0АСААААСТСАСАСАТ0СССА ссатаессАасАсстаААСтсстаасасаАссатсАотсттсстсттссссссААААСССААОСАСАСсстсАта АТСТСССаеАССССТ0А<30ТСАСАТСС0Т00Т0атааАСОТ0А6ССАС0АА0АСССТОА00ТСАА0ТТСААСТ00 ТАС0Т0аАСа0СатаСАв0ТССАТААТ0ССАА0АСААА0СС<ЗС000АааА0САеТАСААСА0САСаТАССатата ЙТСАаССТССТСАССОТССТЙСАССАЙйАСТЙЙСТЙААТбЙСААОСАЙТАСААОТССААЙЙТСТССААСАААЙСС СТСССАССССССАТС0А0ААААССАТСТССААА0ССААА0ааСАдСССС<ЗА0ААССАСА0ОТ0ТАСАСССТаССС ССАТСССС00АОаАСАТСАССАА0ААССАаОТСА0ССТаАССТСССТОСТСААА0ССТТСТАТСССА0С0АСАТС ЙССЕТааАйтааСАСАЙСААТаСвСАасСааАСААСААСТАСААаАССАССССТССССТССтаСАСТССОАСЙЙС тссттеттсстстАТАасААастсАссстасАСААйАасАаатаоСАссАсеаалАсатсттстсАтсстссстс АТаСАТ0АаССТСТССАСААССАСТАСАСаСА0ААаАаССТСТСССТаТССССаСОТАААТаА
НС4946=5145 (ВН0898/901) полипептид 8Е0 ΙϋΝΟ: 117
ОУаьУЁЗаС0ЬУОРаСЗЬКЬЗСАА30РТПШ¥СМТИУЁОАРеК0ЬЕИУЗС113а303УТУУАЕЗУКейРТ15ЕП№КНТЬ¥Ь ОМЫЗЬЙАЕПТАУУУСАЕТТУМОУНОДОТЬУТУЗЗАЗТКСРЗУРРЬАРЗЗКЗТЗССТААГХЗСЬУКПУРРЕРУТУЗНМЗаАЬТ ЗаУНТРРАУЬОЗЗОЬ¥ЗЬ.ЗЗУУТУ₽388ЬаТОТУ1СМ™НКРЗМТКУСККУЕРКЗСПКТНТСРРСРАРЕЪЬО0РЗУГЕРРР кРКОТОМХЯЕТРЕУТСУУУОУЗНЕОРЕУКРНИУУООУЕУННАКТКРЁЁЕОУНЗТУЕУУЗУОТУОНООНигаКЕУКСКУЗйК АЬРАР1ЕКТ13КАК0ОРЕЕРОУ¥ТЬРР5ЕЕЕМТК№УЗЬТСЬУК0РУР8О1АУНИЕЗЫ6ОРЕ№1УКТТ₽РУЬОЗО03РУЬУ 3 КЬТУОКЗЙНОООНУРеСЗУМНЕАЬНННУТОКЗЬЗЬЗ РОК
- 69 015538
Таблица 13Б
Последовательности легких (ЬС) и тяжелых (НС) цепей - родительские
ЬС (родительская) 4910 нуклеотидов 8ЕС ΙΒ ΝΟ: 104
САТАГСаСССТСАСССАаССССССАСССТСТСССССАаСССТССССАСАССАТСАССАТСАССТСТАСССССАССАССАаС САТСТСССССССТТСААСТАССТСТССТССТАТСАССАССАСССССССААСССССССААССТСАТСАТССАССАССССАСС ААТАОАСССАбСаЗСатОТССААТАОАТТСАаССаСАССААОАСССССААСАССаССАСССТСАССАТСАССаСССТОСАС ССТСАССАССА<ЗССС<ЗАСТАСТАСТ(ЗССА(ЗАССТССаАТСТСАСССССАТСАССССССТСТТТС(ЗСССССаААСАААССТТ АссстсстАсотсАесссААасстсссссстссотсАстстсттсссессстсстсталсзсАосттсААассААСААаесс АСАСтастетотстсАТААетОАст,гстАСсс<зааАассо'Г0АСА<зте<зссто<ЗАА(засАОАТАааАОСссс<зтаАА<зсоа аСАОТеОАОАСААССАСАСССТССАААСАААОСААСААСААОТАСССООССАОСАССТАТСТСЗАОССТОАСасС'ГаАбСАв Т<ЗаААСТСССАСАСААССТАСАЙСТСССА133ТСАСССАТаААаааАССАССатс5СААААйАСАСЗтазССССТАСА13ААТаТ ТСАТАС
ЬС (родительская) 4945 8Е0 ГО N0:105 ” вАТАТСССССТаАСССАОССССССАСССТеТСССЙСАаСССтеСССАОАССАТСаССАТСАеСтеТАССООСАССАССАаС аАССТС(?ЗС<ЗССТАСААСТАССТ0ТССТССТАТСАаСАаСАСССССССААСССССССААССТаАТ(ЗАТСТАССАССТ<ЗААС ААСАСАССТАССССССТаТССААСАСАТТСАССаССАаСААСАСССССААСАССасСАСССТСАССАТСТСТОСССТССАС ССТСАССАСаАСасССАСТАСТАСТСССАСАССТАССАССАСАТСААССТСТССССССТСТТТСССССССвААСАААССТТ АС ССТССТАССТСАС СССААСССТССССССТСССТСАСТСТСТТСССССССТССТСТСАСаАССТТСААСССААСААСССС АСАСТС<УГ0тстстсАТАА13тоАСттстАССсаасАССсаТОАСАотессстс<ЗААШСАаАТАССА<зссссстСААСССс СаАСТСаАСАСААССАСА.СССТССАААСАААССААСААСААСТАСССССССАССАССТАТСТСАСССТаАССССТСАССАС Т0ОААОТСССАСА(ЗААесТАСАвСТОССАа<ЗТСАС(ЗСАТОААб(ЗаАаСАССЕТ<ЗаААААОАСА0ТО0ССССТАСАаААТОТ ТСАТАС
ЬС (родительская) 4946 нуклеотидов 8Е0 ГО N0: 106
САСАТССТаСТСАСССАСАССССССССАСССТСАаССТаАССССТСаССАСАСАСССАСССТСТСТТСТАСССССАСССАа ААССТСТТСАССССТТАССТССССТССТАТСАССАСААССССССССАСССССССАСАСТССТСАТСТАСССССССАССААС АСАСССАССССССТ0ССС0ССАСАТТСА0ССССАаССССТСССССАСССАСТТСАСССТСАССАТСА|ЗСАСССТССАаССТ САОСАТТТССССатСТАСТАСТСССАаСАСТАССТОАСССТСССССТСАССТТСБСССАСаССАССААССТССАСАТСААА ОТААСТСТСССТССАССАТСТбТСТТСАТСТТСССеССАТСТСАтаАССАСТТСАААТСТССААСТСССТСтатТСТСТСС СТССТСААТААСТТСТАТСССА<ЗАСАССССАААСТАСАСТССААССТССАТААСССССТССААТСС<ЗСТААСТСССАССАС АСТСТСАСДСАССАССАСАССААССАСАаСАССТАСАСССТСАССАССАСССТСАСССТаАССАААССАСАСТАСОАаААА САСАААСТСТАССССТСССААСТСАСССАТСАСССССТС5АССТССССССТСАСАААаАССТТСААСАСССаАСАСТСТТАС
ЬС (родительская) 5145 нуклеотидов 8Εζ> Ιϋ ΝΟ: 107
6АСАТССТССТСАСССАСАССССС(ЗССАСССТ6АСССТаАССССТСЗСС;йА(5АСССАССеГаТСТТСТА(Э<ЗССаАаСаАа ААССТСТТСАССССТТАССТССССТСКЗТАТСАССАСААаСССССССАСЮСССССАаАСТССТСАТСТАСаЗССССАаСААС АСАСССАССаСССтеССССССАСАТТСАСССССАСсгаССТСССССАССОАСТТСАСССТСАССАТСАССАСССТССАСССТ САССАТТТСССССтаТАСТАСТСССАССАСТАСАТСАСССтаССТСТСАССТТСССССАСаССАССААШТССАСАТСААА СаААСТСТСаСТССАССАТСТСТСТТСАТСТТССССССАТСТСАТСАССАаТТСАААТСТССААСТСССТСТСТТаТСТСС СТССТСААТААСТТСТАТСССАСАСА/ЗСССАААСТАСАСТССААССТССАТААСССССТССААТССССТААСТСССАССАС АСТСТСАСА<ЗАССАССАСАаСААСаАСА<ЗСАССТАСАаССТСАССА(ЗСАСССТ<ЗАСССТСАССАААССАСАСТАССАСААА САСАААСТСТАССССТаССААСТСАСССАТСАСССССТСАССТССССССТСАСАААСАССТТСААСАССССАСАСТСТТАа НС (родительская) 4910 нуклеотидов 8Е() ГО ΝΟ: 108
САСССССАССТССАССТССТССАСАСССССССАССАСТССТССАСССТССССССАСССТСАёАСТаАССТСТССССССАСС
- 70 015538
БССТТСАССТТСАаСАБСТАСТБСАТСАаСТСаОТСАаОСАБСССССТБССААООаССТЙБАСТСОБТСТССБОСАТСАБС
ТАСАОСББСАБСААТАССаАСТАСБССОАСАОСОТБААББвСАББТТСАССАТСАБССБбаАСААСАБСААСААСАСССте ТАССТБСАОАТБААСАОССТСАБАбССОАОБАСАССОССатОТАСТАСТСТОСССОБАТБОБСАТСОАССТабАТТАСТОБ СБ ССАБОССАСССТББТСАССБТСТ ССТСАБССТССАССААбБЕСССАТСББТСТТСССССТСССАСССТССТССААСАБС АССТСТвББ6БСАСАБС66СССТБааСТБССТББТСААБСАСТАСТТСССС6ААССББТСАС6СТОТСБТБОААСТСАББС БСССТБАССАБСОБСвТОСАСАССТТСССБОСТаТССТАСАБТССТСАББАСТСТАСТСССТСАаСАОСБТССТОАССОТО СССТССАССАССТТССССАСССАОАССГАСАТСТаСААСйТБААТСАСААБСССАвСААСАССААББТОБАСААвАБАБТТ САБСССАААТСТТаТСАСААААСТСАСАСАТССССАСССТасССАЙСАССТСААСТССТСОСОББАСССТСАБТСТТССТС ТТССССССААЛАСССААБСАСАСССТСАТБАТСТСССБСАССССТБАБаТСАСАТБСБТССТСБТавАССТБАБССАСХЗАА БАСССТОАвОТСААбТТСААСТББТАСБТББАСББСаТББАББТБСАТААТБССААБАСАААБССаСББаАСБАвСАБТАС ААСАОСАСОТАССОТОТБСТСАБСБТССТСАССБТССТЙСАССАБОАСТББСТБААТСБСААвБАБТАСААБТБСААСБТС ТССААСАААССССТСССАССССССАТСБАСААААССАТСТССАААСССАААБаБСАвССССБАБААССАСАБбТБТАСАСС СТЗСССССАТСССБСОАЙЙАЙАТБАССААБААССАЙЙТСАЙССТБАССТБССТааТСАААОБСТТСТАТСССАйСЙАСАТС 6ССБТБаАОТББвАБАО<^ТБСвСАОССО<^БАА<^СТАСААБАСаАС<Х!СТСССат<ЗСТБОАСТССОАС®ЭСТССТТС ТТССТСТАТАаСААССТСАССаТаБАСААБАБСАбатаССАССАСББСААСБТСТТСТСАТБСТСССТСАТБСАТОАББСТ СТаСАСААССАСТАСАСБСАСААБАБССТСТСССТБТССССБСЕТАААТБА
НС (родительская) 4945 нуклеотидов 8Е<3 ГО N0: 109
САБССССАСОТБСАССТССТБОАБАСССБСССАаОАСТОБТаСАаССТОБСаОСАаССТаАБАСТаАБСТвТССССССАСС БОСТТСАССТТСАОСАОСТАСТБвАТСАОСТОаОТБАОБСАваССССТБССААаасССТСБАБТСЮаТСТССаТБАТСАСС АаСБАТАБСАБСАБСАССТАСТАСвССБАТАвСБТаААБББСССБТТСАССАТСАаССБББАСААСАОСААБААСАСССТБ ТАССТОСАОАТаААСАОССТБАОАаССаАаЗАСАССОССОТвТАСТАСТБТбССАаССАСОБСАТСБАСТТСБАССАСТОО ааССАСББСАСССТССТСАССаТСТССТСАБССТССАССААОСССССАТСаЗТСТТСССССТаОСАСССТССТССААОАБС АССТСТССБОаСАСАБСааСССТСввСТаССТвБТСААББАСТАСТТССССБААССаСТБАССОТСТСБТБСААСТСАБСС БСССТСАССАБСБССБТБСАСАССТТСССББСТБТССТАСАСТССТСАБСАСТСТАСТСССТСАССАаСБТСБТБАССБТБ СССТССАБСАвСТТОББСАСССАБАССТАСАТСТаСААСаТСААТСАСААБСССАБСААСАССААББТБвАСААБАаАатТ БАОСССАААТСТТБТБАСААААСТСАСАСАТЙСССАССБТБСССАБСАССТеААСТССТББОБССАССБТСАОТСТГССТС ТТССССССААААСССААБаАСАСССТСАТаАТСТСССООАССССТОАЗБТСАСАТБСБТБОТССТ&ЗАСБТСАОССАССАА БАСССТБАББТСААБТТСААСТББТАСБТББАСББСБТСЮАбБТБСАТААТБССААОАСАААаССБСБвБАБвАБСАаТАС ААСАБСАСОТАССБТБТБОТСАБСбТССТСАССБТССТБаАССАБСАСТББСТеААТаОСААББАБТАСААБТБСААбОТС ТССААСАААБСССТСССАОСССССАТСОАСААААССАТСТССАААБССАААССБСАОССССаАБААССАСАББТаТАСАСС СТЙСССССАТСССБББАБЙАБАТЙАССААБААССАББТСАБССТБАССТЙССТБОТСАААББСТТСТАТСССАОСС|АСАТС СССБТБОАСТОСОАБАБСААТвСБСАвССХЗаАБААСААСТАСААБАССАСбССТССССТОСТБСАСТССаАСБОСТССТТС ТТССТСТАТАаСААБСТСАСССТСаАСААБАБСАБСТСОСАаСАСваБААСБТСТТСТСАТБСТССБТСАТССАТБАСБСТ СТБСАСААССАСТАаАСаСАБААОАБССТСТСССТБТССССаЗОТАААТСА
НС (родительская) 4946=5145 нуклеотидов 8Ер ГО N0: 110
САЙСТЙСААТТЙЙТЙСАААЙСЙБСЙЙСайССТБбТЙСААССЙйасйССАБССТВСОТСТЙАССТЙСБСйаССТССЙЙАТТТ АССТТТААТААТТАТББТАТБАСТТБСЮТОСБССААБССССТааСААаССТСТСБАаТаЗБТБАаССБТАТСТСТаЗТТСТ БСТАаСТАТАССТАТТАТОСБаАТАССБТБАААаССССТТТТАССАТТТСАСОТОАТААТТСБАААААСАСССТБТАТСТБ САААТБААСАОССТаССТБСБаААБАТАСБвССБТБТАТТАТТасССаСБТАСТАТТТАТАТБСАТТАТТаасОССААааС АСССТООТСАССБТСТССТСАБССТССАССААББвСССАТССЮТСТТСССССтеОСАССеГССТССААБАОСАССТСТааБ ОаСАСАОССССССТССССТБССТСЕТСААББАСТАСТТССССОААССББТОАСССТОТСаТаБААСТСАСССССССТСАСС АЗСаБССТаСАСАССТТСССБОСТБТССТАСАОТССТСАББАСТСТАСТСССТСАССАБСаТССТБАССБТБСССТССАСС АБСТТОББСАСССАСАССТАСАТСТССААСатСААТСАСААаСССАБСААСАССААББТББАСААБАБАБТТБАОСССААА ТСТТСТБАСААААСТСАСАСАТССССАССОТССССАБСАССТСААСТССТБСаССБАССБТСАОТСТТССТСТТССССССА АААСССААСОАСАСССТСАТБАТСТССССОАССССТОАСЮТСАСАТОСаТСБТООТСБАСБТСАвССАСБААаАСССТОАБ БТСААвТТСААСТББТАСвТаОАСББСБТБаАбСТвСАТААТбССААБАСАААаССБСОБСАССАеСАБТАСААСАБСАСБ ТАСаЗТОТБОТСАОСвТССТСАССОТССТаСАССАБвАСТОССТБААТааСААаБАБТАСААОТаСААОСТСТССААСААА аСССТСССАйСССССАТСОАСААААССАТСТССАААаССАААБЙйСАЙССССЙАЙААССАСАССТБТАСАСССТССССССА ТСССаваАББАБАТаАССААБААССАББТСАаССТБАССТБССТББТСАААББСТТСТАТСССАБСаАСАТСБССБТвБАО ТСЙБАБАОСААТОБаСАаССбБАБААСААСТАСААБАССАСОССТССССТОСТБЗАСТССОАаЗОСТССТТСТТССТСТАТ АБСААБСТСАССБТББАСААБАБСАСБТББСАБСАБСКЮААСБТСТТСТСАТБСТССБТБАТБСАТаАСБСТСТССАСААС САСТАСАСгаСАБААБАСССТСТСССТОТССССбОБТАЛАТСА
Пример 9. Анализы биологической активности.
Биологическую активность нейтрализующего антитела к ΌΚΚ1/4 оценивают с помощью анализа репортерного гена с использованием генетически модифицированной клеточной линии НЕΚ293 Т/17 8ΤЕ_70IЯЕ8_Κ^т_(17), обозначенной как 8ирегТорПа511 1<гт17. Эту клеточную линию выводят из клеток почки человеческого эмбриона НЕΚ293 и стабильно трансфектируют: Ι) репортерной конструкцией, в которой промотор ТСЕ сливают против хода транскрипции с геном люциферазы светляка, и ΙΙ) конструкцией, обеспечивающей сверхэкспрессию Κηη на поверхности этих клеток. Обработка белком νηΐ
- 71 015538 этой клеточной линии стимулирует экспрессию люциферазы в зависимости от дозы. Добавление определенных количеств антитела к ΌΚΚ1/4 к фиксированной субмаксимальной дозе ΌΚΚ1 в присутствии νπΐ вызывает повышение экспрессии люциферазы при инкубации в течение 16 ч. В конце этого периода оценивают количество люциферазы, определяя ферментативную активность в клеточном лизате. Люцифераза катализирует превращение субстрата люциферина в оксилюциферин, хемилюминесцентный продукт. Затем полученное в результате этого хемилюминесцентное свечение определяют с помощью соответствующего люминометра.
Биологическую активность нейтрализующего антитела к ΌΚΚ1/4 в изучаемом образце определяют, сравнивая его способность повышать экспрессию люциферазы относительно используемого для сравнения стандарта. Данные, полученные для образцов и для стандарта, стандартизуют на основе содержания белка. Затем рассчитывают относительную активность с помощью параллельного анализа согласно Еигореап Рйагтасо-рое1а1. Конечный результат выражают в виде относительной активности (в процентах) образца по сравнению с используемым для сравнения стандартом.
Пример 10. Активность ш νίΙΐΌ в отношении соответствующих биологических мишеней.
Отбирают наиболее перспективные ЕаЬ-фрагменты, которые обладают аффинностью в нижнем наномолярном диапазоне и высокой активностью по данным клеточного анализа. Физиологическими партнерами, с которыми связывается ΌΚΚ1, являются ЬКР5/6 (Юй~340 пМ) и 1<гетеп 1 и 2 «-280 пМ) (Мао, 2001; Мао, 2002). С учетом указанных характеризующихся высокой аффинностью взаимодействий для успешной конкуренции с физиологическими партнерами по взаимодействию с ΌΚΚ1 требуется дальнейшее повышение аффинности. Для повышения аффинности и биологической активности отобранных ЕаЬ-фрагментов СОЕ-Ь3- и СПК-Н2-участки оптимизируют параллельно с помощью кассетного мутагенеза на основе сайт-направленного мутагенеза с использованием тринуклеотидов (Уннекак, 1994; ^арр1к, 2000; 2002).
После осуществления процедуры созревания аффинности выбирают ЕаЬ-фрагмент, который обладает аффинностью в нижнем пикомолярном диапазоне, способностью к реактивации ингибируемого ΌΚΚ1 передачи сигнала νιΝ, которая характеризуется значением ЕС50 ниже 1 нМ, и перекрестной реактивностью к ΌΚΚ1 яванского макака, мыши и крысы. Затем конструируют вариабельные области этого ЕаЬ-фрагмента в двух различных каркасах человеческого Ι§61.
Антитело к ΌΚΚ1/4 обладает высокой аффинностью к человеческому ΌΚΚ1 (2 пМ), при этом кинетические характеристики связывания типичны для антитела с такой аффинностью (см. фиг. 6).
Фиг. 6. Методы. Аффинность к связыванию и кинетические характеристики наиболее перспективных кандидатов и 1Ί1ΌΚΚ1 (рекомбинантный человеческий ΌΚΚ1) (партия ВТР7757) оценивают с помощью резонанса поверхностного плазмона с помощью устройства В1асоге Т100 (фирма В1асоге, Уппсала, Швеция), снабженного сенсорным чипом СМ5 (Б) (каталожный номер ВК-1006-68). Антитело к человеческому Ес-фрагменту ΙβΟ1 (фирма 1асккоп [ттипо Кекеагсй, каталожный номер 109-006-098) иммобилизуют на каждой проточной ячейке с последующей иммобилизацией наиболее перспективного кандидата при ожидаемой иммобилизации, соответствующей примерно 100 КИ. И, наконец, шесть концентраций ΌΚΚ1 (от 0,195 до 6,25 нМ), взятых с дублированием, пропускают по поверхности чипа. Проточные ячейки активируют для связывания ΌΚΚ1 в течение 240 с и диссоциацию оценивают в течение 30 мин. Для стандартизованных данных (за вычетом фона) подбирают соответствующую модель массового транспорта для связывания 1:1 с использованием кинетического анализа с помощью программы ВМ е\га1иа1юп 1.0. Указанный эксперимент осуществляют в трех повторностях и данные представляют в виде среднего значения, полученного в трех экспериментах, со стандартным отклонением.
Пример 11. Картирование эпитопов.
Зрелый ΌΚΚ1 представляет собой состоящий из 266 аминокислот белок с двумя богатыми цистеином областями (Сук-1 и Сук-2). Сук-2-домен ответствен за связывание с белками и ЬКР и 1<гетеп и является необходимым и достаточным компонентом для ингибирования передачи сигнала νπΐ (Ь1, 2002; ВгоИ 2002). Эксперименты по иммунопреципитации (фиг. 7А, 7Б) демонстрируют, что антитело к ΌΚΚ1/4 связывается специфически с Сук-2-доменом, но не с Сук-1-доменом. Антитело к ΌΚΚ1/4 обладает лишь невысокой активностью при анализе методом Вестерн-блоттинга с денатурированным ΌΚΚ1, и в эксперименте по пептидному картированию не обнаружено специфическое связывание с любым из состоящим из 15 перекрывающихся аминокислот пептидом, которые перекрывают длину белка (ТГР), что позволяет предположить, что антитело к ΌΚΚ1/4, вероятно, распознает нелинейный эпитоп в Сук-2.
На фиг. 7А представлено схематическое изображение полноразмерного и укороченного ΌΚΚ1. Полноразмерный (ЕЬ, содержит остатки 1-266), укороченный на карбоксильном конце (ДС, содержит остатки 1-185) и укороченный на аминоконце (ΔΝ, содержит остатки 1-60 плюс остатки 157-266) сливают с НА-эпитопом на С-концах и клонируют в экспрессионном векторе млекопитающих под контролем промотора цитомегаловируса (СМУ).
На фиг. 7Б представлены результаты оценки связывания нейтрализующего антитела к ΌΚΚ1/4 и белков ΌΚΚ1. Кондиционированную среду подвергнутых кратковременной трансфекции клеток НЕ^93, экспрессирующих полноразмерные, укороченные на аминоконце, укороченные на карбоксиль
- 72 015538 ном конце белки ΌΚΚ1, инкубируют с контрольным ЦС1 к лизоциму или с антителами к ΌΚΚ1/4 в течение 2 ч при комнатной температуре, и иммунокомплексы собирают на гранулах с протеином С, разделяют с помощью ДСН-ПААГ, переносят и блоттируют с антителом к НА. 1/10 общей загрузки вносят в качестве контроля.
Пример 11. Картирование эпитопов - ^гликозилирование.
Ряд белков, находящихся в пути передачи сигнала \УпЕ можно ковалентно модифицировать с помощью посттрансляционных ферментов, которые регулируют их активность в клетках. Представителей семейства ΌΚΚ, включая ΌΚΚ1, модифицируют путем ^гликозилирования ^гиршк, 1999). ΌΚΚ1 имеет один теоретический ^связанный сайт гликозилирования на аминокислоте 256 в Сук-2-домене. С учетом высококонсервативной природы Сук-2-домена и наличия потенциального сайта связывания как ΌΚΚ1 с ЬЯР6, так и антитела к ΌΚΚ1/4 с ΌΚΚ1, при создании изобретения предпринята попытка определить, распознает ли антитело к ΌΚΚ1/4 ^гликозилированную форму ΌΚΚ1. Данные, полученные с помощью ЕШЗА, демонстрируют, что антитело к ΌΚΚ1/4 распознает ^гликозилированную форму ΓΗΌΚΚ1 лучше, чем специфическую ^связанную дегликозилированную форму ΓΗΌΚΚ1 (табл. 14А). Однако эти же белки одинаково хорошо распознаются вторичным антителом (к Ш8), мишенью которого является слитая с эпитопом метка рекомбинантного белка. Указанное различие в аффинности оценивают с помощью резонанса поверхностного плазмона и обнаружено, что антитело к ΌΚΚ1/4 обладает в 100 более высоким значением ΚΒ в отношении гликозилированного ΓΗΌΚΚ1, чем дегликозилированного белка (см. табл. 14Б).
Таблица 14А
Процент связывания - зависящее от гликозилирования связывание антитела к ΌΚΚ1/4 с ΌΚΚ1
Антитело ΏΚΚ1 VI' (дикого типа) ϋΚΚΙ (дегликозилированный)
антитело к Н18-метке 100% 100%
антитело к ϋΚΚΙ/4 100% 12-18%
Таблица 14Б
Данные, полученные с помощью резонанса поверхностного плазмона
Белок К,(1/Мс) Κ-ο (1/с) Ко (Μ)
χντ ПКК1 7,449Ε+6 2,319Ε-5 3,113Ε-12
ϋΚΚΙ (Ν-ϋΕΟΣΥ) 1.424Ε+6 3,071Ε-4 2Д57Е-10
Связывание антитела к ΌΚΚ1/4 с ΓΗΌΚΚ1 дикого типа (^Т) (меченый эпитоп НЕИ Ш8, партия № ВТР7757) и N-дегликозилированным ^-ПЕСКУ, N-дигликозилированный с помощью фермента РNСазы Е (фирма 81дта, каталожный номер Е-ЭЕСЬУ) ΓΗΌΚΚ1 оценивают с помощью ЕЫ8А. В целом метод состоит в следующем: планшет для высокоэффективного связывания ЕЫ8А (фирма Nиπс, № 442404) сенсибилизируют 1 мкг/мл \¥Т или Н-ОЕСЕ-У ΌΚΚ1. Определяют соотношение связывания как антитела к ΌΚΚ1/4, так и антитела к Ш8 с \¥Т ΌΚΚ1 по сравнению с соответствующим связыванием Е-ОЕСБУ. Этот эксперимент осуществляют с использованием трех различных концентраций (показаны данные для одной репрезентативной концентрации), при использовании всех концентраций получены аналогичные результаты.
Аффинность к связыванию и кинетические характеристики антитела к ΌΚΚ1/4 как с ^Т, так и с N ОЕСБУ ΌΚΚ1 (№Κ293, партия № ВТР7757) оценивают с помощью В1асоге Т100. Антитело к ΌΚΚ1/4 во всех вариантах обладает в 100 более низкой аффинность к К-ОЕСЕ-У ΌΚΚ1, чем к \АТ ΌΚΚ1.
Пример 12. Процент идентичности представителей семейства ΌΚΚ.
Семейство человеческих белков ЭюккорГ состоит из четырех парологов (см. табл. 15), три из которых (ΌΚΚ1, 2 и 4) связываются с белками ЬЯР6 и Шетей индуцируют интернализацию ЯЯР5/6 и ингибируют каноническую передачу сигнала \¥п1 (Мао, 2001; Мао, 2003). ΌΚΚ2 синергизирует также сверхэкспрессию ЬЯР6, усиливая передачу сигнала \УпЕ однако коэкспрессия ЬЯР6 и 1<гетеп2 восстанавливает способность ΌΚΚ2 ингибировать путь передачи сигнала (Мао, 2003). Таким образом, ΌΚΚ2 может обладать как агонистическим, так и антагонистическим действием в зависимости от особенностей клеточного окружения. ΌΚΚ3 является менее консервативным представителем семейства, в том числе касательно Сук-2-домена, ответственного за взаимодействие с БЯР5/6 и Шетей и отличается от других представителей семейства ΌΚΚ тем, что он не связывается с ЬЯР или белками 1<гетеп и не блокирует передачу сигнала \¥п1 (Мао, 2001; Мао, 2003).
- 73 015538
Таблица 15
Процент идентичности представителей семейства ИКК на уровне полного белка и Сук-2-доменов
Полный белок ΟΚΚ2 ЭККЗ ΟΚΚ4
ОКК1 38,7 15,5 32,5
ЦКК.2 - 13,4 34,6
ϋΚΚ3 - 15,1
Суз-2-домен ΏΚΚ.2 ΟΚΚ3 ϋΚΚ4
ϋΚΚΙ 69,3 23,0 56,6
ϋΚΚ.2 - 24,1 54,7
ϋΚΚ3 - - 20,8
Гомологию представителей семейства ИКК оценивают (УесЮг ΝΊΊ Лйуапсей 9.1.0) с использованием алгоритма ЛИдпХ для парного сравнительного анализа первичной структуры последовательностей с позиций количества идентичных аминокислот. Применяют штраф за открытие бреши и удлинения бреши 10 и 0,1 соответственно. Эта оценка включает сравнение полных белков, а также сравнение только Сук-2-доменов. Как видно из представленной выше таблицы, на уровне полного белка гомология аминокислотных последовательностей ИКК1, 2 и 4 составляет 30-40%. При сравнении только Сук-2-доменов установлено, что ИКК1 и 2 гомологичны на 69% в пределах указанной области, а домен ИКК4 идентичен примерно на 57% аналогичному домену ИКК1 и 2. Для ИКК3 обнаружен самый низкий уровень гомологии по сравнению с другими представителями семейства. Для всех представителей наибольшая гомология выявлена для Сук-2-домена.
Пример 13. Аффинность антитела к ИКК1/4 к представителям семейства человеческих ИКК.
Помимо способности связываться с ИКК1, антитело к ИКК1/4 связывается также с ИКК4 (см. табл. 16). Хотя его аффинность к ИКК4 примерно в 100 ниже, чем к ИКК1, она сохраняется на субнаномолярном уровне, и поэтому, вероятно, может иметь биологическое и клиническое значение. Следует отметить, что ни в ИКК2, ни в ИКК4 не сохраняется остаток аспарагина, который, вероятно, является мишенью для гликозилирования Сук-2-домена ИКК1. Предварительные эксперименты с использованием иммунопреципитации позволяют предположить, что антитело к ИКК1/4 не обладает способностью к специфическому связыванию с ИКК2. Аффинность к связыванию антитела к ИКК1/4 с ИКК2 можно оценить после успешной очистки ИКК2. Антитело к ИКК1/4 не связывается с ИКК3, что согласуется с данными об отличной от других представителей семейства функции и способности к связыванию ИКК3.
Таблица 16
Аффинность к связыванию антитела к ИКК1/4 с представителями семейства человеческого ИКК
Представитель семейства ϋΚΚ Ко
ϋΚΚΙ 2,0х 1О‘|2М (±0,7)
ΏΚΚ.2 н.о.
ΟΚ.Κ3 Ν8Β
ϋΚΚ.4 2,97* 1Ο'ιυΜ(±1,5)
Аффинность к связыванию и кинетические характеристики антитела к ИКК1/4 в отношении других представителей семейства человеческих белков ЭК К оценивают с помощью В1асоге Т100. Как описано выше, эксперименты с использованием белков, обладающих выраженной способностью связываться с антителом к ИКК1/4, осуществляют в трех повторностях и выражают в виде среднего значения для трех экспериментов со стандартным отклонением. Связывание ИКК3, обладающего наименьшей гомологией представителя семейства, не выявляется на уровне, превышающем фоновый, и поэтому его относят к Ν8Ε (отсутствие выраженного связывания). Аналогично этому полученные при создании изобретения данные позволяют предположить, что антитело к ИКК1/4, предлагаемое в изобретении, не обладает выраженной способностью к связыванию с ИКК2.
Пример 14. Антитело к ИКК1/4 блокирует связывание ИКК1 с ЬКР6.
ИКК1 опосредует антагонистическую активность в отношении νΐ'ΐΐ посредством взаимодействия с ЕКР5/6 и Кгетеп, включая интернализацию и блокаду ν^, индуцированную взаимодействием ЬКР5/6 с Ρ^^ζζ1еά-рецепторами. Антитело к ИКК1/4 конкурентно ингибирует связывание ИКК1 с ЬКР6, что установлено с помощью конкурентного анализа ЕЬЬЗЛ (фиг. 8).
Клетки НЕК293Т не экспрессируют достаточные уровни эндогенного ЬКР5 или 6, которые позволяли ли бы визуализировать связывание ИКК1. Однако после совместной трансфекции ЬКР6 с поверхностным обеспечивающим направленную миграцию белком-компаньоном МЕ8И меченный с помощью СРР (зеленый флуоресцентный протеин) ИКК1 можно выявлять на поверхности клетки, что свидетельствует о специфической природе взаимодействия ПКК1/ЬКР6. Клон ΜΟ^4910, несущий такие же вариабельные области, что и антитело к ЭКК1/4, специфически блокирует указанное взаимодействие.
Способность антитела к ЭКК1/4 ингибировать непосредственное связывание ЭКК1 с ЬКР6 оценивают с помощью ЕЫ8Л. В целом метод состоит в следующем: необработанные планшеты (фирма Р18Йег, каталожный номер 12565501) сенсибилизируют 1 мкг/мл рекомбинантного ЬКР6 (фирма К&Э Зу^епта каталожный номер 1505-ЬК), затем 500 нг/мл гкЭКК1 и серию концентраций либо антитела к ЭКК1/4, либо ЫдС1 (антитело к лизоциму ΜΟ^207, ЛСЕ 10915) предварительно инкубируют на льду в течение 30 мин, после чего их помещают в сенсибилизированные ЬКР6 планшеты на 2 ч. Планшеты отмывают и определяют уровень связывания ЭКК1 с антителом к ЭКК1 (фирма К&Э 8у51ет5 ЛР1096). Представле
- 74 015538 ны примерные значения ОП (за вычетом фона). Возрастающие концентрации антитела к ΌΚΚ1/4 ингибируют непосредственное связывание ΌΚΚ1 с ЬКР6 в зависимости от дозы, а возрастающие концентрации ЫдС1 не блокируют связывание ΌΚΚ1 с ЬКР6.
Способность М0К04910 ингибировать 01<1<1/ЬКР6-связывание на клеточной поверхности оценивают с помощью флуоресцентного микроскопа. Клетки НЕЕ293Т трансфектируют либо имитатором, либо подвергают кратковременной трансфекции плазмидами, кодирующими ЬКР6 и МЕБЭ. Клетки инкубируют с кондиционированной средой ЭЕЮ-СЕР в сочетании с ЕАЬ антитела к лизоциму или ЕаЬ антитела к ΌΚΚ1 М0К04910 в течение 1 ч при 37°С и оценивают с помощью флуоресцентного микроскопа. Флуоресценция СЕР отражает связывание ЭЕЮ-СЕР со сверхэкспрессированным ЬКР6 на плазматической мембране. Антитело к ΌΚΚ1/4 блокирует взаимодействие ΌΚΚ1 с ЬКР6 на клеточной поверхности.
Пример 14. Репортерные анализы - реактивация блокированной ΌΚΚ1 транскрипции гена ТСЕ/ЬЕЕ.
Кульминацией канонического пути передачи сигнала Χνΐ'ΐΙ является транслокация бета-катенина в ядре, где происходи его ассоциация с факторами транскрипции семейства ТСЕ/ЬЕЕ, что приводит к повышенному уровню транскрипции чувствительных к \νπΙ генов. Проводят репортерный анализ с использованием чувствительного к ТСЕ/ЬЕЕ промотора, обеспечивающего транскрипцию гена люциферазы, что облегчает выявление модуляции Χνΐ'ΐΙ-пути. ΌΚΚ1 эффективно блокирует активность люциферазы, индуцированную в этом анализе кондиционированной средой \νΐ'ΐΐ3Λ (СМ). Антитело к ΌΚΚ1/4 реактивирует подавленную ΌΚΚ1 передачу сигнала \νΐ'ΐΕ что характеризуется значением ЕС50 0,16 нМ (фиг. 9). Поскольку для проведения указанного анализа требуется примерно 1 нМ ΌΚΚ1 для полного подавления, а аффинность антитела составляет 2 пМ, вероятно указанное значение ЕС50 отражает чувствительность анализа и относительные количества каждого белка, а не абсолютный предел конкуренции антитела к ΏΚΚ1/4.
Клетки линии 293Т, стабильно трансфектированные репортером БирегТорйакЬ и <гетеп, обрабатывают 10 нг/мл гНЬЕЕЬ 50% кондиционированной среды ^п(3а и различными количествами антитела к ΌΚΚ1/4. Через 18 ч люциферазную активность оценивают с помощью набора для анализа люциферазы Вг1дЫ-С1о (фирма Рготеда).
Пример 15. Репортерные анализы - аннулирование блокированной ΌΚΚ1 секреции щелочной фосфатазы в напоминающих преостеобласты клетках.
Для решения вопроса о том, блокирует ли антитело к ΌΚΚ1/4 функции ΌΚΚ1 в других имеющих физиологическое значение условиях, проводят анализ ΐπ νίΙΐΌ для оценки опросредуемой \νπΙ дифференцировки остеобластов мультипотентной мышиной линии клеток С3Н10Т1/2 (10Т1/2) (см. фиг. 10). При дифференцировке в остеобласты 10Т1/2-клетки секретируют щелочную фосфатазу (АР), этот процесс может ингибироваться ΌΚΚ1. Антитело к ΌΚΚ1/4 в отличие от ЦС-контроля блокирует подавление ΌΚΚ1 дифференцировки 10Т1/2 в присутствии кондиционированной среды ^п!3а.
Известно, что Χνΐ'ΐΙ индуцирует пролиферацию и ингибирует апоптоз в клетках в различных ситуациях, и активация ^п!-пути, что продемонстрировано по стабилизации или ядерной локализации бетакатенина, часто ассоциирована с развитием опухолей. Кроме того, понижающая регуляция ΌΚΚ1 при некоторых формах рака (например, карцинома и меланома ободочной кишки (Сопга^-Бапсйо, 2005; ЕирНаЕ 2006)) привела некоторых исследователей к предположению, что ΌΚΚ1 может быть супрессором опухоли при некоторых формах рака. Для решения вопроса о способности ΌΚΚ1 оказывать воздействие на пролиферацию или выживание опухоли, линии опухолевых клеток обрабатывают антителом к ΌΚΚ1/4 и анализируют изменение их роста. Антитело к ΌΚΚ1/4 не оказывает существенного воздействия ни на одну из изученных линий опухолевых клеток.
Воздействие антитела к ΌΚΚ1/4 на выживание и пролиферацию нескольких линий раковых клеток оценивают ш νίΙΐΌ. В этом анализе антитело к ΌΚΚ1/4 (100 мкг/мл) инкубируют с линией опухолевых клеток, через 3 дня оценивают количество клеток, определяя уровень АТФ (фирма Рготеда, Се11 Тйег С1о Аккау®) в качестве меры количества метаболически активных клеток, с использованием линейной зависимости от количества клеток. Этот анализ осуществляют с использованием трех различных концентраций сыворотки (бессывороточная среда, минимальная среда для роста и полная среда для роста). Не обнаружено никаких существенных изменений по сравнению с необработанными и обработанными ЫдС1 клетками. В супернатантах клеточных линий анализируют экспрессию ΌΚΚ1 с помощью ЕЫБА.
Пример 16. Перекрестная реакция на другие виды и нейтрализация ΌΚΚ1.
Нейтрализующее антитело к ΌΚΚ1/4 отбирают не только с позиций высокой аффинности к человеческому ΌΚΚ1 и его нейтрализующей активности, но также на основе его перекрестной реакции на ΌΚΚ1 других видов, которые можно применять в опытах по оценке эффективности и безопасности. Антитело к ΌΚΚ1/4 дает перекрестную реакцию на ΌΚΚ1 мыши, крысы и яванского макака (супо, Масаса Раксюи1аг1к), при этом аффинность к указанным ΌΚΚ1 и человеческому ΌΚΚ1 является близкой (табл. 17). Кроме того, антитело к ΌΚΚ1/4 нейтрализует опосредуемую всеми четырьмя видами ΌΚΚ1 супрессорную активность в отношении \νΐ'ΐΙ (табл. 17), что позволяет предположить, что указанные виды можно применять в качестве моделей для оценки как безопасности, так и эффективности.
- 75 015538
Таблица 17
Перекрестная реакция на другие виды и нейтрализация ΌΚΚ1
Белок ϋΚΚΙ Кс [пМ] Реактивация ЧОйЗа (Т0РГ1аз11) ЕС5о (пМ)
человека 17 80,6
яванского макака 7 54,2
мыши 10 60,5
крысы 16 255
Аффинность к ΌΚΚ1 человека, яванского макака, мыши и крысы определяют с помощью уравновешивающего титрования раствора (8ЕТ) с использованием анализатора типа М-384 8ЕК.1Е8® (фирма ВюУеиз Еигоре). Для определения значения ΚΒ с помощью уравновешивающего титрования раствора (8ЕТ) мономерные фракции (содержание мономера по меньшей мере 90% при анализе с помощью аналитической гель-фильтрации (8ЕС); 8ирегбех75, фирма АтегзЬат Рйагтааа) используют белок 1дС. Определение аффинности на основе электролюминесценции (ЕСЬ) в растворе и обработку результатов осуществляют в целом согласно методу, описанному у Наепе1 и др., 2005, модель для аппроксимации связывания применяют в модификации, предложенной Р1еЬ1ег и др., 1997. Постоянное количество МОВ4910 1дС уравновешивают различными концентрациями (серийные трехкратные разведения) человеческого ΌΚΚ1 (исходная концентрация 4 нМ) в растворе. Добавляют биотинилированный человеческий ΌΚΚ1, сшитый с парамагнитными гранулами (стрептивидиновые гранулы типа М-280, фирма Оупа1), и меченное с помощью ВУ-!ад™ (фирма ВюУегщ Еигоре, Уитни, Оксфордшир, Великобритания) козье поликлональное антитело к человеческому Е(аЬ)'2 и инкубируют в течение 30 мин. Затем концентрацию несвязанного 1дС определяют с помощью ЕСЬ с использованием анализатора типа М-384 8ЕК1Е8® (фирма ВюУебз Еигоре). Определение аффинности к ΌΚΚ1 крысы, мыши и яванского макака осуществляют согласно описанному ранее методу, используя ΌΚΚ1 мыши, крысы и яванского макака в качестве анализируемого вещества в растворе вместо человеческого ΌΚΚ1. Для выявления свободных молекул 1дС используют биотинилированный человеческий ΌΚΚ1, сшитый с парамагнитными гранулами. МОЯ4910 и антитело к ΌΚΚ1/4 нейтрализует человеческий ΌΚΚ1 (фирма Ыоуагбк) при эквивалентном значении ЕС50, антитело к ΌΚΚ1/4 нейтрализует также обезьяний (фирма Иотагбв), мышиный (фирма Β&Ό 8уз!ет8, 1765-ΌΚ-010) и крысиный (фирма Ыоуагбк) ΌΚΚ1. Репортерный ТОРЕЬА8Н-анализ с использованием ΌΚΚ1 человека, крысы, мыши и яванского макака осуществляют в целом, как описано выше (фиг. 9), используя рекомбинантный ΌΚΚ1 каждого вида в качестве ингибитора кондиционированных сред \Уп1 вместо человеческого ΌΚΚ1. При применении крысиного рекомбинантного ΌΚΚ1 требуются более высокие концентрации белка для достижения существенного ингибирования при ТОРЕЬА8Н-анализе.
Пример 17. Воздействие антитела к ΌΚΚ1/4 на интратибиальный рост ксанотрансплантатов РС3М2АС6.
Метастазы опухоли предстательной железы являются уникальными среди метастазов кости, поскольку они являются скорее остебластическими, чем остеолитическими (ХеИет 2001). Однако даже в основном остеобластические метастазы кости имеют низлежащие области остеолиза и часто снижают плотность костной массы (ВМО), прежде всего, когда пациентов подвергают терапии, основанной на депривации андрогена (8ааб, 2006). В настоящее время продемонстрировано, что ΌΚΚ1 может действовать в качестве переключателя, т.е. экспрессия ΌΚΚ1 усиливает остеолитические свойства линии клеток смешанного остеобластического/остеолитического рака предстательной железы (С4-2В). Кроме того, подавление 811РН1< ΌΚΚ1 ингибирует остеолитическую активность преимущественно остеолитической линии клеток рака предстательной железы (РС3) (На11, 2005; На11, 2006). Выключение ΌΚΚ1 также ингибирует интратибиальный рост ксенотрансплантата опухоли, что позволило авторам настоящего изобретения высказать предположение о том, что остеолитическая активность может быть важной для создания метастатической ниши, но последующая потеря ΌΚΚ1 при метастазах рака предстательной железы приводит к превращению опухоли в опухоль остеобластического фенотипа.
Остеолитическую модель опухоли предстательной железы адаптируют согласно методу, описанному у Κίιη, 2003. Вариант остеолитической линии клеток рака предстательной железы (РС3М), стабильной экспрессирующий люциферазу (РС3М2АС6), инъецируют в большеберцовую кость мышей. Оценивают рост опухоли по уровню люциферазы, а изменения в кости определяют с помощью микрокомпьютерной томографии (микро-КТ) и гистологического анализа. Антитело не усиливает рост опухоли, а скорее имеет тенденцию ингибировать рост опухоли. Хотя ингибирование не является статистически достоверным при оценке в одном эксперименте, оно является постоянным в 5 из 5 экспериментов, проведенных к настоящему времени, в репрезентативном исследовании, результаты которого представлены на фиг. 11, продемонстрировано действие трех доз антитела к ΌΚΚ1/4 на рост опухоли. Аналогичная недостоверная тенденция к ингибированию обнаружена при обработке антителом к ΌΚΚ1/4 мышей с подкожными ксенотрансплантами РС3М2АС6.
Обработку начинают в день 5 после имплантации (0,2 млн клеток/животное). Антитело к ΌΚΚ1/4 вводят ί.ν. в дозах 20, 60 и 200 мкг/мышь/день, каждый день (д.б.) (4 раза в день), 3 раза в неделю в тече
- 76 015538 ние 2 недель. Контрольный Ι§0 вводят ί.ν. в дозе 200 мкг/мышь/день, ц.б., 3 раза в неделю в течение 2 недель. Носитель (ЗФР), применяемый в качестве контроля, вводят ί.ν., ц.б., 3 раза в неделю в течение 2 недель. После обработки рассчитывают конечную эффективность и изменение веса тела.
С помощью указанной модели при создании изобретения было установлено, что антитело к ΌΚΚ1/4 ингибирует индуцируемое опухолью повреждение кортикального слоя кости. Достоверные данные о воздействии на губчатую (трабекулярную) большеберцовую кость при использовании этой модели не получены, поскольку и имплантаты опухоли, имплантаты-имитаторы вызывают механическое повреждение кости, приводящее к начальному увеличению переплетенной костной ткани, что после ремоделирования приводит к снижению видимого объема кости. Относительное воздействие вновь сформированной переплетенной костной ткани и трабекул на соотношение общего объема кости/объема трабекул (ВУ/ТУ) в результате остается невыясненным. Однако очевидно, что антитело к ΌΚΚ1/4 повышает производство костной ткани в большеберцовых костях, в которые имплантируют как опухоль, так и имитатор, и ингибирует или замедляет снижение объема кости в результате ремоделирования. С использованием такой же модели индуцируемого опухолью остеолиза продемонстрировано, что антитело к ΌΚΚ1/4 обладает антиостеолитической активностью, эквивалентной активности 2оте1а (см. фиг. 12). Воздействие антитела к ΌΚΚ1/4 на метаболизм кости зависит от дозы в диапазоне от 20 до 200 мкг/мышь, при этом минимальная эффективная доза составляет 20-60 мкг/мышь (см. фиг. 13). Эти данные в совокупности позволяют предположить, что антитело к ΌΚΚ1/4 оказывает влияние на индуцируемое опухолью остеолитическое заболевание, но может обладать также эффективностью в отношении не связанных с опухолью заболеваний кости, таких как остеопороз, или повышать репарацию переломов кости.
Пример 18. Антитело к ΌΚΚ1/4 поддерживает повышенную плотность кости при имплантации в большеберцовую кость как опухолей, так и имитаторов.
С целью выявления фармакодинамических маркеров эффективности на мышах анализируют три присутствующих в сыворотке маркера костного метаболизма: остеокальцин (0С), остеопротегерин (0РО) и лиганд секретируемого рецептора-активатора ядерного фактора кВ рКАНЕЕ). Применяют эти остеобластические, а не более широко применяемые остеолитические маркеры, из-за ожидаемого механизма действия антитела. Однако никаких видимых изменений не обнаружено в животных, несущих опухоль по сравнению с необработанными животными. Не выявлено корреляции с потерей костной ткани при оценке с помощью микро-КТ или ИГХ (иммуногистохимический анализ), что обычно наблюдается при применении указанных маркеров.
Репрезентативные примеры реконструированных с помощью микро-КТ большеберцовых костей обработанных мышей показаны на фиг. 12 А. Кортикальное повреждение оценивают в баллах от 0 до 3, где 0 соответствует отсутствию повреждения, а 3 - серьезному повреждению (фиг. 12Б). Кортикальное повреждение в большеберцовых костях, в которые имплантированы опухолевые клетки, оценивают вручную с помощью микро-КТ-анализа, который осуществляют вслепую касательно изучаемых групп. Никакого кортикального повреждения не выявлено в конечностях, в которые имплантируют любой из контрольных имитаторов.
Методы. Самкам бестимусных мышей возрастом 12 недель имплантируют внутритибиально 2х105 РС-3М2АС6-клеток в левую большеберцовую кость и осуществляют инъекцию имитатора в правую большеберцовую кость. Обработки начинают через 5 дней после имплантации. Антитело КУР-анти^ΚΚ1/4-NX (антитело к ΌΚΚ1/4) и контрольный Ι§Ο вводят ί.ν. в дозе 200 мкг/мышь/день, ц.б., 3 раза в неделю в течение 2 недель. Наполнитель (ЗФР) в качестве контроля вводят ί.ν., ц.б., 3 раза в неделю в течение 2 недель. Животных сканируют в день 7, 14 и 18 после имплантации опухоли с использованием сканера для микро-КТ УйаСТ40 (фирма БСАNСО, Швейцария). Плотность трабекулярной кости (ВУ/ТУ) анализируют согласно описанному методу. Звездочкой (*) обозначено достоверное различие относительно контроля-наполнителя и контроляЧдО (п=12) в один и тот же момент времени при р < 0,05.
На фиг. 13 показаны результаты определения массы кости, вторичный спонгиоз большеберцовой кости визуализируют с помощью программ 2е155 Рпадег Ζ. 1 и А.хюуыоп после окрашивания по Гимза. Выходные данные выражают в виде процента обызвествленной кости во всем поле зрения. Каждая колонка соответствует среднему значению и стандартному отклонению для указанного количества животных. В группах, обработанных ЗФР, ΙβΟ и антителом к ΌΚΚ1/4, анализируют только животных, которые имеют опухоли. В правые конечности не инъецируют имитаторы, а левые конечности несут опухоли.
Статистический анализ. Применяют однонаправленный регрессионный анализ с использованием критерия для множественных сравнений Дуннета. Для левых конечностей или правых конечностей в сравнении с соответствующей конечностью в группе, обработанной ЗФР, р<0,05*, р<0,01**, р>0,05 п.5.(статистически недостоверное различие).
На фиг. 14 представлены данные, демонстрирующие, что анаболическое действие на кость антитела к ΌΚΚ1/4 зависит от дозы, при этом минимальная эффективная доза находится в пределах 20-60 мкг/мышь 3х/неделю.
Метод. Самкам бестимусных мышей возрастом 12 недель имплантируют внутритибиально 2х105 РС-3М2АС6-клеток в левую большеберцовую кость и осуществляют инъекцию имитатора в правую
- 77 015538 большеберцовую кость. Обработки начинают через 6 дней после имплантации. Антитело КУР-анти^ΚΚ1/4-NX (антитело к ΌΚΚ1/4), контрольный ΙβΟ вводят ί.ν. в дозе 200 мкг/мышь/день, ц.й., 3 раза в неделю в течение 2 недель. Наполнитель (ЗФР) в качестве контроля вводят ί.ν., срй., 3 раза в неделю в течение 2 недель. Животных сканируют в день 7 и 20 после имплантации опухоли с использованием сканера для микро-КТ УгуаСТ40 (фирма БСΑNСΟ, Швейцария). Плотность трабекулярной кости (ВУ/ТУ) анализируют согласно описанному методу. Звездочкой (*) обозначено достоверное различие относительно всех контролей, включая наполнитель, ΙβΟ, только механическое повреждение (отверстие в кости) и необработанных животных в один и тот же момент времени при р<0,05.
Пример 18. Статус биомеркеров.
Биомаркеры ΌΚΚ1.
Схема экспрессии РНК ΌΚΚ1 уже была описана. Κ^ирη^к, 1999, с помощью анализа методом Нозерблоттинга установил, что экспрессия имеет место в плаценте, но отсутствует в сердце, головном мозге, легком, печени, скелетной мышце или поджелудочной железе. νίΠ^, 2003, установил отсутствие экспрессии РНК в печени, почке и молочной железе, хотя экспрессия РНК выявлена в популяции гепатобластом и опухолей Вильмса. Исследования по оценке экспрессии РНК ΌΚΚ1 в желудочно-кишечном тракте, проведенные с помощью гибридизации ш кйи, позволили установить отсутствие экспрессии как в здоровых, так и в пораженных злокачественным заболеванием желудке и ободочной кишке (Вуип, 2006).
Анализ экспрессии РНК мышей позволили выявить высокие уровни экспрессии ΌΚΚ1 в костной ткани, средние уровни экспрессии в эмбрионе и плаценте, слабые уровни экспрессии в бурой жировой ткани, тимусе и двенадцатиперстной кишке (Ы, 2006).
Экспрессию белка ΌΚΚ1 оценивают в образцах миелом с использованием такого же козьего антитела, которое применяют в современных исследованиях (Т1ап, 2003). В этом опубликованном исследовании экспрессия обнаружена в клетках пациентов, страдающих миеломой низкой стадии по данным морфологического анализа; экспрессия белка ΌΚΚ1 не выявлена в полученных с помощью биопсии образцах костного мозга пяти контрольных индивидуумов.
Распределения в тканях и перекрестную реакцию на другие виды терапевтического антитела к ΌΚΚ1/4 оценивают путем скрининга в отношении серий здоровых человеческих и обезьяньих тканей. Оценивают как срезы всей ткани, так и микронаборов тканей. В качестве положительных контролей используют поступающее в продажу антитело к ΌΚΚ1, которое оценивают с использованием такого же набора тканей.
Применяют ΌΚΚ1-15 (конъюгированное с ФИТЦ антитело к ΌΚΚ1/4) и ΌΚΚ1_8 (конъюгированное с ФИТЦ козье антитело к ΌΚΚ1, фирма Η&Ό Бук!етк, № АЕ1096, лоты к СВЬ013101 и СВЫ4111).
Другие биомаркеры.
Поскольку к настоящему времени мало известно о патофизиологической роли ΌΚΚ1, проводится большое количество исследований, которые сфокусированы на получении данных о воздействиях ш νί\Ό антитела к ΌΚΚ1/4 с помощью биомаркеров и на возможности их применения для дальнейших разработок. Ключевыми моментами являются:
1) понимание роли антитела к ΌΚΚ1/4 при нормальном и метастатическом метаболизме кости с помощью оценки находящихся в кровотоке маркеров остеокластической и остеобластической активности,
2) сравнение уровней экспрессии ΌΚΚ1 при множественной миеломе и других опухолях для подтверждения и расширения мишеней для применения,
3) воздействие на уровень экспрессии гена в имеющих решающее значение тканях типа ободочной кишки, костного мозга, легкого, кожи и молочной железы, для оценки активации бета-катенина.
Предварительные молекулярные эпидемиологические исследования подтвердили наличие повышенных уровней в сыворотке ΌΚΚ1 у пациентов, страдающих множественной миеломой, и подтвердили РОС при указанном показании.
Основываясь на существующих сведениях в табл. 18 представлены потенциальные биомаркеры для антитела к ΌΚΚ1/4.
- 78 015538
Биомаркеры ΌΚΚ1- и ПЕКТ-мишеней
Таблица 18
Категории Опухоль Кровь Вспомогательная ткань
Фармакодинамика (ФД) -мишень -результат Механизм действия н/о Уровни свободного и связанного с ОКК.1 Ат к 13КК1/4 Активация бета-катенина ΝΤχ, СТх, ΡΙΝΡ, остеокальцин, КАЫКЬ, ОРО, РТН, витамин 03, кальцитонин Жировая ткань/кожа
Эффективность Сывороточный Мбелок, общий Мбелок в моче, Ь2микроглобин, 163 Н ΝΤχ, СТх, ΡΙΝΡ, остеокальцин, КАИКЬ, ОРО, РТН, кальцитонин костный - АЬР, С1СР, СТх, ΝΤχ и др.
Стратификация предсказанных маркеров Предварительная селекция Экспрессия 0КК1 ΟΚΚ-ί, СТх, ΡΙΝΡ, остеокальцин, ΚΑΝΚ1,, ОРО, РТН, витамин Ώ3, кальцитонин Уровни ЭКК1 в сыворотке
Безопасность Иммуногенность
Фармакокинетика ΑτκϋΚΚΙ/4
Пример 19. Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепи антител к ΌΚΚ1.
Аминокислотные последовательности вариабельных областей легких и тяжелых цепей антител к ΌΚΚ1, СЭК-участки которых представлены в табл. 5, 6, 11А и 11Б, полностью приведены в табл. 19.

Claims (51)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Композиция, включающая антитело или его функционально активный фрагмент, который содержит антигенсвязывающий участок, специфически связывающийся с эпитопом в человеческом ΌΚΚ1 полипептиде (8ЕЦ ΙΌ N0: 1) с ΚΒ 140 пМ или менее.
  2. 2. Композиция по п.1, где связывание с ΌΚΚ1 определяют с помощью по меньшей мере одного анализа, выбранного из группы, включающей анализ антагонизма транскрипции пути передачи XV п1сигнала; основанный на электрохемилюминесценции анализ связывания; твердофазный иммуноферментный анализ связывания; ЕМАТ (анализ связывания, основанный на технологии флуорометрического микрообъемного анализа); ЗЕТ (титрование уравновешенного раствора); 8РЯ (резонанс поверхностного плазмона); определение концентрации остеокальцина (0С^ в сыворотке; определение концентрации остеопротегрина (0РС) в сыворотке; определение концентрации нитрогенного пропептида проколлагена типа 1 (РЮТ),;определение производства АЬР (антилимфоцитарной плазмы); ТорПакН или оценку облегчения остеолиза.
  3. 3. Композиция, включающая выделенную аминокислотную последовательность антитела или его функционально активного фрагмента, который содержит антигенсвязывающий участок, который специфически связывается с эпитопом в человеческом ΌΚΚ1 полипептиде (8ЕЦ ΙΌ N0: 1) с ΚΒ 140 пМ или менее, где аминокислотная последовательность выбирается из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 2-20 и 40-72, и ее консервативные или гуманированные варианты.
  4. 4. Композиция, включающая антитело или его функционально активный фрагмент, который связывается по меньшей мере с одним эпитопом в ΌΚΚ1 или ΌΚΚ4 или обоими, которая включает аминокислотные последовательности, выбранные по меньшей мере из двух СЭРЕ СЭЯ2 или СОЯ3, где СОЯ выбраны из:
    а) группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 2-20, 65-72, каждая из которых содержит антигенсвязывающий участок, включающий Н-СОЯ3-участок;
    б) группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 2-20, 57-64, каждая из которых содержит Н-СОЯ2-участок;
    в) группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 40, которая представляет собой последовательность С[8С8С8ΥТΥΥΛ^8VI<Е. 8ЕЦ ΙΌ N0: 41, которая представляет собой последовательность СКУΥССNТΥΥΛ^8VI<Е. и 8ЕЦ ΙΌ N0: 42, которая представляет собой последовательность СКУУССЗТУΥΛ^8VΚЕ. каждая из которых содержит консенсусный Н-СОЯ2-участок;
    г) группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 2-5, 8-11, 20, 49-56, каждая из которых содержит Н-СЭЯ1участок; и
    д) группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 43, которая представляет собой аминокислотную последовательность СЕТЕ88УСМТ, 8ЕЦ ΙΌ N0: 44, которая представляет собой аминокислотную последовательность СЕТЕ^УСМТ, 8ЕЦ ΙΌ N0: 45, которая представляет собой аминокислотную последовательность СЕТЕЗПУСМТ, 8ЕЦ ΙΌ N0: 46, которая представляет собой аминокислотную последовательность СЕТЕ88ΥVМТ, 8ЕЦ ΙΌ N0: 47, которая представляет собой аминокислотную последовательность СЕТЕЗЗУАМТ, и 8ЕЦ ΙΌ N0: 48, которая представляет собой аминокислотную последовательность СЕТЕ88УСМ8, каждая из которых содержит консенсусный Н-СОЯ1-участок; или
    е) ЗЕ О ΙΌ N0: 21-39 и 73-88;
    ж) группы какой-либо одной или более СЭРЕ СЭЯ2 или СОЯ3, как представлено в табл. 5, 6, 11А, 11Б, 13 А, 13Б, 19, 20 А, 20Б или 20В; и их консервативные или гуманированные варианты.
  5. 5. Композиция по п.4, в которой аминокислотные последовательности выбраны из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 21-39, содержат Ь-СПЯ3-участок, каждая из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 21-39, 73-80, содержит Ь-СОЯ 1-участок, каждая из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 21-39, 81-88, содержит Ь-СПЯ2-участок, каждая из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей 8ЕЦ Ш N0: 21-39, содержит вариабельную область легкой цепи.
  6. 6. Композиция, включающая выделенную нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 97-103.
  7. 7. Композиция, включающая выделенную аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью по п.6, и консервативные и гуманированные варианты аминокислотной последовательности, где:
    а) каждая из 8ЕЦ ΙΌ N0: 97-100 кодирует антигенсвязывающую легкую цепь,
    б) каждая из 8ЕЦ ΙΌ N0: 101-103 кодирует антигенсвязывающую тяжелую цепь.
  8. 8. Композиция по п.6, где нуклеотидная последовательность дополнительно оптимизирована для экспрессии и/или для клинического применения.
  9. 9. Композиция, включающая выделенную нуклеотидную последовательность, выбранную из группы ЗЕО ΙΌ N0: 104-110.
  10. 10. Композиция по п.9 и консервативные или гуманированные варианты аминокислотной последовательности, где:
    - 141 015538
    а) каждая из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 104-107 кодирует антигенсвязывающую легкую цепь,
    б) каждая из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 108-110 кодирует антигенсвязывающую тяжелую цепь.
  11. 11. Композиция по п.9, где нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии и/или для клинического применения.
  12. 12. Композиция, включающая выделенную аминокислотную последовательность, выбранную из группы 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 111-117, и ее консервативные или гуманированные варианты, где:
    а) каждая из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 111-114 кодирует антигенсвязывающую легкую цепь,
    б) каждая из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 115-117 кодирует антигенсвязывающую тяжелую цепь.
  13. 13. Композиция по п.12, где аминокислотная последовательность оптимизирована для экспрессии и/или для клинического применения.
  14. 14. Композиция, включающая выделенную нуклеотидную последовательность, выбранную из группы 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 120, 121.
  15. 15. Композиция, включающая выделенную аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью по п.14, и консервативные или гуманированные варианты аминокислотной последовательности, где:
    а) 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 120 кодирует антигенсвязывающую вариабельную область легкой цепи,
    б) 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 121 кодирует антигенсвязывающую вариабельную область тяжелой цепи.
  16. 16. Композиция по п.14, где нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии и/или для клинического применения.
  17. 17. Композиция, включающая выделенный антигенсвязывающий участок антитела или его функционально активного фрагмента, где антигенсвязывающий участок содержит вариабельную область легкой цепи, которая кодируется нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 120, и вариабельную область тяжелой цепи, которая кодируется нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 121.
  18. 18. Композиция, включающая выделенную аминокислотную последовательность, выбранную из группы 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 118, 119, и ее консервативные или гуманированные варианты.
  19. 19. Композиция по п.18, где 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 118 означает антигенсвязывающую вариабельную область легкой цепи.
  20. 20. Композиция по п.18, где 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 119 означает антигенсвязывающую вариабельную область тяжелой цепи.
  21. 21. Композиция по п.18, где аминокислотная последовательность оптимизирована для экспрессии и/или для клинического применения.
  22. 22. Композиция, включающая выделенную аминокислотную последовательность антитела или его функционально активного фрагмента, который содержит антигенсвязывающий участок, который специфически связывается с эпитопом в человеческом ЭКК1 полипептиде (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1) с Кс 140 пМ или менее, где аминокислотная последовательность по меньшей мере на 95% идентична по меньшей мере одному СОЯ-участку, выбранному из участков, которые представлены в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2-121.
  23. 23. Композиция, включающая выделенную аминокислотную последовательность антитела или его функционально активного фрагмента, который содержит антигенсвязывающий участок, который специфически связывается с эпитопом в человеческом ЭКК1 полипептиде (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1) с Кс 140 пМ или менее, где аминокислотная последовательность имеет консенсусные последовательности СОЯ-участков, которые представлены в табл. 11А и 11Б.
  24. 24. Композиция по п.4, где антитело или его функционально активный фрагмент содержит каркас ΙβΜ и Ι§6, где ΙβΟ выбран из Ι§61, ЦС2 и ЦС3 или ЦС4.
  25. 25. Композиция по п.24, где ΙβΜ или ЦС выбран из поликлонального или моноклонального антитела.
  26. 26. Композиция, содержащая выделенное антитело или его функционально активный фрагмент, включающий антигенсвязывающий участок, специфически связывающийся с эпитопом в ЭКК1 с Кс 140 пМ или менее, где антитело или его функционально активный фрагмент связывается с ЭКК1 или ЭКК4 и предупреждает развитие или облегчает ассоциированное с ЭКК1 заболевание или ассоциированное с ЭКК4 заболевание.
  27. 27. Композиция, содержащая выделенный антигенсвязывающий участок антитела или его функционально активного фрагмента по п.26.
  28. 28. Композиция, содержащая выделенное антитело или его функционально активный фрагмент, включающий антигенсвязывающий участок, который специфически связывается с эпитопом-мишени в ЭКК1 с Ки 140 пМ или менее, где эпитоп содержит по меньшей мере шесть или более аминокислотных остатков СУ82-домена ЭКК1 или ЭКК4.
  29. 29. Композиция по любому из предыдущих пп.1-28, где выделенное антитело или его функционально активный фрагмент включает антигенсвязывающий участок, который специфически связывается с эпитопом в человеческом ЭКК1 полипептиде (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1) и/или человеческом ЭКК4 полипептиде (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 124), и где выделенное антитело или его функционально активный фрагмент выбраны из полного иммуноглобулина или БаЬ-фрагмента или ксБу-фрагмента антитела, тяжелой цепи антитела и его антигенсвязывающего участка, каркасом которого не является иммуноглобулин.
  30. 30. Композиция по п.29, в которой эпитоп представляет собой конформационный эпитоп.
    - 142 015538
  31. 31. Композиция, содержащая по меньшей мере одну композицию по п.29 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
  32. 32. Трансгенное животное, несущее ген, который кодирует антитело или его функционально активный фрагмент по п.29.
  33. 33. Способ лечения нарушения или состояния, ассоциированного с присутствием ОКК1 или ЭКК4, заключающийся в том, что индивидууму, который нуждается в этом, вводят эффективное количество фармацевтической композиции по п.31.
  34. 34. Способ по п.33, в котором нарушение или состояние выбрано из группы, включающей остеолитические повреждения, прежде всего остеолитические повреждения, ассоциированные с миеломой, прежде всего с множественной миеломой или раком костной ткани, молочной железы, ободочной кишки, меланоцитов, гепатоцитов, эпителия, пищевода, головного мозга, легких, предстательной железы или поджелудочной железы или его метастазами; потерю костной ткани, ассоциированную с трансплантацией, или представляет собой остеосаркому, рак предстательной железы, гепатоцеллюлярную карциному (НСС), миелому, включая множественную миелому, диабет, ожирение, мышечную слабость, болезнь Альцгеймера, остеопороз, остеопению, ревматизм, колит и/или нежелательную потерю волос.
  35. 35. Способ по п.33, в котором дополнительно вводят второй терапевтический агент.
  36. 36. Способ по п.35, в котором химиотерапевтический агент представляет собой зомета (ΖοιικΙη).
  37. 37. Применение композиции по любому из пп.1-31 для лечения нарушения или состояния, ассоциированного с присутствием ЭКК1 или ЭКК4, в которой дополнительный терапевтический агент выбран из группы, включающей противораковый агент, антиметаболит, антидиабетический агент, антиостеопорозный агент, антибиотик, противовоспалительный агент, фактор роста и цитокин.
  38. 38. Композиция, включающая выделенное антитело, содержащее первую аминокислотную последовательность, которая представляет собой последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, включающей 8Е0 ГО NО: 2-20, и последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична СОЯучасткам, где СОЯ-участки представлены в 8Еф ГО NО: 2-20; и вторую аминокислотную последовательность, которая представляет собой последовательность легкой цепи, выбранную из группы, включающей 8Еф ГО NО: 21-39, и последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична СОЯ-участкам, где СОЯ-участки представлены в 8Еф ГО NО: 21-39.
  39. 39. Иммуноконъюгат, содержащий композицию по любому из пп.1-5, 7, 10, 12, 13, 15 или 17-28.
  40. 40. Набор, содержащий композицию по любому из пп.1-31, 37 или 38, где выделенное антитело или его функционально активный фрагмент включает антигенсвязывающий участок, который специфически связывается с эпитопом в человеческом ОКК1 полипептиде (§Еф ГО NО: 1) и/или человеческом ЭКК4 полипептиде (5>ЕО ГО NО: 124).
  41. 41. Набор по п.40, дополнительно включающий фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
  42. 42. Набор по п.40, в котором антитело присутствует в виде стандартной дозы.
  43. 43. Набор по п.40, дополнительно включающий инструкцию по применению для индивидуума.
  44. 44. Композиция, содержащая нейтрализующее антитело к ОКК1/4.
  45. 45. Композиция по п.44, где связывание антитела с ОКК1 характеризуется значением Коп менее чем 100 нМ, 50 нМ, 10 нМ, 1,0 нМ, 500 пМ или 100 пМ и скоростью диссоциации ОКК1 менее чем 10-2/с, 10-3/с, 10-4/с или 10-5/с.
  46. 46. Композиция по п.44, где аффинность антитела к ОКК1 или ЭКК4 в 102-106 выше, чем его аффинность к ЭКК2 или ЭКК3.
  47. 47. Композиция по п.44, где антитело конкурирует с нейтрализующим антителом к ЭКК1/4 за связывание с ЭКК1 или ЭКК4.
  48. 48. Способ лечения заболеваний с помощью композиции, содержащей, по меньшей мере, полипептидную последовательность, представленную в 8Еф ГО NО: 118, и полипептидную последовательность, представленную в 8ЕО ГО NО: 119, или их консервативные или гуманированные варианты; где композиция содержит нейтрализующее антитело к ОКК1/ОКК4.
  49. 49. Антитело, аффинность к связыванию которого с ЭКК1 (КО) характеризуется значением 10-8 или менее и которое конкурирует с любыми антителами по п.1
  50. 50. Антитело по п.49, связывание которого с ОКК2 или ОКК3 находится ниже предела обнаружения.
  51. 51. Антитело по п.50, где связывание антитела с ОКК1 или ОКК4 характеризуется значением (КО) 10-3 или более.
EA200801679A 2006-01-13 2007-01-12 Композиции и способы применения антител к dickkopf-1 и/или -4 EA015538B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US75921606P 2006-01-13 2006-01-13
PCT/US2007/000777 WO2007084344A2 (en) 2006-01-13 2007-01-12 Compositions and methods of use for antibodies of dickkopf-1 and/or -4

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801679A1 EA200801679A1 (ru) 2009-02-27
EA015538B1 true EA015538B1 (ru) 2011-08-30

Family

ID=38288117

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801679A EA015538B1 (ru) 2006-01-13 2007-01-12 Композиции и способы применения антител к dickkopf-1 и/или -4

Country Status (31)

Country Link
US (3) US8673306B2 (ru)
EP (1) EP1976594B1 (ru)
JP (2) JP5552233B2 (ru)
KR (1) KR101413785B1 (ru)
CN (1) CN101400406B (ru)
AR (1) AR060017A1 (ru)
AU (1) AU2007207787B2 (ru)
BR (1) BRPI0706524A2 (ru)
CA (1) CA2636579A1 (ru)
CR (1) CR10128A (ru)
CU (1) CU23871B1 (ru)
EA (1) EA015538B1 (ru)
EC (1) ECSP088618A (ru)
GE (1) GEP20125476B (ru)
HK (1) HK1121420A1 (ru)
HN (1) HN2008001104A (ru)
IL (1) IL192631A (ru)
MA (1) MA30158B1 (ru)
ME (2) ME00010B (ru)
MY (1) MY153573A (ru)
NO (1) NO20083477L (ru)
NZ (1) NZ569555A (ru)
PE (2) PE20120816A1 (ru)
SG (1) SG169327A1 (ru)
SM (1) SMP200800042B (ru)
SV (1) SV2008002980A (ru)
TN (1) TNSN08297A1 (ru)
TW (1) TWI432450B (ru)
UA (1) UA101944C2 (ru)
WO (1) WO2007084344A2 (ru)
ZA (1) ZA200805743B (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2740672C2 (ru) * 2015-08-07 2021-01-19 ЭйЭлЭкс Онколоджи Инк. Конструкции, имеющие sirp-альфа домен или его вариант
US11613564B2 (en) 2019-05-31 2023-03-28 ALX Oncology Inc. Methods of treating cancer

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
US8450274B2 (en) 2006-05-24 2013-05-28 Theragenetex Co., Ltd. DKK2 protein and use thereof
KR101218806B1 (ko) * 2010-04-21 2013-01-09 주식회사 테라젠이텍스 Ｄｋｋ2 단백질 및 그의 용도
JP2009065938A (ja) * 2007-09-14 2009-04-02 Matsumoto Shika Univ タンパク質、破骨細胞分化阻害剤、炎症性骨破壊治療薬、遺伝子、組み替えベクター、及びタンパク質の製造方法
TWI489993B (zh) 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
JP5320730B2 (ja) * 2007-12-26 2013-10-23 Ｊｎｃ株式会社 発光基質水溶液およびその製造方法
DK2331136T3 (en) 2008-09-26 2018-03-05 Oncomed Pharm Inc FRIZZLED BINDING AGENTS AND APPLICATIONS THEREOF
AR075715A1 (es) * 2009-03-05 2011-04-20 Novartis Ag Formulacion de anticuerpo liofilizado
AR075989A1 (es) * 2009-04-10 2011-05-11 Lilly Co Eli Anticuerpo dkk -1 (dickkopf-1) humano disenado por ingenieria
BRPI1014535A2 (pt) * 2009-05-07 2016-04-05 Novatis Ag composições e métodos de uso para moléculas de ligação a dickkopf-1 ou dickkopf-4 ou ambas
KR101471239B1 (ko) 2009-05-12 2014-12-09 화이자 인코포레이티드 항-ｄｋｋ-1 항체의 차단 및 그의 용도
WO2010130832A2 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against dickkopf-1 and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with bone loss and/or osteolytic lesions
EP2494354A1 (en) * 2009-10-30 2012-09-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Pcsk9 immunoassay
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
EP2545079A2 (en) * 2010-03-11 2013-01-16 Rinat Neuroscience Corporation ANTIBODIES WITH pH DEPENDENT ANTIGEN BINDING
AU2011235904B2 (en) 2010-04-01 2015-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Frizzled-binding agents and uses thereof
AR083740A1 (es) * 2010-10-27 2013-03-20 Amgen Inc Anticuerpos dkk1 (dickkopf-1) y metodos de uso
CN103608037B (zh) * 2011-02-01 2016-04-13 香港大学 抗dkk1单克隆抗体用于治疗肝癌的用途
WO2012118903A2 (en) 2011-03-01 2012-09-07 Amgen Inc. Bispecific binding agents
CN103472226A (zh) * 2012-06-08 2013-12-25 上海市肿瘤研究所 血清dkk1在制备早期肝细胞癌或小肝细胞癌的诊断试剂中的用途
CN103487581A (zh) * 2012-06-08 2014-01-01 上海市肿瘤研究所 血清dkk1在制备甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断试剂中的用途
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
CA2899353A1 (en) * 2013-02-04 2014-08-07 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a wnt pathway inhibitor
CN103083686B (zh) * 2013-02-18 2014-09-10 上海交通大学医学院附属仁济医院 Dkk4基因及其编码蛋白在制备药物中的应用
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
US10398765B2 (en) 2014-07-03 2019-09-03 Yale University Dickkopf2 (Dkk2) inhibition suppresses tumor formation
DE102016206820B4 (de) 2015-04-22 2017-07-27 BSH Hausgeräte GmbH Weiterentwicklung eines Induktionswasserkochers, einer Kaffeemaschine und einer Suppenmaschine
CN105203773A (zh) * 2015-09-28 2015-12-30 成都博奥新景医学科技有限公司 一种人Dickkopf-1蛋白（DKK-1）定量检测试剂盒
CA3003252C (en) * 2015-10-28 2024-06-25 Yale University Humanized anti-dkk2 antibody and uses thereof
RU2656160C2 (ru) 2016-08-17 2018-05-31 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с рецептором интерлейкина-6 человека
KR20190085935A (ko) * 2016-10-26 2019-07-19 리프 테라퓨틱스 인코포레이티드 항-dkk-1 항체를 사용하여 암을 치료하기 위한 바이오마커로서의 베타-카테닌의 용도
WO2018208108A1 (ko) * 2017-05-10 2018-11-15 주식회사 굳티셀 조절 t 세포에 특이적으로 존재하는 dkk1 단백질 및 그 용도
JP7356505B2 (ja) * 2019-01-15 2023-10-04 バイオニア コーポレーション Ｄｋｋ１遺伝子を標的にする二本鎖オリゴヌクレオチド、これを含む構造体及びこれを含む脱毛予防又は発毛用組成物
EP3917572A4 (en) * 2019-02-01 2022-11-09 Board of Regents, The University of Texas System MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST HUMAN MHC-RELATED DICKKOPF-1 PEPTIDES AND THEIR USES
CN112121147B (zh) * 2019-06-24 2023-07-04 中国人民解放军海军特色医学中心 多肽在治疗或预防骨髓瘤药物中的应用、多肽、核酸、药物及重组表达载体
CN111632147A (zh) * 2020-06-07 2020-09-08 重庆医科大学 骨细胞Wnt激活剂在制备骨折加速愈合、防治骨不连及不运动或失重骨丢失药物中的应用
KR102494042B1 (ko) * 2020-11-20 2023-02-07 주식회사 하울바이오 인간모유두세포의 성장을 촉진하는 항-dkk-1 항체 및 이의 용도
CN112592402B (zh) * 2020-12-02 2022-04-26 杭州奕安济世生物药业有限公司 抗dkk2抗体、包含该抗dkk2抗体的组合物及其用途
WO2022140670A2 (en) * 2020-12-23 2022-06-30 Phenomic Ai Anti-activin antibodies and methods of using the same
WO2023046147A1 (zh) * 2021-09-26 2023-03-30 安沛治疗有限公司 针对dkk1的适体及其用途
CN116514966A (zh) * 2022-01-28 2023-08-01 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗dkk1抗体、其药物组合物及用途

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995024481A2 (en) * 1994-03-10 1995-09-14 Schering Corporation Humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4
WO2002066509A2 (en) * 2001-02-16 2002-08-29 Genentech, Inc. Treatment involving dkk-1 or antagonists thereof
WO2002086085A2 (en) * 2001-04-24 2002-10-31 Bayer Corporation Human timp-1 antibodies
WO2003070760A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-amyloid beta antibodies and their use
US20050069915A1 (en) * 1998-01-15 2005-03-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies that bind human Dickkopf-1 proteins
US20050084494A1 (en) * 2003-05-21 2005-04-21 Darwin Prockop Inhibitors of Dkk-1
US6951921B2 (en) * 1998-09-01 2005-10-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2006017538A2 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Dyax Corp. Hk1-binding proteins
WO2006100582A1 (en) * 2005-03-25 2006-09-28 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules directed to mcsp and having increased fc receptor binding affinity and effector function
WO2007054816A2 (en) * 2005-11-14 2007-05-18 Bioren, Inc. Antibody ultrahumanization by predicted mature cdr blasting and cohort library generation and screening

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0975755T3 (da) 1997-04-16 2007-06-11 Millennium Pharm Inc CRSP-protein (cysteinrige udskilte proteiner), nukleinsyremolekyler der koder herfor samt anvendelser deraf
US7057017B2 (en) 1997-04-16 2006-06-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Human dickkopf-related protein and nucleic acid molecules and uses therefor
DE19747418C1 (de) 1997-10-27 1999-07-15 Deutsches Krebsforsch Inhibitor-Protein des wnt-Signalwegs
WO2000006714A1 (en) 1998-07-31 2000-02-10 Eli Lilly And Company DDKh-3 NUCLEIC ACIDS, POLYPEPTIDES, VECTORS, HOST CELLS, METHODS AND USES THEREOF
US6344541B1 (en) 1998-09-25 2002-02-05 Amgen Inc. DKR polypeptides
US6682736B1 (en) 1998-12-23 2004-01-27 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to CTLA-4
OA12589A (en) 2001-01-05 2006-06-08 Abgenix Inc Antibodies to insulin-like growth factor i receptor.
JP2005512557A (ja) 2001-11-07 2005-05-12 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ アーカンソー 遺伝子発現プロファイリングに基づく多発性骨髄腫の診断、予後、および治療標的候補の同定
WO2004053063A2 (en) 2002-12-05 2004-06-24 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas System Molecular determinants of myeloma bone disease and uses thereof
EP2336177A1 (en) * 2004-08-04 2011-06-22 Amgen, Inc Antibodies to DKK-1
GB0417487D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995024481A2 (en) * 1994-03-10 1995-09-14 Schering Corporation Humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4
US20050069915A1 (en) * 1998-01-15 2005-03-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies that bind human Dickkopf-1 proteins
US6951921B2 (en) * 1998-09-01 2005-10-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2002066509A2 (en) * 2001-02-16 2002-08-29 Genentech, Inc. Treatment involving dkk-1 or antagonists thereof
WO2002086085A2 (en) * 2001-04-24 2002-10-31 Bayer Corporation Human timp-1 antibodies
WO2003070760A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-amyloid beta antibodies and their use
US20050084494A1 (en) * 2003-05-21 2005-04-21 Darwin Prockop Inhibitors of Dkk-1
WO2006017538A2 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Dyax Corp. Hk1-binding proteins
WO2006100582A1 (en) * 2005-03-25 2006-09-28 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules directed to mcsp and having increased fc receptor binding affinity and effector function
WO2007054816A2 (en) * 2005-11-14 2007-05-18 Bioren, Inc. Antibody ultrahumanization by predicted mature cdr blasting and cohort library generation and screening

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALINT R.F. ET AL.: "ANTIBODY ENGINEERING BY PARSIMONIOUS MUTAGENESIS". GENE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 137, no. 1, 27 December 1993 (1993-12-27), pages 109-118, XP002031537, ISSN: 0378-1119, the whole document *
DAVIES J. ET AL.: "Affinity improvement of single antibody VH domains: residues in all three hypervariable regions affect antigen binding". IMMUNOTECHNOLOGY, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS BV, NL, vol. 2, no. 3, September 1996 (1996-09), pages 169-179, XP004070292, ISSN: 1380-2933, the whole document *
HOLT L.J. ET AL.: "Domain antibodies: proteins for therapy". TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE, GB, vol. 21, no. 11, November 2003 (2003-11), pages 484-490, XP004467495, ISSN: 0167-7799, the whole document *
LITTLE M. ET AL.: "Of mice and men: hybridoma and recombinant antibodies". IMMUNOLOGY TODAY, ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE, GB, vol. 21, no. 8, 1 August 2000 (2000-08-01), pages 364-370, XP004215163, ISSN: 0167-5699, the whole document *
YI QING ET AL.: "DKK-1 is a widely expressed, potent tumor-associated antigen in multiple myeloma recognized by cytotoxic T lymphocytes". BLOOD, vol. 106, no. 11, Part 1, November 2005 (2005-11), page 967A, XP002459930 & 47TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN-SOCIETY-OF-HEMATOLOGY; ATLANTA, GA, USA; DECEMBER 10-13, 2005, ISSN: 0006-4971, the whole document *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2740672C2 (ru) * 2015-08-07 2021-01-19 ЭйЭлЭкс Онколоджи Инк. Конструкции, имеющие sirp-альфа домен или его вариант
US11639376B2 (en) 2015-08-07 2023-05-02 ALX Oncology Inc. Constructs having a SIRP-α domain or variant thereof
US11613564B2 (en) 2019-05-31 2023-03-28 ALX Oncology Inc. Methods of treating cancer

Also Published As

Publication number Publication date
CR10128A (es) 2008-08-25
US20120023600A1 (en) 2012-01-26
AU2007207787B2 (en) 2011-03-17
TWI432450B (zh) 2014-04-01
TW200804417A (en) 2008-01-16
MEP1308A (xx) 2010-02-10
SMP200800042B (it) 2009-07-14
GEP20125476B (en) 2012-04-25
SG169327A1 (en) 2011-03-30
US8673306B2 (en) 2014-03-18
ME00010B (me) 2010-06-10
US20140341901A1 (en) 2014-11-20
EP1976594B1 (en) 2015-05-06
US20140170147A1 (en) 2014-06-19
UA101944C2 (ru) 2013-05-27
CU20080133A7 (es) 2012-06-21
PE20120816A1 (es) 2012-08-01
BRPI0706524A2 (pt) 2011-03-29
HK1121420A1 (en) 2009-04-24
AU2007207787A1 (en) 2007-07-26
JP2013099334A (ja) 2013-05-23
PE20071239A1 (es) 2008-02-12
MY153573A (en) 2015-02-27
MA30158B1 (fr) 2009-01-02
ECSP088618A (es) 2008-08-29
JP5552233B2 (ja) 2014-07-16
SV2008002980A (es) 2010-05-21
CN101400406B (zh) 2014-01-29
US9296813B2 (en) 2016-03-29
SMAP200800042A (it) 2008-07-30
KR101413785B1 (ko) 2014-07-09
NZ569555A (en) 2011-12-22
NO20083477L (no) 2008-10-13
WO2007084344A2 (en) 2007-07-26
IL192631A0 (en) 2011-08-01
TNSN08297A1 (en) 2009-12-29
HN2008001104A (es) 2011-06-08
CN101400406A (zh) 2009-04-01
AR060017A1 (es) 2008-05-21
WO2007084344A3 (en) 2008-02-14
JP2009523421A (ja) 2009-06-25
CA2636579A1 (en) 2007-07-26
CU23871B1 (es) 2013-03-27
EP1976594A2 (en) 2008-10-08
EA200801679A1 (ru) 2009-02-27
ZA200805743B (en) 2009-08-26
KR20080085908A (ko) 2008-09-24
IL192631A (en) 2015-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015538B1 (ru) Композиции и способы применения антител к dickkopf-1 и/или -4
US20180230221A1 (en) Methods of Improving or Accelerating Physical Recovery After Surgery for Hip Fracture
CN109111523B (zh) 用于Wnt途径相关疾病的抗体和方法
US20140328848A1 (en) Method for Treating Metabolic Disorders
EA023555B1 (ru) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ c-fms ЧЕЛОВЕКА
EA015584B1 (ru) Антитело к cd38 человека и его применение
EP2282728B1 (en) Modulation of the Vps10p-domain receptors.
EA027071B1 (ru) АНТИТЕЛО К ActRIIB И СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО КОМПОЗИЦИЯ
CN105960414A (zh) 治疗散发性包涵体肌炎的方法
EA018756B1 (ru) Антитела к склеростину, композиции, их содержащие, и их применение
EP3305324A1 (en) Molecules and methods for modulating low-density-lipoprotein receptor-related protein 6 (lrp6)
JP2012526139A (ja) Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１もしくはＤｉｃｋｋｏｐｆ−４または両方に対する結合分子の組成物および使用方法
JP2005530687A (ja) Ｆｇｆｒアゴニスト
US20170318057A1 (en) Modulation of the VPS10P-Domain Receptors for the Treatment of Cardiovascular Disease
TW202210523A (zh) 用於調節骨髓樣細胞發炎表型之抗ｖｓｉｇ４組合物及方法以及其用途
CN102741286B (zh) 以pae技术开发的抗人rankl单抗及其应用
JP2022535550A (ja) 骨髄細胞炎症性表現型を調節するための抗ｐｓｇｌ－１組成物及び方法、ならびにその使用
Ling et al. Shared Epitope–Antagonistic Ligands: A New Therapeutic Strategy in Mice With Erosive Arthritis
Ling et al. Shared epitope antagonistic ligands-a new therapeutic strategy in erosive arthritis
JP2018512394A (ja) 多発性骨髄腫のロネパルスタット併用療法
MX2008008948A (es) Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf-1 y/o -4

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ MD

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KZ KG TJ TM RU