CN101400406A - 使用Dickkopf-1和/或-4抗体的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供结合到蛋白质靶标Dickkopf(DKK1)的抗体和片段，也提供了处理靶标细胞(特别是与骨质溶解性病症相关的细胞)的使用方法和试剂盒。

Description

使用Dickkopf-1和/或-4抗体的组合物和方法
技术领域
本发明涉及使用Dickkopf-1(“DKK1”)抗体、Dickkopf-4(“DKK4”)抗体或其两者的组合物和方法，以治疗DKK异常性相关的骨密度、新陈代谢、糖尿病、癌症等。
背景技术
Wnt信号通路涉及胚胎发育和瘤形成过程的调控。胞外Wnt蛋白质负责许多细胞类型生长和分化，所述生长和分化尤其包括成骨细胞、破骨细胞和脂肪细胞的生长、分化和调节。
许多癌症与骨组织相关，并可导致例如在前列腺癌中发现的那些成骨细胞病变，或例如在肺癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤中发现的那些骨质溶解性损伤(例如，Tian等人，2003 New England J.Med.349：2483-2494)。
Wnt基因家族的成员编码多种发育过程所需的分泌型糖蛋白(Fedi等人，1999 J.Bio.Chem.274：19465-19472)。Wnt家族成员蛋白质启动对成骨细胞生长和分化重要的信号通路，其引起骨沉积。除了骨形成之外，骨再吸收是由称为破骨细胞的细胞执行的进行性正常过程。反之，核因子κB配体的受体活化剂(RANKL)是破骨细胞性骨再吸收的最终介导者，其在绝经后的骨质疏松发病机理中具有重要作用，也在类风湿性关节炎、转移癌、多发性骨髓瘤、芳化酶抑制剂治疗和抗雄激素治疗(androgendeprivation therapy)相关的骨丢失中具有重要作用(参见例如Lewiecki(2006)Expert Opin Biol Ther.6：1041-50)。由成骨细胞表达的护骨蛋白(OPG)抑制RANKL，因而减少破骨细胞活性和形成。合成代谢的骨形成和分解代谢的(analytic)骨再吸收的平衡调节正常骨密度，合成代谢的骨形成和分解代谢的骨再吸收中一个或另一个增加分别导致骨密度增加或骨丢失增加。
Wnt与其他细胞表面蛋白结合并由此发挥作用，并且Wnt信号可促成瘤形成过程。此外，基因改变可影响涉及称为腺瘤结肠息肉的蛋白质β-联蛋白的细胞蛋白质复合体，并且在患有如人结肠癌、黑素瘤和肝细胞癌的患者细胞中已检测到这些复合体，这表明Wnt信号通路的异常与这些以及其他可能的人类癌症的发生有关(Fedi等人，1999 J.Bio.Chem.274：19465-19472)。
至少有两个家族的蛋白质抑制Wnt信号发放，即分泌型卷曲相关家族和Dickkopf(DKK)家族。目前DKK家族包括四个家族成员，即DKK1(人类DNA，登录号NM_12242；PRT，登录号094907)、DKK2(人类，登录号NM_014421；PRT登录号NP_055236)、DKK3(人类，登录号NM_O15881；PRT，登录号AAQ88744)和DKK4(人类，登录号NM_014420；PRT，登录号NP_055235)。
Dickkopf-1(DKK1)是Wnt/β-联蛋白信号通路的分泌型抑制剂。参见例如Niehrs的美国专利申请2005-0079173、McCarthy的美国专利申请2004-0234515。DKK1具有抑制Wnt诱导的轴(axis)复制能力，并且遗传分析显示DKK1向上游抑制Wnt信号发放。暴露于增加水平的DKK1后，对小鸡和小鼠胚胎中骨结构丢失的影响证明DKK1在骨骼发育中也很重要(Tian等人，2003 New England J.Med.349：2483-2494)。增加的DKK1血清水平已与前列腺癌相关，并且在患有多发性骨髓瘤的患者骨髓血浆和外周血中增强的DKK1和RANKL水平与病灶性的骨病变相关，参见例如Tian 2003，OMIM登录号605189。DKK1在脂肪形成、软骨形成、胃肠道上皮增生、风湿症相关的骨丢失和毛囊基板形成的开始中也发挥作用。OMIM登录号605189。
Dickkopf-4(DKK4)未被良好表征但同样是Wnt途径的分泌型抑制剂。已显示DKK4在患有阿尔茨海默病患者的斑点中沉积并且在肌肉中表达。Wnt在肌肉形成中的作用未知，因此本文假定DKK4对肌肉形成具有抑制作用。
需要治疗癌症和骨密度异常的组合物和方法，其包括干扰或中和DKK1和/或DKK4介导的Wnt信号发放的拮抗作用的这类物质。
发明概述
本文本发明的实施方案提供抗体或其选择性结合的抗原结合部分，所述部分中和DKK1和/或DKK4多肽或其片段。在优选的实施方案中，抗体是DKKI/4中和抗体。在多个实施方案中，DKKI/4中和抗体的抗原结合部分未结合DKK2或DKK3。
在一个实施方案中抗体或其抗原结合部分置于免疫球蛋白样支架内，如选自例如人的、人源化的、人改造的(humaneer)、鲨鱼或骆驼支架的构架，所述抗体或其抗原结合部分和/或还可是重组、嵌合或CDR移植的抗体。例如，在本发明中旨在设计使人抗鼠抗体应答最小化的技术(Kalobios的人改造技术或PDL的人源化技术)。此外，DKK1或DKK4特异性的抗原结合部分也可在非免疫球蛋白样支架内，包括例如，置于Adnectin、血纤蛋白原、源自锚蛋白的重复序列等类型的构架内。
在具体实施方案中，DKK1抗体表征为具有特异性靶向蛋白DKK1的抗原结合区，并且该抗体或功能片段结合到DKK1或其片段。在相关的实施方案中，DKK4抗体表征为具有特异性靶向蛋白DKK4的抗原结合区，并且该抗体或功能片段结合到DKK4或其片段。在相关的实施方案中，DKK4抗体表征为具有特异性靶向蛋白DKK4的抗原结合区，并且该抗体或功能片段结合到DKK4或其片段。在优选的实施方案中，抗体或其抗原结合部分结合至DKK1和DKK4多肽，而非DKK2或DKK3多肽。
在另一实施方案中抗体或其抗原结合部分是单克隆的。在另一实施方案中，抗原结合部分是多克隆的。在多个实施方案中，DKK1抗体或其抗原结合部分结合由DKK1或DKK4多肽的30个连续氨基酸组成的肽。
在相关的实施方案中，至少通过下列一种检测来测定对DKK1或DKK4的结合：抑制Wnt信号转录的DKK1或DKK4拮抗作用；表面等离振子共振亲合测定，酶联免疫吸收试验结合；基于电化学发光的结合分析；FMAT、SET、SPR、ALP、TopFlash、生物标志物如人骨钙蛋白(OCN)、前胶原1型含氮前肽(PINP)和护骨蛋白(OPG)的血清浓度，以及结合到细胞表面的受体如Frizzled(Fz)、LRP(LRP5/6)或Kremen(Krm)的血清浓度。在某些实施方案中，DKK1抗体或抗原结合部分具有至少一种以下特性：对DKK1比对人类DKK2或DKK3的选择性至少多103、104或105倍；以小于100nM、50nM、10nM、1.0nM、500pM、100pM、50pM或10pM的Kon结合到DKK1或DKK4；并且具有小于10-2每秒、10-3每秒、10-4每秒或10-5每秒的DKK1解离率(off-rate)。
在相关的实施方案中，本发明的抗体与DKK1和/或DKK4竞争结合LRP5/6。在相关的实施方案中，本发明的抗体与DKK1和/或DKK4竞争结合Krm。
在另一实施方案中，本发明提供任一上述抗体或这些抗体的功能片段的分离的抗原结合区，以及这些区域的氨基酸序列。因此在某些实施方案中，本发明提供选自SEQ ID NO：2-20和SEQ ID NO：40-72的分离的氨基酸序列以及这些序列的保守的或人改造的变体。
此外，在某些其他实施方案中，本发明提供氨基酸序列SEQ ID NO：2-20、65-72，以及这些序列的保守的或人改造的变体，所述氨基酸序列提供各自是H-CDR-3的分离的抗原结合区。
在相关的实施方案中，分离的抗原结合区是具有选自SEQ ID NO：2-20、57-64的氨基酸序列以及这些序列的保守的或人改造的变体的H-CDR2区。在另一相关实施方案中，分离的抗原结合区是描述于选自以下序列的共有H-CDR2区：具有氨基酸序列GISGSGSYTYYADSVKF的SEQ ID NO：40，具有氨基酸序列GISYYGGNTYYADSVKF的SEQ IDNO：41，具有氨基酸序列GISYYGGSTYYADSVKF的SEQ ID NO：42，以及这些序列的氨基酸残基的保守的或人改造的变体。
在某些实施方案中，提供的新序列是SEQ ID NO：2-5、8-11、20、49-56，以及这些序列的保守的或人改造的变体，其提供的分离的抗原结合区是H-CDR1区。
在相关的实施方案中，分离的抗原结合区是具有选自以下氨基酸序列的共有H-CDR1区：氨基酸序列(使用单字母氨基酸代码)GFTFSSYGMT(SEQ ID NO：43)、GFTFNSYGMT(SEQ IDNO：44)、GFTFSNYGMT(SEQ ID NO：45)、GFTFSSYWMT(SEQ ID NO：46)、GFTFSSYAMT(SEQ ID NO：47)、GFTFSSYGMS(SEQ ID NO：48)以及任意这些序列的保守的或人改造的变体。
在另一实施方案中，本发明提供的氨基酸序列是具有L-CDR3区的分离的抗原结合区，例如选自SEQ ID NO：21-39、89-96，以及这些序列的保守的或人改造的变体的氨基酸序列。在另一相关的实施方案中，分离的抗原结合区是具有选自SEQ ID NO：21-39、73-80，以及这些序列的保守的或人改造的变体的氨基酸序列的L-CDR1区。在另一实施方案中，分离的抗原结合区是具有选自SEQ ID NO：21-39、81-88，以及这些序列的保守的或人改造的变体的氨基酸序列的L-CDR2区。
在某些实施方案中，分离的抗原结合区是具有选自SEQ ID NO：21-39，以及这些序列的保守的或人改造的变体的氨基酸序列的可变轻链。
在另一实施方案中，本发明提供选自SEQ ID NO：97-103的核苷酸序列。在相关的实施方案中，每个这些核苷酸序列编码氨基酸序列并且这些编码的氨基酸序列的保守的或人改造的变体也在本发明的范围内。在另一相关的实施方案中，每个SEQ ID NO：97-100的核苷酸序列编码抗原结合轻链。在另一相关的实施方案中，每个SEQ ID NO：101-103的核苷酸序列编码抗原结合重链。在另一相关的实施方案中，在细胞内进一步将这些核酸序列中的每一个最优化以用于表达。优选的细胞包括但不限定于，例如中国仓鼠(如CHO)细胞、杆状病毒、酵母、细菌、骨髓瘤细胞，和/或智人(H.sapiens)。
优选地，将序列进行表达、生产以及临床用途的优化。临床使用优化的特征包括但不限定于，例如，半寿期、药物代谢动力学(PK)、抗原性、效应功能、FcRn清除，以及包括抗体依赖细胞的细胞毒性(ADCC)或补体依赖细胞毒性(CDC)活性的患者应答。
在另一实施方案中，本发明提供具有由选自SEQ ID NO：101-103的核苷酸序列编码的重链的分离的抗原结合区。在相关的实施方案中，本发明提供具有由选自SEQ ID NO：97-100的核苷酸序列编码的轻链的分离的抗原结合区。在另一相关的实施方案中，本发明提供具有由选自SEQ ID NO：97-100的核苷酸序列编码的轻链，以及由选自SEQ ID NO：101-103的核苷酸序列编码的重链的分离的抗原结合区。
在某些实施方案中，本发明提供选自SEQ ID NO：104-110的核苷酸序列。在相关的实施方案中，这些核苷酸序列中的每一个编码氨基酸序列，并且本文这些氨基酸序列保守的或人改造变体也在本发明的范围内。在另一相关的实施方案中，SEQ ID NO：104-107的核苷酸序列中的每一个编码抗原结合轻链。在另一相关的实施方案中，SEQ ID NO：108-110的核苷酸序列中的每一个编码抗原结合重链。在另一相关的实施方案中，将这些核苷酸序列中的每一个进行表达和/或临床用途的优化。
在另一实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有由选自SEQ ID NO：108-110的核苷酸序列编码的重链。在另一相关的实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有由选自SEQ ID NO：104-107的核苷酸序列编码的轻链。在另一相关的实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有由选自SEQ ID NO：104-107的核苷酸序列编码的轻链，以及由选自SEQ ID NO：108-110的核苷酸序列编码的重链。
在另一实施方案中，本发明提供选自SEQ ID NO：111-117的氨基酸序列，并且提供这些序列的保守变体。在相关的实施方案中，每一SEQ ID NO：111-114描述抗原结合轻链。在另一实施方案中，每一SEQ ID NO：115-117描述抗原结合重链。在另一相关的实施方案中，将氨基酸序列进行表达和/或临床用途的优化。
在另一实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有描述于选自SEQ ID NO：115-117的氨基酸序列中的重链，并且提供这些序列的保守变体。在相关的实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有描述于选自SEQ ID NO：111-114的氨基酸序列中的轻链，并且提供这些序列的保守变体。在另一相关的实施方案中，本发明提供分离的抗原结合区，其具有描述于选自SEQ ID NO：115-117的氨基酸序列中的重链(并且提供这些序列的保守变体)，以及描述于选自SEQ ID NO：111-114的氨基酸序列中的轻链(并且提供这些序列的保守变体)。
在另一实施方案中，本发明提供选自SEQ ID NO:120-121的核苷酸序列，和/或分离的抗原结合区，其具有由各核苷酸序列编码的轻链或重链可变区。在相关的实施方案中，每个这些核苷酸序列编码氨基酸序列，并且这些氨基酸序列的保守的或人改造的变体也在本发明的范围内。在另一相关的实施方案中，核苷酸序列SEQ ID NO：120编码抗原结合轻链。在另一相关的实施方案中，核苷酸序列SEQ ID NO：121编码抗原结合重链。在另一相关的实施方案中，进一步将每个这些核苷酸序列进行表达和/或临床用途的优化。
在某些实施方案中，本发明提供选自118-119的氨基酸序列以及这些序列的保守的或人改造的变体。在相关的实施方案中，SEQ ID NO：118描述轻链的抗原结合可变区。在另一相关的实施方案中，SEQ ID NO：119描述重链的抗原结合可变区。在另一相关的实施方案中，将氨基酸序列进行表达和/或临床用途的优化。
在另一实施方案中，本发明提供与描述于SEQ ID NO：2-39的CDR区具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。在相关的实施方案中，本发明提供与描述于SEQ ID NO：111-120的序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。在另一相关的实施方案中，本发明提供与描述于SEQ ID NO：97-110和120-121中的序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％同一性的核苷酸序列。
在某个实施方案中，任一上述分离的抗体都是IgG。在相关的实施方案中，任一上述分离的抗体都是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在另一实施方案中，抗体是IgE、IgM、IgD或IgA。在相关的实施方案中，本发明选自单克隆抗体组合物或多克隆抗体组合物。在另一实施方案中，抗体是嵌合的、人源化的、人改造的、重组的等。在另一实施方案中，本发明提供具有DKK1表位特异性的抗原结合区的分离的人或人源化抗体或其功能片段，并且所述抗体或功能片段结合DKK1或DKK4，或阻止DKK1或DKK4结合细胞表面受体(例如受体如LRP5/6，Kremen，Frizzled)。在某些实施方案中抗体或其片段预防、治疗或改善骨质溶解性损伤的发展。在其他实施方案中，本发明的抗DKK组合物预防、治疗或改善DKK1或DKK4相关的癌症或疾病。
在相关的实施方案中，本发明提供分离的人或人源化抗体或其功能片段，具有靶向DKK1或DKK4的表位的特异性抗原结合区，并且该表位包含来自多肽片段的六个或更多个氨基酸残基，所述多肽片段含有DKK1和/或DKK4的CYS1-交联(linker)-CYS2结构域。在相关的实施方案中，表位是构象表位。在优选的实施方案中，表位存在于CYS2结构域内。在具体实施方案中，表位包括修饰的氨基酸残基。在相关的实施方案中，表位包含至少一个糖基化的氨基酸残基。
功能片段包括Fv和Fab片段(包括单链型，如scFv)，以及抗体的其他抗原结合区，所述抗体包括那些连接到非免疫球蛋白支架的抗体、重链抗体如骆驼和鲨鱼抗体，以及纳米抗体(nanobody)。在相关的实施方案中，上述分离的抗体是IgG。在另一相关的实施方案中，上述分离的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在另一实施方案中，抗体是IgE、IgM或IgA。在相关的实施方案中，本发明是多克隆抗体组合物。
在另一实施方案中，本发明提供药物组合物，其具有至少一个任一上述抗体或功能片段或保守变体，以及可药用载体或赋形剂。
在另一实施方案中，本发明提供转基因动物，其具有编码任一上述抗体或其功能片段的基因。
在某些实施方案中，本发明提供治疗与DKK1或DKK4表达相关的障碍或病症的方法。本文所用的“DKK1相关疾病”或“DKK4相关疾病”包括但不限定于，骨质溶解性损伤，特别是与骨髓瘤(尤其是多发性骨髓瘤)相关的骨质溶解性损伤，或与骨癌、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌、上皮癌、食道癌、脑癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌或其转移瘤相关的骨质溶解性损伤；与移植相关的骨丢失。另外的疾病或障碍包括但不限定于，例如，骨肉瘤、前列腺癌、肝细胞癌(HCC)、骨髓瘤包括多发性骨髓瘤、糖尿病、肥胖症、肌萎缩、阿尔茨海默病、骨质疏松症、骨质减少、风湿病、结肠炎和/或不希望的脱发。该方法涉及在受试者需要时向其施用有效量的任一上述药物组合物。
在相关的实施方案中，待治疗的障碍或病症是骨密度异常性。在另一相关的实施方案中，待治疗的骨密度异常性是受试者中骨质溶解性损伤的存在。
在另一实施方案中，待治疗的障碍或病症是骨质疏松病症，如与癌症相关的骨质溶解性损伤。在相关的实施方案中，治疗的癌症是骨髓瘤，如多发性骨髓瘤，或骨癌、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌、上皮癌、食道癌、脑癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌或其转移瘤。在另一实施方案中，骨质疏松病症是骨质疏松症或骨质减少或骨肉瘤。
在某些实施方案中，任一上述方法还涉及施用化疗物质。在相关的实施方案中，化疗物质是抗癌物质。在另一相关的实施方案中，化疗物质是抗骨质疏松物质。
在另一实施方案中，本发明提供处理靶细胞的方法，该方法包括以任一上述抗体或其功能片段阻碍DKK1或DKK4与细胞的相互作用。通常，靶细胞具有结合DKK1或DKK4的受体。在一个实施方案中，靶细胞是成骨细胞，其中以本发明的中和抗DKK1/4组合物进行处理将增加增殖并刺激骨形成。在一个实施方案中，靶细胞是肌细胞，其中处理将阻碍肌萎缩。
在相关的实施方案中，本方法还涉及以化疗物质或辐射处理具有靶细胞的患者。在相关的实施方案中，施用或接触后，上述任一方法还包括观察骨质溶解性损伤发展的改善或延缓。
在另一实施方案中，本发明提供识别血清中DKK1或DKK4的方法。该方法涉及以另外具有可检测标记的任一上述抗体或抗体片段检测DKK1或DKK4。该标记是放射性的、荧光的、磁性的、顺磁性的或化学发光的。
在另一实施方案中，任一上述人或人源化抗体或抗体片段都是合成的。
在另一实施方案中，本发明提供任一上述抗体或这些抗体的功能片段以及其他治疗物质的药物组合物。其他治疗物质可选自抗癌物质、抗骨质疏松物质、抗生素、抗新陈代谢物质、抗糖尿病物质、抗炎症物质、抗血管生成物质、生长因子和细胞因子。
本发明还涉及以药物组合物在哺乳动物特别是人类中预防或治疗增殖性疾病或诸如癌症的疾病的方法，其中所述组合物包括：
(a)本发明的DKK1/4中和物质；和
(b)一种或多种药物活性物质；
其中至少一种药物活性物质是抗癌治疗剂。
本发明还涉及药物组合物，其包括：
(a)DKK1/4中和抗体；
(b)药物活性物质；和
(c)可药用载体；
其中至少一种药物活性物质是抗癌治疗剂。
本发明还涉及商业性包装或产品，其包括：
(a)DKK1/4中和抗体的药物制剂；和
(b)用于同时、并列、分别或顺次使用的药物活性物质的药物制剂；其中至少一种药物活性物质是抗癌治疗剂。
在某一实施方案中，本发明提供抗体，其具有选自SEQ ID NO：2-20的重链的第一氨基酸序列(其CDR区与具有SEQ ID NO：2-20的CDR区具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％序列同一性)，以及选自SEQ ID NO：21-39的轻链的第二氨基酸序列(其CDR区与SEQ IDNO：21-39所示的CDR区具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％序列同一性)。
在另一实施方案中，本发明提供免疫连接物，其由为上述抗体或片段的第一成分，和含有第二氨基酸序列的第二成分制成。例如，免疫连接物是细胞毒素，或者免疫连接物是结合蛋白或具有不同于DKK1或DKK4的靶标结合特异性的抗体。例如，不同于DKK1或DKK4结合特异性的靶标是癌细胞表面上的肿瘤抗原或肿瘤相关蛋白质。
在某些实施方案中，本发明提供任一上述抗体作为双重特异性抗体。
在另一实施方案中，本发明提供含有任一上述抗体或抗体片段的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒另外包含可药用载体或赋形剂。在另一相关的实施方案中，试剂盒中任一上述抗体以单位剂量存在。在另一实施方案中，试剂盒是ELISA诊断试剂盒。在相关的实施方案中，试剂盒包括向受试者施用任一上述抗体的说明书。
附图简述
图1图示当未洗涤的小珠与那些不同
Figure A200780009135D0019141858QIETU
严格性洗涤的小珠相比，Strep-Tactin包被的小珠中His-Strep标记的DKK1无明显损失。
图2条形图示实施例3提供的使用100μl明亮荧光素酶试剂的Wnt活性试验结果。
图3图示酶联免疫吸附试验(ELISA)。荧光在TECAN Spectrafluor平板读数仪中测定并且显示结合曲线。
图4图示实施例6提供的标准Wnt3a依赖性TCF/LEF luc报告基因试验。
图5图示TCF/LEF luc报告基因试验的改良版本，显示由Kremen共同受体蛋白的共表达介导的对DKK1灵敏性的高度提高。
图6A图示结合到DKK1的抗DKK1/4抗体的表面纤维蛋白溶酶共振测量法。图6B是计算出的结合亲和力和动力学值的列表。
图7A图示用于表位作图的全长和截短的DKK1。图7B描述本发明抗体与图7A的DKK1蛋白质和片段的结合。
图8图示在竞争性ELISA试验中DKK1/4抗体结合。
图9图示Wnt调节基因转录下游DKK1/4抗体相关的再激活。
图10图示DKK1/4抗体逆转DKK1抑制的ALP分泌。
图11图示DKK1/4抗体对异种移植的体内影响。
图12图示体内DKK1/4抗体相关的骨密度增加。
图13图示比较唑来膦酸(Zometa)与DKKI/4抗体的抗溶骨效应。
图14图示DKKI/4抗体对骨合成代谢的剂量依赖效应。
发明详述
本发明涉及分离的DKK1/4抗体，特别是人抗体，其特异性结合DKK1或DKK4并抑制DKK1或DKK4的功能性质的。在优选的实施方案中，DKK1/4抗体不特异性结合DKK2或DKK3。在某些实施方案中，本发明的抗体衍生自特定重链和轻链序列，和/或包括特定结构特征，如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供分离的抗体、制备这类抗体的方法、免疫连接物和包括这些类抗体的双特异性分子以及包含抗体的药物组合物、本发明的免疫连接物或双特异性分子。本发明也涉及使用抗体以抑制与DKK1或DKK4相关的障碍或病症的方法。预期的疾病和障碍包括但不限定于，骨质溶解性损伤，特别是与骨髓瘤(特别是多发性骨髓瘤)相关的骨质溶解性损伤，或与骨癌、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌、上皮癌、食道癌、脑癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌或其转移瘤相关的骨质溶解性损伤；与移植相关的骨丢失。其他的疾病或障碍包括但不限定于，例如，骨肉瘤、前列腺癌、肝细胞癌(HCC)、包括多发性骨髓瘤的骨髓瘤、糖尿病、肥胖症、肌萎缩、阿尔茨海默病、骨质疏松症、骨质减少、风湿病、结肠炎和/或不希望的脱发。
以便更易于理解本发明，首先定义某些术语。在详述描述中列出其他定义。
术语“免疫应答”指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致选择性损害、破坏或从人体清除侵入性病原体、受病原体感染的细胞或组织、癌性细胞，或者(在自身免疫或病理炎症的情况下)正常人细胞或组织。
“信号转导途径”指多种信号转导分子之间的生物化学关系，所述分子在信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中起作用。本文所用的短语“细胞表面受体”包括例如，分子或分子复合体，其能够接受信号并且能够将这种信号经细胞的质膜传递。本发明的“细胞表面受体”的实例是DKK1或DKK4蛋白质分子结合的受体。这类细胞表面受体包括但不限定于Frizzled(Fz)、LRP(LRP5和LRP6)和Kremen(Krm)。
本文所用的术语“抗体”指多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体及其片段如Fab、F(ab)2、Fv，以及保留母体抗体的抗原结合功能的其他片段。同样地，抗体可指免疫球蛋白或糖蛋白，或其片段或部分，或指包括修饰的免疫球蛋白样构架内包含的抗原结合部分的结构，或指包含非免疫球蛋白样构架或支架的结构内包括的抗原结合部分。
本文所用的术语“单克隆抗体”指含有同源抗体群体的抗体组合物。该术语未限定关于抗体的种类或来源，也未旨在由制备的方式所限定。该术语包括全部免疫球蛋白以及片段如Fab、F(ab)2、Fv，以及保留抗体的抗原结合功能的其他片段。在本发明中可使用任一哺乳动物种类的单克隆抗体。然而，由于大鼠或鼠细胞系在用于制备产生单克隆抗体所需的杂交细胞系或杂交瘤中的实用性，抗体一般将是大鼠或鼠源性的。
本文所用的术语“多克隆抗体”指含有异源抗体群体的抗体组合物。多克隆抗体常源自免疫动物或所选人类的混合血清。
本文所用的短语“单链抗体”指通过测定结合抗体的结合结构域(重链和轻链)，以及提供允许保持结合功能的连接部分制备的抗体。实质上，这形成仅具有结合抗原所需可变结构域的部分的极短缩抗体。单链抗体的测定和构建描述于Ladner等人的美国专利号4,946,778。
“天然存在的抗体”是是糖蛋白，其包含通过二硫键连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(本文中简写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中简写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。可以将VH和VL进一步细分为高变区，称作互补决定区(CDR)，其散布着更保守的称作构架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个DR组成，它们从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗原部分”)指结合靶标的蛋白质序列，例如一个或多个CDR。它包括例如，全长抗体、一个或多个抗体片段，和/或保留抗原(如DKK1)特异性结合能力的非免疫球蛋白相关的支架上的CDR。抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”内包括的结合片段的实例包括Fab片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段、包含通过二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)；和分离的互补决定区(CDR)。
本文所用的“抗原”或“表位”可互换使用，指靶蛋白上的多肽序列，所述靶蛋白由抗体、抗体片段或其等价体的抗原结合部分特异识别。抗原或表位包括在靶序列内连续或非连续的至少六个氨基酸。构象表位可包括非连续残基，并且任选可包括天然或人工修饰的氨基酸残基。对残基的修饰包括但不限定于，磷酸化、糖基化、聚乙二醇化、泛素化、呋喃化等。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以用重组方法通过合成接头连接，所述接头使得它们成为一条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，1988 Science 242：423-426；和Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。此类单链抗体意在被术语抗体的“抗原结合部分”包括。使用本领域技术人员已知的常规技术得到这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。
如本文描述的，保守变体包括任一鉴定的氨基酸序列中的氨基酸残基，特别是蛋白质工程领域任一普通技术人员众所周知的保守改变。
本文所用的“分离的抗体”指指抗体，其基本上没有具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，特异结合DKK1的分离的抗体基本上无特异结合不同于DKK1的抗原的抗体)。然而，特异结合DKK1的分离的抗体可以与其他抗原，如来自其他物质的DKK1分子，或其他家族成员如DKK4或相关的侧向同源物具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上无其他细胞物质和/或化学品。
本文所用的术语“人抗体”意在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区都来自人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，那么该恒定区也来自此类人序列，例如，人种系序列，或者人种系序列的突变形式。本发明的人抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)。然而，如本文所用的术语“人抗体”不意在包括这样的抗体，其中来自另一哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已经被嫁接到人构架序列上。
术语“人单克隆抗体”指显示出单结合特异性的抗体，其具有可变区，其中构架区和CDR区都来自人序列。在一个实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，杂交瘤包括来自转基因非人动物，例如转基因小鼠的B细胞，其具有包含与永生细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
本文所用的术语“人源化抗体”指衍生自人类免疫球蛋白序列的免疫球蛋白构架区的至少一部分。已移植到人类构架序列上的“人源化”抗体如具有CDR序列的抗体源自其他物种的种系，特别是哺乳动物种如小鼠。实技术例包括PDL的人源化技术。
本文所用的术语“人改造的抗体”指结合相同表位但序列不同的抗体。技术实例包括通过Kalobios的人改造技术制备的人改造抗体，其中抗原结合区序列是源于例如突变而非源于保守性氨基酸取代。
本文所用的术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如从对于人免疫球蛋白基因为转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体，从被转化而表达人抗体的宿主细胞分离的抗体，例如，从转染瘤分离的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，和通过涉及将人免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接成其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中构架区和CDR区来自人种系免疫球蛋白序列。然而，在一些实施方案中，此类重组人抗体可以进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其尽管来自并且涉及人种系VH和VL序列，但是可以不天然在体内存在于人抗体种系所有组成成分。
本文所用的“同种型”指重链恒定区基因提供的抗体类别(例如IgA、IgD、IgM、IgE、IgG如IgG1、IgG2、IgG3或lgG4)。
短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。本文所用的“特异性结合人DKK1”的抗体意指以5 x 10-9M或更小、2 x 10-9M或更小，或1 x 10-10M或更小的KD结合到人DKK1的抗体。“与不同于人DKK1的抗原交叉反应”的抗体意指以0.5 x 10-8M或更小、5 x 10-9M或更小，或2 x 10-9M或更小的KD结合该抗原的抗体。“不与特定抗原交叉反应”的抗体意指以1.5 x 10-8M或更大，或5-10 x 10-8M或1 x 10-7M或更大的KD结合该抗原的抗体。在某些实施方案中，不与所述抗原交叉反应的此类抗体在标准结合测定中显示出对于这些蛋白质的基本上检测不到的结合。
本文所用的“抑制DKK1结合细胞表面受体”的抗体如LRP、Fz或Krm，指以1nM或更小，0.75nM或更小，0.5nM或更小，或0.25nM或更小的K抑制DKK1结合受体的抗体。
本文所用的“骨质溶解”指骨密度的减少，其可能由于多种作用机理，包括例如，减少的成骨细胞活性、增加的破骨细胞活性。骨质溶解因此包含通常影响骨矿物质密度的机理。本文所用的“抑制骨溶解活性”的抗体意指通过增加骨形成或阻碍骨再吸收来抑制骨密度损失的抗体。
本文所用的术语“Kassoc”或“Ka”意指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语＂Kdis＂或＂KD，＂意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用的，术语＂KD＂意指解离常数，其从Kd与Ka的比(即Kd/Ka)得到并且表达为摩尔浓度(M)。可以使用本领域成熟的方法测定抗体的KD值。用于测定抗体KD的方法是通过使用表面等离振子体共振，或者使用生物传感器系统，如
Figure A200780009135D0025142239QIETU
系统。
本文所用的术语“亲和力”指在单个抗原位点上抗体和抗原之间相互作用的强度。在每一抗原位点，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在多位点相互作用；相互作用越强，亲和力越强。
本文所用的术语“抗体亲抗原性”指抗体-抗原复合物全部的稳定性或强度的信息度量。它由三种主要因素调节：抗体表位亲和力；抗体和抗原的效价；以及相互作用部分的结构排列。最终这些因素限定抗体的特异性，即特定抗体结合到精确的抗原表位的可能性。
为获得更高抗体亲抗原性探针，可构建二聚缀合物(连结FACS标记的两分子JWJ-1)，从而使得低亲和力相互作用(如与种系抗体)通过FACS更易检测到。此外，增加结合抗原的抗体亲抗原性的其他方法包括产生DKK1或DKK4抗体的任一本文描述的纤连蛋白结构的二聚体或多聚体。可通过各个分子间的共价结合产生这类多聚体，例如，通过模拟天然C至N端结合或通过模拟经其恒定区保持在一起的抗体二聚物。设计进入Fc/Fc界面的键可以是共价的或非共价的。此外，在DKK1或DKK4杂化物中可使用不同于Fc的二聚化或多聚化配偶体以创建这种更有序的结构。
本文所用的术语“交叉反应”指抗体或抗体群体结合其他抗原表位。这可由抗体的低抗体亲抗原性或特异性，或由具有同样或非常相似表位的多个不同抗原引起。当需要大体结合到抗原相关组时，或当抗原表位序列在进化中不是高度保守而尝试跨种标记时，交叉反应有时是所期望的。
本文所用的术语IgG抗体的“高亲和力”或“高特异性”指对靶抗原具有10-8M或更小、10-9M或更小，或10-10M或更小的KD的抗体。然而，“高亲和力”结合可因其他抗体同种型而不同。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合指具有10-7M或更小，或10-8M或更小的KD的抗体。
本文所用的术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。。
本文所用的术语“优化”指已被改变成此类氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列使用在产生的细胞或有机体中优选的密码子，和/或已被改变成除去潜在的剪接供体或剪接受体位点的核酸序列。对于多种物种的优化的密码子表是本领域众所周知的。剪接供体或受体位点的序列也是本领域公知的并且潜在的剪接位点可通过例如分析转录或表达数据来鉴定。产生的细胞包括但不限定于，原核细胞，例如像杆状病毒或细菌(大肠杆菌(E.coli))的原核细胞，或真核细胞，例如酵母(如毕赤酵母(Pichia))、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、骨髓瘤细胞或人细胞。将优化的核苷酸序列设计成完全保留或尽可能多地保留由也被认为是“母本”序列的启动核苷酸序列最初编码的氨基酸序列和残基数。本文已将优化序列设计成具有在产生的细胞中优选的密码子，然而本文也预见其他真核或原核细胞中这些序列的优化表达。优化核苷酸序列编码的氨基酸序列任选称为优化的。
在相关的实施方案中，本发明的中和抗-DKK1/4组合物的多肽序列以及编码它们的核苷酸优选进行生产和临床用途的优化。临床使用优化的特征包括但不限定于，例如，半寿期、药物代谢动力学(PK)、抗原性、效应功能、FcRn清除，以及包括抗体依赖细胞的细胞毒性(ADCC)或补体依赖细胞毒性(CDC)活性的患者应答。
本文所用的“DKK1相关的疾病”或“DKK4相关的疾病”包括但不限定于，骨质溶解性损伤，特别是与骨髓瘤(特别是多发性骨髓瘤)相关的骨质溶解性损伤，或与骨癌、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌、上皮癌、食道癌、脑癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌或其转移瘤相关的骨质溶解性损伤；与移植相关的骨丢失。其他的疾病或障碍包括但不限定于，例如，骨肉瘤、前列腺癌、肝细胞癌(HCC)、包括多发性骨髓瘤的骨髓瘤、糖尿病、肥胖症、肌萎缩、阿尔茨海默病、骨质疏松症、骨质减少、风湿病、结肠炎和/或不希望的脱发。
本文所用的“治疗”是以预防发展或改变障碍的病状为目的进行的干预。因此，“治疗”指治疗性处理和预防或预止性。需要治疗的个体包括患有障碍的个体以及待预防障碍的个体。在肿瘤(如癌症)治疗中，治疗剂可直接减少肿瘤细胞的病状，或通过其他的治疗剂如辐射和/或化学疗法使肿瘤细胞更易治疗。癌症的“病状”包括危害患者健康的所有现象。这非限定地包括异常或无法控制的细胞生长、转移、干扰邻近细胞的正常功能、异常水平释放细胞因子或其他分泌产物、炎症或免疫应答的抑制或恶化等。
患有临床疾病、生物化学疾病、放射性疾病或主观疾病(如骨质溶解)的患者治疗，可包括减轻一些或全部这类症状或减少患病诱因。
通常，本发明的中和抗-DKK1/4组合物预防、治疗或改善与DKK1、DKK4或该两者有关，而不是与DKK2、DKK3或Wnt途径的其他调节剂有关的Wnt相关疾病。
本发明的多个方面进一步详细描述于下面部分。
Wnt途径是充质干细胞(MSC)分化成成骨细胞的主要调节因子。它也是活性成骨细胞的重要存活因子。Dickkopf-1(DKK1)是主要在成人骨中表达的Wnt途径拮抗物并且在患有骨质溶解性损伤的骨髓瘤患者中被增量调节。中和抗-DKK1/4的抗体确切地是同化剂，其通过增加成骨细胞的活性同时减少破骨细胞活性来起作用。相反，目前的药物如作为同化剂销售的PTH，实际上增加了成骨细胞和破骨细胞相关的标记。
本发明提供的是选择用于结合DKK1的多克隆和单克隆抗体。优选的抗体具有针对人DKK1小于10pM的亲和力。在某些实施方案中，抗DKK1抗体与DKK4(Kd～300pM)而不与DKK2交叉反应(进行中的亲和力分析)。
将抗-DKK1或抗-DKK4抗体的优选表位定位到Cys-2结构域(第189-263位氨基酸)，其被认为负责LRP6和Kremen的结合。在一个实施方案中，该表位包括DKK1或DKK4多肽的Cys-2结构域的至少六个且至多三十个氨基酸残基。在某一实施方案中，表位包括至少六个连续的氨基酸的一段序列。在另一实施方案中，优选的结合位点是非线性的，即包括非连续性的氨基酸残基。在某些实施方案中，结合取决于N-糖基化。仅仅预知Cys-2结构域中的残基256处的一个N-糖基化位点。
在本发明中，中和抗-DKK1/4抗体在ELISA和细胞表面结合试验中阻碍DKK1与LRP6的相互作用。如所预期的，其在体外以低于1nM的EC50有效中和DKK1的Wnt抑制活性。
在成骨细胞分化的体外模式中，用Wnt3A处理小鼠10T1/2细胞以刺激成骨细胞活性标记物碱性磷酸酶(AP)的分泌。在该模型中DKK1阻碍AP产生并且本发明的抗体充分逆转该抑制作用。
在某些实施方案中，本发明的抗体在小鼠中显示剂量线性药物代谢动力学(AUC)，在小鼠中剂量超过20-200μg/小鼠时具有35-96小时的剂量依赖性终末半寿期。
使用溶骨性前列腺肿瘤转移的胫骨内模型，本发明的抗体抑制肿瘤诱导的骨皮质损伤。在该模型中通过肿瘤移植和虚拟移植对骨造成机械损伤的观测不能区分对骨小梁的影响，其导致在随后重塑的编织骨的初始增加，因此引起表观骨容量的减少。在某一实施方案中，本发明的抗体在肿瘤和虚拟移植的胫骨中增加编织骨的产生，并且抑制伴随重塑的骨容量的减少。
在相关的实施方案中，使用骨标记物的改变(骨钙蛋白、sRANKL、OPG、AP、TRAP)来说明本发明抗体对骨相关疾病的临床效果，并以药物有效水平的本文提供的中和抗DKK1抗体预测治疗的临床结果。Krm在与LRP大约同样的区域结合DKK。经由DKK与LRP相互作用的Wnt信号抑制需要Krm。Krm-DKK-LRP联合以便内在化用于Wnt途径失活。
本发明的中和抗-DKK1/4组合物优选结合DKK1或DKK4，阻碍它们与LRP和/或Krm的相互作用，从而在Wnt信号途径中中和DKK1或DKK4效应。Wnt途径再活化仅仅发生在DKK1和/或DKK4受限制处。
评估抗体与不同种类DKK1结合能力的标准试验是本领域公知的，包括例如，ELISA、western印迹和RIA。合适的试验详细描述于实施例中。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可通过本领域公知的标准试验来评估，例如通过Biacore分析、BioVeris SET试验、FMAT、化学发光和/或SPR试验——信号抑制或释放试验。评估抗体对DKK1功能性质的影响的试验进一步详细描述于实施例中。
因此，“抑制”依据本领域公知并描述于本文的方法学测定的一种或多种这些DKK1功能性质(例如，生物化学活性、免疫化学活性、细胞活性、生理学活性或其他生物学活性)的抗体，将被认为与相对于缺乏抗体时(例如，或当无相关特异性的对照抗体存在时)所显示的特定活性的统计学显著降低相关。抑制DKK1活性的抗体影响这类统计学显著降低至少10％的测量参数，至少50％、80％或90％，并且在某些实施方案中本发明抗体可抑制大于95％、98％或99％的DKK1功能性活性。
Dickkopf家族成员
适当的骨代谢包括调节途径的复杂网络以及成骨细胞、破骨细胞和周围基质间的相互联系。这些调节机制中的不平衡涉及溶骨病症，例如骨质疏松症、肿瘤诱导的骨质溶解性损伤、肾和肝移植诱导的骨丢失，以及抗激素化学疗法诱导的骨丢失。这些病症可具有严重症状包括骨痛、骨折、脊椎压缩和灵活性降低。批准的或目前临床评估中的大多数治疗通过抑制破骨细胞功能而产生显著效果。例如，二磷酸盐类如唑来膦酸(Zometa)是治疗的现行标准并且通过抑制破骨细胞的功能和存活而起作用。虽然二磷酸盐类通常有效时，某些患者无法有效应答或由于肾毒性或骨坏死而停止使用[Markowitz 2003][Ruggiero 2004]。另外，有靶向破骨细胞发育的多种试验药物如RANKL和M-CSF中和抗体，或靶向破骨细胞功能的多种试验药物如组织蛋白酶K抑制剂。
成骨细胞活性的刺激将提供新机制以治疗溶骨性疾病。Wnt途径在成骨细胞分化和活性中起重要作用，而作为拮抗剂的Dickkopf(DKK)家族已被特别鉴定作为该过程的体外关键调节因子(参见综述[Krishnan 2006])。在体外，Wnt是必需的成骨细胞存活和分化因子。Wnt途径作用的临床确认由Wnt途径共受体LRP5中的突变来提供。LRP5中的失活突变导致骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征(OPPG)[Ai 2005]，而激活突变导致高的骨量[Boyden 2002]。这些激活突变发现于细胞外结构域并已证实可削弱对Wnt拮抗剂Dickkopf(DKK)家族的结合。
已报道DKK1在患有骨病变患者的骨髓瘤细胞中过表达，但在正常浆细胞或未患骨病变患者的浆细胞中缺失[Tian 2004][Politou 2006]。这种骨髓瘤细胞的DKK1过表达可通过阻碍成骨细胞分化从而促进骨再吸收而扰乱成骨细胞和破骨细胞间的正常平衡。此外，已报道用于骨髓瘤的某些抗癌治疗如地塞米松可增量调节DKK1[Ohnaka 2004]。因此，抗DKK1中和抗体应当允许骨质溶解性损伤中Wnt途径的再激活，而不影响DKK1水平相对低或其他拮抗剂占优势的其他组织中的Wnt信号发放。成人中，已报道DKK1仅在骨中高量表达[Li 2006]，显示DKK1在调节成人骨代谢中的持续作用。
转基因小鼠在乳房组织中过表达Wnt促进乳腺癌[Tsukamoto 1988]并且约90％的人类结直肠癌在Wnt途径的两种细胞质成分APC或β-联蛋白中具有突变[Morin 1997][Rowan 2000]。这种证据引起对Wnt途径的激活可能是增加肿瘤发生和进展的风险的关注。另外，DKK在结直肠肿瘤和黑素瘤中是减量调节的，这显示潜在的肿瘤抑制作用。
本发明的DKK多肽包括DKK1(SEQ ID NO：1)和DKK4(SEQ ID NO：124)，以及DKK2(SEQ ID NO：122)和DKK3(SEQ ID NO：123)。DKK家族成员具有示于表A-DKK1家族成员集(pileup)中的两个CYS结构域(CYS1和CYS2)。DKK蛋白质包含酸性N端信号肽、由分枝连接区(divergent linker region)隔开的含半胱氨酸残基簇的两个CYS结构域，以及潜在的C末端N糖基化位点。DKK4中的CYS2结构域具有可在质膜上促进WNT/DKK相互作用的脂质结合功能。OMIM登录号605417。
Figure A200780009135D00311
抗DKK1和DKK4的抗体
在优选的实施方案中，本发明的抗体对人DKK蛋白质有特异性。在进一步优选的实施方案中，本发明的抗体
DKKI或DKK4中和抗体与肿瘤诱发相关的Wnt途径修饰不同。Wnt途径由细胞外配基、受体和仅DKK1是拮抗物的复杂网络调节。由于成人中DKK1的限制性表达及其与其他Wnt拮抗物的功能冗余，中和DKK1的抗体不太可能引起Wnt信号发放或所致的肿瘤发生的广泛激活。这另外由两个观察所支持：首先，激活的LRP5突变(抑制DKK结合)诱导高骨量表现型但没有明显增加癌症风险[Moon 2004]，而DKK1杂合裸细胞或双脊小鼠(Doubleridge mice)具有降低的DKK1水平、高骨量表现型，但未报到具有增加的肿瘤形成概率[MacDonald 2004]。
抗DKK1抗体应确实影响骨髓瘤诱导的溶骨性疾病而不增加产生(denovo)肿瘤发生的风险。期望与抗肿瘤化学疗法以及可能与抑制破骨细胞功能的抗骨再吸收药物组合使用这类抗体。
多克隆抗体
本发明抗体可以是多克隆抗体，特别是人多克隆抗体。多克隆来自免疫动物或选择的人的混合血清。
单克隆抗体
本发明的抗体是如实施例1-8所述的分离的和结构表征的人单克隆抗体。所述抗体的VH氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：2-20。所述抗体的VL氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：21-39。
可将抗体的VH氨基酸序列优化，例如示于SEQ ID NO：119中的序列，以用于在哺乳动物细胞中表达。可将抗体的VL氨基酸序列优化，例如示于SEQ ID NO：118中的序列，以用于在哺乳动物细胞中表达。同样，可将序列优化用于在例如酵母、细菌、仓鼠和其他细胞中表达，这取决于优选的特征优化表达系统。本发明的其他抗体包括已经被突变，然而在CDR区中与上述序列中描述的CDR区具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸。
另外，全长轻链母本核苷酸序列示于SEQ ID NO：97-100中。全长重链母本核苷酸序列示于SEQ ID NO：101-103中。优化用于在哺乳动物细胞中表达的全长轻链核苷酸序列示于SEQ ID NO：104-107中。优化用于在哺乳动物细胞中表达的全长重链核苷酸序列示于SEQ ID NO：108-110中。由优化的轻链核苷酸序列编码的全长轻链氨基酸序列示于EQ ID NO：111-114中。由优化的重链核苷酸序列编码的全长重链氨基酸序列示于EQID NO：115-117中。本发明的其他抗体包括已经被突变，然而与上述序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸或核苷酸。
因为这些抗体的每一种都可以结合DKK1，所以，可以将VH、VL序列、全长轻链和全长重链序列(核苷酸序列和氨基酸序列)“混合和匹配”以产生本发明的其他抗DKK1结合分子。可以使用上述和实施例中所述的结合测定法(例如，ELISA)测试此类“混合和匹配的”抗体的DKK1结合。当VH和VL链被混合和匹配时，来自具体VH/VL配对的VH序列应该用结构上相似的VH序列置换。同样，来自具体VH/VL配对的VL序列应该用结构上相似的VL序列置换。同样，来自具体全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应该用结构上相似的全长轻链序列置换。本发明抗体的VH、VL、全长轻链和全长重链序列尤其服从混合和置换，因为这些抗体使用来自相同种系序列的VH、VL、全长轻链和全长重链序列，并且从而显示出结构相似性。
因此，一方面，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其具有：包含选自SEQ ID NO：2-20和119的氨基酸序列的VH区；以及包含选自SEQ ID NO：21-39和118的氨基酸序列的VL区；其中该抗体特异性结合DKK1。
重链和轻链组合的实例包括：包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VL区；或包含SEQ ID NO：3的VH区和包含SEQ ID NO：22的VL区；或包含SEQ ID NO：4的VH区和包含SEQ ID NO：23的VL区；或包含SEQ ID NO：5的VH区和包含SEQID NO：24的VL区；或包含SEQ ID NO：6的VH区和包含SEQ ID NO：25的VL区；或包含SEQ ID NO：7的VH区和包含SEQ ID NO：28的VL区；或包含SEQ ID NO：8的VH区和包含SEQ ID NO：29的VL区；或包含SEQID NO：9的VH区和包含SEQ ID NO：30的VL区；或包含SEQ ID NO：10的VH区和包含SEQ ID NO：31的VL区；或包含SEQ ID NO：11的VH区和包含SEQ ID NO：32的VL区；或包含SEQ ID NO：12的VH区和包含SEQ ID NO：33的VL区；或包含SEQ ID NO：119的VH区和包含SEQ IDNO：118的VL区。
另一方面，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其具有：包含选自SEQ ID NO：115-117的氨基酸序列的全长重链；以及包含选自SEO ID NO：111-114的氨基酸序列的全长轻链。
因此，全长重链和全长轻链组合的实例分别包括：SEQ ID NO：115与SEQ ID NO：111；或SEQ ID NO：116与SEQ ID NO：112；或SEQ IDNO：117与SEQ ID NO：113；或SEQ ID NO：117与SEQ ID NO：114。
另一方面，本发明提供分离的单克隆抗体或抗原结合部分，其含有：选自SEQ ID NO：101-103的核苷酸序列编码的全长重链；以及选自SEQID NO：97-100的核苷酸序列编码的全长轻链。
因此，编码全长重链和全长轻链的核苷酸实例可分别组合包括：SEQID NO：101和97；或SEQ ID NO：102和98；或SEQ ID NO：103和99；或SEQ ID NO：103和100。
另一方面，本发明提供已进行在细胞中表达的优化的分离的单克隆抗体或抗原结合部分，其具有：包含选自SEQ ID NO：108-110的核苷酸序列的全长重链；以及包含选自SEQ ID NO：104-107的核苷酸序列的全长轻链。
另一方面，本发明提供包括抗体重链和轻链CDR1、重链和轻链CDR2和重链和轻链CDR3的抗体，或其组合。抗体的VH CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2-5、8-11、20和49-56。抗体的VH CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2-20和57-64。抗体的VH CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2-20和65-72。抗体的VL CDR1的氨基酸序列示于SEQ IDNO：21-39和73-80。抗体的VL CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：21-39和81-88。抗体的VL CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：21-39和89-96。使用Kabat系统描述CDR区(Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteinsof Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)。
考虑到这些抗体的每一种可以结合DKK1并且抗体结合特异性主要通过CDR1、2和3区提供，可以将VH CDR1、2和3序列与VL CDR1、2和3序列“混合和匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以被混合和匹配，尽管每个抗体必须含有VH CDR1、2和3和VL CDR1、2和3)以产生本发明的其他抗DKK1结合分子。可以使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如，ELISA)测试此类“混合和匹配的”抗体的DKK1结合。当混合和匹配VH CDR序列时，来自具体VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应该用结构上相似的CDR序列置换。同样，当混合和匹配VL CDR序列时，来自具体VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应该用结构上相似的CDR序列置换。此外，具体VH或VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列可特定或随机突变以产生可检测亲和力或结合特性的抗体。技术人员将容易显而易见的是，对于本发明的单克隆抗体，通过用来自本文所示CDR序列的结构上相似的序列替代一个或多个VH和/或VL CDR序列，可以产生新的VH和VL序列。
分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其具有：包含选自SEQ ID NO：2-5、8-11、20和49-56的氨基酸序列的VH区CDR1；包含选自SEQ ID NO：2-20和57-64的氨基酸序列的VH区CDR2；包含选自SEQ ID NO：2-20和65-72的氨基酸序列的VH区CDR3；包含选自SEQ ID NO：21-39和73-80的氨基酸序列的VL区CDR1；包含选自SEQ ID NO：21-39和81-88的氨基酸序列的VL区CDR2；以及包含选自SEQ ID NO：21-39和89-96的氨基酸序列的VL区CDR3；其中该抗体特异性结合DKK1。
在某一实施方案中，抗体组成为：包含SEQ ID NO：2的VH区CDR1；包含SEQ ID NO：6的VH区CDR2；包含SEQ ID NO：7的VH区CDR3；包含SEQ ID NO：21的VL区CDR1；包含SEQ ID NO：22的VL区CDR2；以及包含SEQ ID NO：23的VL区CDR3。
在另一实施方案中，抗体组成为：包含SEQ ID NO：3的VH区CDR1；包含SEQ ID NO：12的VH区CDR2；包含SEQ ID NO：13的VH区CDR3；包含SEQ ID NO：24的VL区CDR1；包含SEQ ID NO：25的VL区CDR2；以及包含SEQ ID NO：26的VL区CDR3。
在另一实施方案中，抗体组成为：包含SEQ ID NO：4的VH区CDR1；包含SEQ ID NO：14的VH区CDR2；包含SEQ ID NO：15的VH区CDR3；包含SEQ ID NO：27的VL区CDR1；包含SEQ ID NO：28的VL区CDR2；以及包含SEQ ID NO：29的VL区CDR3。
在另一实施方案中，抗体组成为：包含SEQ ID NO：5的VH区CDR1；包含SEQ ID NO：16的VH区CDR2；包含SEQ ID NO：17的VH区CDR3；包含SEQ ID NO：30的VL区CDR1；包含SEQ ID NO：31的VL区CDR2；以及包含SEQ ID NO：32的VL区CDR3。
在某一实施方案中，抗体组成为：包含SEQ ID NO：8的VH区CDR1；包含SEQ ID NO：18的VH区CDR2；包含SEQ ID NO：19的VH区CDR3；包含SEQ ID NO：33的VL区CDR1；包含SEQ ID NO：34的VL区CDR2；以及包含SEQ ID NO：35的VL区CDR3。
在某一实施方案中，抗体组成为：包含SEQ ID NO：9的VH区CDR1；包含SEQ ID NO：10的VH区CDR2；包含SEQ ID NO：11的VH区CDR3；包含SEQ ID NO：36的VL区CDR1；包含SEQ ID NO：37的VL区CDR2；以及包含SEQ ID NO：38的VL区CDR3。
如本文所用的，人抗体包含重链或轻链可变区，如果该抗体的可变区从使用种系免疫球蛋白基因的系统得到，那么所述可变区是特定种系序列的“产物”或“来自”该特定种系序列。此类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或者用目的抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或者“来自”所述序列的人抗体可以如下鉴定：通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选自序列与人抗体的序列最接近(即，最大的％同一性)的人种系免疫球蛋白序列。为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或者“来自”所述序列的人抗体可以由于例如天然存在的体细胞突变或者有意引入位点定向诱变而与种系序列相比含有氨基酸差异。然而，所选的人抗体通常与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上至少90％同一并且含有这样的氨基酸残基，当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)比较时，所述氨基酸残基将所述人抗体鉴定为人的。在一些情况中，人抗体可以在氨基酸序列上与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％、或至少95％、或甚至至少96％、97％、98％、或99％同一。通常，来自具体人种系序列的人抗体将显示出与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸差异。在一些情况中，人抗体可以显示出与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
同源抗体
在另一实施方案中，本发明的抗体具有全长重链和轻链氨基酸序列，全长重链和轻链核苷酸序列，可变区重链和轻链核苷酸序列，或可变区重链和轻链氨基酸序列，其与本文所述抗体的氨基酸和核苷酸序列同源，并且其中所述抗体保留本发明中和抗DKK 1/4组合物所希望的功能性质。
例如，本发明提供分离的单克隆抗体或抗原结合部分，其包括VH区和VL区，其中：VH区包含与选自SEQ ID NO：2-20和119的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；VL区包含与选自SEQ ID NO：21-39和118的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；该抗体特异性结合DKK1和/或DKK4，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体中和DKK1蛋白质与LRP6、Fz和/或Krm的结合，或抗体中和DKK4蛋白质与LRP、Pz和/或Krm的结合。
在另一实施例中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括全长重链和全长轻链，其中：全长重链包含与选自SEQ ID NO：115-117的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；全长轻链包含与选自SEQ ID NO：111-114的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；该抗体特异性结合DKK1，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解性损伤，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
在另一实施例中，本发明提供分离的单克隆抗体或抗原结合部分，其包括全长重链和全长轻链，其中：全长重链包含与选自SEQ ID NO：101-103的核苷酸序列至少80％同源的核苷酸序列；全长轻链包含与选自SEQ ID NO：97-100的核苷酸序列至少80％同源的核苷酸序列；该抗体特异性结合DKK1，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解性损伤，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
在另一实施例中，本发明提供已进行细胞中表达的优化的分离的单克隆抗体或抗原结合部分，其包括全长重链和全长轻链，其中：全长重链包含与选自SEQ ID NO：108-110的核苷酸序列至少80％同源的核苷酸序列；全长轻链包含与选自SEQ ID NO：104-107的核苷酸序列至少80％同源的核苷酸序列；该抗体特异性结合DKK1，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解性损伤，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
在另一实施例中，本发明提供已进行细胞中表达的优化的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括VH区和VL区，其中：全长重链包含与选自SEQ ID NO：121的核苷酸序列至少80％同源的核苷酸序列；全长轻链包含与选自SEQ ID NO：120的核苷酸序列至少80％同源的核苷酸序列；该抗体特异性结合DKK1，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解性损伤，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
在多种实施方案中，抗体可以显示出上面讨论的功能性质的一种或多种、两种或多种，或三种。该抗体可以是例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如本文所用的，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是这两个序列共有的相同位置数目的函数(即，％同源性＝相同位置数/位置总数×100)，考虑缺口数、每个缺口的长度，它们被引入以进行两个序列的最佳比对。可以使用如下面的非限制性实例中所述的数学算法完成序列的比较和两个序列之间同一性百分数的确定。
可以使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17，1988)的算法，使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数，该算法已经被结合到ALIGN程序(版本2.0)中。此外，可以使用整合到GCG软件包(可以在http://www.gcg.com得到)的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol，Biol.48：444-453，1970)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，和缺口权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。
额外或备选地，本发明的蛋白质序列还可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索以例如鉴定相关的序列。可以使用Altschul，等人，1990 J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(版本2.0)进行此类搜索。可以用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质搜索来得到与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了得到用于比较目的的缺口比对，可以用如Altschul等人，1997 Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的缺口BLAST。当利用BLAST和缺口BLAST时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守修饰的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体具有由CDR1、CDR2和CDR3序列组成的VH区和由CDR1、CDR2和CDR3序列组成的VL区，其中这些CDR序列中的一个或多个具有基于本文所述抗体的特定氨基酸序列或者其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明的中和抗DKK1/4组合物的所需功能性质。因此，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其组成为由CDR1、CDR2和CDR3序列组成的VH区和由CDR1、CDR2和CDR3序列组成的VL区，其中：CDR1的VH区是选自SEQ ID NO：2-5、8-11、20、49-56的氨基酸序列的氨基酸序列及其保守修饰组成的序列；CDR2的VH区是选自SEQ ID NO：2-20、57-64的氨基酸序列的氨基酸序列及其保守修饰组成的序列；CDR3的VH区是选自SEQ ID NO：2-20、65-72的氨基酸序列的氨基酸序列及其保守修饰组成的序列；CDR1的VL区是选自SEQ ID NO：21-39、73-80的氨基酸序列的氨基酸序列及其保守修饰组成的序列；CDR2的VL区是选自SEQ ID NO：21-39、81-88的氨基酸序列的氨基酸序列及其保守修饰组成的序列；CDR3的VL区是选自SEQID NO：21-39，89-96的氨基酸序列的氨基酸序列及其保守修饰组成的序列；该抗体特异性结合DKK1，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解性损伤，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
在多种实施方案中，抗体可以显示出上面讨论的功能性质的一种或多种、两种或多种，或三种。该抗体可以是例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其他的实施方案中，本发明抗体具有全长重链序列和全长轻链序列，其中一种或多种这些序列具有基于本文描述的抗体或其保守修饰的特定氨基酸序列，并且其中所述抗体保留本发明的中和抗DKK1/4组合物的所希望的功能性质。因此，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括全长重链序列和全长轻链序列，其中：全长重链具有选自SEQ IDNO：115-117的氨基酸序列及其保守修饰；全长轻链具有选自SEQ ID NO：111-114的氨基酸序列及其保守修饰；该抗体特异性结合DKK1，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解性损伤，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
在多种实施方案中，抗体可以显示出上面讨论的功能性质的一种或多种、两种或多种，或三种。该抗体可以是例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其他的实施方案中，进行在细胞中表达优化的本发明抗体具有VH区序列和VL区序列，其中这些序列中的一个或多个具有基于本文所述抗体的特定氨基酸序列或者其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明的中和抗DKK1/4组合物的所需功能性质。因此，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括VH区和VL区，其中：VH区具有选自SEQ IDNO：119的氨基酸序列及其保守修饰；VL区具有选自SEQ ID NO：118的氨基酸序列及其保守修饰；该抗体特异性结合DKK1，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解性损伤，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
在多种实施方案中，抗体可以显示出上面讨论的功能性质的一种或多种、两种或多种，或三种。该抗体可以是例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
本文所用的术语“保守序列修饰”意指氨基酸修饰，其不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的抗体中引入修饰。
保守氨基酸取代是其中将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分枝侧链氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。从而，本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且可以使用本文所述的功能测定法测试经改变的抗体所保留的功能。
结合到与本发明的中和抗DKK1/4组合物相同表位的抗体
在另一实施方案中，本发明提供了结合与本文提供的本发明的多种中和抗DKK1/4组合物结合相同表位的抗体。此类额外的抗体可以基于它们在标准DKK1结合测定法中与本发明的其他抗体交叉竞争(即，以统计学显著方式竞争性抑制结合)来鉴定。受试抗体抑制本发明的抗体与人DKK1结合的能力表明该受试抗体与本发明抗体竞争结合人DKK1；根据非限制性理论，这种抗体可以与它所竞争的抗体结合人DKK1上相同或相关的(例如，结构上相似或空间上接近的)表位。在一些实施方案中，与本发明的抗体结合人DKK1上相同表位的抗体是人单克隆抗体。此类人单克隆抗体可以如实施例中所述的制备和分离。
骆驼的和其他的重链抗体
获自包括新界成员如美洲驼物种(羊驼Lama paccos、原驼Lama glama和瘦驼Lama vicugna)的骆驼和单峰骆驼家族成员(双峰驼Camelusbactrianus和Calelus dromaderius)的抗体蛋白质已为人类受试者表征了大小、结构复杂性和抗原性。对于其他动物的抗体，自然界中发现的该家族哺乳动物的某些IgG抗体缺乏轻链，并因此在结构上明显不同于典型的含两条重链和两条轻链的四链四级结构。见PCT/EP93/02214(WO 94/04678，公开于1994年3月3日)。
鉴定为VHH的小单链可变域的骆驼抗体区可通过基因工程获得以产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质，结果形成已知为“骆驼抗体”的低分子量的源自抗体的蛋白质。见美国专利号5,759,808，出版于1998年6月2日，也见Stijlemans，B.等人2004 J Biol Chem 279：1256-1261，Dumoulin，M.等人，2003 Nature 424：783-788，Pleschberger，M.等人2003 BioconjugateChem 14：440-448，Cortez-Retamozo，V.等人2002 Int J Cancer 89：456-62，以及Lauwereys，M.等人1998 EMBO J 17：3512-3520。骆驼抗体和抗体片段的工程化文库通过商业途径获得，例如，来自Ablynx、Ghent、Belgium。与非人源的其他抗体一样，可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列以获得更相似于人类序列的序列，即可将纳米抗体“人源化”。因此可将骆驼抗体对人类的天然低抗原性进一步降低。
骆驼抗体具有人类IgG分子的大约十分之一的分子量，并且该蛋白质具有仅仅几纳米的物理直径。小尺寸的一个结果是骆驼纳米抗体结合到对于较大抗体蛋白质是功能不可见的抗原位点的能力，即骆驼纳米抗体可用作检测抗原的试剂，否则使用典型的免疫学技术是隐蔽的，以及作为可能的治疗制剂。因此小尺寸的另一个结果是骆驼纳米抗体由于能够抑制结合到靶蛋白的凹槽或窄裂缝中的特异位点，因而能够提供比典型抗体更相似于典型低分子量药物的功能。
低分子量和紧凑尺寸进一步导致骆驼纳米抗体极端耐热，对极端pH和蛋白酶解消化稳定，并且是低抗原性的。另一个结果是骆驼纳米抗体易于从循环系统转移进组织，并且甚至穿过血脑屏障而可以治疗影响神经组织的障碍。纳米抗体可进一步促进穿过血脑屏障的药物转运。参见美国专利申请20040161738，2004公开于8月19日。组合这些对人类低抗原性的特征显示很大的治疗潜力。另外，这些分子在原核细胞如E.coli中可完整表达并且在噬菌体中作为融合蛋白表达并具有功能。
因此，本发明的特征是对DKK1具有高亲和力的骆驼抗体或纳米抗体。在本文的某些实施方案中，骆驼抗体或纳米抗体是在骆驼类动物中天然产生的，即用DKK1或其肽片段免疫后的骆驼产生的，对其他抗体使用本文所述技术。备选地，中和抗DKK1/4骆驼纳米抗体是改造的，即使用如本文实施例中所述的以DKK1和/或DKK4作为靶标的筛选程序，通过例如从噬菌体展示文库中选择产生适当突变的骆驼纳米抗体蛋白质。改造的纳米抗体可进一步通过基因工程定制，使其在受体受试者中具有从45分钟到两周的半寿期。
除了骆驼抗体，重链抗体天然产生于其他动物，所述动物包括但不限定于例如鲨鱼和河豚鱼的某些物种(参见例如PCT公开WO 03/014161)。尽管源自这些重链抗体的可变域可使用于本发明，但源自骆驼的重链抗体和/或其可变结构域序列的用途优选最优化、人源化、人改造等和/或用于人类临床用途。
改造和修饰的抗体
还可以使用具有本文所示的一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始物质进一步制备本发明的抗体以改造修饰的抗体，该修饰的抗体可以具有从起始抗体改变的形式。通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)，例如，一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内的可变区，可以改造抗体。额外或备选地，通过修饰恒定区内的残基，例如，以改变抗体的效应功能来改造抗体。
可以进行的一种类型的可变区改造是CDR嫁接。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，各抗体之间CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更多样化。因为CDR序列负责多数抗体-抗原相互作用，所以可能通过构建表达载体表达重组抗体，其模拟特定天然存在的抗体的性质，所述表达载体包括来自特定天然存在的抗体的CDR序列，其嫁接到来自具有不同性质的不同抗体的构架区上(见例如，Riechmann，L.等人，1998 Nature 332：323-327；Jones，P.等人，1986 Nature 321：522-525；Queen，C.等人，1989 Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；winter的美国专利号5,225,539，和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一实施方案涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括，包含分别具有选自SEQ IDNO：2-5、8-11、20、49-56的氨基酸序列的CDR1序列，具有选自SEQ IDNO：2-20和57-64的氨基酸序列的CDR2序列，具有选自SEQ IDNO：2-20和65-72的氨基酸序列的CDR3序列的VH区；以及包含分别具有选自SEQ IDNO：21-39和73-80的氨基酸序列的CDR1序列，具有选自SEQ IDNO：21-39和81-88的氨基酸序列的CDR2序列，具有选自SEQ IDNO：21-39和89-96的氨基酸序列的CDR3序列的VL区。因此，这类抗体包含单克隆抗体的VH和VL CDR序列，也可包含这些抗体的不同的构架序列。
此类构架序列可以从公共DNA数据库或公布的参考文献得到，其包括种系抗体基因序列。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在＂VBase＂人种系序列数据库(可以在英特网网址www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获取)，以及在Kabat，E.A.，等人，1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson，I.M.，等人，1992 J.fol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等人，1994 Eur.JImmunol.24：827-836中找到，将它们都明确引入本文作为参考。
用于本发明抗体的构架区的实例是与所选的本发明抗体使用的构架序列，例如，本发明的单克隆抗体使用的共有序列和/或构架序列结构上相似的那些构架序列。可以将VH CDR1、2和3序列，和VL CDR1、2和3嫁接在构架区上，该构架区具有与该构架序列所来源的种系免疫球蛋白基因中发现的相同序列，或者可以将CDR序列嫁接在构架区上，该构架区与种系序列相比具有一个或多个突变。例如，已经发现在一些情况中，有益的是突变构架区内的残基以保持或增强抗体的抗原结合能力(见，例如，Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一类型的可变区修饰是突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基从而提高目的抗体的一种或多种结合性质(例如，亲和力)，称作“亲和力成熟”。可以进行位点定向诱变或者PCR介导的诱变以以导入突变，并且可以用如本文所述的和实施例中提供的体外或体内测定法评估对抗体结合或者其他目的功能性质的影响。可以引入保守修饰(如上文讨论)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，通常改变CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，在另一实施方案中，本发明提供分离的中和抗DKK1/4组合物或其抗原结合部分，其组成为：VH区具有组成为选自SEQ ID NO：2-5、8-11、20、49-56的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2-5、8-11、20、49-56相比具有一、二、三、四或五个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列的VHCDR1区；具有选自SEQ ID NO：2-20和57-64的氨基酸序列或与SEQ IDNO：2-20和57-64相比具有一、二、三、四或五个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列的VH CDR2区；具有选自SEQ ID NO：2-20和65-72的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2-20和65-72相比具有一、二、三、四或五个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列的VH CDR3区；具有选自SEQ IDNO：21-39和73-80的氨基酸序列或与SEQ ID NO：21-39和73-80相比具有一、二、三、四或五个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列的VL CDR1区；具有选自SEQ ID NO：21-39和81-88的氨基酸序列或与SEQ ID NO：21-39和81-88相比具有一、二、三、四或五个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列的VL CDR2区；具有选自SEQ ID NO：21-39和89-96的氨基酸序列或与SEQ ID NO：21-39和89-96相比具有一、二、三、四或五个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列的VL CDR3区。
本发明的经改造的抗体包括这样的抗体，其中已经对VH和/或VL内的构架残基进行修饰以例如改善抗体的性质。通常，进行此类构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是“回复突变”一个或多个构架残基成对应的种系序列。更特别地，已经经历体细胞突变的抗体可以含有与该抗体所来源的种系序列不同的构架残基。通过比较抗体构架序列与该抗体所来源的种系序列可以鉴定此类残基。为了使构架区序列回复到它们的种系构型，可以例如通过位点定向诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”成种系序列。此类“回复突变”抗体也意在被本发明包括。
另一类型的构架修饰涉及突变构架区内，或者甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以除去T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称作“去免疫”并且在Carr等人的美国专利公布号20030153043中进一步详细描述。
作为在构架或CDR区内进行修饰，额外或备选地可以改造本发明的抗体以包括Fc区内的修饰，通常改变抗体的一种或多种功能性质，如血清半寿期、补体固定、Fc受体结合，和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以连接到抗体)或经修饰而改变它的糖基化，再次改变该抗体的一种或多种功能性质。这些实施方案的每一个都在下面详细描述。Fc区内的残基编号为Kabat的EU指数编号。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区使得改变，例如，增加或减少铰链区中半胱氨酸残基的数目。该方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述。改变CH1的铰链区中的半胱氨酸残基数目以例如方便轻链和重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，将抗体的Fc铰链区突变以降低该抗体的生物学半寿期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变导入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，使得该抗体相对于天然Fc铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌A蛋白(SpA)结合。该方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中进一步详细描述。
在另一实施方案中，修饰抗体以增加其生物学半寿期。多种方法是可能的。例如，可以导入一个或多个下面的突变：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利号6,277,375所述。备选地，为了延长生物学半寿期，可以在抗体的CH1或CL区内改变以含有从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环得到的回复受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中描述。
在其他实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基用不同的氨基酸残基置换以改变抗体的效应功能来改变Fc区。例如，一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基置换，使得该抗体对于效应配体具有改变的亲和力但是保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应配体可以是例如，Fc受体或补体的C1组分。该方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详述。
在另一实施方案中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以用不同氨基酸残基置换使得该抗体具有改变的C1q结合和/或减小或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中进一步详述。
在另一实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基以改变该抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中进一步描述。
在另一实施方案中，通过修饰一个或多个氨基酸修饰Fc区以增加该抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力。该方法在Presta的PCT公布号WO 00/42072中进一步描述。此外，已经为人IgG1对FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点作图并且已经描述了具有提高的结合的变体(见Shields，R.L.等人，2001 J.Biol.Chen.276：6591-6604)。
在另一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化抗体(即，缺少糖基化的抗体)。可以改变糖基化以例如，增加抗体对“抗原”的亲和力。此类糖类修饰可以通过例如改变抗体序列内一个或多个糖基化位点完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致去除一个或多个可变区构架糖基化位点，从而去除该位点的糖基化。此类无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述。
额外或备选地，可以制备具有改变类型的糖基化的抗体，如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖基化抗体或者具有增加的等分GlcNac结构的抗体。已经表明此类改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。通过例如在具有改变的糖基化系统的宿主细胞中表达抗体完成此类糖类修饰。具有改变的糖基化系统的细胞已经在本文中描述并且可以用作宿主细胞，在其中表达本发明的重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能被破坏的FUT8基因的细胞系，所述FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体显示出低岩藻糖化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖连接到Asn(297)-连接的糖类的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(也见Shields，R.L.等人，2002J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342描述了细胞系，其被改造而表达修饰糖蛋白的岩藻糖基转移酶(例如，β(1，4)-N乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII)，使得在该改造细胞系中表达的抗体显示出增加的等分GlcNac结构，其导致抗体增加的ADCC活性(也见Umana等人，1999 Nat.Biotech.17：176-180)。
本发明设想的本文抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体聚乙二醇化，例如，以延长该抗体的生物学(例如，血清)半寿期。为了聚乙二醇化抗体，通常将该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)，如PEG的活性酯或醛衍生物在这样的条件下反应，在所述条件下，一个或多个PEG基团变得附着到抗体或抗体片段。通过用反应性PEG分子(或其类似的反应性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应，可以进行聚乙二醇化。本文所用的术语“聚乙二醇”意在包括任一形式的PEG，其已经被用于衍生其他蛋白质，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或者聚乙二醇-马来酰亚胺。在一些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的抗体。见例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
非免疫球蛋白支架
可应用多种的抗体/免疫球蛋白构架或支架，只要得到的多肽包括至少一个靶蛋白特异性结合区。这类构架或支架包括人类免疫球蛋白的五个主要的独特型或其片段(例如本文别处公开的那些片段)，并包括其他动物物种的免疫球蛋白，优选地具有人源化特征。如在骆驼和/或鲨鱼中鉴定的那些单一的重链抗体在这方面特别受关注。将由本领域的技术人员继续发现和开发新的构架、支架和片段。
一方面，本发明涉及使用可移植本发明的CDR于其上的非免疫球蛋白支架来产生基于非免疫球蛋白的抗体。可应用已知或未知的非免疫球蛋白构架和支架，只要它们包括目的蛋白质SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：122的特异性结合区。这类化合物在本文中称为“包括靶标特异性结合区的多肽”。已知的非免疫球蛋白构架和支架包括但不限定于，Adnectin(纤连蛋白)(Compound Therapeutics，Inc.，Waltham，MA)、锚蛋白(MolecularPartners AG，Zurich，瑞士)、结构域抗体(Domantis，Ltd(Cambridge，MA)和Ablynx nv(Zwijnaarde，Belgium))、脂笼蛋白(Anticalin)(PierisProteolab AG，Freising，德国)、小型免疫药物(small modularimmuno-pharmaceutical)(Trubion Pharmaceuticals Inc.，Seattle，WA)、maxybodies(Avidia，Inc.(Mountain View，CA))、A蛋白(Afiibody AG，瑞典)以及affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，Halle，德国)。
(i)Adnectin—化合物治疗
Adnectin支架基于纤连蛋白III型结构域(例如纤连蛋白III型的第十模块(10 Fn3结构域))。纤连蛋白III型结构域具有7或8条分布在两个β片层的β链，其中它们之间相互包装(pack against each other)以形成蛋白质核心，并且还包含互相连接β链并且暴露于溶剂的环(类似于CDR)。在β片层夹心层的每一边缘至少有三个这样的环，其中边缘是蛋白质垂直于β链方向的界线。(U S 6,818,418)。
这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白，尽管全部折叠密切涉及最小的功能性抗体片段——重链可变区，其包括骆驼和美洲驼IgG中的完整抗原识别单位。由于这种结构，非免疫球蛋白抗体模拟与抗体特性在本质上和亲和力上相似的抗原结合特性。可将这些支架用于体外的环随机化和改组策略中，其与体内抗体亲和力成熟过程相似。这些基于纤连蛋白的分子可用作支架，其中使用标准克隆技术可将分子的环区用本发明的CDR取代。
(ii)锚蛋白—分子伴侣
该技术基于使用具有锚蛋白来源的重复模块的蛋白质作为携带可变区的支架，其可用于结合到不同靶标。锚蛋白重复模块是由两个反平行的α-螺旋和β-转角构成的33个氨基酸多肽。可变区的结合主要通过使用核糖体展示来最优化。
(iii)Maxybodies/Avimer-Avidia
Avimer源自包含蛋白质如LRP-1的天然结构域A。这些结构域本来是用于蛋白质-蛋白质相互作用并且在超过250个人蛋白质中结构性基于结构域A。由大量不同的经由氨基酸键连接的“A结构域”单体(2-10)构成Avimer。使用描述于例如20040175756、20050053973、20050048512以及20060008844中的方法能够产生可结合到目的抗原的Avimer。
(vi)A蛋白—亲和体(affibody)
Figure A200780009135D00521
亲和配基是小型的、简单的蛋白质，其组成为基于A蛋白的一种IgG结合结构域的支架的三个螺旋束。A蛋白是细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白。该支架域由58个氨基酸构成，其中的13个随机产生含大量配体变体的
Figure A200780009135D00522
文库(参见例如US5,831,012)。
Figure A200780009135D00523
分子模拟抗体，与150kDa分子量的抗体相比，它们具有6kDa的分子量。虽然它的尺寸小，但
Figure A200780009135D00524
分子的结合位点与抗体的结合位点相似。
(v)Anticalin—Pieris
Figure A200780009135D00525
是由Pieris ProteoLab AG公司开发的产品。它们源自脂笼蛋白，一组分布广泛的小而强力的蛋白质，该蛋白质通常涉及化学敏感的或不溶的化合物的生理转运或贮藏。某些天然的脂笼蛋白产生于人类组织或体液中。
该蛋白质构造让人联想到具有刚性构架顶部高变环的免疫球蛋白。然而，与抗体或其重组片段相反，脂笼蛋白由含160至180个氨基酸残基的单一多肽链构成，仅在边缘比单一免疫球蛋白结构域更大些。
一套四个环组成结合口袋，显示显著的结构可塑性并耐受多种侧链。可因此在专有的程序中改造结合位点以识别指定的具有高亲和力和特异性的不同形状的靶分子。
通过诱变一套四个环，脂笼蛋白家族的一种蛋白质，甘兰菜粉蝶(PierisBrassicae)的胆汁三烯结合蛋白(BBP)已用于开发Anticalin。描述“Anticalin”的专利申请书的一个实例是PCT WO 199916873。
(vi)Affilin-Scil蛋白质
AffilinTM分子是设计成对蛋白质和小分子具有特异亲和力的小的非免疫球蛋白蛋白质。新的AffilinTM分子可从两个文库中非常迅速地筛选出，每一文库都是基于源自不同人类的支架蛋白质。
AffilinTM分子未显示与免疫球蛋白蛋白质的任何结构同源性。Sell蛋白质使用两种AffilinTM支架，其中一种是γ-晶体蛋白，人类结构性眼晶状体蛋白质以及另一种是“泛素”超家族蛋白质。两种人类支架都非常小，显示高温稳定性并且几乎能抵抗pH变化和变性剂。这种高稳定性主要是由于蛋白质的延展β片层结构。源自蛋白质的γ-晶体蛋白的实例描述于WO200104144中并且“泛素样”蛋白质的实例描述于WO2004106368中。
改造抗体的方法
如上面讨论，具有本文所示的VH和VL序列，或全长重链和轻链序列的抗DKK1抗体可以用于通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列或其连接的恒定区而产生新的抗DKK1/4抗体。从而，在本发明的另一方面，本发明的抗DKK1抗体的结构特征用于产生结构相关的抗DKK1/4抗体，其保留本发明抗体的至少一种功能性质，如结合人DKK1或DKK4或其两者，以及抑制DKK1或DKK4或其两者的一种或多种功能性质。
例如，本发明抗体的一个或多个CDR区或其突变可以与已知的构架区和/或其他CDR重组组合，以产生如上文讨论的额外的重组改造的抗DKK1抗体。其他类型的修饰包括前面部分中描述的那些修饰。用于改造方法的起始材料是本文提供的一种或多种VH和/或VL序列，或者其一个或多个CDR区。为了产生改造的抗体，不必实际上制备(即，作为蛋白质表达)具有本文提供的一个或多个VH和/或VL序列或其一个或多个CDR区的抗体。相反，将序列中所含的信息用作起始材料产生来自最初序列的“第二代”序列，然后制备“第二代”序列并表达为蛋白质。
因此，在另一实施方案中，本发明提供制备抗DKK1抗体的方法，所述抗DKK1抗体由VH区抗体序列和VL区抗体序列组成，所述VH区抗体序列具有选自SEQ ID NO：2-5、8-11、20、49-56的CDR1序列，选自SEQID NO：2-20和57-64的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO：2-20和65-72的CDR3序列；所述VL区抗体序列具有选自SEQ ID NO：21-39和73-80的CDR1序列，选自SEQ ID NO：21-39和81-88的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO：21-39和89-96的CDR3序列；改变所述VH区抗体序列和/或VL区抗体序列内的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；并将该改变的抗体序列表达为蛋白质。
因此，在另一实施方案中，本发明提供制备抗DKK1抗体的方法，所述抗DKK1抗体由全长重链抗体序列和全长轻链抗体序列组成，所述全长重链抗体序列具有选自SEQ ID NO：115-117的序列；所述全长轻链抗体序列具有选自SEQ ID NO：111-114的序列；改变所述全长重链抗体序列和/或全长轻链抗体序列内的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；并将该改变的抗体序列表达为蛋白质。
在另一实施方案中，本发明提供制备进行哺乳动物表达的优化的中和抗DKK1/4组合物的方法，所述中和抗DKK1/4组合物由VH区抗体序列和VL区抗体序列组成，所述VH区抗体序列具有选自SEQ ID NO：119的序列；所述VL区抗体序列具有选自SEQ ID NO：118的序列；改变所述VH区抗体序列和/或VL区抗体序列内的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；并将该改变的抗体序列表达为蛋白质。
可以用标准分子生物学技术制备和表达改变的抗体序列。所改变的抗体序列编码的抗体是保留本文所述的中和抗DKK1/4组合物的一种、一些或所有功能性质的抗体，其功能性质包括但不限于，特异性结合人DKK1；和显示出至少一种下面的功能性质的抗体：该抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或该抗体抑制DKK1受体结合，以预防或改善骨质溶解；或该抗体抑制DKK1受体结合，以预防或改善骨质溶解性损伤；或该抗体抑制抑制DKK1受体结合，以预防或改善癌症。
所改变的抗体可以显示出一种或多种、两种或多种，或三种或多种上面讨论的功能性质。
可以使用本领域中可得的和/或本文所述的标准测定法，如实施例中给出的那些(例如，ELISA)评估改变的抗体的功能性质。
在改造本发明抗体的方法的一些实施方案中，可以沿着抗DKK1抗体编码序列的全部或者部分随机或者选择性导入突变，并可以对得到的经修饰的抗DKK1抗体筛选如本文所述的结合活性和/或其他功能性质。突变方法已经在本领域描述。例如，Short的PCT公布WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接装配，或者其组合产生和筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679描述了使用计算机筛选方法优化抗体的理化性质的方法。
抗体的Fc恒定区对确定血清半寿期和效应功能，即抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性是至关重要的。可设计Fc片段的特定突变以改变效应功能和/或血清半寿期(参见例如Xencortechnology，也参见例如WO2004029207)。
改变抗体的效应功能和血清半寿期的方法是嫁接具有适当效应功能的Fc片段的抗体片段的可变区。可针对细胞杀伤活性来选择IgG1或IgG4同种型，而IgG2同种型可用于沉默或中和抗体(不具有细胞杀伤活性)。
通过用血清蛋白如HSA或结合到这种血清蛋白的蛋白质如HSA结合蛋白制备抗体可变区的嵌合融合物，以获得具有长血清半寿期的沉默抗体。
效应功能也可通过调节抗体的糖基化模式来改变。Glycart(例如US6,602,684)、Biowa(例如US6,946,292)和Genentech(例如WO03/035835)已将哺乳动物细胞系改造为产生具有增加的或减少的效应功能的抗体。具体地，非岩藻糖基化的抗体将具有增强的ADCC活性。Glycofi也已开发能产生抗体的特定糖形的酵母细胞系。
编码本发明抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及编码本发明抗体的核酸分子。全长轻链母本核苷酸序列的实例示于SEQ ID NO：97-100中。全长重链母本核苷酸序列的实例示于SEQ ID NO：101-103中。进行细胞中表达的优化的全长轻链核苷酸序列的实例示于SEQ ID NO：104-107中。进行细胞中表达的优化的全长重链核苷酸序列的实例示于SEQ ID NO：108-110中。
核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或者可以是部分纯化或者基本上纯的形式。当通过标准技术纯化核酸以除去其他细胞组分或其他污染物，例如，其他细胞核酸或蛋白质时，核酸是“分离的”或“使得基本上纯的”，所述标准技术包括碱/SDS处理、CsCl分带(binding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他技术。见F.Ausubel，等人，编著，1987Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and WileyInterscience，New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或不含有内含子序列。在一个实施方案中，核酸是cDNA分子。核酸可以存在于载体，如噬菌体展示载体，或者重组质粒载体中。
可以使用标准分子生物学技术得到本发明的核酸。对于杂交瘤(例如，如下文进一步描述的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码通过杂交瘤制备的抗体的重链和轻链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术得到。对于从免疫球蛋白基因文库(例如，使用噬菌体展示技术)得到的抗体，可以从作为文库成员的多种噬菌体克隆回收编码所述抗体的核酸。
一旦得到编码VH和VL区段的DNA片段，就可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如，以将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因，或者scFv基因。在这些操作中，编码VL-或VH的DNA片段有效连接到另一DNA分子，或者编码另一蛋白质的片段，如抗体恒定区或柔性接头。该上下文中使用的术语“有效连接”意指两个DNA片段以功能性方式连接，例如，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合读框，或者使得该蛋白质在所希望的启动子控制下表达。
可以将编码VH区的分离的DNA转变成全长重链基因，通过将VH编码DNA有效连接到编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子实现所述转变。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(见例如，Kabat，E.A.，等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)并且可以通过标准PCR扩增得到包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。对于Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA有效连接至编码仅仅重链CH1恒定区的另一DNA分子。
通过将VL编码DNA有效连接到编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，可以将分离的编码VL区的DNA转变成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(见例如，Kabat，E.A.，等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)并且包含这些区的DNA片段可以通过标准DNA扩增得到。轻链恒定区可以是K或λ恒定区。
为了产生scFv基因，可以将编码VH和VL的DNA片段有效连接到编码柔性接头，例如，编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段，使得VH和VL序列可以作为连续的单链蛋白质表达，通过柔性接头连接VL和VH区(见，例如，Bird等人，1988 Science 242：423-426；Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，1990 Nature348：552-554)。
本发明单克隆抗体的制备
可以通过多种技术产生单克隆抗体(mAb)，所述技术包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein，1975 Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。可以使用多种用于产生单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或癌基因转化。
用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。在小鼠中的杂交瘤产生是成熟的方法。用于分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合步骤也是已知的。
可以基于如上述制备的鼠单克隆抗体的序列制备本发明的嵌合或人源化抗体。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目的鼠杂交瘤得到并使用标准分子生物学技术改造成含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区(见，例如，Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入到人构架区。见例如，Winter的美国专利号5,225,539和Queen.等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6；180；370。
在某一实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠免疫系统的转基因或转染色体小鼠产生针对DKK1的此类人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别称作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且它们在本文中统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb 
Figure A200780009135D0058145219QIETU
(Medarex，Inc.)含有人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，其编码未重排的人重链(μ和γ)和K轻链免疫球蛋白序列，以及定向突变，其失活内源μ和K链基因座(见例如，Lonberg，等人，1994Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠显示出小鼠IgM或K的降低的表达，并且在应答免疫时，所导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和性人IgGK单克隆抗体(Lonberg，N.等人，1994上文；Lonberg，N.，1994 Handbook of Experimental Pharmacology113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.，1995 Intern.Rev.Immunol.13：65-93，和Harding，F.和Lonberg，N.，1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546中综述)。HuMAb小鼠的制备和用途，和此类小鼠携带的基因组修饰在Taylor，L.等人，1992 Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等人，1993 International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi等人，1993 NatureGenetics 4：117-123；Chen，J.等人，1993 EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人，1994 J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等人，1994 InternationalImmunology 579-591；和Fishwild，D.等人，1996 Nature Biotechnology 14：845-851中进一步描述，将它们的内容都完整引入本文作为参考。还见，Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；Surani等人的美国专利号5,545,807；和Lonberg和Kay的PCT公开号WO92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884和WO 99/45962；和Korman等人的PCT公开号WO 01/14424。
在另一实施方案中，使用在转基因或转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生本发明的人抗体。此类小鼠在本文中称作“KM小鼠”，在Ishida等人的PCT公布号WO 02/43478中详细描述。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选的转基因动物系统可以在本领域中得到并且可以用于产生本发明的抗DKK1抗体。例如，可以使用称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的备选转基因系统；此类小鼠在例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6，150,584和6,162,963中描述。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选的转染色体动物系统可以在本领域中获得并且可以用于产生本发明的抗DKK1抗体。例如，可以使用称作“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；此类小鼠在Tomizuka等人，2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中描述。此外，携带人重链和轻链转染色体的奶牛已经在本领域描述(Kuroiwa等人，2002 Nature Biotechnology 20：889-894)并且可以用于产生本发明的抗DKK1抗体。
也可以使用筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备本发明的人单克隆抗体。此类用于分离人抗体的噬菌体展示方法在本领域中建立。见例如：Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
也可以使用其中已经重建了人免疫细胞的SCID小鼠制备本发明的人单克隆抗体，从而当免疫时可以产生人抗体应答。此类小鼠在例如Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中描述。
筛选人抗体文库可用以鉴定本发明的抗体。筛选技术的选择包括但不限定于，例如噬菌体展示(Morphosys)、文库类型(例如Morphosys的HuCaI文库)、亲和力突变技术和另外的密码子优化序列。
产生抗DKK1的人单克隆抗体
将来自大肠杆菌、杆状病毒或HEK-EBNA细胞的纯化重组人DKK1、或纯化的缀合到钥孔血蓝蛋白(KLH)的重组人DKK1用作抗原。
使用表达人抗体基因的HuMab转基因小鼠的HCo7品系制备针对IL-13的完全人单克隆抗体。在每一该小鼠品系中，可以如Chen等人，1993EMBO J.12：811-820中描述的纯合地破坏内源小鼠K轻链基因并且可以如PCT公开WO 01109187的实施例1中所述的纯合地破坏内源小鼠重链基因。每一该小鼠品系携带如Fishwild等人，1996 Nature Biotechnology14：845-851中描述的人κ轻链转基因KCo5。如美国专利号5,545,806；5,625,825；和5,545,807中所述的HCo7品系携带HCo7人重链转基因。如PCT公开WO 01/09187的实施例2中描述的HCo12品系携带HCo12人重链转基因。HCo17品系携带HCo17人重链转基因。如PCT公开WO02/43478中描述的KNM品系包括SC20转染色体。
为产生DKK1的全长人单克隆抗体，HuMab小鼠和KM小鼠使用来自大肠杆菌的纯化重组DKK1或DKK1-KLH缀合物作为抗原来免疫。HuMab小鼠的一般免疫方案在Lonberg，N.等人，1994 Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等人，1996 Nature Biotechnology 14：845-851和PCT公开WO 98/24884中描述。第一次输注抗原时小鼠为6-16周龄。DKK1抗原的纯化重组制剂(5-50μg)(例如从表达DKK1的转染的大肠杆菌细胞中纯化的)用于腹膜内、皮下(Sc)或经由足垫的注射来免疫HuMab小鼠和KM小鼠。
转基因小鼠经腹膜内(IP)、皮下(Sc)或足垫(FP)由完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原免疫两次，之后的3-21天用在不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原IP、Sc或FP免疫(总共免疫11次)。免疫应答通过眼眶取血来监测。血浆由ELISA筛选，并且具有足够抗DKK1人免疫球蛋白效价的小鼠用于融合。处死和移除脾脏前的3天和2天使用抗原对小鼠进行静脉推射。通常，对每一种抗原进行10-35次融合。每一种抗原免疫几打小鼠。用DKK1免疫HCo7、HCo12、HCo17和KM小鼠品种(strain)总共82只小鼠。
为选择产生结合DKK1的抗体的HuMab或KM小鼠，来自免疫小鼠的血清可通过由Fishwild，D等人，1996描述的ELISA检测。简要地，微量滴定板用PBS中来自大肠杆菌的1-2μg/ml纯化的重组DKK1包被，50μl/孔4℃温育过夜然后用200μl/孔PBS/Tween(0.05％)中的5％鸡血清封闭。将来自DKK1免疫小鼠的血浆稀释液加入到每孔中并在室温下温育1-2小时。平板用PBS/Tween洗涤并然后用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗人IgG Fc多克隆抗体于室温下温育1小时。洗涤后，平板用ABTS底物显色(Sigma，A-1888，0.22mg/ml)并且通过分光光度计在OD 415-495处分析。具有最高效价的抗DKK1抗体的小鼠用于融合。进行融合并且通过ELISA测定杂交瘤上清液的抗DKK1活性。
基于标准方案，分离自HuMab小鼠和KM小鼠的小鼠脾细胞在PEG存在下融合小鼠骨髓瘤细胞系。然后筛选得到的杂交瘤的抗原特异性抗体的产生。将来自免疫小鼠脾脏淋巴细胞的单细胞悬浮液在50％PEG(Sigma)存在下融合四分之一数量的SP2/0非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)。细胞以大约1x105/孔涂布于平底微量滴定板中，接下来在包含10％胎牛血清、10％P388D 1(ATCC、CRL TIB-63)的条件培养基、以及含有3-5％origen(IGEN)、5mM HEPES、0.055mM2-巯基乙醇、50mglnni庆大霉素和1x HAT(Sigma，CRL P-7185)的DMEM(Mediatech，CRL 10013，含有高葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠)的选择性培养基中培养约两周。1-2周后，细胞培养于其中的HAT替换成HT的培养基中。然后通过ELISA来筛选各孔中的人抗DKK1单克隆IgG抗体。一旦杂交瘤大量生长，就通常在10-14天后监测培养基。抗体分泌性杂交瘤重涂布、再次筛选并且，如果仍然对人类IgG呈阳性，则将抗DKK1单克隆抗体通过限制性稀释进行至少两次亚克隆。然后将稳定的亚克隆于体外培养以在组织培养基中产生小量抗体用于进一步的表征。
人类Ig小鼠的免疫
如描述于Lonberg，N等人，1994 Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等人，1996 Nature Biotechnology 14：845-851；和PCT公开WO98124884和WO 01/14424中的，当人类Ig小鼠用于产生本发明的人抗体时，这类小鼠可用DKK1抗原和/或重组DKK1、或DKK1融合蛋白的纯化的或浓缩的制剂来免疫。第一次注射时小鼠可以是6-16周龄。例如，DKK1抗原的纯化的或重组的制剂(5-50μg)可用于进行腹膜内免疫人类Ig小鼠。
产生对DKK1的完整人单克隆抗体的详细程序如上所述。不同抗原累积的经验已显示当使用完全弗氏佐剂中的抗原进行腹膜内(IP)初始免疫时，转基因小鼠应答，接下来使用不完全弗氏佐剂中的抗原进行每隔一周IP免疫(总达6次)。然而，发现除弗氏之外的佐剂也有效。另外，缺乏佐剂的整个细胞显现非常高的免疫原性。眼眶取血获得的血浆样品可在免疫方案的过程中监测免疫应答。血浆可通过ELISA筛选，并且具有充分效价的抗DKK1人类免疫球蛋白的小鼠可用于融合。处死和移除脾脏前的3天用抗原对小鼠可进行静脉推射。预期每次免疫可能需要进行2-3次融合。每种抗原通常免疫6至24只小鼠。通常使用HCo7和HCo12品种。另外，HCo7和HCo 12转基因可共同培育成具有两种不同人类重链转基因的单一小鼠(HCo7/HCo12)。
产生人单克隆抗体的杂交瘤的制备
为制备产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，可将免疫小鼠的脾细胞和/或淋巴腺细胞分离并融合到合适的永生化细胞系，如小鼠骨髓瘤细胞。得到的杂交瘤可筛选用于产生抗原特异性抗体。例如，可将免疫小鼠的脾脏淋巴细胞的单细胞悬浮液用50％ PEG融合到六分之一量的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞。细胞在平底微量滴定板中以约2 x 145涂布，接下来在含20％胎克隆血清、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0:055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和IX HAT(Sigma；融合后24h加入HAT)的选择性培养基中温育两周。约两周后，细胞可培养于其中的HAT培养基替换为HT培养基中。然后单独的孔通过ELISA来筛选人类单克隆IgM和IgG抗体。只要发生广泛的杂交瘤生长，通常就在10-14天后观测培养基。抗体分泌性杂交瘤重涂布、再次筛选，并且如果仍然对人类IgG呈阳性，则可将单克隆抗体通过限制性稀释进行至少两次亚克隆。然后将稳定的亚克隆于体外培养，用以在组织培养基中产生小量抗体用于表征。
为纯化人单克隆抗体，可将选择的杂交瘤在两升搅拌式培养瓶中生长以纯化单克隆抗体。采用A蛋白-琼脂糖凝胶(Pharmacia，Piscataway，N.J.)的亲和色谱法前可过滤和浓缩上清液。洗脱的IgG可通过凝胶电泳和高效液相色谱检测以确保纯度。缓冲溶液可调换成PBS，并且浓度可通过使用消光系数为1.43的OD280来测定。可将单克隆抗体等分并储存于-80℃。
产生单克隆抗体的转染瘤的制备
还可以在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体，使用例如，本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如，Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，为了表达抗体，或者其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如，PCR扩增或cDNA克隆，使用表达目的抗体的杂交瘤)可以得到编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将DNA插入到表达载体中，使得基因有效连接到转录和翻译控制序列。在该上下文中，术语“有效连接”意指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到单独的载体，或者更典型地，可以将两种基因插入到相同的表达载体中。通过标准方法向表达载体中插入抗体基因(例如，在抗体基因片段或载体上连接互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点，那么为平末端连接)。本文所述抗体的轻链和重链可变区可以用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因，通过将所述基因插入到已经编码所希望同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段有效连接载体内的CH区段并且VL区段有效连接载体内的CL区段，可以实现所述产生。额外或备选地，重组表达载体可以编码信号肽，其方便抗体链从宿主细胞的分泌。可以将抗体链基因克隆到载体中使得信号肽与抗体链基因的氨基末端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体还可以携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)，其控制抗体链基因的转录或翻译。此类调节序列描述于例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA1990)。本领域技术人员将明白表达载体的设计，包括调节序列的选择，可以依赖于此类因素，如待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白质表达水平，等等。哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，如启动子和/或增强子，其来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))，和多瘤。备选地，可以使用非病毒调节序列，如泛蛋白启动子或P珠蛋白启动子。此外，由不同来源的序列组成的调节元件，如SRa启动子系统，其含有来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复的序列(Takebe，Y.等人，1988 Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除了抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体可以携带额外的序列，如调节宿主细胞中载体复制的序列(如复制原点)和选择标记基因。选择标记基因方便已经导入载体的宿主细胞的选择(见，例如，Axel等人的美国专利号4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择标记基因对已经导入载体的宿主细胞赋予对药物(如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞，使用氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞。术语“转染”的多种形式意在包括常用于向原核或真核宿主细胞中导入外源DNA的多种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。在理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。讨论了抗体在真核细胞，尤其哺乳动物宿主细胞中的表达，因为此类真核细胞，尤其哺乳动物细胞，比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠的和免疫活性抗体。已经报导抗体基因的原核表达对于产生高产量的活性抗体是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.，1985 Immunology Today6：12-13)。
用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，1980 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，使用DH FR选择标记，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp，1982 Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体地，为使用NSO骨髓瘤细胞，另一种表达系统是示于WO 87/04462，WO 89/01036和EP 338,841中的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足够允许抗体在宿主细胞中表达的时间或者将抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。
药物组合物
另一方面，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，其含有本发明的中和抗DKK1/4组合物或其抗原结合片段之一或组合，与可药用载体一起配制。此类组合物可以包括本发明的抗体或免疫连接物或双特异性分子之一或组合(例如，两种或多种不同抗体的组合)。例如，本发明的药物组合物可以包含结合靶抗原上不同表位或者具有互补活性的抗体(或者免疫连接物或双特异性分子)的组合。
也可以以组合疗法，即与其他药剂相组合来施用本发明的药物组合物。
例如，组合疗法可以包括与至少一种其他抗炎剂或抗骨多孔性制剂组合的本发明的抗DKK1抗体。可以用于组合疗法的治疗剂的实例在下面关于本发明抗体用途的章节中更详细地描述。
本文所用的“可药用载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂，等等。载体应该适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或灌输)。取决于施用途径，活性化合物，即抗体、免疫连接物，或双特异性分子可以用材料包衣以保护化合物免于酸和可以失活该化合物的其他自然条件的作用。
本发明的药物化合物可以包括一种或多种可药用盐。“可药用盐”指保留亲本化合物的所希望的生物活性并且不赋予任何不希望的毒理学效应的盐(见例如，Berge，S.M.，等人，1977 J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来自无毒无机酸的盐，如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸的盐，等等，以及来自无毒有机酸的盐，所述无毒有机酸为如脂肪族一或二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂肪族和芳族磺酸，等等。碱加成盐包括来自碱土金属如钠、钾、镁、钙等等的那些盐，以及来自无毒有机胺的盐，所述无毒有机胺为如N，N′-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因，等等。
本发明的药物组合物还可以包括可药用抗氧化剂。可药用抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等等；油可溶的抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚，等等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸，等等。
可以用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)，和其合适的混合物，植物油，如橄榄油，和可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料，如卵磷脂，对于分散体的情况通过保持所需的颗粒大小，和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。微生物存在的防止可以通过如上消毒程序，和通过包括多种抗细菌和抗真菌剂来确保，所述抗细菌和抗真菌剂为例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等等。还希望在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等等。此外，通过包括延缓吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶可以引起可注射药物形式的延长吸收。
可药用载体包括无菌水溶液或分散体和无菌粉剂，其用于临时制备无菌注射液或分散体。此类介质和试剂在药学活性物质中的用途是本领域已知的。除了与活性化合物不相容的常规介质或试剂之外，预期其用于本发明的药物组合物。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
治疗组合物通常必须是在生产和保存条件下是无菌的和稳定的。可以将组合物配制成溶液剂、微乳剂、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，等等)，和其合适的混合物。可以保持适当流动性，例如，通过使用包衣，如卵磷脂，对于分散体的情况通过保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂。在许多情况中，可以在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露醇，山梨醇，或者氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延缓吸收的物质，如单硬脂酸盐和明胶来实现。
通过将活性化合物以所需的量在合适的溶剂中与上面列举的成分之一或者组合掺和，如果需要，接着无菌微量过滤来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体制备分散体，所述载体含有基本分散介质和来自上面列举的那些成分的所需的其他成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其之前无菌过滤溶液的任何额外的所需成分的粉末。
可以与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于被治疗的受试者、具体施用方式而变。可以与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，以百分比计，该量将为约0.01％到约99％活性成分、约0.1％到约70％，或约1％到约30％活性成分与可药用载体组合。
调节剂量方案以提供最佳的目的应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单次快速浓注，可以随时间施用几个分份剂量，或者可以根据治疗情况的紧迫性成比例地减小或增加剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以容易施用和剂量统一。如本文所用的剂量单位形式指适宜作为待治疗受试者的单一剂量的物理上分散的单位；每个单位含有预定量的活性成分，所述量经计算以与所需的药物载体结合产生所希望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格由如下决定并且直接依赖于：活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果，和本领域中配制用于治疗个体中敏感性的这种活性化合物的固有局限性。
对于抗体施用，剂量为约0.0001到200mg/kg，更通常0.01到50mg/kg宿主体重。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或1-20mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3到6月一次。本发明的抗DKK1抗体的剂量方案可以包括通过静脉内或皮下施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，用下面的给药方案之一施用抗体：例如，每四周一次施用6次剂量，然后每3月一次；每3周一次；3mg/kg体重一次，接着每3周1mg/kg体重。
在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在这种情况下施用的每种抗体的剂量落入所指出的范围内。通常在多个时机施用抗体。单次剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每3月或每年。间隔也可以是不规则的，通过测量患者中针对靶抗原或某些生物标记物如OCN、OPG或PINP的抗体的血液水平来指示。在一些方法中，调节剂量以实现血浆抗体浓度为约1-1000μg/ml并且在一些方法中为约25-300μg/ml。
备选地，可以作为持续释放制剂施用抗体，在该情况中，需要低频率的施用。剂量和频率取决于抗体在患者中的半寿期而变。通常，人抗体显示出最长的半寿期，其次是人源化抗体、嵌合抗体，和非人抗体。剂量和施用频率可以随着治疗是预防性还是治疗性的而变。在预防性应用中，在长时间期间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者终生持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对高剂量直到疾病的进展减慢或者终止或者直到患者显示出疾病症状的部分或完全减轻。之后，可以对患者施用预防方案。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，只要活性成分的量对于具体患者、组合物和施用方式实现所希望的治疗应答，而对该患者无毒性。所选的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括使用的本发明的具体组合物或者其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，使用的具体化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所用的具体组分组合使用的其他药物、化合物和/或物质、被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和以前的医疗史，和医学领域中公知的其他因素。
本发明抗DKK1抗体的“治疗有效剂量”可以导致疾病症状严重性的降低、无疾病症状期的频率和持续时间的增加，或者由于疾病折磨而引起的病损或残疾的预防。
可以使用本领域已知的一种或多种方法，通过一种或多种施用途径施用本发明的组合物。如技术人员将理解，施用途径和/或方式将取决于所希望的结果而变。本发明抗体的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱其他肠胃外施用途径，例如，通过注射或灌注。如本文使用的短语“肠胃外施用”指不同于经肠和局部施用的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和intrastemal注射和灌注。
备选地，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径施用，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内、口腔、阴道、直肠、舌下或局部。
可以用保护活性化合物免于快速释放的载体制备活性化合物，如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂，和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的许多方法被申请专利或者是本领域技术人员公知的。见例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
可以用本领域已知的医学装置施用治疗组合物。例如，在一个实施方案中，可以用无针头的皮下注射装置施用本发明的治疗组合物，如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中所示的装置。可用于本发明的公知的植入物或组件的实例包括：美国专利号4,487,603，其说明了用于以受控速率分配药物的可植入的微量输液泵；美国专利号4,486,194，其说明了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其说明了用于以精确的输注速率递送药物的药物输液泵；美国专利号4,447,224，其说明了用于连续药物递送的变速流可植入输液器；美国专利号4,439,196，其说明了具有多个腔室的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其说明了渗透药物递送系统。将这些专利引入本文作为参考。许多其他此类植入物、递送系统，和组件是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，可以配制本发明的人单克隆抗体以确保在体内适当分配。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如果希望)，可以将它们用例如脂质体配制。关于生产脂质体的方法，见例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含一种或多种部分，其被选择性运输到特定细胞或器官中，从而增强定向药物递送(见，例如，V.V.Ranade，1989 J.Cline Pharmacol.29：685)。示例性定向部分包括叶酸或生物素(见，例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷类(Umezawa等人，1988 Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人，1995 FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，1995 Antimicrob.Agents Chernother.39：180)；表面活性剂A蛋白受体(Briscoe等人，1995 Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人，1994 J.Biol.Chem.269：9090)；也见K.Keinanen；M.L.Laukkanen，1994 FEBSLett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler，1994Immnunomethods 4：273。
组合
本发明还涉及在哺乳动物特别是人类中以药用物质的组合预防或治疗增殖性疾病或疾病如癌症的方法，其中包括：
(a)中和抗DKK1/4组合物；和
(b)一种或多种药用活性物质。
本发明另外涉及的药物组合物，其包括：
(a)中和抗DKK1/4组合物；
(b)药用活性物质；和
(c)可药用载体。
本发明另外涉及商业包装或产品，其包括：
(a)中和抗DKK1/4组合物的药物制剂；和
(b)同时、并列、单独或依次使用的药用活性物质的药物制剂。
药用活性物质
术语“药用活性物质”是涵盖许多具有不同作用机理的药用活性物质的广义范畴。若干这些药用活性物质和中和DKK1/4抗体/组合物的组合可导致癌症治疗的改进。通常，药用活性物质依据其作用机理分类。许多可获得的物质是多种肿瘤发生途径的抗代谢物，或与肿瘤细胞的DNA反应。这些也有抑制酶例如拓扑异构酶I和拓扑异构酶II的物质，或抗有丝分裂的物质。
术语“药用活性物质”尤其指不同于中和抗DKK1/4组合物或其衍生物的任一药用活性物质。它包括但不限定于：
i.芳化酶抑制剂；
ii.抗雌激素药、抗雄激素药或促性腺激素释放因子激动剂；
iii.拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂；
iv.微管活性剂、烷化剂、抗肿瘤的抗代谢物或铂化合物；
v.靶向/降低蛋白质或脂质激酶活性、或者蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物，或进一步的抗血管生成的化合物或诱导细胞分化过程的化合物；
vi.单克隆抗体；
vii.环加氧酶抑制剂、二磷酸盐、类肝素酶抑制剂、生物反应调节剂；
viii.Ras致癌同种型抑制剂；
ix.端粒末端转移酶抑制剂；
x.蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、甲硫氨酸氨肽酶抑制剂或蛋白酶体抑制剂；
xi.用于治疗血液性恶性肿瘤的试剂、靶向，降低或抑制Flt-3活性的物质；
xii.HSP90抑制剂；
xiii.抗增殖性抗体；
xiv.组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂；
xv.靶向、降低或抑制丝氨酸/苏氨酸mTOR激酶活性/功能的化合物；
xvi.促生长素抑制素受体拮抗剂；
xvii.抗白血病的化合物；
xviii.肿瘤细胞损伤方式；
xix.EDG结合剂；
xx.核苷酸还原酶抑制剂；
xxi.S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂；
xxii.VEGF或VEGFR的单克隆抗体；
xxiii.光动力学治疗；
xxiv.血管稳定(Angiostatic)类固醇；
xxv.包含糖皮质激素的植入物；
xxvi.ATI受体拮抗剂；和
xxvii.ACE抑制剂。
本文所用的术语“芳化酶抑制剂”涉及抑制雌激素生成即抑制底物雄烯二酮和睾酮分别转化为雌酮和雌二醇的化合物。该术语包括但不局限于类固醇、尤其是阿他美坦、依西美坦和福美坦，以及特别地非类固醇的、尤其是氨鲁米特、洛太米特、吡鲁米特、曲洛司坦、睾内脂、肤康王、伏氯唑、法倔唑、阿那曲唑和来曲唑。依西美坦商标为AROMASIN；福美坦商标为LENTARON；法倔唑商标为AFEMA；阿那曲唑商标为ARIMIDEX；来曲唑商标为FEMARA或FEMAR；氨鲁米特商标为ORIMETEN。包含的药用活性物质为芳化酶抑制剂的本发明组合对于治疗诸如乳腺肿瘤的激素受体阳性肿瘤尤其有用。
本文所用的术语“抗雌激素药”涉及在雌激素受体水平对抗雌激素效应的化合物。该术语包括但不局限于他莫西芬、氟维司群、雷咯昔芬和盐酸雷咯昔芬。他莫西芬可以以其NOLVADEX的商品化形式进行施用。盐酸雷咯昔芬可以以其EVISTA的商品化形式进行施用。氟维司群可以按照美国专利号4,659,516配制并且商标为FASLODEX。包含的药用活性物质为抗雌激素药的本发明组合对于治疗诸如乳腺肿瘤的雌激素受体阳性肿瘤尤其有用。
本文所用的术语“抗雄激素”涉及任何能够抑制雄激素生物效应的物质，并且包括但不局限于能够按照美国专利号4,636,505所公开的配制的比卡鲁胺(CASODEX)。
本文所用的术语“促性腺激素释放因子激动剂”包括但不局限于阿巴瑞克、戈舍瑞林和醋酸戈舍瑞林。戈舍瑞林在美国专利号4,100,274中得到公布，并且商标为ZOLADEX。阿巴瑞克可以按照美国专利号5,843,901中公布的配方进行制造。
本文所用的术语“拓扑异构酶I抑制剂”包括但不局限于托泊替康、gimatecan、依立替康、喜树碱及其类似物、9-硝基喜树碱和大分子的喜树碱结合物PNU-166148(WO 99/17804中的化合物A1)。依立替康可以以例如其诸如商标CAMPTOSAR的商品化形式进行施用。托泊替康可以以例如其诸如商标HYCAMTIN的商品化形式进行施用。
本文所用的术语“拓扑异构酶II抑制剂”包括但不局限于诸如多柔比星，其包含脂质体制剂，如CAELYX；其包含脂质体制剂，如DAUNOSOME、柔红霉素、表柔比星、伊达比星和奈莫柔比星、米托蒽醌和洛索蒽醌(蒽醌)、以及依托泊苷和替尼泊苷(鬼臼毒素)。依托泊苷商标为ETOPOPHOS；替尼泊苷商标为VM26-BRISTOL；多柔比星商标为ADRIBLASTIN或ADRIAMYCIN；表柔比星商标为FARMORUBICIN；伊达比星商标为ZAVEDOS且米托蒽醌商标为NOVANTRON。
本文所用的术语“微管活性剂”涉及微管稳定剂、微管去稳定剂和微管聚合抑制剂，其包括但不局限于诸如紫杉醇和多西紫杉的紫杉烷、诸如长春碱、尤其是硫酸长春碱盐的长春花生物碱、尤其是硫酸长春新碱的长春新碱、长春瑞滨、discodermolide、秋水仙碱和诸如epothilone B或其衍生物的epothilone及其衍生物。紫杉醇商标为TAXOL；多西紫杉商标为TAXOTERE；硫酸长春碱商标为VINBLASTIN R.P；硫酸长春新碱商标为FARMISTIN。也包括紫杉醇的一般形式以及紫杉醇的多种剂量形式。紫杉醇的一般形式包括但不限定于盐酸倍他洛尔。紫杉醇的多种剂量形式包括但不限定于商标为ABRAXANE、ONXOL、CYTOTAX的清蛋白纳米紫杉醇；discodermolide可例如美国专利号5,010,099中所公开的获得。还包含美国专利号6,194,181、WO 98/10121、WO 98/25929、WO 98/08849、WO 99/43653、WO 98/22461和WO 00/31247中公布的Epothilone衍生物。特别优选Epothilone A和/或B。
本文所用的术语“烷化剂”包括但不局限于环磷酰胺、异磷酰胺、美法仑，或亚硝基脲(BCNU或Gliadel)，或泰莫佐罗(TEMODAR)。环磷酰胺可以以例如其诸如商标CYCLOSTIN的商品化形式进行施用。环磷酰胺可以以例如其诸如商标CYCLOSTIN的商品化形式进行施用；而异环磷酰胺可以以例如其诸如商标HOLOXAN的商品化形式进行施用。
术语“抗肿瘤的抗代谢物”包括但不局限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、吉西他滨、DNA脱甲基化剂、例如5-阿扎胞苷和地西他滨、氨甲喋呤和依达曲沙、以及诸如培美曲塞的叶酸拮抗剂。卡培他滨可以以例如其诸如商标XELODA的商品化形式进行施用。吉西他滨可以以例如其诸如商标GEMZAR的商品化形式进行施用。
本文所用的术语“铂化合物”包括但不局限于卡铂、顺铂、顺氯氨铂、奥沙利铂、沙铂和铂物质如ZD0473。卡铂可以以例如其商标CARBOPLAT的形式进行施用。奥沙利铂可以以例如其商标ELOXATIN的形式进行施用。
本文所用的术语“靶向/减少蛋白质或脂质激酶活性，或蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物，或其他抗血管生成的化合物”包括但不限定于，酪氨酸蛋白激酶和/或丝氨酸和/或苏氨酸激酶抑制剂或脂质激酶抑制剂，例如：
i)靶向、降低或抑制血管内皮生长因子受体(VEGFR)活性的化合物，如靶向、降低或抑制VEGF活性的化合物，尤其是抑制VEGF受体的化合物，例如但不限定于，7H-吡咯[2，3-d]嘧啶衍生物(AEE788)、BAY43-9006、公开于WO 00/09495中的异胆碱(isolcholine)化合物如(4-叔丁基-苯基)-94-吡啶-4-基甲基-异喹啉-1-基)-胺(AAL881)；和
ii)靶向、降低或抑制血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制PDGFR活性的化合物，尤其是抑制PDGF受体的化合物，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，如imatinib、SU101、SU6668和GFB-111；
iii)靶向、降低或抑制成纤维细胞生长因子受体(FGFR)活性的化合物；
iv)靶向、降低或抑制胰岛素样生长因子受体1(IGF-1R)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制IGF-1R活性的化合物，尤其是抑制IGF-1R受体的化合物，如WO 02/092599中公布的那些化合物以及衍生物，4-氨基-5-苯基-7-环丁基-吡咯[2，3-d]嘧啶衍生物(AEW541)。
v)靶向、降低或抑制Trk受体酪氨酸激酶家族活性的化合物；
vi)靶向、降低或抑制Axl受体酪氨酸激酶家族活性的化合物；
vii)靶向、降低或抑制c-Met受体活性的化合物；
viii)靶向、降低或抑制Ret受体酪氨酸激酶活性的化合物；
ix)靶向、降低或抑制Kit/SCFR受体酪氨酸激酶活性的化合物；
x)靶向、降低或抑制C-kit受体酪氨酸激酶(PDGFR家族的一部分)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制c-Kit受体酪氨酸激酶家族活性的化合物，尤其是抑制c-Kit受体的化合物，例如imatinib；
xi)靶向、降低或抑制c-Abl家族成员及其基因融合产物(例如BCR-Abl激酶)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制c-Abl家族成员及其基因融合产物的化合物，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如imatinib、PD180970、AG957、NSC 680410或来自ParkeDavis的PD173955、BMS354825；
xii)靶向、降低或抑制蛋白激酶C(PKC)和丝氨酸/苏氨酸激酶的Raf家族成员、MEK、SRC、JAK、FAK、PDK和Ras/MAPK家族成员或者PI(3)激酶家族或PI(3)激酶相关激酶家族成员、和/或细胞周期蛋白依赖性激酶家庭(CDK)成员活性的、并且尤其是那些美国专利号5,093,330中公布的诸如米哚妥林的星形孢菌素衍生物的化合物；其他化合物的实例还包括例如UCN-01、沙芬戈、BAY 43-9006、苔藓抑素I、哌立福辛、llmofosine、RO 318220和RO 320432；诸如WO 00/09495中公布的那些异喹啉化合物、FTI、PD184352或QAN697、P13K抑制剂；
xiii)靶向、降低或抑制蛋白质酪氨酸激酶活性的化合物，例如靶向、降低或抑制蛋白质酪氨酸激酶抑制剂活性的、包括甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC)、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)或pyrymidylaminobenzamide及其衍生物(AMN 107)。酪氨酸磷酸化抑制剂优选低分子量(Mr<1500)的化合物或其可药用盐，尤其是选自苄叉丙二腈类或者S-芳基苯丙二腈或双底物喹啉类(bisubstrate quinoline class)的化合物，更尤其是选自酪氨酸磷酸化抑制剂A23/RG-50810、AG 99、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 213、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1748、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 490、酪氨酸磷酸化抑制剂B44、酪氨酸磷酸化抑制剂B44(+)对映异构体、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 555、AG 494、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 556、AG957和adaphostin(4-{[(2，5-二羟基苯基)甲基]氨基}-苯甲酸金刚烷酯、NSC 680410、adaphostin)的化合物；
xiv)靶向、降低或抑制受体酪氨酸激酶的表皮生长因子家族(同二聚体或异二聚体的EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制表皮生长因子受体家族活性的化合物尤其是抑制诸如EGF受体、ErbB2、ErbB3和ErbB4的EGF受体酪氨酸激酶家族成员或者结合EGF或EGF相关配体的化合物、蛋白质或抗体，并且特别是那些WO97/02266中一般性和特别地公布的化合物、蛋白质或单克隆抗体，例如实施例39的化合物或EP 0 564 409、WO 99/03854、EP 0520722、EP 0 566226、EP 0 787 722、EP 0 837 063、美国专利号5,747,498、WO 98/10767、WO97/30034、WO 97/49688、WO 97/38983、并且尤其是WO 96/30347(例如命名为CP 358774的化合物)、WO 96/33980(例如化合物ZD 1839)和WO 95/03283(例如化合物ZM105180)中的化合物，例如司徒曼布(HERCEPTIN)、西妥昔单抗、Iressa、Tarceva、OSI-774、CI-1033、EKB-569、GW-2016、E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3或E7.6.3、以及WO 03/013541中公开的7H-吡咯并-[2，3-d]嘧啶衍生物、厄洛替尼和吉非替尼。厄洛替尼可以以例如其诸如商标TARCEVA的商品化形式进行施用；而吉非替尼可以以例如其诸如商标IRESSA的商品化形式进行施用；以及
xv)靶向、降低或抑制丝氨酸/苏氨酸mTOR激酶活性的化合物尤其是抑制mTOR激酶家族成员化合物、蛋白质或抗体，例如RAD、RAD001、CCI-779、ABT578、SAR543、雷帕霉素及其衍生物、来自Ariad的AP23573、伊维莫司(CERTICAN)和西罗莫司。CERTICAN(伊维莫司，RAD)是防止T细胞和血管平滑肌细胞增殖的研究性新型增殖信号抑制剂。
当提及抗体时，其包括完整的单克隆抗体、纳米抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体组成的多特异性抗体，以及抗体片段，只要它们呈现预期的生物学活性。
本文所用的短语“靶向、降低或抑制蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物”包括但不限定于，磷酸酶1、磷酸酶2A、PTEN或CDC25的抑制剂，例如冈田酸或其衍生物。
本文所用的术语“单克隆抗体”包括但不限定于，贝伐单抗、西妥昔单抗、曲妥单抗、替伊莫单抗、狄诺塞麦、抗-CD40、抗-GM-CSF，以及托西莫单抗和碘I131。贝伐单抗可以以例如AVASTIN的商品化形式进行施用；西妥昔单抗可以以例如ERBI?TUX的商品化形式进行施用；曲妥单抗可以以例如HERCEPTIN的商品化形式进行施用；利妥昔单抗可以以例如MABTHERA的商品化形式进行施用；替伊莫单抗可以以例如ZEVULIN的商品化形式进行施用；抗-RANKL可以以例如狄诺塞麦(AMG162)的商品化形式进行施用、抗-CD40可以以例如HCD122(美国专利申请2002-0106371)的商品化形式进行施用，并且托西莫单抗和碘I 131可以以例如BEXXAR的商品化形式进行施用。
短语“进一步的抗血管生成的化合物”包括但不限定于具有它们的活性具有另一机制、例如与蛋白质或脂质激酶抑制无关的化合物，例如沙利度胺(THALOMID)和TNP-470。
本文所用的短语“诱导细胞分化过程的化合物”包括但不限定于视黄酸、α-γ-或β-生育酚或α-γ-或δ-生育三烯酚。
本文所用的术语“环加氧酶抑制剂”包括但不限定于例如Cox-2抑制剂、5-烷基取代的2-芳基氨基苯乙酸及衍生物，例如塞来考昔(CELEBREX)、罗非考昔(VIOXX)、艾托考昔、伐地考昔或5-烷基-2-芳基氨基苯乙酸，例如5-甲基-2-(2′-氯-6′-氟苯胺基)苯乙酸、鲁米昔布。
本文所用的术语“二磷酸盐”包括但不限定于etridonic acid、氯膦酸、替鲁磷酸、帕米磷酸、阿仑磷酸、伊班磷酸、利塞磷酸和唑来磷酸。“Etridonic acid”可以以例如DIDRONEL的商品化形式进行施用。“氯膦酸”可以以例如BONEFOS的商品化形式进行施用。“替鲁磷酸”可以以例如SKELID的商品化形式进行施用。“帕米磷酸”可以以例如AREDIA的商品化形式进行施用。“阿仑磷酸”可以以例如FOSAMAX的商品化形式进行施用。“伊班磷酸”可以以例如BONDRANAT的商品化形式进行施用。“利塞磷酸”可以以例如ACTONEL的商品化形式进行施用。“唑来磷酸”可以以例如ZOMETA的商品化形式进行施用。
本文所用的术语“类肝素酶抑制剂”是指靶向、降低或抑制硫酸肝素降解的化合物。该术语包括但不局限于PI-88。
本文所用的术语“生物反应调节剂”包括但不限定于是指淋巴因子或干扰素，例如干扰素γ。
本文所用的术语“Ras致瘤同种型的抑制剂”包括但不限定于H-Ras、K-Ras或N-Ras，如本文所用的，指靶向、降低或抑制Ras致癌活性的化合物，例如“法尼基转移酶抑制剂”，例如L-744832、DK8G557或P115777(ZARNESTRA)。
本文所用的术语“端粒末端转移酶抑制剂”包括但不限定于靶向、降低或抑制端粒末端转移酶活性的化合物。靶向、降低或抑制端粒末端转移酶活性的化合物尤其是抑制端粒末端转移酶受体的化合物，例如telomestatin。
本文所用的术语“基质金属蛋白酶抑制剂”或(MMP抑制剂)包括但不限定于胶原肽模拟抑制剂和非肽模拟抑制剂、四环素衍生物，例如异羟肟酸肽模拟抑制剂巴马司他及其口服的生物有效性类似物马立马司他(BB-2516)、普啉司他(AG3340)、metastat(NSC 683551)、BMS-279251、BAY12-9566、TAA211、MM1270B或AAJ996。
本文所用的术语“甲硫氨酸氨肽酶抑制剂”包括但不限定于靶向、降低或抑制甲硫氨酸氨肽酶活性的化合物。靶向、降低或抑制甲硫氨酸氨肽酶活性的化合物例如bengamide或其衍生物。
本文所用的术语“蛋白酶体抑制剂”包括靶向、降低或抑制蛋白酶体活性的化合物。靶向、降低或抑制蛋白酶体活性的化合物包括例如PS-341、MLN 341、硼替佐米或万珂。
本文所用的短语“用于治疗血液性恶性肿瘤的物质”包括但不限定于FMS样酪氨酸激酶抑制剂(例如靶向、降低或抑制FMS样酪氨酸激酶受体(Flt-3R)活性的化合物)、干扰素、1-b-D-阿糖呋喃胞嘧啶(ara-c)和重硫酸盐(bisulfan)、以及诸如靶向、降低或抑制退行性淋巴瘤激酶的化合物的ALK抑制剂。
本文所用的短语“靶向，降低或抑制Flt-3活性的物质”包括但不限定于抑制Flt-3的化合物、蛋白质或抗体，例如N-苯甲酰基-星孢菌素、米哚妥林、星孢菌素衍生物、SU 11248和MLN518。
本文所用的术语“HSP90抑制剂”包括但不限定于靶向、降低或抑制HSP90的内源ATP酶活性的化合物；通过泛素蛋白酶体途径降解、靶向、降低或抑制HSP90服务蛋白(HSP90 client protein)的化合物。靶向、降低或抑制HSP90内源的ATP酶活性的化合物尤其是抑制HSP90的ATP酶活性的化合物、蛋白质和抗体，例如一种格尔德霉素衍生物17-烯丙氨基，17-去甲氧基格尔德霉素(17AAG)、格尔德霉素相关的其他化合物、根赤壳菌素抑制剂和HDAC抑制剂。
本文所用的术语“抗增殖抗体”包括但不限定于曲妥单抗(HERCEPTIN)、曲妥单抗-DM1、厄洛替尼(TARCEVA)、贝伐单抗(AVASTIN)、利妥昔单抗(RITUXAN)、PR064553(抗CD40)和抗体2C4。抗体是指例如完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体组成的多特异性抗体、以及抗体片段，只要它们呈现目的生物学活性。
本文所用的术语“HDAC抑制剂”涉及抑制组蛋白脱乙酰酶和具有抗增殖活性的化合物。该化合物包括但不限定于公开于WO 02/22577中的化合物，特别是N-羟基-3-[4-[[(2-羟乙基)[2-(1H-吲哚-3-基)乙基3-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺和N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺及其可药用盐(LBH589)。另外特别包括辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)；[4-(2-氨基-苯氨羰基)-苯甲基]-氨基甲酸吡啶-3-基甲基酯及其衍生物；丁酸、pyroxamide、曲古抑菌素A、Oxamflatin、apicidin、酯肽、depudecin和trapoxin。
本文所用的短语“靶向、降低或抑制丝氨酸/苏氨酸mTOR激酶的活性/功能的化合物”包括但不限定于靶向/抑制mTOR激酶家族成员的化合物、蛋白质或抗体，例如RAD、RADOOl、CCI-779、ABT578、SAR543、雷帕霉素及其衍生物/类似物、来自Ariad的AP23573和AP23841、依维莫司(CERTICAN)和西罗莫司(RAPAMUNE)、CCI-779和ABT578。CERTICAN(依维莫司，RAD)是防止T细胞和血管平滑肌细胞增殖的研究性新型增殖信号抑制剂。
本文所用的术语“生长素抑制素受体拮抗剂”包括但不限定于靶向、治疗或抑制生长素抑制素受体的物质，例如奥曲肽和SOM230。
本文所用的术语“抗白血病的化合物”包括但不限定于嘧啶类似物Ara-C，所述嘧啶类似物为脱氧胞苷的2′-α-羟基核糖(阿糖胞苷)衍生物。还包括次黄嘌呤、6-巯基嘌呤(6-MP)和磷酸氟达拉滨的嘌呤类似物。
短语“肿瘤细胞损伤方式”意指诸如电离辐射的方式。上文和下文所述术语“电离辐射”表示以电磁射线(例如X-射线和γ-射线)或粒子(例如α-粒子和β-粒子)发生的电离辐射。电离辐射用于(但不局限于)辐射疗法，并在本领域是已知的。见Hellman，Principles of RadiationTherapy，Cancer，in Principles and Practice of Oncology，Devita等人编辑，第四版，第1卷，第248-275页(1993)。
本文所用的术语“EDG结合剂”包括但不限定于一类调节淋巴细胞再循环的免疫抑制剂，例如FTY720。
本文所用的术语“核苷酸还原酶抑制剂”包括但不限定于氟达拉滨和/或ara-C、6-硫代鸟嘌呤、5-FU、克拉曲滨、6-巯基嘌呤(尤其是与ara-C联用治疗ALL)和/或喷司他丁的嘧啶或嘌呤核苷类似物。核苷酸还原酶抑制剂尤其是羟基脲或2-羟基-1H-异吲哚-1，3-二酮衍生物，例如Nandy等人在Acta Oncologica，第33卷，第8期，第953-961页(1994)中提及的PL-1、PL-2、PL-3、PL-4、PL-5、PL-6、PL-7或PL-8。
本文所用的术语“S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂”包括但不限定于公开于美国专利号5,461,076中公开的化合物。
本文所用的短语“VEGF或VEGFR的单克隆抗体”包括但不限定于WO 98/35958中公开的化合物，例如1-(4-氯苯胺)-4-(4-吡啶基甲基)-2，3-二氮杂萘或其可药用盐如琥珀酸盐，或WO 00/09495、WO 00/27820、WO00/59509、WO 98/11223、WO 00/27819和EP 0 769 947中公开的化合物；由WO 00/37502和WO 94/10202中由Prewett等人，Cancer Res，第59卷，第5209-5218页(1999)，Yuan等人，Proc Natl Acad Sci USA，第93卷，第14765-14770页(1996)，Zhu等人，Cancer Res，第58卷，第3209-3214页(1998)，以及Mordenti等人，Toxicol Pathol，第27卷，第1期，第14-21页(1999)描述的那些化合物；由O′Reilly等人，Cell，第79卷，第315-328页(1994)描述的血管他丁(ANGIOSTATIN)；由O′Reilly等人，Cell，第88卷，第277-285页(1997)描述的内皮他丁(ENDOSTATIN)；邻氨基苯甲酸酰胺；ZD4190；ZD6474；SU5416；SU6668；贝伐单抗；或抗-VEGF抗体或抗-VEGF受体抗体如rhuMAb和RHUFab；VEGF适体如Macugon；FLT-4抑制剂；FLT-3抑制剂；VEGFR-2 IgG1抗体；Angiozyme(RPI 4610)和Avastan。
本文所用的术语“光动力学治疗”意指使用某些已知为光增敏剂的化学物质来治疗或预防癌症的疗法。光动力学疗法的实例包括使用诸如VISUDYNE和卟吩姆钠的物质的疗法。
本文所用的术语“血管稳定类固醇”包括但不限定于阻止或抑制血管发生的试剂，例如阿奈可他、曲安西龙、氢化可的松、11-α-表氢化可的松、脱氧皮(甾)醇、17α-羟孕酮、皮质酮、去氧皮质酮、睾酮、雌酮和地塞米松。
本文所用的短语“血管稳定类固醇的植入物”包括但不限定于诸如氟轻松、地塞米松的物质。
本文所用的术语“ATI受体拮抗剂”包括但不限定于诸如DIOVAN的物质。
本文所用的术语“ACE抑制剂”包括但不限定于CIBACEN、贝那普利、enazepril(LOTENSIN)、卡托普利、依拉普利、复辛普利、赖诺普利、莫昔普利、喹那普利、雷米普利、培哚普利和群多普利。
其他药用活性物质包括但不限定于植物生物碱、激素试剂和拮抗剂、生物反应调节剂、优选淋巴因子或干扰素、反义寡核苷酸或寡核苷酸衍生物、或者混杂的试剂或具有其他或未知作用机理的试剂。
在提供所引用的专利申请或科技出版物的情况，特别是这些公开物中的化合物权利要求、工作实施例的药物制剂和最终产品，其主题物质，药物制剂及其权利要求因此引入本申请作为参考。这里公开的同样包括相应的立体异构体以及相应的晶体变型，例如溶剂化物和多晶型物。在这里所公开的组合中用作活性成分的化合物可以分别如所引用文件中所描述的那样来进行制备和给药。
通过代码编号、通用名称或商业名称鉴定的活性剂结构可以从实际版次的标准提纲“默克索引”或诸如“国际专利(Patents International)(IMS世界出版物)”的数据库中获得。其中相应的内容在此引用作为参考。
应当清楚的是，在提及组分(a)和(b)是指也包括任一活性物质的可药用盐。例如，如果由组分(a)和/或(b)构成的活性物质含有，至少一个碱性中心，它们可以形成酸加成盐。如果需要，也可以形成含有另一个存在的碱性中心的相应的酸加成盐。含有酸根(例如COOH)的化合物也可以与碱形成盐。组分(a)和/或(b)中所包含的活性物质或其可药用盐中也可以以氢氧化物的形式应用或包括其他用于结晶的溶剂。
因此，一方面，本发明涉及用于预防或治疗哺乳动物(优选人类患者)中增殖性疾病或由持续血管生成引发的疾病的方法，该方法包括用药物有效量的下列组合共同或依次治疗患者：
(a)中和抗DKK1/4的组合物；和
(b)药用活性物质。
在优选的实施方案中，本发明提供药物制剂，其包括：
(a)中和抗DKK1/4的组合物；和
(b)选自芳化酶抑制剂、抗雌激素药、抗雄激素药、促性激素释放素拮抗剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、微管活性剂、烷化剂、抗肿瘤的抗代谢物、铂化合物、靶向/降低蛋白质或脂质激酶活性，或者蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物、抗血管生成化合物、诱导细胞分化过程的化合物、单克隆抗体、环加氧酶抑制剂、二磷酸盐、类肝素酶抑制剂、生物反应调节剂、Ras致瘤同种型的抑制剂、端粒末端转移酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、甲硫氨酸氨肽酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、靶向，降低或抑制Flt-3活性的物质、HSP90抑制剂、抗增殖抗体、HDAC抑制剂、靶向，降低或抑制丝氨酸/苏氨酸mTOR激酶的活性/功能的化合物、生长素抑制素受体拮抗剂、抗白血病的化合物、肿瘤细胞损伤方式、EDG结合剂、核苷酸还原酶抑制剂、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂、VEGF或VEGFR的单克隆抗体、光动力学治疗、血管稳定类固醇、包含糖皮质激素的植入物、ATI受体拮抗剂以及ACE抑制剂的一种或多种药用活性物质。
组分(a)和/或(b)的任一组合，包括施用这两种组分治疗温血动物的方法，包括同时、分别或依次使用这两种组分的药物组合物，该组合在增殖性疾病的进程延缓或治疗中的用途，或制备用于该目的的药物制剂的用途，或包括组分(a)和/或(b)的这类组合的商品，全部如上所提及或定义，随后提及作为本发明的组合(因此该术语指可在适当时代替该术语的任一这些实施方案)。
同时给药例如可以以两种或多种活性成分的一种固定的组合进行，或通过同时施用独立配制的两种或多种活性成分。依次使用(施用)优选地指在一个时间点施用组合的一种(或多种)组分，在不同的时间点施用其他组分，即以按时间顺序交错的方式，优选使该组合比单独施用单一化合物显示更有效(尤其显示协同作用)。分别使用(施用)优选指在不同的时间点彼此单独地施用组合的组分，优选指施用组分(a)和(b)以使在重叠时(在相同时间)，两种化合物的可测量血液水平无重叠。
两种或多种依次、分别和同时施用的组合也是可能的，优选组合的药物成分显示联合治疗效果，这种联合治疗效果远远超过以时间间隔单独使用组合药物成分时产生的效果(在它们的治疗功效上不能发现相互作用的效果)，协同作用效果是尤其优选的。
本文所用的术语“延缓进程”指向处于待治疗疾病的首发发作或复发的前期或早期的患者施用该组合，其中，例如诊断患者相应疾病的前期形式，或哪些患者患有病症，例如在医学治疗或由意外产生的病症期间，在该情况下很可能产生相应的疾病。
“联合治疗活性”或“联合治疗效果”指化合物可以这样的时间间隔(按时间顺序交错的方式，尤其是特异时间顺序的方式)分别施用，以使它们优选在待治疗的温血动物特别是人类中仍然显示(优选协同作用)相互作用(联合治疗效果)。不管是否如此，其可由下述血液水平来测定，所述血液水平显示至少在某些时段两种化合物都存在于待治疗的人类血液中。
“药物有效的”优选意指针对增殖性疾病进程在治疗上或在更广泛意义上也在预防上有效的量。
本文所用的术语“商业包装”或“产品”定义的尤其是一种“成套的试剂盒(kit of parts)”，其指的是如上所定义的组分(a)和(b)可独立地进行给药或通过使用具有不同数量的组分(a)和(b)的不同固定组合来进行给药，即可以同时或在不同的时间点进行给药。此外，这些术语包括在增殖性疾病的进程延缓或治疗中同时、依次(优选，按时间顺序交错，特异时间顺序)或单独(较不优选)使用的，包含有效成分组分(a)和(b)的商业包装，及其说明书。然后试剂盒的各部分可以例如同时给药或按时间顺序交错给药，即成套的试剂盒的任何部分可以在不同的时间点以相同或不同的时间间隔进行给药。特别优选所选择的时间间隔可以使各部分的联合应用对所治疗疾病的效果大于仅使用该组合伴侣(a)和(b)中的任何一种所获得的效果(如依据标准方法可测定的)。在联合制剂中用于进行给药的组合伴侣(a)与组合伴侣(b)的总量的比例可以变化，例如，为了符合所治疗的患者亚人群的需要或单个患者的需要(这些患者由于年龄、性别、体重等的不同而具有不同的需要)而进行变化。优选可以获得至少一种有益效果，例如组合伴侣(a)和(b)的作用相互增强，特别是具有协同作用，例如高于相加的作用、额外增加的有利作用、较少的副作用、在组合伴侣(a)和(b)中的一种或两种的非有效剂量下获得联合治疗效果，并且十分优选组合伴侣(a)和(b)具有强的协同作用。
在使用组分(a)和(b)的组合以及商业包装两种情况下，同时、依次和分别使用任一组合也是可能的，指可在一个时间点同时施用组分(a)和(b)；接着在之后的时间点(长期例如超过3-4周)以日剂量施用低宿主毒性的仅仅一种组分，随后是另外的组分；或者在更晚的时间点施用两种组分的组合(在后续的药物组合治疗过程中用于最佳的抗肿瘤效果)等。
本发明的组合也可与其他治疗组合施用，其他治疗例如外科手术、过热和/或放射治疗。
根据本发明的药物组合物可通过常规方法制备，并且为那些经肠内(例如口腔的或直肠的)或肠胃外施用于哺乳动物(包括人)的那些组合物，包括治疗有效量的VEGF抑制剂，以及单独或与一种或多种可药用载体组合的至少一种药用活性物质，特别是那些适用于肠内的或肠胃外的应用。
药物组合物包括从约0.00002至约100％，特别例如在即用输注稀释液的情况下是0.0001至0.02％，或例如在注射或输注浓缩物或特别是肠胃外制剂的情况下是从约0.1％至约95％，优选从约1％至约90％，更优选从约20％至约60％的活性成分(每一情况下都是以重量计)。根据本发明的药物组合物可以是例如单位剂量的形式，例如安瓿剂、小瓶、糖锭剂、输液袋或者胶囊剂形式。
本发明制剂中所用的每一组合伴侣的有效剂量可依据所用的具体化合物或药物组合物、给药模式、待治疗的病症和待治疗病症的严重性而变化。常规技术人员中的内科医师、临床医师或兽医师可容易地确定预防、治疗或抑制病情进展所需的每一活性成分的有效剂量。
酪氨酸磷酸化抑制剂，特别是Adaphostin，以约1-6000mg/天，更优选25-5000mg/天，最优选50-4000mg/天的剂量范围向温血动物尤其是人类优选施用。除非本文另作说明，该化合物优选以每天1-5次特别是1-4次来施用。
用于肠内的或肠胃外施用的组合治疗的药物制剂是例如单位剂量形式如糖衣片剂、胶囊剂或栓剂以及另外的安瓿剂。如不另作说明，这些制剂通过常规方法制备，例如借助于常规混合、粒化、糖衣化、溶解或冻干过程。应理解包含在每一剂型各个剂量所含组合伴侣的单位含量本身不需构成有效量，因为需要的有效量可通过施用多个剂量单位来达到。本领域的专业技术人员具备确定组合组分的适宜药物有效量的能力。
优选地，化合物或其可药用盐是以片剂、胶囊剂或糖浆剂的形式作为口服药物制剂，或如果合适作为肠胃外注射剂来施用的。
在口服施用的组合物制备中，可施用任一可药用介质例如水、乙二醇、油、乙醇、调味剂、防腐剂、着色剂。可药用载体包括淀粉、糖类、微晶纤维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、结合剂、崩解剂。
活性成分的肠胃外施用可使用活性成分的溶液、还有悬液、特别是等渗水溶液或悬液，在为仅包含活性成分或包含活性成分和载体(例如甘露醇)的冻干组合物时是可能的，所述溶液或悬液可在使用之前制备。该药物组合物可以进行灭菌，和/或包含诸如防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂的赋形剂，并且通过本身已知的方式、例如通过常规的溶解或冻干过程的方式进行制备。所述溶液或悬液可以包含增加粘度的物质，例如羧甲基纤维素纳、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯吡咯酮或者明胶。油中悬液包含作为油成分的、通常用于注射目的的植物的、合成的或者半合成油。
等渗制剂可选自本领域任一公知的那些例如甘露醇、葡聚糖、葡萄糖和氯化钠。输注制剂可用含水介质稀释。作为稀释剂应用的含水介质的量依据输注溶液中活性成分的需要浓度来选择。输注溶液可包括用于静脉内施用的制剂中通常应用的其他赋形剂例如抗氧化剂。
本发明还涉及本文所用的术语“联合制剂”，其定义的尤其是一种“成套的试剂盒(kit of parts)”，其指的是如上所定义的组合伴侣(a)和(b)可独立地进行给药或通过使用具有不同数量的组合伴侣(a)和(b)的不同固定组合来进行给药，即可以同时或在不同的时间点进行给药。然后试剂盒的各部分可以例如同时给药或按时间顺序交错给药，即成套的试剂盒的任何部分可以在不同的时间点以相同或不同的时间间隔进行给药。在联合制剂中用于进行给药的组合伴侣(a)与组合伴侣(b)的总量的比例可以变化，例如，为了符合所治疗的患者亚人群的需要或单个患者的需要(这些患者由于年龄、性别、体重等的不同而具有不同的需要)而进行变化。
本发明的用途和方法
本发明的抗体(和免疫连接物和双特异性分子)具有体外和体内诊断和治疗效用。例如，可以将这些分子施用于例如体外或体内的培养细胞，或者施用于受试者(例如，体内)以治疗、预防或诊断多种障碍。如本文所用的术语“受试者”意在包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、猫、奶牛、马、鸡、两栖动物和爬行类。所述方法尤其适于治疗具有与DKK1表达相关的病症的人类患者。当一起施用DKK1抗体与另一活性剂时，可以将两种以任一顺序或同时施用。
在一个实施方案中，本发明的抗体(和免疫连接物和双特异性分子)可以用于检测DKK1的水平，或者含有DKK1的细胞水平。这可以例如，通过将样品(如体外样品)和对照样品与抗DKK1抗体在允许抗体和DKK1之间形成复合体的条件下接触。检测抗体和DKK1之间形成的任何复合体并在样品和对照中比较。非限定的例如，可以使用本发明的组合物进行本领域公知的标准检测方法，如ELISA和流式细胞测定法。
因此，一方面，本发明还提供了检测样品中DKK1(例如，人DKK1抗原)的存在，或测量DKK1的量的方法，其包括将样品、对照样品与本发明的抗体或其特异结合DKK1的抗原结合部分在允许所述抗体或其部分与DKK1之间形成复合体的条件下接触。然后检测复合体的形成，其中样品与对照样品相比复合体形成的差异表明在该样品中存在DKK1。
本发明的范围内还包括试剂盒，其由本发明的组合物(例如，抗体、人抗体、免疫连接物和双特异性分子)和使用说明书组成。试剂盒可以还含有至少一种额外试剂，或者一种或多种本发明的额外抗体(例如，具有互补活性的抗体，其与第一种抗体结合靶抗原上不同的表位)。试剂盒通常包括标签，指出该试剂盒内含物的预期用途。术语标签包括在试剂盒上提供或试剂盒提供或附随该试剂盒的任何书面或录音材料。
已经完全描述了本发明，通过下面的实施例和权利要求进一步阐明本发明，所述实施例是说明性的并且不意在进一步限定。本领域技术人员将认识到或者能够仅仅使用常规实验确定本文所述具体步骤的许多等同方案。此类等同方案在本发明和权利要求的范围内。将本申请全文引用的所有参考文献，包括出版的专利和公布的专利申请的内容都引入本文作为参考。
实施例
实施例1：从HuCAL 文库中制备人DKK1特异性抗体
抗人DKK1蛋白质的治疗抗体可通过使用作为抗体变体蛋白质来源的市售噬菌体展示文库MorphoSys HuCAL 
Figure A200780009135D00892
文库，来挑选具有高结合亲和力的克隆来产生。HuCAL 
Figure A200780009135D00901
是Fab文库(Knappik等人，2000 J.Mol.Biol.296：57-86；Krebs等人，2001 J Immunol.Methods 254：67-84；Rauchenberger等人，2003 J Biol Chem.278(40)：38194-38205)，其中所有六个CDR通过适当的突变而多样化，并且应用CysDisplayTM技术将Fab片段连接到噬菌体表面(WO 01/05950 Lδhning 2001)。
常规程序：噬菌粒回复、噬菌体扩增以及纯化
HuCAL 文库在含有34μg/ml氯霉素和1％葡萄糖(2xYT-CG)的标准丰富细菌培养基(2xYT)中扩增。在OD600nm为0.5时用VCSM13辅助噬菌体感染细胞(于37℃静置温育细胞和噬菌体的混合物30分钟，接着于37℃以250转/分钟振荡30分钟)后，将细胞离心(4120g，5分钟，4℃)、重悬于2xYT/34μg/ml氯霉素/50μg/ml卡那霉素/0.25mM IPTG中，并于22℃生长过夜。在该阶段结束时通过离心将细胞移出，且从上清液中用PEG沉淀噬菌体两次，重悬于PBS/20％甘油中并于-80℃保存。
两轮筛选之间的噬菌体扩增如下进行：以DKK1蛋白质挑选后对用噬菌体感染的对数中期的大肠杆菌菌株TG1细胞进行洗脱，并且涂布于补充有1％葡萄糖和34μg/ml氯霉素的LB琼脂上(LB-CG平板)。该平板于30℃温育过夜后，将细菌克隆从琼脂表面刮下，并用于接种到2xYT-CG肉汤以使OD600nm达到0.5，然后加入VCSM 13辅助噬菌体以获得如上所述的生产性感染。
使用Strep-Tactin磁珠进行溶液淘选(solution panning)的预试验
已报道Strep-tag II对Strep-Tactin基质具有低亲和力(依据Voss和Skerra，1997 Protein Eng.10:975-982，KD约1μM)，因此，进行预试验以评估使用Strep-Tactin包被的MagStrep小珠在抗体选择期间捕获抗原且在淘选期间避免抗原丢失的适宜性。
为此，8mg的MagStrep小珠与46μg的His-Strep标记的DKK1于室温温育1h并且样品分装进四个预封盖的Eppendorf管中。一管作为阳性对照(未洗涤)并且依据HuCAL 
Figure A200780009135D00911
手册的淘选部分以不同严格性洗涤其他三个样品。使用山羊抗DKK1抗体和铷标记的抗山羊检测抗体，在BioVeris中对His-Strep标记的DKK1与MagStrep磁珠(获自IBA的Strep-Tactin包被的磁珠，
Figure A200780009135D00912
德国)的结合进行检测。
如本文中图1所示，当未洗涤的小珠与那些用不同
Figure A200780009135D00913
严格性洗涤的小珠比较时，没有检测到明显的His-Strep标记的DKK1从Strep-Tactin包被的小珠丢失。因此，His-Strep标记的DKK1似乎适用于用Strep-Tactin包被的磁珠(MagStrep磁珠)进行的溶液淘选。
通过从文库中淘选DKK1特异性抗体来筛选
为了筛选识别人DKK1的抗体，应用两种淘选策略。
总的来说，将HuCAL 
Figure A200780009135D00914
噬菌体抗体分成包括VH主基因的不同组合的四个集合(包含VH1/5λκ的1集合；包含VH3λκ的2集合；包含VH2/4/6λκ的3集合；以及包含VH1-6λκ的4集合)。这些集合单独地接受两轮捕获于Strep Tactin磁珠(Mega Strep小珠，IBA)上的His-Strep标记的DKK1的溶液淘选，并且仅对于第三轮挑选，在捕获于Strep Tactin磁珠上的His-Strep标记的DKK1上或在由Streptavidin小珠(M-280 Streptavidin，Dynal)捕获的APP标记的人DKK1蛋白质上都含生物素化的抗APP抗体。
详细地，为了使用结合StrepTactin磁珠的His-Strep标记的DKK1进行溶液淘选，应用以下方案：通过将预封盖的管子(1.5ml Eppendorf管)用以PBS 1:1稀释的1.5ml 2x ChemiBLOCKER于4℃处理过夜来准备。预封闭的小珠通过如下处理来制备：580μl(28mg的小珠)StrepTactin磁珠用580μl PBS洗涤一次并重悬于580μl Ix ChemiBLOCKER(稀释于一倍体积的Ix PBS)中。小珠的封闭在预封盖的管子中于4℃过夜进行。
为每一淘选条件而稀释于终体积为500μl的PBS中的噬菌体颗粒与500μl 2x ChemiBLOCKER/0.1％ Tween混合，并且于室温下在摇床(rotating wheel)上保持1小时。为去除StrepTactin或小珠结合的噬菌体而进行两次噬菌体颗粒的预吸附：将160μl封闭的StrepTactin磁珠(4mg)加入到封闭的噬菌体颗粒中，并且于室温在摇床上温育30分钟。通过磁性装置(Dynal MPC-E)分离小珠后，噬菌体上清液(约1.1ml)转移到新鲜的、封盖的反应管中，并且使用160μl封闭的小珠重复预吸附30分钟。然后，将400nM或100nM His-Strep标记的DKK1加入到新的、封盖的1.5ml反应管中的封闭的噬菌体颗粒中，并且混合物于室温下在摇床上温育60分钟。
噬菌体抗原复合物可使用分别加入到400nM或100nM噬菌体淘选集合中的320μl或160μl封闭的StrepTactin磁珠来捕获，然后于室温下在摇床上温育20分钟。结合到StrepTactin磁珠的噬菌体颗粒再次用磁性颗粒分离器收集。
小珠然后用PBS/0.05％ Tween(PBST)洗涤七次，接着仅用PBS另外洗涤三次。噬菌体颗粒从StrepTactin磁珠中的洗脱通过向每一管中加入10mM Tris-HCl、pH8.0中的200μl 20mM DTT进行10分钟。收集洗脱液，小珠用200μl PBS洗涤一次并且将PBS洗脱液加入到DTT洗脱液中。该洗脱液样品用于感染14ml已生长到OD600nm为0.6-0.8的大肠杆菌TG-1培养物。
在感染以及之后的5000转/分钟离心10分钟后，每一细菌沉淀重悬于500μl 2xYT培养基中，涂布于2xYT-CG琼脂平板上并于30℃温育过夜。第二天早上，将得到的克隆从平板上刮下并且通过上述的回复和扩增来制备噬菌体。
对His-Strep标记的DKK1的第二轮溶液淘选依据第一轮的方案进行，除了使用减少量的抗原(50nM和10nM)和适当改变洗涤程序的严格性。
两种不同的淘选策略应用于第三轮筛选：第二轮淘选的扩增噬菌体的产量是分开的并且接受用于两种不同筛选条件。第一半噬菌体产量用于从上述StrepTactin小珠上捕获的人His-Strep标记的DKK1的标准淘选策略(抗原量分别是10nM或1nM)。
第三轮挑选的第二种筛选变通方案是在人APP标记的DKK1上进行的。终浓度为50nM或10nM的APP标记的DKK1蛋白质与1ml预清洗的第二轮噬菌体颗粒混合，并且混合物于室温下在摇床上温育1小时。平行地，8mg预封闭的Dynabeads M-280 Streptavidin(Dynal)与40μg生物素化的小鼠抗APP抗体于室温下在摇床上温育30分钟，接着用PBST进行两步洗涤。由结合到APP标记的DKK1的噬菌体-抗体组成的预形成的复合物通过抗APP对包被的M-280 Streptavidin磁珠于室温下30分钟。噬菌体的洗脱和扩增如上进行。
可溶性Fab片段的亚克隆和表达
将挑选的HuCAL 
Figure A200780009135D00931
噬菌粒编码Fab的插入序列亚克隆进表达载体
Figure A200780009135D00932
X9_Fab_FH，以促进快速并有效地表达可溶性Fab。为此，所选克隆的质粒DNA用限制性核酸内切酶Xba I和EcoR I消化，从而切除编码Fab的插入序列(ompA-VLCL和phoA-Fd)。然后将该插入序列克隆进Xba I/EcoR I消化的表达载体
Figure A200780009135D00933
X9_Fab_FH。
Fab蛋白质从该载体中表达，并且从而携带用于检测和纯化的两个C末端标记(分别是FLAGTM和6xHis)。
大肠杆菌中HuCAL 
Figure A200780009135D00934
Fab抗体的微表达
为获得足够量的由上述获得的每个克隆编码的蛋白质，在将挑选的Fab亚克隆进X9_Fab_FH表达载体后筛选耐受氯霉素的单一细菌克隆。然后每个这些克隆接种到灭菌的96孔微量滴定板的孔中，每个孔含有100μl 2xYT-CG培养基每孔，并且细菌于37℃生长过夜。将每一大肠杆菌TG-1培养物的样品(5μl)转移到新鲜的、灭菌的、预填有补充了34μg/ml氯霉素和0.1％葡萄糖每孔的100μl 2xYT培养基的96孔微量滴定板中。微量滴定板于30℃在微量滴定板摇床上以400转/分钟振荡温育直至培养物稍微浑浊(约2-4小时)，OD600nm约0.5。
为以这些平板的形式表达，将补充了34μg/ml氯霉素和3mMIPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的20μl 2xYT培养基加入到每个孔中(终浓度为0.5mM的IPTG)，微量滴定板用气体渗透带密封，并于30℃以400转/分钟振荡温育过夜。
全部细胞裂解物的制备(BEL提取物)
向表达平板的每个孔中加入含2.5mg/ml溶菌酶的40μl BEL缓冲液(2xBBS/EDTA：24.7g/l硼酸、18.7g NaCl/l、1.49g EDTA/l，pH8.0)，并且平板于22℃在微量滴定板振荡器上(400转/分钟)温育1小时。BEL提取物用于通过FMAT的结合分析(参见实施例2)。
大肠杆菌中微克量的HuCAL 
Figure A200780009135D00941
Fab抗体的表达和纯化
在50ml的塑料管中进行由大肠杆菌TG1F细胞中的
Figure A200780009135D00942
X9_Fab_FH编码的Fab片段的表达。为此，用单一克隆接种的预培养物于30℃在2xYT-CG培养基中生长过夜。第二天早上，50μl的每一预培养物用于接种到灭菌的50ml塑料管中以补充了4μg/ml氯霉素、1mM IPTG和0.1％葡萄糖的25ml 2xYT培养基中，并于30℃温育过夜。收获大肠杆菌细胞，冷冻细胞沉淀最终用Bug Buster(Novagen)裂解(disrupt)。使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen，Hilden，德国)分离Fab片段。
大肠杆菌中毫克量的HuCAL 
Figure A200780009135D00943
Fab抗体的表达和纯化
在使用补充了34μg/ml氯霉素的750ml 2xYT培养基的摇瓶培养物中进行由TG 1F细胞中的
Figure A200780009135D00944
X9_Fab_FH编码的Fab片段的表达。培养物于30℃振荡直至OD600nm达到0.5。加入0.75mM IPTG诱导表达，接着于30℃温育20小时。细胞使用溶菌酶裂解，并且Fab片段由Ni-NTA色谱(Qiagen，Hilden，德国)分离。蛋白质浓度通过UV-分光光度计(Krebs等人，2001)测定。
实施例2：DKK1特异性的
Figure A200780009135D00951
抗体的鉴定
由上述淘选策略挑选的各个大肠杆菌克隆的BEL提取物通过微体积荧光试验技术(FM ATTM，8200 Cellular Detection System analyzer，Applied Biosystems，Foster City，Calif)分析，以鉴定编码DKK1特异性Fab的克隆。FM ATTM 8100 HTS系统是共聚焦式高通量荧光筛选仪器，其自动检测活细胞或小珠的混合并读取、是非放射性试验(Miraglia，J.Biomol.Screening(1999)，4(4)193-204)。
用于从细菌裂解物中检测DKK1结合的Fab的基于微体积荧光试验技术(FMAT)的结合分析
为从大肠杆菌裂解物(BEL提取物)中检测DKK1结合的Fab抗体，用FMAT 8200细胞检测系统(Applied Biosystems)来分析结合。为将His-Strep标记的DKK1结合到M-450 Expoxy小珠(Dynal)上，将300μlM-450 Epoxy小珠(1.2x108小珠)的样品转移进反应管中并用磁性颗粒分离器捕获。移除上清液并且小珠用1ml 100mM、pH7.4的磷酸钠缓冲液洗涤四次。为包被抗原，向150μl 100mM、pH7.4的磷酸钠缓冲液中的小珠悬浮液中加入60μg His-Strep标记的DKK1。抗原-小珠悬浮液于室温下在摇床上温育16小时。然后包被的小珠用PBS洗涤三次并且重悬于终体积为250μl的PBS中。
为每一384孔平板准备含3％ BSA、0.005％ Tween-20、4μl DKK1包被的小珠(1.9x106小珠)的20ml PBS和4μl Cy5TM检测抗体的混合物。45μl该溶液的样品分配到384孔FMAT黑色/透明的平底板的(AppliedBiosystems)各孔中。将含Fab的BEL提取物(5μl)加入每一孔中。FMAT平板于室温下温育过夜。第二天早上平板在8200 Cellular Detection系统(Applied Biosystems)中分析。
获得阳性克隆，分析在FMAT中产生阳性的、特异性信号的克隆重链和轻链序列。据观测，鉴定显示对人DKK1强烈结合的57个独特的(非冗余)抗DKK1克隆。将这些克隆表达、纯化并测试亲和力以及进行功能性试验。
使用表面等离振子共振测定纳摩尔亲和力
使用这些克隆，在CM5芯片(Biacore，瑞典)上进行动力学的SPR分析，该芯片使用标准的EDC-NHS胺结合化学技术以10mM、pH4.5醋酸钠中的400RU密度的重组人DKK1、小鼠DKK1(R&D System)或食蟹猴DKK1包被。相当量的人血清白蛋白(HSA)固定在参考流动池上。PBS(136mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4pH7.4)用作运转缓冲液。Fab制剂以20μl/分钟流速、16-500nM的浓度梯度应用。联合相设置于60秒且解离相设置于120秒。该方法测定的对每一人类、小鼠和食蟹猴DKK1的纳摩尔级亲和力的概述于本文所示的表1中。
表1.挑选的Fab对每一人类、小鼠和食蟹猴的亲和力
 
抗体 KD[nM]人DKK1     KD[nM]小鼠DKK1＊      KD[nM]食蟹猴DKK1＊       
MOR04470 3.2±2.0 3.6 1.7
MOR04516 2.6±0.7 2.4 1.9
MOR04454 3.2±0.4 6 2.7
MOR04456 7.9±0.9 11.6 8.1
MOR04461 7.6±3.3 12.8 7.3
MOR04455 1.6±0.3 n.d. 1.5
＊单一测定
n.d.：未检出
实施例3：抑制DKK1的Wnt拮抗活性的抗人DKK1 Fab候选物的鉴定
使用得到的选自HuCAL 
Figure A200780009135D00961
文库的57个不同的DKK1特异性抗体以获得纯化抗体，然后用于测试抑制人DKK1的Wnt拮抗活性的能力。这些抗体中的17个抗体候选物具有功能性活性，如图2和4所示。
使用荧光素酶报告基因试验检测每一
Figure A200780009135D00971
Fab的功能性活性。在表现出荧光素酶基因TCF/Lef应答的荧光素酶报告基因上游克隆12个TCF/Lef的结合位点。常规的规范Wnt蛋白质导致β联蛋白的稳定性，从而激活TCF/Lef的转录并产生荧光素酶蛋白质。DKK1蛋白质的加入阻碍Wnt活性并因此也阻碍荧光素酶基因的转录。结果，期望由各个细胞产生的荧光素酶水平与挑选的Fab阻碍DKK1作用的能力相关。
稳定的TCF/Lef应答的报告细胞系HEK293T/17-12xSTF
使用稳定的人胚胎肾细胞报告细胞系HEK293T/17-12xSTF来进行生物试验。细胞培养于含有10％ FCS(PAN或BioWhittaker)和1μg/ml嘌呤霉素(BD Biosciences)的DMEM高葡萄糖培养基(Invitrogen)中，直至达到90％汇合。然后将细胞用胰蛋白酶消化、计数并稀释于不含嘌呤霉素的培养基中以达到4x105细胞/ml的浓度。随后，细胞接种到白色的、平底的96孔板中(Corning，每孔100μl细胞悬浮液)，并于37℃和5％CO2中培养过夜。第二天，准备试验培养基：将500ng/ml DKK1-APP加入到Wnt3a条件培养基(CM)中。抗DKK1 Fab(20μg/ml的终浓度)和用作阳性对照的山羊抗人DKK1抗体(R&D Systems)(1.5μg/ml的终浓度)稀释于CM中。
从试验平板的每一孔中移出60μl体积的培养基而不扰乱贴壁的细胞，并用稀释于CM中的60μl试验抗体或对照替代。细胞再培养24小时并向每孔加入100μl明亮(Bright-Glo)荧光素酶试剂。5分钟温育时间后，在光度计(GenioPro，Tecan)上读取荧光。57个Fab中的20个获得的结果显示于本文图2中。表达的荧光素酶范围是抗体存在范围的度量。
实施例4：结合亲和力的定量分析：抑制DKK1的Wnt拮抗活性的抗人DKK1 Fab候选物的测定
亲和力测定
为进一步表征抗DKK1抗体，测定对人类、食蟹猴和小鼠DKK1的亲和力。重组DKK1蛋白质固定在CM5 Biacore芯片上并将Fab应用于不同浓度的流动相。为了可信地测定单价亲和力，仅仅将这批Fab用于Biacore测定，所述这批Fab在大小排阻色谱中显示为大于90％的单体片段。
人类、小鼠和食蟹猴DKK1的亲和力数据总结于表2中。发现所有17个待测Fab都具有对人DKK1的100nM以下的亲和力。另外，产生抗体的9个克隆的亲和力低于10nM。在所有测试情况下，对食蟹猴和小鼠DKK1的亲和力几乎等同于对人DKK1的那些亲和力。
表2.挑选的Fab对人类、小鼠和食蟹猴的亲和力数据
抗体 KD[nM]人DKK1 KD[nM]小鼠DKK1＊     KD[nM]食蟹猴DKK1＊    
MOR04480 1.0±0.0 2 n.d.
MOR04455 1.6±0.3 n.d. 1.5
MOR04516 2.6±0.7 2.4 1.9
MOR04470 3.2±2.0 3.6 1.7
MOR04454 3.2±0.4 6 2.7
MOR04483 5.5±0.7 n.d. n.d.
MOR04466 6.5±2.1 n.d. n.d.
MOR04461 7.6±3.3 12.8 7.3
MOR04456 7.9±0.9 11.6 8.1
MOR04462 16.5±2.1 n.d. n.d.
MOR04447 22＊ n.d. n.d.
MOR04469 36±0.0 n.d. n.d.
MOR04482 36±5.7 n.d. n.d.
MOR04468 41.5±21.9 n.d. n.d.
MOR04476 44＊ n.d. n.d.
MOR04481 65＊ n.d. n.d.
MOR04503 93＊ n.d. n.d.
＊单一测定
n.d.：未检出
EC50测定
显示用于对DKK1具有最强亲和力的抗体克隆抑制达50％的有效浓度的数据本文显示于表3中。数据显示有效浓度EC50范围从39至95nM，具有58和83nM间的中值。
表3.用于对挑选的Fab抑制达50％的有效浓度
 
抗体 荧光素酶报道基因试验EC50[nM]
MOR04470 58
MOR04516 42
MOR04454 83
MOR04456 95
MOR04461 57
MOR04455 39
实施例5：通过LCDR3和HCDR2盒的平行交换的挑选的抗DKK1Fab的亲和力成熟
为优化本文描述的抗体对DKK1的亲和力，对于母本Fab片段的集合，每一母本Fab的轻链的LCDR3、构架4和恒定区使用BpiI和SphI来去除，并且用多样化的LCDR3连同构架4和恒定域的所用组成成分来替换。将0.5μg的结合集合载体(binder pool vector)样品结合到超过携带多样化LCDR3的3倍摩尔量插入片段。
在相似的方法中，使用XhoI和BssHII位点将HCDR2多样化，并且连接构架区保持不变。为增加克隆效率，在插入多样化HCDR2盒前用590bp填充序列来取代母本HCDR2。
将11个不同文库的连接混合物电穿孔进入4ml大肠杆菌TOP10F′细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，产生2x107至2x108的各个克隆。如前所述地进行文库扩增(Rauchenberger等人，2003 J Biol Chem.278(40)：38.194-38205)。为了控制质量，随机挑选每一文库中的几个克隆并使用引物CFR84(VL)和OCAL_Seq_Hp(VH)进行测序(SequiServe，Vaterstetten，德国)。
挑选亲和力成熟的候选物
选出的六个挑选的成熟候选物(“母本Fab”)表征为具有以下特征：对人DKK1的亲和力小于10nM，食蟹猴和小鼠DKK1具有显著的交叉反应，EC50小于100nM，并且优于大肠杆菌中的(中等)Fab表达水平以及Fab纯化后缺乏聚集。
在亲和力测定过程中，很显然MOR04480在高度稀释时极其不稳定。为此，MOR04480从成熟候选物的列表中删除，虽然其在所有待测Fab中具有最高亲和力(1nM)和最好EC50(7nM)。MOR04483对人DKK1具有5.5nM的高亲和力，但是显示对小鼠DKK1交叉反应，且MOR04453包含纯化后高比例的Fab聚集。因此，这两种抗体也从成熟候选物中排除。
在仔细评估所有可获得数据后，选出六个成熟候选物(MOR04454、MOR04455、MOR04456、MOR04461、MOR04470和MOR04516)。这些候选物的特征在本文中列于表4中。
表4.挑选的Fab的特征
 
抗体 KD[nM]人DKK1 KD[nM]小鼠DKK1＊ KD[nM]食蟹猴DKK1＊ EC50[nM] 交叉反应性小鼠   Fab表达[mg/l]   大小排阻色谱
MOR04470 3.2±2.0 3.6 1.7 58 ++ 32.8 #
MOR04516 2.6±0.7 2.4 1.9 42 ++ 1.5 #
MOR04454 3.2±0.4 6 2.7 83 ++ 17.8 #
MOR04456 7.9±0.9 11.6 8.1 95 ++ 10.7 #
MOR04461 7.6±3.3 12.8 7.3 57 ++ 12 #
MOR04455 1.6±0.3 n.d. 1.5 39 ++ 9 #
＊单一测定
n.d.：未检出
#单体部分大于90％
用于亲和力成熟的挑选的Fab文库的制备
为了获得具有抗DKK1抗体的增强亲和力和抑制活性的克隆，前面实施例中所示的挑选的Fab克隆MOR04454、MOR04455、MOR04456、MOR04461、MOR04470和MOR04516接受另一轮的多样化和挑选，即称为亲和力成熟的过程。
为此，使用由三核苷酸突变预建模的相应的LCDR3和HCDR2成熟盒来使CDR区多样化(Virnekas等人，1994Nucleic Acids Res.22：5600-5607；Nagy等人，2002 Nature Medicine 8：801-807)。本文的表5显示针对母本克隆MOR04454、MOR04455、MOR04456、MOR061、MOR04470和MOR4516的LCDR3序列。
表5.针对挑选的Fab的LCDR3序列
 
抗体 VL LCDR3序列 SEQ ID NO：
MOR04454 K1 LQYYGMPP 21
MOR04455 K1 QQYDSIPM 22
MOR04456 K3 QQYGDEPI 23
MOR04470 L2 QSYASGNTKV 25
MOR04461 L2 STWDMTVDF 24
MOR04516 L1 ASFDMGSPNV 26
本文的表6显示针对母本克隆MOR04454、MOR04455、MOR04456、MOR061、MOR04470和MOR4516的HCDR2序列。
表6.针对挑选的Fab的HCDR2序列
 
抗体 VH HCDR2序列 SEQ ID NO：
MOR04454 H3 DGSHMDKPPGYVFAF 2
MOR04455 H3 HYMDH 3
MOR04456 H3 TIYMDY 4
MOR04461 H3 MGIDLDY 5
MOR04470 H3 HGIDFDH 6
MOR04516 H5 GIPFRMRGFDY 7
将来自表达载体
Figure A200780009135D01021
X9_Fab_FH的Fab片段亚克隆进噬菌粒载体
Figure A200780009135D01022
25(参见US专利号6,753,136)中。该载体提供N端融合半胱氨酸残基和C末端半胱氨酸也融合到Fd抗体链的噬菌体蛋白质pIII，并因此提供各个Fab片段在噬菌体表面的二硫化物连接的展示。两种不同的策略平行应用以优化母本Fab的亲和力和功效。
产生五个噬菌体抗体Fab文库，其中六个母本克隆中的五个LCDR3由单独的轻链CDR3序列所用组成成分来取代。未进行MOR04454的LCDR3成熟，因为该克隆在一个CDR区具有附加的Bpi I限制性位点并将Bpi I限制酶用于文库克隆程序。
平行地，每个母本克隆的HCDR2区由单独的重链CDR2序列所用组成成分来取代。将每个母本Fab切除并用590bp填充片段取代。在成熟淘选期间该DNA填充片段促进单消化载体从双消化载体条带中分离并且减少高亲和力母本Fab的背景。
在后续步骤中，填充片段从每个母本克隆的Fab编码噬菌粒中切除并用高度多样化的HCDR2成熟盒来取代。
多于2x107个成员的巨大的亲和力成熟文库通过标准的克隆程序来产生，并且将多样化的克隆转化进电感受态大肠杆菌TOP10F′细胞(Invitrogen)。如上述实施例1中描述地来制备含Fab的噬菌体。
构建四个成熟集合以促进后续的挑选过程：集合1a组成为MOR04470和MOR04516 LCDR3文库；集合1b组成为MOR04470和MOR04516HCDR2文库；集合2a组成为MOR04454、MOR04455、MOR04456和MOR04461 LCDR3文库；以及集合2b组成为MOR04454、MOR04455、MOR04456和MOR04461 HCDR2文库。
在溶液中使用减少量的His-Strep标记的DKK1和由Strep-Tactin小珠捕获的噬菌体-抗原对每个组成为进行淘。平行地，使用减少量的在Neutravidin包被的平板捕获的生物素化的DKK1将每个库应用于淘选。为增强淘选严格性并挑选出提高的解离率，在延长温育期期间进行与纯化的母本Fab以及未标记抗原的竞争。
筛选后立即将富集的噬菌粒集合亚克隆进pMORPH X9_FH表达载体。选出约2300个单克隆，并且以IPTG诱导Fab。
成熟筛选策略
在溶液中分别以His-Strep标记的DKK1以及以生物素化的His-Strep标记的DKK1进行两轮或三轮使用四个抗体集合的筛选程序。对于每一筛选策略，应用与纯化的母本Fab蛋白质或与未标记的APP标记DKK1的竞争，以及低抗原浓度和大量的洗涤来增强严格性。
通过主要依据描述于实施例1的标准方案的两轮挑选来进行对未标记的His-Strep标记的DKK1的溶液淘选。但是这些程序应用减量抗原(从5nM减少至1nM)、含或不含竞争剂的洗涤程序的高严格性，以及抗体-噬菌体连同抗原的延长的温育期。
对于第一轮挑选，使用生物素化的DKK1，将Neutravidin平板的孔用300μl PBS洗涤两次。孔用1:1稀释于PBS(封闭缓冲液)中的2xChemiBLOCKER(
Figure A200780009135D0103152047QIETU
，Temecula，CA)封闭。挑选前，HuCAL
Figure A200780009135D01031
噬菌体也用一倍体积的含0.1％Tween-20的封闭缓冲液于室温下封闭30分钟。将封闭的噬菌体制剂以100μl等分量转移至于室温下经30分钟Neutravidin包被的平板的孔中。该预吸附步骤重复一次。封闭的和预清洗的噬菌体制剂与5nM生物素化的DKK1于22℃在摇床上温育2小时。加入母本Fab、APP-DKK1或非竞争剂并且样品于4℃在摇床上温育过夜。
于室温经20分钟在Neutravidin平板的孔中捕获抗原噬菌体复合物。在大量洗涤步骤后，通过向每孔加入200μl的10mM Tris中的20mMDTT(pH8.0)于室温经10分钟来洗脱结合的噬菌体颗粒。将洗脱液移出并加入到OD600nm为0.6-0.8的14ml大肠杆菌TG1细胞中。孔用200μlPBS洗涤一次并且该溶液也加入到大肠杆菌TG1细胞中。噬菌体感染大肠杆菌于37℃静置进行45分钟。5000转/分钟离心10分钟后，细菌沉淀各自重悬于500μl 2xYT培养基中，涂布于2xYT-CG琼脂板上并于30℃温育过夜。通过从平板表面刮下来收获克隆并且如上所述将噬菌体颗粒回复和扩增。
如上所述地对第一轮挑选进行第二轮和第三轮挑选，只是洗涤条件更加严格并且抗原浓度分别是1和0.1nM。
基于电化学发光(BioVeris)的结合Fab的DKK1的结合分析
为了检测大肠杆菌裂解物(BEL提取物)中亲和力增强的、DKK1特异性抗体片段，使用BioVeris M-384 
Figure A200780009135D01041
 Workstation(Bio Veris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)。在96孔聚丙烯微量滴定板中完成进行该试验并且以补充0.5％ BSA和0.02％ Tween-20的PBS作为试验缓冲液。依据供应商的说明书将生物素化的人DKK1固定在M-280 Streptavidin顺磁小珠(Dynal)上。每孔加入1:25稀释度的小珠贮备液。100μl稀释的BEL提取物样品和小珠于室温下在振荡器上温育过夜。为了检测，依据供应商(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)的说明书，使用以BV-tagTM标记的抗人(Fab)′2(Dianova)。
一组约2300个随机挑出的克隆通过上述方法分析。选择给出最高值的一组160个克隆用于溶液平衡滴定中的进一步分析。
使用溶液平衡滴定(SET)的皮摩尔亲和力的测定
对于KD测定，使用Fab的单体片段(由分析性SEC分析的至少90％单体含量；Superdex75，Amersham Pharmacia)。如由Haenel等人，2005描述地从基本上进行溶液中基于电化学发光(ECL)的亲和力测定和数据评估。Fab的恒定量以溶液中不同浓度(3n的连续稀释)的人DKK1(4nM初始浓度)平衡。加入连接顺磁小珠(M-280 Streptavidin，Dynal)的生物素化的人DKK1，以及BV-tagTM(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)标记的抗人类(Fab)′2(Dianova)并且将混合物温育30分钟。随后，未结合的Fab的浓度通过使用
Figure A200780009135D01042
384分析仪(BioVeris Europe)的ECL检测来定量。
为此，挑选160个单一克隆并由Ni-NTA琼脂糖以μg级进行纯化。初步的亲和力由BioVeris中的四点溶液平衡滴定(SET)来测定。从这些数据中挑选出显示亲和力的20个克隆。这些Fab以mg级进行纯化。由于在大小排阻色谱中检测到的Fab的局部聚集，MOR04950从亲和力测定中排除并另行评估。使用八点SET测定和人类、小鼠和食蟹猴的DKK1，从每个Fab克隆的两个独立批次中检测最终的亲和力。
基本上如上所述，使用作为溶液中分析物的小鼠DKK1(R&D Systems)和食蟹猴DKK1而不是人DKK1来进行对小鼠和食蟹猴DKK1的亲和力测定。为检测游离的Fab，使用连接顺磁小珠的生物素化的人DKK1。依据Haenel等人，2005 Anal Biochem 339.1：182-184计算亲和力。
使用上述的试验条件，在溶液中测定亲和力优化的抗DKK1 Fab的亲和力。测定对MOR04910和MOR04946的亲和力，对人DKK1的KD低于30pM并且对小鼠和食蟹猴DKK1的KD在36pM和42pM之间。另外七个抗体显示对所有三种抗原低于100pM的亲和力。克隆MOR04950未显示对生物素化的DKK1的结合。亲和力总结于本文的表7中。
表7.Fab亲和力
Figure A200780009135D01051
Figure A200780009135D01061
＊：两个不同Fab批次之间至少进行两个独立的测定
#：仅单一测定
实施例6：亲和力优化的抗人DKK1 Fab的表征
酶联免疫吸附试验(ELISA)技术
在50％人类血清(HS)存在下测定成熟Fab的结合特异性。TBS中连续稀释的人类重组的、生物素化的DKK1于室温下经2小时包被到Neutravidin微量滴定板上，从每孔8ng DKK1至每孔125ng DKK1的浓度。抗原包被后，用1％BSA补充的TBS/0.05％ Tween(TBS-T)于室温下经1小时将孔封闭。上述纯化的Fab以终浓度1μg/ml稀释于TBS/4％BSA或TBS/50％HS中，加入到包被的和封闭的孔中并且平板于室温下温育1小时。为了检测，使用抗FLAG碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体(1:5000稀释于TBST中)和荧光底物AttoPhos(Roche)。每次温育后，微量滴定板的孔用TBST洗涤五次，只是在使用标记的第二抗体的最终温育步骤中孔洗涤三次。
在TECAN Spectrafluor平板读数器中测定荧光。示例性的结合曲线本文显示于图3中。表8总结与4％BSA中的结合活性相比在50％人类血清存在下优化的抗DKK1 Fab的结合活性，其范围从83％至100％。中值显示为93％，因此发现抗DKK1 Fab在人血清存在下充分结合到靶标。
表8.Fab的结合活性
Figure A200780009135D01062
Figure A200780009135D01071
使用U2OS细胞系的人类血清存在下的荧光素酶报告细胞试验
为另外测定优化的抗DKK1 Fab的结合特异性，在15％人类血清存在下使用骨肉瘤细胞系U2OS重复荧光素酶报告基因细胞试验。依据供应商的方案(ATCC，Manassas，VA，USA)培养U2OS细胞(ATCC No.HTB-96)。将细胞用胰蛋白酶消化、计数并稀释于培养基中(McCoy′s 5a/10％ FCS)以达到2x105细胞/ml的浓度。对于每2x104个细胞，制备0.075μgpTA-LUC-12xSuperTopFlash和0.004μg phRL-SV40的混合物溶液。将这些混合到终体积为9.8μl的OPTI-MEM中。然后加入0.2μl FuGENE 6转染试剂(Roche，Mannheim，德国)。转染混合物简单温育并然后与预先制备的细胞混合。随后，将细胞以100μl每孔接种到白色平底的96孔细胞培养皿中并于37℃和5％CO2中培养过夜。第二天，从试验板的每孔中移出75μl培养基并替代为10μl 
Figure A200780009135D01072
Fab抗体稀释液(10至0.01μg/ml稀释于无血清培养基中)、15μl70％ FCS或人血清，并向每孔加入50μl含600ng/ml DKK1-APP的Wnt3a条件培养基。
对于阴性对照，加入无血清培养基以代替抗体稀释液。为获得最大量的荧光素酶信号，加入含代替抗体稀释液的10μl无血清培养基和不含DKK1-APP的50μl Wnt3a CM的对照。于37℃、5％CO2中培养24小时后，依据制造商说明使用Dual-Glo荧光素酶试验系统(Promega，Madison，WI，USA)来测定荧光。
表9 显示在15％人类血清存在下优化的抗DKK1 Fab的抑制活性(与15％ FCS中的抑制活性相比)。数据显示血清存在下获得的活性范围从26％至90％，中值为70-74％。这些数据显示获得的抗DKK1 Fab的克隆在人类血清存在下发挥作用。
表9.Fab的抑制活性
 
抗体 荧光素酶报告基因试验w/o Kremen；在15％人血清中的活性(％)                   
MOR04945 74％
MOR04910 90％
MOR04946 60％
MOR04913 88％
MOR04920 75％
MOR04948 70％
MOR04952 60％
MOR04921 26％
MOR04914 80％
MOR04907 54％
MOR04954 55％
MOR04937 84％
通过荧光素酶报告基因细胞试验测定亲和力优化的抗DKK1 Fab的EC50
在使用10nM DKK1的标准Wnt3a依赖性TCF/LEF荧光素酶报告基因试验中测试亲和力改进的Fab，以便获得荧光素酶表达的抑制作用。由于试验的灵敏性太低，可见无法通过该方法产生EC50值。通过本文图4中所示的所有待测Fab的陡峭的抑制曲线和相似的EC50值可见。
开发了TCF/LEF荧光素酶报告基因试验的改良版本。DKK1结合到Kremen-1和-2跨膜蛋白质并且该相互作用导致Wnt信号的强烈协同抑制作用(Mao等2002 Nature：417：664-67)。因此，Kremen cDNA与TCF/LEF荧光素酶报告基因试验共转染。得到的Wnt3a依赖性报告试验显示由Kremen共受体蛋白质的共表达介导的对DKK1灵敏性的高度增强。在该试验中，0.33nM DKK1足够诱导Wnt信号的完全抑制。使用0.33nMDKK1重复Fab滴定(以10倍浓度)，并且产生从中可计算EC50值的S形抑制曲线(本文图5)。
考虑到上述EC50而分析亲和力优化的抗DKK1 Fab。如本文表10中所示，由该方法获得的EC50值范围从0.2nM至5.6nM。
表10.Fab的EC50
 
抗体 TCF/LEF萤光素酶试验w/Kremen：EC50[nM] 
MOR04913 0.5
MOR04946 0.2
MOR04907 0.9
MOR04945 0.5
MOR04914 1.1
MOR04920 1.8
MOR04954 1.3
MOR04952 0.6
MOR04948 0.5
MOR04910 0.3
MOR04921 0.7
MOR04947 1.7
MOR04951 2.2
MOR04919 2.7
MOR04949 5.3
MOR04922 2
MOR04911 5.6
亲和力优化的Fab的序列分析
测定所有20个Fab的重链和VL区(VH和VL)的核苷酸序列。互补决定区(CDR)的氨基酸序列列于本文表11A和表11B中。
Table 11A.重链CDR的氨基酸序列
 
Antibody VH HCDR1 SEQ IDNo.HCDR1  HCDR2 SEQ IDNo.HCDR2 HCDR3 SEQ IDNo.HCDR3
P MOR04455 VH3 GFTFSSYGMS 3 WVSGISGSGSYTYYADSVKG 3 HYMDH 3
1 MOR04918 VH3 GFTFSSYGMS 49 WVSGISERGVYIFYADSVKG 57 HYMDH 65
P MOR04456 VH3 GFTFNNYGMT 4 WVSGISGSGSYTYYADSVKG 4 TIYMDY 4
2 MOR04907 VH3 GFTFNNYGMT 8 WVSGISGSGSYTYYADSVKG 8 TIYMDY 8
3 MOR04946 VH3 GFTFNNYGMT 10 WVSGISGSGSYTYYADSVKG 10 TIYMDY 10
4 MOR04949 VH3 GFTFNNYGMT 50 WVSGISGSGSYTYYADSVKG 58 TIYMDY 66
5 MOR04913 VH3 GFTFNNYGMT 9 WVSGISGSGSYTYYADSVKG 9 TIYMDY 9
P MOR04461 VH3 GFTFSSYWMS 5 WVSGISYSGSNTHYADSVKG 5 MGIDLDY 5
6 MOR04911 VH3 GFTFSSYWMS 51 WVSDIEHKRRAGGATSYAASVKG 59 MGIDLDY 67
7 MOR04922 VH3 GFTFSSYWMS 52 WVSMIEHKTRGGTTDYAAPVKG 60 MGIDLDY 68
8 MOR04910 VH3 GFTFSSYWMS 11 WVSGISYSGSNTHYADSVKG 11 MGIDLDY 11
9 MOR04948 VH3 GFTFSSYWMS 13 WVSGISYSGSNTHYADSVKG 13 MGIDLDY 13
10 MOR04919 VH3 GFTFSSYWMS 53 WVSGISYSGSNTHYADSVKG 61 MGIDLDY 69
11 MOR04921 VH3 GFTFSSYWMS 12 WVSGISYSGSNTHYADSVKG 12 MGIDLDY 12
P MOR04470 VH3 GFTFSSYWMS 6 WVSVISSDSSSTYYADSVKG 6 HGIDFDH 6
12 MOR04914 VH3 GFTFSSYWMS 14 WVSVISSDSSSTYYADSVKG 14 HGIDFDH 14
13 MOR04945 VH3 GFTFSSYWMS 16 WVSVISSDSSSTYYADSVKG 16 HGIDFDH 16
14 MOR04951 VH3 GFTFSSYWMS 54 WVSVISSDSSSTYYADSVKG 62 HGIDFDH 70
15 MOR04952 VH3 GFTFSSYWMS 55 VWSVISSDSSSTYYADSVKG 63 HGIDFDH 71
16 MOR04950 VH3 GFTFSSYWMS 56 WVSVIEHKSFGSATFYAASVKG 64 HGIDFDH 72
17 MOR04954 VH3 GFTFSSYWMS 18 WVSVIEHKDKGGTTYYAASVKG 18 HGIDFDH 18
18 MOR04920 VH3 GFTFSSYWMS 15 WVSSIEHKDAGYTTWYAAGVKG 15 HGIDFDH 15
P MOR04516 VH5 GYSFTNYYIG 7 WMGIIYPTDSYTNYSPSFQG 7 GIPFRMRGFDY 7
19 MOR04947 VH5 GYSFTNYYIG 19 WMGIIYPGTSYTIYSPSFGQ 19 GIPFRMRGFDY 19
Table 11B.轻链CDR的氨基酸序列
 
MORAntibodyNo.      VL HCDR1 SEQIDNo. HCDR2 SEQIDNo. hCDR3 SEQIDNo. Comment
P 04455 K1 RASQDISNYLH 22 LLIYGASNLQS 22 QQYDSIPM 22
1 04918 K1 RASQDISNYLH 73 LLIYGASNLQS 81 QQYDSIPM 89
P 04456 K3 RASQNLFSPYLA 23 LLIYGASNRAT 23 QQYGDEPI 23
2 04907 K3 RASQNLFSPYLA 27 LLIYGASNRAT 27 QQYLSLPT 27
3 04946 K3 RASQNLFSPYLA 29 LLIYGASNRAT 29 QQYLTLPL 29
4 04949 K3 RASQNLFSPYLA 74 LLIYGASNRAT 82 QQYLFPL 90
5 04913 K3 RASQNLFSPYLA 28 LLIYGASNRAT 28 QQYMTLPL 28 FW4 mutation
P 04461 L2 TGTSSDVGGFNYVS 24 LMIHDGSNRPS 24 STWDMTVDF 24
 
6 04911 L2 TGTSSDVGGFNYVS 75 LMIHDGSNRPS 83 STWDMTVDF 91
7 04922 L2 TGTSSDVGGFNYVS 76 LMIHDGSNRPS 84 STWDMTVDF 92
8 04910 L2 TGTSSDVGGFNYVS 30 LMIHDGSNRPS 30 QSWDVSPITA 30
9 04948 L2 TGTSSDVGGFNYVS 32 LMIHDGSNRPS 32 QTWDSLSFF 32
10 04919 L2 TGTSSDVGGFNYVS 77 LMIHDGSNRPS 85 QSWGVGPGGF 93
11 04921 L2 TGTSSDVGGFNYVS 31 LMIHDGSNRPS 31 QTWATSPLSS 31
P 04470 L2 TGTSSDLGGYNYVS 25 LMIYDVNNRPS 25 QSYASGNTKV 25
12 04914 L2 TGTSSDLGGYNYVS 33 LMIYDVNNRPS 33 QSYTYTPISP 33
13 04945 L2 TGTSSDLGGYNYVS 35 LMIYDVNNRPS 35 QTYDQIKLSA 35
14 04951 L2 TGTSSDLGGYNYVS 78 LMIYDVNNRPS 86 QSYDPFLDVV 94
15 04952 L2 TGTSSDLGGYNYVS 79 LMIYDVNNRPS 87 QSYDSPTDSV 95
16 04950 L2 TGTSSDLGGYNYVS 80 LMIYDVNNRPS 88 QSYASGNTKV 96
17 04954 L2 TGTSSDLGGYNYVS 37 LMIYDVNNRPS 37 QSYASGNTKV 37
18 04920 L2 TGTSSDLGGYNYVS 34 LMIYDVNNRPS 34 QSYASGNTKV 34 HCDR2 pointmutation   
P 04516 L1 SGSSSNIGSSFVN 26 LLIGNNSNRPS 26 ASFDMGSPNV 26 Potential N-glycosylsites           
19 04947 L1 SGSSSNIGSSFVN 38 LLIGNNSNRPS 38 ASFDMGSPNV 38 Potential N-glycosylsite
consensus1 RASQxxxxxYx 131 LLIYGASNxxx 132 QQYxxxPx 133
consensus2 TGTSSDVGGFNYVS 134 LMIxDxxNRPS 135 xxWDxxxxx 136
序列分析显示六个母本(P)Fab中的五个产生亲和力增强的继承者(successor)。在HCDR2以及在LCDR3中可优化MOR04461和MOR04470。没有获得MOR04454的优化继承者。另外，如表11B中所示，各种CDR的共有序列1和共有序列2中完全不同的母本抗体间显示高度同源性。使用本领域技术人员众所周知的方法可为显示于表10A中的母本序列提供相似的共有序列。
另外，已确定MOR04920在HCDR2区具有突变(在第73位丝氨酸残基突变为甘氨酸，依据Honegger和Pluckthun，2001 J MoI Biol309.3：657-670公布的编号方案)，因而偏离
Figure A200780009135D01111
设计。
显示MOR04913具有在k轻链的构架4中的点突变(在第148位赖氨酸变为天冬酰胺)。因为不期望该位点影响抗体的结合特性，在IgG转变期间将突变回复成种系
Figure A200780009135D01112
组合物，产生抗体MOR05145。
MOR04947在LCDR2中具有潜在的糖基化位点。由于MOR04947仅仅选作备选候选物之一，因而未去除该位点。
实施例7：制备
Figure A200780009135D01121
免疫球蛋白
转换成IgG形式
为表达全长免疫球蛋白(Ig)，对于人类IgG1或人类IgG4，将重(VH)和轻链(VL)的可变区片段从
Figure A200780009135D01122
X9_FH Fab表达载体中亚克隆进_h_Ig或
Figure A200780009135D01124
2_h_Ig载体系列。其他载体可用于人IgG2。限制酶EcoRI、MfeI和BlpI用于将VH域片段亚克隆进_h_IgG1和
Figure A200780009135D01126
_h_IgG4。限制酶MfeI和BlpI用于将VH结构域片段亚克隆进
Figure A200780009135D01127
2_h_IgG1f和
Figure A200780009135D01128
2_h_IgG4。使用EcoRV和Bsi Wl位点将VL结构域片段亚克隆进
Figure A200780009135D01129
_h_IgK和2_h_IgK，而使用EcoRV和Hpa l将VL结构域片段亚克隆进
Figure A200780009135D011211
_h_Igλ和
Figure A200780009135D011212
2_h_Igλ2。
人类IgG的瞬时表达和纯化
用等摩尔量的IgG重链和轻链表达载体转染HEK293细胞。转染后4或5天时，收获细胞培养上清液。调节上清液的pH至8.0并且过滤灭菌后，将溶液进行标准的A蛋白柱层析(Poros 20A，PE Biosystems)。
母本Fab转换成IgG形式
平行于亲和力成熟的开始，将MOR04454、MOR04456和MOR04470克隆进
Figure A200780009135D011213
_h_IgG1和_h_IgG4表达载体。备选的构建体可用于IgG2表达载体的产生。由HEK293细胞的瞬时转染进行小范围表达并且从细胞培养上清液中纯化全长免疫球蛋白。
由大小排阻色谱显示的数据表明抗体是单体形式的。Wnt3a依赖性报告基因试验中的测试证实蛋白质是有功能的。
实施例8：优化用于表达的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
为增强哺乳动物的表达，将改变引入本文中的Fab的重链和轻链中，以进行细胞中表达的密码子选择的优化。已知的几个负的顺式作用基序减少在哺乳动物中的表达。本文的优化过程去除对表达起负作用的负的顺式作用位点(例如剪接位点或poly(A)信号)。本文的优化过程另外丰富GC含量以延长mRNA半寿期。
使用本文通过噬菌体展示筛选分离到的Fab克隆MOR04945(全长轻链母本核苷酸序列是SEQ ID NO：98，并且全长重链母本核苷酸序列是SEQ ID NO：102)来优化可变轻链和重链区。然后使用这些方案来优化编码这种或其他克隆的每一完整轻链和重链的核苷酸序列。
对于MOR04945的VH和VL链的优化过程
为优化用于在哺乳动物细胞中表达的每一VL和VH链的核苷酸序列和氨基酸序列，使密码子选择适用于哺乳动物基因的密码子偏爱。另外，在可能的情况下减少或消除GC含量非常高(>80％)或非常低(<30％)的区域。备选地，对于细菌、酵母或杆状病毒中表达的优化，将基于它们各自基因改变密码子的选择。
在哺乳动物表达的优化过程中，消除以下顺式作用序列基序：内在的TATA盒、Chi位点和核糖体进入位点、富含AT或富含GC的序列片段、RNA不稳定基序(ARE)序列元件、抑制RNA序列元件(INS)、cAMP响应(CRS)序列元件、重复序列和RNA二级结构、包括隐蔽位点的剪接供体和受体位点，以及分支点。除另外说明，在优化VL链的核苷酸序列过程中避免Mlu I和Hind III位点的引入。除另外说明，在优化VH链的核苷酸序列过程中避免Mly I和BstE II位点的引入。
优化用于表达的MOR04945的VH和VL链的氨基酸序列
为了对上述克隆MOR04945的VH和VL链产生优化的氨基酸序列，改变密码子选择为哺乳动物的密码子选择，以使在哺乳动物细胞中具有更高和更稳定的表达速率。参见实施例5。
下面的表12A显示可变轻链(SEQ ID NO：120)的有义和反义(AS)核苷酸序列以及为表达而优化产生的可变轻链氨基酸(称为AA)序列(SEQ IDNO：118)。
表12A 优化用于表达的VL链的核苷酸有义和反义序列，以及氨基酸序列
Figure A200780009135D01141
下面的表12B显示有义和反义可变重链核苷酸序列(SEQ ID NO：121)以及为表达而优化产生的可变重链氨基酸(称为AA)序列(SEQ ID NO：119)。
表12B 优化用于表达的VH链的核苷酸有义和反义序列，以及氨基酸序列
优化前和优化后的图表可分别对每一母本序列和优化的基因提供序列密码子的百分率，并分析编码VH和VL链的相关核苷酸序列的质量等级。本文所用的质量值指在期望的表达系统中用于给定氨基酸的最高频密码子设置为100，并且余下的密码子依据使用频率按比例标度。(Sharp，P.M.，Li，W.H.，Nucleic Acids Res.15(3)，1987)
另外，密码子适应指数(CAI)是描述核苷酸序列的密码子与目的生物的优选密码子选择匹配程度的数值。CAI的最大值设置为1.0，因此认为大于0.9的CAI能够高表达。优化前的VL链的CAI显示为0.73，而优化后，CAI测定为0.95。同样地，优化前的VH链的CAI显示为0.74，而优化后，在优化的结构中测定为0.98，VL链中的GC含量从MOR04945的母本序列的51％增加到源自MOR04945的优化序列的62％。如图9A和9B中所示，VH链中的GC含量从MOR04945的母本序列的54％增加到MOR04945的优化衍生物的64％。
MOR04910、MOR04945、MOR04946和MOR05145的全长轻链和重链用于表达的优化
将优化过程应用于MOR04910(SEQ ID NO：97)、MOR04945(SEQ IDNO：98)、MOR04946(SEQ ID NO：99)和MOR05145(SEQ ID NO：100)的轻链的每一母本全长核苷酸序列以及MOR04910(SEQ ID NO：101)、MOR04945(SEQ ID NO：102)、MOR04946(SEQ ID NO：103)和MOR05145(SEQ ID NO：103)的重链的母本全长核苷酸序列。
使用优化过程来构建与母本克隆数相关的每一下列轻链核苷酸序列：对于克隆MOR04910，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：104；对于克隆MOR04945，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：105；对于克隆MQR04946，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：106；以及对于克隆MOR05145，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：107。另外，使用优化过程来构建与母本克隆数相关的每一下列重链核苷酸序列：对于克隆MOR04910，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：108；对于克隆MOR04945，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：109；对于克隆MOR04946，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：110；以及对于克隆MOR05145，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：110。
优化的轻链核苷酸序列与下列优化的轻链氨基酸序列相关：对于克隆MOR04910，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：111；对于克隆MOR04945，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：112；对于克隆MOR04946，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：113；以及对于克隆MOR05145，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：114。优化的重链核苷酸序列与下列优化的重链氨基酸序列相关：对于克隆MOR04910，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：115；对于克隆MOR04945，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：116；对于克隆MOR04946，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：117；以及对于克隆MOR05145，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：117。
预期的全长轻链和重链序列的核苷酸和多肽序列的列表提供于表13A和表13B中。表13A提供优化的核苷酸序列和由它们编码的多肽。优化这些核苷酸序列以去除在哺乳动物表达系统中识别的潜在的剪接位点。表13B为列于表13A中的克隆提供母本核苷酸序列。
表13A：轻链(LC)和重链(HC)序列-优化的
 
LC(opt)4910 nucleotide                                            SEQ ID NO：97
GATATCGCACTGACCCAGCCAGCTTCAGTGAGCGGCTCACCAGGTCAGAGCATTACCATCTCGTGTACGGGTACTAGCAGCGATGTTGGTGGTTTTAATTATGTGTCTTGGTACCAGCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGATTCATGATGGTTCTAATCGTCCCTCAGGCGTGAGCAACCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCAACACCGCGAGCCTGACCATTAGCGGCCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGTCTTGGGATGTTTCTCCTATTACTGCTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGCTTACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACAACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAAAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG          
LC4910(BHQ880)polypeptide                                         SEQ ID NO：111
DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGFNYVSWYQQHPGKAPKLMIHDGSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSWDVSPITAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS                                
 
LC(opt)4945 nucleotide                                           SEQ ID NO：98
GATATCGCACTGACCCAGCCAGCTTCAGTGAGCGGCTCACCAGGTCAGAGCATTACCATCTCGTGTACGGGTACTAGCAGCGATCTTGGTGGTTATAATTATGTGTCTTGGTACCAGCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGATTTATGATGTTAATAATCGTCCCTCAGGCGTGAGCAACCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCAACACCGCGAGCCTGACCATTAGCGGCCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCCAGACTTATGATCAGATTAAGTTGTCTGCTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGCTTACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACAACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAAAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG          
LC4945(BHQ892)polypeptide                                        SEQ ID NO：112
DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQTYDQIKLSAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS                                
LC(opt)4946 nucleotide                                           SEQ ID NO：99
GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGAATCTTTTTTCTCCTTATCTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGTGCTTCTAATCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATCTTACTCTTCCTCTTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG                
LC4946(BHQ898)polypeptide                                        SEQ ID NO：113
DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYLTLPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC                                  
LC(opt)5145 nucleotide                                           SEQ ID NO：100
GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGAATCTTTTTTCTCCTTATCTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGTGCTTCTAATCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTATATGACTCTTCCTCTTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG                
LC5145(BHQ901)polypeptide                                        SEQ ID NO：114
DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYMTLPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC                                  
HC(opt)4910 nucleotide                                           SEQ ID NO：101
CAGGCACAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTTCTTCTTATTGGATGTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGGTATCTCTTATTCTGGTAGCAATACCCATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTATGGGTATTGATCTTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC
 
GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA                                                                
HC4910 (BHQ880)polypeptide                                          SEQ ID NO：115
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISYSGSNTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGIDLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK                                                    
HC (opt)4945 nucleotide                                            SEQ ID NO：102
CAGGCACAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTTCTTCTTATTGGATGTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGTTATCTCTTCTGATTCTAGCTCTACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCATGGTATTGATTTTGATCATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA                                                                
HC4945 (BHQ892)polypeptide                                        SEQ ID NO：116
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSVISSDSSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGIDFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK                                                    
HC (opt)4946＝5145 nucleotide                                    SEQ ID NO：103
CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAACAACTACGGCATGACCTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGGCATCAGCGGCAGCGGCA
 
GCTACACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCGGACCATCTACATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA                                                                         
HC4946＝5145(BHQ898/901)polypeptide                                 SEQ ID NO：117
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYGMTWVRQAPGKGLEWVSGISGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIYMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK                                                     
表13B：轻链(LC)和重链(HC)序列-母本的
 
LC(parental)4910 nucleotide                                   SEQ ID NO：104
GATATCGCCCTGACCCAGCCCGCCAGCGTGTCCGGCAGCCCTGGCCAGAGCATCACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGCGATGTGGGCGGCTTCAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCCACGACGGCAGCAATAGACCCAGCGGCGTGTCCAATAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCAGCGGCCTGCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCCAGAGCTGGGATGTGAGCCCCATCACCGCCGTGTTTGGCGGCGGAACAAAGCTTACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACAACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAAAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG          
LC(parental)4945                                              SEQ ID NO：105
GATATCGCCCTGACCCAGCCCGCCAGCGTGTCCGGCAGCCCTGGCCAGAGCATCACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGCGACCTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGACGTGAACAACAGACCTAGCGGCGTGTCCAACAGATTCAGCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACCATCTCTGGCCTGCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCCAGACCTACGACCAGATCAAGCTGTCCGCCGTGTTTGGCGGCGGAACAAAGCTTACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACAACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAAAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG          
LC(parental)4946 nucleotide                                   SEQ ID NO：106
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TTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACCTGACCCTGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG                
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CAGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACTGGATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGTGATCAGCAGCGATAGCAGCAGCACCTACTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGGCACGGCATCGACTTCGACCACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGAC
 
CAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA                                                                
HC (parental) 4946＝5145 nucleotide                               SEQ ID NO：110
CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAATAATTATGGTATGACTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGGTATCTCTGGTTCTGGTAGCTATACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTACTATTTATATGGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA                                                                          
实施例9：生物活性试验
在报告基因试验中测定中和抗DKK1/4抗体的生物活性，使用称为SuperTopflash Krm 17的遗传修饰的细胞系T/17 STF_70IRES_Krm_(17)。细胞系源自人胚肾细胞HEK293并稳定转染有i)其中启动子TCF融合到萤火虫荧光素酶基因上游的报道基因构建体和ii)导致该细胞表面Krm过表达的构建体。在该细胞系中，暴露于Wnt蛋白质可刺激荧光素酶以剂量依赖性方式表达。在Wnt存在下向固定的、次最大剂量的DKK1中加入分级量的抗DKK1/4抗体，导致在16小时的温育期期间荧光素酶表达的增加。在末期，基于细胞裂解物中的酶活性来定量荧光素酶的量。荧光素酶催化底物荧光素向化学发光产物氧化虫荧光素的转变。然后用适当的光度计测定作为结果的发光型化学发光。
中和抗DKK1/4抗体试验样品的生物潜能通过与参考标准物比较其增加荧光素酶表达的能力来测定。基于蛋白质含量来归一化样品和标准品。然后依据欧洲药典1(European Pharmaco-poeia1)使用平行系试验来计算相对潜能。最终的结果表示成与参考标准相比的样品的相对潜能(以百分数)。
实施例10：相关生物靶标的体外活性
选择的前导Fab具有低纳摩尔范围的亲和力和细胞试验中的潜在活性。DKK1的生理学上的结合配偶体是LRP5/6(Kd～340 pM)以及Kremen 1和2(Kd～280pM)[Mao 2001][Mao 2002]。鉴于这些高亲和力相互作用，需要另外提高亲和力以便更好地与生理学上的DKK1相互作用竞争。为增加挑选的Fab的亲和力和生物活性，通过使用导致突变的三核苷酸的盒式突变来平行优化CDR-L3和CDR-H2区[Virnekas 1994][Knappik 2000][Nagy 2002]。
亲和力成熟之后，挑选出具有低皮摩尔亲和力的、以低于1nM的EC50抑制Wnt信号发放的再激活DKK1的、并与食蟹猴、小鼠和大鼠DKK1交叉反应的FAb。然后将该FAb的可变区改造成两个不同的人类IgG1构架。
抗DKK1/4抗体具有对人DKK1的高亲和力(2pM)，具有特别针对该亲和力抗体的结合动力学。参见图6。
图6.方法：使用具有包含CM5(S)传感器芯片(Cat#BR-1006-68)的Biacore TIOO(Biacore，Uppsala，瑞典)仪器的表面等离振子体共振来测定前导候选物和rhDKK1(重组人DKK1)(批次BTP7757)的结合亲和力和动力学。将抗人IgG1 Fc(Jackson Immuno Research，Cat# 109-006-098)固定在每一流动细胞上，随后以约100RU的期望捕获来捕获前导候选物。最后，六种浓度的DKK1(范围0.195-6.25nM)以一种重复浓度在芯片上运行。将流动细胞激活用于240秒的DKK1结合，而接下来的解离达30分钟。在BIA评估1.0软件中使用动力学分析，使规范归一化的数据(减去背景的)适合与大量运输模式以1:1结合。该试验进行三次重复，并且得到的数据是具有标准偏差的这三个试验的平均值。
实施例11：表位作图
成熟的DKK1是含两个半胱氨酸富集区(Cys-1和Cys-2)的266个氨基酸的蛋白质。Cys-2域负责结合LRP和Kremen蛋白质并且对于Wnt信号发放的抑制是必需且充分的[Li2002][Brott2002]。免疫沉淀试验(图7A、7B)证实抗DKK1/4抗体特异性结合Cys-2结构域，而不是Cys-1结构域。抗DKK1/4抗体在用变性DKK1进行的Western印迹中的活性微弱，并且在肽作图试验中未发现特异结合包括蛋白质(JTP)长度的任一重叠的15个氨基酸肽，这提示抗DKK1/4抗体很可能识别Cys-2内的非线性表位。
图7(A)图示全长和截短DKK1。全长(FL，含有残基1-266)、羧基端截短(ΔC，包含残基1-185)、以及氨基端截短(ΔN，包含残基1-60以及残基157-266)，在它们的C端与HA表位融合，并且克隆到巨细胞病毒(CMY)启动子控制下的哺乳动物表达载体中。图7(B)描述中和抗DKK1/4抗体和DKK1蛋白质的结合。来自表达包含全长的、氨基端截短的、羧基端截短的DKK1蛋白质的短暂转染的Hek293细胞的条件培养基与抗溶菌酶IgG1对照或抗DKK1/4抗体于室温下温育2小时，并且免疫复合物在G蛋白小珠上收集、由SDS-PAGE分离、转移并用抗HA抗体进行印迹。总输入量的1/10上样作为对照。
实施例11：表位作图-N-糖基化
Wnt信号发放途径内的大量蛋白质是通过调节它们的细胞活性的酶翻译后共价修饰。包括DKK1的DKK家族成员由N-糖基化来修饰[Krupnik 1999]。DKK1在Cys-2结构域内的第256位氨基酸具有一个理论上的N连接的糖基化位点。鉴于Cys-2结构域的高度保守特性，以及DKK1对LRP6和抗DKK1/4抗体对DKK1的潜在结合位点，我们试图确定抗DKK1/4抗体是否识别DKK1的N-糖基化形式。ELISA证实抗DKK1/4抗体识别rhDKK1的N-糖基化形式，胜过rhDKK1的特异N连接的去糖基化形式。参见表14A。而用直接针对重组蛋白质的融合表位标记区的第二抗体(抗HIS)完全等同地识别相同的蛋白质。通过使用表面等离振子体共振来定量亲和力的差异，并且发现相对于去糖基化蛋白质，抗DKK1/4抗体对糖基化的rhDKK1具有100倍高的KD，参见表14B。
表14A.结合百分比-结合到DKK1的抗DKK1/4抗体的糖基化依赖性
 
抗体 WT DKK1 DKK1(去糖基化(dyglycosylate))
抗-HIS标记 100％ 100％
抗-DKK1/4 100％ 12-18％
表14B.表面等离振子体共振
 
蛋白质 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
WT DKK1 7.449E+6 2.319E-5 3.113E-12
DKK1(N-去糖基化) 1.424E+6 3.071E-4 2.157E-10
通过ELISA测定抗DKK1/4抗体与野生型(WT)rhDKK1(HEK HIS表位标记的批次#BTP7757)和N连接的去糖基化的(N-DEGLY，使用酶PNGase F(Sigma，Cat#E-DEGLY)的N连接的去糖基化)rhDKK1的结合。简要地，高度结合ELISA(Nunc#442404)平板用1μg/ml WT或N-DEGLYDKK1包被。与它们分别结合N-DEGLY相比较，显示抗DKK1/4抗体和抗HIS抗体结合WT DKK1的比率。该试验以三种不同浓度进行(显示一种代表性浓度的数据)，所有浓度具有相似的结果。使用Biacore T100测定抗DKK1/4抗体与WT和N-DEGLY DKK1(HEK293批次#BTP7757)的结合亲和力和动力学。与WT DKK1相比，抗DKK1/4抗体始终具有对N-DEGLY DKK1低100倍的亲和力。
实施例12：DKK家族成员的同一性百分比
人Dickkopf家族包括四种侧向同源物(参见表15)，其中三种(DKK1、2和4)结合LRP6和Kremen蛋白质，诱导LRP5/6的内化并抑制常规Wnt信号发放[Mao 2001][Mao 2003]。DKK2也协同LRP6过表达以增强Wnt信号发放，但是LRP6和Kremen2的共表达恢复该途径的DKK2抑制作用[Mao 2003]。因此DKK2可充当激动剂和拮抗剂，这取决于细胞类型(cell context)。DKK3是最不保守的家族成员，其包括在负责LRP5/6和Kremen相互作用的Cys-2域内，而且由于其不结合LRP及Kremen，并且不阻碍Wnt信号而区别于其他DKK家族成员[Mao 2001][Mao 2003]。
表15.跨越整个蛋白质和Cys-2域内的DKK家族成员的百分比同源性
使用用于比较氨基酸同一性比率的配对序列比对的AlignX运算法则来评估DKK家族成员间的同源性。应用分别是10和0.1的空位开放罚分和空位延伸罚分。该评估包括整个蛋白质的比较，以及仅仅Cys-2域的比较。如上表中指出的，DKK1、2和4在整个蛋白质上有30-40％的氨基酸序列同源性。单独Cys-2结构域的比较显示DKK1和2在该区内有69％的同源性，而DKK4与DKK1和2共有约57％的相同结构域。DKK3显示与其他家族成员最低水平的同源性。Cys-2结构域内的所有成员间的同源性最大。
实施例13：抗DKK1/4抗体与人DKK家族成员的亲和力
除了结合DKK1，抗DKK1/4抗体也结合DKK4，参见表16。虽然对DKK4的亲和力比对DKK1的亲和力低大约100倍，它仍然是次纳摩级并因此很可能是生物学上和临床上相关的。值得注意的，DKK2和DKK4都没有保留预测的在DKK1的Cys-2域中靶向用于糖基化的天冬酰胺残基。初步的免疫沉淀试验提示抗DKK1/4抗体未特异结合DKK2。结合DKK2的抗DKK1/4抗体的结合亲和力将在DKK2成功纯化后测定。与DKK3的独特功能和结合特性相一致，抗DKK1/4抗体不结合DKK3。
表16.抗DKK1/4抗体对人DKK家族成员的亲和力
 
DKK家族成员 KD
DKK1 2.0X10-12M(±0.7)
DKK2 ND
DKK3 NSB
DKK4 2.97X10-10M(±1.5)
使用Biacore T100测定抗DKK1/4抗体对人DKK家族蛋白质其他成员的结合亲和力和动力学。与以前一样，试验进行三次重复，针对显著结合抗DKK1/4抗体的蛋白质并报告为具有标准偏差的三次试验的平均值。同源性最少的家族成员DKK3，在背景水平上不具有可检测结合并因此称为NSB(无显著结合)。同样地，近期数据显示本发明的抗DKK1/4抗体也对DKK2具有无显著结合。
实施例14：抗DKK1/4抗体阻碍DKK1对LRP6的结合
DKK1通过与LRP5/6和Kremen的相互作用来介导它的Wnt拮抗剂活性，诱导内化并阻碍Wnt诱导的LRP5/6与Frizzled受体的相互作用。在图8的竞争性ELISA试验中抗DKK1/4抗体竞争性抑制DKK1与LRP6的结合。
HEK293T细胞未表达足够水平的内源性LRP5或6以使DKK1结合显现。然而，可在细胞表面检测到LRP6与表面运输侣伴蛋白质、MESD、GFP标记的DKK1的共转染，这表明DKK1/LRP6相互作用的特定性质。与抗DKK1/4抗体具有相同可变区的MOR04910特异性地阻碍该相互作用。
抗DKK1/4抗体抑制DKK1与LRP6直接结合的能力由ELISA测定。简要地，未处理平板(Fisher，Cat# 12565501)用1μg/ml重组LRP6(R&DSystems Cat#1 505-LR)包被，然后将500ng/ml rhDKK1和抗DKK1/4抗体或hlgG1(抗溶菌酶MOR3207，ACE1 0915)的浓度曲线(concentrationcurve)在冰上预温育30分钟，然后将它们放置到LRP6包被的板上达2小时。洗涤平板并用抗DKK1抗体(R&D Systems AF 1096)检测DKK1结合水平。显示的是原始OD值(减去背景的)。增加浓度的抗DKK1抗体以剂量依赖方式抑制DKK1L与LRP6的直接结合，而增加浓度的hlgG1未阻碍DKK1与LRP6的结合。
MOR04910抑制DKK1/LRP6结合到细胞表面上的能力由荧光显微镜测定。HEK293T细胞是以编码LRP6和MESD的质粒转染的或短暂转染的模拟体。细胞与DKK1-GFP条件培养基连同抗溶菌酶Fab或抗DKK1FAb MOR04910于37℃温育1小时，并由荧光显微镜测定。GFP荧光反映DKK1-GFP在质膜上对超量表达的LRP6的结合。抗DKK1/4抗体在细胞表面阻碍DKK1与LRP6相互作用。
实施例14：报告基因试验-DKK1抑制的TCF/LEF基因转录的再激活
常规的Wnt信号发放在β联蛋白转移到细胞核中时终止，其中β联蛋白与导致Wnt应答基因转录增强的TCF/LEF家族的转录因子相关。报告基因试验使用驱动荧光素酶基因转录的TCF/LEF应答启动子来构建，以便于Wnt途径调节的检测。在该试验中DKK1有效地阻碍由Wnt3A条件培养基(CM)诱导的荧光素酶活性。抗DKK1/4抗体以明显的0.16nM EC50重新激活DKK1抑制的Wnt信号发放，参见图9。因为试验需要约1nM的DKK1用于完全抑制并且抗体亲和力是2pM，很可能该EC50反映试验的灵敏性和每一蛋白质的相对量而不是抗DKK1/4抗体竞争的绝对限定。
以SuperTopflash报道基因和Kremen稳定转染的293T细胞用10ng/ml rhDKK、50％ Wnt3a条件培养基，以及多种量的抗DKK1/4抗体来处理。18小时后，荧光素酶活性由明亮荧光素酶试验试剂盒(Promega)测定。
实施例15：报告基因试验-在前成骨细胞样细胞中DKK1抑制的碱性磷酸酶分泌的反转
为测定抗DKK1/4抗体是否以更加生理相关的状态阻碍DKK1功能，建立体外试验以测定多能性小鼠细胞系C3H10T1/2(10T1/2)的Wnt介导的成骨细胞分化，参见图10。成骨细胞分化后，10T1/2细胞分泌碱性磷酸酶(AP)，该现象可由DKK1抑制。抗DKK1/4抗体但不是IgG对照，在Wnt3A条件培养基存在时阻碍DKK1对10T1/2分化的抑制作用。
已报道Wnt诱导增殖和抑制许多细胞类型上的细胞凋亡和Wnt途径的激活，如由β联蛋白稳定性或核定位指示的，Wnt途径的激活常与肿瘤发展相联系。此外，在某些癌症(例如结肠癌和黑素瘤)中DKK1的减量调节，已引导某些研究者提出DKK 1对某些癌症可能是肿瘤抑制剂[Gonzalez-Sancho 2005][Kuphal 2006]。为测试DKK1对肿瘤增殖或存活是否具有影响，肿瘤细胞系用抗DKK1/4抗体处理并分析生长中的变化。未发现抗DKK1/4抗体的加入显著影响测试的肿瘤细胞系。
在体外评估抗DKK1/4抗体对若干肿瘤细胞系的存活或增殖的影响。在该试验中，抗DKK1/4抗体(100μg/ml)用肿瘤细胞系温育，3天后细胞数量由ATP(Promega，CellTiter GIo 
Figure A200780009135D0130160951QIETU
)的定量来评估，ATP作为与细胞数量呈线性关系的代谢活性细胞的度量。以三种不同血清浓度(无血清，最小生长，以及完全生长)进行该试验。与未处理的和hlgG1处理的细胞相比未发现明显变化。通过ELISA分析细胞系上清液的DKK1表达。
实施例16：种间交叉反应和DKK1的中和
中和抗DKK1/4抗体的选择不是因其针对人DKK1的高亲和力和中和能力，而是基于其与其他物种的交叉反应，其中这些物种用于功效和安全研究。抗DKK1/4抗体以与对人DKK1相似的亲和力来与小鼠、大鼠和食蟹猴(cyno，Macaca fascicularis)DKK1交叉反应，见表17。此外，抗DKK1/4抗体中和所有四个种的D与KK1介导的Wnt抑制活性(表17)，暗示这些物种应该与安全和功效模式相关。
表17.种间交叉反应和DKK1的中和
 
DKK1蛋白质 KD[pM] Wnt3a信号发放的反应性(topFlash)EC50(pM)     
人类 17 80.6
食蟹猴 7 54.2
小鼠 10 60.5
大鼠 16 255
对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠DKK1的亲和力测定通过使用M-384分析仪(BioVeris，Europe)的溶液平衡滴定(SET)来分析。对于由溶液平衡滴定(SET)测定的KD，使用IgG蛋白质的单体片段(至少90％单体含量，由分析性SEC分析的，Superdex75，Amersham Pharmacia)。在溶液中基于电化学发光(ECL)的亲和力测定和数据评估基本如描述于[Haenel et al.，2005]中地进行，应用如依据[Piehler等人，1997]修饰改进的结合安装模型。恒量的MOR4910 IgG用溶液中不同浓度的(3n稀释)人DKK1(4nM初始浓度)平衡。加入连接生物素化的人DKK1的顺磁小珠(M-280 Streptavidin，Dynal)和BV-tagTM(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)标记的山羊抗人类(Fab)′2多克隆抗体并温育30分钟。随后，经由采用M-384 
Figure A200780009135D01311
分析仪(BioVeris，Europe)的ECL检测来定量未结合的IgG浓度。在溶液中使用小鼠、大鼠和食蟹猴DKK1而不是人DKK1作为分析物来基本上如上所述进行对大鼠、小鼠和食蟹猴DKK1的亲和力测定。为检测游离的IgG分子，使用连接生物素化的人DKK1的顺磁小珠。MOR4910和抗DKK1/4抗体以相同的EC50中和人DKK1(Novartis)，抗DKK1/4抗体也中和猴(Novartis)、小鼠(R&D Systems1765-DK-010)和大鼠(Novartis)的DKK1。基本如上所述(图9)使用每一种的重组DKK1而不是人DKK1作为Wnt条件培养基的抑制剂来进行对人类、大鼠、小鼠和食蟹猴DKK1的TOPFLASH报告基因试验。大鼠重组DKK1需要较高的蛋白质浓度以达到TOPFLASH试验的显著抑制。
实施例17：抗DKK1/4抗体对PC3M2AC6异种移植物的胫骨内生长的影响
前列腺肿瘤转移由于它们主要是成骨细胞的而不是溶骨细胞的，因而在骨转移中是独特的[Keller2001]。然而，甚至主要的成骨细胞性骨转移具有潜在的骨质溶解区并经常具有低骨质密度(BMD)，特别是当患者正接受雄性激素撤除治疗时[Saad 2006]。最近，证实DKK1可充当开关，由此DKK1的表达增强混合的成骨性的/溶骨性的前列腺肿瘤细胞系(C4-2B)的溶骨细胞特征。另外，DKK1的shRNA抑制作用抑制主要的溶骨性前列腺肿瘤细胞系(PC3)的溶骨活性[Hall 2005][Hall 2006]。DKK1敲除也抑制肿瘤异种移植物的胫骨内生长，导致本发明人推测溶骨活性可能对建立转移生境很重要，但随后在前列腺转移中DKK1的损失将肿瘤转变为成骨细胞表现型。
溶骨性前列腺肿瘤模式由[Kim 2003]的方法来改进。将稳定表达荧光素酶的溶骨性前列腺肿瘤细胞系(PC3M)的变体注入小鼠胫骨。肿瘤的生长由荧光素酶来监测，而骨中变化由微计算机处理X线断层摄影术(micro-CT)和组织学来监测。抗DKK1/4抗体倾向于抑制肿瘤生长，而非促进肿瘤生长。当在任一研究中抑制作用都不显著时，目前它在实施的5/5研究中一致发生，显示3倍剂量的抗DKK1/4抗体对肿瘤生长影响的代表性研究显示于图11中。具有皮下PC3M2AC6异种移植物的抗DKK1/4抗体处理的小鼠产生针对抑制作用的相似的非显著性趋势。
植入(0.2百万个细胞/动物)后第5天开始处理。以20、60和200μg/小鼠/天的剂量，每天、一周3次地静脉内注射施用抗DKK1/4抗体持续两周。以200μg/小鼠/天，每天、一周3次地静脉内注射施用对照IgG持续两周。处理后计算最终功效数据和体重变化。
使用该模式，我们发现抗DKK1/4抗体抑制肿瘤诱导的骨皮质损伤。在该模式中通过肿瘤移植物和虚拟移植对骨造成机械损伤的观测无法区分对骨小梁的影响，其造成随后重塑的编织骨中的初始增加，因此引起表观骨容量上的减少。新形成的编织骨和小梁对整体骨容量/小梁容量比率的相对影响因而不明显。然而，抗DKK1/4抗体在肿瘤和虚拟移植的胫骨中增加骨的产生，并抑制或延缓伴随重塑的骨容量的减少是明显的。使用相同的肿瘤诱导的溶骨性模式，抗DKK1/4抗体显示与唑来膦酸当量的抗溶骨活性，参见图12。抗DKK1/4抗体的骨代谢效果在20-200μg/小鼠的范围内是剂量应答的，最低有效剂量在20至60μg/小鼠之间，参见图13。综合这些数据，提示抗DKK1/4抗体对肿瘤诱导的溶骨性疾病应具有效果，但可能也对非肿瘤性骨疾病如骨质疏松症或增强骨折修复有效。
实施例18：在肿瘤和虚拟移植的胫骨中抗DKK1/4抗体维持增加的骨密度
为了评估小鼠药效学标记中的功效，分析了骨代谢的三种血清标记：骨钙蛋白(OC)、护骨蛋白(OPG)以及核因子κB配体分泌型受体活化因子(sRANKL)。由于预期的抗体作用机理，使用这些成骨细胞标记而非更典型的破骨细胞标记。然而，在与正常动物相对的患肿瘤的动物中未检测到一致的改变。如由micro-CT或IHC测定的，以任一这些标记始终未观测到骨丢失的相关性。
待治疗小鼠胫骨的MicroCT再建的典型实例显示于图12A中。皮质损伤划分成从0＝无损伤至3＝严重损伤。参见图12B。由microCT分析来人工划分肿瘤移植的胫骨中的皮质损伤，其对于研究的组是未知的。在任一虚拟移植的胫中未观测到皮质损伤。
方法：12周龄的雌性裸鼠在左胫骨中用2x105PC-3M2AC6细胞进行胫骨内移植并且在右胫骨中进行虚拟注射。处理开始于移植后的第5天。以200μg/小鼠/天的剂量，每天、一周3次地静脉内注射施用NVP-抗-DKK1/4抗体-NX(抗DKK1/4抗体)和IgG对照持续两周。也每天、一周3次地静脉内注射施用载体(PBS)对照持续两周。在肿瘤移植后的第7、14和18天采用μ-CT VivaCT40扫描仪(SCANCO，瑞士)来扫描动物。如方法中描述地来分析小梁的骨密度(BV/TV)。星号(＊)指载体和IgG对照在相同时间点上统计学显著差异(n＝12)，p<0.05。
在图13中，为测定骨密度，胫骨的次级松质骨(spongiosa)用基于吉姆萨染色剂的Zeiss Imager Z.1和Axiovision软件进行作图。读数基于整个视野中钙化骨的百分比。每个柱形代表规定数目动物的平均值和标准偏差。在PBS、IgG和抗DKK1/4抗体处理组中，仅分析患肿瘤的动物。右胫没有虚拟注射而左胫有肿瘤。统计分析：Dunnett试验单因素方差分析。左胫或右胫与PBS组中的对应胫进行比较，p<0.05＊，p<0.01＊＊，p>0.05无显著差异。
图14显示抗DKK1/4抗体的代谢骨功效是剂量依赖性的，最低有效剂量在20至60μg/小鼠3x/周之间。12周龄的雌性裸鼠在左胫骨中用2x105PC-3M2AC6细胞进行胫骨内移植并且在右胫骨中进行虚拟注射。治疗开始于移植后的第6天。以20、60和200μg/小鼠/天的剂量，每天、一周3次地静脉内注射施用NVP-抗-DKK1/4抗体-NX(抗DKK1/4抗体)持续两周。每天、一周3次地静脉内注射施用载体对照(PBS)持续两周。在肿瘤移植后的第7和20天使用μ-CT VivaCT40扫描仪(SCANCO，瑞士)来扫描动物。如方法中描述地来分析小梁的骨密度(BV/TV)。＊指包括载体、IgG、仅钻孔和正常动物的所有对照在相同时间点上统计学显著差异，p<0.05。
实施例18：生物标记情况
DKK1生物标记
已描述DKK1的RNA表达模式。Krupnik(1999)通过Northern印迹分析显示在胎盘中的表达，在心脏、脑、肺、肝、骨骼肌或胰腺中未检测到表达。Wirths(2003)显示在肝、肾和乳腺中缺乏RNA表达，尽管在肝胚细胞(hepatoblasomas)瘤和Wilms肿瘤亚种中可见RNA表达。技术人员通过RNA原位杂交检测的DKK1胃肠道表达显示在不管是正常的或恶性的胃和结肠内均未表达(Byun 2006)。
小鼠中RNA表达分析显示骨中的高DKK1表达水平，胎儿和胎盘中的中等表达，以及褐色脂肪组织、胸腺和十二指肠中的微弱表达[Li 2006]。
使用应用于当前研究中的相同的山羊抗体在骨髓瘤样本中评估DKK1蛋白质表达(Tian，2003)。本文中，在具有低级形态学的患者的骨髓瘤细胞中可见表达，在五种对照受试者的骨髓活组织切片样本中未检测到DKK1蛋白质表达。
通过对一系列正常人类和猴子组织的筛选来进行治疗性抗体抗DKK1/4抗体的组织分布和物种间交叉反应研究。评估全部的组织切片和组织微阵列。阳性对照包括在相同组织体系中评估的抗DKK1的市售抗体。
DKK1_15(FITC缀合的抗DKK1/4抗体)和DKK1_8(FITC缀合的山羊抗DKK1，R&D Systems，# AF 1096，lots GBL013101和GBL14111)。
其他生物标记
由于很少了解关于DKK1的病理生理作用，相当大的努力正在并已经集中于通过生物标记研究来构建关于抗DKK1/4抗体的体内效果的知识基础，以及如何利用和进一步发展这一知识基础。关注的重点领域包括
1)在正常的和转移性的骨代谢中通过测定破骨细胞和成骨细胞活性的循环标记来理解抗DKK1/4抗体的效果。
2)在多发性骨髓瘤和其他肿瘤中用以确定和扩大靶标指示的DKK1的可比较的表达水平。
3)在重要组织如结肠、骨髓、肺、皮肤和乳腺中用以评估β联蛋白活性的基因表达水平上的效果。
初步的分子流行病学研究已证实在患有多发性骨髓瘤的患者中具有增加的DKK1血清水平并在该迹象中支持POC。
基于现有知识，表18为抗DKK1/4抗体提供建议的潜在生物标记。
表18.针对DKK1和DKK4靶标的生物标记物
 
类别 肿瘤 血液 替代组织
药物动力(PD)-靶标-下游作用机理 N/A 无以及抗-DKK1/4Ab结合DKK-1水平β-联蛋白活性NTx、CTx、PINP、骨钙蛋白、RANKL、OPG、PTH、维生素D3、降钙素                    脂肪/皮肤
功效 血清M蛋白、尿总M蛋白、b2微珠蛋白、LDH                NTx、CTx、PINP、骨钙蛋白、RANKL、OPG、PTH，降钙素骨-ALP、CICP、CTx、NTx等     
预测标记分层预筛选       DKK1表达 DKK-1、CTx、PINP、RANKL、OPG、PTH、维生素D3、降钙素DKK1血清水平             
安全性 免疫原性
药物动力 抗-DKK1/4Ab
实施例19：抗DKK1抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列
抗DKK1抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列全部提供于表19中，其中抗体的CDR区显示于表5、6、11A和11B中。
表19.抗DKK1抗体重链和轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：2-39)
 
MOR04454  VH：  (SEQ ID NO：2)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGLHWVRQAPGKGLEWVSSISYYGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSHMDKPPGYVFAFWGQGTLVTVSS                            
MOR04454  VL：  (SEQ ID NO：21)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIKNYLNWYQQKPGKAPKLLIGAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYYGMPPTFGQGTKVEIKRT                                            
MOR04455  VH：  (SEQ ID NO：3)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYMDHWGQGTLVTVSS                                       
MOR04455  VL：  (SEQ ID NO：22)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLHWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLT    
 
ISSLQPEDFAVYYCQQYDSIPMTFGQGTKVEIKRT
MOR04456  VH：   (SEQ ID NO：4)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYGMTWVRQAPGKGLEWVSGISGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIYMDYWGQGTLVTVSS                                 
MOR04456  VL：   (SEQ ID NO：23)DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQYGDEPITFGQGTKVEIKRT                                      
MOR04461  VH：   (SEQ ID NO：5)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISYSGSNTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGIDLDYWGQGTLVTVSS                                
MOR04461  VL：   (SEQ ID NO：24)DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGFNYVSWYQQHPGKAPKLMIHDGSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSTWDMTVDFVFGGGTKLTVLGQ                                    
MOR04470  VH：   (SEQ ID NO：6)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSVISSDSSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGIDFDHWGQGTLVTVSS                                
MOR04470  VL：   (SEQ ID NO：25)DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSYASGNTKVVFGGGTKLTVLGQ                                   
MOR04516  VH：   (SEQ ID NO：7)QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNYYIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPTDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGIPFRMRGFDYWGQGTLVTVSS                            
MOR04516  VL：   (SEQ ID NO：26)DIVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSSNIGSSFVNWYQQLPGTAPKLLIGNNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQSEDEADYYCASFDMGSPNVVFGGGTKLTVLGQ                                    
MOR04907  VH：   (SEQ ID NO：8)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYGMTWVRQAPGKGLEWVSGISGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIYMDYWGQGTLVTVSS                                 
MOR04907  VL：   (SEQ ID NO：27)DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYLSLPTTFGQGTKVEIKRT                                      
MOR04913  VH：   (SEQ ID NO：9)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYGMTWVRQAPGKGLEWVSGISGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIYMDYWGQGTLVTVSS                                 
MOR04913  VL：   (SEQ ID NO：28)DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYMTLPLTFGQGTKVEINRT                                      
MOR04946  VH：   (SEQ ID NO：10)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYGMTWVRQAPGKGLEWVSGISGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIYMDYWGQGTLVTVSS                                 
MOR04946  VL：   (SEQ ID NO：29)DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYLTLPLTFGQGTKVEIKRT                                      
MOR04910  VH：   (SEQ ID NO：11)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISYSGSNTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGIDLDYWGQGTLVTVSS                                
MOR04910  VL：   (SEQ ID NO：30)DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGFNYVSWYQQHPGKAPKLMIHDGSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSWDVSPITAVFGGGTKLTVLGQ                                   
MOR04921  VH：   (SEQ ID NO：12)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISYSGSNTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGIDLDYWGQGTLVTVSS                                
MOR04921  VL：   (SEQ ID NO：31)DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGFNYVSWYQQHPGKAPKLMIHDGSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQTWATSPLSSVFGGGTKLTVLGQ                                   
MOR04948  VH：   (SEQ ID NO：13)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISYSGSNTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGIDLDYWGQGTLVTVSS                                
MOR04948  VL：   (SEQ ID NO：32)DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGFNYVSWYQQHPGKAPKLMIHDGSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQTWDSLSFFVFGGGTKLTVLGQ                                    
 
MOR04914  VH：   (SEQ ID NO：14)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSVISSDSSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGIDFDHWGQGTLVTVSS                                      
MOR04914  VL：   (SEQ ID NO：33)DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQOHPGKAPKLMIYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSYTYTPISPVFGGGTKLTVLGQ                                        
MOR04920  VH：   (SEQ ID NO：15)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSSIEHKDAGYTTWYAAGVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGIDFDHWGQGTLVTVSS                                    
MOR04920  VL：   (SEQ ID NO：34)DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSYASGNTKVVFGGGTKLTVLGQ                                         
MOR04945  VH：   (SEQ ID NO：16)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSVISSDSSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGIDFDHWGQGTLVTVSS                                      
MOR04945  VL：   (SEQ ID NO：35)DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYOOHPGKAPKLMIYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQT.YDQIKLSAVFGGGTKLTVLGQ                                      
MOR04952  VH：   (SEQ ID NO：17)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSVISSDSSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGIDFDHWGQGTLVTVSS                                      
MOR04952  VL：   (SEQ ID NO：36)DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSYDSPTDSVVFGGGTKLTVLGQ                                         
MOR04954  VH：   (SEQ ID NO：18)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSVIEHKDKGGTTYYAASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGIDFDHWGQGTLVTVSS                                     
MOR04954  VL：   (SEQ ID NO：37)DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSYASGNTKVVFGGGTKLTVLGQ                                         
MOR04947  VH：   (SEQ ID NO：19)QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNYYIGWVRQMPGKGLEWMGIIVPGTSYTIYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGIPFRMRGFDYWGQGTLVTVSS                                  
MOR04947  VL：   (SEQ ID NO：38)DIVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSSNIGSSFVNWYQQLPGTAPKLLIGNNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQSEDEADYYCASFDMGSPNVVFGGGTKLTVLGQ                                         
MOR05145  VH：   (SEQ ID NO：20)QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYGMTWVRQAPGKGLEWVSGISGSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIYMDYWGQGTLVTVSS                                       
MOR05145  VL：   (SEQ ID NO：39)DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNLFSPYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYMTLPLTFGQGTKVEIKRT                                            
将表19中的可变区的CDR和FR片段排列于针对重链(SEQ IDNO：2-20；VH3是SEQ ID NO：125，VH5是SEQ ID NO：126)的表20A、针对k轻链(SEQ ID NO：21、22、23、27、28和29；VK1是SEQ ID NO：127并且VK3是SEQ ID NO：128)的表20B以及针对λ轻链(SEQ ID NO：24、25、30、31、32、33、34、35、36和37；VL2是SEQ ID NO：129并且VL1是SEQ ID NO：130)的表20C中。
Figure A200780009135D01401
共有CDR序列至少提供于SEQ ID NO：40-48和表11B中。其他的一共有CDR序列可由本领域的技术人员使用标准方法和本文提供的方法从表20A-20C的比对中确定。
等同方案
从上述本发明具体实施方案的详细说明，显而易见的是已对新抗体及其免疫学的片段进行了描述。尽管本文已详细公开了具体的实施方案，也要经由仅仅示例性的实施例来完成该描述。特别地，本发明人预期可对本发明进行多种替换、更改和修饰，而不背离本发明的精神或范围。
序列表
<110>诺瓦提斯公司
<120>使用Dickkopf-1和/或-4抗体的组合物和方法
<130>ON4-34783
<150>USSN 60/759216
<151>2006-01-13
<160>136
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>266
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Figure A200780009135Q01431
Figure A200780009135Q01441
<210>2
<211>124
<212>PRT
<213>人
<400>2
Figure A200780009135Q01442
<210>3
<211>114
<212>PRT
<213>人
<400>3
<210>4
<211>115
<212>PRT
<213>人
<400>4
Figure A200780009135Q01452
Figure A200780009135Q01461
<210>5
<211>116
<212>PRT
<213>人
<400>5
Figure A200780009135Q01462
<210>6
<211>116
<212>PRT
<213>人
<400>6
Figure A200780009135Q01463
Figure A200780009135Q01471
<210>7
<211>120
<212>PRT
<213>人
<400>7
Figure A200780009135Q01472
<210>8
<211>115
<212>PRT
<213>人
<400>8
Figure A200780009135Q01481
<210>9
<211>115
<212>PRT
<213>人
<400>9
Figure A200780009135Q01491
<210>10
<211>115
<212>PRT
<213>人
<400>10
Figure A200780009135Q01492
<210>11
<211>116
<212>PRT
<213>人
<400>11
Figure A200780009135Q01493
Figure A200780009135Q01501
<210>12
<211>116
<212>PRT
<213>人
<400>12
Figure A200780009135Q01502
<210>13
<211>116
<212>PRT
<213>人
<400>13
Figure A200780009135Q01511
<210>14
<211>116
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<400>16
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<400>17
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<400>21
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<400>23
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<400>26
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<400>27
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<400>28
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<400>35
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<400>37
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<400>39
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<400>115
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Figure A200780009135Q01931
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<211>446
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<400>116
Figure A200780009135Q01932
Figure A200780009135Q01941
Figure A200780009135Q01951
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<400>117
Figure A200780009135Q01952
Figure A200780009135Q01961
Figure A200780009135Q01971
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<400>118
Figure A200780009135Q01972
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<400>119
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<400>120
Figure A200780009135Q01982
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<211>361
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<213>人
<400>121
Figure A200780009135Q01983
Figure A200780009135Q01991
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<212>PRT
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<400>122
Figure A200780009135Q01992
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<211>350
<212>PRT
<213>人
<400>123
Figure A200780009135Q02002
Figure A200780009135Q02011
<210>124
<211>224
<212>PRT
<213>人
<400>124
Figure A200780009135Q02012
Figure A200780009135Q02021
<210>125
<211>127
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(99)..(116)
<223>其中X可以是任意氨基酸
<400>125
Figure A200780009135Q02022
Figure A200780009135Q02031
<210>126
<211>127
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(99)..(116)
<223>其中X可以是任意氨基酸
<400>126
Figure A200780009135Q02032
<210>127
<211>110
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>其中X可以是任意氨基酸
<400>127
<210>128
<211>111
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(91)..(98)
<223>其中X可以是任意氨基酸
<400>128
Figure A200780009135Q02051
<210>129
<211>113
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(91)..(100)
<223>其中X可以是任意氨基酸
<400>129
<210>130
<211>112
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(90)..(99)
<223>其中X可以是任意氨基酸
<400>130
Figure A200780009135Q02061
<210>131
<211>11
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(11)
<223>其中X可以是任意氨基酸
<400>131
<210>132
<211>11
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(11)
<400>132
Figure A200780009135Q02071
<210>133
<211>8
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(8)
<223>其中X可以是任意氨基酸
<400>133
Figure A200780009135Q02072
<210>134
<211>14
<212>PRT
<213>人
<400>134
<210>135
<211>11
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(7)
<223>其中X可以是任意氨基酸
<400>135
Figure A200780009135Q02074
<210>136
<211>9
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(9)
<223>其中X可以是任意氨基酸
<400>136
Figure A200780009135Q02081

Claims (53)

1.组合物，其含有特异性结合DKK1多肽(SEQ ID NO：1)和/或DKK4多肽(SEQ ID NO：122)表位的抗原结合区，其中所述抗体或其功能片段结合DKK1或DKK4或其两者的至少一个表位。
2.权利要求1的抗体，其中在选自如下的至少一种试验中测定所述抗体与DKK1或DKK4的结合：Wnt信号转录的拮抗作用；基于电化学发光的结合分析；酶联免疫吸附试验的结合；FMAT；SET；SPR；骨钙蛋白(OCN)血清浓度；护骨蛋白(OPG)血清浓度；前胶原1型含氮前肽(PlNP)血清浓度，ALP产物；TopFlash或骨质溶解的改善。
3.选自SEQ ID NO：2-20和SEQ ID NO：40-72的分离的氨基酸序列和其保守的或人改造的变体。
4.权利要求3的分离的氨基酸序列，和其保守的或人改造的变体，其中所述氨基酸序列选自：
a)SEQ ID NO：2-20、65-72；每个都包含含有H-CDR3区的抗原结合区；
b)SEQ ID NO：2-20、57-64；每个都包含H-CDR2区；
c)包含序列GISGSGSYTYYADSVKF的SEQ ID NO：40，包含序列GISYYGGNTYYADSVKF的SEQ ID NO：41，和包含序列GISYYGGSTYYADSVKF的SEQ ID NO：42；每个都包含共有序列H-CDR2区；
d)SEQ ID NO：2-5、8-11、20、49-56；上述每个都包含H-CDR1区；和
e)具有氨基酸序列GFTFSSYGMT的SEQ ID NO：43，具有氨基酸序列GFTFNSYGMT的SEQ ID NO：44，具有氨基酸序列GFTFSNYGMT的SEQ ID NO：45，具有氨基酸序列GFTFSSYWMT的SEQ ID NO：46，具有氨基酸序列GFTFSSYAMTF的SEQ ID NO：47，和具有氨基酸序列GFTFSSYGMS的SEQ ID NO：48；每个都包含共有序列H-CDR1区；或
f)SEQ ID NO：21-39和73-88。
5.权利要求4的分离的抗原结合区，其中选自SEQ ID NO：21-39的氨基酸序列的均包含L-CDR3区，选自SEQ ID NO：21-39、73-80的氨基酸序列的均包含L-CDR1区，选自SEQ ID NO：21-39、81-88的氨基酸序列的均包含L-CDR2区，选自SEQ ID NO：21-39的氨基酸序列的均包含轻链的可变区。
6.选自SEQ IDNO：97-103的分离的核苷酸序列。
7.权利要求6的核苷酸序列编码的分离的氨基酸序列，以及所述氨基酸序列的保守的或人改造的变体，其中
a)每个SEQ ID NO：97-100均编码抗原结合轻链；和
b)每个SEQ ID NO：101-103均编码抗原结合重链。
8.权利要求6的分离的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列进一步进行了用于表达和/或临床用途的优化。
9.选自SEQ IDNO：104-110的分离的核苷酸序列。
10.权利要求9的核苷酸序列编码的分离的氨基酸序列，以及所述氨基酸序列的保守的或人改造的变体，其中
a)每个SEQ ID NO：104-107均编码抗原结合轻链；和
b)每个SEQ ID NO：108-110均编码抗原结合重链。
11.权利要求9的分离的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列进行了用于表达和/或临床用途的优化。
12.选自111-117的分离的氨基酸序列，及其保守的或人改造的变体，其中
a)每个SEQ ID NO：111-114均编码抗原结合轻链；和
b)每个SEQ ID NO：115-117均编码抗原结合重链。
13.权利要求12的分离的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列进行了用于表达和/或临床用途的优化。
14.选自SEQ ID NO：120-121的分离的核苷酸序列。
15.权利要求14的核苷酸序列编码的分离的氨基酸序列，以及所述氨基酸序列的保守的或人改造的变体，其中
a)SEQ ID NO：120编码轻链的抗原结合可变区；和
b)SEQ ID NO：121编码重链的抗原结合可变区。
16.权利要求14的分离的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列进行了用于表达和/或临床用途的优化。
17.分离的抗原结合区，其包含选自SEQ ID NO：120的核苷酸序列编码的轻链可变区，和选自SEQ ID NO：121的核苷酸序列编码的重链可变区。
18.选自118-119的分离的氨基酸序列，及其保守的或人改造的变体。
19.权利要求18的分离的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：118为轻链的抗原结合可变区。
20.权利要求18的分离的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：119为重链的抗原结合可变区。
21.权利要求18的分离的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列进行了用于表达和/或临床用途的优化。
22.分离的氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO：2-121所示区域的至少一个CDR区具有至少95％同一性。
23.分离的氨基酸序列，其具有表11A和11B所示CDR区的共有序列。
24.权利要求1的分离的抗体，其含有选自IgM和IgG的支架，其中IgG选自IgG1、IgG2和IgG3或IgG4。
25.权利要求24的分离抗体，其中IgM或IgG选自多克隆的或单克隆的。
26.分离的抗体或其功能片段，其包含DKK1表位特异性的抗原结合区，其中抗体或其功能片段结合DKK1或DKK4，并预防或改善DKK1相关疾病或DKK4相关疾病的发展。
27.权利要求26的抗体或其功能片段的分离的抗原结合区。
28.分离的抗体或其功能片段，其含有靶标DKK1或DKK4或其两者表位特异性的抗原结合区，其中所述表位包括靶标DKK1或DKK4的CYS2结构域的至少六个或更多个氨基酸残基。
29.上述权利要求1-28中任一项的分离的抗体或功能片段，其选自完整免疫球蛋白或其Fab片段或scFv抗体片段、重链抗体和非免疫球蛋白支架上的抗原结合区。
30.权利要求29的分离的抗体或其功能片段，其中表位是构象性表位。
31.药物组合物，其包含至少一种权利要求29的抗体或功能片段，以及可药用载体或赋形剂。
32.转基因动物，其携带编码权利要求29的抗体或其功能片段的基因。
33.治疗与DKK1或DKK4的存在相关的障碍或病症的方法，其包括对所需患者施用有效量的权利要求31的药物组合物。
34.权利要求33的方法，其中障碍和病症选自骨质溶解性损伤，特别是与骨髓瘤相关的骨质溶解性损伤，特别是与多发性骨髓瘤相关的骨质溶解性损伤；或与骨癌、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、肝细胞癌、上皮癌、食道癌、脑癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌或其转移瘤相关的骨质溶解性损伤；与移植相关的骨丢失；或骨肉瘤、前列腺癌、肝细胞癌(HCC)、包括多发性骨髓瘤的骨髓瘤、糖尿病、肥胖症、肌萎缩、阿尔茨海默病、骨质疏松症、骨质减少、风湿病、结肠炎和/或不希望的脱发。
35.权利要求33的方法，其中所述方法还包括施用第二治疗物质。
36.权利要求35的方法，其中所述化疗剂是唑来膦酸。
37.权利要求35的药物组合物，其中另外的治疗物质选自抗癌物质、抗新陈代谢物质、抗糖尿病物质、抗骨质疏松物质、抗生素、抗炎物质、生长因子和细胞因子。
38.分离的抗体，其含有第一氨基酸序列，其为选自SEQ ID NO：2-20的重链，和其CDR区与SEQ ID NO：2-20中所示CDR区具有至少95％序列同一性的序列，以及第二氨基酸序列，其为选自SEQ ID NO：21-39的轻链，和其CDR区与SEQ ID NO：21-39中所示的CDR区具有至少95％序列同一性的序列。
39.免疫连接物，其含有第一成分，该成分是上述权利要求中任一项的抗体或其片段。
40.试剂盒，其含有上述权利要求中任一项的抗体或其片段。
41.权利要求40的试剂盒，其还含有可药用载体或赋形剂。
42.权利要求40的试剂盒，其中抗体以单位剂量存在。
43.权利要求40的试剂盒，其还含有对受试者施用的说明书。
44.组合物，其含有中和抗DKK1/4抗体。
45.权利要求0的抗体，其中所述抗体以小于100nM、50nM、10nM、1.0nM、500pM或100pM的Kon结合DKK1；并且具有小于10-2每秒、10-3每秒、10-4每秒或10-5每秒的DKK1解离率。
46.权利要求0的抗体，其中所述抗体与DKK1或DKK4的亲和力比其与DKK2或DKK3的高102-106倍。
47.权利要求0的抗体，其所述抗体与中和抗DKK1/4竞争性结合DKK1或DKK4。
48.以组合物治疗疾病的方法，所述组合物含有至少一种SEQ ID NO：118的多肽序列和SEQ ID NO：119的多肽序列，或其保守的或人改造的改变；其中所述组合物是中和抗DKK1/DKK4抗体。
49.在哺乳动物特别是人类中用药物组合预防或治疗增殖性疾病或疾病如癌症的方法，其中所述药物组合包含：
(a)中和抗DKK1/4组合物；和
(b)一种或多种药用活性物质。
本发明另外涉及药物组合物，其包含：
(a)中和抗DKK1/4组合物；
(b)药用活性物质；和
(c)可药用载体。
本发明另外涉及商业包装或产品，其包含：
(a)中和抗DKK1/4组合物的药物制剂；和
(b)用于同时、并列、分别或依次使用药用活性物质的药物制剂。
50.权利要求49的方法，其中药用活性物质特别指不同于中和抗DKK1/4组合物或其衍生物的任意药用活性物质，其中所述物质选自：
i.芳化酶抑制剂；
ii.抗雌激素、抗雄激素或促性激素释放素激动剂；
iii.拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂；
iv.微管活性剂、烷化剂、抗肿瘤的抗代谢物或铂化合物；
v.靶向/减少蛋白质或脂质激酶活性，或蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物，其他抗血管生成的化合物或诱导细胞分化过程的化合物；
vi.单克隆抗体；
vii.环加氧酶抑制剂、二磷酸盐、类肝素酶抑制剂、生物反应调节剂；
viii.Ras致瘤同种型的抑制剂；
ix.端粒末端转移酶抑制剂；
x.蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、甲硫氨酸氨肽酶抑制剂或蛋白酶体抑制剂；
xi.用于治疗血液性恶性肿瘤的物质，或靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物；
xii.HSP90抑制剂；
xiii.抗增殖抗体；
xiv.组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂；
xv.靶向、降低或抑制丝氨酸/苏氨酸mTOR激酶的活性/功能的化合物；
xvi.生长素抑制素受体拮抗剂；
xvii.抗白血病的化合物；
xviii.肿瘤细胞损伤方式；
xix.EDG结合剂；
xx.核苷酸还原酶抑制剂；
xxi.S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂；
xxii.VEGF或VEGFR的单克隆抗体；
xxiii.光动力学治疗；
xxiv.血管稳定类固醇；
xxv.包含皮质类固醇的植入物；
xxvi.ATI受体拮抗剂；和
xxvii.ACE抑制剂。
51.抗体，其以10-8或更小的亲和力(KD)结合DKK1，并与权利要求1中的任意抗体竞争。
52.权利要求51的抗体，其与DKK2或DKK3无可检测的结合。
53.权利要求52的抗体，其中所述抗体以10-3或更高的(KD)结合DKK1或DKK4。
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102388065A (zh) * 2009-04-10 2012-03-21 伊莱利利公司 Dkk-1抗体
WO2012103787A1 (en) * 2011-02-01 2012-08-09 The University Of Hongkong Use of anti-dkk1 monoclonal antibody for treatment of liver cancer
CN103083686A (zh) * 2013-02-18 2013-05-08 上海交通大学医学院附属仁济医院 Dkk4基因及其编码蛋白在制备药物中的应用
CN103472226A (zh) * 2012-06-08 2013-12-25 上海市肿瘤研究所 血清dkk1在制备早期肝细胞癌或小肝细胞癌的诊断试剂中的用途
CN103487581A (zh) * 2012-06-08 2014-01-01 上海市肿瘤研究所 血清dkk1在制备甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断试剂中的用途
CN105203773A (zh) * 2015-09-28 2015-12-30 成都博奥新景医学科技有限公司 一种人Dickkopf-1蛋白（DKK-1）定量检测试剂盒
CN106659912A (zh) * 2014-07-03 2017-05-10 耶鲁大学 Dickkopf2(Dkk2)抑制作用抑制肿瘤形成
CN111632147A (zh) * 2020-06-07 2020-09-08 重庆医科大学 骨细胞Wnt激活剂在制备骨折加速愈合、防治骨不连及不运动或失重骨丢失药物中的应用
CN112121147A (zh) * 2019-06-24 2020-12-25 林霖 多肽在治疗或预防骨髓瘤药物中的应用、多肽、核酸、药物及重组表达载体
WO2022116808A1 (zh) * 2020-12-02 2022-06-09 杭州奕安济世生物药业有限公司 抗dkk2抗体、包含该抗dkk2抗体的组合物及其用途
WO2023046147A1 (zh) * 2021-09-26 2023-03-30 安沛治疗有限公司 针对dkk1的适体及其用途
WO2023143444A1 (zh) * 2022-01-28 2023-08-03 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗dkk1抗体、其药物组合物及用途

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
US8450274B2 (en) 2006-05-24 2013-05-28 Theragenetex Co., Ltd. DKK2 protein and use thereof
KR101218806B1 (ko) * 2010-04-21 2013-01-09 주식회사 테라젠이텍스 Ｄｋｋ2 단백질 및 그의 용도
JP2009065938A (ja) * 2007-09-14 2009-04-02 Matsumoto Shika Univ タンパク質、破骨細胞分化阻害剤、炎症性骨破壊治療薬、遺伝子、組み替えベクター、及びタンパク質の製造方法
TWI489993B (zh) 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
JP5320730B2 (ja) * 2007-12-26 2013-10-23 Ｊｎｃ株式会社 発光基質水溶液およびその製造方法
DK2331136T3 (en) 2008-09-26 2018-03-05 Oncomed Pharm Inc FRIZZLED BINDING AGENTS AND APPLICATIONS THEREOF
AR075715A1 (es) * 2009-03-05 2011-04-20 Novartis Ag Formulacion de anticuerpo liofilizado
BRPI1014535A2 (pt) * 2009-05-07 2016-04-05 Novatis Ag composições e métodos de uso para moléculas de ligação a dickkopf-1 ou dickkopf-4 ou ambas
KR101471239B1 (ko) 2009-05-12 2014-12-09 화이자 인코포레이티드 항-ｄｋｋ-1 항체의 차단 및 그의 용도
WO2010130832A2 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against dickkopf-1 and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with bone loss and/or osteolytic lesions
EP2494354A1 (en) * 2009-10-30 2012-09-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Pcsk9 immunoassay
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
EP2545079A2 (en) * 2010-03-11 2013-01-16 Rinat Neuroscience Corporation ANTIBODIES WITH pH DEPENDENT ANTIGEN BINDING
AU2011235904B2 (en) 2010-04-01 2015-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Frizzled-binding agents and uses thereof
AR083740A1 (es) * 2010-10-27 2013-03-20 Amgen Inc Anticuerpos dkk1 (dickkopf-1) y metodos de uso
WO2012118903A2 (en) 2011-03-01 2012-09-07 Amgen Inc. Bispecific binding agents
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
CA2899353A1 (en) * 2013-02-04 2014-08-07 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a wnt pathway inhibitor
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
DE102016206820B4 (de) 2015-04-22 2017-07-27 BSH Hausgeräte GmbH Weiterentwicklung eines Induktionswasserkochers, einer Kaffeemaschine und einer Suppenmaschine
SG10201912905VA (en) * 2015-08-07 2020-02-27 Alx Oncology Inc Constructs having a sirp-alpha domain or variant thereof
CA3003252C (en) * 2015-10-28 2024-06-25 Yale University Humanized anti-dkk2 antibody and uses thereof
RU2656160C2 (ru) 2016-08-17 2018-05-31 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с рецептором интерлейкина-6 человека
KR20190085935A (ko) * 2016-10-26 2019-07-19 리프 테라퓨틱스 인코포레이티드 항-dkk-1 항체를 사용하여 암을 치료하기 위한 바이오마커로서의 베타-카테닌의 용도
WO2018208108A1 (ko) * 2017-05-10 2018-11-15 주식회사 굳티셀 조절 t 세포에 특이적으로 존재하는 dkk1 단백질 및 그 용도
JP7356505B2 (ja) * 2019-01-15 2023-10-04 バイオニア コーポレーション Ｄｋｋ１遺伝子を標的にする二本鎖オリゴヌクレオチド、これを含む構造体及びこれを含む脱毛予防又は発毛用組成物
EP3917572A4 (en) * 2019-02-01 2022-11-09 Board of Regents, The University of Texas System MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST HUMAN MHC-RELATED DICKKOPF-1 PEPTIDES AND THEIR USES
AU2020282791A1 (en) 2019-05-31 2021-12-09 ALX Oncology Inc. Methods of treating cancer with SIRP alpha Fc fusion in combination with an immune checkpoint inhibitor
KR102494042B1 (ko) * 2020-11-20 2023-02-07 주식회사 하울바이오 인간모유두세포의 성장을 촉진하는 항-dkk-1 항체 및 이의 용도
WO2022140670A2 (en) * 2020-12-23 2022-06-30 Phenomic Ai Anti-activin antibodies and methods of using the same

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5597710A (en) * 1994-03-10 1997-01-28 Schering Corporation Humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4
DK0975755T3 (da) 1997-04-16 2007-06-11 Millennium Pharm Inc CRSP-protein (cysteinrige udskilte proteiner), nukleinsyremolekyler der koder herfor samt anvendelser deraf
US7057017B2 (en) 1997-04-16 2006-06-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Human dickkopf-related protein and nucleic acid molecules and uses therefor
DE19747418C1 (de) 1997-10-27 1999-07-15 Deutsches Krebsforsch Inhibitor-Protein des wnt-Signalwegs
US7446181B2 (en) 1998-01-15 2008-11-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies that bind human Dickkopf-1 proteins
WO2000006714A1 (en) 1998-07-31 2000-02-10 Eli Lilly And Company DDKh-3 NUCLEIC ACIDS, POLYPEPTIDES, VECTORS, HOST CELLS, METHODS AND USES THEREOF
US7538086B2 (en) * 1998-09-01 2009-05-26 Genentech, Inc. PRO1303 polypeptides
US6344541B1 (en) 1998-09-25 2002-02-05 Amgen Inc. DKR polypeptides
US6682736B1 (en) 1998-12-23 2004-01-27 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to CTLA-4
OA12589A (en) 2001-01-05 2006-06-08 Abgenix Inc Antibodies to insulin-like growth factor i receptor.
HUP0303194A2 (hu) * 2001-02-16 2003-12-29 Genentech, Inc. DKK-1 és antagonistái alkalmazásai
US7091323B2 (en) * 2001-04-24 2006-08-15 Bayer Corporation Human TIMP-1 antibodies
JP2005512557A (ja) 2001-11-07 2005-05-12 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ アーカンソー 遺伝子発現プロファイリングに基づく多発性骨髄腫の診断、予後、および治療標的候補の同定
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
WO2004053063A2 (en) 2002-12-05 2004-06-24 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas System Molecular determinants of myeloma bone disease and uses thereof
US20050084494A1 (en) 2003-05-21 2005-04-21 Darwin Prockop Inhibitors of Dkk-1
WO2006017538A2 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Dyax Corp. Hk1-binding proteins
EP2336177A1 (en) * 2004-08-04 2011-06-22 Amgen, Inc Antibodies to DKK-1
GB0417487D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound
RU2007139283A (ru) * 2005-03-25 2009-04-27 Гликарт Биотехнологи Аг (Ch) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ К MCSP И ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРА И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
ES2402576T3 (es) 2005-11-14 2013-05-06 Bioren, Inc. Ultrahumanización de anticuerpos por generación y selección de bibliotecas cohorte y blast de cdr maduras previstas

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102388065B (zh) * 2009-04-10 2014-09-03 伊莱利利公司 Dkk-1抗体
CN102388065A (zh) * 2009-04-10 2012-03-21 伊莱利利公司 Dkk-1抗体
WO2012103787A1 (en) * 2011-02-01 2012-08-09 The University Of Hongkong Use of anti-dkk1 monoclonal antibody for treatment of liver cancer
CN103608037A (zh) * 2011-02-01 2014-02-26 香港大学 抗dkk1单克隆抗体用于治疗肝癌的用途
CN103608037B (zh) * 2011-02-01 2016-04-13 香港大学 抗dkk1单克隆抗体用于治疗肝癌的用途
CN103472226A (zh) * 2012-06-08 2013-12-25 上海市肿瘤研究所 血清dkk1在制备早期肝细胞癌或小肝细胞癌的诊断试剂中的用途
CN103487581A (zh) * 2012-06-08 2014-01-01 上海市肿瘤研究所 血清dkk1在制备甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断试剂中的用途
CN103083686A (zh) * 2013-02-18 2013-05-08 上海交通大学医学院附属仁济医院 Dkk4基因及其编码蛋白在制备药物中的应用
WO2014124551A1 (zh) * 2013-02-18 2014-08-21 上海交通大学医学院附属仁济医院 Dkk4基因及其编码蛋白在制备药物中的应用
CN106659912B (zh) * 2014-07-03 2021-11-30 耶鲁大学 Dickkopf2(Dkk2)抑制作用抑制肿瘤形成
CN106659912A (zh) * 2014-07-03 2017-05-10 耶鲁大学 Dickkopf2(Dkk2)抑制作用抑制肿瘤形成
CN114306605A (zh) * 2014-07-03 2022-04-12 耶鲁大学 Dickkopf2(Dkk2)抑制作用抑制肿瘤形成
CN105203773A (zh) * 2015-09-28 2015-12-30 成都博奥新景医学科技有限公司 一种人Dickkopf-1蛋白（DKK-1）定量检测试剂盒
CN112121147A (zh) * 2019-06-24 2020-12-25 林霖 多肽在治疗或预防骨髓瘤药物中的应用、多肽、核酸、药物及重组表达载体
CN112121147B (zh) * 2019-06-24 2023-07-04 中国人民解放军海军特色医学中心 多肽在治疗或预防骨髓瘤药物中的应用、多肽、核酸、药物及重组表达载体
CN111632147A (zh) * 2020-06-07 2020-09-08 重庆医科大学 骨细胞Wnt激活剂在制备骨折加速愈合、防治骨不连及不运动或失重骨丢失药物中的应用
WO2022116808A1 (zh) * 2020-12-02 2022-06-09 杭州奕安济世生物药业有限公司 抗dkk2抗体、包含该抗dkk2抗体的组合物及其用途
WO2023046147A1 (zh) * 2021-09-26 2023-03-30 安沛治疗有限公司 针对dkk1的适体及其用途
WO2023143444A1 (zh) * 2022-01-28 2023-08-03 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗dkk1抗体、其药物组合物及用途

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