CN102388065B - Dkk-1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与人DKK-1结合并抑制其活性的人工程化的抗体及其抗原结合片段，并且它们在治疗发病机理是由DKK-1介导的疾病中是有效的。

Description

DKK-1抗体
本发明涉及抗DKK-1的人工程化的抗体，及其在治疗发病机理是由DKK-1介导的疾病中的用途。
Dickkopf-1(Dkk-1)是dickkopf蛋白质家族的成员，表现为是规范的Wnt-信号通路的负调控子。该通路在骨骼发育和形成中发挥了关键作用。Dkk-1通过与Wnt共同受体LRP5或LRP6和kremen蛋白的相互作用，抑制Wnt信号传递。Dkk-1抑制Wnt通路的成员与LRP5或LRP6的相互作用，从而抑制Wnt-介导的信号转导。DKK1还表现出涉及骨骼转移癌症，包括多发性骨髓瘤、乳腺癌、肾癌和非小细胞肺癌。
已描述了结合Dkk-1的抗体(例如，参见WO2006015373)，然而，仍然需要可抑制Dkk-1与LRP5和LRP6相互作用的治疗性人工程化的DKK-1抗体。此外，鉴于Dkk-1参与调控骨骼形成，需要治疗性人工程化的抗Dkk-1抗体用于骨骼愈合。此外，考虑到Dkk-1参与癌症，需要人工程化的抗Dkk-1抗体用于治疗癌症，包括多发性骨髓瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌。
本发明的抗体是具有多种理想特性的治疗性有效的DKK-1拮抗剂。该人工程化的抗体表现出对人DKK-1、猕猴DKK-1、大鼠DKK-1、小鼠DKK-1和兔DKK-1的高亲和力(Kd)。本发明的抗体阻断DDK-1介导的碱性磷酸酶的抑制作用，后者是成骨细胞活性的标志物。此外，本发明的抗体表现出在皮质缺陷的体内模型中增加前后皮质的骨量密度，并展现出在体内对非小细胞肺异种移植物的显著的生长抑制。
本发明提供了在37℃下，具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)、猕猴(cynomolgus)DKK-1(SEQ ID NO：30)、大鼠DKK-1(SEQ ID NO：31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO：33)和兔DKK-1(SEQ ID NO：32)的Kd小于5.0X10-11M的人工程化的DKK-1抗体，或其抗原结合片段。
本发明提供了人工程化的DKK-1抗体或其结合片段，其中LCDR1具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，LCDR2具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列，LCDR3具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列，HCDR1具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，HCDR2具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，和HCDR3具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列。
本发明还提供了药物组合物，其包括本发明的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供了愈合骨骼的方法，包括施用本发明的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了治疗癌症的方法，包括施用本发明的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中所述癌症选自多发性骨髓瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌。
本发明提供了如本文所述的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)的Kd小于1.5X10-11M。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)的Kd小于1.0X10-11M。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)的Kd小于5.0X10-12M。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)的Kd在0.5X10-12M和1.5X10-11M之间。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)的Kd在1.0X10-12M和1.0X10-11M之间。所述Kd值是如实施例2所述，通过37℃的结合平衡确立的。
本发明还提供了如本文所述的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)、猕猴DKK-1(SEQ ID NO：30)、大鼠DKK-1(SEQ ID NO：31)、小鼠DKK-1(SEQID NO：33)和兔DKK-1(SEQ ID NO：32)的Kd小于5.0X10-11M。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)、猕猴DKK-1(SEQ IDNO：30)、大鼠DKK-1(SEQ ID NO：31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO：33)和兔DKK-1(SEQ ID NO：32)的Kd小于3.0X10-11M。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)、大鼠DKK-1(SEQ ID NO：31)和小鼠DKK-1(SEQ ID NO：33)的Kd小于2.0X10-11M。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)、猕猴DKK-1(SEQ ID NO：30)、大鼠DKK-1(SEQ ID NO：31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO：33)和兔DKK-1(SEQ ID NO：32)的Kd在1.0X10-11M和5.0X10-11M之间。更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)、大鼠DKK-1(SEQ ID NO：31)和小鼠DKK-1(SEQ ID NO：33)的Kd在1.5X10-11M和3.0X10-11M之间。所述Kd值是如实施例2所述，通过37℃的结合平衡确立的。
更优选的，本发明提供了这样的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含了包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HCVR，且其中所述人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段具有的对于人DKK-1(SEQID NO：29)、猕猴DKK-1(SEQ ID NO：30)、大鼠DKK-1(SEQ ID NO：31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO：33)和兔DKK-1(SEQ ID NO：32)的Kd小于3.0X10-11M。更优选的，本发明提供了这样的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含了包括SEQ IDNO：14的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HCVR，且其中所述人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)、猕猴DKK-1(SEQ ID NO：30)、大鼠DKK-1(SEQ ID NO：31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO：33)和兔DKK-1(SEQ IDNO：32)的Kd小于2.5X10-11M。更优选的，本发明提供了这样的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含了包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HCVR，且其中所述人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)、猕猴DKK-1(SEQ ID NO：30)、大鼠DKK-1(SEQ ID NO：31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO：33)和兔DKK-1(SEQ ID NO：32)的Kd小于2.0X10-11M。更优选的，本发明提供了这样的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含了包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HCVR，且其中所述人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)、猕猴DKK-1(SEQ ID NO：30)、大鼠DKK-1(SEQ ID NO：31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO：33)和兔DKK-1(SEQ ID NO：32)的Kd在0.5X10-12M和3.0X10-11M之间。更优选的，本发明提供了这样的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含了包括SEQ IDNO：14的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HCVR，且其中所述人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段具有的对于人DKK-1(SEQ ID NO：29)、猕猴DKK-1(SEQ ID NO：30)、大鼠DKK-1(SEQ ID NO：31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO：33)和兔DKK-1(SEQ IDNO：32)的Kd在1.0X10-12M和2.5X10-11M之间。所述Kd值是如实施例2所述，通过37℃的结合平衡确立的。
本发明提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，包括轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，而HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，HCDR1具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，和HCDR2具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
本发明提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中LCDR1具有SEQ ID NO：46的氨基酸序列，LCDR2具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列，LCDR3具有SEQ ID NO：50的氨基酸序列，HCDR1具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，HCDR2具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列，和HCDR3具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列。本发明优选的提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中LCDR1具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，LCDR2具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列，LCDR3具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列，HCDR1具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，HCDR2具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，和HCDR3具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列。
本发明提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中LCDR1具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，LCDR2具有选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列，LCDR3具有选自SEQID NO：7和SEQ ID NO：9的氨基酸序列，HCDR1具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，HCDR2具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，和HCDR3具有选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
本发明优选的提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3具有选自以下的氨基酸序列：
(i)LCDR1是SEQ ID NO：5，LCDR2是SEQ ID NO：6，LCDR3是SEQ ID NO：7，HCDR1是SEQ ID NO：1，HCDR2是SEQ ID NO：2，和HCDR3是SEQ ID NO：3；
(ii)LCDR1是SEQ ID NO：5，LCDR2是SEQ ID NO：8，LCDR3是SEQ ID NO：7，HCDR1是SEQ ID NO：1，HCDR2是SEQ ID NO：2，和HCDR3是SEQ ID NO：4；
(iii)LCDR1是SEQ ID NO：5，LCDR2是SEQ ID NO：6，LCDR3是SEQ ID NO：9，HCDR1是SEQ ID NO：1，HCDR2是SEQ ID NO：2，和HCDR3是SEQ ID NO：3；
(iv)LCDR1是SEQ ID NO：5，LCDR2是SEQ ID NO：10，LCDR3是SEQ ID NO：9，HCDR1是SEQ ID NO：1，HCDR2是SEQ ID NO：2，和HCDR3是SEQ ID NO：3。
本发明提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中LCVR包括SEQ ID NO：52的氨基酸序列，HCVR包括SEQ ID NO：51的氨基酸序列。
本发明优选的提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中LCVR包括选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
本发明优选的提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中HCVR包括选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
本发明优选的提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中LCVR和HCVR包括选自以下的氨基酸序列：
(i)包括SEQ ID NO：13的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HCVR；
(ii)包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HCVR；
(iii)包括SEQ ID NO：15的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HCVR；
(iv)包括SEQ ID NO：16的氨基酸序列的LCVR和包括SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HCVR。
本发明优选的提供了人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括了包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的LCVR，和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HCVR。
本发明优选的提供了人工程化的DKK-1抗体，其中人工程化的DKK-1抗体包含轻链，其中所述轻链包含选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
本发明优选的提供了人工程化的DKK-1抗体，其中人工程化的DKK-1抗体包含重链，其中所述重链包含选自SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
更优选的，本发明提供了人工程化的DKK-1抗体，其中人工程化的DKK-1抗体包含重链和轻链，其氨基酸序列选自：
(i)包括SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO：19的氨基酸序列的轻链；
(ii)包括SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链；
(iii)包括SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列的轻链；和
(iv)包括SEQ ID NO：17的氨基酸序列的重链和包括SEQ ID NO：22的氨基酸序列的轻链。
本发明优选的提供了人工程化的DKK-1抗体，包括两条轻链和两条重链，其中每条轻链都包括SEQ ID NO：19的氨基酸序列，其中每条重链都包括SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
本发明优选的提供了人工程化的DKK-1抗体，包括两条轻链和两条重链，其中每条轻链都包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列，其中每条重链都包括SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
本发明优选的提供了人工程化的DKK-1抗体，包括两条轻链和两条重链，其中每条轻链都包括SEQ ID NO：22的氨基酸序列，其中每条重链都包括SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
本发明优选的提供了人工程化的DKK-1抗体，包括两条轻链和两条重链，其中每条轻链都包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列，其中每条重链都包括SEQ ID NO：18的氨基酸序列。
本发明还提供了通过抗体竞争测定确定的，与本发明的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段竞争结合人DKK-1(SEQ ID NO：29)的抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了药物组合物，包括本发明的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
此外，本发明提供了药物组合物，包括本发明的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂，和任选的其它治疗性成分。
在另一方面，本发明提供了愈合骨骼的方法，包括施用本发明的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供了治疗癌症的方法，包括施用本发明的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，其中所述癌症优选选自多发性骨髓瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌。
此外，本发明提供了本发明的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，用于治疗。优选的，本发明提供了本发明的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段，用在愈合骨骼的治疗或癌症治疗中，其中所述癌症优选选自多发性骨髓瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌。
此外，本发明还提供了本发明的人工程化的DKK-1抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗、愈合骨骼或治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症优选选自多发性骨髓瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌。
定义
全长抗体正如其天然存在的，是包括通过二硫键互联的2条重(H)链和2条轻(L)链的免疫球蛋白分子。每一链的氨基酸末端部分包括主要通过其中所含的互补决定区(CDR)来负责抗原识别的、约100-110个氨基酸的可变区。每一链的羧基末端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。
CDR被较保守的，称作框架区(“FR”)的区域分散。每一轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR和4个FR构成，它们按下述顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR称作“LCDR1、LCDR2和LCDR3”并且重链的3个CDR称作“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。CDR含有与抗原形成特异相互作用的大多数残基。在LCVR和HCVR区域内的CDR氨基酸残基的编号和位置是根据公知的Kabat编号协定。
轻链分为κ或λ，并且表征为本领域已知的特定恒定区。重链分为γ、μ、α、δ或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。IgG抗体可以进一步划分为亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。每种重链类型表征为具有本领域公知序列的特定恒定区。
如在此使用，术语“单克隆抗体”(Mab)指源自单拷贝或克隆包括如任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，而并不是生产它的方法。本发明的Mab优选以均一的或基本上均一的群体存在。完整的Mab含有2条重链和2条轻链。此种单克隆抗体的“抗原结合片段”包括例如，Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和单链Fv片段。可以例如通过重组技术、噬菌体展示技术、合成技术如CDR-移植、或此类技术的组合或者其他本领域已知的技术来生产本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段。例如，可以用人DKK-1或其片段免疫小鼠，得到的抗体可以回收并纯化，并且可以通过在下面实施例中公开的方法来评估确定它们是否拥有与本文公开的抗体化合物相似或相同的结合和功能特性。抗原结合片段也可以通过常规方法来生产。生产和纯化抗体及抗原结合片段的方法是本领域公知的并且可见于，例如Harlow和Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，第5-8以及15章，ISBN 0-87969-314-2。
短语“嵌合抗体”指含有来自不同物种(一般是2种物种)的结构域的抗体。抗体V是这样的嵌合抗体，其中轻链和重链可变结构域含有来自鼠抗体的残基，而恒定区轻链结构域含有包含大鼠κ轻链的残基，恒定区重链结构域含有包含大鼠IgG1抗体的残基。抗体V是小鼠/大鼠嵌合体，用于在长期的临床前模型中研究降低免疫应答可能性。
短语“人工程化的抗体”指具有根据本发明的结合和功能特性，并且具有围绕源自于非人抗体的CDR的基本上是人的或者完全是人的框架区的单克隆抗体。此类人工程化的抗体的“抗原结合片段”包括例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和单链Fv片段。“框架区”或“框架序列”指框架区1至4中任一。本发明所涵盖的人工程化的抗体和其抗原结合片段包括其中框架区1至4中一或多个为基本上或完全是人源的分子，即其中存在任何的单个基本上是人源的或者完全是人源的框架区1至4的可能组合。例如，这包括其中框架区1和框架区2、框架区1和框架区3、框架区1、2和3等基本上是或者完全是人源的分子。基本上是人源的框架是与已知的人胚系框架序列具有至少约80％序列同一性的那些。优选地基本上是人源的框架与已知的人胚系框架序列具有至少约85％、约90％、约95％或约99％的序列同一性。
完全人框架是与已知的人胚系框架序列相同的那些。人框架胚系序列可以通过其网站http://imgt.cines.fr获自ImMunoGeneTics(IMGT)，或者获自Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc的The ImmunoglobulinFactsBook，Academic Press，2001，ISBN 012441351。例如，胚系轻链框架可以选自下组：A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、LI、L1I、L12、L2、L5、L15、L6、L8、O12、O2和O8，并且胚系重链框架区可以选自下组：VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VHI-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VHI-18、VHI-69、VI-13-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59和VH5-5I。
除了本文公开的那些，根据本发明展现类似功能特性的人工程化的抗体可以使用若干不同的方法来产生。本文公开的特定抗体化合物可用作模板或亲本抗体化合物，来制备其它的抗体化合物。在一种方法中，亲本抗体化合物CDR移植到与亲本抗体化合物框架具有高序列同一性的人框架中。新框架的序列同一性通常将与亲本抗体化合物中相应框架的序列有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同一性。这一移植可造成相比于亲本抗体而言减小的结合亲和性。如果是这种情况，那么可以根据Queen等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2869公开的特定规则，将框架回复突变成亲本框架。描述用于人源化鼠抗体的其他参考文献包括美国专利No.4,816,397；5,225,539和5,693,761；Levitt(1983)J.Mol.Biol.168：595-620所述的计算机程序ABMOD和ENCAD；以及Winter和同事的方法(Jones等人，(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等人，(1988)Nature 332：323-327；以及Verhoeyen等人，(1988)Science 239：1534-1536)。
可以按照下面进行考虑用于回复突变的残基鉴定：
当氨基酸落入下述目录时，被使用的人胚系序列的框架氨基酸(“受体框架”)由来自亲本抗体化合物的框架的框架区氨基酸(“供体框架”)所替代：
(a)在该位置，受体框架的人框架区的氨基酸对于人框架是不寻常的，而在该位置供体免疫球蛋白中的相应氨基酸对于人框架是典型的。
(b)氨基酸的位置紧挨着CDR之一；或者
(c)在三维免疫球蛋白模型中，框架氨基酸的任何侧链原子都在约5-6埃(中心到中心)的CDR氨基酸的任何原子内。
当受体框架的人框架区的每个氨基酸以及供体框架中的相应氨基酸在该位置对于人框架通常是不寻常的时，此氨基酸可以由在该位置对于人框架是典型的氨基酸所取代。这一回复突变原则使得其能够恢复亲本抗体化合物的活性。
另一种产生与在此公开的抗体化合物展现相似的功能特性的人工程化的抗体的方法涉及随机突变移植CDR内的氨基酸而不改变框架，并且筛选与亲本抗体化合物一样好甚至比它们更好的结合亲和性以及其他功能特性的得到的分子。也可以在每个CDR内的每个氨基酸位置引入单突变，随后评估此种突变对结合亲和性以及其他功能特性的影响。产生改善的特性的单突变可以组合以评估它们与其他组合的作用。
此外，前述两种方法的组合是可能的。在CDR移植后，除了在CDR中引入氨基酸改变外，可以使特异框架区回复突变。这一方法描述于Wu等人，(1999)J.Mol.Biol.294：151-162。
应用本发明的教导，本领域技术人员可以使用诸如定点诱变的常用技术来置换本发明公开的CDR和框架内序列的氨基酸，从而产生源自本发明序列的其他可变区氨基酸序列。所有可选的天然产生的氨基酸都可以被引入特异置换位点。在此公开的方法可以随后用于筛选这些其他的可变区氨基酸序列以鉴定具有所示体内功能的序列。以此方式，可以鉴定其他适于制备根据本发明的人工程化的抗体及其抗原结合部分的序列。优选地，框架内的氨基酸置换限于在此公开的4条轻链和/或重链框架内中任何一或多条内的一、二或三个位置。优选地，CDR内的氨基酸置换限于3条轻链和/或重链CDR中任何一或多条内的一、二或三个位置。上述这些框架区和CDR内的多种改变的组合也是可能的。最优选的，使用这些技术来产生其他可变区氨基酸序列，所述序列分别利用在SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：14中描述的可变重链和轻链氨基酸序列。
与本文公开的分子“竞争”的人工程化的抗体或其抗原结合片段是那些在与本发明分子结合的位点相同或重叠的位点结合人DKK-1(SEQ IDNO：29)的分子。通过例如抗体竞争测定，可以鉴别竞争性人工程化的抗体或其抗原结合片段。例如，将纯化的或部分纯化的人DKK-1(SEQ IDNO：29)样品结合在固体支持物上。然后添加本文公开的抗体和测试的单克隆抗体或抗原结合片段，其中标记了所述测试或本发明的抗体。如果标记的抗体和未标记的抗体结合DKK-1上分离的和不相连的位点，则不论是否存在怀疑的竞争性抗体，标记的抗体都以相同的水平结合。然而，如果相互作用位点是相同或重叠的，则未标记的抗体将发生竞争，与抗原结合的标记抗体的量将降低。如果存在过量的未标记抗体，则不会结合标记的抗体。出于本发明的目的，竞争性人工程化的抗体或其抗原结合片段是降低本发明抗体与DKK-1的结合约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的抗体或其抗原结合片段。进行此类竞争性测定的方法细节是本领域普遍已知的，可见于例如Harlow和Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York，第567-569页，ISBN 0-87969-314-2中。通过使用纯化的抗体可以定量进行此类测定。通过用一种抗体滴定被标记的所述抗体的形式，来确立标准曲线。滴定未标记的竞争性单克隆抗体或其抗原结合片段抑制标记分子与平板结合的能力。绘制所述结果，比较实现理想程度的结合抑制所必需的浓度。通过本文实施例中公开的方法，可以确定在此类竞争性测定中，与本发明的人工程化的抗体或其抗原结合片段竞争的单克隆抗体或其抗原结合片段是否具有与本发明的人工程化的抗体相同或相似功能特性。
术语“抑制”意指基本上拮抗、阻止、预防、限制、减慢、干扰、消除、终止、降低或逆转DKK-1的生物学效应的能力。
术语“治疗”指这样的过程，所述过程涉及减慢、干扰、停止、控制、终止、降低或逆转症状、病症、病况或疾病的进展或严重程度，但并非必需涉及完全消除与DKK-1活性相关的所有疾病相关症状、病况或病症。
术语“预防”意指阻止、限制或抑制症状、病症、病况或疾病的出现或发生。可以治疗和预防急性事件和慢性病况。在急性事件中，在症状、病症、病况或疾病的开始时施用抗体或其抗原结合片段，当急性事件结束时停止。相反，在更延长的时间框架中治疗慢性症状、病症、病况或疾病。
术语“有效量”指本发明抗体化合物的量或剂量，所述量或剂量在向患者的单次或多次剂量施用时，提供了理想的治疗或预防。本发明抗体化合物的治疗有效量可以包含单次剂量从约0.1mg/kg至约20mg/kg的范围内的量。可以通过健康护理供应商监控抗体化合物对生物标志物的效应，来确定对任何个体患者的治疗有效量。
术语“骨骼愈合”指通过阻断DKK-1，在损伤位点刺激骨骼形成。骨骼愈合指征的实例包括但不限于骨折愈合、植入物固定/保持，和牙科植入物固定/保持。
本发明的人工程化的抗体可用作通过多种途径施用的人药物中的药物。最优选的，此类组合物是用于肠胃外的施用的。此类药物组合物可通过本领域普遍已知的方法制备(参见例如，Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第19版，(1995)，A.Gennaro等人，Mack PublishingCo.)，并包含如本文公开的人工程化的抗体，和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
下列测定的结果证实，本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段可用作DKK-1抑制剂。本发明的抗体具有多种理想的特性。例如，本发明的抗体II具有增加的化学和物理稳定性，和溶解度。通过在不同的缓冲液条件下(pH和NaCl差异)孵育本发明的抗体，和在4℃、25℃和40℃下孵育4周，来实施加速研究(Accelerated study)评估抗体的化学稳定性。通过阳离子交换(CEX)层析分离带电的变体(例如，天冬酰胺脱酰胺化为天冬氨酸)和LC-MS分析鉴别降解的特定位点，来检测本发明抗体的化学修饰。抗体II具有通过CEX检测的最少量的降解，该结果得到LC-MS数据的进一步验证，LC-MS数据显示，在40℃下pH 8的缓冲液中孵育4周后，相比本文所述的其他抗体，所述CDR中全部三个天冬酰胺残基具有最少量的脱酰胺化作用。当在pH 6+150mM NaCl下配制时，抗体II的溶解度比抗体I更有利。此外，储藏在4℃时，抗体II维持了＞105mg/mL的溶解度，而抗体I的溶解度仅为48mg/mL，并在这些相同的条件下沉淀。如本文中使用的，“EC50”指产生对所述物质的50％的最大可能响应时的物质浓度。“Kd”指可以通过公式：koff/kon＝Kd计算的平衡解离常数。
实施例1——抗体的生产
可以如下制造和纯化抗体I、II、III和IV。用分泌抗体的表达系统瞬时或稳定的转染恰当的宿主细胞，例如HEK 293EBNA或CHO，所述表达系统使用优化的预先确定的HC∶LC载体比例或者编码HC(例如SEQ IDNO：23或SEQ ID NO：24)和LC(例如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28)的单个载体系统。使用多种常用技术的任一种纯化已分泌了抗体的澄清培养基。例如，常规的可将培养基用于已经用相容的缓冲液平衡了的蛋白A或G Sepharose FF柱，所述缓冲液例如磷酸盐缓冲的盐溶液(pH 7.4)。洗涤柱子，去除非特异性结合的组分。例如通过pH梯度(例如0.1M磷酸钠缓冲液，pH 6.8至0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 3.0)洗脱结合的抗体。例如通过SDS-PAGE检测抗体级分，然后混合。进一步的纯化是任选的，取决于预期的用途。可以使用常规技术浓缩和/或无菌过滤抗体。可以通过常规技术有效去除可溶性聚集物和多聚体，包括尺寸排阻、疏水性相互作用、离子交换或羟磷灰石层析。在这些层析步骤之后的抗体纯度大于99％。产物可以在-70℃立即冷冻，或者可以冻干。下文提供了这些抗体的氨基酸序列。
SEQ ID NOs
  抗体   重链   轻链   HCVR   LCVR
  I   17   19   11   13
  II   18   20   12   14
  III   17   21   11   15
  IV   17   22   11   16
  V   35   34   37   36
实施例2——DKK-1抗体的亲和力(Kd)测量
为了建立结合平衡，将恒定浓度的抗体与改变浓度的His标记的DKK-1(SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32或SEQ ID NO：33)(1nM-1pM范围)在PBS(pH 7.4)+1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)中或仅在缓冲液中混合，在37℃孵育若干天。设置两套结合反应，一套在低抗体浓度(3pM)下启动，一套在高抗体浓度(30或50pM)下启动。
在建立平衡后，使用KinExA 3000仪器(Sapidyne Inst.Inc.)探测“游离的”(未结合的)抗体级分。简而言之，将His标记的DKK-1与NHS激活的Sepharose 4Fast Flow珠(GE Healthcare)共价偶联，所述珠被仪器塞满产生小柱。将预平衡的抗体+His标记的DKK-1的混合物通过珠子，只捕获游离的抗体。所捕获的游离抗体的量与平衡样品中的游离浓度成比例，并被注射的荧光标记的二抗检测。使用KinExA软件中的n-曲线分析全面拟合从抗体低浓度至高浓度的数据集。该拟合返回了Kd值和95％的置信区间。
表1：抗体II与各种物种的DKK-1的亲和力
实施例3——Dkk-1抗体在C2C12碱性磷酸酶测定中的效应
经典Wnt信号传递对成骨细胞分化和活性是重要的。组合了BMP-4的Wnt-3a CM(条件培养基)诱导多能性小鼠C2C12细胞分化为具有可测量的碱性磷酸酶(AP)终点的成骨细胞，所述酶是成骨细胞活性的标志物。DKK-1是经典Wnt信号传递的抑制剂，抑制AP的分化和产生。DKK-1中和抗体阻止了DKK-1介导的AP的抑制作用。阻断DKK-1抑制活性的抗体阻止了AP活性的丧失。
C2C12细胞在生长培养基(含有L-谷氨酰胺、10％热失活的胎牛血清(FBS)、1x抗生素/抗真菌剂、1x丙酮酸钠的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM))中，在组织培养瓶中生长到60％-80％汇合度。将C2C12细胞在生长培养基中重悬为浓度30,000细胞/mL，并向96孔组织培养板中添加100μL/孔，37℃、95％湿度、5％CO2中孵育过夜。用50μL测定培养基(含有L-谷氨酰胺、5％热失活的FBS、1x抗生素/抗真菌剂、1x丙酮酸钠的DMEM)替换生长培养基。为了刺激分化(从而诱导AP产生)，添加含1.5x Wnt-3a CM+BMP-4(R&D Systems货号#314-BP)的100μL测定培养基。这产生的终浓度为1x Wnt-3a CM和25ng/mL BMP-4。阴性对照只含有L-细胞CM(无Wnt-3a或BMP-4)。在37℃、95％湿度、5％CO2中孵育细胞72小时。去除培养基，用200μL磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞，去除PBS。将细胞冻融3次。每个孔添加100μL一步pNPP底物(Thermo Scientific货号#37621)，并在室温孵育平板。读取405nm的吸光值。为了确定抑制分化所需的DKK-1的浓度，滴定各种物种的Dkk-1分子，鉴别完全抑制AP诱导所需的最小浓度。
完全抑制AP诱导的各个物种的最小DKK-1浓度如下：人DKK-1＝38nM，猕猴DKK-1＝11.4nM，大鼠DKK-1＝5.8nM，和兔DKK-1＝25.0nM。
已确定了完全抑制AP诱导的DKK-1浓度，在含抑制浓度的Dkk-1的测定培养基中预孵育递增浓度的抗DKK-1抗体，室温30分钟。如上所述确定AP诱导。结果报道为EC50(nM±标准误差)。
抗体II阻断Dkk-1介导的C2C12AP抑制作用。对于各个物种的DKK-1，EC50(以nM±标准误差给出)如下：人＝9.8±0.41，猕猴＝6.4±0.25，大鼠＝2.9±0.25，和兔＝6.0±0.32。
实施例4——皮质缺陷(CD)体内测定
将6月龄的雌性Sprague-Dawley大鼠切除卵巢，并允许骨质丢失2个月。用电钻和2mm牙用钻头向左右股骨导入2mm直径的缺陷。该钻孔同时穿过前后皮质。通过在术后使用定量计算机X射线断层术(qCT)评估骨密度(“BMD”)35天，纵向的监控骨骼的愈合。在实验结束时，处死动物，将整个股骨进行loaded-to-failure测定，验证整个骨干的生物力学强度。如所示的剂量和时间间隔皮下施用抗体。
给予的抗体II如下：从术后第1天开始，每2周1次5mg/kg(组1)，从术后第9天开始，每2周1次施用1mg/kg(组2)、5mg/kg(组3)，或15mg/kg(组4)。在第35天通过qCT评估BMD。组1表现出前侧和后侧皮质的BMD的统计学显著的增加。组4表现出两侧皮质的BMD的统计学显著的增加，而组2和3表现出BMD的非显著性增加。
实施例5：癌症的体内功效测定
在开始实验之前，在动物设备中驯化小鼠(雌性C.B-17小鼠，FoxChase重度联合免疫缺陷模型#CB17SC-M)一周。在驯化后，将小鼠随机分为每种治疗10只一组。将培养的人A549非小细胞肺癌细胞皮下植入到小鼠的后背侧，并允许肿瘤达到平均肿瘤体积～100mm3。通过皮下注射施用抗体II(1mg/kg和5mg/kg)、对照IgG抗体(1mg/kg和5mg/kg)或载体(补充了0.02％Tween 80的柠檬酸缓冲盐溶液)。动物间隔7天接受2次治疗。
通过电动测径器每周测量肿瘤2次，绘制生长曲线。还每周2次监控动物的体重波动和毒性标志。第29天采集了表3显示的肿瘤体积测量。
如表2所示，治疗组接受抗体II，证实了人A549非小细胞肺癌异种移植物在体内的显著生长抑制。
表2：抗体II在A549人非小细胞肺癌异种移植物模型中的功效
实施例6：在体内异种移植物测定中的血管发生再归一化
为了理解抗肿瘤功效的机制，对用抗体II或IgG对照处理的A549肿瘤进行高容量成像分析。同时定量和定性的分析若干基于表型的标志物，来评估血管发生(CD31和平滑肌肌动蛋白，SMA)、缺氧诱导(葡萄糖转运子1，GLUT1)、细胞增殖(Ki67)和凋亡(Terminal UDP Nick-EndLabeling，TUNEL)的癌症相关生物学过程。
驯化7至8周龄的雌性C.B-17(Fox Chase SCID)模型#CB17SC-M小鼠1周，并允许随意的喂养正常的低脂肪(4.5％)膳食，所述膳食持续整个研究过程。
在补充了10％FBS(InVitrogen#0，100x稀释的丙酮酸钠，非必需氨基酸和pen-strep(分别是Invitrogen#11360、#11140和#15140))的F-12Kaighn培养基(InVitrogen#21127)中生长并分配ATCC来源的A549细胞。在第19代具有95％活力时，将所述细胞分离，并在PBS中制备为终浓度为50x106细胞/ml。
在对象小鼠的侧面以PBS和Matrigel(Becton Dickinson，Bedford，MA)的1∶1混合物，皮下注射5x106A549人肺癌细胞。每周实施2次肿瘤和体重测量。在治疗前，使用随机算法，基于肿瘤大小将小鼠随机化。
当肿瘤达到200mm3时开始，将随机化的小鼠分为2组各10只动物，在第1天和第8天分别皮下给药5mg/kg的抗体II或IgG4对照。在施用第一剂抗体后第10天终止所述研究。
在柠檬酸缓冲盐溶液(CBS)(10mM柠檬酸，pH6，150mM NaCl和0.2％聚山梨醇酯80)中制备抗体II。在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中以6.0mg/ml提供IgG4对照。
在给药17天后从小鼠切除异种移植肿瘤，并置于Zinc-Tris固定剂(BDPharmingen)中。加工固定的肿瘤，封闭在石蜡中，并切片为3μM薄片置于标准显微镜玻片上。玻片在60°F烘烤1小时，然后在二甲苯中去石蜡(处理4次，每次10分钟)。通过一系列乙醇/水浸泡将玻片再度水合，在Tris缓冲盐溶液/Tween(TBST)中进行最后洗涤。然后，用Protein Block(DAKO)封闭玻片30分钟。对于肿瘤健康组，用Hoechst 33324(Invitrogen)、大鼠抗人CD31(Pharmingen)/抗大鼠Alexa-488(Invitrogen)、兔抗Ki67(NeoMarkers)/抗兔Alexa 647(Invitrogen)，和TUNEL-TMR红(在TUNEL稀释缓冲液中1∶5稀释；Roche)的组合染色玻片。对于血管发生组，用Hoechst 33324(Invitrogen)、大鼠抗人CD31(Pharmingen)/抗大鼠Alexa-488(Invitrogen)、兔抗-GLUT1(Chemicon)/抗兔Alexa 647(Invitrogen)，和小鼠抗平滑肌肌动蛋白/Cy3(Sigma)的组合染色玻片。使用iCys激光扫描流式细胞仪(CompuCyte)和安装了Zeiss Axiovert 200M倒置荧光显微镜(Intelligent ImagingInnovations)的Marianas数字成像工作站将玻片成像。使用JMP统计学软件(SAS)中的Dunnet分析来实施治疗组的定量数据比较。
如表3所示，对照IgG治疗动物的A549异种移植物是适当血管化的，具有中度水平的成肌纤维细胞和许多局部的低氧区域。对照IgG治疗肿瘤具有由新生血管发生的血管芽和被周细胞较少覆盖的成熟血管组成的延伸的血管网。对照IgG治疗肿瘤具有作为与灌流血管有一定距离的明显区分开的区域的低氧区(用GLUT1标记)，和更加远离血管的坏死区。用抗体II治疗导致减少的血管面积，减少的周细胞面积和血管的减少的周细胞覆盖。然而，该治疗没有导致肿瘤缺氧的显著差异。定性而言，抗体II治疗的肿瘤血管系统似乎由更小得、较低网络化的血管组成，相比对照IgG治疗组具有较低的周细胞覆盖。
如表3所示，IgG治疗的肿瘤的增殖肿瘤细胞的整体分布均匀，但也经常展现出一处或多处无血管大面积的坏死。用抗体II治疗没有导致凋亡的改变，总增殖面积仅有轻微的、非显著的减少。然而，抗体II治疗的肿瘤中的高强度Ki67细胞的百分比面积有显著减少，表示处于G2细胞周期阶段的细胞量减少。
表3：抗体II在体内异种移植物测定中的血管发生再归一化
实施例7：骨骼的体内功效测定
为了评估抗体V(轻链SEQ ID NO：34和重链SEQ ID NO：35)加快植入物周围骨骼形成和骨组织再生的能力，使用称重在约425克的四月龄雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan Sprague Dawley Inc)。向大鼠两腿的在胫骨-腓骨关节右上方的中间外侧，手术植入钛螺钉(2mm x 4mm)。然后，根据体重将大鼠随机分为2组，从手术当天开始，接受每周1次的皮下注射10mg/kg抗体V或10mg/kg IgG对照，共21天。使用定量的计算机X射线断层术(Aloka LaTheta LTC-100模型CT扫描仪)进行离体扫描，定量具有60-μm体素(voxel)大小的新形成的骨。目标体积(VOI)定义为在前述植入物位点以0.1mm间距的28片(slice)。使用显著水平为P＜0.05的Dunnett方法与IgG对照比较，用JMP 5.1版软件(Cary，NorthCarolina)评估组差异。离体的faxitron X射线成像定性评估指出抗体V治疗的大鼠在植入物周围具有更多的新骨或愈伤组织。定量CT分析揭示了相比IgG对照，在抗体V治疗的大鼠中，皮质的植入物周围的骨矿物质含量(14％)、新骨面积(16％)、皮质厚度(7％)和骨髓松质的植入物周围的新骨矿物质含量(18％)和骨面积(16％)统计学显著的增加。数据证实抗体V刺激植入钛的大鼠中的新骨形成和加快再生骨组织。
表4：植入物周围的新骨形成的显微CT分析
数据表示为平均值±SE。*，p＜0.05，对比IgG对照，JMP Dunnett测试。
序列表
重链CDR
SEQ ID NO：1GFTFSSYTMS
SEQ ID NO：2TISGGGFGTYYPDSVKG
SEQ ID NO：3PGYHNYYFDI
SEQ ID NO：4PGYNNYYFDI
轻链CDR
SEQ ID NO：5HASDSISNSLH
SEQ ID NO：6YGRQSIQ
SEQ ID NO：7QQSESWPLH
SEQ ID NO：8YARQSIQ
SEQ ID NO：9QQSASWPLH
SEQ ID NO：10YARQSEQ
重链可变区
SEQ ID NO：11
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG
GFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYHNYYFDI
WGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG
GFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYNNYYFDI
WGQGTTVTVSS
轻链可变区
SEQ ID NO：13
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYGRQSIQG
IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPLHFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：14
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYARQSIQG
IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPLHFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：15
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLIYYGRQSIQG
IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWPLHFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：16
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYARQSEQ
GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWPLHFGGGTKVEIK
完整的重链
SEQ ID NO：17
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG
GFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYHNYYFDI
WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG
ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE
SKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG
LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSLG
SEQ ID NO：18
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG
GFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYNNYYFDI
WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG
ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE
SKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG
LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSLG
完整的轻链
SEQ ID NO：19
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYGRQSIQG
IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPLHFGGGTKVEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS
KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：20
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYARQSIQG
IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPLHFGGGTKVEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS
KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：21
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYGRQSIQG
IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWPLHFGGGTKVEIKRTVAAP
SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS
KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：22
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYARQSEQ
GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWPLHFGGGTKVEIKRTVAA
PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
核苷酸序列——重链可变区
SEQ ID NO：23
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCC
TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATACCATGTCTT
GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATTTCCGG
TGGTGGTTTCGGCACATACTATCCCGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCT
CCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC
CGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCTGGATATCACAACTACTACT
TTGACATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAA
GGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGC
ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG
TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC
CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG
CAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAAC
ACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCT
GCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAA
ACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTG
GTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATG
GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACA
GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAC
GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCG
AGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACA
CCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG
CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAAT
GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG
GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGA
GGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA
CACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT
SEQ ID NO：24
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCC
TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATACCATGTCTT
GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATTTCCGG
TGGTGGTTTCGGCACATACTATCCCGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCT
CCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC
CGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCTGGATATAATAACTACTACT
TTGACATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAA
GGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGC
ACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGG
TGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC
CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG
CAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAAC
ACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCT
GCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAA
ACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTG
GTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATG
GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACA
GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAAC
GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCG
AGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACA
CCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG
CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAAT
GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG
GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGA
GGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACA
CACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT
核苷酸序列——轻链可变区
SEQ ID NO：25
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAG
AGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGT
ACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGGCAGACA
GTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC
TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTG
TCAACAGAGTGAGAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG
ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA
GCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATC
CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA
CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC
AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC
GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCA
ACAGGGGAGAGTGC
SEQ ID NO：26
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAG
AGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGT
ACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGCTAGACA
GTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC
TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTG
TCAACAGAGTGAGAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG
ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA
GCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATC
CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA
CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC
AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC
GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCA
ACAGGGGAGAGTGC
SEQID NO：27
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAG
AGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGT
ACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGGCAGACA
GTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC
TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTG
TCAACAGAGTGCCAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG
ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA
GCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATC
CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA
CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC
AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC
GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCA
ACAGGGGAGAGTGC
SEQ ID NO：28
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAG
AGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGT
ACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGCTAGACA
GTCCGAGCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC
TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTG
TCAACAGAGTGCCAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG
ATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGA
GCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATC
CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA
CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC
AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC
GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCA
ACAGGGGAGAGTGC
人DKK-1
SEQ ID NO：29
TLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCA
EDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICV
SSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDC
ASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKD
HHQASNSSRLHTCQRH
猕猴DKK-1
SEQ ID NO：30
TLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCA
EDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICV
SSDQNNFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHSKGQEGSVCLRSSDC
ATGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKD
HHQASNSSRLHTCQR
大鼠DKK-1
SEQ ID NO：31
TLNSVLINSNAIKNLPPPLGGAGGQPGSAVSVAPGVLYEGGNKYQTLDNYQPYPC
AEDEECGTDEYCSSPSRGAAGVGGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNG
ICMPSDHSHLPRGEIEEGIIENLGNDHGAGDGYPRRTTLTSKIYHTKGQEGSVCLR
SSDCATGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLAC
RIQKDHHQTSNSSRLHTCQRHAFIDYKDDDDKHV
兔DKK-1
SEQ ID NO：32
TLNSVLVNSNAIKNLPPPLGGANGHPGSAVSATPGILYEGGNKYLPLDNYQPYPC
TEDEECGTDEYCASPARGGGAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGIC
MPSDHNHFHRGEIEETIVESFGNDHSTSDGYSRRTTLSSKMYHAKGQEGSVCLRS
SDCATGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGDGLSCR
LQNDQHEASNSSRLHTCQR
小鼠DKK-1
SEQ ID NO：33
TLNSVLINSNAIKNLPPPLGGAGGQPGSAVSVAPGVLYEGGNKYQTLDNYQPYPC
AEDEECGSDEYCSSPSRGAAGVGGVQICLACRKRRKRCMTHAMCCPGNYCKNG
ICMPSDHSHFPRGEIEESIIENLGNDHNAAAGDGYPRRTTLTSKIYHTKGQEGSVC
LRSSDCAAGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHKRKGSHGLEIFQRCYCGEGL
ACRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH
抗体V-完整的轻链
SEQ ID NO：34
DILLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASDSISGSLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGI
PSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLNFGAGTKLELKRADAAP
TVSIFPPSTEQLATGGASVVCLMNNFYPRDISVKWKIDGTERRDGVLDSVTDQDS
KDSTYSMSSTLSLSKADYESHNLYTCEVVHKTSSSPVVKSFNRNEC
抗体V-完整的重链
SEQ ID NO：35
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISGG
GGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLSSLRSEDTALYYCARPGYNNYYFDY
WGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGTALKSNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNS
GALSSGVHTFPAVLQSGLYTLTSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIV
PRNCGGDCKPCICTGSEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISQDDPEVHFS
WFVDDVEVHTAQTRPPEEQFNSTFRSVSELPILHQDWLNGRTFRCKVTSAAFPSPI
EKTISKPEGRTQVPHVYTMSPTKEEMTQNEVSITCMVKGFYPPDIYVEWQMNGQ
PQENYKNTPPTMDTDGSYFLYSKLNVKKEKWQQGNTFTCSVLHEGLHNHHTEK
SLSHSPGK
抗体V-轻链可变区
SEQ ID NO：36
DILLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASDSISGSLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGI
PSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLNFGAGTKLELK
抗体V-重链可变区
SEQ ID NO：37
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISGG
GGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLSSLRSEDTALYYCARPGYNNYYFDY
WGQGTTLTVSS
抗体V-重链CDR
SEQ ID NO：38    TISGGGGNTYYPDSVKG
SEQ ID NO：39    PGYNNYYFDY
抗体V-轻链CDR
SEQ ID NO：40    RASDSISGSLH
SEQ ID NO：41    YASQSIS
SEQ ID NO：42    QQSNSWPLN
共同重链CDR
SEQ ID NO：43TISGGGX1X2TYYPDSVKG
X1是F、G
X2是G、N
SEQ ID NO：44PGYX3NYYFDI
X3是H、N
SEQ ID NO：45PGYX4NYYFDX5
X4是H、N
X5是I、Y
共有轻链CDR
SEQ ID NO：46X6ASDSISX7SLH
X6是H、R
X7是N、G
SEQ ID NO：47YX8RQSX9Q
X8是G、A
X9是I、E
SEQ ID NO：48YX10X11QSX12X13
X10是G、A
X11是R、S
X12是I、E
X13是Q、S
SEQ ID NO：49QQSX14SWPLH
X14是E、A
SEQ ID NO：50QQSX15SWPLX16
X15是E、A、N
X16是H、N
共有重链可变区
SEQ ID NO：51
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGG
GFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYX17NYYF
DIWGQGTTVTVSS
X17是H、N
共有轻链可变区
SEQ ID NO：52
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWQQKPGQAPRLLIYYX18RQS
X19QGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC QQSX20SWPLHFGGGTKVEIK
X18是G、A
X19是I、E
X20是E、A

Claims (6)

1.人工程化的DKK-1抗体，其包含轻链可变区LCVR和重链可变区HCVR，其中LCVR的氨基酸序列通过SEQ IDNO:14给出，且HCVR的氨基酸序列通过SEQ ID NO:12给出。
2.权利要求1的人工程化的DKK-1抗体，其中人工程化的DKK-1抗体包括轻链和重链氨基酸序列，其中轻链氨基酸序列通过SEQ ID NO:20给出，且重链氨基酸序列通过SEQ IDNO:18给出。
3.权利要求2的人工程化的DKK-1抗体，其包含两条轻链和两条重链氨基酸序列，其中每条轻链氨基酸序列通过SEQID NO:20的氨基酸序列给出，且每条重链的氨基酸序列通过SEQ ID NO:18的氨基酸序列给出。
4.药物组合物，其包含权利要求1-3的任一项的人工程化的DKK-1抗体，和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
5.权利要求4的药物组合物，其用于骨骼愈合的治疗。
6.权利要求4的药物组合物，其用于选自多发性骨髓瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌的癌症的治疗。
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