KR20130029452A - 스클레로스틴에 대한 항체의 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

스클레로스틴에 대한 항체의 조성물 및 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20130029452A
KR20130029452A KR1020137005418A KR20137005418A KR20130029452A KR 20130029452 A KR20130029452 A KR 20130029452A KR 1020137005418 A KR1020137005418 A KR 1020137005418A KR 20137005418 A KR20137005418 A KR 20137005418A KR 20130029452 A KR20130029452 A KR 20130029452A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
sclerostin
antibodies
binding
seq
Prior art date
Application number
KR1020137005418A
Other languages
English (en)
Inventor
미하엘라 크네이셀
크리스틴 할레욱
소우-이 후
비아트 디펜바흐-스트레이버
요세프 프라슬러
Original Assignee
노파르티스 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40219404&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20130029452(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 노파르티스 아게 filed Critical 노파르티스 아게
Publication of KR20130029452A publication Critical patent/KR20130029452A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/662—Phosphorus acids or esters thereof having P—C bonds, e.g. foscarnet, trichlorfon
    • A61K31/663—Compounds having two or more phosphorus acid groups or esters thereof, e.g. clodronic acid, pamidronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/108—Osteoporosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

본 발명은 스클레로스틴에 대한 항체, 및 골다공증과 같은 뼈 이상과 관련된 질병을 치료하기 위한 상기 항체의 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

스클레로스틴에 대한 항체의 조성물 및 사용 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR USE FOR ANTIBODIES AGAINST SCLEROSTIN}
본 발명은 스클레로스틴에 대한 항체, 및 스클레로스틴에 의해 매개되는 병리학적 질환 또는 골다공증과 같은 뼈 이상과 관련된 질병을 치료하기 위한 상기 항체의 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.
SOST 유전자는 213개 아미노산의 분비형 당단백질인 단백질 스클레로스틴을 코딩한다. 스클레로스틴은 시스틴-노트 (cystine-knot) 함유 인자의 거대부류의 구성원이다. 스클레로스틴은 DAN/Cerberus 단백질 패밀리에 관련되고, 이는 수용체에 대한 BMP의 결합 및 따라서 BMP 신호전달 케스케이드를 억제함으로써 BMP 신호전달을 직접 저해한다 (Avsian-Kretchmer, Mol. Endocrinol 2004, 18(1):1-12).
스클레로스틴 mRNA 발현은 성인 인간에서 뼈 및 신장에서 우세하게 검출된다. 스클레로스틴 단백질은 뼈에서 우세하게 검출가능하다. 뼈 내에서, 그의 발현은 성숙 및 말기 분화된 골 형성 세포인 골세포에 제한된다.
스클레로스틴은 사람 및 마우스에서 골 형성의 강력한 음성 조절물질이다. SOST 발현의 결여는 경화협착증을 일으킨다 ([Balemans et al. Hum Mol. Genet., 2001, 10(5):537-43]; [Brunkow et al. Am J Hum Genet, 2001, 68(3):577-89]). 환자는 골 무기질 밀도 및 강도의 증가를 일으키는 일생 동안의 뼈 과도성장으로 고통받는다. 이들은 다른 내분비학적 이상을 보이지 않고, 이들이 일생 동안 겪는 모든 합병증은 뼈의 비정상 축적에 관련된다. 이러한 열성 질환의 이형접합성 보인자는 또한 증가된 골 질량을 보인다 (Gardner et al. J Clin Endocrinol Metab, 2005, 90(12):6392-5). 상기 표현형은 SOST 결핍 마우스에서 설명될 수 있고, 그의 과다발현은 골감소증을 일으킨다. 또한, 반 부켐 (Van Buchem) 병 [MIM 239100] (경화협착증의 표현형 복제)은 장기 골 인핸서 (enhancer)의 게놈 결실로 인한 SOST 조절이상에 의해 유발된다 ([Balemans et al. J Med Gene, 2002, 39(2):91-7]; [Loots et al., Genome Res, 2005, 15(7):928-35]). 마지막으로, SOST는 골 형성 동안 부갑상선 호르몬에 의해 하향조절되고 (임상적으로 검증된 골 형성 원리), 이는 PTH의 동화 작용의 일부가 SOST를 통해 매개될 수 있음을 제안한다 (Keller and Kneissel Bone, 2005, 37(2): 148-58).
스클레로스틴은 BMP (골 형태형성 단백질)에 결합하고, 시험관 내에서 BMP 길항제로서 작용할 수 있다 (Winkler et al. EMBO J., 2003, 22(23):6267-76). 스클레로스틴은 또한 LRP5/LRP6에 결합함으로써 직접적으로 ([Li et al. J Biol Chem., 2005, 20;280(20)]; [Semenov, J Biol Chem. 2006 Oct 19]; [van Bezooijen et al. J Bone Miner Res, 2006, Oct 10]) 또는 간접적으로 (Winkler et al. J Biol Chem., 2005, 28;280(4):2498-502) 고전적 (canonical) Wnt 신호전달의 음성 조절물질로서 작용한다.
스클레로스틴 발현의 결여는 많은 골 형성을 일으키지만, 골 흡수는 방해받지 않는다 (경화협착증, 반 부켐병) ([Balemans et al. 2001]; [Brunkow et al. Am J Hum Genet, 2001, 68(3):577-89], [Balemans et al. 2006]; [Loots et al., Genome Res, 2005, 15(7):928-35]).
골격 질환에 대해 현재 이용가능한 치료법의 몇몇은 성인의 골 밀도를 증가시킬 수 있고, 대부분의 현재 이용가능한 치료법은 새로운 골 형성을 자극하기보다는 주로 추가의 골 흡수를 억제함으로써 작용한다.
골 손실을 치료하기 위해 사용되는 의약의 한 예는 에스트로겐이다. 그러나, 에스트로겐이 임의의 유익한 장기 효과를 갖는지의 여부는 불분명하다. 또한, 에스트로겐은 다양한 종류의 종양, 예를 들어 유방암 및 자궁내막암의 유병률을 증가시키는 위험을 가질 수 있다. 골다공증에 대한 다른 현재의 치료 방안은 비스포스포네이트 (예를 들어, 포사맥스 (Fosamax)™, 악토넬 (Actonel)™, 본비바 (Bonviva)™, 조메타 (Zometa)™, 올파드로네이트, 네리드로네이트, 스케리드, 보네포스), 부갑상선 호르몬, 칼슘수용체 길항물질 (calcilytics), 칼슘유사 작용제 (calcimimetics) (예를 들어, 시나칼세트 (cinacalcet)), 스타틴, 동화 스테로이드, 란탄염 및 스트론튬염, 및 불화나트륨을 포함한다. 그러나, 그러한 치료제는 종종 바람직하지 않은 부작용과 연관된다.
<발명의 개요>
본 발명의 한 실시태양은 본원에서 스클레로스틴 폴리펩티드 (서열 155) 내의 표적에 대한 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질을 제공하고, 상기 항체 또는 기능성 단백질은 스클레로스틴 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, 포유동물에서 골 형성, 골 무기질 밀도, 골 무기질 함량, 골 질량, 골의 질 및 골의 강도 중 적어도 하나를 증가시킬 수 있음을 특징으로 한다.
한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 시험관내 골 무기질화 (mineralization)의 스클레로스틴 억제를 역전시키는 능력을 갖는다. 관련 실시태양에서, 항체는 wnt-1 매개된 신호전달 경로의 스클레로스틴 억제를 역전시키는 능력을 갖는다. 다른 관련 실시태양에서, 항체는 스클레로스틴 LRP6 결합을 파괴하고, BMP 유도된 Smad1 인산화에 대해 스클레로스틴이 고용량에서 갖는 억제 효과를 차단할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 155의 아미노산 112 내지 126 (양끝 포함)의 스클레로스틴의 구역 (즉, 상기 구역은 서열 155의 아미노산 112 내지 126으로 이루어진다) 및/또는 서열 155의 아미노산 160-174 (양끝 포함)의 구역 (즉, 상기 구역은 서열 155의 아미노산 160 내지 174로 이루어진다)에 결합하고, 보다 구체적으로 ARLLPNAIGRGKWWR (서열 156) 및 RLVASCKCKRLTRFH (서열 157) 모두를 포함하는 구역에 결합한다.
스클레로스틴은 HEK293 세포에서 STF (Super top flash, 고전적 wnt 신호전달에 대한 리포터 판독 (readout))의 wnt1-매개 활성화를 억제한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체는 고도로 재현가능한 방식으로 wnt 신호전달 리포터 판독을 회복시킨다.
비-골모세포에서 Wnt 신호전달 리포터 분석에서 스클레로스틴 작용에 대한 본 발명에 따른 항체의 관찰된 억제 효과는 생체 내에서 스클레로스틴 억제로 인한 골 형성 반응의 유도로 번역되는 것으로 나타났다. 실제로, 고령의 설치류에서의 생체내 실험에서는 본 발명에 따른 항체가 강한 골 동화작용을 촉진함을 보여준다. 골 질량 증가는 극히 높은 동화 용량의 부갑상선 호르몬 (이를 양성 대조군으로서 사용하였다)을 사용한 매일의 간헐적 치료의 효과 수준에 도달하였다.
따라서, 다른 바람직한 실시태양에 따라, 본 발명에 따른 항체는 스클레로스틴에 대한 친화도가 낮은 pM 범위이고, 약 10 nM의 IC50으로 wnt 신호 전달에 대한 스클레로스틴의 영향을 억제한다.
보다 바람직하게는, 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 서열 155의 아미노산 112 내지 126 (양쪽 포함) (즉, 상기 구역은 서열 155의 아미노산 112 내지 126으로 이루어진다) 및 아미노산 160 내지 174 (양쪽 포함) (즉, 상기 구역은 서열 155의 아미노산 160 내지 174로 이루어진다)를 포함하는 스클레로스틴의 구역, 보다 구체적으로는 각각 적어도 펩티드 ARLLPNAIGRGKWWR (서열 156) 및 RLVASCKCKRLTRFH (서열 157)에 중복되는 구역에 결합하고, 스클레로스틴에 대한 친화도가 낮은 pM 범위이고, 약 10 nM의 IC50으로 wnt 신호 전달에 대한 스클레로스틴의 영향을 억제한다. 상기 항체는 극히 높은 동화 용량의 부갑상선 호르몬 (양성 대조군)을 사용한 매일 피하 처리의 효과 수준에서 마우스 동물 모델의 몸통 및 팔다리 골격에서 골 질량을 증가시키는 능력을 갖고, 따라서 골다공증과 같은 뼈 이상에 관련된 질병의 치료에 유용하다.
추가의 실시태양은 본 발명의 항체를 골다공증을 치료하기 위한 다른 요법, 예를 들어 비스포스포네이트, 부갑상선 호르몬, 부갑상선 호르몬 방출 물질 (칼슘수용체 길항물질), LRP4 중화 항체 및 DKK-1 중화 항체와 조합으로 포함하는 조성물을 포함한다.
도 1: wnt-1 분석에서 MOR05813_IgG2람다의 효과.
도 2: MC3T3-1b 세포에서 BMP-2-유도된 무기질화에서 MOR05813_IgG2람다.
도 3: LRP6-SOST ELISA에서 MOR05813_IgG2람다의 효과.
도 4: Phospho-Smad1 분석에서 MOR05813_IgG2람다의 효과.
도 5: A - Hek293 세포에서 wnt-1 분석에서 SOST 억제 작용에 대한 LRP4 녹다운 (knockdown) (siRNA)의 효과 (흑색 숫자: SOST의 부재 하의 STF 활성에 대한 상대적인 값, 굵은 흑색 숫자: SOST의 존재/부재 하의 STF 활성의 비); B - Hek293 세포에서 wnt-1 분석에서 SOST IC50 및 Dkk1 IC50에 대한 LRP4 과다발현의 효과의 특이성; C - C28a2 세포에서 wnt-1 분석에서 SOST 및 Dkk1 억제 작용에 대한 LRP4 과다발현의 효과의 특이성; D - Hek293 세포에서 wnt-1 분석에서 SOST 및 Dkk1 억제 작용에 대한 LRP4 녹다운 (siRNA)의 효과의 특이성; E - LRP4에 의한 MOR05813의 활성의 조정.
도 6: 마우스 연구, 생체내 pQCT - MOR05813을 사용한 2.5주 처리는 경골 근위 골간단부 (proximal tibia metaphysis)에서 총 골 무기질 함량을 증가시킨다.
도 7: 마우스 연구, 생체내 pQCT - MOR05813을 사용한 2.5주 처리는 경골 근위 골간단부에서 총 골 무기질 밀도를 증가시킨다.
도 8: 마우스 연구, 생체내 pQCT - MOR05813을 사용한 2.5주 처리는 경골 근위 골간단부에서 피질 두께를 증가시킨다.
도 9: 마우스 연구, 생체내 uQCT - MOR05813을 사용한 2.5주 처리는 경골 근위 골간단부에서 해면골 부피를 증가시킨다.
도 10: 마우스 연구, 생체내 uQCT - MOR05813을 사용한 2.5주 처리는 경골 근위 골간단부에서 지주골 두께를 증가시킨다.
도 11: 마우스 연구, 생체내 pQCT - MOR05813을 사용한 5주 처리는 경골 근위 골간단부에서 총 골 무기질 밀도를 증가시킨다.
도 12: 마우스 연구, 생체외 DEXA - MOR05813을 사용한 5주 처리는 경골에서 골 무기질 밀도를 더욱 증가시킨다.
도 13: 마우스 연구, 생체외 DEXA - MOR05813을 사용한 5주 처리는 대퇴골에서 골 무기질 밀도를 더욱 증가시킨다.
도 14: 마우스 연구, 생체외 DEXA - MOR05813을 사용한 5주 처리는 척추에서 골 무기질 밀도를 더욱 증가시킨다.
도 15: 마우스 연구, 생체외 조직형태계측 - MOR05813을 사용한 2.5주 처리는 팔다리 골격 (대퇴골 원위 골간단부 (distal femur metaphysis))에서 골 형성 속도를 증가시킨다.
도 16: 마우스 연구, 생체외 조직형태계측 - MOR05813을 사용한 2.5주 처리는 팔다리 골격 (대퇴골 원위 골간단부)에서 무기질 침착률 (apposition rate)을 증가시킨다.
도 17: 마우스 연구, 생체외 조직형태계측 - MOR05813을 사용한 2.5주 처리는 팔다리 골격 (대퇴골 원위 골간단부)에서 무기질화 표면을 증가시킨다.
도 18: 마우스 연구, 생체외 조직형태계측 - MOR05813을 사용한 2.5주 처리는 몸통 골격 (요추)에서 골 형성 속도를 증가시킨다.
도 19: 마우스 연구, 생체외 조직형태계측 - MOR05813을 사용한 2.5주 처리는 파골세포 표면에 의해 측정시 팔다리 골격 (대퇴골 원위 골간단부)에서 골 흡수에 영향을 미치지 않는다.
도 20: LRP6의 SOST 결합에 대한 MOR05813_IgG2람다의 효과를 보여주는 ELISA. 각각의 경우에 0.9 nM SOST를 사용하였다.
도 21: 마우스 연구, MOR05813 및 졸레드론산을 사용한 동시-처리 후 생체내 pQCT, (A) 총 골 무기질 밀도, (B) 총 골 무기질 함량, (C) 피질 두께, 및 (D) 해면골 무기질 밀도.
도 22: 마우스 연구, 생체내 pQCT: 알렌드로네이트 (alen) 전-처리에 이은 MOR05813을 사용한 처리, (A) 총 골 무기질 밀도, (B) 총 골 무기질 함량, (C) 피질 두께, 및 (D) 해면골 무기질 밀도.
도 23: 마우스 연구, MOR05813 및 (i) 항-DKK1, 또는 (ii) PTH를 사용한 동화작용성 동시-처리 후 생체내 pQCT, (A) 총 골 무기질 밀도, (B) 총 골 무기질 함량, (C) 피질 두께, 및 (D) 해면골 무기질 밀도.
본 발명은 스클레로스틴에 특이적으로 결합하고, 스클레로스틴의 기능적 특성을 억제하는 단리된 항체, 특히 인간 항체에 관한 것이다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 특정 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유래하고/하거나 특정 아미노산 서열을 포함하는 CDR 구역과 같은 특정 구조적 특색을 포함한다. 본 발명은 단리된 항체, 그러한 항체의 제조 방법, 그러한 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트 및 다가 또는 다중특이적 분자, 및 본 발명의 항체, 면역컨쥬게이트 또는 이중특이적 분자를 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 예를 들어 스클레로스틴에 의해 매개되거나 증가된 수준의 스클레로스틴과 연관되는 병리학적 질환; 예를 들어, 골다공증과 같은 뼈와 관련된 질병의 치료에서, 스클레로스틴 발현의 존재와 연관된 질환 또는 병태를 억제하기 위해 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있기 위해, 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명 전체에서 제시된다.
용어 "포함하는"은 "포함하는" 뿐만 아니라 "이루어지는"을 포함하고, 예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 전적으로 X로 이루어질 수 있거나, 추가의 어떤 것, 예를 들어 X + Y를 포함할 수 있다.
수치 값 x에 관련한 용어 "약"은 예를 들어 x±10％를 의미한다.
단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않고, 예를 들어 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우에, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.
용어 "면역 반응"은 침습 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적인 손상, 그의 파괴, 또는 인간 신체로부터 소실을 일으키는, 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 탐식 세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에서 생산된 가용성 거대분자 (항체, 시토킨 및 보체 포함)의 작용을 나타낸다.
용어 스클레로스틴은 서열 155로 규정되는 인간 스클레로스틴을 나타낸다. 재조합 인간 스클레로스틴은 R&D 시스템즈 (R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스; 2006 cat# 1406-ST-025)로부터 입수할 수 있다. 추가로, 재조합 마우스 스클레로스틴/SOST는 R&D 시스템즈 (미국 미네소타주 미네아폴리스, 2006 cat# 1589-ST-025)로부터 상업적으로 이용가능하다. 미국 특허 6,395,511 및 6,803,453과 미국 특허 출원 공개 20040009535 및 20050106683에서는 항-스클레로스틴 항체를 일반적으로 언급한다.
용어 "항체"는 본원에서 칭할 때 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원 결합 부분") 또는 단일쇄를 포함한다. 자연 발생하는 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 구역 (본원에서 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 구역으로 구성된다. 중쇄 불변 구역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 구역 (본원에서 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 구역으로 구성된다. 경쇄 불변 구역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 구역은 프레임워크 구역 (FR)으로 불리는 보다 보존되는 구역이 산재하는 상보성 결정 구역 (CDR)으로 불리는 초가변성의 구역으로 더욱 나누어질 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단부터 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 구역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 구역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포) 및 전통적인 보체계의 제1 성분 (C1q)을 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 간단히 "항원 부분")은 본원에서 사용될 때 항원 (예를 들어, 스클레로스틴)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 전장 항체 또는 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab 단편 (VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편); F(ab)2 단편 (힌지 구역에서 디술피드 다리로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편); VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 구역 (CDR)을 포함한다.
또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 단일 단백질 사슬로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 연결될 수 있고, 여기서 VL 및 VH 구역은 쌍을 이루어 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 ([Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; 및 [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883]) 참조)를 형성한다. 그러한 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 구역" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 효용에 대해 스크리닝된다.
"단리된 항체"는 본원에서 사용할 때 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 나타낸다 (예를 들어, 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 스클레로스틴 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예를 들어 다른 종으로부터의 스클레로스틴 분자에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 본원에서 사용될 때 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 나타낸다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 보인다.
용어 "인간 항체"는 본원에서 사용될 때 프레임워크 및 CDR 구역 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래되는 가변 구역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 구역을 함유하는 경우에, 불변 구역도 또한 그러한 인간 서열, 예를 들어 인간 생식계열 서열, 또는 인간 생식계열 서열의 돌연변이된 버전, 또는 문헌 [Knappik, et al. (2000. J Mol Biol 296, 57-86)]에 기재된 바와 같이 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다.
본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 용어 "인간 항체"는 본원에서 사용할 때 다른 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅 (grafting)된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 및 CDR 구역이 모두 인간 서열로부터 유래되는 가변 구역을 갖는 단일 결합 특이성을 보이는 항체를 나타낸다. 한 실시태양에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 도입유전자 (transgene) 및 경쇄 도입유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 (transgenic) 비인간 포유동물, 예를 들어, 트랜스제닉 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마 (hybridoma)에 의해 생산된다.
용어 "재조합 인간 항체"는 본원에서 사용될 때 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모좀 (transchromosomal)인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 이입세포 (transfectoma)로부터 단리된 항체, 재조합의 조합적 인간 항체 라이브러리 (library)로부터 단리된 항체, 및 인간 면역글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱 (splicing)하는 것을 포함한 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 그러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 구역이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 구역을 갖는다. 그러나, 특정 실시태양에서, 그러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이 유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용될 때, 생체내 체세포 돌연변이 유발)될 수 있어서, 재조합 항체의 VH 및 VL 구역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되어 그에 관련되지만 생체 내에서 인간 항체 생식계열 레파토리 내에서 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에서 사용될 때 "이소형 (isotype)"은 중쇄 불변 구역 유전자에 의해 제공되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예를 들어 IgG1 또는 IgG2)를 나타낸다.
어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용할 때 "스클레로스틴 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는" 항체는 1 x 10-8 M 이하, 1 x 10-9 M 이하, 또는 1 x 10-10 M 이하의 KD로 스클레로스틴 폴리펩티드에 결합하는 항체를 나타내도록 의도된다. "스클레로스틴 이외의 항원과 교차-반응하는" 항체는 0.5 x 10-8 M 이하, 5 x 10-9 M 이하, 또는 2 x 10-9 M 이하의 KD로 그 항원에 결합하는 항체를 나타내도록 의도된다. "특정 항원과 교차-반응하지 않는" 항체는 1.5 x 10-8 M 이상의 KD, 또는 5 x 10-8 M 내지 10 x 10-8 M, 또는 1 x 10-7 M 이상의 KD로 그 항원에 결합하는 항체를 나타내도록 의도된다. 특정 실시태양에서, 항원과 교차-반응하지 않는 항체는 표준 결합 분석에서 이들 단백질에 대해 본질적으로 검출가능한 결합을 나타내지 않는다.
본원에서 사용할 때, "세포 기반 wnt 신호전달 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하는" 항체는 세포 기반 STF 분석에서 스클레로스틴의 존재 하에 1 mM 미만, 100 nM, 20 nM, 10 nM 이하의 IC50으로 wnt 유도된 신호전달을 회복시키는 항체를 나타내도록 의도된다. 그러한 STF 분석은 하기 실시예에서 보다 상세하게 설명된다.
본원에서 사용할 때, "세포 기반 무기질화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하는" 항체는 세포 기반 분석에서 스클레로스틴의 존재 하에 1 mM 미만, 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM 이하의 IC50으로 BMP2 유도된 무기질화를 회복시키는 항체를 나타내도록 의도된다. 그러한 분석은 하기 실시예에서 보다 상세하게 설명된다.
본원에서 사용할 때, "Smad1 인산화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하는" 항체는 세포 기반 분석에서 스클레로스틴의 존재 하에 1 mM 미만, 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM 이하의 IC50으로 BMP6 유도된 Smad1 인산화를 회복시키는 항체를 나타내도록 의도된다. 그러한 분석은 하기 실시예에서 보다 상세하게 설명된다.
본원에서 사용할 때, "LRP-6에 대한 스클레로스틴의 결합을 억제하는" 항체는 1 mM, 500 nM, 100 nM, 10 nM, 5 nM, 3 nM, 1 nM 이하의 IC50으로 LRP-6에 대한 스클레로스틴의 결합을 억제하는 항체를 나타낸다. 그러한 분석은 하기 실시예에서 보다 상세하게 설명된다.
본원에서 사용할 때, "골 형성 및 질량 및 밀도를 증가시키는" 항체는 실시예 10에 나타낸 바와 같이 높은 동화 용량의 PTH를 사용한 매일의 간헐적 치료의 수준에서 골 형성, 질량 및 밀도에 도달할 수 있는 항체를 나타낸다.
용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 본원에서 사용할 때 특정 항체-항원 상호작용의 회합율을 나타내도록 의도되는 반면, 용어 "Kdis" 또는 "KD"는 본원에서 사용할 때 특정 항체-항원 상호작용의 해리율을 나타내도록 의도된다. 용어 "KD"는 본원에서 사용할 때 해리 상수를 나타내도록 의도되고, 이는 Kd 대 Ka의 비 (즉 Kd/Ka)로부터 얻고 몰 농도 (M)로 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 잘 확립된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 이용함으로써, 또는 바이오센서 시스템, 예를 들어 Biacore® 시스템을 이용함으로써이다.
본원에서 사용할 때, 용어 "친화도"는 단일 항원성 부위에서 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 나타낸다. 각각의 항원성 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 구역은 약한 비-공유 힘을 통해 수많은 부위에서 항원과 상호작용하고; 상호작용이 더 많을수록, 친화도가 더 강하다.
본원에서 사용할 때, 용어 "결합력 (avidity)"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도의 정보 척도를 나타낸다. 이는 3개의 주요 인자에 의해 제어된다: 항체 에피토프 친화도; 항원 및 항체 모두의 결합가 (valence); 및 상호작용 부분의 구조적 배열. 궁극적으로, 이들 인자는 항체의 특이성, 즉, 특정 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합하는 가능성을 규정한다.
보다 고결합력의 프로브를 얻기 위해서, 이량체 컨쥬게이트를 구성할 수 있어서, 저친화도 상호작용 (예를 들어, 생식계열 항체와의)이 FACS에 의해 보다 쉽게 검출되도록 할 수 있다. 또한, 항원 결합의 결합력을 증가시키는 다른 수단은 항-스클레로스틴 항체의 본원에서 설명되는 임의의 구성체의 이량체, 삼량체 또는 다량체를 생성하는 것을 포함한다. 그러한 다량체는 예를 들어, 천연 C→N-말단 결합을 모방함으로써 또는 그들의 불변 구역을 통해 함께 유지되는 항체 이량체를 모방함으로써 개별 모듈 (module)들 사이의 공유 결합을 통해 생성할 수 있다. Fc/Fc 계면 내로 공학처리된 결합은 공유 또는 비-공유일 수 있다. 또한, Fc 이외의 이량체화 또는 다량체화 파트너 (partner)가 그러한 보다 고차 구조를 생성하기 위해 스클레로스틴 하이브리드 (hybrid)에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 다량체화 도메인, 예를 들어 WO2004039841 (Borean)에 기재된 삼량체화 도메인 또는 국제 특허 출원 공개 WO98/18943에 기재된 오량체화 도메인을 사용하는 것이 가능하다.
본원에서 사용할 때, 용어 "교차-반응성"은 다른 항원 상의 에피토프에 결합하는 항체 또는 항체의 집단을 나타낸다. 이는 항체의 낮은 결합력 또는 특이성에 의해 또는 동일한 또는 매우 유사한 에피토프를 갖는 다수의 구분되는 항원에 의해 유발될 수 있다. 교차-반응성은 관련 군의 항원들에 대한 전반적인 결합을 원할 때, 또는 항원 에피토프 서열이 진화에서 고도로 보존되지 않은 경우에 교차-종 표지를 시도할 때 때때로 바람직하다.
본원에서 사용할 때, IgG 항체에 대한 용어 "고친화도"는 표적 항원에 대한 KD가 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 또는 10-10 M 이하인 항체를 나타낸다. 그러나, "고친화도" 결합은 다른 항체 이소형에 대해 변할 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 KD가 10-7 M 이하, 또는 10-8 M 이하인 항체를 나타낸다.
본원에서 사용할 때, 용어 "대상"은 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본원에서 사용할 때, 용어 "최적화된"은 뉴클레오티드 서열이 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어, 피치아 (Pichia) 또는 트리코더마 (Trichoderma)의 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경된 것을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 코딩되는 아미노산 서열 ("모" 서열로서도 알려짐)을 완전히 또는 가능한 많이 보유하도록 공학처리된다. 최적화된 서열은 본원에서 포유동물 세포에 바람직한 코돈을 갖도록 공학처리되었지만, 다른 진핵 세포에서 이들 서열의 최적화된 발현이 또한 본원에서 고안된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 또한 최적화된 것으로 언급된다.
본 발명의 다양한 측면은 다음 하위섹션에서 추가로 상세히 설명한다.
다양한 종의 스클레로스틴을 향한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 분석, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 (western blot) 및 RIA은 당업계에 공지되어 있다. 적합한 분석은 실시예에서 상세히 설명한다. 항체의 결합 운동학 (예를 들어, 결합 친화도)는 또한 당업계에 공지된 표준 분석에 의해, 예를 들어 Biacore 분석에 의해 평가할 수 있다. 스클레로스틴의 기능적 특성에 대한 항체의 효과 (예를 들어, 수용체 결합, 골용해의 방지 또는 개선)를 평가하기 위한 분석을 실시예에서 보다 상세히 설명한다.
따라서, 당업계에 공지되고 본원에서 설명되는 방법에 따라 결정될 때 하나 이상의 이들 스클레로스틴의 기능적 특성 (예를 들어, 생화학, 면역화학, 세포성, 생리학적 또는 다른 생물학적 활성 등)을 "억제하는" 항체는 항체의 부재 하에 (또는 비관련 특이성의 대조 항체가 존재할 때) 보이는 것에 비해 특정 활성의 통계적으로 유의한 감소에 관련되는 것으로 이해될 것이다. 스클레로스틴 활성을 억제하는 항체는 측정된 파라미터의 10％ 이상, 적어도 50％, 80％ 또는 90％ 이상으로 그러한 통계적으로 유의한 감소를 일으키고, 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 스클레로스틴 기능성 활성을 95％, 98％ 또는 99％ 초과로 억제할 수 있다.
용어 "교차-차단하다", "교차-차단된" 및 "교차-차단하는"은 표준 경쟁 결합 분석에서 스클레로스틴에 대한 다른 항체 또는 결합 물질의 결합을 저해하는 항체 또는 다른 결합 물질의 능력을 의미하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
항체 또는 다른 결합 물질이 스클레로스틴에 대한 다른 항체 또는 결합 분자의 결합을 저해할 수 있는 능력 또는 정도, 및 따라서 본 발명에 따라 교차-차단하는 것으로 말해질 수 있는지 여부는 표준 경쟁 결합 분석을 이용하여 결정할 수 있다. 하나의 적합한 분석은 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 Biacore 기술 (예를 들어 BIAcore 3000 기기 (비아코어 (Biacore, 스웨덴 웁살라)를 사용함으로써)의 사용을 포함한다. 교차-차단을 측정하기 위한 다른 분석에서는 ELISA-기반 방안을 사용한다.
두 방법에 대한 추가의 상세한 내용은 실시예에 제공한다.
본 발명에 따라, 본 발명에 따른 교차-차단 항체 또는 다른 결합 물질은 항체 또는 결합 물질의 조합물 (혼합물)의 기록된 결합이 조합한 2개의 항체 또는 결합 물질의 최대 이론적 결합 (상기 규정된)의 80％ 내지 0.1％ (예를 들어 80％ 내지 4％), 구체적으로 최대 이론적 결합의 75％ 내지 0.1％ (예를 들어 75％ 내지 4％), 보다 구체적으로 70％ 내지 0.1％ (예를 들어 70％ 내지 4％), 보다 구체적으로 최대 이론적 결합의 65％ 내지 0.1％ (예를 들어 65％ 내지 4％)가 되는 정도로 설명된 BIAcore 교차-차단 분석에서 스클레로스틴에 결합한다.
항체는 용액상 항-스클레로스틴 항체가 용액상 항-스클레로스틴 항체의 부재 (즉, 양성 대조 웰) 하에 얻은 스클레로스틴 검출 신호 (즉, 코팅된 항체에 의해 결합된 스클레로스틴의 양)에 비해 스클레로스틴 검출 신호의 60％ 내지 100％, 구체적으로 70％ 내지 100％, 보다 구체적으로 80％ 내지 100％의 감소를 일으킬 수 있으면, 실시예에 설명되는 바와 같은 ELISA 분석에서 교차-차단성으로 규정된다.
모노클로날 항체
본 발명의 항체는 실시예에서 설명되는 바와 같이 단리된 인간 모노클로날 항체를 포함한다. 본 발명의 단리된 항체의 VH 아미노산 서열을 서열 69-77에 제시한다. 본 발명의 단리된 항체의 VL 아미노산 서열을 각각 서열 80-88에 제시한다. 본 발명의 항체의 대응하는 바람직한 전장 중쇄 아미노산 서열을 서열 113-121에 제시한다. 본 발명의 항체의 대응하는 바람직한 전장 경쇄 아미노산 서열을 각각 서열 124-132에 제시한다. 본 발명의 다른 항체는 CDR 구역에서 돌연변이되지만, 상기 설명된 서열에 제시된 CDR 구역과 적어도 60, 70, 80, 90 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 상기 설명된 서열에 제시된 CDR 구역에 비교할 때 CDR 구역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 가변 중쇄 모 뉴클레오티드 서열을 서열 89-90에 제시한다. 가변 중쇄 모 뉴클레오티드 서열을 서열 100-101에 제시한다. 포유동물 세포 내에서 발현을 위해 최적화된 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열을 서열 146-154에 제시한다. 포유동물 세포 내에서 발현을 위해 최적화된 전장 중쇄 뉴클레오티드 서열을 서열 135-143에 제시한다. 최적화된 경쇄 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 전장 경쇄 아미노산 서열을 서열 124-132에 제시한다. 최적화된 중쇄 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 전장 중쇄 아미노산 서열을 서열 113-121에 제시한다. 본 발명의 다른 항체는 돌연변이되지만, 상기 설명된 서열과 적어도 60, 70, 80, 90 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 또는 핵산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 실질적으로 동일한 치료 활성을 보유하면서, 상기 설명된 서열에 제시된 가변 구역에 비교할 때 가변 구역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
각각의 이들 항체는 스클레로스틴에 결합할 수 있으므로, VH, VL, 전장 경쇄, 및 전장 중쇄 서열 (뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열)은 "혼합 조화 (mixed and matched)"되어 본 발명의 다른 항-스클레로스틴 결합 분자를 생성할 수 있다. 그러한 "혼합 조화된" 항체의 스클레로스틴 결합은 상기 및 실시예에서 설명된 결합 분석 (예를 들어, ELISA)을 이용하여 시험할 수 있다. 이들 사슬이 혼합 조화될 때, 특정 VH/VL 쌍으로부터 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 교체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 교체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 VH/VL 쌍으로부터 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 교체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 교체되어야 한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 서열 69-77로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역; 및 서열 80-88로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역을 갖는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 구역을 제공하고; 여기서 항체는 스클레로스틴에 특이적으로 결합한다.
다른 측면에서, 본 발명은
(i) 서열 113-121로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 포유동물의 세포 내에서 발현을 위해 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄; 및 서열 124-132로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 포유동물의 세포 내에서 발현을 위해 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄를 갖는 단리된 모노클로날 항체; 또는
(ii) 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은
(i) 서열 135-143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 포유동물의 세포 내에서 발현을 위해 최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전장 중쇄; 및 서열 146-154로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 포유동물의 세포 내에서 발현을 위해 최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전장 경쇄를 갖는 단리된 모노클로날 항체; 또는
(ii) 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 그의 조합을 포함하는 항체를 제공한다. 항체의 VH CDR1의 아미노산 서열을 서열 1-11에 제시한다. 항체의 VH CDR2의 아미노산 서열을 서열 12-22에 제시한다. 항체의 VH CDR3의 아미노산 서열을 서열 23-33에 제시한다. 항체의 VL CDR1의 아미노산 서열을 서열 34-44에 제시한다. 항체의 VL CDR2의 아미노산 서열을 서열 45-55에 제시한다. 항체의 VL CDR3의 아미노산 서열을 서열 56-66에 제시한다. CDR 구역은 카바트 시스템을 이용하여 서술된다 (Kabat, E.A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).
각각의 이들 항체가 스클레로스틴에 결합할 수 있고, 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 구역에 의해 제시되면, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 조화될" 수 있지만 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR들이 혼합 조화될 수 있다), 본 발명의 다른 항-스클레로스틴 결합 분자를 생성하기 위해 각각의 항체는 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유해야 한다. 그러한 "혼합 조화된" 항체의 스클레로스틴 결합은 상기 및 실시예에서 설명된 결합 분석 (예를 들어, ELISA)을 이용하여 시험할 수 있다. VH CDR 서열들이 혼합 조화될 때, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 교체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 조화될 때, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 교체되어야 한다. 신규한 VH 및 VL 서열은 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 구역 서열을 본 발명의 모노클로날 항체에 대해 본원에 제시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 생성될 수 있음은 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다.
단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 구역은 서열 1-11로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역 CDR1; 서열 12-22로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역 CDR2; 서열 23-33으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역 CDR3; 서열 34-44로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역 CDR1; 서열 45-55로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역 CDR2; 및 서열 56-66으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역 CDR3을 갖고; 여기서 항체는 스클레로스틴에 특이적으로 결합한다.
특정 실시태양에서, 항체는 서열 3의 중쇄 가변 구역 CDR1; 서열 14의 중쇄 가변 구역 CDR2; 서열 25의 중쇄 가변 구역 CDR3; 서열 36의 경쇄 가변 구역 CDR1; 서열 47의 경쇄 가변 구역 CDR2; 및 서열 58의 경쇄 가변 구역 CDR3을 포함한다.
특정 실시태양에서, 항체는 서열 4의 중쇄 가변 구역 CDR1; 서열 15의 중쇄 가변 구역 CDR2; 서열 26의 중쇄 가변 구역 CDR3; 서열 37의 경쇄 가변 구역 CDR1; 서열 48의 경쇄 가변 구역 CDR2; 및 서열 59의 경쇄 가변 구역 CDR3을 포함한다.
특정 실시태양에서, 항체는 서열 5의 중쇄 가변 구역 CDR1; 서열 16의 중쇄 가변 구역 CDR2; 서열 27의 중쇄 가변 구역 CDR3; 서열 38의 경쇄 가변 구역 CDR1; 서열 49의 경쇄 가변 구역 CDR2; 및 서열 60의 경쇄 가변 구역 CDR3을 포함한다.
특정 실시태양에서, 항체는 서열 6의 중쇄 가변 구역 CDR1; 서열 17의 중쇄 가변 구역 CDR2; 서열 28의 중쇄 가변 구역 CDR3; 서열 39의 경쇄 가변 구역 CDR1; 서열 50의 경쇄 가변 구역 CDR2; 및 서열 61의 경쇄 가변 구역 CDR3을 포함한다.
특정 실시태양에서, 항체는 서열 7의 중쇄 가변 구역 CDR1; 서열 18의 중쇄 가변 구역 CDR2; 서열 29의 중쇄 가변 구역 CDR3; 서열 40의 경쇄 가변 구역 CDR1; 서열 51의 경쇄 가변 구역 CDR2; 및 서열 62의 경쇄 가변 구역 CDR3을 포함한다.
특정 실시태양에서, 항체는 서열 8의 중쇄 가변 구역 CDR1; 서열 19의 중쇄 가변 구역 CDR2; 서열 30의 중쇄 가변 구역 CDR3; 서열 41의 경쇄 가변 구역 CDR1; 서열 52의 경쇄 가변 구역 CDR2; 및 서열 63의 경쇄 가변 구역 CDR3을 포함한다.
특정 실시태양에서, 항체는 서열 9의 중쇄 가변 구역 CDR1; 서열 20의 중쇄 가변 구역 CDR2; 서열 31의 중쇄 가변 구역 CDR3; 서열 42의 경쇄 가변 구역 CDR1; 서열 53의 경쇄 가변 구역 CDR2; 및 서열 64의 경쇄 가변 구역 CDR3을 포함한다.
특정 실시태양에서, 항체는 서열 10의 중쇄 가변 구역 CDR1; 서열 21의 중쇄 가변 구역 CDR2; 서열 32의 중쇄 가변 구역 CDR3; 서열 43의 경쇄 가변 구역 CDR1; 서열 54의 경쇄 가변 구역 CDR2; 및 서열 65의 경쇄 가변 구역 CDR3을 포함한다.
특정 실시태양에서, 항체는 서열 11의 중쇄 가변 구역 CDR1; 서열 22의 중쇄 가변 구역 CDR2; 서열 33의 중쇄 가변 구역 CDR3; 서열 44의 경쇄 가변 구역 CDR1; 서열 55의 경쇄 가변 구역 CDR2; 및 서열 66의 경쇄 가변 구역 CDR3을 포함한다.
본원에서 사용할 때, 인간 항체는 항체의 가변 구역 또는 전장 사슬이 인간 생식계열 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어지면, 특정 생식계열 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유도된" 중쇄 또는 경쇄 가변 구역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 그러한 시스템은 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심있는 항원으로 면역화시키거나 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심있는 항원을 사용하여 스크리닝하는 것을 포함한다. 따라서, 인간 생식계열 면역글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유도된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열에 비교하고 서열이 인간 항체의 서열에 가장 가까운 (즉, 최대 동일성 ％) 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선택함으로써 확인할 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유도된" 인간 항체는 생식계열 서열에 비해, 예를 들어 자연 발생하는 체세포 돌연변이, 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인한 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 대개 아미노산 서열이 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 90％ 이상 동일하고, 다른 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 뮤린 생식계열 서열)에 비교하여 인간의 것으로서 인간 항체를 확인하는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간 항체는 아미노산 서열이 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대해 60％, 70％, 80％, 90％ 이상, 또는 95％ 이상, 또는 심지어 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래되는 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열로부터 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열로부터 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 일부 실시태양에서, 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열은 각각 서열 67-68로 이루어지는 가변 중쇄 서열, 및 각각 서열 78-79로 이루어지는 가변 경쇄 서열을 포함하는 것으로부터 선택된다.
상동성 항체
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 본원에서 설명되는 항체의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 상동성인 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열; 전장 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열, 가변 구역 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열, 또는 가변 구역 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 갖고, 여기서 항체는 본 발명의 항-스클레로스틴 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 구역 및 경쇄 가변 구역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 (또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질)를 제공하고, 여기서 중쇄 가변 구역은 서열 67-77로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열에 대해 80％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 구역은 서열 78-88로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열에 대해 80％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 항체는 스클레로스틴에 특이적으로 결합하고, 항체는 적어도 하나의 다음과 같은 기능적 특성을 보인다: 항체는 세포 기반 wnt 신호전달 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, 항체는 세포 기반 무기질화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, Smad1 인산화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, 항체는 LRP-6에 대한 스클레로스틴의 결합을 억제하거나, 항체는 골 형성 및 질량 및 밀도를 증가시킨다.
다른 예에서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 포함하는 단리된 모노클로날 항체 (또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질)를 제공하고, 여기서 전장 중쇄는 서열 111-121로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열에 대해 80％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 전장 경쇄는 서열 122-132로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열에 대해 80％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 항체는 스클레로스틴에 특이적으로 결합하고, 적어도 하나의 다음과 같은 기능적 특성을 보인다: 항체는 세포 기반 wnt 신호전달 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, 항체는 세포 기반 무기질화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, Smad1 인산화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, 항체는 LRP-6에 대한 스클레로스틴의 결합을 억제하거나, 항체는 골 형성 및 질량 및 밀도를 증가시킨다.
다른 예에서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 포함하는 단리된 모노클로날 항체 (또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질)를 제공하고, 여기서 전장 중쇄는 서열 133-143으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 80％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고; 전장 경쇄는 서열 144-154로 이루어지는 군 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 80％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 항체는 스클레로스틴에 특이적으로 결합하고, 적어도 하나의 다음과 같은 기능적 특성을 보인다: 항체는 세포 기반 wnt 신호전달 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, 항체는 세포 기반 무기질화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, Smad1 인산화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, 항체는 LRP-6에 대한 스클레로스틴의 결합을 억제하거나, 항체는 골 형성 및 질량 및 밀도를 증가시킨다.
다양한 실시태양에서, 항체는 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개의 상기 논의된 기능적 특성을 나타낼 수 있다. 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 (chimera) 항체일 수 있다.
다른 실시태양에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 상기 제시된 서열에 대해 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다. 다른 실시태양에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 위치(들)에서의 아미노산 치환을 제외하고는 동일할 수 있다. 각각 서열 67-77 및 서열 78-88의 VH 및 VL 구역에 대해 높은 (즉, 80％ 이상) 동일성을 갖는 VH 및 VL 구역을 갖는 항체는 각각 서열 89-99 및 100-110을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이 유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이 유발)에 이어, 코딩된 변경된 항체를 본원에서 설명되는 기능성 분석을 이용하여 보유된 기능 (즉, 상기 제시된 기능)에 대해 시험함으로써 얻을 수 있다.
다른 실시태양에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 아미노산 서열은 상기 제시된 서열에 대해 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다. 각각 임의의 서열 111-121의 전장 중쇄 및 임의의 서열 122-132의 전장 경쇄에 대해 높은 (즉, 80％ 이상) 동일성을 갖는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 갖는 항체는 각각 서열 133-143 및 서열 144-154를 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이 유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이 유발)에 이어, 코딩된 변경된 항체를 본원에서 설명되는 기능성 분석을 이용하여 보유된 기능 (즉, 상기 제시된 기능)에 대해 시험함으로써 얻을 수 있다.
다른 실시태양에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 상기 제시된 서열에 대해 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다.
다른 실시태양에서, 중쇄 및/또는 경쇄 뉴클레오티드 서열의 가변 구역은 상기 제시된 서열에 대해 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다.
본원에서 사용될 때, 2개의 서열들 사이의 동일성 비율은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭 (gap)의 수와 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, ％ 동일성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100). 2개의 서열들 사이의 서열의 비교 및 동일성 비율의 결정은 아래의 비-제한적인 예에서 설명하는 바와 같은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성할 수 있다.
2개의 아미노산 서열들 사이의 동일성 비율은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 통합된 문헌 [E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988]의 알고리즘을 이용하여, PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열들 사이의 동일성 비율은 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 내의 GAP 프로그램 내로 통합된 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970]의 알고리즘을 이용하여, Blossom 62 행렬 또는 PAM250 행렬 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여 결정할 수 있다.
추가로 또는 별법으로, 본 발명의 단백질 서열은 예를 들어, 관련 서열을 확인하기 위해 공공 데이타베이스에 대한 검색을 수행하기 위해 "질의 (query) 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 그러한 검색은 문헌 [Altschul, et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10]의 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 항체 분자에 대해 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 (wordlength) = 3을 이용하여 수행할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 도입 (gapped) 정렬을 얻기 위해, 문헌 [Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 설명된 바와 같이 Gapped BLAST를 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 (default) 파라미터를 사용할 수 있다 (http:www.ncbi.nhn.nih.gov 참조).
보존적 변형을 갖는 항체
특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역을 갖고, 여기서 하나 이상의 이들 CDR 서열은 본원에서 설명되는 항체 또는 그의 보존적 변형에 기반한 특정화된 아미노산 서열을 갖고, 항체는 본 발명의 항-스클레로스틴 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 구역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 구역으로 이루어지는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 구역 CDR1 아미노산 서열은 서열 1-11 및 그의 보존적 변형으로 이루어지는 군 중에서 선택되고; 중쇄 가변 구역 CDR2 아미노산 서열은 서열 12-22 및 그의 보존적 변형으로 이루어지는 군 중에서 선택되고; 중쇄 가변 구역 CDR3 아미노산 서열은 서열 23-33 및 그의 보존적 변형으로 이루어지는 군 중에서 선택되고; 경쇄 가변 구역 CDR1 아미노산 서열은 서열 34-44 및 그의 보존적 변형으로 이루어지는 군 중에서 선택되고; 경쇄 가변 구역 CDR2 아미노산 서열은 서열 45-55 및 그의 보존적 변형으로 이루어지는 군 중에서 선택되고; 경쇄 가변 구역 CDR3 아미노산 서열은 서열 56-66 및 그의 보존적 변형으로 이루어지는 군 중에서 선택되고; 항체는 스클레로스틴에 특이적으로 결합하고, 항체는 적어도 하나의 다음과 같은 기능적 특성을 보인다: 항체는 세포 기반 wnt 신호전달 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, 항체는 세포 기반 무기질화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, Smad1 인산화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, 항체는 LRP-6에 대한 스클레로스틴의 결합을 억제하거나, 항체는 골 형성 및 질량 및 밀도를 증가시킨다.
다양한 실시태양에서, 항체는 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상의 상기 논의된 나열된 기능적 특성을 나타낼 수 있다. 그러한 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
다른 실시태양에서, 포유동물 세포에서 발현을 위해 최적화된 본 발명의 항체는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 갖고, 여기서 하나 이상의 이들 서열은 본원에서 설명되는 항체 또는 그의 보존적 변형에 기반한 특정화된 아미노산 서열을 갖고, 항체는 본 발명의 항-스클레로스틴 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄로 이루어지는, 포유동물 세포에서 발현을 위해 최적화된 단리된 모노클로날 항체를 제공하고, 여기서 전장 중쇄는 서열 111-121 및 그의 보존적 변형의 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고; 전장 경쇄는 서열 122-132 및 그의 보존적 변형의 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖고; 항체는 스클레로스틴에 특이적으로 결합하고; 항체는 적어도 하나의 다음과 같은 기능적 특성을 보인다: 항체는 세포 기반 wnt 신호전달 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, 항체는 세포 기반 무기질화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, Smad1 인산화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, 항체는 LRP-6에 대한 스클레로스틴의 결합을 억제하거나, 항체는 골 형성 및 질량 및 밀도를 증가시킨다.
다양한 실시태양에서, 항체는 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상의 상기 논의된 나열된 기능적 특성을 나타낼 수 있다. 그러한 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
본원에서 사용할 때, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 나타내도록 의도된다. 그러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위-지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발에 의해 본 발명의 항체 내로 도입될 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 교체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 규정되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 구역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 교체될 수 있고, 변경된 항체는 본원에서 설명되는 기능성 분석을 이용하여 보유된 기능에 대해 시험할 수 있다.
본 발명의 항- 스클레로스틴 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
다른 실시태양에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 본 발명의 다양한 특이적 항-스클레로스틴 항체가 결합하는 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 놀랍게도 실제로,
(i) 세포 기반 wnt 신호전달 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하고;
(ii) 세포 기반 무기질화 분석에서 억제 효과를 차단하고;
(iii) LRP-6에 대한 스클레로스틴의 결합을 억제하고;
(iv) 골 형성, 질량 및 밀도를 증가시킬 수 있는, 실시예에서 설명되는 모든 항체가 스클레로스틴 내의 동일한 에피토프에 고친화도로 결합하고, 상기 에피토프는 서열 156 및 서열 157 모두로부터의 아미노산을 포함하는 입체형태적 에피토프인 것으로 밝혀졌다. 임의의 특정 모델로 제한되지 않지만, 본원에서 서열 156 및 서열 157의 아미노산 서열은 본 발명의 항체가 인식하는 스클레로스틴 폴리펩티드 내의 하나의 입체형태적 에피토프 구역을 설명하는 것으로 제안되었다.
따라서, 추가의 항체는 표준 스클레로스틴 결합 분석에서 본 발명의 다른 항체와 교차-경쟁하는 (예를 들어, 통계적으로 유의한 방식으로 결합을 경쟁적으로 억제하는) 그들의 능력에 기초하여 확인할 수 있다. 인간 스클레로스틴에 대한 본 발명의 항체의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 인간 스클레로스틴에 대한 결합에 대해 그 항체와 경쟁할 수 있음을 입증하고; 그러한 항체는 비-제한적인 이론에 따르면, 그가 경쟁하는 항체와 인간 스클레로스틴 상의 동일한 또는 관련 (예를 들어, 구조적으로 유사한 또는 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체와 인간 스클레로스틴 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 그러한 인간 모노클로날 항체는 실시예에 설명되는 바와 같이 제조하고 단리할 수 있다.
공학처리된 및 변형된 항체
본 발명의 항체는 변형된 항체를 공학처리하기 위해 출발 물질로서 본원에 제시된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 추가로 제조할 수 있고, 상기 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나의 또는 두개의 가변 구역 (즉, VH 및/또는 VL) 내의, 예를 들어 하나 이상의 CDR 구역 내의 및/또는 하나 이상의 프레임워크 구역 내의 하나 이상의 잔기를 변형함으로써 공학처리될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 예를 들어 항체의 효과기 기능(들)을 변경하기 위해 불변 구역(들) 내의 잔기를 변형함으로써 공학처리될 수 있다.
수행할 수 있는 하나의 종류의 가변 구역 공학처리는 CDR 그라프팅이다. 항체는 우세하게 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 구역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체들 사이에서 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 특정한 자연 발생하는 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작함으로써 특정한 자연 발생하는 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327]; [Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525]; [Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 5,225,539 (Winter) 및 미국 특허 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
따라서, 본 발명의 다른 실시태양은 서열 1-11로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 12-22로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 서열 23-33으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 각각 포함하는 중쇄 가변 구역; 및 서열 34-44로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 45-55로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 및 서열 56-66으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3 서열을 각각 갖는 경쇄 가변 구역을 포함하는, 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질에 관한 것이다. 따라서, 그러한 항체는 모노클로날 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 상기 항체와 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.
그러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이타베이스 또는 공개된 참조문으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 구역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이타베이스 (인터넷 상에서 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능함), 및 그의 각각의 내용이 본원에 참조로 명백하게 포함된 문헌 ([Kabat, E.A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]; [Tomlinson, I.M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox, J.P.L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836])에서 찾을 수 있다.
본 발명의 항체에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 컨센서스 서열 및/또는 프레임워크 서열에 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 프레임워크 서열이 유래하는 생식계열 면역글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 구역 상에 그라프팅될 수 있거나, CDR 서열은 생식계열 서열에 비해 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 구역 상에 그라프팅될 수 있다. 예를 들어, 특정 예에서 항체의 항원 결합 능력을 유지하거나 향상시키기 위해 프레임워크 구역 내의 잔기를 돌연변이시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
다른 종류의 가변 구역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 구역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜, 관심있는 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선하는 것이다 ("친화도 성숙 (maturation)"으로 공지됨). 부위-지정 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이 유발은 돌연변이(들)을 도입하기 위해 수행할 수 있고, 항체 결합, 또는 관심있는 다른 기능적 특성에 대한 효과는 본원에서 설명되고 실시예에 제시되는 것과 같은 시험관내 또는 생체내 분석으로 평가할 수 있다. 보존적 변형 (상기 논의된)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 또한, CDR 구역 내의 대개 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
따라서, 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 1-11을 갖는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 1-11에 비해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1 구역; 서열 12-22로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 12-22에 비해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 구역; 및 서열 23-33으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 23-33에 비해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 구역을 갖는 중쇄 가변 구역; 및 서열 34-44로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 34-44에 비해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1 구역; 서열 45-55로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 45-55에 비해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 구역; 및 서열 56-66으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열 56-66에 비해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3 구역을 갖는 경쇄 가변 구역으로 이루어지는 단리된 항-스클레로스틴 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질을 제공한다.
항원-결합 도메인의 다른 프레임워크 또는 스캐폴드 ( scaffold ) 내로의 그라프팅.
생성되는 폴리펩티드가 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 하나의 결합 구역을 포함하는 한, 매우 다양한 항체/면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드를 사용할 수 있다. 그러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 5개의 주요 개별특이형 (idiotype)의 인간 면역글로불린, 또는 그의 단편 (예를 들어, 본원에서 다른 곳에서 개시된 것)을 포함하고, 바람직하게는 인간화 측면을 갖는 다른 동물 종의 면역글로불린을 포함한다. 카멜리드 (camelid)에서 확인되는 것과 같은 단일 중쇄 항체가 이와 관련하여 특히 중요하다. 당업자는 신규한 프레임워크, 스캐폴드 및 단편을 계속하여 발견하고 개발하고 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 그 위로 그라프팅될 수 있는 비-면역글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-면역글로불린계 항체를 생성하는 것에 관한 것이다. 서열 155의 표적 단백질에 특이적인 결합 구역을 포함하는 한, 공지의 또는 미래의 비-면역글로불린 프레임워크 및 스캐폴드를 사용할 수 있다. 그러한 화합물은 본원에서 "표적-특이적 결합 구역을 포함하는 폴리펩티드"로서 알려져 있다. 비-면역글로불린 프레임워크의 예는 다음 섹션 (카멜리드 항체 및 비-항체 스캐폴드)에서 추가로 설명한다.
카멜리드 항체
신세계 구성원, 예를 들어 라마 종 (라마 파코스 (Lama paccos), 라마 글라마 (Lama glama) 및 라마 비쿠그나 (Lama vicugna))을 비롯한 낙타 및 단봉낙타 (카멜루스 박트리아누스 (Camelus bactrianus) 및 카멜루스 드로마데리우스 (Camelus dromaderius))과의 구성원으로부터 얻은 항체 단백질은 크기, 구조적 복잡성 및 인간 대상에 대한 항원성에 관하여 특성이 결정되었다. 자연에서 발견되는 상기 과의 포유동물로부터의 특정 IgG 항체는 경쇄가 결핍되고, 따라서 다른 동물로부터의 항체에 대한 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4쇄 4원 구조로부터 구조상 구분된다 (PCT/EP93/02214 (WO 94/04678, 1994년 3월 3일 공개) 참조).
VHH로서 확인된 작은 단일 가변 도메인인 카멜리드 항체의 구역은 "카멜리드 나노바디 (nanobody)"로서 공지된 저분자량 항체-유래 단백질을 생성시키는, 표적에 대해 고친화도를 갖는 작은 단백질을 얻도록 유전공학에 의해 처리함으로써 얻을 수 있다 (미국 특허 5,759,808 (1998년 6월 2일 등록); 문헌 ([Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261]; [Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788]; [Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448]; [Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62]; 및 [Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520]) 참조). 카멜리드 항체 및 항체 단편의 공학처리된 라이브러리는 예를 들어 애블링스 (Ablynx, 벨기에 겐트)로부터 상업적으로 이용가능하다. 비-인간 기원의 다른 항체와 마찬가지로, 카멜리드 항체의 아미노산 서열은 인간 서열을 보다 밀접하게 닮은 서열을 얻도록 재조합 방식으로 변경될 수 있다; 즉 나노바디는 "인간화될" 수 있다. 따라서, 인간에 대한 카멜리드 항체의 천연의 저항원성이 추가로 낮추어질 수 있다.
카멜리드 나노바디는 저분자량이 인간 IgG 분자의 약 1/10이고, 단백질은 물리적인 직경이 단지 수 나노미터이다. 작은 크기의 하나의 중요성은 보다 큰 항체 단백질에 대해 기능적으로 보이지 않는 항원성 부위에 결합하는 카멜리드 나노바디의 능력이다; 즉 카멜리드 나노바디는 전통적인 면역학적 기술을 이용하여 달리 알 수 없는 항원을 검출하는 시약으로서 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기의 다른 중요성은 카멜리드 나노바디가 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈 내의 특이적 부위에 대한 결합의 결과로서 억제할 수 있고, 따라서 전통적인 항체보다 전통적인 저분자량 약물의 기능을 보다 밀접하게 닮은 능력을 나타낼 수 있다는 점이다.
저분자량 및 치밀한 크기는 또한 극히 열안정성이고, 극도의 pH 및 단백분해 소화에 안정하고, 항원성이 거의 없는 카멜리드 나노바디를 추가로 생성시킨다. 다른 중요성은 카멜리드 나노바디가 순환계로부터 조직 내로 및 심지어 혈액 뇌 장벽을 가로질러 쉽게 이동하고, 신경 조직을 침범하는 질환을 치료할 수 있다는 점이다. 나노바디는 혈액 뇌 장벽을 가로질러 약물 수송을 추가로 용이하게 할 수 있다 (2004년 8월 19일 공개된 미국 특허 출원 공개 20040161738 참조). 이들 특징은 인간에 대한 낮은 항원성과 조합되어 큰 치료 가능성을 나타낸다. 또한, 이들 분자는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 내에서 완전히 발현될 수 있고, 박테리오파지와 융합 단백질로서 발현되고 기능성이다.
따라서, 본 발명의 특징은 스클레로스틴에 고친화도를 갖는 카멜리드 항체 또는 나노바디이다. 본원의 특정 실시태양에서, 카멜리드 항체 또는 나노바디는 카멜리드 동물에서 자연적으로 생산되고, 즉, 다른 항체에 대해 본원에서 설명하는 기술을 이용하여 스클레로스틴 또는 그의 펩티드 단편으로 면역화시킨 후 카멜리드에 의해 생산된다. 별법으로, 항-스클레로스틴 카멜리드 나노바디는 공학처리되고, 즉, 예를 들어 본원의 실시예에서 설명하는 바와 같이 표적으로서 스클레로스틴을 사용하는 패닝 (panning) 절차를 이용하여 적절하게 돌연변이시킨 카멜리드 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지의 라이브러리로부터 선택에 의해 생산된다. 공학처리된 나노바디는 수여 대상 내의 반감기가 45분 내지 2주가 되도록 유전공학에 의해 처리함으로써 추가로 맞춤 생산될 수 있다. 특정한 실시태양에서, 카멜리드 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT/EP93/02214 (WO94/04678)에 설명된 바와 같이 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열 내로 그라프팅함으로써 얻어진다.
비-항체 스캐폴드
공지의 비-면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 애드넥틴 (Adnectin) (피브로넥틴) (컴파운드 쎄라퓨틱스, 인크. (Compound Therapeutics, Inc., 미국 매사추세츠주 월담)), 안키린 (몰레큘라 파트너스 아게 (Molecular Partners AG, 스위스 취리히)), 도메인 항체 (도만티스, 엘티디 (Domantis, Ltd, 미국 매사추세츠주 캠브리지) 및 애블링스 엔브이 (Ablynx nv, 벨기에 즈비나아르데)), 리포칼린 (안티칼린) (피에리스 프로테오랩 아게 (Pieris Proteolab AG, 독일 프라이징)), 소형 모듈 면역-의약품 (small modular immuno-pharmaceuticals) (트루비온 파마슈티칼스 인크. (미국 워싱톤주 시애틀)), 맥시바디 (Maxybody) (아비디아, 인크. (Avidia, Inc. 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)), 단백질 A (아피바디 아게 (Affibody AG, 스웨덴)) 및 아필린 (감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴) (스킬 프로테인즈 게엠베하 (Scil Proteins GmbH, 독일 할레)), 단백질 에피토프 모방체 (폴리포르 엘티디 (Polyphor Ltd, 스위스 알슈빌))를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
(i) 애드넥틴 - 컴파운드 쎄라퓨틱스
애드넥틴 스캐폴드는 피브로넥틴 타입 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 타입 III의 10번째 모듈 (10 Fn3 도메인))에 기반한다. 피브로넥틴 타입 III 도메인은 2개의 베타 시트 사이에 분포되는 7 또는 8개의 베타 스트랜드를 갖고, 이들은 서로에 대해 채워져서 단백질의 코어를 형성하고, 베타 스트랜드를 서로에 연결시키고 용매 노출되는 루프 (loop) (CDR에 유사한)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각각의 가장자리에 3개 이상의 그러한 루프가 존재하고, 여기서 가장자리는 베타 스트랜드의 방향에 수직인 단백질의 경계이다 (US 6,818,418).
상기 피브로넥틴계 스캐폴드는 면역글로불린이 아니지만, 전체 접힘은 최소 기능적 항체 단편인 중쇄의 가변 구역 (낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함함)에 밀접하게 관련된다. 상기 구조 때문에, 비-면역글로불린 항체는 항체와 성질이 유사한 항원 결합 특성 및 친화도를 모방한다. 이들 스캐폴드는 생체내 항체의 친화도 성숙 과정에 유사한 시험관내 루프 무작위화 및 셔플링 (shuffling) 전략에 사용될 수 있다. 분자의 루프 구역이 표준 클로닝 기술을 이용하여 본 발명의 CDR로 교체될 수 있는 이들 피브로넥틴계 분자는 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
(ii) 안키린 - 몰레큘라 파트너스
상기 기술은 안키린 유래 반복 (repeat) 모듈을 갖는 단백질을 상이한 표적에 대한 결합을 위해 사용될 수 있는 가변 구역을 보유하기 위한 스캐폴드로서 사용하는 것에 기초한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역-평행 α-나선 및 β-턴 (turn)으로 이루어지는 33개 아미노산 폴리펩티드이다. 가변 구역의 결합은 리보좀 디스플레이를 사용함으로써 가장 최적화된다.
(iii) 맥시바디/아비머 (avimer) - 아비디아
아비머는 LRP-1과 같은 천연 A-도메인 함유 단백질로부터 유도된다. 이들 도메인은 자연에서 단백질-단백질 상호작용을 위해 사용되고, 인간에서 250개가 넘는 단백질이 구조적으로 A-도메인에 기초한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 많은 상이한 "A-도메인" 단량체 (2-10)로 이루어진다. 예를 들어, 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 기재되어 있는 방법을 사용하여, 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머를 생성시킬 수 있다.
(vi) 단백질 A - 아피바디
아피바디® 친화도 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 하나의 스캐폴드에 기초하는 3-나선 다발로 이루어진 작고 단순한 단백질이다. 단백질 A는 세균 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질이다. 상기 스캐폴드 도메인은 58개 아미노산으로 이루어지고, 그 중 13개는 다수의 리간드 변이체를 갖는 아피바디® 라이브러리를 생성하도록 무작위화된다 (예를 들어, US 5,831,012 참조). 아피바디® 분자는 항체를 모방하고, 150 kDa인 항체의 분자량에 비해 분자량이 6 kDa이다. 그의 작은 크기에도 불구하고, 아피바디® 분자의 결합 부위는 항체의 결합 부위와 유사하다.
(v) 안티칼린 - 피에리스
안티칼린®은 피에리스 프로테오랩 아게에서 개발된 제품이다. 이들은 대체로 화학적 감수성 또는 불용성 화합물의 생리학적 수송 또는 보관에 관여되는 광범위한 군의 작고 강력한 단백질인 리포칼린으로부터 유래한다. 수개의 천연 리포칼린이 인간 조직 또는 체액에 존재한다.
단백질 구조는 면역글로불린을 연상시키고, 단단한 프레임워크의 상단에 초가변 루프를 갖는다. 그러나, 항체 또는 그들의 재조합 단편과는 달리, 리포칼린은 160 내지 180개의 아미노산 잔기를 갖는 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되고, 이는 단일 면역글로불린 도메인보다 단지 근소하게 더 크다.
결합 포켓 (pocket)을 형성하는 4개 루프의 세트는 현저한 구조적 유연성을 보이고 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서, 결합 부위는 상이한 형상의 규정된 표적 분자를 고친화도 및 특이성으로 인식하기 위해 독점적인 과정으로 재성형될 수 있다.
리포칼린 패밀리의 한 단백질인 피에리스 브라시카에 (Pieris brassicae)의 빌린-결합 단백질 (BBP)을 사용하여 4개 루프의 세트를 돌연변이시킴으로써 안티칼린을 개발하였다. "안티칼린"을 설명하고 있는 특허 출원의 일례는 PCT WO199916873이다.
(vi) 아필린 - 스킬 프로테인즈
아필린™ 분자는 단백질 및 소분자를 향한 특이적 친화도를 위해 설계된 작은 비-면역글로불린 단백질이다. 새로운 아필린™ 분자는 그 각각이 상이한 인간 유래 스캐폴드 단백질에 기초하는 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선택될 수 있다.
아필린™ 분자는 면역글로불린 단백질에 임의의 구조적 상동성을 보이지 않는다. 스킬 프로테인즈에서는 2개의 아필린™ 스캐폴드를 사용하였고, 그 중 하나는 감마 결정질인 인간 구조적 수정체 단백질이고 다른 하나는 "유비퀴틴" 거대부류 단백질이다. 두 인간 스캐폴드는 매우 작고, 고온 안정성을 보이고, pH 변화 및 변성제에 대해 대체로 저항성이다. 상기 고안정성은 주로 단백질의 확대된 베타 시트 구조 때문이다. 감마 결정질 유래 단백질의 예는 WO200104144에 기재되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO2004106368에 기재되어 있다.
(vii) 단백질 에피토프 모방체 (PEM)
PEM은 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 주요 2차 구조인 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간 크기의 환상 펩티드-유사 분자 (MW 1-2 kDa)이다. 보다 일반적으로, 개시된 항체의 에피토프의 3D 구조를 모방하는 임의의 폴리펩티드는 본 발명의 일부이다. 바람직한 실시태양은 적어도 다음 폴리펩티드 E1-L-E2 (여기서, E1은 서열 156이고, E2는 서열 157이고, L은 E1 및 E2가 본 발명의 항체가 인식하는 구역의 3D 구조를 재현하도록 하는 폴리펩티드 링커임)를 포함하는 30-100개의 아미노산의 폴리펩티드이다. 바람직한 실시태양에 따라, L은 글라이신 또는 세린 아미노산 중에서 선택되는 10-20개 아미노산으로 이루어지는 링커이다. 바람직하게는, 링커 L은 펩티드 GGGSGGGGSGGGG (서열 X/서열 158) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGG (서열 Y/서열 159)를 포함하고, 보다 바람직하게는 링커 L은 본질적으로 서열 X 또는 서열 Y로 이루어진다.
이들 폴리펩티드는 본 발명의 항체에 대한 고친화도를 보유하여야 한다. 이들 폴리펩티드는 또한 유리하게는 스클레로스틴에 대한 항체를 생성시키도록 면역원으로서 사용될 수 있다.
이들 폴리펩티드는 또한 스클레로스틴의 길항제 또는 효능제로서 사용될 수 있고, 따라서 본 발명의 항체에 대해 설명된 것과 유사한 용도를 갖는다.
E1 및/또는 E2 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실, 바람직하게는 1, 2 또는 3개 이상의 아미노산 치환, 또는 결실을 갖는 폴리펩티드도 본 발명의 일부이다. 이들 폴리펩티드는 반감기를 증가시키거나 용해도를 개선하도록 추가로 공학처리될 수 있다. 특히, 본 발명의 항체 단편 분자에 대한 다음 문단에 설명된 Fc 공학처리와 유사하게, 반감기를 증가시키기 위해 이들 폴리펩티드와 혈청 단백질, 예를 들어 IgG의 Fc 단편 또는 인간 혈청 알부민과의 융합 구성체를 생성할 수 있다.
프레임워크 또는 Fc 공학처리
본 발명의 공학처리된 항체는 예를 들어 항체의 특성을 개선하기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 대해 변형이 이루어진 것을 포함한다. 일반적으로 그러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 방안은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 대응하는 생식계열 서열로 "복귀 돌연변이 (backmutation)"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪은 항체는 그로부터 항체가 유도된 생식계열 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 그러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 그로부터 항체가 유도된 생식계열 서열에 비교함으로써 확인할 수 있다. 프레임워크 구역 서열을 그들의 생식계열 형상으로 복귀시키기 위해, 체세포 돌연변이는 예를 들어 부위-지정 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이 유발에 의해 생식계열 서열로 "복귀 돌연변이"될 수 있다. 그러한 "복귀 돌연변이된" 항체도 본 발명에 포함되도록 의도된다.
다른 종류의 프레임워크 변형은 T 세포-에피토프를 제거하여 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해 프레임워크 구역 내의 또는 심지어 하나 이상의 CDR 구역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 포함한다. 상기 방안은 또한 "탈면역화"로 불리고, 미국 특허 출원 공개 20030153043 (Carr et al.)에 보다 상세히 설명되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 구역 내에 이루어지는 변형에 추가로 또는 별법으로, 본 발명의 항체는 일반적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예를 들어 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 구역 내에 변형을 포함하도록 공학처리될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 다시 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경시키기 위해 그의 글리코실화를 변경시키도록 화학적으로 변형되거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티 (moiety)가 항체에 부착될 수 있다) 변형될 수 있다. 각각의 이들 실시태양은 아래에 보다 상세히 설명되어 있다. Fc 구역에서 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스 (index)의 것이다.
한 실시태양에서, CH1의 힌지 구역은 힌지 구역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 상기 방안은 미국 특허 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 구역 내의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하기 위해 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다.
다른 실시태양에서, 항체의 Fc 힌지 구역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 손상된 스태필로코커스 단백질 A (SpA) 결합을 갖도록 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 구역 내로 도입된다. 상기 방안은 미국 특허 6,165,745 (Ward et al.)에 보다 상세히 설명되어 있다.
다른 실시태양에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 방안이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 6,277,375 (Ward)에 설명되어 있는 바와 같이 하나 이상의 다음 돌연변이가 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 별법으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 설명되어 있는 바와 같이 IgG의 Fc 구역의 CH2 도메인의 2개 루프로부터 취해진 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 구역 내에서 변경될 수 있다.
다른 실시태양에서, 항체의 효과기 기능을 변경시키기 위해 Fc 구역은 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 교체함으로써 변경된다. 항체가 효과기 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록, 예를 들어 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 그에 대한 친화도가 변경되는 효과기 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 상기 방안은 미국 특허 5,624,821 및 5,648,260 (둘 모두 Winter et al.)에 보다 상세히 설명되어 있다.
다른 실시태양에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 폐지된 보체 의존 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 교체될 수 있다. 상기 방안은 미국 특허 6,194,551 (Idusogie et al.)에 보다 상세히 설명되어 있다.
다른 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 보체를 고정하기 위해 항체의 능력을 변경시킨다. 상기 방안은 PCT 공개 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다.
또다른 실시태양에서, Fc 구역은 하나 이상의 아미노산을 변형함으로써 항체 의존 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키기 위해 및/또는 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변형된다. 상기 방안은 PCT 공개 WO 00/42072 (Presta)에서 추가로 설명된다. 또한, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위는 매핑 (mapping)되었고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 설명되었다 (Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604).
또다른 실시태양에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 무글리코실화 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결여된다). 글리코실화는 예를 들어 "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 그러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 글리코실화의 하나 이상의 부위를 변경시킴으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 구역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 일으켜 그 부위에서 글리코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 그러한 무글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 그러한 방안은 미국 특허 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 더욱 상세히 설명된다.
추가로 또는 별법으로, 변경된 종류의 글리코실화를 갖는 항체, 예를 들어 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 (hypofucosylated) 항체 또는 증가된 2등분성 (bisecting) GlcNac 구조를 갖는 항체를 제조할 수 있다. 그러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 그러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 달성할 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 설명되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al.)에서는 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자 (푸코실 트랜스퍼라제를 코딩함)를 갖는 세포주를 설명하고 있고, 그러한 세포주 내에서 발현된 항체는 저푸코실화를 보인다. PCT 공개 WO 03/035835 (Presta)에서는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 설명하고 있고, 이는 또한 그 숙주 세포 내에서 발현된 항체의 저푸코실화를 일으킨다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO 99/54342 (Umana et al.)에서는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어 베타(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 공학처리된 세포주를 설명하고 있고, 여기서 공학처리된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 2등분성 GlcNac 구조를 나타낼 수 있고, 이는 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다 (또한 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).
본 발명에서 고려되는 본원에서 항체의 다른 변형은 PEG화이다. 예를 들어, 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 항체를 peg화할 수 있다. 항체를 peg화하기 위해, 항체 또는 그의 단편을 대개 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예를 들어 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와, 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되도록 하는 조건 하에 반응시킨다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)를 사용하는 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행할 수 있다. 본원에서 사용할 때, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용되는 임의의 형태의 PEG, 예를 들어 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포함하도록 의도된다. 특정 실시태양에서, peg화시킬 항체는 무글리코실화 항체이다. 단백질을 peg화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)을 참조한다.
본 발명에서 고려되는 항체의 다른 변형은 생성되는 분자의 반감기를 증가시키기 위해 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민 또는 그의 단편에 대한, 적어도 본 발명의 항체의 항원-결합 구역의 컨쥬게이트 (conjugate) 또는 단백질 융합이다. 상기 방법은 예를 들어 EP0322094 (Ballance et al.)에 기재되어 있다.
다른 가능성은 생성되는 분자의 반감기를 증가시키기 위해 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 단백질에 대한, 적어도 본 발명의 항체의 항원-결합 구역의 융합이다. 상기 방법은 예를 들어 EP0486525 (Nygren et al.)에 기재되어 있다.
변경된 항체의 공학처리 방법
상기 논의된 바와 같이, 본원에서 제시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항-스클레로스틴 항체는 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열, 또는 이들에 부착된 불변 구역(들)을 변형함으로써 새로운 항-스클레로스틴 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 항-스클레로스틴 항체의 구조적 특징은 본 발명의 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예를 들어 인간 스클레로스틴에 대한 결합 및 또한 스클레로스틴의 하나 이상의 기능적 특성의 억제 (예를 들어, 수용체 결합, 골용해의 방지 또는 개선)를 보유하는, 구조적으로 관련된 항-스클레로스틴 항체를 생성하기 위해 사용된다.
예를 들어, 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR 구역, 또는 그의 돌연변이는 공지의 프레임워크 구역 및/또는 다른 CDR과 재조합 방식으로 조합되어, 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 추가의 재조합 방식으로-공학처리된 항-스클레로스틴 항체를 생성할 수 있다. 다른 종류의 변형은 선행 섹션에서 설명된 것을 포함한다. 공학처리 방법을 위한 출발 물질은 본원에서 제공되는 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열, 또는 그의 하나 이상의 CDR 구역이다. 공학처리된 항체를 생성하기 위해서, 본원에서 제공되는 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열, 또는 그의 하나 이상의 CDR 구역을 갖는 항체를 실제로 제조하는 (즉, 단백질로서 발현하는) 것은 불필요하다. 대신에, 서열(들)에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 원래의 서열(들)로부터 유도된 "제2 세대" 서열(들)을 생성하고, 이어서 "제2 세대" 서열(들)을 제조하고 단백질로서 발현시킨다.
따라서, 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 1-11로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDR1 서열, 서열 12-22로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDR2 서열 및/또는 서열 23-33으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDR3 서열을 갖는 중쇄 가변 구역 항체 서열; 및 서열 34-44로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDR1 서열, 서열 45-55로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDR2 서열 및/또는 서열 56-66으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 구역 항체 서열로 이루어지는 항-스클레로스틴 항체를 제조하고; 중쇄 가변 구역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 구역 항체 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜 하나 이상의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.
따라서, 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 111-121의 군 중에서 선택되는 서열을 갖는 전장 중쇄 항체 서열; 및 122-132의 군 중에서 선택되는 서열을 갖는 전장 경쇄 항체 서열로 이루어지는, 포유동물 세포에서 발현을 위해 최적화된 항-스클레로스틴 항체를 제조하고; 전장 중쇄 항체 서열 및/또는 전장 경쇄 항체 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜 하나 이상의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.
변경된 항체 서열은 또한 서열 23-33으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 고정된 CDR3 서열 또는 US20050255552에 설명된 바와 같은 최소 필수 결합 결정인자 (determinant), 및 CDR1 및 CDR2 서열 상의 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터 항체를 스크리닝하기에 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예를 들어 파지 디스플레이 기술에 따라 수행할 수 있다.
변경된 항체 서열을 제조하기 발현시키기 위해 표준 분자 생물학 기술을 이용할 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩되는 항체는 본원에서 설명되는 항-스클레로스틴 항체의 기능적 특성 중 하나, 일부 또는 전부를 보유하는 것이고, 상기 기능적 특성은 인간 스클레로스틴에 대한 특이적 결합을 포함하고 이로 제한되지 않으며; 항체는 적어도 하나의 다음과 같은 기능적 특성을 보인다: 항체는 세포 기반 wnt 신호전달 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, 항체는 세포 기반 무기질화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, Smad1 인산화 분석에서 스클레로스틴의 억제 효과를 차단하거나, 항체는 LRP-6에 대한 스클레로스틴의 결합을 억제하거나, 항체는 골 형성 및 질량 및 밀도를 증가시킨다.
변경된 항체는 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상의 상기 논의된 기능적 특성을 나타낼 수 있다.
변경된 항체의 기능적 특성은 당업계에 이용가능하고/하거나 본원에서 설명되는 표준 분석, 예를 들어 실시예에 제시되는 것 (예를 들어, ELISA)을 이용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 항체의 공학처리 방법의 특정 실시태양에서, 돌연변이가 항-스클레로스틴 항체 코딩 서열의 일부 또는 전부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 항-스클레로스틴 항체는 결합 활성 및/또는 본원에서 설명되는 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에 설명되어 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 02/092780 (Short)에서는 포화 돌연변이 유발, 합성 라이게이션 (ligation) 조립, 또는 그의 조합을 이용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 설명하고 있다. 별법으로, PCT 공개 WO 03/074679 (Lazar et al.)에서는 항체의 물리화학적 특성을 최적화하기 위해서 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용하는 방법을 설명하고 있다.
본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 전장 경쇄 모 뉴클레오티드 서열의 예를 서열 144-145에 제시한다. 전장 중쇄 모 뉴클레오티드 서열의 예를 서열 133-134에 제시한다. 포유동물 세포에서 발현을 위해 최적화된 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열의 예를 서열 146-154에 제시한다. 포유동물 세포에서 발현을 위해 최적화된 전장 중쇄 뉴클레오티드 서열의 예를 서열 135-143에 제시한다.
핵산은 전체 세포 내에, 세포 용해물 내에 존재할 수 있거나, 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태의 핵산일 수 있다. 핵산은 알칼린/SDS 처리, CsCl 밴딩 (banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 공지된 다른 방법 (문헌 [F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York] 참조)을 포함한 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어, 다른 세포성 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리되거나", "실질적으로 순수하게 된다". 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 한 실시태양에서, 핵산은 cDNA 분자이다. 핵산은 파지 디스플레이 벡터와 같은 벡터 내에, 또는 재조합 플라스미드 벡터 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 아래에서 추가로 설명되는 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체에 대해, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻을 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 얻은 항체에 대해 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용하여), 항체를 코딩하는 핵산은 라이브러리의 구성원인 다양한 파지 클론으로부터 회수할 수 있다.
VH 및 VL 세그먼트를 코딩하는 DNA 단편을 얻은 후에, 이들 DNA 단편은 예를 들어, 가변 구역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자로, Fab 단편 유전자로 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위해 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작할 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 다른 DNA 분자, 또는 다른 단백질, 예를 들어 항체 불변 구역 또는 가요성 링커를 코딩하는 단편에 작동가능하게 연결된다. 상기 문맥에서 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편들이 기능적 방식으로, 예를 들어, 2개의 DNA 단편들에 의해 코딩되는 아미노산 서열들이 인-프레임 (in-frame)으로 유지되도록, 또는 단백질이 목적하는 프로모터의 제어 하에 발현되도록 연결되는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
VH 구역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 구역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 구역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E.A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 구역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 중쇄 불변 구역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 구역일 수 있다. 바람직하게는, 중쇄 불변 구역은 IgG2 이소형 중에서 선택된다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대해, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 구역만을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL 구역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 구역, 즉 CL을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자 (및 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 구역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E.A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 구역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 경쇄 불변 구역은 카파 또는 람다 불변 구역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해서, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 다른 단편에 작동가능하게 연결하여, VH 및 VL 서열이 인접 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 하고, 여기서 VL 및 VH 구역은 가요성 링커에 의해 연결된다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554] 참조).
본 발명의 모노클로날 항체의 생성
모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법, 예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함한 다양한 기술에 의해 생산할 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 많은 기술, 예를 들어, B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환을 이용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마 생산은 잘 확립된 절차이다. 융합을 위해 면역화된 비장세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.
본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 설명된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 DNA는 관심있는 뮤린 하이브리도마로부터 얻고, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 공학처리될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 뮤린 가변 구역을 당업계에 공지된 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조)을 이용하여 인간 불변 구역에 연결할 수 있다. 인간화 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 구역을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다 (예를 들어 미국 특허 5225539 (Winter)와 미국 특허 5530101; 5585089; 5693762 및 6180370 (Queen et al.) 참조).
특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 스클레로스틴에 대해 작용하는 그러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모좀 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모좀 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 칭하는 마우스를 포함하고, 본원에서 "인간 Ig 마우스"로서 총칭한다
HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크. (Medarex, Inc.))는 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니로커스를, 내인성 μ 및 κ 사슬 로커스를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al., 1994 Nature 368 (6474):856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 도입유전자는 클래스 스위칭 (class switching) 및 체세포 돌연변이를 거쳐 고친화도 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 ([Lonberg, N. et al., 1994 상기 문헌]; [Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; [Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13:65-93] 및 [Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 검토됨). HuMAb 마우스의 제조 및 사용과 그러한 마우스가 보유한 게놈 변형은 그 전체 내용이 본원에 참고로 구체적으로 포함되는 문헌 ([Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; [Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5:647-656]; [Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724]; [Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123]; [Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12:821-830]; [Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920]; [Taylor, L et al., 1994 International Immunology 579-591]; 및 [Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851]에 추가로 설명되어 있다. 또한, 미국 특허 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429 (모두 Lonberg 및 Kay); 미국 특허 5,545,807 (Surani et al.); PCT 공개 WO 92/103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 Lonberg 및 Kay); 및 PCT 공개 WO 01/14424 (Korman et al.)을 참고한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 도입유전자 및 트랜스크로모좀 상에 인간 면역글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예를 들어 인간 중쇄 도입유전자 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀을 보유하는 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 그러한 마우스 (본원에서 "KM 마우스"로서 칭함)는 PCT 공개 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 상세히 기재되어 있다.
인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 또 다른 대안적인 트랜스제닉 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 항-스클레로스틴 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, Xenomouse (압제닉스, 인크. (Abgenix, Inc.))로서 칭하는 대안적인 트랜스제닉 시스템을 사용할 수 있다. 상기 마우스는 예를 들어, 미국 특허 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.
또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스크로모좀 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 항-스클레로스틴 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 트랜스크로모좀 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀을 모두 보유하는 마우스 ("TC 마우스"로서 칭함)를 사용할 수 있고; 상기 마우스는 문헌 [Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모좀을 보유하는 소가 당업계에서 설명되었고 (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894), 본 발명의 항-스클레로스틴 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 그러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에서 확립되거나 하기 실시예에서 설명된다. 예를 들어 미국 특허 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner et al.); 미국 특허 5,427,908 및 5,580,717 (Dower et al.), 미국 특허 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths et al.)을 참조한다.
또한, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화 시에 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 그 내부로 인간 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수 있다. 상기 마우스는 예를 들어 미국 특허 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.
인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화시킨 마우스로부터 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화 세포주, 예를 들어 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성되는 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화시킨 마우스로부터 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 50％ PEG를 사용하여 P3X63-Ag8.653 비분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580)의 수의 1/6에 융합시킬 수 있다. 세포를 평저 미량역가 플레이트 내에 약 2 x 145로 플레이팅한 후, 20％ 우태 혈청, 18％ "653" 조건화 배지, 5％ 오리겐 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 단위/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 겐타마이신 및 1X HAT (시그마 (Sigma); HAT는 융합의 24시간 후에 첨가한다)을 함유하는 선택 배지 내에서 2주 인큐베이이팅한다. 약 2주 후에, 세포를 HAT를 HT로 교체한 배지 내에 배양할 수 있다. 이어서, 개별 웰을 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 일단 광범한 하이브리도마 성장이 일어나면, 배지를 대체로 10-14일 후에 관찰할 수 있다. 항체 분비 하이브리도마를 재플레이팅하고, 다시 스크리닝할 수 있고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성이면, 모노클로날 항체를 제한 희석에 의해 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여, 특성 결정을 위해 조직 배양 배지 내에서 소량의 항체를 생성할 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노클로날 항체 정제를 위해 2-리터 스피너 (spinner)-플라스크 내에서 성장시킬 수 있다. 상등액을 여과하고 농축한 후, 단백질 A-세파로즈 (파마시아 (Pharmacia, 미국 뉴저지주 피츠카타웨이))를 사용하여 친화도 크로마토그래피로 처리하였다. 용출된 IgG는 순도를 보장하기 위해 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 검토할 수 있다. 버퍼 용액을 PBS로 교환할 수 있고, 농도는 1.43 흡광 계수를 사용하여 OD280에 의해 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고 -80℃에서 저장할 수 있다.
모노클로날 항체를 생산하는 이입세포의 생성
본 발명의 항체는 또한 당업계에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 예를 들어 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 이용하여 숙주 세포 이입세포 내에서 생산할 수 있다 (예를 들어, [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]).
예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심있는 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 얻을 수 있고, DNA를 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 상기 문맥에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그들의 의도된 기능을 수행하도록 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포에 적합하도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 보다 일반적으로 두 유전자는 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터에 대한 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에 블런트 (blunt) 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 본원에서 설명되는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 구역은 이들을 목적하는 이소형의 중쇄 불변 경쇄 불변 구역을 이미 코딩하는 발현 벡터 내로, VH 세그먼트가 벡터 내의 CH 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 세그먼트가 벡터 내의 CL 세그먼트에 작동가능하게 연결되도록 삽입함으로써, 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인-프레임으로 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자에 추가로, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. 용어 "조절 서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 그러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990)]에 기재되어 있다. 당업자는 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 설계가 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 요구되는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인에 따라 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예를 들어 사이토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주오 후기 프로모터 (AdMLP)), 및 폴리오마로부터 유래되는 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 별법으로, 비-바이러스 조절 서열, 예를 들어 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, SV40 조기 프로모터로부터의 서열 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복체를 함유하는 SRa 프로모터 시스템과 같은 조절 요소는 상이한 공급원으로부터의 서열로 이루어진다 (Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 추가로, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들어 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 그 내부에 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두 Axel et al.)). 예를 들어, 전형적으로, 선택가능한 마커 유전자는 그 내부로 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물, 예를 들어 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 선택가능한 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭으로 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위해) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위한)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)는 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염된다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA의 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로의 도입을 위해 통상 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하도록 의도된다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론적으로 가능하다. 진핵 세포, 특히 포유동물 세포는 원핵 세포보다 적절하게 폴딩된 면역학적 활성 항체를 조합하고 분비할 것이기 때문에, 진핵 세포, 특히 포유동물 숙주 세포 내에서 항체 발현을 논의한다. 항체 유전자의 원핵 발현은 활성 항체의 고수율 생산을 위해 비효과적인 것으로 보고되었다 (Boss, M.A. and Wood, C.R., 1985 Immunology Today 6:12-13).
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어, 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621]에 설명된 바와 같이 DHFR 선택가능한 마커와 함께 사용되는 dhfr- CHO 세포 포함, 문헌 [Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 설명됨), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하기 위해, 다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 제시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입될 때, 숙주 세포 내에서 항체의 발현 또는 숙주 세포가 성장되는 배양 배지 내로 항체의 분비를 허용하기 위해 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체가 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
이중특이적 분자
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-스클레로스틴 항체 또는 그의 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 구역은 유도체화되거나 다른 기능성 분자, 예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)에 연결되어, 2개 이상의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 유도체화되거나 1개 초과의 다른 기능성 분자에 연결되어, 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고; 그러한 다중특이적 분자는 또한 본원에서 사용될 때 용어 "이중특이적 분자"에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 이중특이적 분자가 생성되도록 하나 이상의 다른 결합 분자, 예를 들어 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결될 수 있다 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 또는 다른 방식에 의해).
따라서, 본 발명은 적어도 하나가 스클레로스틴에 대한 제1 결합 특이성, 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함하다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한 스클레로스틴의 다른 에피토프이다. 다른 예는 적어도 하나가 스클레로스틴에 대한 제1 결합 특이성, 및 Dkk-1 내의 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자이다. 다른 예는 적어도 하나가 스클레로스틴에 대한 제1 결합 특이성, 및 LRP4 내의 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자이다.
추가로, 이중특이적 분자가 다중특이적인 발명에 대해, 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프에 추가로 제3 결합 특이성을 더 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이성으로서 하나 이상의 항체 또는 그의 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv를 포함한다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편, 예를 들어 그 내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 4,946,778 (Ladner et al.)에 기재된 Fv 또는 단일쇄 구성체일 수 있다.
본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 각각의 구성체 결합 특이성을 컨쥬게이팅함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이성을 따로 생성된 후 서로 컨쥬게이팅할 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드일 때, 공유 컨쥬게이션을 위해 다양한 커플링 또는 가교결합제를 사용할 수 있다. 가교결합제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 ([Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686]; [Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648]) 참조). 다른 방법은 문헌 ([Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132]; [Brennan et al., 1985 Science 229:81-83] 및 [Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375])에 기재된 것을 포함한다. 컨쥬게이팅제는 SATA 및 술포-SMCC (둘 모두 피어스 케미칼 컴퍼니 (Pierce Chemical Co., 미국 일리노이주 록포드))로부터 입수가능함)이다.
결합 특이성이 항체일 때, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 구역의 술프히드릴 결합에 의해 컨쥬게이팅될 수 있다. 특정한 실시태양에서, 힌지 구역은 컨쥬게이션 전에 홀수의, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
별법으로, 두 결합 특이성은 동일한 벡터 내에서 코딩되고, 동일한 숙주 세포에서 발현되고 조합될 수 있다. 상기 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2, 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일쇄 항체 및 결합 결정인자를 포함하는 단일쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정인자를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 2개 이상의 단일쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 5,260,203; 미국 특허 5,455,030; 미국 특허 4,881,175; 미국 특허 5,132,405; 미국 특허 5,091,513; 미국 특허 5,476,786; 미국 특허 5,013,653; 미국 특허 5,258,498; 및 미국 특허 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자의 그의 특이적 표적에 대한 결합은 예를 들어 효소 연결 면역흡착 분석 (ELISA), 방사성 면역분석 (REA), FACS 분석, 생물학적 검정 (bio-assay) (예를 들어, 성장 억제), 또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인할 수 있다. 각각의 이들 분석은 일반적으로 관심있는 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용함으로써 특히 중요한 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
다가 항체
다른 측면에서, 본 발명은 스클레로스틴에 결합하는 본 발명의 항체의 2개 이상의 동일하거나 상이한 항원 결합 부분을 포함하는 다가 화합물을 제공한다. 바람직하게는, 스클레로스틴의 삼량체 성질이 주어지면, 본 발명의 화합물은 항체의 3 또는 4개 이상의 항원 결합 부분을 제공한다. 항원 결합 부분들은 단백질 융합 또는 공유 또는 비-공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 별법으로, 연결 방법은 이중특이적 분자에 대해 설명되었다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 본 발명의 항체의 불변 구역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 구역에 결합하는 항체와 가교결합시킴으로써 4가 화합물을 얻을 수 있다.
삼량체화 도메인은 예를 들어 특허 EP 1 012 280B1 (Borean)에 기재되어 있다. 오량체화 모듈은 예를 들어 PCT/EP97/05897에 기재되어 있다.
제약 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제형화된 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 구역(들) 중 하나 또는 그의 조합물을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 본 발명의 (예를 들어, 2개 이상의 상이한) 항체, 또는 면역컨쥬게이트 또는 이중특이적 분자 중 하나 또는 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하거나 상보성 활성을 갖는 항체의 조합물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 제약 조성물은 조합 요법으로, 즉, 다른 물질과 조합하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 본 발명의 항-스클레로스틴 항체를 1종 이상의 다른 소염제 또는 골다공증 치료제와 조합하여 포함할 수 있다. 조합 요법으로 사용할 수 있는 치료제의 예는 본 발명의 항체의 용도에 대한 아래 섹션에서 보다 상세히 설명한다. 조성물은 바람직하게는 생리학적 pH에서 제형화된다.
본원에서 사용할 때 "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 적합성인 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한)에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 면역컨쥬게이트 또는 이중특이적 분자는 산 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하기 위해 물질 내에 코팅될 수 있다.
본 발명의 제약 화합물은 하나 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 염을 나타내고, 임의의 바람직하지 않은 독성학적 효과를 부여하지 않는다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 상기 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유도된 염, 및 비독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유도된 염을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리토 금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유도된 염, 및 비독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유도된 염을 포함한다.
또한, 본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 염산염, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; 지용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이팅제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물에 사용할 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물, 식물유, 예를 들어 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅 물질, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지할 수 있다.
또한, 이들 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재 예방은 상기한 멸균 절차에 의해 및 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함 모두에 의해 보장할 수 있다. 등장제, 예를 들어 당, 염화나트륨 등을 조성물 내에 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 주사가능한 제약 형태의 연장된 흡수가 일어날 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 수분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 제약학상 활성 물질을 위한 그러한 매질 및 물질의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질이 활성 화합물에 비적합성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서 그의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 화합물을 또한 조성물 내로 포함시킬 수 있다.
치료 조성물은 일반적으로 멸균되고 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 질서 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지할 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어, 당, 다가알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시킬 수 있다. 조성물 내에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 모노스테아레이트염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사가능한 조성물의 연장된 흡수가 일어날 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 요구되는 경우 상기 열거한 성분 중 하나 또는 그의 조합물과 함께 활성 화합물을 요구되는 양으로 적절한 용매 내에 포함시킨 후, 멸균 미세여과함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산매 및 상기 열거한 것으로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 포함시킴으로써 제조한다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 그의 앞서 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결-건조 (동결건조)이다.
단일 투여형을 제조하기 위해 담체 물질과 조합할 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상, 및 특정 투여 방식에 따라 다를 것이다. 단일 투여형을 제조하기 위해 담체 물질과 조합할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 상기 양은 제약상 허용되는 담체와 조합한 100％ 중의 약 0.01％ 내지 약 99％의 활성 성분, 약 0.1％ 내지 약 70％, 또는 약 1％ 내지 약 30％의 활성 성분일 것이다.
투여 계획은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼러스가 투여될 수 있거나, 수회의 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 긴급성이 나타내는 바에 따라 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이함과 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용될 때 투여 단위형은 치료할 대상을 위한 단위 투여량으로서 알맞은 물리적으로 구분되는 단위를 나타내고; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 예정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위형에 대한 명세서는 활성 화합물의 특유한 특징 및 달성할 특정 치료 효과, 및 개인에서 감수성의 치료를 위해 그러한 활성 화합물을 화합하는 기술에 내재하는 한계에 의해 기술되고 그에 직접 의존적이다.
항체의 투여를 위해, 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg (숙주 체중), 보다 대체로 0.01 내지 5 mg/kg 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중이거나, 1-10 mg/kg의 범위 내에 있다. 예시적인 치료 계획은 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 매달 1회, 3개월마다 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 본 발명의 항-스클레로스틴 항체에 대한 투여량 계획은 정맥내 투여에 의해 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 포함하고, 여기서 항체는 다음 투약 스케쥴 중 하나를 사용하여 주어진다: 6회 투여량에 대해 4주마다, 이어서 3개월마다; 3주마다; 3 mg/kg 체중으로 1회, 이어서 1 mg/kg 체중으로 3주마다.
몇몇 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 모노클로날 항체가 동시에 또는 순차적으로 투여되고, 이 경우에 투여되는 각각의 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 있다. 항체는 대체로 다수 경우로 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 예를 들어 매주, 매월, 3개월마다 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙할 수 있다. 몇몇 방법에서, 투여량은 약 1-1000 ㎍/ml, 및 일부 방법에서 약 25-300 ㎍/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다.
별법으로, 항체는 지속 방출 제형으로서 투여될 수 있고, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 변한다. 일반적으로, 인간 항체는 가장 긴 반감기를 보이고, 그 다음은 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비인간 항체의 순이다. 투여량 및 투여 빈도는 처리가 예방적인지 치료적인지 여부에 따라 변할 수 있다. 예방 용도에서, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그들의 나머지 생애동안 계속 치료받는다. 치료 용도에서, 질병의 진행이 감소되거나 종결될 때까지 또는 환자가 질병 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 보일 때까지 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자는 예방 계획으로 투여받을 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 내의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하기 위해 효과적인 활성 성분을 양을 얻도록 변할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배설 속도, 치료의 지속 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합으로 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의료력 및 의학 분야에 잘 공지된 유사한 인자를 포함한 다양한 약동학 인자에 따라 결정될 것이다.
본 발명의 항-스클레로스틴 항체의 "치료 유효 투여량"은 질병 증상의 중증도의 감소, 질병 증상이 없는 기간의 빈도와 지속시간의 증가, 또는 질병 고통으로 인한 장애 또는 무능력의 예방을 일으킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 하나 이상의 투여 경로에 의해 투여할 수 있다. 당업자가 이해할 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 변할 것이다. 본 발명의 항체에 대한 투여 경로는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피부내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 어구 "비경구 투여"는 본원에서 사용될 때 장관 및 국소 투여 이외의, 대체로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 거미막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
별법으로, 본 발명의 항체는 비경구가 아닌 경로에 의해, 예를 들어 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어, 비강내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소로 투여할 수 있다.
활성 화합물은 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화 (microencapsulated) 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제형과 같이 신속한 방출로부터 화합물을 보호할 담체와 함께 제조할 수 있다. 생분해성 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 그러한 제형의 많은 제조 방법은 특허로 등록되었거나 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다 (예를 들어, [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조).
치료 조성물은 당업계에 공지된 의학 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 본 발명의 치료 조성물은 무침 피하 주사 장치, 예를 들어 미국 특허 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 또는 4,596,556에 제시된 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 공지된 임플란트 및 모듈의 예는 제어된 속도로 약물을 분배하기 위한 이식가능한 미세-주입 펌프를 제시하는 미국 특허 4,487,603; 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료 장치를 제시하는 미국 특허 4,486,194; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 제시하는 미국 특허 4,447,233; 연속적 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능 주입 장치를 제시하는 미국 특허 4,447,224; 다챔버 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 제시하는 미국 특허 4,439,196; 및 삼투 약물 전달 시스템을 제시하는 미국 특허 4,475,196을 포함한다. 이들 특허는 본원에 참조로 포함된다. 많은 다른 그러한 임플란트, 전달 시스템, 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체 내에서 적합한 분포를 보장하기 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 혈액 뇌 장벽 (BBB)은 많은 고친수성 화합물을 차단한다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 가로지르도록 (원하는 경우에) 보장하기 위해, 이들을 예를 들어 리포좀 내에 제형화할 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포좀은 특이적 세포 또는 장기 내로 선택적으로 수송되어, 표적화된 약물 전달을 향상시키는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문허 [V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어 미국 특허 5,416,016 (Low et al.) 참조); 만노시드 (Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체 ([P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140]; [M. Owais et al,, 1995 Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함한다 (문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBS Lett. 346:123]; [J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273]을 또한 참조한다).
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체는 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 효용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 다양한 질환을 치료, 예방 또는 진단하기 위해 세포에 배양액 내에서, 예를 들어 시험관 내에서 또는 생체 내에서, 또는 대상에서, 예를 들어, 생체 내에서 투여할 수 있다. 용어 "대상"은 본원에서 사용할 때 인간 또는 비인간 동물을 포함하도록 의도된다. "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어,포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다.
방법은 스클레로스틴-관련 질환 및/또는 비정상적인 골 무기질 밀도 질환, 예를 들어, 골다공증의 치료, 예방 또는 진단에 특히 적합하다.
또한, 본 발명은 골의 무기질 함량 및/또는 무기질 밀도를 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 조성물은 정형외과 처치, 치과 처치, 임플란트 이식술, 관절 대치술, 골 이식, 골 성형 수술 및 골 회복, 예를 들어 골절 치유, 불유합 치유, 지연 유합 치유 및 안면 재구성에서 성과를 개선하기 위해 유용할 수 있다. 하나 이상의 조성물이 처치, 대치술, 이식, 수술 또는 회복 전, 동안 및/또는 후에 투여될 수 있다.
본원에서 사용할 때 "스클레로스틴-관련 질환"은 골 무기질 밀도 (BMD)가 건강한 대상에 비해 비정상적으로 및/또는 병리학적으로 낮은 질환을 포함한다. 낮은 BMD 및/또는 뼈 허약을 특징으로 하는 질환은 원발성 및 속발성 골다공증, 골감소증, 골연화증, 불완전 골생성증 (OI), 무혈관 괴사 (골괴사), 골절 및 임플란트 치유 (치과 임플란트 및 고관절 (hip) 임플란트), 다른 질환으로 인한 골 손실 (예를 들어, HIV 감염, 암 또는 관절염과 연관된)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 "스클레로스틴-관련 질환"은 류마티스 관절염, 골관절염, 관절염, 및 골용해성 병변의 형성 및/또는 존재를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용할 때 "스클레로스틴-관련 질환"은 비정상적인 스클레로스틴 수준과 연관되거나 특징으로 하는 병태를 포함한다. 이들 질환은 암 및 골다공증 병태 (예를 들어, 골다공증 또는 골감소증)를 포함하고, 그 중 일부는 본원에서 정의되는 "스클레로스틴-관련 질환"과 중복된다. 스클레로스틴-관련 암은 골수종 (예를 들어, 골용해성 병변이 있는 다발 골수종), 유방암, 결장암, 흑색종, 간세포암, 상피암, 식도암, 뇌암, 폐암, 전립선암 또는 췌장암 및 그의 임의의 전이를 포함할 수 있다.
또한, "스클레로스틴-관련 질환"은 적어도 신장 및 심혈관에서 스클레로스틴의 발현으로 인한 신장 및 심혈관 병태를 포함할 수 있다. 상기 질환은 사구체 질병 (예를 들어, 전신 홍반성 루푸스, 굳파스쳐 (Goodpasture) 증후군, 다발성 골수종, 당뇨병, 다낭성 신장 질병, 신생물, 겸상적혈구 질병, 및 만성 염증성 질병과 같은 전신 질병과 연관된 급성 및 만성 사구체신염, 급속히 진행되는 사구체신염, 신 증후군, 초점성 증식성 사구체신염, 사구체 병변), 세뇨관 질병 (예를 들어, 급성 세뇨관 괴사 및 급성 신 부전증, 다낭성 신장 질병, 수질성 해면 신장, 수질성 낭성 질병, 신성 당뇨병, 및 신 세뇨관 산성증), 세뇨관간질 질병 (예를 들어, 신우신염, 약물 및 독소 유발 세뇨관간질 신장염, 고칼슘혈성 신병증, 및 저칼륨혈성 신병증), 급성 및 급속히 진행되는 신 부전증, 만성 신 부전증, 신결석증, 통풍, 혈관 질병 (예를 들어, 고혈압 및 신장경화증, 미세혈관병성 용혈 빈혈, 신동맥 죽상색전성 신장 질병, 미만성 피질 괴사, 및 신경색증), 또는 종양 (예를 들어, 신세포 암종 및 신장모세포종)과 같은 신장 질환을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
또한, 상기 질환은 또한 허혈성 심장 질병 (예를 들어, 협심증, 심근 경색, 및 만성 허혈성 심장 질병), 고혈압성 심장 질병, 폐성 심장 질병, 판막성 심장 질병 (예를 들어, 류마티스열 및 류마티스 심장 질병, 심내막염, 승모판 탈출증, 및 대동맥판 협착증), 선천 심장 질병 (예를 들어, 판막 및 혈관 폐쇄성 병변, 심방 또는 심실 중격 결손, 및 동맥관 개존증), 또는 심근 질병 (예를 들어, 심근염, 울혈성 심근병증, 및 비대 심근병증)과 같은 심혈관 질환을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
스클레로스틴에 대한 항체를 다른 물질과 함께 투여할 경우, 두 물질을 임의의 순서로 (즉, 순차적으로) 또는 동시에 투여할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 다른 요법, 예를 들어 골다공증 요법에서와 같이 골 흡수 억제제를 사용하는 요법, 특히 칼슘, 칼시토닌 또는 그의 유사체 또는 유도체, 예를 들어 연어, 뱀장어 또는 인간 칼시토닌, 칼슘수용체 길항물질, 칼슘유사 작용제 (예를 들어, 시나칼세트), 스테로이드 호르몬, 예를 들어 에스트로겐, 부분 에스트로겐 효능제 또는 에스트로겐-게스타겐 복합제, SERM (선택적 에스트로겐 수용체 조정제), 예를 들어 랄록시펜, 라소폭시펜, 바제독시펜, 아르족시펜, FC1271, 티볼론 (리비알 (Livial)®), SARM (선택적 안드로겐 수용체 조정제), RANKL 항체 (예를 들어, 데노수맙), 카텝신 K 억제제, 비타민 D 또는 그의 유사체, 또는 PTH, PTH 단편 또는 PTH 유도체, 예를 들어 PTH (1-84) (예를 들어 프레오스(Preos)™), PTH (1-34) (예를 들어 포르테오(Forteo)™), PTH (1-36), PTH (1-38), PTH (1-31)NH2 또는 PTS 893을 사용하는 요법에 부가 또는 보조제로서 사용될 수 있다. 다른 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 비스포스포네이트 (예를 들어, 포사맥스™ (알렌드로네이트), 악토넬™ (리세드로네이트 나트륨), 본비바™ (이반드론산), 조메타™ (졸레드론산), 아클라스타(Aclasta)™/레클라스트(Reclast)™ (졸레드론산), 올파드로네이트, 네리드로네이트, 스케리드, 보네포스), 스타틴, 동화 스테로이드, 란탄 및 스트론튬 염, 및 불화나트륨을 포함한 현재의 다른 골다공증 요법 방안과 조합으로 사용될 수 있다.
하나의 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 LRP4 조정 물질, 즉, LRP4, 예를 들어 LRP4 중화 항체의 발현 또는 활성을 조정하는 물질과 조합으로 투여될 수 있다.
다른 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 DKK1 조정 물질, 즉, Wnt 신호전달의 Dkk-1 매개 길항작용을 저해 또는 중화하는 물질, 예를 들어 DKK1 중화 항체와 조합으로 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 스클레로스틴에 의해 매개되거나 증가된 수준의 스클레로스틴과 연관되는 병리학적 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 항체 또는 기능성 단백질, 및 (i) 졸레드론산, (ii) 항-DKK1 항체, (iii) 알렌드로네이트, (iv) 항-LRP4 항체, (v) hPTH 및/또는 (vi) 부갑상선 호르몬 방출 물질 (칼슘수용체 길항물질)의 용도를 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 스클레로스틴에 의해 매개되거나 증가된 수준의 스클레로스틴과 연관되는 병리학적 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 항체 또는 기능성 단백질의 용도를 제공하고, 여기서 의약은 (i) 졸레드론산, (ii) 항-DKK1 항체, (iii) 알렌드로네이트, (iv) 항-LRP4 항체, (v) hPTH 및/또는 (vi) 부갑상선 호르몬 방출 물질 (칼슘수용체 길항물질)과 함께 사용된다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 스클레로스틴에 의해 매개되거나 증가된 수준의 스클레로스틴과 연관되는 병리학적 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 (i) 졸레드론산, (ii) 항-DKK1 항체, (iii) 알렌드로네이트, (iv) 항-LRP4 항체, (v) hPTH 및/또는 (vi) 부갑상선 호르몬 방출 물질 (칼슘수용체 길항물질)의 용도를 제공하고, 여기서 의약은 본 발명의 항체 또는 기능성 단백질과 함께 사용된다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 스클레로스틴에 의해 매개되거나 증가된 수준의 스클레로스틴과 연관되는 병리학적 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 항체 또는 기능성 단백질의 용도를 제공하고, 여기서 환자는 (i) 졸레드론산, (ii) 항-DKK1 항체, (iii) 알렌드로네이트, (iv) 항-LRP4 항체, (v) hPTH 및/또는 (vi) 부갑상선 호르몬 방출 물질 (칼슘수용체 길항물질)이 사전에 투여된 환자이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 스클레로스틴에 의해 매개되거나 증가된 수준의 스클레로스틴과 연관되는 병리학적 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 (i) 졸레드론산, (ii) 항-DKK1 항체, (iii) 알렌드로네이트, (iv) 항-LRP4 항체, (v) hPTH 및/또는 (vi) 부갑상선 호르몬 방출 물질 (칼슘수용체 길항물질)의 용도를 제공하고, 여기서 환자는 본 발명의 항체 또는 기능성 단백질이 사전에 투여된 환자이다.
상기 열거한 조합의 한 실시태양에서, hPTH는 hPTH(1-34)이다.
한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 스클레로스틴의 수준, 또는 스클레로스틴을 함유하는 세포의 수준을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어 샘플 (예를 들어 시험관내 샘플) 및 대조 샘플을 항-스클레로스틴 항체와, 항체와 스클레로스틴 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 접촉시킴으로써 달성할 수 있다. 샘플 및 대조군 내에서 항체와 스클레로스틴 사이에 형성된 임의의 복합체를 검출하고 비교한다. 예를 들어, 당업계에 공지된 표준 검출 방법, 예를 들어 ELISA 및 유동 세포측정 분석이 본 발명의 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 샘플 및 대조 샘플을 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 구역과, 항체 또는 그의 일부와 스클레로스틴 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 내에서 스클레로스틴 (예를 들어, 인간 스클레로스틴 항원)의 존재를 검출하거나 스클레로스틴의 양을 측정하는 방법을 또한 제공한다. 이어서, 복합체의 형성을 검출하고, 여기서 대조 샘플에 비해 샘플 사이의 복합체 형성의 차이가 샘플 내의 스클레로스틴의 존재를 나타낸다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 항체, 인간 항체 및 이중특이적 분자) 및 사용을 위한 설명서로 이루어지는 키트가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 키트는 1종 이상의 추가의 시약, 또는 본 발명의 하나 이상의 추가의 항체 (예를 들어, 제1 항체와 구분되는 표적 항원 상의 에피토프에 결합하는 상보성 활성을 갖는 항체)를 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 본 발명의 항체 또는 기능성 단백질, 및 하나 이상의 (i) 졸레드론산, (ii) 항-DKK1 항체, (iii) 알렌드로네이트, (iv) 항-LRP4 항체, (v) hPTH 및 (vi) 부갑상선 호르몬 방출 물질 (칼슘수용체 길항물질)을 포함할 수 있다. 키트는 일반적으로 키트의 내용물의 의도된 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 제공되거나 키트에 달리 수반되는 임의의 필기 또는 기록물을 포함한다.
본 발명을 충분히 설명하였지만, 다음 실시예 및 청구의 범위에 의해 추가로 예시되고, 이는 단지 예시적인 것으로서 본 발명을 추가로 제한하지 않는다. 당업자는 본원에서 설명되는 특정 절차의 수많은 균등물을 단지 일상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있다. 그러한 균등물은 본 발명의 범위 및 특허청구범위 내에 있다. 본원 전체에서 인용되는 등록된 특허 및 공개된 특허 출원을 비롯한 모든 참조문의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
실시예 :
기능성 분석
알칼린 포스파타제 분석 ( ALP )
세포
MC3T3 1b 세포는 OSE2-luc를 발현하는 MC3T3-JP 세포의 클론이다. 상기 클론은 pcDNA3.1+ 내의 8x-OSE2wt-mOG2luc를 사용하는 MC3T3-JP (MC3T3-E1 마우스 골모세포, 저팬 클론 (Japan clone, 일본); 고꾸보 박사 (Dr. T. Kokkubo, 노바티스 (Novartis, 일본) 제공)의 안정한 형질감염 후에 수득하였다.
배양 배지
MC3T3-1b 세포를 10％ 우태 혈청 (FCS; 아미메드 (Amimed) Cat#2-01F100-1), 2 mM L-글루타민 (깁코 (Gibco) Cat#25030-024), 50 IU 페니실린/50 ㎍/ml 스트렙토마이신 (아미메드 Cat#4-01F00-H) 및 10 mM Hepes (깁코 Cat#15630-056) 및 0.75 mg/ml G418 (깁코 Cat#10131-027)을 보충한 최소 필수 배지 알파 (MEMα; 인비트로겐 (Invitrogen), Cat#22561-021) 내에서 일상적으로 배양하였다 (유지 배양 배지).
원액
DMEM-LG 중 10 mM 아스코르브산 (와코 퓨어 케미칼 (Wako Pure Chemical) Cat#013-12061), 5 mM 아세트산 중 14 nM BMP-2 (R&D Cat#355-BM-010), 및 0.1％ 소 혈청 알부민 (BSA, 시그마 Cat#A-8806); 타이로드 (Tyrode) 용액 중 1 M β-글리세로포스페이트 (시그마 Cat#G9891); 타이로드 용액: 1 L H2O 중 9.72 g 타이로드 염 (시그마 Cat#T2145) 및 1 g NaHCO3, ALP 기질 버퍼: 25 mM 글라이신 및 0.5 mM MgCl2 (pH 10.5); ALP 기질 용액: 3.75 ml ALP 기질 버퍼 (pH 10.5) 중 5 mg p-니트로페닐 포스페이트 (시그마 104 기질, 시그마 Cat#50942-200TAB); ALP 기질 용액 중 1 mM p-니트로페놀 (시그마 Cat#104-1).
분석
ALP 분석을 위해, MC3T3 1b 세포를 분석 배양 배지 (G418 부재 하의 유지 배양 배지에 대응함) 내에 성장시켰다. MC3T3 1b를 200 ㎕ 내에, 유도를 72h 후에 시작하는 경우에 3x104 세포/ml 또는 유도를 96h 후에 시작하는 경우에는 2x104 세포/ml로 접종하였다. 플레이트를 72h 또는 96h 동안 37℃ 및 5％ CO2에서 인큐베이팅한 후, 완전 배지를 사용하여 유도를 시작하였다 (배양 배지를 10 mM b-글리세로-포스페이트 (bGP) 및 50 μM 아스코르브산 (AA)으로 보충함으로써). 시험할 항체를 완전 배지로 희석하였다. 항체를 BMP-2 (0.7 nM) 및 스클레로스틴 (50 nM)과 함께 웰 (삼중)에 200 ㎕ 완전 배지의 최종 부피로 첨가하였다. 각각의 플레이트 상에서, 4개의 내부 대조군을 삼중으로 포함시켰다: 용매 대조군 (BSA), BMP-2 대조군 (0.7 nM), BMP-2 + 스클레로스틴 (BMP-2 (0.7 nM) 및 스클레로스틴 (50 nM)) 및 스클레로스틴 대조군 (50 nM). 플레이트를 추가 72h 동안 37℃ 및 5％ CO2에서 인큐베이팅하였다. 유도 기간의 끝에, 배지를 제거하고 150 ㎕ ALP 기질 용액 (새로 제조된)을 각각의 웰에 첨가함으로써 분석을 종료하였다. 플레이트를 3 - 30 min 동안 인큐베이팅하였다. 100 ㎕의 1M NaOH를 첨가하여 반응을 중지시키고, 플레이트를 플레이트 진탕기 (Plateshaker) 상에서 진탕하였다. OD를 405 nm에서 블랭크와 비교하여 판독하고, ALP 활성을 nmol/min으로 계산하였다. 50 nM 스클레로스틴을 사용하여 BMP-2 유도된 ALP 생산 [0.7 nM BMP-2]의 70％ 이상의 억제를 얻었다.
WNT -분석
본 분석은 STF 리포터 유전자의 Wnt1-매개 유도를 억제하는 스클레로스틴의 능력을 기초로 하여 항체를 시험하기 위해 확립되었다.
HEK293 세포의 형질감염
제1일에, HEK293 세포를 항생제가 없는 10％ 우태 혈청 (FCS), 1％ L-글루타민 (깁코, Cat #25030.024), 1％ 비-필수 아미노산 (깁코, cat #11140)을 함유하는 DMEM (깁코, Cat#61965-026) 내에 24-웰 폴리-D-라이신 플레이트 (BD-BioCoat #356414)에서 1.3-1.4 x 105 세포/웰 (0.5 ml 부피 내에)로 접종하였다. 형질감염은 제2일에 리포펙타민 2000 (인비트로겐, Cat#11668-019)을 사용하여 수행하였다. 형질감염시킬 각각의 웰에 대해, 다음 양의 플라스미드를 50 ㎕ OptiMEM®I (깁코, Cat#31985-047)의 최종 부피에 첨가하였다: 대조 웰 (pcDNA3+, 480 ng; SuperTopFlash (STF) 20 ng; phRL-CMV, 0.5 ng) 및 Wnt1 처리 웰 (pcDNA-wnt1, 20 ng; pcDNA3+, 460 ng; SuperTopFlash (STF) 20 ng; phRL-CMV, 0.5 ng).
제2 튜브 내에서, 1.6 ㎕의 리포펙타민 2000을 50 ㎕의 OptiMEM®I 내로 희석하고 실온에서 5분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 지질 튜브의 내용물을 DNA 튜브에 첨가함으로써 2개의 튜브의 내용물을 혼합하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하여 DNA-지질 복합체 형성을 허용하였다. 이어서, DNA-지질 복합체 (100 ㎕)를 웰에 균등하게 첨가하고, 37℃에서 5％ CO2 내에서 5시간 동안 인큐베이팅하였다. 5-시간 인큐베이션의 끝에, 세포는 시험 시약, 예를 들어 SOST, 항체 등을 사용한 처리를 위해 준비되었다.
SOST-용량 의존 억제의 확립
용량 억제 곡선을 확립하기 위해, 항생제가 없는 10％ FCS, 1％ L-글루타민 및 1％ 비-필수 아미노산을 함유하는 DMEM 중 rhSOST의 일련의 2배 희석액 (160 nM에서 시작함)을 제조하였다. 원액 rhSOST의 농도는 1％ FCS를 함유하는 DMEM 중의 260 ㎍/ml이었다. 통상적으로, 각각의 조건을 이중으로 시험하였다. 따라서, 각각의 조건에 대해 1 ml의 배지를 제조하고, 형질감염 믹스를 함유하는 배지를 웰로부터 제거한 후 웰 당 450 ㎕을 첨가하였다. 처리 시간은 18-20시간이었다. 인큐베이션의 끝에, 루시퍼라제 분석을 아래에 개략한 바와 같이 수행하였다.
항-SOST 항체의 시험
항체를 SOST와 예비혼합한 후 세포에 첨가하였다. 이 목적을 위해, 20 내지 30 nM의 rhSOST를 함유하는 DMEM 배지 (항생제가 없는 10％ FCS, 1％ L-글루타민 및 1％ 비-필수 아미노산)를 제조하였다. 이어서, 시험된 항체의 상이한 희석액을 실험 설계에 따라 SOST 함유 배지에 첨가하였다. 이들 믹스를 처리 40분 전에 제조하였다. 각각의 조건은 일상적으로 이중으로 시험하였다. 이를 위해, 각각의 조건에 대해 1 ml의 배지를 제조하고, 형질감염 믹스를 함유하는 배지를 웰로부터 제거한 후 웰 당 450 ㎕을 첨가하였다. 처리 시간은 18-20시간이었다. 인큐베이션의 끝에, 루시퍼라제 분석을 아래에 개략한 바와 같이 수행하였다.
루시퍼라제 분석
인큐베이션의 끝에, 배지를 제거하고, 300 ㎕의 1X 수동성 용해 버퍼 (프로메가 (Promega), Cat#E194A)를 첨가하여 세포를 용해시켰다. 이어서, 30 ㎕의 용해물을 사용하여 Dual-Glo 루시퍼라제 시스템 (프로메가, Cat#E2940)을 이용하여 루시퍼라제 활성을 이중으로 측정하였다. 분석은 키트와 함께 제공되는 지시 책자에 따라 수행하였다. 일반적으로, 30 ㎕의 Dual-Glo 루시퍼라제 (반딧불이 루시퍼라제; STF에 대해) 및 30 ㎕의 Dual-Glo Stop 및 Glo (레닐라 (Renilla) 루시퍼라제; 형질감염 효율 대조군에 대해) 기질을 사용하였다. 발광 신호를 Mithras LB940 기기 (버톨드 테크놀로지스 (Berthold Technologies))를 사용하여 측정하였다.
데이타 계산
반딧불이 루시퍼라제 대 레닐라 루시퍼라제의 비를 계산하였다. SOST가 없는 Wnt1의 값을 1로 설정함으로써 최종 결과를 표현한다.
무기질화 분석
세포
MC3T3 1b 세포는 OSE2-luc를 발현하는 MC3T3-JP 세포의 클론이다. 상기 클론은 pcDNA3.1+ 내의 8x-OSE2wt-mOG2luc를 사용하는 MC3T3-JP (MC3T3-E1 마우스 골모세포, 저팬 클론; 고꾸보 박사 제공, 노바티스, 일본)의 안정한 형질감염 후에 수득하였다.
배양 배지
MC3T3-1b 세포를 10％ 우태 혈청 (FCS; 아미메드 Cat#2-01F100-1), 2 mM L-글루타민 (깁코 Cat#25030-024), 50 IU 페니실린/50 ㎍/ml 스트렙토마이신 (아미메드 Cat#4-01F00-H) 및 10 mM Hepes (깁코 Cat#15630-056) 및 0.75 mg/ml G418 (깁코 Cat#10131-027)을 보충한 최소 필수 배지 알파 (MEMα; 인비트로겐, Cat#22561-021) 내에서 일상적으로 배양하였다 (유지 배양 배지).
무기질화 분석
웰 내에 침착된 매트릭스-회합 칼슘을 MC3T3-1b 세포 내에서 칼슘 키트 (액손 랩 (Axon Lab), Cat#AXON0012)를 사용하여 결정하였다. 세포 반응성을 개선하기 위해 세포를 96-웰 플레이트 내에서 100 ㎕ 분석 배양 배지 (G418이 없는 유지 배양 배지) 내에 6x103 세포/웰 또는 2x103 세포/웰로 접종하고, 전면성장 (confluence)에 도달하도록 3일 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 분석 배양 배지를 교환하고, 시험할 화합물을 10 mM b-글리세로-포스페이트 (bGP; 시그마 Cat#G9891) 및 50 μM 아스코르브산 (AA; 와코 퓨어 케미칼 Cat#013-12061)과 함께 첨가하였다. 이들을 세포에 첨가하기 전에, 스클레로스틴 및 시험할 Fab를 별개의 플레이트 내에서 2h 동안 실온에서 예비-인큐베이팅하고; 그 동안 분석 96 웰-플레이트에 2.1 또는 2.8 nM BMP-2 (R&D 시스템즈, Cat#355-BM-010)를 도입한 후, 스클레로스틴-Fab 믹스를 제공하였다. 세포를 14일 동안 인큐베이팅하고, 분석 배지를 3-4일마다 교체하였다. 간단히 설명하면, 인큐베이션의 끝에, 세포를 200 ㎕의 PBS/웰로 2회 세척하고, 50 ㎕의 0.5 M HCl을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 -20℃에서 최소 24h 동안 동결시켰다. 적절한 시간에, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 해동시키고, 10 ㎕의 각각의 웰을 새로운 96-웰 플레이트 내에 옮겼다. 이어서, 칼슘 작업 용액 (1:5)을 첨가하고 (200 ㎕), 5-30분 후에, 플레이트를 마이크로플레이트 판독기 상에서 595 nm에서 판독하였다.
흡광도를 표준 곡선에 따라 칼슘의 ㎍로 번역하고, 대조 웰 (아스코르브산 및 베타-글리세로포스페이트) 값을 각각의 데이타 웰로부터 공제하고, 최종 결과를 BMP-2-유도된 무기질화의 ％로서 표현하였다.
SMAD1 인산화 웨스턴
물질
MC3T3-E1 마우스 골모세포 (저팬 클론, 고꾸보 박사 제공, 노바티스, 일본)
C3H10T1/2 세포 (마우스 배아 중간엽; ATCC, Cat. Nb.: CCL-226)
SCL 비-글리코실화, 이. 콜라이 유래 (노바티스, PSU5257)
15N SCL 비-글리코실화, 이. 콜라이 유래 (노바티스, PSU11274)
hSOST-APP, 글리코실화, HEK-EBNA 유래 (노바티스, BTP11100)
rhSCL, 글리코실화, 마우스 골수종 세포 유래 (R&D 시스템즈, Cat. Nb.: 1406-ST/CF)
항hSOST 항체 (R&D 시스템즈, Cat. Nb.: AF1406)
PhosphoSafe 추출 시약 (노바겐 (Novagen), Cat. Nb.: 71296-3)
프로테아제 억제제 칵테일 세트 III (칼비오켐 (Calbiochem), Cat. Nb.: 539134)
NuPAGE Novex Tris-아세테이트 겔 7％ 1.5 mm, 15웰 (인비트로겐, Cat. Nb.: EA03585)
Tris-아세테이트 SDS 전개 버퍼 20x (인비트로겐, Cat. Nb.: LA0041)
NuPAGE 항산화제 (인비트로겐, Cat. Nb.: NP0005)
Immobilon-P 전달막 (Transfer Membrane) 0.45 ㎛ (밀리포어 (Millipore), Cat. Nb.: IPVH00010)
Wattman 크로마토그래피 종이 (머크 (Merck), Cat. Nb.: 3587600)
XCell SureLock Mini-Cell 및 XCell II 블롯 모듈 (인비트로겐)
VersaMax 마이크로플레이트 판독기 (Bucher)
세포 배양 및 추출
MC3T3-E1 및 C3H10T1/2 세포를 각각 최소 필수 배지 알파 (MEMα; 인비트로겐, Cat#22561-021) 내에서 또는 고 글루코스를 함유하는 DMEM (인비트로겐, Cat#41965-039) 내에서 일상적으로 배양하였다. 모든 배양 배지에 10％ 우태 혈청 (FCS; 바이오콘셉트 (BioConcept) Cat#2-01F10-I, 로트 Z04459P), 2 mM L-글루타민 (인비트로겐 Cat#25030-024), 50 IU 페니실린/50 ㎍/ml 스트렙토마이신 (인비트로겐 Cat#15140-122) 및 10 mM Hepes (인비트로겐 Cat#15630-056)를 보충하였다 (유지 배양 배지).
세포를 6웰 플레이트 (3 ml/웰)에서 유지 배양 배지 내에 접종하고 전면성장까지 성장시켰다 (1.4x105 MC3T3-1b 세포/웰을 사용하면, 전면성장은 제3일에 도달하였고; 1.0x105 C3H10T1/2 세포/웰을 사용하면, 전면성장은 제3일에 도달하였다). 1％ FBS를 함유하는 배양 배지 내에서 밤새 혈청 고갈시킨 후, 배지를 1％ FBS, BMP-6 (R&D 시스템즈, Cat#507-BP) 및 시험할 물질(들)을 보충한 신선한 배지로 교체하였다. 세포에 첨가하기 전에, BMP-6 및 시험할 물질(들)을 C3H10T1/2 내의 phospho-Smad1/3/5에 대해 설명한 바와 같이 (Winkler, EMBO J., 2003, 22(23):6267-76) 1 h 동안 실온에서 예비-인큐베이팅하였다. 항-스클레로스틴 항체를 시험할 때, 이들을 스클레로스틴과 함께 4℃에서 밤새 예비-인큐베이팅한 후, 0.2 nM BMP-6과 함께 1h 동안 실온에서 인큐베이팅하고, 마지막으로 융합성 세포에 첨가하였다. 적절한 처리 시간 후에, 세포를 2 ml 빙냉 PBS로 세척하였다. 이어서, 100 ㎕/웰의 PhosphoSafe 추출 시약 및 1:200 희석된 프로테아제 억제제 칵테일을 세포에 첨가한 후, 이를 얼음 상에서 5 min 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 웰로부터 긁어내어 미세원심분리관에 옮겼다. 세포 추출액을 5 min마다 볼텍스 (vortex) 단계로 차단하면서 얼음 상에서 15 min 동안 유지하였다. 그 후, 세포 추출액을 5 min 동안 16,000g 및 4℃에서 원심분리하였다. 마지막으로, 단백질 결정을 위해 상등액을 새로운 미세원심분리관에 옮겼다.
세포 용해물 내의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 결정하였다. BSA를 표준품으로서 사용하였다. 변성을 위해, 세포 용해물을 Laemmli 버퍼 (바이오-라드 (Bio-Rad), Cat#161-0737, 새로 첨가한 β-머캅토에탄올 (1:20, 머크, Cat#1.12006) 함유)로 1:2 희석하고, 5 min 동안 95℃에서 비등시켰다. 냉각시킨 후, 샘플을 추가로 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
웨스턴 블롯
Smad (H-465) 항체 (산타 크루즈 (Santa Cruz), Cat. Nb.: sc-7153)는 인간 기원의 전장 Smad1을 나타내는 아미노산 1-465에 대해 생성된 토끼 폴리클로날 IgG이다. 이는 인간, 래트 및 마우스 기원의 Smad1, Smad2, Smad3, Smad5 및 Smad8을 인식할 것이다. Phospho-Smad1 (Ser463/465)/Smad5 (Ser463/465)/Smad8 (Ser426/428) 항체 (셀 시그널링 (Cell Signalling), Cat#9511)은 인간 mad5의 Ser463/465를 둘러싸는 잔기에 대응하는 합성 포스포-펩티드에 대해 생성된 토끼 폴리클로날 IgG이다. 이는 Smad1의 내인성 수준 (세린 463 및 세린 465에서 이중 인산화될 때에만)뿐만 아니라 Smad5 및 Smad8 (인간, 마우스, 래트, 밍크 및 제노푸스 (xenopous) 기원의 동등한 부위에서 인산화될 때에만)을 검출할 것이다. 항체는 다른 Smad-관련 단백질과 교차-반응하지 않는다.
XCell SureLock Mini Cell 시스템 (인비트로겐)을 제조자의 지시에 따라 준비하였다. 단백질 샘플 (Smad 분석의 경우 2 ㎍, Phospho-Smad 웨스턴 분석의 경우 5 ㎍)을 동일 최종 부피로 7％ NuPAGE Novex Tris-아세테이트 겔 상에 1x 전개 버퍼 내에 로딩하였다. SeeBlue Plus2 예비-염색된 표준품 (10 ㎕, 1:10; 인비트로겐, Cat# LC5925) 및 MagicMark XP 웨스턴 단백질 표준품 (10 ㎕, 1:100; 인비트로겐, Cat#; LC5602)을 분자량 마커로서 사용하였다. 겔을 75 min 동안 일정한 전압 (150 V)으로 전개시켰다.
블로팅 패드 및 여과지를 700 ml 1x NuPAGE 전달 버퍼 내에 침액시켰다. PVDF 전달막을 먼저 30 sec 동안 메탄올 내에 침액시킨 후, 1x NuPAGE 전달 버퍼 (인비트로겐, Cat#NP0006, 새로 제조된 전달 버퍼:메탄올 10:1) 내에 옮겼다. 겔 카세트 (cassette) 플레이트를 겔 나이프 (knife)를 사용하여 분리시키고, 하나의 예비-침액시킨 여과지를 겔의 상부에 놓고, 임의의 포획된 기포를 조심스럽게 제거하였다. 플레이트를 Saran 랩 (wrap) 상에 뒤집어 놓고, 플레이트를 제거한 후, 예비-침액시킨 전달막을 겔 상에 놓고 임의의 기포를 제거하였다. 제2의 예비-침액시킨 여과지를 상부에 놓고 임의의 기포를 제거하였다. 2개의 침액시킨 플래팅 (platting) 패드를 Cell II 블롯 모듈의 캐소드 (cathode) 코어에 넣었다. 겔/막 샌드위치를 조심스럽게 집어올려 블로팅 패드 상에 놓았다 (겔을 캐소드 코어에 가장 가깝게). 마지막으로, 3개의 예비-침액시킨 블로팅 패드를 막 조립체 상에 놓고, 애노드 (anode) 코어를 상단부에 첨가하였다. 블롯 모듈을 하부 버퍼 챔버 상의 가이드 레일 (guide rail) 내로 밀어넣고, 제조자의 지시에 따라 웨지 (wedge)를 제자리에 잠갔다. 겔/막 조립체가 덮일 때까지 블롯 모듈을 1x NuPAGE 전달 버퍼로 채웠다. 외부 버퍼 챔버를 650 ml 탈이온수로 채우고, PVDF 막으로 단백질 전달을 일정한 전압 (30 V)을 이용하여 2시간 동안 수행하였다.
블로팅 후에, 막을 먼저 10 min 동안 PBS 중의 0.05％ Tween 20 내에서 세척한 후, 부드럽게 진탕하면서 1시간 동안 25 ml SuperBlock T20 차단 버퍼 내에서 실온에서 차단하였다. 1차 항체 (Phospho-Smad 1/5/8 또는 Smad (H-465))를 막에 SuperBlock T20 차단 버퍼 (피어스, Cat#37516) 내에 1:1000 희석하여 첨가하고, 막을 진탕하면서 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 막을 10 min 동안 PBS 중의 0.05％ Tween 20 (플루카 (Fluka), Cat#93773)로 3회 세척한 후, RP-컨쥬게이팅된 2차 항체 (SuperBlock T20 차단 버퍼 중 1:1000)와 함께 60 min 동안 실온에서 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 각각 10 min의 3회 이상 세척 단계를 수행한 후, 막을 5 min 동안 SuperSignal West Femto 기질 작업 용액 (피어스, Cat#34095)과 함께 인큐베이팅하였다. 마지막으로, 막을 플라스틱 포켓 내에 넣고, Fluor-S MultiImager (바이오-라드) 및 카메라를 사용하여 영상화하였다. 30 sec 내지 5 min에 취한 영상들을 비교함으로써 1 내지 2 min의 최적 노출 시간이 결정되었다.
데이타 분석
화학발광 활성은 Quantity One (바이오-라드)를 사용하여 측정하고, EC50 값은 XLfit4 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 각각의 phospho-Smad 신호를 그의 상응하는 총 Smad 신호에 의해 표준화하였다.
LRP6 / 스클레로스틴 ELISA
96-웰 미량역가 비-시험된 플레이트를 PBS 내에 희석시킨 LRP6/Fc (1 ㎍/ml, R&D 시스템즈, Cat#1505-LR)로 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 비-특이적 결합 (NSB)에 대해 대조군으로서, 몇몇 웰을 100 ㎕/웰의 PBS로 채웠다. 플레이트를 플라스틱 필름으로 덮고, RT에서 밤새 인큐베이팅하였다. 코팅 후에, 플레이트를 PBS 중의 0.05％ Tween 20 (플루카, Cat#93773)으로 200 ㎕/웰로 3회 세척하고, 웰을 TBS 중의 SuperBlock 차단 버퍼 (피어스, Cat#37535)를 300 ㎕/웰로 첨가함으로써 1h 동안 37℃에서 차단하였다. 인큐베이션 후에, 차단 용액을 제거하고, PBS 중 1％ BSA 내에 희석시킨 스클레로스틴 (이. 콜라이 유래, 노바티스; 1-1000 ng/ml)을 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 2h 동안 RT에서 인큐베이팅한 후, PBS 중의 0.05％ Tween 20을 200 ㎕/웰로 3회 세척하였다. 그 후, PBS 중 1％ BSA 내에 희석시킨 항-스클레로스틴 항체 (1 ㎍/ml)를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 플레이트를 2h 동안 RT에서 인큐베이팅한 후, PBS 중의 0.05％ Tween 20을 200 ㎕/웰로 3회 세척하였다. 마지막으로, PBS 중 1％ BSA (시그마 Cat. Nb.: A-7888) 내에 희석시킨 ALP 컨쥬게이팅된 항-염소 IgG Ab (1:5000; 시그마 Cat#A-7888)를 100 ㎕/웰로 1 h 동안 RT에서 첨가한 후, 플레이트를 PBS 중의 0.05％ Tween 20으로 200 ㎕/웰로 3회 세척하였다. ALP를 결정하기 위해, 100 ㎕/웰의 ALP 기질 (시그마, Cat#S0942) 용액 (1 정제/5 ml 디에탄올아민 기질 버퍼 1x; 피어스, Cat#34064)을 플레이트에 90 min 동안 첨가하고, 광학 밀도를 405 nm에서 측정하였다.
HEK293 세포 내에서 LRP4 과다발현
HEK293 세포 (ATCC Cat#CRL-1573)를 10％ FCS (바이오콘셉트 Cat#2-01F10-I, 로트 Z04459P), 2 mM L-글루타민 (인비트로겐 Cat#25030-024), 100 IU 페니실린/100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (인비트로겐 Cat#15140-122) 및 10 mM HEPES (인비트로겐 Cat#15630-056)을 보충한 DMEM/F12 (인비트로겐 Cat#21331-020) 내에서 일상적으로 배양하였다. Hek293 세포를 5x104 세포/웰로 폴리-D-라이신 48 웰-플레이트 포맷 상에 접종하고 24h 동안 인큐베이팅한 후, 리포펙타민 2000 (인비트로겐 Cat#11668-019)을 사용하는 형질감염을 수행하였다. 형질감염시킬 각각의 웰에 대해, 다음 양의 플라스미드를 25 ㎕ OptiMEM®I (깁코, Cat#31985-047)의 최종 부피에 첨가하고 부드럽게 혼합하였다: 대조 웰 (pmaxGFP, 62.5 ng, pcDNA3+, 125 ng; SuperTopFlash (STF) 62.5 ng; SV40-추진 레닐라 루시퍼라제 플라스미드, 0.75 ng) 및 Wnt1 처리 웰 (pmaxGFP, 62.5 ng, pcDNA-wnt1, 62.5 ng; pcDNA3+, 62.5 ng; SuperTopFlash (STF) 62.5 ng; SV40-추진 레닐라 루시퍼라제 플라스미드, 0.75 ng) 및 LRP4-Wnt1 처리 웰 (pcDNA3+-LRP4, 62.5 ng, pcDNA3+-wnt1, 62.5 ng; pcDNA3+, 62.5 ng; SuperTopFlash (STF) 62.5 ng; SV40-추진 레닐라 루시퍼라제 플라스미드, 0.75 ng). 제2 튜브 내에서, 0.8 ㎕의 리포펙타민 2000을 25 ㎕의 OptiMEM®I 내로 희석하고 실온에서 5분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 지질 튜브의 내용물을 DNA 튜브에 첨가함으로써 2개의 튜브의 내용물을 혼합하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하여 DNA-지질 복합체 형성을 허용하였다. 이어서, DNA-지질 복합체 (50 ㎕)를 웰에 균등하게 첨가하고, 37℃에서 5％ CO2 내에서 5시간 동안 인큐베이팅하였다. 5-시간 인큐베이션의 끝에, 세포는 시험 시약, 예를 들어 SOST, DKK1 (R&D Cat#1096-DK), 항체 등을 사용한 20h 처리를 위해 준비되었다. 루시퍼라제 분석은 "Wnt-분석" 하에 설명된 바와 같이 수행하였지만 대신에 150 ㎕ 수동성 용해 버퍼를 첨가하였다.
C28A2 세포 내에서 LRP4 과다발현
C28a2 세포 (매리 골딩 (Mary Goldring, 하버드 의학 연구소 (Harvard Institutes of Medicine, 미국 매사추세츠주 보스턴) 제공)를 HEK293 (상기 참조)과 동일한 배지 내에서 배양하였지만, HEPES가 존재하지 않고 비-필수 아미노산 (깁코 Cat#11140)의 보충물을 첨가하였다. C28a2 세포를 항생제가 없는 배양 배지 내에서 24-웰 플레이트 포맷 내에 1x105 세포/웰로 첨가하고, 밤새 인큐베이팅한 후, 리포펙타민 2000 (인비트로겐 Cat#11668-019)을 사용하는 형질감염을 수행하였다. 형질감염시킬 각각의 웰에 대해, 다음 양의 플라스미드 (총 600 ng/웰)를 50 ㎕ OptiMEM®I (깁코, Cat#31985-047)의 최종 부피에 첨가하고 부드럽게 혼합하였다: 대조 웰 (SuperTopFlash (STF) 100 ng; SV40-추진 레닐라 루시퍼라제 플라스미드, 2 ng 및 pcDNA3+, 500 ng 보충을 위해) 및 Wnt1 처리 웰 (pcDNA-wnt1 플라스미드, 100 ng; LRP5 플라스미드, 100 ng; SuperTopFlash (STF) 100 ng; SV40-추진 레닐라 루시퍼라제 플라스미드, 2 ng 및 pcDNA3+, 300 ng) 및 LRP4-Wnt1 처리 웰 (pcDNA-wnt1 플라스미드, 100 ng; LRP5 플라스미드, 100 ng; LRP4 플라스미드, 100 ng; SuperTopFlash (STF) 100 ng; SV40-추진 레닐라 루시퍼라제 플라스미드, 2 ng 및 pcDNA3+, 200 ng). 제2 튜브 내에서, 1.6 ㎕의 리포펙타민 2000을 48.4 ㎕의 OptiMEM®I 내로 희석하고 실온에서 5분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 지질 튜브의 내용물을 DNA 튜브에 첨가함으로써 2개의 튜브의 내용물을 혼합하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하여 DNA-지질 복합체 형성을 허용하였다. 이어서, DNA-지질 복합체 (100 ㎕)를 웰에 균등하게 첨가하고, 37℃에서 5％ CO2 내에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 2시간 인큐베이션의 끝에, 형질감염 배지를 450 ㎕/웰의 항생제-미함유 배지로 교체하고, 세포를 24 h 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 20h 동안 시험 시약, 예를 들어 SOST, 또는 DKK1 (R&D Cat#1096-DK)로 처리하였다. 루시퍼라제 분석은 "Wnt-분석" 하에 설명된 바와 같이 수행하였다.
HEK293 세포 내에서 LRP4 녹다운
Wnt1/STF/레닐라 Hek293 세포 (Wnt1 발현 플라스미드, SuperTopFlash 리포터 플라스미드, 및 SV40-추진 레닐라 루시퍼라제 플라스미드를 사용한 Hek293 세포 (ATCC Cat#CRL-1573)의 안정한 형질감염으로부터 나온 안정한 클론))를 10％ FCS (아미메드 Cat#2-0F100-I), 2 mM L-글루타민 (인비트로겐 Cat#25030-081), 100 IU/ml 페니실린/100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (깁코 Cat#15140-163), 6 ㎍/ml 푸로마이신 (인비트로겐 Cat#ant-pr-1), 150 ㎍/ml 제오신 (인비트로겐 Cat#45-0430) 및 150 ㎍/ml 히그로마이신 (인비트로겐 Cat#10687-010)을 보충한 DMEM 4500 g/L 글루코스 (인비트로겐 Cat#41965-035) 내에서 일상적으로 배양하였다. 선택 항생제는 녹다운 실험 동안 빼놓았다. 세포를 0.6x105 세포/웰로 폴리-D-라이신 24 웰-플레이트 포맷 내에 접종하고, 부착하도록 밤새 방치한 후, HiPerFect (퀴아젠 (Qiagen) Cat#301707)을 사용하여 LRP4 siRNA의 형질감염을 수행하였다. 사용된 LRP4 siRNA의 센스 및 안티센스 서열은 다음과 같았다:
LRP4a: TAAATTATCATAAAGTCCTAA / AGGACTTTATGATAATTTATT; (서열 160/161)
LRP4b: ATAGTGGTTAAATAACTCCAG / GGAGTTATTTAACCACTATTT; (서열 162/163)
LRP4c: TAAATTCTCGTGATGTGCCAT / GGCACATCACGAGAATTTATT; (서열 164/165)
LRP4d: TTTCTTATAGCACAGCTGGTT / CCAGCTGTGCTATAAGAAATT; (서열 166/167)
LRP4e: TAGACCTTTCCATCCACGCTG / GCGTGGATGGAAAGGTCTATT; (서열 168/169)
형질감염시킬 각각의 웰에 대해, 2개의 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브를 준비하였다: 첫 번째 것은 0.2 ㎕의 LRP4 siRNA 중 하나의 20 nM 원액 또는 0.1 ㎕의 2개의 상이한 LRP4 siRNA의 20 nM 원액 (siRNA/웰 중 최종 총 농도는 6.6 nM임) 및 50 ㎕ Optimem을 함유하였고, 두 번째 것은 3 ㎕ HiPerFect 및 47 ㎕ Optimem을 함유하였다. 두 번째 튜브의 내용물을 첫 번째 것에 첨가하고, 짧게 볼텍싱하고, 10분 동안 실온에서 방치하였다. 이어서, 상기 혼합물 100 ㎕을 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 37℃에서 5％ CO2 하에 30시간 동안 인큐베이팅하였다. 그 후, 형질감염 혼합물을 제거하고 신선한 무항생제 배양 배지로 교체하고 (450 ㎕/웰), 추가 24시간 동안 인큐베이팅하도록 방치하였다. SOST 또는 DKK1 처리 전에, 배지를 제거하고, SOST 또는 DKK1 (R&D Cat#1096-DK)의 적절한 희석액을 함유하는 신선한 무항생제 배양 배지로 교체하고, 세포를 20시간 동안 37℃에서 5％ CO2 하에 인큐베이팅하였다. 이어서, 루시퍼라제 결정을 "Wnt-분석" 하에 설명된 바와 같이 수행하였다.
동물 모델
8개월령의 암컷 OF1/IC 마우스 (n=16/군, 찰스 리버 (Charles River, 프랑스))에게 항-스클레로스틴 항체인 항체 A (25 mg/kg, h/mIgG2a) (MOR05813) 또는 대조 항체 (항-PC-h/mIgG2a)를 매주 2회 정맥내 투여하였다. 대조군에는 100 ㎍/kg PTH(1-34) 또는 PBS 비히클을 매일 피하로 투여하였다. 모든 동물에 대해 처리를 2.5주 동안 지속하였다. 조직형태계측 분석을 위해 이 시점에 동물의 절반 (n = 8/군)을 희생시켰다. 나머지 동물 (n = 8/군)에 대해 5주까지 처리를 계속하였다.
동물의 경골 골 질량 및 기하구조를 처리 개시시에 말초골 정량적 전산화 단층촬영 (pQCT) 및 마이크로 전산화 단층촬영 (microCT)에 의해 측정하였다. 동물을 pQCT에 의해 측정될 때 체중 및 경골 총 골 무기질 밀도에 따라 군 내에 균등하게 분포시켰다. 골 무기질 밀도, 질량 및 기하구조 변화를 처리 2.5 및 5주 후에 평가하였다. 체중을 매주 모니터링하였다. 처리 2.5주 후에 희생시킨 동물에게 부검 10 및 3일 전에 골 무기질화를 표지하기 위해 2개의 형광색소 표지를 투여하였다. 혈액을 부검 시에 채집하였다. 부검 시에 절제한 경골, 대퇴골, 및 요추에 대해 이중 에너지 x선 흡수 계측법 (DEXA) 측정을 수행하였다. 마이크로톰 (microtome) 절편제조 및 골 형성 동역학의 조직형태계측 분석을 위해 뼈를 고정하고 탈수시키고 포매하였다.
처리 프로토콜
대조 항체: 항-PC-h/mIgG2a,
농도: 2.5 mg/ml, 적용 부피: 10 ml/kg,
비히클: 50 mM 시트레이트, 140 mM NaCl.
항-스클레로스틴 항체: 항-SOST-MOR05813, h/mIgG2a,
2.45 mg/ml, 적용 부피: 10 ml/kg,
비히클: 50 mM 시트레이트, 140 mM NaCl.
hPTH (1-34) (바켐 (Bachem, 스위스 부덴도르프)) 100 ㎍/kg
비히클: PBS+BSA 0.1％
처리군:
1. 이소형 대조군 iv. = 항-PC-mIgG2a
2. 항-SOST-MOR05813 iv.
3. 비히클 대조군 sc. = PBS+BSA 0.1％
4. hPTH(1-34) sc.
유지 조건
동물을 4 내지 5마리의 동물의 군으로 25℃에서 12:12 h 주야 사이클로 수용하였다. 이들에게 0.8％ 인 및 0.75％ 칼슘을 함유하는 표준 실험실 식이 (NAFAG 3893.0.25, 클리바 (Kliba, 스위스 바젤))를 먹였다. 음식 및 물을 자유롭게 접근하도록 제공하였다.
동물 복지에 대한 언급
동물 실험은 스위스 캔톤 바젤-시티에서 유효한 규제에 따라 수행하였다.
방법
말초골 정량적 전산화 단층촬영 (pQCT)
동물을 흡입 마취 (이소플루란, 2.5％) 하에 측위로 놓았다. 좌측 다리를 당겨 그 위치에 고정하였다.
단면 골 질량, 밀도 및 기하구조를 Oxford 50 AM X-선관 및 0.5 mm 직경의 조준기 (collimator)가 장치된 개조된 Stratec-Norland XCT-2000을 사용하여 정찰 (scout) 스캔으로 검출할 때 경골 근위 골간단부에서 중간-비골 머리 및 경골의 근위 말단에 1.8 mm 먼 수준에서 모니터링하였다. 측정을 위해 다음 설정을 선택하였다: 보셀 (voxel) 크기: 0.1 x 0.1 x 0.5 mm; 스캔 속도: 정찰 영상 (view) 10 mm/s; 최종 스캔 3 mm/s, 1 블록, 윤곽 (contour) 방식 1, 박피 (peel) 방식 2; 피질 역치: 610 mg/cm3, 내부 역치: 610 mg/cm3.
마이크로 전산화 단층촬영 (microCT)
동물을 흡입 마취 (이소플루란, 2.5％) 하에 측위로 놓았다. 좌측 다리를 당겨 그 위치에 고정하였다.
해면골 구조는 좌측 경골 근위 골간단부에서 Scanco vivaCT20 (스칸코 메디칼 아게 (Scanco Medical AG, 스위스))를 사용하여 평가하였다. 비-등척 보셀은 10.5x10.5x10.5 ㎛의 치수를 가졌다. 단면 영상으로부터, 해면골 구획은 그의 윤곽을 추적함으로써 피질 뼈로부터 묘사되었다. 모든 다른 조각에서, 경계는 관심있는 부피를 규정하도록 추적에 기초하여 기입하였다. 2차 해면질의 영역 내에서 143개의 조각 (성장판의 측하부 가장자리 아래에서 출발함)을 평가하였다. 구조 파라미터의 3차원 평가를 위해 370의 역치 값을 사용하였다.
이중 에너지 x선 흡수 계측법 (DEXA)
생체외 DEXA 측정을 좌측 경골, 좌측 대퇴골 및 요추 1-4번에 대해 수행하였다. 연조직 시뮬레이션 (soft tissue simulation)을 위해 에탄올 (70％)을 사용하였다. 측정은 작은 동물의 측정을 위해 개조된 표준 Hologic QDR-1000 기기를 사용하여 수행하였다. 0.9 cm 직경의 조준기 및 초고분해능 방식 (0.0254 cm 간격의 선, 분해능 0.0127 cm)을 사용하였다.
형광색소 표지:
알리자린 (20 mg/kg, 피하, 알리자린 콤플렉손 (complexone), 머크 (스위스 디티콘)): 부검 10일 전.
칼세인 (30 mg/kg, 피하, 플루카 (스위스 부츠)): 부검 3일 전.
조직학 및 조직형태계측
해부 후에, 우측 대퇴골 및 요추 5 및 6번을 24 h 동안 카르노프스키 (Karnovsky) 고정제 내에 넣고, 에탄올 내에서 4℃에서 탈수시키고, 수지 (메틸메타크릴레이트) 내에 포매하였다. Microtome 2050 Supercut (라이커트 융 (Reichert Jung, 독일 아른스베르크))을 사용하여, 5 ㎛-두께의 비-연속 마이크로톰 절편을 형광색소-표지-기반의 골 형성의 평가를 위해 전방 중간면에서 절개하였다. 절편을 카메라 (SONY DXC-950P, 일본 도쿄) 및 개조된 Quantimet 600 소프트웨어 (레이카 (Leica, 영국, 캠브리지))가 장치된 Leica DM 현미경 (레이카, 스위스 히어브루크)을 사용하여 검사하였다. 동물당 하나의 절편을 샘플링하였다. 시료의 현미경 영상을 디지털화하고, 스크린 상에서 반-자동으로 평가하였다. 골 둘레 (perimeter), 단일 및 이중-표지된 골 둘레, 및 표지간 폭을 측정하였다 (X200 배율). 무기질화된 둘레 값 (％), 무기질 침착률 (마이크로미터/일) (해면골 구획에서 단면 경사에 대해 교정됨), 및 매일의 골 형성률 값 (매일의 골 형성률/골 둘레 [마이크로미터/일])을 계산하였다. 대퇴골 원위 골간단부의 2차 해면질에서 및 하나의 요추에서 모든 파라미터를 평가하였다. 다른 세트의 절편은 염색된 타르트레이트 내성 산 포스파타제 (TRAP)이었다. 골 표면당 파골세포 표면 (％)을 2차 해면질에서 평가하였다:
통계학적 분석
결과를 평균+/-SEM으로서 표현하였다. 스튜던트 (Student's) t 검정 (2-테일드(tailed); 쌍을 이루지 않음)을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 처리 (항-스클레로스틴 항체 또는 hPTH(1-34))을 대조군 (대조 항체 또는 PBS)에 대한 차이에 대해 시험하였다 (*, +p<0.05; **, ++ p<0.01).
친화도 결정
표면 플라즈몬 공명 ( Biacore )을 사용한 선택된 항-인간 스클레로스틴 Fab 의 친화도 결정
BIAcore 3000 기기 (비아코어, 스웨덴 웁살라)를 사용하여 공유 결합으로 고정된 항원 스클레로스틴에 결합하는 각각의 Fab의 연속 희석액의 운동학 상수 kon 및 koff를 결정하였다. 공유 항원 고정을 위해, 표준 EDC-NHS 아민 커플링 화학을 사용하였다. 운동학 측정은 PBS (136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4 (pH 7.4)) 내에서 20 ㎕/min의 유속으로 1.5 - 500 nM의 Fab 농도 범위를 이용하여 수행하였다. 각각의 농도에 대한 주사 시간은 1 min이고, 이어서 3 min은 해리기였다. 재생을 위해, 2 x 5 ㎕ 10 mM 글라이신 (pH 1.5)을 사용하였다. 모든 센소그램은 BIA 평가 소프트웨어 3.1 (비아코어)를 사용하여 피팅하였다.
용해물 내의 스클레로스틴 결합 Fab 의 친화도를 측정하기 위한 전기화학발광 (BioVeris) 기반 결합 분석
이. 콜라이 용해물 (BEL 추출액)에서 스클레로스틴-결합 항체 단편의 친화도 측정을 위해, 결합을 BioVeris M-384 SERIES® Workstation (바이오베리스 유럽 (BioVeris Europe, 영국 옥스포드셔 위트니))에 의해 분석하였다.
실험은 96-웰 폴리프로필렌 미량역가 플레이트에서 분석 버퍼로서 0.5％ BSA 및 0.02％ Tween 20을 보충한 PBS 내에서 수행하였다. 비오티닐화 인간 스클레로스틴 단백질을 공급자의 지시에 따라 M-280 스트렙타비딘 상자성 비드 (다이날 (Dynal)) 상에 고정시켰다. 비드 원액의 1:25 희석액을 웰마다 첨가하였다. 100 ㎕의 희석된 BEL 추출액 및 비드를 RT에서 진탕기 상에서 밤새 인큐베이팅하였다. 검출을 위해, 공급자 지시에 따라 BV-tag™ (바이오베리스 유럽, 영국 옥스포드셔 위트니)로 표지된 항-인간 (Fab)'2 (디아노바 (Dianova))를 사용하였다.
무작위로 선택한 클론을 상기 설명한 방법으로 분석하였다. 가장 높은 값을 제시하는 클론을 용액 평형 적정에서 추가의 분석을 위해 선택하였다.
용액 평형 적정 ( SET )을 이용한 스클레로스틴에 대한 Fab 의 친화도의 결정
KD 결정을 위해, Fab의 단량체 분획 (분석적 SEC에 의해 분석할 때 90％ 이상의 단량체 함량; Superdex75, 아머샴 파마시아 (Amersham Pharmacia))을 사용하였다. 용액 내의 전기화학발광 (ECL) 기반 친화도 결정 및 데이타 평가는 기본적으로 문헌 [Haenel et al., 2005]에 설명된 바와 같이 수행하였다. 일정량의 Fab (25 pM)를 용액 내에서 상이한 농도 (연속 3n 희석)의 비표지된 인간, 마우스 또는 사이노몰거스 스클레로스틴 (출발 농도: 500 pM)으로 평형화시켰다. 상자성 비드 M-280 스트렙타비딘 (다이날)에 커플링된 비오티닐화 인간 스클레로스틴 (0.5 ㎍/ml) 및 BV-tag™ (바이오베리스 유럽, 영국 옥스포드셔 위트니) 표지된 항-인간 (Fab)'2 항체 (디아노바)를 첨가하고, 30 min 동안 인큐베이팅하였다. 후속적으로, 비결합된 Fab의 농도를 M-SERIES® 384 분석기 (바이오베리스 유럽)를 사용하여 ECL 검출을 통해 정량하였다.
친화도 개선된 Fab 클론을 ECL 기반 고출력 친화도 스크리닝 BioVeris 분석에 의해 확인하였다. 히트 (hit) 선택 후에, 4개의 서브-클론을 동일한 방법에 의해 강화하였다.
BioVerisTM 을 사용한 수용체 결합 억제 효력 분석
BioVerisTM-기반 결합 억제 효력 분석을 위해, 재조합 인간 BMP-2를 공급자의 지시에 따라 카르복실산 M-270 자성 비드 (다이날)에 직접 커플링시켰다 (NHS/EDC 화학). 분석은 96-웰 폴리프로필렌 미량역가 플레이트 (넝크 (Nunc))에서 수행하였다. 분석 버퍼 (PBS + 1％ Tween 20 (엄격한) 또는 0.1％ Tween 20 (덜 엄격한) + 1％ BSA) 중의 정제된 Fab을 50 ㎕/웰로 1:3 희석 단계로 희석하였다 (출발 농도: 1000 nM). 비오티닐화 인간 스클레로스틴 (4 nM)을 50 ㎕/웰로 각각의 Fab 희석액에 첨가하였다. 22℃에서 에펜도르프 써모믹서 (Thermomixer) 상에서 400 rpm에서 진탕하면서 90 min 동안 인큐베이션 후에, 25 ㎕의 BMP-2 코팅된 비드 (2.7E07 비드/ml) 및 공급자의 지시에 따라 BV-tag™ (바이오베리스 유럽)으로 표지된 1:500 희석된 스트렙타비딘을 각각의 웰에 첨가하고, 30 min (800 rpm, 22℃) 동안 인큐베이팅하였다. 검출은 BioVeris M-384 SERIES® Workstation (바이오베리스 유럽)에 의해 수행하였다. EC50 결정을 위해, 4-파라미터 로지스틱 logistic) 피트 모델 (XLfit, IDBS)를 사용하였다.
면역글로불린의 생산
인간 IgG1 포맷 및 인간/마우스 IgG2a 포맷으로 전환
전장 IgG를 발현시키기 위해, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 도메인 단편을 Fab 발현 벡터로부터 적절한 pMorph®Ig 벡터: pMorph®_h_Ig1 및 키메라 인간/마우스 pMorph®2_h/m_Ig2a 내로 서브클로닝하였다. 각각 제한 효소 EcoRI, MfeI, BlpI를 pMorph®_h_IgG1 또는 pMorph®2_h/m_IgG2a 내로 VH 도메인 단편의 서브클로닝을 위해, 및 EcoRV, BsiWI, HpaI를 각각 pMorph®_h_Igκ, pMorph®_h_Igλ 및 pMorph®2_h/m_Igλ 벡터 내로 VL 도메인 단편의 서브클로닝을 위해 사용하였다.
제한 효소 EcoRI, MfeI 및 BlpI를 pMORPH®_h_IgG1 내로 VH 도메인 단편의 서브클로닝을 위해 사용하였고, 벡터 백본은 EcoRI/BlpI 소화 및 6400 bp 단편의 추출에 의해 생성한 반면, VH 단편 (350 bp)은 MfeI 및 BlpI을 사용한 소화 및 후속적인 정제에 의해 생산하였다. 벡터 및 삽입물을 각각 EcoRI 및 MfeI 소화에 의해 생성된 적합성 오버행 (overhang)을 통해, 및 BlpI 부위를 통해 라이게이션하였다. 그에 의해, EcoRI 및 MfeI 제한 부위 모두가 파괴된다.
제한 효소 MfeI 및 BlpI을 pMORPH®2_h/m_IgG2a 내로 VH 도메인 단편의 서브클로닝을 위해 사용하였다. IgG 벡터의 이러한 새로운 생성에서, 다른 변형 시에, EcoRI 부위 (적합성 오버행을 통한 서브-클로닝만을 허용함)를 MfeI 부위로 교체하여, 벡터 및 삽입물 모두의 MfeI/BlpI 소화를 허용하였다.
pMORPH®_h_Igκ 내로 VL 도메인 단편의 서브클로닝은 EcoRV 및 BsiWI 부위를 통해 수행한 반면, pMORPH®_h_Igλ 및 pMORPH®2_h/m_Igλ 내로 서브클로닝은 EcoRV 및 HpaI을 사용하여 수행하였다.
인간 IgG 의 일시적 발현 및 정제
HEK293 또는 HKB11 세포를 등몰량의 IgG 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 후 제4 또는 5일에, 세포 배양 상등액을 수확하였다. 상등액의 pH를 pH 8.0으로 조정하고 멸균 여과한 후, 용액을 표준 단백질 A 컬럼 크로마토그래피 (Poros 20A, PE 바이오시스템즈 (PE Biosystems))로 처리하였다.
실시예 1: 인간 및 사이노 재조합 스클레로스틴 단백질의 생성
천연 신호 펩티드 (aa 1-213, NPL 005002)를 특징으로 하는 인간 스클레로스틴 전구체를 코딩하는 전장 cDNA (GenBank Acc. No AF326739)를 제한 부위 Asp718 및 XbaI 내로 삽입함으로써 포유동물 발현 벡터 pRS5a 내로 클로닝하였다. 단백질 검출 및 정제 태그 (APP = EFRH)를 유전자의 C-말단에 첨가하였다.
일시적 6-웰-플레이트 형질감염 분석으로 소규모 발현 검증 후에, 리포펙션 (lipofection)에 의한 4개의 풀 (각각 1.0x10E6 세포)의 형질감염에 의해 안정한 형질감염 풀 (pool)의 생성을 개시하였다. 형질감염 48시간 후에, 100 ㎍/ml 농도로 항생제 제오신™의 첨가에 의해 형질감염체의 선택을 시작하였다. 4개의 모든 풀이 정상 성장을 재개한 후, 재조합 단백질 역가를 항-APP HPLC 상의 분석적 친화도 크로마토그래피에 의해 평가하고, 최고 생산 풀 (Pool2)을 무혈청 배지 내로 적응 및 추가의 규모확대를 위해 선택하였다. 동시에, 형질감염 동안 플라스미드 DNA의 담체로서 폴리에틸렌이민, 및 배양 시스템으로서 Wave™ 생물반응기 시스템 (C20SPS-F, Art.-No. 100.001, 웨이브 바이오테크 (Wave Biotech))을 사용하여 10리터 규모의 대규모 일시적 발현을 또한 수행하였다. 12-22 리터의 세포 배양 상등액을 형질감염 7-10일 후에 수확하고, 정제 전에 횡류 (cross-flow) 여과 및 투석여과에 의해 농축하였다.
인간 및 사이노 SOST를 면역친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 간단히 설명하면, 10-20 L 조직 배양 상등액의 배치 (batch)를 횡류 여과 (컷오프 (cut off) 10 kDa)에 의해 1-2 L로 농축하고, 제조자의 지시에 따라 특허 등록된 모노클로날 항-Ab1-40/APP (6E10-A5)를 CNBr 활성화된 세파로즈 4B에 커플링함으로써 (10 mg 항체/ml 수지) 제조된 50 ml 항-APP 세파로즈 컬럼 상에 2 ml/min으로 적용하였다. PBS를 사용한 기준선 세척 후에, 결합된 물질을 100 mM 글라이신 (pH 2.7)로 용출하고 중화시키고 멸균 여과하였다. 단백질 농도는 전산화 흡수 인자를 사용하여 A280에 의해 결정하였다. 정제된 단백질을 마지막으로 SDS-PAGE, N-말단 서열결정 및 LC-MS에 의해 특성 결정하였다. 정제된 인간 SOST의 분취액을 1 mM 술포-NHS-lc-비오틴 (업티마 (Uptima); UP54398A)를 사용하여 1시간 동안 37℃에서 PBS 내에서 비오티닐화하였다. 이어서, PBS에 대한 광범한 투석에 의해 과잉의 시약을 제거하였다.
이. 콜라이 유래 인간 SOST
His6-PreScission 태깅된 SOST aa24-213 (NPL006071, 플라스미드 pXI504) 및 SOST aa24-213 (NPL006690, 플라스미드 pXI515)를 재폴딩 (refolding)에 의해 생산하였다. 이. 콜라이 Tuner (DE3)를 두 플라스미드로 형질전환시켰다.
배치 PSU5257를 변형 TB 배지 (버전 lab 112)를 사용하여 20 리터 규모 (V9405)로 발효시켰다. 세포를 3.90의 OD600에서 1 mM IPTG로 유도하고, 3시간 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 수확은 연속 유동 원심분리를 사용하여 수행하여, 190 g의 습식 세포 펠렛을 얻었다.
배치 PSU11274를 15N-표지된 염화암모늄을 보충한 16 L의 최소 M9-1 배지 내에서 20 리터 규모로 발효시켰다. 일단 1.5의 OD600가 도달한 후 세포를 1 mM IPTG로 1회 유도하고, 연속 유동 원심분리를 이용하여 3.3의 OD600에서 수확하여, 50 g의 습식 세포 펠렛을 얻었다.
상기 발효로부터의 습식 세포 펠렛을 Avestin C-50 유화제를 사용하여 8 부피의 50 mM Tris (pH 8.0) (5 mM의 각각의 EDTA, DTT 및 벤즈아미딘-HCl 함유) 내에 용해시키고, 30 min 동안 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 폐기하고, 생성되는 펠렛을 10 부피의 용해 버퍼에 재현탁시키고, 다시 원심분리하였다. 과정을 3회 더 반복하고, 그 후 용해 버퍼를 5 mM DTT를 함유하는 Milli-Q 수로 교체하였다. 펠렛을 이들 조건 하에 추가로 2회 세척하였다. 봉입체를 8M 구아니딘-HCl (100 mM DTT, 50 mM Tris (pH 8) 및 5 mM EDTA 함유) 내에 3-4 h 동안 주변 온도에서 용해시킨 후, 20,000 rpm에서 30 min 동안 원심분리하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다. 재폴딩은 88 부피 (PSU11274) 및 92 부피 (PSU5257)의 냉각 재폴딩 버퍼 (0.9 M 아르기닌-HCl, 5 mM GSH 및 0.5 mM GSSG를 함유하는 0.5 M Tris (pH 8))로 신속한-희석에 의해 개시하였다. 용액을 4℃에서 1주 동안 저장하였다. 이 단계에서, 재폴딩을 완료하기 전에 PSU5257로부터 his6-태그를 제거해야할 요건 때문에 2개의 제제를 약간 상이하게 처리하였다.
PSU5257
희석된 폴딩 용액을 2배 농축한 후 다시 원래의 부피로 희석함으로써 1.5 부피의 50 mM Tris (pH 8), 5 mM GSH, 0.5 mM GSSG에 대해 투석여과하였다. 이를 3회 수행한 후, PreScission 프로테아제를 첨가하고, 용액을 48h 동안 4℃에서 방치하였다. 모든 농도/투석여과를 10 KDa 컷오프 막이 있는 Pellicon II 초여과 카세트를 사용하여 수행하였다. 마지막으로, 용액을 10배 농축하였다.
PSU11274
희석된 재폴딩 용액을 10배 농축하였다. 농축 전에 LC-MS를 사용하여 4개의 모든 디술피드 다리의 형성을 확인하였다.
이어서, 두 제제를 2 x 10 부피의 50 mM 아세트산나트륨 (pH 5)에 대해 투석하였다. 침전된 단백질을 제거하기 위해 유리 솜 및 3.0 μm 막을 통한 연속 여과 후에, SP-세파로즈™ 고성능 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 정제를 수행하였다. 컬럼을 투석 버퍼로 평형화시키고, 후속적으로 20 컬럼 부피에 걸쳐 동일한 버퍼 내에서 0 - 1 M NaCl 구배로 용출시켰다. 스클레로스틴은 약간의 어깨부 (shoulder)가 있는 단일 피크로서 용출되었고, 이를 폐기하였다. PSU5257의 경우에, 주 피크를 수집하고 농축하고, 50 mM Tris, 150 mM NaCl로 평형화시킨 Superdex 75™의 컬럼을 사용하는 크기-배제 크로마토그래피로 처리하였다. PSU11274에서는, 샘플을 양이온-교환 후에 직접 제공하였다.
사이노몰거스 원숭이 SOST cDNA (cySOST)를 아프리카 녹색 원숭이 SOST 서열 (GenBank 기탁# AF326742)에 기초한 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 증폭시켰다. 5' 프라이머 (ATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTTGT) (서열 170)는 신호 펩티드 서열의 N-말단에 대응하고 최종 분비된 단백질 내에 존재하지 않고; 3' 프라이머 (AATCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACTAG) (서열 171)는 인간, 아프리카 녹색 원숭이 및 마우스 사이에서 보존되는 구역에 대응한다. 증폭된 단편을 pcDNA3.1(+)의 BamHI/EcoRI 부위 내로 서브클로닝하고, 서열을 확인하였다. 상기 플라스미드는 Gateway 기술에 따라 pDESTRS5a 내로 최종 클로닝하기 위해 C-말단 APP 태그 및 attB 재조합 부위를 첨가하기 위해 사이노-SOST의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 추가로 기능하였다 [cySOST-pDESTRS5a].
발현은 Wave™ 생물반응기 시스템에서 10 L 규모의 대규모 일시적 형질감염에 의해 이루어지고, 형질감염 9일 후에 수확하고, 상기 설명된 바와 같이 정제하였다.
실시예 2: HuCAL GOLD ® 라이브러리로부터 인간 스클레로스틴 -특이적 항체의 생성
인간 스클레로스틴 단백질에 대한 치료 항체는 항체 변이체 단백질의 공급원으로서 상업적으로 이용가능한 파지 디스플레이 라이브러리인 MorphoSys HuCAL GOLD® 라이브러리를 사용하여, 고결합 친화도를 갖는 클론의 선택에 의해 생성하였다. HuCAL GOLD® 라이브러리는 6개의 모든 CDR이 적절한 돌연변이에 의해 다양화되고, Fab를 파지 표면에 연결하기 위해 CysDisplay™ 기술 (WO01/05950, Loehning et al., 2001)을 사용하는 Fab 라이브러리 (Knappik et al., 2000)이다.
라이브러리로부터 스클레로스틴 -특이적 항체의 패닝에 의한 선택
인간 스클레로스틴을 인식하는 항체의 선택을 위해, 몇몇 패닝 전략을 적용하였다.
요약하면, HuCAL GOLD® 항체-파지를 상이한 VH 마스터 (master) 유전자를 포함하는 3개의 풀로 나누었다.
이들 풀을 개별적으로
a) 항원 (인간 및 마우스 스클레로스틴)을 Maxisorp 96 웰 미량역가 플레이트 (넝크, 독일 비스바덴)) 상에 직접 코팅시키는 고상 패닝, 또는
b) 항원 (비오티닐화 스클레로스틴) 및 파지-항원 복합체가 각각 N/A 투명 스트립 (strip) 상에 포획되는 포획 및 반-용액 패닝, 또는
c) 파지-항원 복합체가 각각의 패닝 풀에 대해 스트렙타비딘 자성 비드 (Dynabeads M-280; 다이날)에 의해 포획되는, 비오티닐화 스클레로스틴을 사용한 용액 패닝으로 처리하였다.
· 스클레로스틴 상의 고상 패닝
스클레로스틴에 대한 제1 라운드의 패닝을 위해, Maxisorp 플레이트의 웰을 PBS에 희석시킨 300 ㎕ (5 ㎍/ml)의 인간 스클레로스틴 (HEK 세포에서 생산된)로 밤새 코팅하였다. 400 ㎕ PBS를 사용한 2회 세척 단계 후에, 웰을 PBS 내에 희석시킨 5％ 우유 분말을 함유하는 차단 버퍼와 함께 인큐베이팅하였다.
선택에 앞서, 항체의 비특이적인 선택을 피하기 위해 HuCAL GOLD® 파지를 차단 버퍼 (5％ 우유 분말/ PBS, 0.5％ Tween 20) 내에서 2 h 동안 RT에서 예비-흡착시켰다.
코팅하고 차단시킨 Maxisorp 플레이트의 세척 (2x 400 ㎕ PBS) 후에, 300 ㎕의 예비-흡착시킨 파지를 코팅된 웰에 첨가하고, 2 h 동안 RT에서 부드럽게 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 상기 인큐베이션에 이어서, RT에서 PBS 및 PBS/0.05％ Tween 20을 사용하는 10회 세척 사이클을 수행하였다. 결합된 파지는 10 mM Tris/HCl (pH 8.0) 중 300 ㎕의 20 mM DTT를 웰마다 10 min 동안 RT에서 첨가함으로써 용출시켰다. 용출액을 제거하고, 0.6 - 0.8의 OD600nm로 성장시킨 15 ml의 이. 콜라이 TG1F+ 세포에 첨가하였다. 이. 콜라이의 파지 감염은 진탕하지 않으면서 45 min 동안 37℃에서 허용되었다. 5 min 동안 4120xg에서 원심분리한 후, 세균 펠렛을 각각 600 ㎕ 2xYT 배지 내에 재현탁시키고, LB-CG 아가 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 콜로니를 플레이트로부터 긁어내고, 파지를 구조하고 증폭시켰다.
제2 및 제3 라운드의 선택은 제1 라운드의 선택과 동일한 방식으로 수행하였지만, 파지 결합 후에 세척 조건이 보다 엄격한 차이가 있었다. 일부 패닝 조건에 대한 제2 선택 라운드에 대해, 마우스 교차-반응성 항체에 대해 풍부화하기 위해 마우스 스클레로스틴을 항원으로서 사용하였다. 일부 패닝 조건에 대해, 다른 배치의 인간 재조합 스클레로스틴 (이. 콜라이에서 생산된)을 코팅하였다.
· 스클레로스틴 상의 반-용액 패닝
상기 종류의 패닝을 위해 2가지 상이한 방법을 수행하였다: 포획 반-용액 패닝 및 표준 반-용액 패닝 절차.
상세히 설명하면, 비오티닐화 스클레로스틴에 대한 포획 반-용액 패닝을 위해, 100 ㎕의 항원을 2 h 동안 RT에서 뉴트라비딘 (N/A) 투명 스트립 (피어스, 활성화 수준 100 ㎕, 결합 용량 15 pmol/웰) 상에 코팅하였다. N/A 스트립을 4℃에서 200 ㎕ Chemiblock으로 밤새 차단시키고, PBS로 2회 세척하였다.
차단시킨 파지 용액 (Chemiblock/0.05％ Tween 20)을 차단시킨 N/A 웰에 30 min 동안 첨가하고, 상기 단계를 추가로 30 min 동안 반복하여 뉴트라비딘 결합제를 제거하였다. 이어서, 에비-청정화시킨 파지를 N/A 투명 스트립 상에 고정시킨 비오티닐화 스클레로스틴에 옮기고, 호일로 밀봉하고, RT에서 진탕하면서 밤새 인큐베이팅하였다.
다음날, 파지 용액을 항원 코팅된 웰로부터 제거하고, 웰을 세척하였다.
표준 반-용액 패닝을 위해, 차단시키고 (Chemiblock/0.05％ Tween 20) 예비-청정화시킨 파지를 새로운 예비-차단시킨 1.5 ml 반응 튜브 (Chemiblock/0.05％ Tween 20)에 첨가한 후, 비오티닐화 인간 스클레로스틴을 100 nM의 최종 농도로 첨가하고, RT에서 진탕하면서 밤새 인큐베이팅하였다.
다음날, 1.5 ml 반응 튜브로부터 파지-항원 용액을 뉴트라비딘 스트립의 새로 차단시킨 웰에 첨가하고, 30 min 동안 RT에서 결합시킨 후 세척하였다.
두 패닝 절차에 대해, 결합된 파지는 세척 후에 10 mM Tris/HCl (pH 8.0) 중 300 ㎕의 20 mM DTT를 웰마다 10 min 동안 RT에서 첨가함으로써 용출시켰다. 용출액을 제거하고, 0.6 - 0.8의 OD600nm로 성장시킨 15 ml의 이. 콜라이 TG1 세포에 첨가하였다. 이. 콜라이의 파지 감염은 진탕하지 않으면서 45 min 동안 37℃에서 허용되었다. 5 min 동안 4120xg에서 원심분리한 후, 세균 펠렛을 각각 600 ㎕ 2xYT 배지 내에 재현탁시키고, LB-CG 아가 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 콜로니를 플레이트로부터 긁어내고, 파지를 구조하고 증폭시켰다.
제2 및 제3 라운드의 선택은 제1 라운드의 선택과 동일한 방식으로 수행하였지만, 파지의 결합 후에 세척 조건이 보다 엄격한 차이가 있었다.
· 스클레로스틴 상의 용액 패닝
이러한 종류의 패닝을 위해, 200 ㎕의 스트렙타비딘 자성 비드 (Dynabeads M-280; 다이날)를 PBS로 1회 세척하고, Chemiblock으로 2 h 동안 RT에서 차단시켰다. 500 ㎕의 파지를 Chemiblock으로 1 h 동안 RT에서 회전시키면서 차단시켰다. 차단시킨 파지를 50 ㎕의 차단시킨 스트렙타비딘 자성 비드에 대하여 30 min 동안 2회 에비-흡착시켰다. 파지 상등액을 새로 차단시킨 2 ml 반응 튜브에 옮기고, 상이한 농도의 인간 비오티닐화 스클레로스틴을 첨가하고 (표 5, 6 및 7 참조), 1 h 동안 RT에서 회전시키면서 인큐베이팅하였다. 100 ㎕의 차단시킨 스트렙타비딘 자성 비드를 각각의 패닝 풀에 10 min 동안 회전기 (rotator) 상에서 인큐베이팅하였다. 입자 분리기 (다이날 MPC-E)를 사용하여 약 2.5 min 동안 비드를 수집하고, 용액을 조심스럽게 제거하였다.
세척 사이클 (표 2) 후에, 결합된 파지는 10 mM Tris/HCl (pH 8.0) 중 300 ㎕의 20 mM DTT를 웰마다 10 min 동안 RT에서 첨가함으로써 용출시켰다. 용출액을 제거하고, 0.6 - 0.8의 OD600nm로 성장시킨 15 ml의 이. 콜라이 TG1F+ 세포에 첨가하였다. 이. 콜라이의 파지 감염은 진탕하지 않으면서 45 min 동안 37℃에서 허용되었다. 5 min 동안 4120xg에서 원심분리한 후, 세균 펠렛을 각각 600 ㎕ 2xYT 배지 내에 재현탁시키고, LB-CG 아가 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 콜로니를 플레이트로부터 긁어내고, 파지를 구조하고 증폭시켰다.
제2 및 제3 라운드의 선택은 제1 라운드의 선택과 동일한 방식으로 수행하였지만, 파지의 결합 후에 세척 조건이 보다 엄격한 차이가 있었다. 일부 패닝 조건에 대한 제2 및 제3 선택 라운드에 대해, 항원 농도는 감소되었다.
선택된 Fab 단편의 서브클로닝 및 발현
선택된 Fab 단편의 미세발현
가용형 Fab의 신속한 발현을 촉진하기 위해, 선택된 HuCAL GOLD® 파지의 Fab-코딩 삽입물을 XbaI 및 EcoRI을 통해 각각의 디스플레이 벡터로부터 이. 콜라이 발현 벡터 pMORPH®X9_MH (Rauchenberger et al., 2003) 내로 서브클로닝하였다. 이. 콜라이 TG1 F- 세포 내로 발현 플라스미드의 형질전환 후에, 클로람페니콜 내성 단일 클론을 100 ㎕ 2xYT-CG 배지를 예비-충전한 멸균 96-웰 미량역가 플레이트의 웰 내로 선택하고 37℃에서 밤새 성장시켰다. 5 ㎕의 각각의 이. 콜라이 TG-1 배양액을 웰마다 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 0.1％ 글루코스을 보충한 100 ㎕ 2xYT 배지를 예비-충전한, 새로운 멸균 96-웰 미량역가 플레이트에 옮겼다. 미량역가 플레이트를 마이크로플레이트 진탕기 상에서 400 rpm에서 진탕하면서 30℃에서, 배양액이 약 0.5의 OD600nm로 약간 혼탁해질 때까지 (약 2-4 h) 인큐베이팅하였다. 이들 발현 플레이트에, 34 ㎍/ml 클로람페니콜 및 3 mM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 보충한 20 ㎕ 2xYT 배지를 웰마다 첨가하고 (최종 농도: 0.5 mM IPTG), 미량역가 플레이트를 통기성 테이프로 밀봉하고, 400 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 밤새 인큐베이팅하였다.
전세포 용해물의 생성 (BEL 추출액): 발현 플레이트의 각각의 웰에, 40 ㎕ BEL 버퍼를 첨가하고, 미량역가 플레이트 진탕기 (400 rpm) 상에서 1 h 동안 22℃에서 인큐베이팅하였다.
이. 콜라이에서 HuCAL ®- Fab 항체의 발현 및 정제
이. 콜라이 TG1 F- 세포에서 pMORPH®X9_Fab_MH에 의해 코딩되는 Fab 단편의 보다 대규모의 발현은 34 ㎍/ml 클로람페니콜을 보충한 750 ml의 2xYT 배지를 사용하여 진탕기 플라스크 배양액에서 수행하였다. 배양액을 0.5의 OD600nm에 도달할 때까지 30℃에서 진탕하였다. Fab 발현은 0.75 mM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)의 첨가 및 30℃에서 추가로 20 h 동안 배양에 의해 유도하였다. 세포를 수확하고, 라이소자임을 사용하여 파괴시키고, Fab 단편을 Ni-NTA 크로마토그래피 상에 단리시켰다. 겉보기 분자량은 교정 표준품을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정하였다. 농도는 UV-분광광도법에 의해 결정하였다 (Krebs et al., 2001).
실시예 2: 스클레로스틴 -특이적 HuCAL ® 항체의 확인
직접 코팅된 스클레로스틴에 대한 스클레로스틴 결합 Fab 의 검출을 위한 효소 연결 면역흡착 분석 (ELISA)
Maxisorp (넝크, 미국 뉴욕주 로체스터) 384 웰 플레이트를 4℃에서 PBS (pH 7.4) 내에서 20 ㎕의 2.5 ㎍/ml 항원 (인간 스클레로스틴 - HEK 세포에서 생산됨; 인간 스클레로스틴 - 이. 콜라이 세포에서 생산된; 및 마우스 스클레로스틴)으로 밤새 코팅하였다.
플레이트를 5％ 우유 분말을 함유하는 PBS/0.05％ Tween 20 (PBST)으로 1 h 동안 RT에서 차단시켰다. 웰을 PBST로 세척한 후, PBS에 희석시킨 BEL-추출액, 정제된 HuCAL GOLD® Fab, 또는 대조 Fab를 웰에 첨가하고, 1 h 동안 RT에서 인큐베이팅하였다. 1차 항체를 검출하기 위해, 다음 2차 항체를 적용하였다: 알칼린 포스파타제 (AP)-컨쥬게이팅된 AffiniPure F(ab')2 단편, 염소 항-인간, 항-마우스 IgG (잭슨 이뮤노리서치 (Jackson ImmunoResearch)). AP-컨쥬게이트의 검출을 위해, AttoPhos (로슈 (Roche))와 같은 형광성 기질을 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 모든 인큐베이션 단계 사이에, 미량역가 플레이트의 웰을 PBST로 3회 세척하고, 2차 항체와의 최종 인큐베이션 후에 5회 세척하였다. 형광은 TECAN Spectrafluor 플레이트 판독기에서 측정하였다.
비오티닐화 스클레로스틴을 사용한 포획 스크리닝
이러한 종류의 ELISA는 용액 패닝을 진행한 후 HuCAL GOLD® Fab에 대해 스크리닝하기 위해 사용하였다.
Maxisorp (넝크, 미국 뉴욕주 로체스터) 384 웰 플레이트를 PBS (pH 7.4) 중에 희석시킨 20 ㎕의 5 ㎍/ml 양 항-인간 IgG (Fd 단편 특이적) (더 바인딩 사이트 (The Binding Site, 영국 버밍엄))으로 코팅하였다.
TBS, 0.05％ Tween 20 중 3％ BSA로 2 h 동안 RT에서 차단시킨 후, 주변세포질 추출액 또는 정제된 HuCAL GOLD® Fab을 첨가하고 1 h 동안 RT에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척한 후에, 특이적 결합에 대해 20 ㎕의 비오티닐화 스클레로스틴, 또는 비특이적 결합에 대해 비오티닐화 트랜스페린을 웰에 첨가하였다.
후속적으로, 비오티닐화 항원 스클레로스틴을 포획된 HuCAL®-Fab 단편에 결합시켰다. 세척 후에, 알칼린 포스파타제에 컨쥬게이팅된 스트렙타비딘 (자이멕스 (Zymex))와 함께 인큐베이팅하였다. AP-스트렙타비딘의 검출을 위해, AttoPhos (로슈)와 같은 형광성 기질을 제조자 (로슈 다이아그노스틱스 (Roche Diagnostics, 독일 만하임))의 지시에 따라 사용하였다. 430 nm에서 여기시켜, 535 nm에서 형광 방출을 기록하였다.
결과:
패닝 후에, 풍부화된 파지 풀을 pMORPH®23 라이브러리 벡터 (파지 표면 상에 효율적인 항체 디스플레이를 허용하는)로부터 가용형 Fab의 주변세포질 발현을 매개하는 pMORPH®X9_Fab_MH 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 단일 클론을 선택하고, 가용형 Fab를 이들 단일 클론으로부터 발현시켰다. Fab를 세균 용해물로부터 Maxisorp 미량역가 플레이트 상에 고정시킨 인간 및 마우스 스클레로스틴으로 직접 결합시킴으로써 또는 Maxisorp 미량역가 플레이트로 항-Fd 항체를 통한 Fab의 포획에 이은 비오티닐화 인간 스클레로스틴의 결합에 의해 수행한 1차 스크리닝에서, 총 약 4600개의 클론을 분석하였다. 검출은 ELISA로 알칼린 포스파타제-표지된 항-인간 (Fab)'2 항체로 표지한 후 또는 스트렙타비딘 알칼린 포스파타제를 사용하여 수행하였다.
배경에 비해 5배를 초과하는 신호를 갖는, 재조합 스클레로스틴에 대한 1차 스크리닝으로부터 얻어진 히트를 비오티닐화 스클레로스틴을 사용하여 직접 코팅되거나 또는 용액 중의 인간 HEK 및 이. 콜라이 스클레로스틴 및 마우스 스클레로스틴에 대한 결합에 대해 추가로 분석하였다. 모든 스클레로스틴 유도체를 인식하는 히트를 선택하고 서열결정하였다.
HuCAL GOLD ® Fab 의 특성 결정
Biacore 를 이용하는 친화도 결정
항-스클레로스틴 항체를 추가로 특성결정하기 위해, 인간, 마우스 및 사이노몰거스 스클레로스틴에 대한 친화도를 결정하였다. 재조합 스클레로스틴 단백질을 CM5 Biacore 칩 상에 고정시키고, Fab를 상이한 농도로 이동상에 적용하였다. 1가 친화도의 신뢰가능한 결정을 위해, Biacore 측정을 위해 그러한 Fab 배치만을 사용하였고, 이는 정성적 크기 배제 크로마토그래피에서 ≥90％ 단량체 분획을 보였다.
재조합 인간, 사이노몰거스 및 마우스 스클레로스틴에 대한 친화도를 Biacore로 결정하였다. 친화도는 인간에 대해 나노몰 미만으로부터 500 nM 초과까지, 사이노몰거스에 대해 거의 5000 nM까지, 및 마우스 스클레로스틴에 대해 4500 nM까지이다.
실시예 3: BioVeris ™ 장치를 사용한 고정된 BMP -2에 대한 스클레로스틴 결합을 억제하는 항-인간 스클레로스틴 Fab 후보의 확인
모든 생성되고 정제된 Fab를 재조합 인간 BMP-2에 대한 스클레로스틴 결합을 억제하는 그들의 능력에 대해 BioVeris-기반 결합 억제 효력 분석에서 시험하였다. 2가지 상이한 엄격성 조건 (버퍼 시스템 중 0.1％ 대 1％ Tween 20)을 시험하였다. 27개의 Fab 중 9개가 엄격한 버퍼 조건 하에 고정된 BMP-2에 대한 스클레로스틴 결합을 억제할 수 있었다.
실시예 4: MC3T3 세포에서 BMP -2 유도된 ALP 생산의 스클레로스틴 억제의 회귀.
모 결합제의 IgG 전환 및 IgG 의 특성 결정
21개의 후보를 각각 pMORPH®_h_IgG1 발현 벡터, 및 pMORPH®_h_Ig 벡터 시리즈의 대응하는 경쇄 구성체 내로 서브클로닝함으로써 인간 IgG1 포맷으로 전환시켰다. 발현은 HEK293 또는 HKB11 세포의 일시적 형질감염에 의해 수행하고, 전장 면역글로불린을 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 정제 후에 IgG1의 기능성을 고정된 인간, 마우스 및 사이노몰거스 스클레로스틴에 대한 ELISA 결합에 의해 평가하였다.
1차 생물학적 검정에서 IgG
모든 정제된 hIgG를 적정하고 ALP 분석으로 시험하였다. 분석은 BMP-2 스클레로스틴 억제에 대해 신뢰가능하였지만, 선택된 후보는 모든 실험에서 스클레로스틴 억제를 보이지는 않았다 (분석 대 분석 활동 변동, 플레이트 대 플레이트 변동, 삼중 웰 내에서 높은 변동). 따라서, IgG의 활성의 순위결정만이 가능하였다.
실시예 5: LCDR3 및 HCDR2 카세트의 평행 교환에 의한 선택된 항- 스클레로스틴 Fab의 친화도 성숙.
ALP 분석에서 IgG를 시험한 결과는 순위결정만을 허용하였다. 이러한 순위로부터, 친화도 성숙에 대해 고 위험에서 4개의 Fab를 선택하였다. 모든 후보는 L-CDR3 및 H-CDR2에서 단일 선도 (lead) 후보로서 최적화되도록 선택되었다.
4개의 선택된 항체 단편의 친화도 및 생물학적 활성을 증가시키기 위해, LCDR3 및 HCDR2 구역을 지정 돌연변이 유발을 사용하는 카세트 돌연변이 유발에 의해 평행으로 최적화하여 (Virnekas et al., 1994), 프레임워크 구역을 일정하게 유지하였다. 성숙 라이브러리의 클로닝 전에, 모든 모 Fab 단편을 XbaI/EcoRI 제한 부위를 통해 발현 벡터 pMORPH®x9_MH로부터 CysDisplay™ 성숙 벡터 pMORPH®25로 전달하였다. 상기 벡터는 시스테인 잔기에 N-말단에서 융합되고 C-말단 시스테인은 Fd 항체 사슬에 융합되어, 파지 표면 상에 각각의 Fab 단편의 디술피드-연결된 디스플레이를 허용하는 파지 단백질 pIII을 제공한다.
HCDR2 라이브러리의 생성을 위해, 각각의 모 Fab의 HCDR2 구역을 절제하고 590 bp 스터퍼 (stuffer)로 교체하였다. 상기 DNA 스터퍼는 이중 소화된 벡터 밴드로부터 단일 소화된 벡터 밴드의 분리를 용이하게 하고, 성숙 패닝 동안 고-친화도 모 Fab의 배경을 감소시킨다. 후속 단계에서, 각각의 모 클론의 Fab-코딩 플라스미드로부터 스터퍼를 절제하고, 고도 다양화된 HCDR2 성숙 카세트로 교체하였다.
이와 병행하여, 4개의 모 클론들 중 5개의 LCDR3 구역을 스터퍼의 중간 클로닝 없이 다양화된 LCDR3 성숙 카세트로 교체하였다.
성숙 라이브러리의 크기는 1％ 미만의 클로닝 배경에서 1x107 내지 4x108 클론이었고, 서열결정에 의한 품질 제어에 의해 각각의 라이브러리의 우수한 품질이 밝혀졌다. 모 클론 MOR04520의 LCDR3 라이브러리만이 작은 크기 (<106)를 갖고, 따라서 많은 부정확한 클론은 성숙 패닝에 포함시키지 않았다.
각각의 LCDR3 및 HCDR2 성숙 라이브러리에 대해, 항체-디스플레이 파지를 제조하고, 파지 역가를 점적 (spot) 적정에 의해 결정하였다.
친화도 성숙을 위한 패닝 전략
다음의 성숙 라이브러리로부터 항체-디스플레이 파지를 별개의 패닝 및 스크리닝으로 처리하였다:
리드 (Lead) 1: MOR04518 (L-CDR3 성숙)
리드 1: MOR04518 (H-CDR2 성숙)
리드 2: MOR04520 (H-CDR2 성숙)
리드 3: MOR04532 (L-CDR3 성숙)
리드 3: MOR04532 (H-CDR2 성숙)
리드 4: MOR04799 (L-CDR3 성숙)
리드 4: MOR04799 (H-CDR2 성숙)
각각의 리드 라이브러리에 대해, 3개의 상이한 패닝을 수행하였다. 각각의 패닝 전략을 위해, 상이한 엄격도 조건을 적용하였다. 패닝 엄격도를 증가시키고 개선된 오프율 (off-rate)에 대해 선택하기 위해, 광범한 세척, 및 정제된 모 Fab와 또는 가용형 재조합 스클레로스틴과의 경쟁을 수행하였다. 성숙 패닝 후에, 풍부화된 파지미드 풀을 pMORPH®x9_MH 발현 벡터 내로 서브-클로닝하였다. 약 2900개의 단일 클론을 선택하고, Fab를 IPTG를 사용한 유도에 의해 발현시켰다.
BioVerisTM 친화도 순위결정 및 개선된 친화도에 대한 스크리닝
친화도-개선된 스클레로스틴-특이적 Fab의 확인을 위해, 약 2900 단일 클론의 세균 용해물을 희석하고, 스트렙타비딘-코팅된 비드 상에 고정된 비오티닐화 인간 스클레로스틴에 결합하는 Fab에 대해 검토하였다. 결합을 BioVeris Workstation을 사용하여 분석하였다. 최고 신호를 내는 클론은 개선된 친화도를 나타내고, 따라서 용액 평형 적정에 의한 추가의 분석을 위해 선택하였다.
이 목적을 위해, 176개의 단일 클론을 선택하고, 예비 친화도를 BioVeris에서 4-지점 용액 평형 적정 (SET)을 통해 결정하였다. 이들 데이타로부터, 최상의 친화도를 보이는 24개의 클론을 선택하였다. 이들 Fab를 mg 규모로 정제하였다.
최종 친화도는 8-지점 SET 측정 및 인간, 마우스 및 사이노몰거스 스클레로스틴을 사용하여 결정하였다.
1차 생물학적 검정에서 최적화된 Fab
최적화된 Fab를 세포 ALP 분석으로 시험하였다. 이들 대부분은 불활성이었고; 스클레로스틴 억제의 가변적인 역전이 일부 Fab에서 보였다. 따라서, 선택된 클론을 인간/마우스 IgG2a 포맷으로 전환시키고, 동일한 분석으로 시험하였다. 그러나, 인간/마우스 IgG2a 포맷의 이들 클론은 스클레로스틴 억제를 완전히 역전시킬 수 없었고, 또한 요구되는 EC50 (<10nM) 기준이 도달될 수 없었다. 최상의 성숙된 후보 MOR05177 (모 MOR04518로부터 성숙된 VL)은 50 nM Fab 또는 140 - 467nM 인간/마우스 IgG2a에서 ALP 신호의 75-85％ 회복을 보였다.
실시예 6: 새로운 1차 생물학적 검정에서 모 및 최적화된 Fab 및 IgG 로부터 항-스클레로스틴 항체의 확인
스클레로스틴이 Wnt 신호전달에 직접 또는 간접적으로 영향을 미침을 보여주는 새로운 문헌 ([Wu et al. JBC 2005], [He et al. JBC 2005], [Bezooyen et al. ASBMR 2005], [Winkler et al. JBC 2005])에 기초하여, 새로운 기능성 생물학적 검정법을 개발하였다.
상기 검정은 HEK293 세포에서 STF의 Wnt1-매개 활성화를 억제하는 스클레로스틴의 능력에 기초한 것이다.
상기 검정에서, 초기 스크리닝에서 확인된 모든 Fab + 친화도 성숙에서 확인된 모든 Fab를 시험하였다. 성숙된 Fab의 증가된 친화도가 wnt-1 분석에서 증가된 효력 및 효능에 반영됨이 명백해졌다
모든 모 Fab를 시험하여 추가의 친화도 성숙을 위한 유망한 주형으로서 2개의 추가의 항체를 확인하였다. 도 1은 wnt-1 분석에서 확인된 가장 강력한 항체 중 하나인 MOR05813_IgG2람다의 활성을 보여준다.
실시예 7: 다른 생물학적 검정에서 모 및 친화도 성숙된 Fab 의 특성 결정
무기질화 분석에서 모 및 친화도 성숙된 Fab 의 활성
무기질화 분석은 골분화를 겪는 그들의 능력을 나타내는, 무기질화 매트릭스를 형성하는 MC3T3 세포의 능력에 기초한다. 14일 후에 시험된 모든 BMP-2 농도에서 강한 무기질화 (웰당 > 1 ㎍ 칼슘 침착 (96-웰 포맷))가 측정되었다. 증가하는 스클레로스틴 농도의 첨가는 BMP-2 (2.1 nM)의 용량 의존 억제를 유도하고, 무기질화 (IC50: 120 nM)를 유도하였다 (데이타 미제시).
도 2는 MOR05813_Fab의 존재 하에 무기질화의 예를 보여준다. 항체는 BMP-2-유도된 무기질화를 초기 반응의 최대 80％로 회복시킬 수 있는 반면, 음성 대조군으로서 사용된 항-라이소자임 Fab는 효과가 없었다.
LRP6 / 스클레로스틴 ELISA 에서 모 및 친화도 성숙된 Fab 의 활성
LRP6/스클레로스틴 ELISA는 LRP6에 결합하는 스클레로스틴의 능력에 기초한다. 생산된 Fab를 추가로 특성결정하기 위해, 선택된 Fab 및 IgG를 상기 분석으로 시험하였다. 항-스클레로스틴 항체 (R&D)의 존재 (1000 ng/ml = 약 7 nM) 하에, LRP6에 대한 스클레로스틴 (0.9 nM) 결합이 대조군에 비해 68％ 억제되었다 (데이타 미제시).
MOR05813_IgG2 람다는 LRP6에 대한 스클레로스틴 결합을 90 nM에서 90％까지 억제한 반면, 음성 대조군으로 사용된 항-라이소자임 IgG는 LRP6에 대한 스클레로스틴 결합에 대한 효과가 없었다 (도 3).
Phospho - Smad1 분석에서 모 및 친화도 성숙된 Fab 의 활성
phospho-Smad1 분석 (웨스턴)은 MC3T3-E1 세포에서 15분 내에 Smad1 인산화를 유도하는 BMP-6의 능력에 기초한다. MOR05318_IgG2 람다는 BMP-6-유도된 Smad1 인산화에 대한 스클레로스틴 작용을 115 nM의 EC50으로 억제하고, Smad1 인산화를 BMP-6-유도된 인산화의 최대 66％로 회복시켰다. 음성 대조군 항-라이소자임 IgG (IgG C)는 효과가 없었다 (도 4).
실시예 8: 항- SOST 항체의 활성에 대한, 신규한 SOST -상호작용 파트너인 LRP4의 효과
LRP4 siRNA e를 제외하고는, LRP4 mRNA 녹다운은 SOST의 부재 하에 STF 활성에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 이는 STF 활성을 억제하는 SOST의 능력을 10 내지 30％ 감소시켰다. 이는 단독으로 (도 5A) 또는 상이한 조합으로 (데이타 미제시) 시험된 5개의 모든 siRNA에 대해서 동일하게 달성되었다. 과다발현 시에, LRP4는 SOST IC50을 HEK 및 c28a2 supertopflash 분석에서 각각 5배 및 16배 감소시켰다 (도 5B 및 C). 과다발현된 LRP4가 DKK1 IC50에 대한 효과가 없다는 점에서 상기 효과는 특이적이었다. LRP4의 녹다운 (siRNA)은 Wnt-1 유도된 STF에서 SOST의 억제 작용을 감소시킨 반면, DKK1의 억제 작용을 감소시키지 않았다 (도 5D). 결국, LRP4는 MOR05813_IgG2a EC50을 17.2 nM에서 30 nM로 증가시킴으로써 항-SOST 항체의 억제 작용을 감소시켰다 (도 5E). 이들 데이타는 LRP4가 SOST 작용의 촉진제임을 제안한다.
실시예 9: 새로운 성숙
생물학적 검정으로부터 얻은 결과에 기초하여 2개의 새로 선택된 항체 단편의 친화도 및 생물학적 활성을 증가시키기 위해, LCDR3 및 HCDR2 구역을 지정 돌연변이 유발을 사용하는 카세트 돌연변이 유발에 의해 평행으로 최적화하여 (Virnekas et al., 1994), 프레임워크 구역을 일정하게 유지하였다. 성숙 라이브러리의 클로닝 전에, 모든 모 Fab 단편을 XbaI/EcoRI 제한 부위를 통해 발현 벡터 pMORPH®x9_MH로부터 CysDisplay™ 성숙 벡터 pMORPH®25로 전달하였다. 상기 벡터는 시스테인 잔기에 N-말단에서 융합되고 C-말단 시스테인은 Fd 항체 사슬에 융합되어, 파지 표면 상에 각각의 Fab 단편의 디술피드-연결된 디스플레이를 허용하는 파지 단백질 pIII을 제공한다.
HCDR2 라이브러리의 생성을 위해, 각각의 모 Fab의 HCDR2 구역을 절제하고 590 bp 스터퍼로 교체하였다. 상기 DNA 스터퍼는 이중 소화된 벡터 밴드로부터 단일 소화된 벡터 밴드의 분리를 용이하게 하고, 성숙 패닝 동안 고-친화도 모 Fab의 배경을 감소시킨다. 후속 단계에서, 각각의 모 클론의 Fab-코딩 플라스미드로부터 스터퍼를 절제하고, 고도로 다양화된 HCDR2 성숙 카세트로 교체하였다.
이와 병행하여, 4가지 모 클론들 중 5개의 LCDR3 구역을 스터퍼의 중간 클로닝 없이 다양화된 LCDR3 성숙 카세트로 교체하였다.
성숙 라이브러리의 크기는 1％ 미만의 클로닝 배경에서 2x107 내지 2x108 클론이었고, 서열결정에 의한 품질 제어를 통해 각각의 라이브러리의 우수한 품질이 밝혀졌다. 각각의 LCDR3 및 HCDR2 성숙 라이브러리에 대해, 항체-디스플레잉 파지를 제조하고, 파지 역가를 점적 적정에 의해 결정하였다.
추가의 친화도 성숙을 위한 패닝 전략
다음의 성숙 라이브러리로부터 항체-디스플레잉 파지를 별개의 패닝 및 스크리닝으로 처리하였다:
리드 1: MOR04525 (L-CDR3 성숙)
리드 1: MOR04525 (H-CDR2 성숙)
리드 2: MOR04529 (L-CDR3 성숙)
리드 2: MOR04529 (H-CDR2 성숙)
각각의 리드 또는 풀 라이브러리에 대해, 3개의 상이한 패닝을 수행하고, 각각의 패닝 전략을 위해, 상이한 엄격도 조건을 적용하였다. 패닝 엄격도를 증가시키고 개선된 오프율에 대해 선택하기 위해, 연장된 인큐베이션 및 세척 기간 동안 가용형 재조합 스클레로스틴 단백질과의 경쟁을 수행하였다.
패닝 후에, 풍부화된 파지미드 풀을 pMORPH®x9_MH 발현 벡터 내로 서브-클로닝하였다. 약 1600개의 단일 클론을 선택하고, Fab를 IPTG를 사용한 유도에 의해 발현시켰다.
인간 스클레로스틴에 대한 < 100 pM의 친화도 기준이 두 모 Fab의 유도체에 대해 충족되었다. < 500pM의 사이노몰거스 스클레로스틴과의 및 마우스 스클레로스틴과의 교차-반응성이 두 모 Fab의 유도체에 대해 충족되었다. MOR04525는 3개의 모든 종에 대해 보다 높은 친화도를 갖는 보다 많은 클론을 생성시켰다.
실시예 10: 생체내 연구에서 항- 스클레로스틴 항체의 특성 결정
8개월령의 암컷 OF1/IC 마우스 (n=16/군, 찰스 리버, 프랑스)에게 항-스클레로스틴 항체인 MOR05813 (24.5 mg/kg, mIgG2a) 또는 이소형 대조 항체 (항-PC-mIgG2a)를 매주 2회 정맥내 투여하였다. 대조군에는 100 ㎍/kg PTH(1-34) 또는 비히클 (PBS + 0.1％ BSA)을 매일 피하로 투여하였다. 모든 동물에 대해 처리를 2.5주 동안 지속하였다. 조직형태계측 분석을 위해 이 시점에 동물의 절반 (n = 8/군)을 희생시켰다. 이들 동물에게 골 형성 동역학의 조직형태계측 평가를 위해 부검 10 및 3일 전에 형광색소 마커를 투여하였다. 나머지 동물 (n = 8/군)에 대해 5주까지 처리를 계속하였다.
동물을 골 질량, 밀도 및 기하구조의 변화에 대해 모니터링하였다. 생체내 말초골 정량적 전산화 단층촬영 [pQCT]으로 MOR05177이 골 무기질 함량 (도 6) 및 밀도 (도 7)를 증가시키는, 고령의 마우스의 근위 경골에서 강한 골 동화성임을 입증하였다. 골 동화 효과는 피질 (도 8) 및 해면골 (도 9) 구획 모두에서 일어났다. 이들 데이타는 비-골모세포에서 Wnt 신호전달 리포터 분석에서 스클레로스틴 작용에 대한 MOR05813의 관찰된 억제 효과가 생체 내에서 스클레로스틴 억제로 인한 골 형성 반응의 유도로 번역되는 것을 제안한다. 마우스에서 골 동화 반응의 크기는 고용량의 hPTH(1-34)에 의해 유도된 골 동화작용에 대등하였다.
MicroCT 분석으로 지주골 부피의 증가 (도 9)가 골 동화작용과 일치하는 주로 지주골 구조의 비후에 관련됨 (도 10)을 입증하였다.
골 무기질 밀도는 5주까지 계속 처리한 동물에서 더욱 증가하였다 (도 11). 생체 외에서 DEXA에 의해 평가한 골 무기질 밀도는 팔다리 (경골, 대퇴골) 및 몸통 (요추) 골격 (도 12 - 14)에서 증가하였다. 효과는 100 ㎍/kg hPTH(1-34)로 매일 처리한 양성 대조군에서 측정된 것에 대등하였다.
골 형성 동역학의 조직형태계측 형광색소 마커 기반 분석으로 골 질량 증가가 팔다리 (도 15) 및 몸통 골격 (도 18)에서 골 형성률의 실질적인 증가로 인한 것임을 입증하였다. 효과는 고용량의 PTH(1-34)의 것에 대등하였다. 골 형성률의 증가는 무기질 침착율 (도 16) 및 무기질화 표면 (도 17)의 증가에 모두 관련되었다. 골 흡수는 파골세포 표면 측정에 의해 입증되는 바와 같이 처리에 의해 증가되지 않았다 (도 19).
실시예 11: 본 발명의 스클레로스틴 결합 항체를 교차 차단하는 항체의 스크리닝
Biacore 교차 차단 분석
다음은 항체 또는 다른 결합 물질이 본 발명에 따른 항체를 교차-차단하는지 또는 교차-차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 적합한 Biacore 분석을 일반적으로 설명한다. 분석은 본원에서 설명되는 임의의 스클레로스틴 결합 물질과 함께 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
Biacore 기기 (예를 들어 BIAcore 3000)은 제조자의 권장사항에 일치하게 작동된다.
스클레로스틴을 일상적으로 사용되는 아민 커플링 화학, 예를 들어 EDC-NHS 아민 커플링에 의해, 예를 들어 CM5 Biacore 칩에 커플링시켜 스클레로스틴-코팅된 표면을 생성할 수 있다. 측정가능한 수준의 결합을 얻기 위해, 대개 200-800 공명 단위의 스클레로스틴을 칩에 커플링시킬 수 있다 (상기 양은 측정가능한 수준의 결합을 제공하고, 동시에 사용되는 시험 시약의 농도에 의해 쉽게 포화가능하다).
스클레로스틴을 BIAcore 칩에 부착시키는 다른 방안은 "태깅된" 버전의 스클레로스틴, 예를 들어 N-말단 또는 C-말단 His-태깅된 스클레로스틴을 사용함에 의한 것이다. 상기 방식에서, 항-His 항체가 Biacore 칩에 커플링될 것이고, 이어서 His-태깅된 스클레로스틴이 칩의 표면 위로 통과되어 항-His 항체에 의해 포획될 것이다.
서로 교차-차단하는 능력에 대해 평가할 2개의 항체는 시험 혼합물을 생성하기 위해 적합한 버퍼 내에서 결합 부위의 화학양론적 양으로, 예를 들어 1 대 1 몰비로 혼합된다. 사용된 버퍼는 대개 단백질 화학에서 보통 사용되는 버퍼, 예를 들어 PBS (136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4 (pH 7.4)) 등이다. 결합 부위를 기준으로 농도를 계산할 때, 항체의 분자량은 항체의 총 분자량을 그 항체 상의 표적 (즉, 스클레로스틴) 결합 부위의 수로 나눈 값으로 가정된다.
시험 혼합물 내의 각각의 항체의 농도는 BIAcore 칩 상에 결합되는 스클레로스틴 분자 상에서 그 항체에 대한 결합 부위의 포화를 보장하기 위해 충분히 높아야 한다. 혼합물 내의 항체는 동일한 몰 농도 (결합 기초)이고, 그 농도는 대개 1.0 mM 내지 1.5 mM (결합 부위 기초)일 것이다.
독립적으로 별개의 항체를 함유하는 별개의 용액을 또한 제조하였다. 이들 별개의 용액을 위한 버퍼는 시험 혼합물에 대해 사용된 것과 동일한 버퍼이고 동일한 농도이어야 한다.
시험 혼합물을 스클레로스틴-코팅된 BIAcore 칩 위로 통과시키고, 결합을 기록하였다. 그 후, 결합된 항체는 칩을 예를 들어 산, 예를 들어 30 mM HCl로 약 1분 동안 처리함으로써 제거하였다. 칩에 결합된 스클레로스틴 분자가 손상되지 않도록 하는 것이 중요하다.
이어서, 제1 항체 단독의 용액을 스클레로스틴-코팅된 표면 위로 통과시키고, 결합을 기록하였다. 그 후, 칩-결합 스클레로스틴을 손상시키지 않으면서 모든 결합된 항체를 제거하기 위해 칩을 예를 들어 상기 언급된 산 처리에 의해 처리하였다.
이어서, 제2 항체 단독의 용액을 스클레로스틴-코팅된 표면 위로 통과시키고, 결합의 양을 기록하였다.
최대 이론적 결합은 각각의 항체의 스클레로스틴에 대한 개별적인 결합의 합으로서 정의할 수 있다. 이어서, 이를 측정된 항체들의 혼합물의 실제 결합과 비교한다. 실제 결합이 이론적 결합보다 더 낮으면, 2개의 항체는 서로 교차-차단성이다.
ELISA -기반 교차-차단 분석
항-스클레로스틴 항체 또는 다른 스클레로스틴 결합 물질의 교차-차단을 또한 ELISA 분석에 의해 검출할 수 있다.
ELISA-분석의 일반적인 원리는 항-스클레로스틴 항체를 ELISA 플레이트의 웰 상에 코팅하는 것을 포함한다. 이어서, 과량의 제2의 잠재적으로 교차-차단성인 항-스클레로스틴 항체를 용액에 첨가한다 (즉, ELISA 플레이트에 결합되지 않는). 이어서, 제한량의 스클레로스틴을 웰에 첨가한다.
웰 상으로 코팅된 항체 및 용액 내의 항체는 제한량의 스클레로스틴 분자의 결합에 대해 경쟁할 것이다. 이어서, 플레이트를 세척하여 코팅된 항체에 결합되지 않은 스클레로스틴을 제거하고, 또한 제2의 용액상 항체, 및 제2의 용액상 항체와 스클레로스틴 사이에 형성되는 임의의 복합체를 제거한다. 이어서, 결합된 스클레로스틴의 양을 적절한 스클레로스틴 검출 시약을 사용하여 측정한다. 코팅된 항체를 교차-차단할 수 있는 용액 내의 항체는 제2의 용액상 항체의 부재 하에 코팅된 항체가 결합할 수 있는 스클레로스틴 분자의 수에 비해 코팅된 항체가 결합할 수 있는 스클레로스틴 분자의 수를 감소시킬 수 있을 것이다.
상기 분석을 Ab-X 및 Ab-Y로 불리는 2개의 항체에 대하여 아래에서 추가로 보다 상세히 설명한다. Ab-X는 고정되는 항체가 되도록 선택되는 경우에 ELISA 플레이트의 웰 상으로 코팅되고, 그 후 플레이트를 적합한 차단 용액으로 차단시켜 후속적으로 첨가되는 시약의 비-특이적 결합을 최소화시킨다. 이어서, 웰당 Ab-Y 스클레로스틴 결합 부위의 몰이 ELISA 플레이트의 코팅 동안 웰당 사용되는 Ab-X 스클레로스틴 결합 부위의 몰보다 적어도 10배 더 높도록, 과량의 Ab-Y를 ELISA 플레이트에 첨가한다. 이어서, 웰당 첨가되는 스클레로스틴의 몰이 각각의 웰을 코팅하기 위해 사용된 Ab-X 스클레로스틴 결합 부위의 몰보다 적어도 25배 더 낮도록 스클레로스틴을 첨가한다. 적합한 인큐베이션 기간 후에, ELISA 플레이트를 세척하고, 스클레로스틴 검출 시약을 첨가하여 코팅된 항-스클레로스틴 항체 (이 경우에 Ab-X)가 특이적으로 결합하는 스클레로스틴의 양을 측정한다. 분석에 대한 배경 신호는 코팅된 항체 (이 경우에 Ab-X), 제2 용액상 항체 (이 경우에 Ab-Y), 스클레로스틴 버퍼 단독 (즉, 스클레로스틴 미함유) 및 스클레로스틴 검출 시약을 사용하여 웰에서 얻은 신호로서 정의한다. 분석에 대한 양성 대조군 신호는 코팅된 항체 (이 경우에 Ab-X), 제2 용액상 항체 버퍼 단독 (즉, 제2 용액상 항체 미함유), 스클레로스틴 및 스클레로스틴 검출 시약을 사용하여 웰에서 얻은 신호로서 정의한다. ELISA 분석은 양성 대조군 신호가 배경 신호의 적어도 6배가 되도록 하는 방식으로 실행할 필요가 있다.
어떤 항체를 코팅 항체로서 사용하고 어떤 항체를 제2 (경쟁자) 항체로서 사용할지의 선택에 의한 임의의 인위효과 (예를 들어, 스클레로스틴에 대한 Ab-X와 Ab-Y 사이의 유의하게 상이한 친화도)를 피하기 위해, 교차-차단 분석을 2가지 포맷으로 실행할 필요가 있다: 1) 포맷 1은 Ab-X가 ELISA 플레이트 상에 코팅되는 항체이고, Ab-Y가 용액으로 존재하는 경쟁자 항체인 경우이고, 2) 포맷 2는 Ab-Y가 ELISA 플레이트 상에 코팅되는 항체이고, Ab-X가 용액으로 존재하는 경쟁자 항체인 경우이다.
실시예 12: LRP6 의 SOST 결합에 대한 MOR05813 _ IgG2람다의 효과를 검출하기 위한 ELISA
LRP6 / 스클레로스틴 ELISA
96-웰 미량역가 비-처리 플레이트를 PBS에 희석시킨 LRP6/Fc (1 ㎍/ml, R&D 시스템즈, Cat#1505-LR)로 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 비-특이적 결합 (NSB)에 대한 대조군으로서, 몇몇 웰을 100 ㎕/웰의 PBS로 채웠다. 플레이트를 플라스틱 필름으로 덮고, RT에서 밤새 인큐베이팅하였다. 코팅 후에, 플레이트를 PBS 중의 0.05％ Tween 20 (플루카, Cat#93773)으로 200 ㎕/웰로 3회 세척하고, 웰을 1h 동안 37℃에서 TBS 중의 SuperBlock 차단 버퍼 (피어스, Cat#37535)를 300 ㎕/웰로 첨가함으로써 차단하였다. 인큐베이션 후에, 차단된 용액을 제거하고, PBS 중 1％ BSA 내에 희석시킨 스클레로스틴 (이. 콜라이 유래, 노바티스; 1-1000 ng/ml)을 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 플레이트를 2h 동안 RT에서 인큐베이팅한 후, PBS 중의 0.05％ Tween 20로 200 ㎕/웰로 3회 세척하였다. 그 후, PBS 중 1％ BSA 내에 희석시킨 항-스클레로스틴 항체 (1 ㎍/ml)를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 플레이트를 2h 동안 RT에서 인큐베이팅한 후, PBS 중의 0.05％ Tween 20으로 200 ㎕/웰로 3회 세척하였다. 마지막으로, PBS 중 1％ BSA (시그마 Cat. Nb.:A-7888) 내에 희석시킨 ALP 컨쥬게이팅된 항-염소 IgG Ab (1:5000; 시그마 Cat#A-7888)를 100 ㎕/웰로 1 h 동안 RT에서 첨가한 후, 플레이트를 PBS 중의 0.05％ Tween 20으로 200 ㎕/웰로 3회 세척하였다. ALP를 결정하기 위해, 100 ㎕/웰의 ALP 기질 (시그마, Cat#S0942) 용액 (1 정제/5 ml 디에탄올아민 기질 버퍼 1x; 피어스, Cat#34064)을 플레이트에 90 min 동안 첨가하고, 광학 밀도를 405 nm에서 측정하였다.
LRP6 / 스클레로스틴 ELISA 에서 모 및 친화도 성숙된 Fab 의 활성
LRP6/스클레로스틴 ELISA는 LRP6에 결합하는 스클레로스틴의 능력에 기초한다. 생산된 Fab를 추가로 특성 결정하기 위해서, 선택되는 Fab 및 IgG를 본 분석으로 시험하였다. 항-스클레로스틴 항체 (R&D) (1000 ng/ml = 약 7 nM)의 존재 하에, LRP6에 대한 스클레로스틴 (0.9 nM)의 결합이 대조군에 비해 68％ 억제되었다 (데이타 미제시). MOR05813_IgG2 람다는 90 nM에서 LRP6에 대한 스클레로스틴 결합을 90％까지 억제한 반면, 음성 대조군으로 사용된 항-라이소자임 IgG는 LRP6에 대한 스클레로스틴 결합에 대해 효과가 없었다 (도 20).
실시예 13: MOR05813 을 사용한 동시-처리
MOR05813 + 졸레드론산
8개월령의 암컷 OF1/IC 마우스 (n=10/군, 찰스 리버, 프랑스)를 난소절제하여 에스트로겐 박탈에 의해 골 손실을 유도하거나, 무손상으로 놓아두었다. 동물에게 항-스클레로스틴 항체 MOR05813 (24 mg/kg, h/mIgG2a) 또는 대조 항체 (항-PC-h/mIgG2a, 무손상 및 OVX 대조군)를 매주 2회 정맥내 투여하였다. 추가의 군에 졸레드론산을 단독으로 (100 ㎍/kg) 또는 항-스클레로스틴 항체 MOR05813과 조합으로 단일 투여하였다. 항체 처리는 3.5주 동안 지속하였다 (7회 투여).
난소절제에 앞서, 동물의 경골 골 질량 및 기하구조를 말초골 정량적 전산화 단층촬영 (pQCT)에 의해 측정하였다. 동물을 체중 및 경골 총 골 무기질 밀도에 따라 군 내에 균등하게 분포시켰다. 골 무기질 밀도, 질량 및 기하구조 변화를 처리 기간의 끝에 평가하였다.
결과를 평균+/-SEM으로 표현한다. 통계학적 분석은 RS1 (윈도우용 시리즈 1999, 도메인 매뉴팩처링 코퍼레이션 (Domain Manufacturing Corp., 미국))을 이용하여 수행하였다. 데이타는 일원 분산 분석 (ANOVA)으로 처리하였다. 분산의 동일성은 레벤 (Levene) F-검정에 의해 시험하고, 군들 사이의 차이는 본페로니 (Bonferroni)-조정 던넷 (Dunnett) 검정을 이용하여 시험하였다. 처리군을 대조 항체 처리된 OVX군으로부터의 차이의 유의성에 대해 시험하였다 (p<0.05*, p<0.01**).
난소절제로 유도된 골 손실은 고령의 마우스에서 항체 처리에 의해 차단될 수 있다 (도 21). 항체를 비스포스포네이트 졸레드론산의 단일 정맥내 주사와 조합으로 사용할 때, 골 손실이 차단되고, 골 무기질 함량 (도 21A) 및 밀도 (도 21B)의 증가뿐만 아니라 피질 두께 (도 21C) 및 해면골 무기질 밀도 (도 21D)의 증가로 표시되는 바와 같이 골 증가가 유도된다.
MOR05813 + 알렌드로네이트 전-처리
4.5개월령의 암컷 OF1/IC 마우스 (n=10/군, 찰스 리버, 프랑스)에게 항-스클레로스틴 항체 MOR05813 (10 mg/kg, h/mIgG2a) 또는 대조 항체 (항-PC-mIgG2a, 무손상 및 OVX 대조군)를 매주 2회 정맥내 투여하였다. 추가의 군에게 대조 항체 또는 항-스클레로스틴 항체 MOR05813을 투여하기 전에 7주 알렌드로네이트 전-처리 (4 ㎍/kg/일; 5일/주)를 수행하였다. 항체 처리는 3.5주 동안 지속하였다 (7회 투여).
동물의 경골 골 질량 및 기하구조를 항체 처리의 개시시에 말초골 정량적 전산화 단층촬영 (pQCT)에 의해 측정하였다. 동물을 체중 및 경골 총 골 무기질 밀도에 따라 군 내에 균등하게 분포시켰다. 골 무기질 밀도, 질량 및 기하구조 변화를 처리 기간의 끝에 평가하였다.
결과를 평균+/-SEM으로 표현한다. 통계학적 분석은 RS1 (윈도우용 시리즈 1999, 도메인 매뉴팩처링 코퍼레이션, 미국)을 이용하여 수행하였다. 데이타는 일원 분산 분석 (ANOVA)으로 처리하였다. 분산의 동일성은 레벤 F-검정에 의해 시험하고, 군들 사이의 차이는 본페로니-조정 던넷 검정을 이용하여 시험하였다. 알렌드로네이트 예비-처리군을 예비-처리하지 않은 군으로부터의 차이의 유의성에 대해 시험하였다 (p<0.05*, p<0.01**).
비스포스포네이트 알렌드로네이트로 장기 예비처리하면 총 골 무기질 함량 (도 22A) 및 밀도 (도 22B)의 증가뿐만 아니라 피질 두께 (도 22C) 및 해면골 무기질 밀도 (도 22D)의 증가에 의해 반영되는 바와 같이 항-스클레로스틴 MOR05813의 골 동화 작용에 부정적인 영향을 미치지 않는다. 투여 기간 후에도 비스포스포네이트의 지속적인 항-흡수 특성으로 인해, 총 골 무기질 함량 (도 22A) 및 피질 두께 (도 22C)의 증가가 관찰된다.
MOR05813 + DKK1 또는 hPTH
6개월령의 암컷 누드 (nude) 마우스 (n=8/군)에게 비히클, 항-스클레로스틴 항체 MOR05813 (10, 20 및 40 mg/kg, IgG2), 항-Dkk1 항체 (10 mg/kg, IgG1), hPTH(1-34) (100 ㎍/kg) 또는 그의 조합물을 매주 2회 정맥내 투여하였다. 항체 처리를 4주 지속하였다 (8회 투여).
동물의 경골 골 질량 및 기하구조를 처리 전에 말초골 정량적 전산화 단층촬영 (pQCT)에 의해 측정하였다. 동물을 체중 및 경골 총 골 무기질 밀도에 따라 군 내에 균등하게 분포시켰다. 골 무기질 밀도, 질량 및 기하구조 변화를 처리 기간의 끝에 평가하였다.
결과를 평균+/-SEM으로 표현한다. 통계학적 분석은 RS1 (윈도우용 시리즈 1999, 도메인 매뉴팩처링 코퍼레이션, 미국)을 이용하여 수행하였다. 데이타는 일원 분산 분석 (ANOVA)으로 처리하였다. 분산의 동일성은 레벤 F-검정에 의해 시험하고, 군들 사이의 차이는 본페로니-조정 던넷 검정을 이용하여 시험하였다. 군들을 비히클 처리군으로부터의 차이의 유의성에 대해 시험하였다 (p<0.05*, p<0.01**).
골 동화 효과는 항-스클레로스틴 MOR05813의 용량에 따라 증가한다 (도 23). 항-Dkk1 항체로 동시-처리하면 총 골 무기질 함량 (도 23A) 및 밀도 (도 23B) 및 피질 두께 (도 23C)의 개선된 증가와 해면골 무기질 밀도 (도 23D)의 상승적 증가를 일으킨다. hPTH(1-34)로 동시-처리하면 측정된 모든 파라미터에서 상승적 증가를 일으킨다 (도 23A-D).
<참조문헌>
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR ANTIBODIES AGAINST SCLEROSTIN <130> 52279 <160> 171 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Trp Val Ser Phe Ile Ser Gly Asp Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 1 5 10 15 Ser Val Lys Gly 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Trp Val Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 1 5 10 15 Ser Val Lys Gly 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Trp Val Ser Phe Ile Ser Gly Asp Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 1 5 10 15 Ser Val Lys Gly 20 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Trp Val Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 1 5 10 15 Ser Val Lys Gly 20 <210> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Trp Val Ser Val Thr Gly Val His Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Trp Val Ser Val Ile Gly Asn Trp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Trp Val Ser Val Thr Thr His Gln Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Trp Val Ser Ala Thr Asn Arg Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Trp Val Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 1 5 10 15 Ser Val Lys Gly 20 <210> 21 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Trp Val Ser Val Ile Thr Pro Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Trp Val Ser Val Ile Thr Pro Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Thr Phe Met His Gly His Leu Gly Gly Gly Leu Ser Met Asp Phe 1 5 10 15 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr 1 5 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Thr Phe Met His Gly His Leu Gly Gly Gly Leu Ser Met Asp Phe 1 5 10 15 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr 1 5 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr 1 5 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Phe Tyr Val His 1 5 10 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Trp Val Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 1 5 10 15 Ser Val Lys Gly 20 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Phe Tyr Val His 1 5 10 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser 1 5 10 <210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser 1 5 10 <210> 40 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser 1 5 10 <210> 41 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser 1 5 10 <210> 42 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser 1 5 10 <210> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser 1 5 10 <210> 44 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser 1 5 10 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Gly Ser Trp Ala Gly Ser Ser Gly Ser Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 1 5 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Ala Ser Trp Thr Gly Val Glu Pro Asp Tyr 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Gln Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Glu 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 1 5 10 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Ser Thr Tyr Asp Gly Pro Gly Leu Ser Glu 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 1 5 10 <210> 67 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Gly Asp Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Phe Met His Gly His Leu Gly Gly Gly Leu Ser Met Asp 100 105 110 Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 68 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30 Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Gly Asp Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Phe Met His Gly His Leu Gly Gly Gly Leu Ser Met Asp 100 105 110 Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30 Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30 Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Thr Gly Val His Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 72 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30 Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Gly Asn Trp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30 Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Thr Thr His Gln Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 74 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30 Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Thr Asn Arg Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 75 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30 Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 76 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30 Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Thr Pro Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 77 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30 Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Thr Pro Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 78 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Phe Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Ala Gly Ser Ser Gly Ser 85 90 95 Tyr Val Phe Gly Gly Arg Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 79 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile 20 25 30 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Glu Ser 85 90 95 Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 80 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Ser Phe Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Thr Gly Val Glu Pro Asp 85 90 95 Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 <210> 81 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile 20 25 30 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Tyr Leu Ser Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 82 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile 20 25 30 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Glu Ser 85 90 95 Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 83 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile 20 25 30 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Glu Ser 85 90 95 Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 84 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile 20 25 30 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Glu Ser 85 90 95 Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 85 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile 20 25 30 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Glu Ser 85 90 95 Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 86 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile 20 25 30 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Asp Gly Pro 85 90 95 Gly Leu Ser Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 87 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile 20 25 30 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Glu Ser 85 90 95 Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 88 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Ile 20 25 30 Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Asp Gly Pro 85 90 95 Gly Leu Ser Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln <210> 89 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taccttttct tcttatgtta tgaattgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcttt atctctggtg attctagcaa tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtactttt 300 atgcatggtc atcttggtgg tggtctttct atggattttt ggggccaagg caccctggtg 360 acggttagct ca 372 <210> 90 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttcgt tctcattggc tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcaat atcaattatg atggtagctc tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgatact 300 tatcttcatt ttgattattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a 351 <210> 91 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taccttttct tcttatgtta tgaattgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcttt atctctggtg attctagcaa tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtactttt 300 atgcatggtc atcttggtgg tggtctttct atggattttt ggggccaagg caccctggtg 360 acggttagct ca 372 <210> 92 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttcgt tctcattggc tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcaat atcaattatg atggtagctc tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgatact 300 tatcttcatt ttgattattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a 351 <210> 93 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttcgt tctcattggc tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt actggtgttc atggtgatac ttattatgct 180 gattctgtta agggtcgttt taccatttca cgtgataatt cgaaaaacac cctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgatacttat 300 cttcattttg attattgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca 348 <210> 94 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttcgt tctcattggc tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt attggtaatt ggggtgatac ttattatgct 180 gattctgtta agggtcgttt taccatttca cgtgataatt cgaaaaacac cctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgatacttat 300 cttcattttg attattgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca 348 <210> 95 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttcgt tctcattggc tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt actactcatc agggttatac ttattatgct 180 gattctgtta agggtcgttt taccatttca cgtgataatt cgaaaaacac cctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgatacttat 300 cttcattttg attattgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca 348 <210> 96 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttcgt tctcattggc tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgct actaatcgtt atggttatac ttattatgct 180 gattctgtta agggtcgttt taccatttca cgtgataatt cgaaaaacac cctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgatacttat 300 cttcattttg attattgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca 348 <210> 97 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttcgt tctcattggc tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcaat atcaattatg atggtagctc tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgatact 300 tatcttcatt ttgattattg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a 351 <210> 98 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttcgt tctcattggc tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt attactcctt atggtgatac ttattatgct 180 gattctgtta agggtcgttt taccatttca cgtgataatt cgaaaaacac cctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgatacttat 300 cttcattttg attattgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca 348 <210> 99 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttcgt tctcattggc tttcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt attactcctt atggtgatac ttattatgct 180 gattctgtta agggtcgttt taccatttca cgtgataatt cgaaaaacac cctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tgatacttat 300 cttcattttg attattgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca 348 <210> 100 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgataatat tggttctttt tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat aataatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg cggttcttgg gctggttctt ctggttctta tgtgtttggc 300 ggccgcacga agttaaccgt tcttggccag 330 <210> 101 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt gatattaatg atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatgatgtta ataatcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc tcttcttatg gtgagtctct tacttcttat 300 gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccag 339 <210> 102 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgataatat tggttctttt tatgttcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttatgatgat aataatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg cgcttcttgg actggtgttg agcctgatta tgtgtttggc 300 ggcggcacga agttaaccgt tcttggccag 330 <210> 103 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt gatattaatg atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatgatgtta ataatcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc cagtcttatg ctggttctta tctttctgag 300 gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccag 339 <210> 104 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt gatattaatg atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatgatgtta ataatcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc tcttcttatg gtgagtctct tacttcttat 300 gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccag 339 <210> 105 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt gatattaatg atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatgatgtta ataatcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc tcttcttatg gtgagtctct tacttcttat 300 gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccag 339 <210> 106 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt gatattaatg atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatgatgtta ataatcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc tcttcttatg gtgagtctct tacttcttat 300 gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccag 339 <210> 107 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt gatattaatg atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatgatgtta ataatcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc tcttcttatg gtgagtctct tacttcttat 300 gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccag 339 <210> 108 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt gatattaatg atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatgatgtta ataatcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc tctacttatg atggtcctgg tctttctgag 300 gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccag 339 <210> 109 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt gatattaatg atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatgatgtta ataatcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc tcttcttatg gtgagtctct tacttcttat 300 gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccag 339 <210> 110 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 gatatcgcac tgacccagcc agcttcagtg agcggctcac caggtcagag cattaccatc 60 tcgtgtacgg gtactagcag cgatgttggt gatattaatg atgtgtcttg gtaccagcag 120 catcccggga aggcgccgaa acttatgatt tatgatgtta ataatcgtcc ctcaggcgtg 180 agcaaccgtt ttagcggatc caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240 caagcggaag acgaagcgga ttattattgc tctacttatg atggtcctgg tctttctgag 300 gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtt cttggccag 339 <210> 111 <211> 469 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Phe Ile Ser Gly Asp Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Phe Met His Gly His Leu Gly Gly Gly Leu 115 120 125 Ser Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser 145 150 155 160 Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 165 170 175 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 180 185 190 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 195 200 205 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr 210 215 220 Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr 225 230 235 240 Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro 245 250 255 Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 305 310 315 320 Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 112 <211> 462 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 225 230 235 240 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 113 <211> 469 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Phe Ile Ser Gly Asp Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Phe Met His Gly His Leu Gly Gly Gly Leu 115 120 125 Ser Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser 145 150 155 160 Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 165 170 175 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 180 185 190 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 195 200 205 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr 210 215 220 Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr 225 230 235 240 Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro 245 250 255 Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 305 310 315 320 Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 114 <211> 462 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 225 230 235 240 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 115 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Val Thr Gly Val His Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 210 215 220 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 260 265 270 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 275 280 285 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 305 310 315 320 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 325 330 335 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 340 345 350 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 355 360 365 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 370 375 380 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 385 390 395 400 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 420 425 430 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 116 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Val Ile Gly Asn Trp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 210 215 220 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 260 265 270 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 275 280 285 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 305 310 315 320 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 325 330 335 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 340 345 350 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 355 360 365 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 370 375 380 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 385 390 395 400 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 420 425 430 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 117 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Val Thr Thr His Gln Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 210 215 220 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 260 265 270 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 275 280 285 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 305 310 315 320 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 325 330 335 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 340 345 350 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 355 360 365 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 370 375 380 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 385 390 395 400 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 420 425 430 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 118 <211> 465 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Thr Asn Arg Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 195 200 205 Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 210 215 220 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys 225 230 235 240 Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser 260 265 270 Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp 275 280 285 Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr 290 295 300 Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu 325 330 335 Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val 355 360 365 Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr 370 375 380 Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr 385 390 395 400 Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys 420 425 430 Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu 435 440 445 Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 119 <211> 462 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 225 230 235 240 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 120 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Val Ile Thr Pro Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 210 215 220 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 260 265 270 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 275 280 285 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 305 310 315 320 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 325 330 335 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 340 345 350 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 355 360 365 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 370 375 380 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 385 390 395 400 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 420 425 430 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 121 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Pro Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Val Gln Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Arg Ser His Trp Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Val Ile Thr Pro Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 210 215 220 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 260 265 270 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln 275 280 285 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu 305 310 315 320 Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 325 330 335 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 340 345 350 Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 355 360 365 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 370 375 380 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 385 390 395 400 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 420 425 430 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 435 440 445 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 122 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val 20 25 30 Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly 35 40 45 Ser Phe Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val 50 55 60 Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly 85 90 95 Thr Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Ala Gly 100 105 110 Ser Ser Gly Ser Tyr Val Phe Gly Gly Arg Thr Lys Leu Thr Val Leu 115 120 125 Gly Gln 130 <210> 123 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly 20 25 30 Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp 35 40 45 Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val 65 70 75 80 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser 100 105 110 Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 145 150 155 160 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp 165 170 175 Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln 180 185 190 Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu 195 200 205 Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly 210 215 220 Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 124 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val 20 25 30 Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly 35 40 45 Ser Phe Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val 50 55 60 Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly 85 90 95 Thr Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Thr Gly 100 105 110 Val Glu Pro Asp Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 115 120 125 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 130 135 140 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 165 170 175 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 180 185 190 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 195 200 205 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 210 215 220 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 <210> 125 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly 20 25 30 Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp 35 40 45 Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val 65 70 75 80 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser 100 105 110 Tyr Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 145 150 155 160 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp 165 170 175 Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln 180 185 190 Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu 195 200 205 Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly 210 215 220 Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 126 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly 20 25 30 Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp 35 40 45 Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val 65 70 75 80 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser 100 105 110 Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 145 150 155 160 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp 165 170 175 Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln 180 185 190 Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu 195 200 205 Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly 210 215 220 Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 127 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly 20 25 30 Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp 35 40 45 Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val 65 70 75 80 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser 100 105 110 Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 145 150 155 160 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp 165 170 175 Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln 180 185 190 Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu 195 200 205 Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly 210 215 220 Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 128 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly 20 25 30 Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp 35 40 45 Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val 65 70 75 80 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser 100 105 110 Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 145 150 155 160 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp 165 170 175 Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln 180 185 190 Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu 195 200 205 Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly 210 215 220 Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 129 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly 20 25 30 Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp 35 40 45 Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val 65 70 75 80 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser 100 105 110 Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 145 150 155 160 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp 165 170 175 Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln 180 185 190 Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu 195 200 205 Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly 210 215 220 Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 130 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly 20 25 30 Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp 35 40 45 Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val 65 70 75 80 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr 100 105 110 Tyr Asp Gly Pro Gly Leu Ser Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 145 150 155 160 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp 165 170 175 Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln 180 185 190 Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu 195 200 205 Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly 210 215 220 Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 131 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly 20 25 30 Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp 35 40 45 Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val 65 70 75 80 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser 100 105 110 Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 145 150 155 160 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp 165 170 175 Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln 180 185 190 Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu 195 200 205 Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly 210 215 220 Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 132 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly 20 25 30 Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp 35 40 45 Val Gly Asp Ile Asn Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val 65 70 75 80 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr 100 105 110 Tyr Asp Gly Pro Gly Leu Ser Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 145 150 155 160 Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp 165 170 175 Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln 180 185 190 Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu 195 200 205 Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly 210 215 220 Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 133 <211> 1410 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133 atggcttggg tgtggacctt gccattcctg atggcagctg cccaaagcgt gcaggcccag 60 gtgcagctgg tcgagtctgg cggcggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagcagc tacgtgatga actgggtgcg gcaggcccct 180 ggcaagggcc tggagtgggt gtccttcatc agcggcgaca gcagcaacac ctactacgcc 240 gacagcgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaaca gcctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gaccttcatg 360 cacggccacc tgggcggagg actgagcatg gatttctggg gccagggcac cctggtcacc 420 gtctcctcag cttccaccaa gggcccatcc gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 480 acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540 acggtgtcgt ggaactcagg cgctctgacc agcggcgtgc acaccttccc agctgtccta 600 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgacag tgccctccag caacttcggc 660 acccagacct acacctgcaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaca 720 gttgagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag caccacctgt ggcaggaccg 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccac gggaggagca gttcaacagc 960 acgttccgtg tggtcagcgt cctcaccgtt gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 accaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacacc tcccatgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1410 <210> 134 <211> 1389 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 atggcttggg tgtggacctt gccattcctg atggcagctg cccaaggtgt ccaggcccag 60 gtgcagctgg tcgagagcgg cggagggctg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagaagc cactggctgt cctgggtgcg gcaggcccct 180 ggcaagggcc tggaatgggt gtccaacatc aactacgacg gcagcagcac ctactacgcc 240 gacagcgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaaca gcctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag ggacacctac 360 ctgcacttcg actactgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctcctcagc ttccaccaag 420 ggcccatccg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagcggcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gctctgacca gcggcgtgca caccttccca gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgacagt gccctccagc aacttcggca cccagaccta cacctgcaac 660 gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagacag ttgagcgcaa atgttgtgtc 720 gagtgcccac cgtgcccagc accacctgtg gcaggaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccacg ggaggagcag ttcaacagca cgttccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgttg tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaaggcctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacacct cccatgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaatga 1389 <210> 135 <211> 1410 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 135 atggcttggg tgtggacctt gccattcctg atggcagctg cccaaagcgt gcaggcccag 60 gtgcagctgg tcgagtctgg cggcggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagcagc tacgtgatga actgggtgcg gcaggcccct 180 ggcaagggcc tggagtgggt gtccttcatc agcggcgaca gcagcaacac ctactacgcc 240 gacagcgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaaca gcctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg gaccttcatg 360 cacggccacc tgggcggagg actgagcatg gatttctggg gccagggcac cctggtcacc 420 gtctcctcag cttccaccaa gggcccatcc gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 480 acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540 acggtgtcgt ggaactcagg cgctctgacc agcggcgtgc acaccttccc agctgtccta 600 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgacag tgccctccag caacttcggc 660 acccagacct acacctgcaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaca 720 gttgagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag caccacctgt ggcaggaccg 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccac gggaggagca gttcaacagc 960 acgttccgtg tggtcagcgt cctcaccgtt gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 accaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacacc tcccatgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1410 <210> 136 <211> 1389 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 136 atggcttggg tgtggacctt gccattcctg atggcagctg cccaaggtgt ccaggcccag 60 gtgcagctgg tcgagagcgg cggagggctg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagaagc cactggctgt cctgggtgcg gcaggcccct 180 ggcaagggcc tggaatgggt gtccaacatc aactacgacg gcagcagcac ctactacgcc 240 gacagcgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaaca gcctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag ggacacctac 360 ctgcacttcg actactgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctcctcagc ttccaccaag 420 ggcccatccg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagcggcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gctctgacca gcggcgtgca caccttccca gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgacagt gccctccagc aacttcggca cccagaccta cacctgcaac 660 gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagacag ttgagcgcaa atgttgtgtc 720 gagtgcccac cgtgcccagc accacctgtg gcaggaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccacg ggaggagcag ttcaacagca cgttccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgttg tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaaggcctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacacct cccatgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaatga 1389 <210> 137 <211> 1386 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 atggcttggg tgtggacctt gccattcctg atggcagctg cccaaagtgt ccaggcccag 60 gtgcagctgg tcgagagcgg cggagggctg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagaagc cactggctgt cctgggtgcg gcaggcccct 180 ggcaagggcc tggaatgggt gtccgtgacc ggcgtgcacg gcgacaccta ctacgccgac 240 agcgtgaagg gccggttcac catcagccgg gacaacagca agaacaccct gtacctgcag 300 atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccaggga cacctacctg 360 cacttcgact actggggcca gggcaccctg gtcaccgtct cctcagcttc caccaagggc 420 ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agcggccctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct 540 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600 agcagcgtgg tgacagtgcc ctccagcaac ttcggcaccc agacctacac ctgcaacgta 660 gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacagttg agcgcaaatg ttgtgtcgag 720 tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccacggga ggagcagttc aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc 960 accgttgtgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380 aaatga 1386 <210> 138 <211> 1386 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 138 atggcttggg tgtggacctt gccattcctg atggcagctg cccaaagtgt ccaggcccag 60 gtgcagctgg tcgagagcgg cggagggctg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagaagc cactggctgt cctgggtgcg gcaggcccct 180 ggcaagggcc tggaatgggt gtccgtgatc ggcaactggg gcgacaccta ctacgccgac 240 agcgtgaagg gccggttcac catcagccgg gacaacagca agaacaccct gtacctgcag 300 atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccaggga cacctacctg 360 cacttcgact actggggcca gggcaccctg gtcaccgtct cctcagcttc caccaagggc 420 ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agcggccctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct 540 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600 agcagcgtgg tgacagtgcc ctccagcaac ttcggcaccc agacctacac ctgcaacgta 660 gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacagttg agcgcaaatg ttgtgtcgag 720 tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccacggga ggagcagttc aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc 960 accgttgtgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380 aaatga 1386 <210> 139 <211> 1386 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 atggcttggg tgtggacctt gccattcctg atggcagctg cccaaagtgt ccaggcccag 60 gtgcagctgg tcgagagcgg cggagggctg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagaagc cactggctgt cctgggtgcg gcaggcccct 180 ggcaagggcc tggaatgggt gtccgtgacc acccaccagg gctacaccta ctacgccgac 240 agcgtgaagg gccggttcac catcagccgg gacaacagca agaacaccct gtacctgcag 300 atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccaggga cacctacctg 360 cacttcgact actggggcca gggcaccctg gtcaccgtct cctcagcttc caccaagggc 420 ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agcggccctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct 540 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600 agcagcgtgg tgacagtgcc ctccagcaac ttcggcaccc agacctacac ctgcaacgta 660 gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacagttg agcgcaaatg ttgtgtcgag 720 tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccacggga ggagcagttc aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc 960 accgttgtgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380 aaatga 1386 <210> 140 <211> 1386 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 140 atggcttggg tgtggacctt gccattcctg atggcagctg cccaaagtgt ccaggcccag 60 gtgcagctgg tcgagagcgg cggagggctg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagaagc cactggctgt cctgggtgcg gcaggcccct 180 ggcaagggcc tggaatgggt gtccgccacc aacagatacg gctacaccta ctacgccgac 240 agcgtgaagg gccggttcac catcagccgg gacaacagca agaacaccct gtacctgcag 300 atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccaggga cacctacctg 360 cacttcgact actggggcca gggcaccctg gtcaccgtct cctcagcttc caccaagggc 420 ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agcggccctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct 540 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600 agcagcgtgg tgacagtgcc ctccagcaac ttcggcaccc agacctacac ctgcaacgta 660 gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacagttg agcgcaaatg ttgtgtcgag 720 tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccacggga ggagcagttc aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc 960 accgttgtgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380 aaatga 1386 <210> 141 <211> 1389 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141 atggcttggg tgtggacctt gccattcctg atggcagctg cccaaggtgt ccaggcccag 60 gtgcagctgg tcgagagcgg cggagggctg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagaagc cactggctgt cctgggtgcg gcaggcccct 180 ggcaagggcc tggaatgggt gtccaacatc aactacgacg gcagcagcac ctactacgcc 240 gacagcgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaaca gcctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag ggacacctac 360 ctgcacttcg actactgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctcctcagc ttccaccaag 420 ggcccatccg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagcggcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gctctgacca gcggcgtgca caccttccca gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgacagt gccctccagc aacttcggca cccagaccta cacctgcaac 660 gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagacag ttgagcgcaa atgttgtgtc 720 gagtgcccac cgtgcccagc accacctgtg gcaggaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccacg ggaggagcag ttcaacagca cgttccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgttg tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaaggcctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaaa ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacacct cccatgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaatga 1389 <210> 142 <211> 1386 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 142 atggcttggg tgtggacctt gccattcctg atggcagctg cccaaagtgt ccaggcccag 60 gtgcagctgg tcgagagcgg cggagggctg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagaagc cactggctgt cctgggtgcg gcaggcccct 180 ggcaagggcc tggaatgggt gtccgtgatc accccctacg gcgacaccta ctacgccgac 240 agcgtgaagg gccggttcac catcagccgg gacaacagca agaacaccct gtacctgcag 300 atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccaggga cacctacctg 360 cacttcgact actggggcca gggcaccctg gtcaccgtct cctcagcttc caccaagggc 420 ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agcggccctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct 540 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600 agcagcgtgg tgacagtgcc ctccagcaac ttcggcaccc agacctacac ctgcaacgta 660 gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacagttg agcgcaaatg ttgtgtcgag 720 tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccacggga ggagcagttc aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc 960 accgttgtgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380 aaatga 1386 <210> 143 <211> 1386 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 atggcttggg tgtggacctt gccattcctg atggcagctg cccaaagtgt ccaggcccag 60 gtgcagctgg tcgagagcgg cggagggctg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagaagc cactggctgt cctgggtgcg gcaggcccct 180 ggcaagggcc tggaatgggt gtccgtgatc accccctacg gcgacaccta ctacgccgac 240 agcgtgaagg gccggttcac catcagccgg gacaacagca agaacaccct gtacctgcag 300 atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccaggga cacctacctg 360 cacttcgact actggggcca gggcaccctg gtcaccgtct cctcagcttc caccaagggc 420 ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agcggccctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct 540 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600 agcagcgtgg tgacagtgcc ctccagcaac ttcggcaccc agacctacac ctgcaacgta 660 gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacagttg agcgcaaatg ttgtgtcgag 720 tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccacggga ggagcagttc aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc 960 accgttgtgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200 ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1260 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1320 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1380 aaatga 1386 <210> 144 <211> 393 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 144 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60 gccgatatcg aactgaccca gccgccttca gtgagcgttg caccaggtca gaccgcgcgt 120 atctcgtgta gcggcgataa tattggttct ttttatgttc attggtacca gcagaaaccc 180 gggcaggcgc cagttcttgt gatttatgat gataataatc gtccctcagg catcccggaa 240 cgctttagcg gatccaacag cggcaacacc gcgaccctga ccattagcgg cactcaggcg 300 gaagacgaag cggattatta ttgcggttct tgggctggtt cttctggttc ttatgtgttt 360 ggcggccgca cgaagttaac cgttcttggc cag 393 <210> 145 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcagctacg gcgagagcct gaccagctac 360 gtgtttggcg gcggaaccaa gcttaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 <210> 146 <211> 705 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgagc tgacccagcc ccccagcgtg agcgtggccc ctggccagac cgcccggatc 120 agctgcagcg gcgacaacat cggcagcttc tacgtgcact ggtatcagca gaagcccggc 180 caggcccccg tgctggtgat ctacgacgac aacaaccggc ccagcggcat ccccgagcgg 240 ttcagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcac ccaggccgag 300 gacgaggccg actactactg cgccagctgg accggcgtgg agcccgacta cgtgtttggc 360 ggcggaacaa agcttaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 420 ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 480 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 540 gtggagacaa ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 600 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 660 gggagcaccg tggaaaagac agtggcccct acagaatgtt catag 705 <210> 147 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 caggccgagg acgaggccga ctactactgc cagagctacg ccggcagcta cctgagcgag 360 gtgttcggcg gagggaccaa gcttaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 <210> 148 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 148 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcagctacg gcgagagcct gaccagctac 360 gtgtttggcg gcggaaccaa gcttaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 <210> 149 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 149 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcagctacg gcgagagcct gaccagctac 360 gtgtttggcg gcggaaccaa gcttaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 <210> 150 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 150 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcagctacg gcgagagcct gaccagctac 360 gtgtttggcg gcggaaccaa gcttaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 <210> 151 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcagctacg gcgagagcct gaccagctac 360 gtgtttggcg gcggaaccaa gcttaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 <210> 152 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 152 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcacctacg acggccctgg cctgagcgag 360 gtgttcggcg gagggaccaa gcttaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 <210> 153 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 153 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcacctacg acggccctgg cctgagcgag 360 gtgttcggcg gagggaccaa gcttaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 <210> 154 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 154 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcacctacg acggccctgg cctgagcgag 360 gtgttcggcg gagggaccaa gcttaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 <210> 155 <211> 213 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 155 Met Gln Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu Val Cys Leu Leu Val His Thr 1 5 10 15 Ala Phe Arg Val Val Glu Gly Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp 20 25 30 Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro 35 40 45 Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg 50 55 60 Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys 65 70 75 80 Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser 85 90 95 Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala 100 105 110 Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser 115 120 125 Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val 130 135 140 Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg 145 150 155 160 Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gln 165 170 175 Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gln Lys Gly 180 185 190 Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ala Lys Ala Asn Gln Ala Glu 195 200 205 Leu Glu Asn Ala Tyr 210 <210> 156 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 Ala Arg Leu Leu Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg 1 5 10 <210> 157 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu Thr Arg Phe His 1 5 10 15 <210> 158 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Protein linker sequence <400> 158 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 159 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Protein linker sequence <400> 159 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly <210> 160 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 160 taaattatca taaagtccta a 21 <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 161 aggactttat gataatttat t 21 <210> 162 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 162 atagtggtta aataactcca g 21 <210> 163 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 163 ggagttattt aaccactatt t 21 <210> 164 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 164 taaattctcg tgatgtgcca t 21 <210> 165 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 165 ggcacatcac gagaatttat t 21 <210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 166 tttcttatag cacagctggt t 21 <210> 167 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 167 ccagctgtgc tataagaaat t 21 <210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 168 tagacctttc catccacgct g 21 <210> 169 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> siRNA <400> 169 gcgtggatgg aaaggtctat t 21 <210> 170 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RT-PCT primer <400> 170 atgcagctcc cactggccct gtgtcttgt 29 <210> 171 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RT-PCR primer <400> 171 aatcaggccg agctggagaa cgcctactag 30

Claims (1)

  1. 스클레로스틴에 의해 매개되거나 증가된 수준의 스클레로스틴과 연관되는 병리학적 질환, 예를 들어 뼈와 관련된 질병, 예를 들어 골다공증을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 스클레로스틴 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, 포유동물에서 골 형성, 골 무기질 밀도 및 골 무기질 함량을 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 스클레로스틴 폴리펩티드 (서열 155) 내의 표적에 대한 단리된 항체, 또는 상기 항체의 항원 결합 부분을 포함하는 기능성 단백질의 용도.
KR1020137005418A 2007-10-12 2008-10-10 스클레로스틴에 대한 항체의 조성물 및 사용 방법 KR20130029452A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07118414 2007-10-12
EP07118414.7 2007-10-12
EP08151911 2008-02-25
EP08151911.8 2008-02-25
EP08161342 2008-07-29
EP08161342.4 2008-07-29
PCT/EP2008/063691 WO2009047356A1 (en) 2007-10-12 2008-10-10 Compositions and methods for use for antibodies against sclerostin

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107010349A Division KR101268675B1 (ko) 2007-10-12 2008-10-10 스클레로스틴에 대한 항체의 조성물 및 사용 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20130029452A true KR20130029452A (ko) 2013-03-22

Family

ID=40219404

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137005418A KR20130029452A (ko) 2007-10-12 2008-10-10 스클레로스틴에 대한 항체의 조성물 및 사용 방법
KR1020107010349A KR101268675B1 (ko) 2007-10-12 2008-10-10 스클레로스틴에 대한 항체의 조성물 및 사용 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107010349A KR101268675B1 (ko) 2007-10-12 2008-10-10 스클레로스틴에 대한 항체의 조성물 및 사용 방법

Country Status (36)

Country Link
US (3) US7879322B2 (ko)
EP (2) EP2586796B1 (ko)
JP (3) JP2011502470A (ko)
KR (2) KR20130029452A (ko)
CN (1) CN101821291B (ko)
AR (1) AR068767A1 (ko)
AU (1) AU2008309514B2 (ko)
BR (1) BRPI0817879A2 (ko)
CA (1) CA2702005C (ko)
CL (1) CL2008003004A1 (ko)
CO (1) CO6270368A2 (ko)
CR (1) CR11313A (ko)
CU (1) CU23869B1 (ko)
CY (2) CY1114872T1 (ko)
DK (2) DK2586796T3 (ko)
EA (1) EA018756B1 (ko)
ES (2) ES2614328T3 (ko)
GT (1) GT201000085A (ko)
HK (1) HK1143173A1 (ko)
HN (1) HN2010000674A (ko)
HR (2) HRP20140161T1 (ko)
HU (1) HUE031995T2 (ko)
IL (1) IL204510A (ko)
LT (1) LT2586796T (ko)
MA (1) MA31760B1 (ko)
MX (1) MX2010003915A (ko)
MY (1) MY152282A (ko)
NZ (1) NZ584158A (ko)
PE (1) PE20091221A1 (ko)
PL (2) PL2586796T3 (ko)
PT (2) PT2203478E (ko)
SI (2) SI2203478T1 (ko)
TN (1) TN2010000140A1 (ko)
TW (1) TWI489993B (ko)
WO (1) WO2009047356A1 (ko)
ZA (1) ZA201001789B (ko)

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040009535A1 (en) * 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
BRPI9915679B8 (pt) 1998-11-27 2021-05-25 Darwin Discovery Ltd composições e métodos para aumentar a mineralização óssea
RS20050934A (en) 2003-06-16 2008-04-04 Celltech R. & D. Inc., Antibodies specific for sclerostin and methods fo r increasing bone mineralization
US8461155B2 (en) * 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
WO2007053577A2 (en) 2005-10-31 2007-05-10 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
US7723477B2 (en) * 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
EP3345607B1 (en) 2006-12-29 2022-10-26 Ossifi-Mab LLC Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
US8680019B2 (en) * 2007-08-10 2014-03-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin Type III binding-domain libraries
US8470966B2 (en) 2007-08-10 2013-06-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
JP5781762B2 (ja) * 2007-08-10 2015-09-24 プロテリックス、インク ユニバーサルｉｉｉ型フィブロネクチン結合ドメインのライブラリ
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
TWI489993B (zh) * 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
CA2705923A1 (en) 2007-11-16 2009-05-22 Nuvelo, Inc. Antibodies to lrp6
DK2708559T3 (en) 2008-04-11 2018-06-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of repeatedly binding two or more antigen molecules
RU2579897C2 (ru) * 2008-09-26 2016-04-10 Онкомед Фармасьютикалс, Инк. Агенты, связывающие рецептор "frizzled", и их применение
AR075715A1 (es) * 2009-03-05 2011-04-20 Novartis Ag Formulacion de anticuerpo liofilizado
WO2010115932A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Novartis Ag Combination for the treatment of bone loss
WO2011037791A1 (en) * 2009-09-25 2011-03-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Antagonists of pcsk9
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
KR20130043102A (ko) 2010-04-01 2013-04-29 온코메드 파마슈티칼스, 인크. 프리즐드-결합 작용제 및 그의 용도
AU2011237679B2 (en) 2010-04-07 2014-11-06 Abbvie Inc. TNF-alpha binding proteins
BR112012026098A2 (pt) * 2010-04-16 2016-11-22 Novartis Ag métodos e composições para melhorar a osseointegração de implante.
US9290573B2 (en) 2010-05-06 2016-03-22 Novartis Ag Therapeutic low density lipoprotein-related protein 6 (LRP6) multivalent antibodies
JP2013527762A (ja) 2010-05-06 2013-07-04 ノバルティス アーゲー 治療的低密度リポタンパク質関連タンパク質６（ｌｒｐ６）抗体の組成物および使用方法
DK3195880T3 (da) 2010-05-14 2020-03-02 Amgen Inc Højkoncentrerede anti-sclerostin-antistofformuleringer
US9403882B2 (en) 2010-06-07 2016-08-02 Joshua Rabbani Sulfation of Wnt pathway proteins
US9493541B2 (en) 2010-06-07 2016-11-15 Joshua Rabbani Antibodies specific for sulfated sclerostin
US11167011B2 (en) 2010-06-07 2021-11-09 Enzo Biochem, Inc. Methods for treating bone loss using sclerostin peptides
US9617323B2 (en) 2010-06-07 2017-04-11 Joshua Rabbani Sulfonated sclerostin, antibodies, epitopes and methods for identification and use therefor
WO2012028683A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Novartis Ag Antibody gel system for sustained drug delivery
WO2012058393A2 (en) * 2010-10-27 2012-05-03 Amgen Inc. Dkk1 antibodies and methods of use
EP3111954B1 (en) 2010-11-05 2019-04-03 Novartis Ag Methods of treating ankylosing spondylitis using anti-il-17 antibodies
TWI812066B (zh) 2010-11-30 2023-08-11 日商中外製藥股份有限公司 具有鈣依存性的抗原結合能力之抗體
MX2013010011A (es) 2011-03-01 2014-10-24 Amgen Inc Agentes de unión biespecífica.
MA35009B1 (fr) 2011-03-25 2014-04-03 Amgen Inc Cristaux d'anticorps anti-sclérotine et formulations de ceux-ci
ES2685479T3 (es) 2011-04-19 2018-10-09 Amgen Inc. Método para el tratamiento de la osteoporosis
EP2702408A1 (en) 2011-04-29 2014-03-05 Novartis AG Methods of treating squamous cell carcinoma related applications
SI2739311T1 (en) * 2011-08-04 2018-07-31 Amgen Inc. Method for the treatment of bone defect defects
US10307167B2 (en) 2012-12-14 2019-06-04 Corquest Medical, Inc. Assembly and method for left atrial appendage occlusion
US10314594B2 (en) 2012-12-14 2019-06-11 Corquest Medical, Inc. Assembly and method for left atrial appendage occlusion
US10813630B2 (en) 2011-08-09 2020-10-27 Corquest Medical, Inc. Closure system for atrial wall
CA2853357A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Abbvie Inc. Immunobinders directed against tnf
TW201323441A (zh) 2011-10-24 2013-06-16 Abbvie Inc 抗ｔｎｆ之雙特異性免疫結合物
MX2014004977A (es) * 2011-10-24 2014-09-11 Abbvie Inc Inmunoaglutinantes dirigidos contra esclerostina.
AU2012332263A1 (en) 2011-11-04 2014-05-22 Novartis Ag Low density lipoprotein-related protein 6 (LRP6) - half life extender constructs
JP6363954B2 (ja) 2011-12-28 2018-07-25 アムジエン・インコーポレーテツド 抗スクレロスチン抗体の使用による歯槽骨消失の治療方法
EP3626267A1 (en) * 2012-07-05 2020-03-25 UCB Pharma, S.A. Treatment for bone diseases
AU2013334790A1 (en) 2012-10-23 2015-04-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using Wnt pathway-binding agents
US20140142689A1 (en) 2012-11-21 2014-05-22 Didier De Canniere Device and method of treating heart valve malfunction
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US20150307625A1 (en) * 2012-11-29 2015-10-29 Bayer Healthcare Llc MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST ACTIVATED PROTEIN C (aPC)
CN104936618A (zh) 2012-11-29 2015-09-23 拜尔健康护理有限责任公司 针对活化蛋白c的人源化单克隆抗体及其用途
WO2014118705A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Novartis Ag Methods of treating chronic kidney disease-mineral and bone disorder using sclerostin antagonists
CN105073195A (zh) 2013-02-04 2015-11-18 昂科梅德制药有限公司 使用Wnt途径抑制剂进行治疗的方法及对该治疗的监测
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
CA2907422C (en) * 2013-03-20 2021-08-31 Genzyme Corporation Methods for treating osteogenesis imperfecta
WO2014155278A2 (en) 2013-03-26 2014-10-02 Novartis Ag Methods of treating autoimmune diseases using il-17 antagonists
US9566443B2 (en) 2013-11-26 2017-02-14 Corquest Medical, Inc. System for treating heart valve malfunction including mitral regurgitation
WO2015087187A1 (en) * 2013-12-10 2015-06-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-sclerostin antibodies
US9763911B2 (en) 2013-12-12 2017-09-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research Prostacyclin compositions for regulation of fracture repair and bone formation
US10842626B2 (en) 2014-12-09 2020-11-24 Didier De Canniere Intracardiac device to correct mitral regurgitation
MA41142A (fr) * 2014-12-12 2017-10-17 Amgen Inc Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
CA2978976C (en) * 2015-03-13 2024-05-14 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-sclerostin antibody, antigen binding fragment and medical use thereof
US11077187B2 (en) 2015-11-17 2021-08-03 Oklahoma Medical Research Foundation Epitope of optimized humanized monoclonal antibodies against activated protein C and uses thereof
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
EP3496744A1 (en) 2016-08-08 2019-06-19 Amgen Inc. Method of improving connective tissue attachment using anti-sclerostin antibodies
KR20190096409A (ko) * 2016-12-21 2019-08-19 메레오 바이오파마 3 리미티드 불완전 골형성증 치료에서의 항-스클레로스틴 항체의 용도
EA201991514A1 (ru) * 2016-12-21 2019-12-30 Сефалон, Инк. Антитела, которые специфически связываются с ил-15, и их применение
WO2018115879A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Mereo Biopharma 3 Limited Use of anti-sclerostin antibodies in the treatment of osteogenesis imperfecta
WO2018139623A1 (en) * 2017-01-30 2018-08-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-sclerostin antibodies and methods of use
CN108866002A (zh) * 2017-05-12 2018-11-23 上海复旦张江生物医药股份有限公司 用于sost蛋白或抗体筛选的细胞株及其制备方法和应用
KR20200034748A (ko) 2017-07-27 2020-03-31 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드 Sost 항체 약학적 조성물 및 그의 용도
CN107817350B (zh) * 2017-10-26 2019-09-06 成都医学院第一附属医院 一种肺癌筛查试剂盒
SG11202008206TA (en) 2018-03-30 2020-09-29 Amgen Inc C-terminal antibody variants
GB201810746D0 (en) 2018-06-29 2018-08-15 Mereo Biopharma 3 Ltd Use of sclerostin antagonist
JP7425041B2 (ja) 2018-08-10 2024-01-30 アムジエン・インコーポレーテツド 抗体医薬製剤を作製する方法
CN114364694B (zh) * 2019-07-12 2024-05-10 国立大学法人京都大学 靶向usag-1分子的用于牙齿再生治疗的中和抗体
MX2022001805A (es) 2019-08-12 2022-06-08 Amgen Inc Formulaciones de anticuerpos anti-esclerostina.
TR201920272A1 (tr) * 2019-12-15 2021-06-21 Uludamar Altay Dental i̇mplantlar, greft materyalleri̇ ve prf i̇le osseoi̇ntegrasyonun artirilmasi i̇çi̇n bi̇r terapöti̇k kompozi̇syon ve bunun lokal kullanim yöntemleri̇
CN112070678B (zh) * 2020-08-10 2023-04-11 华东交通大学 一种批量蛋白质印迹膜条倾斜矫正和分割方法及系统
KR102472582B1 (ko) * 2020-08-20 2022-11-30 한림대학교 산학협력단 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 진단 및 치료 방법
CN113354724A (zh) * 2021-04-28 2021-09-07 蒋青 骨硬化蛋白及其在制备治疗或预防阿尔兹海默症的相关产品上应用

Family Cites Families (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US6455275B1 (en) 1980-02-25 2002-09-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA construct for producing proteinaceous materials in eucaryotic cells
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
AU612370B2 (en) 1987-05-21 1991-07-11 Micromet Ag Targeted multifunctional proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH059615A (ja) 1991-07-01 1993-01-19 Sumitomo Metal Mining Co Ltd スポンジＣｄの回収方法
ES2313867T3 (es) 1991-12-02 2009-03-16 Medical Research Council Produccion de anticuerpos anti-auto de repertorios de segmentos de anticuerpo expresados en la superficie de fagos.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
EP2192131A1 (en) 1992-08-21 2010-06-02 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
ES2309999T3 (es) 1996-10-28 2008-12-16 University Of Lausanne Metodo para la oligomerizacion de peptidos.
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
WO1998056906A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Thoegersen Hans Christian Trimerising module
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
AU776049B2 (en) 1998-10-09 2004-08-26 United Kingdom Research And Innovation Method for generating diversity
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
BRPI9915679B8 (pt) 1998-11-27 2021-05-25 Darwin Discovery Ltd composições e métodos para aumentar a mineralização óssea
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
KR101155191B1 (ko) 1999-01-15 2012-06-13 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
PT1144607E (pt) 1999-07-20 2009-04-22 Morphosys Ag Novos métodos para apresentar (poli)peptídeos/ proteínas em partículas bacteriofágicas através de ligações dissulfureto
US6984720B1 (en) 1999-08-24 2006-01-10 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
US7220840B2 (en) 2000-06-16 2007-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator protein
WO2002002641A1 (en) 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
EP1381631B1 (en) * 2001-04-24 2010-10-13 Bayer Corporation Human anti timp-1 antibodies
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
CA2467521A1 (en) 2001-11-16 2003-07-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
AU2003276430A1 (en) 2002-06-14 2003-12-31 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
FR2840910B1 (fr) 2002-06-17 2004-08-27 Rhodia Chimie Sa Composition silicone pour la realisation d'un ensemble comprenant plusieurs elements en silicone reticules par polyaddition adherant fermement les uns aux autres
US20040065598A1 (en) 2002-06-17 2004-04-08 Ross David Justin Address disambiguation for mail-piece routing
AU2003277828B2 (en) 2002-10-29 2009-06-04 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
RS20050934A (en) 2003-06-16 2008-04-04 Celltech R. & D. Inc., Antibodies specific for sclerostin and methods fo r increasing bone mineralization
US8461155B2 (en) 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
WO2005069970A2 (en) 2004-01-20 2005-08-04 Kalobios, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
US7737190B2 (en) 2005-03-24 2010-06-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process to prepare stable trifluorostyrene containing compounds grafted to base polymers using a solvent/water mixture
US20060264576A1 (en) 2005-03-24 2006-11-23 Roelofs Mark G Process to prepare stable trifluorostyrene containing compounds grafted to base polymers
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
DE102006002221A1 (de) 2005-11-11 2007-05-24 Micronas Gmbh Integrierter elektronischer Schaltkreis
JP5688829B2 (ja) * 2005-11-11 2015-03-25 敏一 吉川 示差的な糖尿病の予知・診断方法および糖尿病予知・診断用キット
DOP2006000277A (es) 2005-12-12 2007-08-31 Bayer Pharmaceuticals Corp Anticuerpos anti mn y métodos para su utilización
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
EP2460828A3 (en) 2006-11-10 2012-08-08 UCB Pharma, S.A. Antibodies and diagnostics
US20100036091A1 (en) 2006-11-10 2010-02-11 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
EP3345607B1 (en) 2006-12-29 2022-10-26 Ossifi-Mab LLC Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
EP2131860B1 (en) * 2007-03-20 2013-12-18 Eli Lilly & Company Anti-sclerostin antibodies
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
TWI489993B (zh) * 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
US20110044978A1 (en) 2007-12-14 2011-02-24 Amgen Inc. Method for treating bone fracture

Also Published As

Publication number Publication date
PT2203478E (pt) 2014-02-25
CY1118691T1 (el) 2017-07-12
JP2013153757A (ja) 2013-08-15
LT2586796T (lt) 2017-02-27
CN101821291A (zh) 2010-09-01
HK1143173A1 (en) 2010-12-24
PE20091221A1 (es) 2009-09-11
ES2448542T3 (es) 2014-03-14
US8486661B2 (en) 2013-07-16
HRP20170347T1 (hr) 2017-08-11
CO6270368A2 (es) 2011-04-20
PL2203478T3 (pl) 2014-05-30
CY1114872T1 (el) 2016-12-14
AU2008309514A1 (en) 2009-04-16
DK2203478T3 (da) 2014-02-10
BRPI0817879A2 (pt) 2014-06-17
MA31760B1 (fr) 2010-10-01
MY152282A (en) 2014-09-15
CN101821291B (zh) 2013-04-10
SI2586796T1 (sl) 2017-04-26
KR101268675B1 (ko) 2013-06-25
EP2203478A1 (en) 2010-07-07
CL2008003004A1 (es) 2009-06-26
US20110052592A1 (en) 2011-03-03
JP2016121170A (ja) 2016-07-07
SI2203478T1 (sl) 2014-03-31
MX2010003915A (es) 2010-04-30
ES2614328T3 (es) 2017-05-30
HN2010000674A (es) 2013-02-04
CR11313A (es) 2010-05-06
ZA201001789B (en) 2011-12-28
JP2011502470A (ja) 2011-01-27
EP2203478B1 (en) 2013-11-20
TN2010000140A1 (en) 2011-09-26
CU23869B1 (es) 2013-03-27
EP2586796B1 (en) 2016-12-07
JP6401196B2 (ja) 2018-10-03
KR20100074271A (ko) 2010-07-01
CU20100059A7 (es) 2012-06-29
GT201000085A (es) 2014-03-14
PL2586796T3 (pl) 2017-05-31
EA201000559A1 (ru) 2010-10-29
EP2586796A1 (en) 2013-05-01
US8246953B2 (en) 2012-08-21
US7879322B2 (en) 2011-02-01
US20120276591A1 (en) 2012-11-01
TWI489993B (zh) 2015-07-01
DK2586796T3 (en) 2017-02-13
CA2702005C (en) 2016-06-14
JP5913181B2 (ja) 2016-04-27
US20090130113A1 (en) 2009-05-21
PT2586796T (pt) 2017-03-15
CA2702005A1 (en) 2009-04-16
HUE031995T2 (en) 2017-08-28
WO2009047356A1 (en) 2009-04-16
HRP20140161T1 (hr) 2014-03-28
EA018756B1 (ru) 2013-10-30
NZ584158A (en) 2011-10-28
IL204510A (en) 2013-01-31
AU2008309514B2 (en) 2011-06-23
AR068767A1 (es) 2009-12-02
TW200922621A (en) 2009-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2586796T3 (en) Compositions and Methods for Using Antibodies against Sclerostin
KR101865974B1 (ko) β-ＫＬＯＴＨＯ, ＦＧＦ 수용체 및 이들의 복합체에 결합하는 인간 항원 결합 단백질
CN109311977B (zh) 人源化的抗pacap抗体及其用途
JP5766179B2 (ja) 筋肉増殖を増加させるための組成物および方法
KR20240131457A (ko) 위 저해 펩타이드 수용체(gipr)에 대한 길항제에 접합된 glp-1 수용체 작용제를 사용하여 대사 장애를 치료 또는 개선하는 방법
AU2016378739A1 (en) Method of treating or ameliorating metabolic disorders using binding proteins for gastric inhibitory peptide receptor (GIPR) in combination with GLP-1 agonists
KR20140021589A (ko) 항-fgfr4 항체 및 사용 방법
KR20130060223A (ko) 상피세포 성장인자 수용체(ｅｇｆｒ)에 대한 항체 및 이의 용도
KR20170040249A (ko) 항-cdh6 항체 약물 접합체
KR20220019785A (ko) 나트륨이뇨 펩티드 수용체 1 항체 및 사용 방법
CN115380049A (zh) 对生理性铁过载的治疗
EA039579B1 (ru) Способы и композиции антител, направленных против bmp6

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid