TWI546079B - Ｄｋｋ－１抗體 - Google Patents

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TWI546079B TW099110438A TW99110438A TWI546079B TW I546079 B TWI546079 B TW I546079B TW 099110438 A TW099110438 A TW 099110438A TW 99110438 A TW99110438 A TW 99110438A TW I546079 B TWI546079 B TW I546079B
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Description

DKK-1抗體
本發明係關於抗DKK-1之經改造人類抗體及其在治療其中發病機制受DKK-1調介之疾病中的用途。
Dickkopf-1(Dkk-1)係dickkopf家族蛋白之成員，該等dickkopf家族蛋白經證實為典型Wnt-信號傳導途徑之負調節物。該途徑在骨骼發育及形成中起著重要作用。Dkk-1可藉由與Wnt共受體LRP5或LRP6及kremen蛋白相互作用來抑制Wnt信號傳導。Dkk-1可阻止Wnt途徑之成員與LRP5或LRP6相互作用，進而阻止Wnt調介之信號轉導。亦證實DKK1參與骨轉移性癌症，包括多發性骨髓瘤、乳癌瘤、腎癌瘤及非小細胞肺癌。
儘管人們已經闡述可結合Dkk-1之抗體(例如，參見，WO2006015373)，然而，仍需要可抑制Dkk-1與LRP5及LRP6相互作用之治療性經改造人類DKK-1抗體。此外，鑒於Dkk-1參與調節骨骼形成，人們需要可用於骨骼癒合之治療性經改造人類抗-Dkk-1抗體。此外，考慮到Dkk-1參與癌症，人們需要可用於治療包括多發性骨髓瘤、乳癌及非小細胞肺癌在內之癌症的經改造人類抗-Dkk-1抗體。
本發明之抗體係擁有許多期望特性之治療有用的DKK-1拮抗劑。本發明經改造人類抗體對人類DKK-1、獼猴DKK-1、大鼠DKK-1、小鼠DKK-1、及兔子DKK-1均呈現高親和性(Kd)。本發明之抗體可阻斷DKK-1-調介之鹼性磷酸酶(成骨細胞活性之標記物)抑制。進而言之，本發明之抗體在活體內皮質缺陷模型中於前皮質及後皮質處呈現骨質密度增加並展現明顯的活體內非小細胞肺異種移植生長抑制。
本發明提供在37℃下對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)、獼猴DKK-1(SEQ ID NO: 30)、大鼠Dkk-1(SEQ ID NO: 31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO: 33)、及兔子DKK-1(SEQ ID NO: 32)具有小於5.0×10-11 M之Kd的經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段。
本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其結合片段，其中LCDR1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5，LCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO: 47，LCDR3具有胺基酸序列SEQ ID NO: 49，HCDR1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1，HCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO: 2，且HCDR3具有胺基酸序列SEQ ID NO: 44。
本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明之經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
本發明提供癒合骨骼之方法，其包含投與本發明之經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段。本發明亦提供治療癌症之方法，其包含投與本發明之經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中該癌症係選自由多發性骨髓瘤、乳癌及非小細胞肺癌組成之群。
本發明提供如本文所述經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)具有小於1.5×10-11 M之Kd。更佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)具有小於1.0×10-11 M之Kd。另外較佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)具有小於5.0×10-12 M之Kd。更佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)具有介於0.5×10-12 M與1.5×10-11 M間之Kd。另外較佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)具有介於1.0×10-12 M與1.0×10-11 M間之Kd。該等Kd數值可藉由在37℃下之結合平衡來建立，如在實例2中所述。
本發明亦提供如本文所述經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)、獼猴DKK-1(SEQ ID NO: 30)、大鼠Dkk-1(SEQ ID NO: 31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO: 33)、及兔子DKK-1(SEQ ID NO: 32)具有小於5.0×10-11 M之Kd。更佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)、獼猴DKK-1(SEQ ID NO: 30)、大鼠Dkk-1(SEQ ID NO: 31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO: 33)、及兔子DKK-1(SEQ ID NO: 32)具有小於3.0×10-11 M之Kd。另外較佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)、大鼠Dkk-1(SEQ ID NO: 31)、及小鼠DKK-1(SEQ ID NO: 33)具有小於2.0×10-11 M之Kd。更佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)、獼猴DKK-1(SEQ ID NO: 30)、大鼠Dkk-1(SEQ ID NO: 31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO: 33)、及兔子DKK-1(SEQ ID NO: 32)具有介於1.0×10-11 M與5.0×10-11 M間之Kd。另外較佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)、大鼠Dkk-1(SEQ ID NO: 31)、及小鼠DKK-1(SEQ ID NO: 33)具有介於1.5×10-11 M與3.0×10-11 M間之Kd。該等Kd數值可藉由在37℃下之結合平衡來建立，如在實例2中所述。
更佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其包含包含胺基酸序列SEQ ID NO: 14之LCVR及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 12之HCVR且其中該經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)、獼猴DKK-1(SEQ ID NO: 30)、大鼠Dkk-1(SEQ ID NO: 31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO: 33)、及兔子DKK-1(SEQ ID NO: 32)具有小於3.0×10-11 M之Kd。另外較佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其包含包含胺基酸序列SEQ ID NO: 14之LCVR及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 12之HCVR且其中該經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)、獼猴DKK-1(SEQ ID NO: 30)、大鼠Dkk-1(SEQ ID NO: 31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO: 33)、及兔子DKK-1(SEQ ID NO: 32)具有小於2.5×10-11 M之Kd。更佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其包含包含胺基酸序列SEQ ID NO: 14之LCVR及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 12之HCVR且其中該經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)、獼猴DKK-1(SEQ ID NO: 30)、大鼠Dkk-1(SEQ ID NO: 31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO: 33)、及兔子DKK-1(SEQ ID NO: 32)具有小於2.0×10-11 M之Kd。另外較佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其包含包含胺基酸序列SEQ ID NO: 14之LCVR及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 12之HCVR且其中該經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)、獼猴DKK-1(SEQ ID NO: 30)、大鼠Dkk-1(SEQ ID NO: 31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO: 33)、及兔子DKK-1(SEQ ID NO: 32)具有介於0.5×10-12 M與3.0×10-11 M間之Kd。更佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其包含包含胺基酸序列SEQ ID NO: 14之LCVR及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 12之HCVR且其中該經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段對人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)、獼猴DKK-1(SEQ ID NO: 30)、大鼠Dkk-1(SEQ ID NO: 31)、小鼠DKK-1(SEQ ID NO: 33)、及兔子DKK-1(SEQ ID NO: 32)具有介於1.0×10-12 M與2.5×10-11 M間之Kd。該等Kd數值可藉由在37℃下之結合平衡來建立，如在實例2中所述。
本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其結合片段，其包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含互補決定區(CDR) LCDR1、LCDR2、及LCDR3且該HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中LCDR1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5，HCDR1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1，且HCDR2具有具有胺基酸序列SEQ ID NO: 2。
本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其結合片段，其中LCDR1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 46，LCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO: 48，LCDR3具有胺基酸序列SEQ ID NO: 50，HCDR1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1，HCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO: 43，且HCDR3具有胺基酸序列SEQ ID NO: 45。本發明較佳提供經改造人類DKK-1抗體或其結合片段，其中LCDR1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5，LCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO: 47，LCDR3具有胺基酸序列SEQ ID NO: 49，HCDR1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1，HCDR2具有具有胺基酸序列SEQ ID NO: 2，且HCDR3具有胺基酸序列SEQ ID NO: 44。
本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其結合片段，其中LCDR1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5，LCDR2具有選自由SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、及SEQ ID NO: 10組成之群之胺基酸序列，LCDR3具有選自由SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 9組成之群之胺基酸序列，HCDR1具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1，HCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO: 2且HCDR3具有選自由SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4組成之群之胺基酸序列。
本發明較佳提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2及HCDR3具有選自由下列組成之群之胺基酸序列：
(i) LCDR1係SEQ ID NO: 5、LCDR2係SEQ ID NO: 6、LCDR3係SEQ ID NO: 7、HCDR1係SEQ ID NO: 1、HCDR2係SEQ ID NO: 2、且HCDR3係SEQ ID NO: 3，
(ii) LCDR1係SEQ ID NO: 5、LCDR2係SEQ ID NO: 8、LCDR3係SEQ ID NO: 7、HCDR1係SEQ ID NO: 1、HCDR2係SEQ ID NO: 2、且HCDR3係SEQ ID NO: 4，
(iii) LCDR1係SEQ ID NO: 5、LCDR2係SEQ ID NO: 6、LCDR3係SEQ ID NO: 9、HCDR1係SEQ ID NO: 1、HCDR2係SEQ ID NO: 2、且HCDR3係SEQ ID NO: 3，
(iv) LCDR1係SEQ ID NO: 5、LCDR2係SEQ ID NO: 10、LCDR3係SEQ ID NO: 9、HCDR1係SEQ ID NO: 1、HCDR2係SEQ ID NO: 2、且HCDR3係SEQ ID NO: 3。
本發明提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中LCVR包含胺基酸序列SEQ ID NO: 52且HCVR包含胺基酸序列SEQ ID NO: 51。
本發明較佳提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中LCVR包含選自由SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、及SEQ ID NO: 16組成之群之胺基酸序列。
本發明較佳提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中HCVR包含選自由SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12組成之群之胺基酸序列。
本發明較佳提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中LCVR及HCVR包含選自由下列組成之群之胺基酸序列：
(i)　包含胺基酸序列SEQ ID NO: 13之LCVR及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 11之HCVR；
(ii)　包含胺基酸序列SEQ ID NO: 14之LCVR及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 12之HCVR；
(iii)　包含胺基酸序列SEQ ID NO: 15之LCVR及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 11之HCVR；
(iv)　包含胺基酸序列SEQ ID NO: 16之LCVR及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 11之HCVR。
本發明較佳提供經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其包含包含胺基酸序列SEQ ID NO: 14之LCVR及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 12之HCVR。
本發明較佳提供經改造人類DKK-1抗體，其中該經改造人類DKK-1抗體包含輕鏈，其中該輕鏈包含選自由SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、及SEQ ID NO: 22組成之群之胺基酸序列。
本發明較佳提供經改造人類DKK-1抗體，其中該經改造人類DKK-1抗體包含重鏈，其中該重鏈包含選自由SEQ ID NO: 17及SEQ ID NO: 18組成之群之胺基酸序列。
更佳地，本發明提供經改造人類DKK-1抗體，其中該經改造人類DKK-1抗體包含選自有下列組成之群之重鏈及輕鏈胺基酸序列：
(i)　包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 19之輕鏈，
(ii)　包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 20之輕鏈，
(iii)　包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 21之輕鏈，以及
(iv)　包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之輕鏈。
本發明較佳提供包含兩輕鏈及兩重鏈之經改造人類DKK-1抗體，其中每一輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 19，其中每一重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17。
本發明較佳提供包含兩輕鏈及兩重鏈之經改造人類DKK-1抗體，其中每一輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 21，其中每一重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17。
本發明較佳提供包含兩輕鏈及兩重鏈之經改造人類DKK-1抗體，其中每一輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22，其中每一重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17。
本發明較佳提供包含兩輕鏈及兩重鏈之經改造人類DKK-1抗體，其中每一輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 20，其中每一重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18。
本發明亦提供可與本發明之經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段競爭結合人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)的抗體或其抗原結合片段，如藉由抗體競爭檢驗測得。
本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明之經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
進而言之，本發明提供醫藥組合物，其包含本發明之經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段以及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、或賦形劑及可選其他治療成份。
在另一態樣中，本發明提供癒合骨骼之方法，其包含投與本發明之經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段。
在另一態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其包含投與本發明之經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段，其中該癌症較佳選自由多發性骨髓瘤、乳癌及非小細胞肺癌組成之群。
進而言之，本發明提供本發明之經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段於治療中之用途。較佳地，本發明提供本發明之經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段於治療骨骼癒合及治療癌症中之用途，其中該癌症較佳選自由多發性骨髓瘤、乳癌及非小細胞肺癌組成之群。
進而言之，本發明亦提供本發明之經改造人類DKK-1抗體或其抗原結合片段於製造藥物中用途，該藥物用於治療、癒合骨骼或治療癌症，其中該癌症較佳選自由多發性骨髓瘤、乳癌及非小細胞肺癌組成之群。
 定義
自然界存在的全長抗體係包含2條重(H)鏈及2條輕(L)鏈藉由二硫鍵互連之免疫球蛋白分子。每條鏈之胺基端部分包括約100-110個胺基酸之可變區，經由其中所含互補決定區(CDRs)主要負責抗原識別。每條鏈之羧基端部分界定主要負責效應子功能之恆定區。
該等CDR間散佈有較保守的區域，稱為框架區(「FR」)。每一輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)係由3個CDR及4個FR組成，自胺基端至羧基端以下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈之3個CDR稱作「LCDR1、LCDR2、及LCDR3」且重鏈之3個CDR稱作「HCDR1、HCDR2、及HCDR3」。該等CDR含有大部分與該抗原形成特定相互作用之殘基。LCVR區及HCVR區內之CDR胺基酸殘基之編號及定位係根據熟知的Kabat編號規定。
輕鏈分類為κ或λ，由業內熟知的特定恆定區表徵。重鏈分類為γ、μ、α、δ、或ε，分別將抗體之同型(isotype)定義為IgG、IgM、IgA、IgD、或IgE。IgG抗體可進一步分成亞類，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。每一重鏈類型由具有業內熟知序列之特定恆定區表徵。
如本文所用，術語「單株抗體」(Mab)係指衍生自單拷貝或純系(包括例如任何真核、原核或噬菌體純系)之抗體，而非指產生該抗體之方法。本發明之Mabs較佳以同源或實質同源群體存在。完整Mab含有2條重鏈及2條輕鏈。此等單株抗體之「抗原結合片段」包括例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、及單鏈Fv片段。本發明之單株抗體及其抗原結合片段可藉由例如重組技術、噬菌體呈現技術、合成技術(例如CDR-接枝)、或此等技術之組合、或業內已知的其他技術產生。舉例而言，可用人類DKK-1或其片段免疫小鼠，可回收並純化所得抗體，並可藉由下文實例中所揭示方法來評估該等抗體是否擁有與本文所揭示抗體化合物相似或相同的結合及功能性質。抗原結合片段亦可由習用方法製備。用於產生及純化抗體及抗原結合片段之方法在業內為眾人所熟知，可發現於例如Harlow及Lane(1988) Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York，第5-8章及第15章，ISBN 0-87969-314-2中。
短語「嵌合抗體」係指含有來自不同物種(通常2種物種)之結構域的抗體。抗體V係其中輕鏈及重鏈可變結構域含有來自鼠類抗體之殘基，而恆定區輕鏈結構域含有包含大鼠K輕鏈之殘基且恆定區重鏈結構域含有包含大鼠IgG1抗體之殘基的嵌合抗體。抗體V係鼠類/大鼠嵌合體且其可用於研究中以降低長期臨床前模型之免疫響應可能性。
短語「經改造之人類抗體」係指按照本發明具有結合及功能特性且具有框架區的單株抗體，該等框架區係在衍生自非人類抗體之CDR周圍的實質上人類或完全人類框架區。此等經改造人類抗體之「抗原結合片段」包括(例如)Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段及單鏈Fv片段。「框架區」或「框架序列」係指框架區1至4中之任一者。本發明所涵蓋經改造之人類抗體及其抗原結合片段包括其中框架區1至4中任一者或多者係實質上或完全人類框架區之分子，亦即，其中存在個別實質上或完全人類框架區1至4之任一可能組合。舉例而言，此包括其中框架區1及框架區2、框架區1及框架區3、框架區1、2及3等為實質上或完全人類框架區之分子。實質上人類框架係彼等與已知人類種系框架序列具有至少約80%序列一致性者。較佳地，該等實質上人類框架與已知人類種系框架序列具有至少約85%、約90%、約95%、或約99%序列一致性。
完全人類框架係彼等與已知人類種系框架序列一致者。人類種系框架序列可自ImMunoGeneTics(IMGT)經由其網址http://imgt.cines.fr或自Marie-Paule Lefranc及Gerard Lefranc之The Immunoglobulin FactsBook，Academic Press,2001,ISBN 012441351獲得。舉例而言，種系輕鏈框架可選自由下列組成之群：A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、LI、L1I、L12、L2、L5、L15、L6、L8、O12、O2、及O8，且種系重鏈框架區可選自由下列組成之群：VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VHI-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VHI-18、VHI-69、VI-13-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59、及VH5-5I。
可使用若干不同的方法來產生除彼等本文所揭示者外按照本發明呈現類似功能特性之經改造人類抗體。本文所揭示特定抗體化合物可用作製備額外抗體化合物之模板或親本抗體化合物。在一種方法中，將該等親本抗體化合物CDR接入與親本抗體化合物框架具有高度序列一致性之人類框架。新穎框架之序列與親本抗體化合物之對應框架的序列通常可具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%一致性。與親本抗體之結合親和性相比，此接入可導致結合親和性降低。倘若如此，則該框架可依據Queen等人，(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869所揭示特定標準在某些位置處經回復突變生成該親本框架。闡述可用於人類化小鼠抗體之方法的額外參考文獻包括美國專利第4,816,397號、第5,225,539號及第5,693,761號；如在Levitt(1983) J. Mol. Biol. 168:595-620中所述計算機程式ABMOD及ENCAD；及Winter及同事之方法(Jones等人，(1986) Nature 321:522-525;Riechmann等人，(1988) Nature 332:323-327；及Verhoeyen等人，(1988) Science 239:1534-1536)。
考慮回復突變之殘基的識別可實施如下：
當胺基酸屬於下列類屬時，可使用的人類種系序列之框架胺基酸(「受體框架」)可藉由親本抗體化合物框架之框架胺基酸(「供體框架」)代替：
(a)在受體框架之人類框架區中之胺基酸對於在彼位置處之人類框架而言為異常的，而在供體免疫球蛋白中之對應胺基酸對於在彼位置處之人類框架而言為典型的；
(b)該胺基酸之位置緊鄰該等CDR中之一者；或
(c)在三維免疫球蛋白模型中，框架胺基酸之任一側鏈原子係在距CDR胺基酸任一原子約5-6埃(中心至中心)範圍內。
當在受體框架之人類框架區中之每一胺基酸及在供體框架中之對應胺基酸對於在彼位置處之人類框架通常為異常時，此胺基酸可藉由對於在彼位置處之人類框架而言為典型的胺基酸代替。此回復突變標準使得人們能夠恢復親本抗體化合物之活性。
產生與本文所揭示抗體化合物呈現類似功能特性之經改造人類抗體之另一方法涉及在不改變框架的情況下使所移植CDR內之胺基酸任意地突變並篩選結合親和性及其他功能特性與親本抗體化合物一樣好或較其更佳的所得分子。亦可在每一CDR內之每一胺基酸位置處引入單突變，繼而評定此等突變對結合親和性及其他功能特性之影響。可將產生改良特性之若干單突變組合在一起以便評定該等在彼此組合時之影響。
進而言之，上述兩方法之組合係可能的。在CDR接入後，人們除了可在該等CDR中引入胺基酸變化外亦可對特定框架區實施回復突變。此方法闡述於Wu等人，(1999)J. Mol. Biol. 294:151-162中。
熟習此項技術之人員可應用本發明之教示使用常見技術(例如，定點誘變)來取代在目前所揭示CDR及框架序列中之胺基酸並藉此產生源自本發明序列之其他可變區胺基酸序列。可在特定取代位點引入所有替代天然胺基酸。本文所揭示方法隨後可用於篩選此等額外可變區胺基酸序列以鑑別具有指定活體內功能之序列。以此方式可鑑別適用於製備本發明之經改造人類抗體及其抗原結合部分的其他序列。較佳地，在該等框架內之胺基酸取代限於在本文所揭示4個輕鏈及/或重鏈框架區之任一者或多者內之1個、2個或3個位置。較佳地，在該等CDR內之胺基酸取代限於在3個輕鏈及/或重鏈CDR之任一者或多者內之1個、2個或3個位置。在此等框架區及上文所述CDR內之各種變化之組合亦為可能的。最佳地，此等技術可用於產生其他可變區胺基酸序列，使用在SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 14中分別所述的可變重鏈及輕鏈胺基酸序列。
與本文所揭示分子「競爭」之經改造人類抗體或其抗原結合片段係彼等可在與結合本發明分子之位點相同或重疊的位點處結合人類DKK-1(SEQ ID NO: 29)者。可藉由(例如)抗體競爭檢驗來鑑別競爭經改造人類抗體或其抗原結合片段。舉例而言，純化或部分純化人類DKK-1(SEQ ID NO:29)試樣與固體載體結合。隨後可添加本文所揭示抗體及測試單株抗體或抗原結合片段，其中該測試體或本發明抗體經標記。倘若經標記抗體及未經標記抗體結合在DKK-1上之單獨分立位點，則無論是否存在疑似競爭抗體該經標記抗體均會以相同程度結合。然而，倘若相互作用位點相同或重疊，則未經標記抗體會競爭且結合抗原之經標記抗體之量會減少。倘若存在過量的未經標記抗體，則不會結合經標記抗體。出於本發明之目的，競爭經改造人類抗體或其抗原結合片段係彼等可使本發明抗體與DKK-1之結合減少約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%、或約99%者。關於實施此等競爭檢驗之程序的詳情在業內已為眾人所熟知且可發現於(例如)Harlow及Lane(1988) Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York，第567-569頁，ISBN 0-87969-314-2中。可藉由使用經純化抗體來定量此等檢驗。可藉由針對抗體本身之經標記形式來滴定該抗體來建立標準曲線。滴定測量未經標記競爭單株抗體或其抗原結合片段抑制經標記分子與模板結合之能力。將該等結果繪製成圖並比較達成期望結合抑制程度所必需的濃度。可藉由在本文實例中所揭示方法來測定在此等競爭檢驗中與本發明經改造人類抗體或其抗原結合片段競爭之單株抗體或其抗原結合片段是否與本發明經改造人類抗體擁有相同的或相似的功能特性。
術語「抑制」意指實質上拮抗、製止、阻止、限制、減緩、破壞、消除、終止、減小、或逆轉DKK-1之生物效應的能力。
術語「治療(treating或treat或treatment)」係指涉及減緩、中斷、中止、控制、終止、減小、或逆轉症狀、病症、病況、或疾病之發展或嚴重程度的過程，但不一定涉及所有與DKK-1活性有關之疾病相關性症狀、病況、或病症的完全消除。
術語「預防(preventing或prevent或prevention)」意指製止、限制或抑制症狀、病症、病況、或疾病之發病或出現。可治療或預防急性事件及慢性病況。在急性事件中，抗體或其抗原結合片段係在症狀、病症、病況、或疾病發作時投與並在該急性事件結束時停止。相反，慢性症狀、病症、病況、或疾病需延長治療時限。
術語「有效量」係指在以單劑或多劑投與患者時提供期望治療或預防之本發明抗體化合物之量或劑量。本發明抗體化合物之治療有效量可包含介於約0.1 mg/kg至約20 mg/kg每單劑之間的量。任一個別患者之治療有效量可由醫療保健提供者藉由監測抗體化合物對生物標記之影響來測定。
術語「骨骼癒合」係指藉由阻斷DKK-1來刺激在損傷位點處骨骼形成。骨骼癒合適應症之實例包括但不限於骨折癒合、植入體固定/保留、及牙科植入體固定/保留。
本發明之經改造人類抗體在人類醫學中可用作醫藥，藉由各種途徑投與。最佳地，此等組合物適合非經腸投與。此等醫藥組合物可藉由業內熟知方法來製備(參見，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第19版(1995),A. Gennaro等人，Mack Publishing公司)且包含如本文所揭示經改造人類抗體及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
下列檢驗之結果證明本發明之單株抗體及其抗原結合片段可用作DKK-1抑制劑。本發明之抗體擁有許多期望特性。舉例而言，本發明之抗體II具有增強的化學及物理穩定性及溶解性。實施加速研究以藉由在不同緩衝條件(pH及NaCl有所變化)下培育本發明之抗體及在4℃、25℃及40℃下培育4周來評定抗體之化學穩定性。可藉由陽離子交換(「CEX」)層析來分離帶電荷變化形式(例如，天冬醯胺脫醯胺生成天冬胺酸)及藉由LC-MS分析來鑑別特定降解位點來檢測本發明抗體之化學修飾。抗體II具有藉由CEX檢測得最少降解量且此結果可藉由LC-MS數據來進一步證實，LC-MS數據顯示在40℃下於pH 8緩衝劑中培育4周後與本文所述其他抗體相比在CDR中之所有3個天冬醯胺殘基具有最少脫醯胺量。在pH 6+150 mM NaCl下調配時抗體II與抗體I相比溶解性更為有利。進而言之，抗體II在4℃下儲存時保持>105 mg/mL之溶解性，而抗體I之溶解性僅為48 mg/mL且在此等相同條件下會沉澱出。如本文所用「EC50」係指藥劑可能產生50%最大響應之濃度。「Kd」係指可藉由公式：koff/kon=Kd計算之平衡解離常數。
實例1-抗體之產生
抗體I、II、III、及IV可製造及純化如下。用分泌抗體之表現系統暫時地或穩定地轉染諸如HEK 293 EBNA或CHO等適當宿主細胞，使用最佳預定HC:LC載體比例或編碼HC(諸如SEQ ID NO: 23、或SEQ ID NO: 24)及LC(諸如SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、或SEQ ID NO: 28)之單載體系統。使用許多常用技術中之任一者來純化其中分泌抗體之澄清介質。舉例而言，該介質可方便地應用於用諸如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)等適當緩衝液平衡之蛋白A或G瓊脂糖FF管柱。洗滌該管柱以移除非特異性結合組份。藉由(例如)pH梯度(諸如0.1 M磷酸鈉緩衝液pH 6.8至0.1 M檸檬酸鈉緩衝液pH 3.0)來洗脫結合抗體。藉由(諸如)SDS-PAGE檢測各抗體部分且隨後彙集之。其他純化係可選的，視期望用途而定。抗體可使用常用技術經濃縮及/或無菌過濾。可藉由常見技術(包括尺寸排除、疏水性相互作用、離子交換或羥磷灰石層析)來有效地移除可溶性聚集體及多聚體。該抗體在此等層析步驟後之純度係大於99%。可將產物在-70℃下立即冷藏或可凍乾。下文提供此等抗體之胺基酸序列。
實 例2：DKK-1抗體之親和性(Kd)測量
為了建立結合平衡，將恆定濃度之抗體與變化濃度之經His標籤DKK-1(SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、或SEQ ID NO: 33)(1 nM-1 pM範圍)混合於PBS(pH 7.4)+1 mg/mL牛血清白蛋白(「BSA」)或單獨緩衝液中並在37℃下培育若干天。安排兩組結合反應，一組以低濃度抗體(3 pM)開始且一組以高濃度抗體(30或50 pM)開始。
在建立平衡後，使用KinExA 3000儀器(Sapidyne Inst.公司)來探測「游離」(未結合)抗體部分。簡而言之，使經His標籤DKK-1共價偶合至藉由該該儀器堆積以形成小管柱之經NHS-活化Sepharose 4 Fast Flow珠體(GE Healthcare)。使抗體+經His標籤DKK-1之預平衡混合物經過該等珠體以便僅捕捉游離抗體。所捕捉游離抗體之量係與其在該平衡試樣之游離濃度成正比並可藉由注入經螢光標記之二級抗體來檢測。使用n型曲線分析藉助KinExA軟體在總體上擬合低濃度及高濃度抗體之數據組。此擬合可彙報Kd值以及95%置信區間。
實 例3：在C2C12鹼性磷酸酶檢驗中Dkk-1抗體之效應
典型Wnt信號傳導對於成骨細胞分化及活性而言十分重要。與BMP-4組合之Wnt-3a CM(條件培養基)可誘導多潛能小鼠C2C12細胞分化成成骨細胞，其中鹼性磷酸酶(「AP」)(成骨細胞活性之標記物)具有可測量終點。DKK-1，一種典型Wnt信號傳導之抑制劑，可抑制AP之分化及產生。中和DKK-1抗體可阻止DKK-1-調介之AP抑制。可阻斷DKK-1抑制活性之抗體可防止AP活性丟失。
使C2C12細胞在組織培養燒瓶中於生長培養基(含有L-麩胺醯胺、10%熱滅活胎牛血清(「FBS」)、1x抗生素/抗黴菌劑、1x丙酮酸鈉之杜貝克氏改良鷹氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(「DMEM」))中生長至60%-80%匯合。將C2C12細胞以30,000個細胞/mL濃度混懸於生長培養基中並以100 μL/孔添加至96-孔組織培養板中且在37℃、95%濕度、5% CO2下培育過夜。用50 μL檢驗培養基(含有L-麩胺醯胺、5%熱滅活FBS、1x抗生素/抗黴菌劑、1x丙酮酸鈉之DMEM)替換生長培養基。為了刺激分化(及因此誘導AP產生)，添加100 μL檢驗培養基+1.5x Wnt-3a CM+BMP-4(R & D Systems目錄號314-BP)。此產生1x Wnt-3a CM及25 ng/mL BMP-4之最終濃度。陰性對照僅含有L-細胞CM(無Wnt-3a或BMP-4)。將細胞在37℃、95%濕度、5% CO2下培育72小時。移除培養基，用200 μL磷酸緩衝鹽溶液(「PBS」)洗滌細胞並移除PBS。將細胞冷凍-解凍3次。向每個孔中添加100 μL單步pNPP基質(Thermo Scientific，目錄號37621)並在室溫下培育該孔板。在405 nm下讀取吸光度。為了測定抑制分化所需DKK-1濃度，滴定來自各物種之Dkk-1分子以確認完全抑制AP誘導所需最小濃度。
可完全抑制AP誘導之每一物種DKK-1之最小濃度係如下：人類DKK-1=38 nM，獼猴DKK-1=11.4 nM，大鼠DKK-1=5.8 nM及兔子DKK-1=25.0 nM。
在測定可完全抑制AP誘導之DKK-1濃度後，將增加濃度之抗-DKK-1抗體在具有抑制濃度Dkk-1之檢驗培養基中於室溫下預培育30分鐘。按照上文所述測定AP誘導。結果報告為EC50(nM±標準誤差)。
抗體II可阻斷Dkk-1-調介之C2C12 AP抑制。對於各種物種之DKK-1，EC50(作為nM±標準誤差給出)係如下：人類=9.8±0.41、獼猴=6.4±0.25、大鼠=2.9±0.25及兔子=6.0±0.32。
實例4：活體內皮質缺陷(CD)檢驗
對6個月大雌性斯普拉-道來氏大鼠切除卵巢且使其骨質疏鬆達2個月。使用具有2 mm牙用鑽頭之電鑽在左側及右側股骨中引入2 mm直徑缺陷。此孔經由前皮質及後皮質延伸。藉由在外科手術後通過使用定量計算的X線段層攝影術(「qCT」)評定骨質密度(「BMD」)35天來在縱向上監測骨骼癒合。在實驗結束時，將動物處死並對全股骨實施加載至失效(loaded-to-failure)測定以確定全骨幹之生物機械強度。以指定劑量及間隔經皮下投與抗體。
抗體II係如下投藥：在外科手術後1天開始每兩週一次5 mg/kg(第1組)，或在外科手術後9天開始每兩週一次投與1 mg/kg(第2組)，5 mg/kg(第3組)，15 mg/kg(第4天)。藉由qCT在第35天評定BMD。第1組顯示在前皮質及後皮質處之BMD在統計學上顯著增加。第4組顯示在兩皮質處之BMD在統計學上顯著增加，但第2組及第3組顯示BMD之增加不明顯。
實例5：活體內癌症效力檢驗
在實驗開始前使小鼠(雌性C.B-17小鼠，Fox Chase重症聯合免疫缺陷模型號CB17SC-M)在動物設施中適應1周。在適應後，將小鼠隨機分成10只/治療組。將經培養人類A549非小細胞肺癌瘤細胞經皮下植入小鼠之後脅腹中並使腫瘤達~100 mm3平均腫瘤體積。藉由皮下注射投與抗體II(1 mg/kg及5 mg/kg)、對照IgG抗體(1 mg/kg及5 mg/kg)或媒劑(補充有0.02% Tween 80之檸檬酸緩衝鹽溶液)。使動物每隔7天接受2次治療。
藉由電子測徑器每週2次測量腫瘤以繪製生長曲線。亦以每週兩次監測動物之體重及毒性跡象。在第29天實施示於表3中腫瘤體積測量。
如在表2中所示，接受抗體II之治療組展現人類A549非小細胞肺活體內異種移植之顯著生長抑制。
實 例6：活體內血管生成再正規化(re-normalization)異種移植檢驗
為理解抗腫瘤功效之機制，對經抗體II或IgG對照治療之A549腫瘤實施高含量顯像分析。對幾種基於表型之標記物實施定量及定性分析以評估與癌症相關之血管發生生物過程(CD31及平滑肌肌動蛋白，SMA)、缺氧誘導(葡萄糖運輸蛋白1，GLUT1)、細胞增生(Ki67)及凋亡(末端UDP切口末端標記(Terminal UDP Nick-End Labeling,TUNEL))。
7至8週齡雌性C.B-17(Fox Chase SCID)型號CB17SC-M小鼠適應1週，並隨意地餵養正常低脂肪(4.5%)飲食，持續整個研究時程。
來自ATCC之A549細胞在補充有10%FBS(InVitrogen 0號)及100x丙酮酸鈉稀釋液、非必需胺基酸及pen-strep(分別Invitrogen 11360號、11140號及15140號)之F-12 Kaighn培養基(InVitrogen 21127號)中生長並分裂。將該等細胞分離出，並以95%存活率傳代19次製備在PBS中之最終濃度為50×106個細胞/ml。
5×106個A549人類肺癌瘤細胞於PBS與基質膠(Matrigel)(Becton Dickinson,Bedford,MA)之1:1混合物中經皮下注射於小鼠脅腹中。每週兩次實施腫瘤及體重測量。在治療前，根據腫瘤大小使用隨機算法將小鼠隨機化。
在腫瘤達200 mm3時開始，將隨機化小鼠分成2組，每組10隻小鼠，在第1天且再於第8天經皮下投藥5 mg/kg抗體II或IgG4對照。在投與第一劑抗體後10天終止該研究。
抗體II在檸檬酸鹽緩衝鹽水(CBS)(10 mM檸檬酸鹽pH 6，150 mM NaCl及0.2%聚山梨醇酯)中製備。提供6.0 mg/ml於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之IgG4對照。
在投藥17天後，異種移植腫瘤自小鼠切除並置於Zinc-Tris固定劑(BD Pharmingen)中。將固定之腫瘤處理，封在石蠟中，並切成3 μM切片放在標準顯微鏡載玻片上。載玻片在60℉烘焙1小時，隨後在二甲苯中脫蠟(處理4次，每次10分鐘)。載玻片經由浸入一系列乙醇/水中再水合，並在Tris緩衝鹽水/Tween(TBST)中最終洗滌。隨後載玻片用Protein Block(DAKO)封阻30分鐘。對於腫瘤保健小組(Tumor Health Panel)，載玻片用Hoechst 33324(Invitrogen)、大鼠抗-人類CD31(Pharmingen)/抗-大鼠Alexa-488(Invitrogen)、兔子抗-Ki67(NeoMarkers)/抗-兔子Alexa 647(Invitrogen)、及TUNEL-TMR red(在TUNEL稀釋緩衝液中以1:5稀釋；Roche)之組合染色。對於血管發生小組，載玻片用Hoechst 33324(Invitrogen)、大鼠抗-人類CD31(Pharmingen)/抗-大鼠Alexa-488(Invitrogen)、兔子抗-GLUT1(Chemicon)/抗-兔子Alexa 647(Invitrogen)及小鼠抗-平滑肌肌動蛋白/Cy3(Sigma)之組合染色。載玻片使用iCys雷射掃描細胞計數器(CompuCyte)及配置有Zeiss Axiovert 200M倒置螢光顯微鏡(Intelligent Imaging Innovations)之Marianas數位顯像工作站顯像。使用JMP統計軟體(SAS)中之Dunnet分析實施各治療組之定量數據比較。
如在表3中所示，來自經IgG治療對照動物之A549異種移植體適度地形成血管、具有中等成肌纖維細胞含量及許多局灶性缺氧區。經IgG治療之對照腫瘤具有由新生成血管芽及成熟血管組成之經擴展血管網絡，該等成熟血管未被周細胞充分覆蓋。經IgG治療之對照腫瘤具有缺氧區(藉由GLUT1標記)，其係距灌流血管一定距離之標記分明的區域及距血管甚至更遠之壞死區。用抗體II治療可減小血管區、減小周細胞區及減小血管之周細胞覆蓋率。然而，此治療並不會使腫瘤缺氧顯著變化。在定量上，經抗體II治療之腫瘤血管系統看起來由較小、較少網絡化的血管組成且與經IgG治療之對照組相比周細胞覆蓋率較小。
如在表3中所示，經IgG治療之腫瘤具有均勻地分佈遍及之增生腫瘤細胞，而且亦經常地顯示一個或多個大的無血管壞死區。用抗體II治療並未使凋亡有所變化且僅使總增生面積有輕微的、不明顯的減少。然而，在經抗體II治療腫瘤中高強度Ki67細胞之面積百分比明顯下降，此可表明在G2細胞週期中細胞之量減少。
實 例7：骨骼活體內效力檢驗
為了評估抗體V(輕鏈SEQ ID NO: 34及重鏈SEQ ID NO: 35)加速植入體周圍骨骼形成及再生骨骼組織之能力，利用稱重約425克之4個月大雄性斯普拉-道來氏大鼠(Harlan Sprague Dawley公司)。在脛骨-腓骨關節正上方於兩腿之中間橫向側對大鼠以外科手術方式植入鈦螺絲(2 mm×4 mm)。隨後將大鼠按照體重隨機分成2組並使其每週一次經皮下注射接受抗體V 10 mg/kg或IgG對照10 mg/kg，在外科手術之日開始，持續21天。使用定量計算的X線斷層攝影術(Aloka LaTheta LTC-100型CT掃描儀)進行離體掃描並定量具有60-μm立體像素大小之新形成骨骼。相關體積(VOI)定義為在先前植入部位上方間隔0.1 mm之28個切片。用JMP 5.1.版軟體(Cary,North Carolina)評定各組差異，使用Dunnett方法與IgG-對照相比，其中顯著性程度P<0.05。藉由離體Faxitron x-射線影像實施定量評定，表明經抗體V治療之小鼠在植入體周圍具有更新的骨骼或愈傷組織。定量CT分析揭露在與IgG對照相比時經抗體V治療大鼠之皮質植入體周圍骨礦物質含量(14%)、新穎骨骼面積(16%)、皮質厚度(7%)及骨髓網狀骨質植入體周圍新穎骨骼礦物質含量(18%)及骨骼面積(16%)均在統計學上顯著地增加。數據表明在植入鈦之大鼠中抗體V可刺激新穎骨骼形成並加速骨骼組織再生。
SEQ ID列表
重鏈CDRs
輕鏈CDRs
重鏈可變區
輕鏈可變區
完整重鏈
完整輕鏈
核苷酸序列-重鏈可變區
核苷酸序列-輕鏈可變區
人類DKK-1
獼猴DKK-1
大鼠DKK-1
兔子DKK-1
小鼠DKK-1
抗體V-完整輕鏈
抗體V-完整重鏈
抗體V-輕鏈可變區
抗體V-重鏈可變區
抗體V-重鏈CDRs
抗體V-輕鏈CDR
共有重鏈CDR
X 1 係F、G
X 2 係G、N
X 3 係H、N
X 4 係H、N
X 5 係I、Y
共有輕鏈CDR
X 6 係H、R
X 7 係N、G
X 8 係G、A
X 9 係I、E
X 10 係G、A
X 11 係R、S
X 12 係I、E
X 13 係Q、S
X 14 係E、A
X 15 係E、A、N
X 16 係H、N
共有重鏈可變區
X 17 係H、N
共 有輕鏈可變 區
X 18 係G、A
X 19 係I、E
X 20 係E、A
<110>　美國禮來大藥廠
<120>　DKK-1抗體
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<223>　合成構建體
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<213>　白額卷尾猴(Cebus albifrons)
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<213>黑鼠(Rattus rattus)
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<220>
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<222>　(92)..(92)
<223>　92位Xaa=Glu或Ala
<400>　52

Claims (6)

  1. 一種經改造之人類DKK-1抗體，其包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR之胺基酸序列如SEQ ID NO：14所示且該HCVR之胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
  2. 如請求項1之經改造之人類DKK-1抗體，其中該經改造之人類DKK-1抗體包含輕鏈胺基酸序列及重鏈胺基酸序列，其中該輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：20所示且該重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示。
  3. 如請求項2之經改造之人類DKK-1抗體，其包含兩個輕鏈胺基酸序列及兩個重鏈胺基酸序列，其中各輕鏈胺基酸序列係如SEQ ID NO：20之胺基酸序列所示，且各重鏈胺基酸序列係如SEQ ID NO：18之胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3任一項之經改造之人類DKK-1抗體，其用以癒合骨骼。
  5. 如請求項1至3任一項之經改造之人類DKK-1抗體，其用以治療癌症，其中該癌症係選自由多發性骨髓瘤、乳癌及非小細胞肺癌組成之群組。
  6. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至3任一項之經改造之人類DKK-1抗體及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20120475A1 (es) 2009-05-12 2012-05-05 Pfizer Anticuerpos especificos para dkk-1
HUE047874T2 (hu) 2012-12-10 2020-05-28 Biogen Ma Inc Vér dendritikus sejt antigén 2 elleni antitestek és alkalmazásuk
JP6567083B2 (ja) * 2015-05-18 2019-08-28 イーライ リリー アンド カンパニー 抗ｄｋｋ−１−抗ｒａｎｋｌ二重特異性抗体化合物
WO2017040301A1 (en) * 2015-08-28 2017-03-09 Alector Llc Anti-siglec-7 antibodies and methods of use thereof
CA3004117A1 (en) * 2015-11-03 2017-05-11 Janssen Biotech, Inc. Antibodies specifically binding pd-1 and their uses
MX2019004940A (es) * 2016-10-26 2019-09-26 Leap Therapeutics Inc Uso de beta-catenina como un biomarcador para el tratamiento de canceres que usan el anticuerpo anti-dkk-1.
US20220064298A1 (en) * 2018-07-11 2022-03-03 Momenta Pharmaceuticals, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO ENGINEERED Fc-ANTIGEN BINDING DOMAIN CONSTRUCTS TARGETED TO CTLA-4
CN112121147B (zh) * 2019-06-24 2023-07-04 中国人民解放军海军特色医学中心 多肽在治疗或预防骨髓瘤药物中的应用、多肽、核酸、药物及重组表达载体
WO2021055789A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Leap Therapeutics, Inc. Use of dkk-1 inhibitors for treating cancer
IL293090A (en) * 2019-11-22 2022-07-01 Leap Therapeutics Inc Methods for treating cancer using dkk-1 inhibitors
KR102494042B1 (ko) * 2020-11-20 2023-02-07 주식회사 하울바이오 인간모유두세포의 성장을 촉진하는 항-dkk-1 항체 및 이의 용도
CN112592402B (zh) * 2020-12-02 2022-04-26 杭州奕安济世生物药业有限公司 抗dkk2抗体、包含该抗dkk2抗体的组合物及其用途
MX2023008834A (es) * 2021-02-05 2023-09-14 Omeros Corp Biomarcador para evaluar el riesgo de desarrollar covid-19 agudo y covid-19 post-agudo.
EP4398889A1 (en) 2021-09-10 2024-07-17 Leap Therapeutics, Inc. Combination therapy
WO2024015463A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Leap Therapeutics, Inc. Combination therapy
CN116589590B (zh) * 2023-03-21 2024-03-26 浙江大学 一种特异性抗异菌脲的单克隆抗体及其重组表达质粒

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DK0975755T3 (da) 1997-04-16 2007-06-11 Millennium Pharm Inc CRSP-protein (cysteinrige udskilte proteiner), nukleinsyremolekyler der koder herfor samt anvendelser deraf
DE19747418C1 (de) 1997-10-27 1999-07-15 Deutsches Krebsforsch Inhibitor-Protein des wnt-Signalwegs
US7446181B2 (en) 1998-01-15 2008-11-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies that bind human Dickkopf-1 proteins
DK1490386T3 (da) 1998-03-10 2008-12-15 Genentech Inc Nyt polypeptid og nukleinsyrer kodende for dette
EP1572987A4 (en) 2000-02-03 2005-11-30 Nuvelo Inc NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES
EP1573024A4 (en) 2001-04-10 2007-08-29 Agensys Inc NUCLEIC ACIDS AND SUITABLE PROTEINS SUITABLE FOR THE TREATMENT AND EVIDENCE OF VARIOUS CANCER DISEASES
WO2002092015A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Genome Therapeutics Corporation Reagents and methods for modulating dkk-mediated interactions
US20040038860A1 (en) 2002-05-17 2004-02-26 Allen Kristina M. Reagents and methods for modulating dkk-mediated interactions
US7371736B2 (en) 2001-11-07 2008-05-13 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Gene expression profiling based identification of DKK1 as a potential therapeutic targets for controlling bone loss
US7308364B2 (en) 2001-11-07 2007-12-11 The University Of Arkansas For Medical Sciences Diagnosis of multiple myeloma on gene expression profiling
US7668659B2 (en) 2001-11-07 2010-02-23 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Diagnosis and classification of multiple myeloma
US7642238B2 (en) * 2002-12-05 2010-01-05 Shaughnessy John D Molecular determinants of myeloma bone disease and uses thereof
US20050084494A1 (en) 2003-05-21 2005-04-21 Darwin Prockop Inhibitors of Dkk-1
WO2005028678A2 (en) 2003-06-06 2005-03-31 Wyeth Methods and materials for identifying agents which modulate bone remodeling and agents identified thereby
CA2574881C (en) 2004-08-04 2013-01-08 Amgen Inc. Antibodies to dkk-1
AR060017A1 (es) * 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
WO2008097510A1 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Merck & Co., Inc. Antibodies specific for dkk-1
AU2010245833B2 (en) * 2009-05-07 2014-03-27 Novartis Ag Compositions and methods of use for binding molecules to Dickkopf-1 or Dickkopf-4 or both

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