ES2309999T3 - Metodo para la oligomerizacion de peptidos. - Google Patents
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Abstract
OLIGOMERO COMPUESTO DE MAS DE DOS UNIDADES, EN EL CUAL CADA UNIDAD COMPRENDE UN DOMINIO PEPTIDICO CAPAZ DE OLIGOMERIZACION Y UN DOMINIO CAPAZ DE FORMAR UN ENLACE CON UN ACEPTANTE (LIGANDO) Y EN EL CUAL EL DOMINIO DE OLIGOMERIZACION NO ES UN ANTICUERPO O UN FRAGMENTO DE ANTICUERPO FUNCIONAL DE UNA REGION CONSTANTE. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN AL USO Y LA SINTESIS DE ESTE OLIGOMERO.
Description
Método para la oligomerización de péptidos.
Se han hecho grandes progresos en los últimos
años en la comprensión de las interacciones moleculares en el campo
de las biomoléculas tales como proteínas y ácidos nucleicos
beneficiándose del aislamiento de "ligandos" de polipéptido
artificiales con nuevas actividades de unión a "receptores". Se
ofrece un medio poderoso de desarrollo de ligandos artificiales
mediante el uso de bibliotecas de polipéptidos grandes, presentados
en la superficie de un bacteriófago filamentoso como una fusión con
las proteínas de la envuelta de fago. En particular, el aislamiento
de nuevos ligandos de péptido permitió, por ejemplo, mapear sitios
de unión de anticuerpos para encontrar residuos importantes en
moléculas HLA-DR, para identificar sustratos de
proteasas e inhibidores. Obviamente, el aislamiento de nuevos
ligandos de péptido de alta afinidad hacia sus "receptores"
diana puede ayudar a responder cuestiones biológicas importantes y
es de gran interés para el desarrollo farmacéutico. Sin embargo,
aparte de algunas excepciones, se han aislado solamente ligandos de
baja afinidad (intervalo micromolar) a partir de bibliotecas de
péptidos. Esto puede explicarse fácilmente por
el alto grado de libertad de conformación y el escaso número de residuos de contacto en una molécula de péptido corta.
el alto grado de libertad de conformación y el escaso número de residuos de contacto en una molécula de péptido corta.
Con el fin de mejorar esta situación, se
construye un nuevo tipo de molécula de unión de alta avidez
aprovechando el efecto de interacción multivalente. Efimov et
al. (Federation of European Biochemical Societies Letters, vol.
341, págs. 54-58, 1994) describieron la proteína
oligomérica de matriz del cartílago (COMP, Cartilage Oligomeric
Matrix Protein) y su dominio de ensamblaje. Argos (Journal of
Molecular Biology, vol. 211, págs. 943-958)
describe además el uso de ligadores para conjugar moléculas, no
siendo dichos ligadores susceptibles a escisión mediante proteasas
huésped. La solicitud de patente WO9531540 da a conocer una
proteína trimérica que comprende un péptido de región de cuello
como el dominio de oligomerización. En los ejemplos actuales se
expresa un ligando de péptido corto por medio de una región bisagra
semirrígida como una fusión como un dominio
helico-helicoidal de la proteína oligomérica de
matriz del cartílago (COMP), que da como resultado una molécula de
unión multivalente pentamérica. En el caso de un cuerpo pentamérico
(Pab-S) tal como se describe en el presente
documento, un ligando de péptido (S) especifico para el idiotipo de
superficie de linfoma de células B de ratón (BCL_{1}), se
selecciona de una biblioteca de presentación en fago. La molécula
de Pab-S se une específicamente al idiotipo de
superficie de células BCL_{1} con una avidez aparente de
aproximadamente 1 nM, lo que corresponde a un aumento de 2 x
10^{5} veces, en comparación con la afinidad del propio péptido
sintético S. Los estudios de unión en equilibrio sugieren
fuertemente que la alta avidez de Pab-S es un
resultado de la interacción multivalente de sus "cabezas de
péptido" y receptor de inmunoglobulina de BCL_{1} superficial.
Tal como se demuestra por cromatografía de filtración en gel,
análisis SDS-PAGE y dicroísmo circular,
Pab-S es un homopentámero estable de
aproximadamente 85 kDa, con las cinco cadenas reticuladas mediante
puentes disulfuro. Pab-S puede desnaturalizarse de
modo reversible, reconstituyendo por renaturalización su estructura
pentamérica y actividad de unión completa, proporcionando un modo
fácil de dar una especificidad de péptido diferente en el mismo
heteropentámero, por tanto cuerpos pentaméricos biespecíficos o
multispecíficos.
Los oligómeros inventivos tienen diversas
características únicas.
- \bullet
- La especificidad para molécula diana del oligómero inventivo puede proporcionarse mediante un ligando de péptido corto, que representa un dominio de unión "mínimo", en el que la información estructural primaria (es decir la secuencia de aminoácidos) es suficiente para el reconocimiento. Esto demuestra por primera vez, que un ligando de péptido de baja afinidad (aunque específica) puede usarse para crear una molécula de unión de alta avidez.
- \bullet
- Puede introducirse fácilmente una región bisagra que determina la geometría y las características dinámicas de la interacción multivalente.
- \bullet
- Los oligómeros inventivos pueden producirse sin modificaciones postraduccionales exhaustivas y, por consiguiente, pueden producirse fácilmente en microorganismos como E. coli.
- \bullet
- Los ligandos de péptido pueden unirse al extremo C- o N-terminal del dominio de oligomerización, proporcionando así diversas geometrías de unión, con una distancia máxima entre dos ligandos de péptido (por ejemplo, algunos unidos al extremo C-terminal y algunos al extremo N-terminal en un oligómero).
- \bullet
- Si se usan dominios de \alpha-hélice helico-helicoidales, los oligómeros resultantes son en la mayoría de los casos muy solubles debido a su estructura intrínseca.
- \bullet
- Generalmente puede usarse el dominio COMP para la oligomerización de compuestos unidos al mismo.
- \bullet
- Es un método general para la oligomerización de péptidos.
La presente invención se refiere a un oligómero
que comprende 2 o más de 2 unidades, en el que cada unidad
comprende un dominio peptídico que puede oligomerizarse y un
dominio que puede unirse a un aceptor (ligando), en el que el
dominio de oligomerización no es un anticuerpo ni un fragmento de
anticuerpo funcional de la región constante.
Un fragmento de anticuerpo funcional es, por
ejemplo, el dominio F_{c} o la región constante de la cadena
ligera o pesada.
En una realización preferida de la invención el
oligómero inventivo comprende más de 2, preferiblemente más de 4
unidades y lo más preferiblemente el oligómero inventivo consiste en
5 unidades.
En otra realización preferida las unidades
individuales se oligomerizan de modo espontáneo. Según la presente
invención, el dominio peptídico que puede oligomerizarse es el
dominio de pentamerización de la proteína oligomérica de matriz del
cartílago (Slavin y Strober (1978) Nature 272,
624-626) que puede ensamblar unidades monoméricas.
Las unidades especialmente preferidas pueden separarse del
oligómero y volver a oligomerizarse sin pérdida de actividad. En
otra realización preferida de la invención cada una de las unidades
monoméricas tiene menos de 600 aminoácidos. El aceptor, al que se
une el oligómero inventivo, puede ser de diversos orígenes como,
por ejemplo, cualquier proteína que se une específicamente a un
componente como un sustrato, un inhibidor, un activador, un
anticuerpo, un receptor y similares. Un aceptor preferido es, por
ejemplo, un anticuerpo o un receptor. Ejemplos para tales
anticuerpos o receptores preferidos son células BCL_{1} de un
idiotipo de superficie de linfoma de células B o cualquier otro
receptor expresado en la superficie celular. El oligómero inventivo
puede comprender unidades que tienen la misma o diferentes
especificidades con el fin de unirse al mismo o a distintos
aceptores; en el que el dominio que puede unirse a un aceptor puede
unirse al extremo C- y/o N-terminal del dominio de
oligomerización. También se comprende dentro del alcance de la
presente invención la unidad individual que puede oligomerizarse
tal como se describió anteriormente, un método para la síntesis de
esta unidad, el vector de expresión usado para esta síntesis, así
como el huésped que comprende dicho vector de expresión. Los
huéspedes preferidos son de origen microbiológico como E.
coli.
Existen varios modos de sintetizar las unidades
inventivas.
- \bullet
- Mediante ingeniería genética: Se construye un vector de expresión que comprende un casete de expresión para la unidad inventiva completa, que se expresa en un huésped adecuado. Pueden prepararse casetes de expresión adecuados mediante técnicas convencionales en ingeniería genética. Además de la información necesaria para la síntesis de la unidad deseada, el casete de expresión puede contener adicionalmente una secuencia señal que fuerza la secreción de la proteína producida. También es posible expresar la unidad inventiva como una proteína de fusión con proteína de la envuelta de fago, especialmente la de fagos filamentosos y fagémidos.
- \bullet
- Químicamente: Debido a la longitud relativamente corta de las unidades individuales, pueden sintetizarse químicamente, por ejemplo por medio de síntesis en fase sólida.
- \bullet
- Mezcladas: Una parte de la unidad inventiva se expresa mediante un huésped adecuado y se conecta con una parte sintetizada químicamente. Por ejemplo, se sintetiza la parte de oligomerización por un microorganismo y se elonga mediante síntesis química para añadir un dominio que puede unirse a un aceptor.
El dominio peptídico que puede oligomerizarse y
el dominio que puede unirse a un aceptor pueden conectarse
directamente o por medio de un espaciador (región bisagra) para
proporcionar, por ejemplo, una mayor flexibilidad del dominio de
unión. Por ejemplo, se supone que una secuencia rica en prolina de
un espaciador impide la formación de elementos de estructura
secundaria y como consecuencia una estructura 3-D
fija. Además, una región de espaciador como esta se supone
generalmente que es bastante rígida debido a las limitaciones de
conformación de los residuos de prolina, dando un efecto
beneficioso para la cooperatividad de la unión multivalente. Por
consiguiente, en otra realización preferida de la invención, el
dominio peptídico que puede oligomerizarse y el dominio que puede
unirse a un aceptor están conectados por medio de un espaciador,
que comprende preferiblemente una región rica en prolina.
Además, el extremo C-terminal de
algunas o todas las unidades del oligómero puede modificarse
mediante la adición de un dominio funcional adicional, como un
marcador, un dominio enzimático o citotóxico, o un dominio que
añade propiedades de unión adicionales, por ejemplo a átomos de
metal u otros compuestos estructurales, que pueden usarse, por
ejemplo, en cromatografía de afinidad.
Las unidades individuales pueden conectarse por
medio de puentes disulfuro, por ejemplo de modo espontáneo, o por
medio de una o más moléculas de ligador. Tales moléculas de ligador
son moléculas que portan dos o más grupos reactivos como -SH,
-N_{3}, -COOH, -COBr, -COCl, -NH_{2}, -CHO,
-CO-O-CO-,
-CO-NH-CO-. Ejemplos son
N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida,
p-azidofenazilbromuro,
p-azidofenilglioxal,
N-4-(azidofeniltio)ftalimida, suberato de
bis(sulfosuccinimidilo), bis-maleimidohexano,
bis[2-(succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfona,
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno,
ácido
4,4'-diisotiociano-2,2'-disulfónico
estilbeno, adipimidato de dimetilo, pimelimidato de dimetilo,
suberimidato de dimetilo, ditiobis(succinimidilpropionato),
suberato de disuccinimidilo, tatrato de disuccinimidilo,
3,3'-ditiobispropionimidato de dimetilo,
4,4'-ditiobisfenilazida,
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),
etil-4-azidofenil-1,4-ditiobutirimidato,
1-azido-4-fluoro-3-nitrobenceno,
N-hidroxisuccinimidil-4-azidobenzoato,
metil-4-azidobenzoimidato, éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfo-succinimida,
ácido
N-hidroxisuccinimidil-4-azidosalicílico,
p-nitrofenil-2-diazo-3,3,3-trifluoropropionato,
N-succinimidil(4-azidofenil)-1,3'-ditiopropionato,
2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-etil-1,3'-ditiopropionato
de sulfosuccinimidilo,
N-succinimidil-6(4'-azido-2'-nitrofenil-amino)hexanoato,
2-(p-azidosalicilamido)etil-1,
3'-ditiopropionato de sulfosuccinimidilo,
N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato,
4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-l-carboxilato
de succinimidilo,
4-(p-meleimidofenil)-butirato de
succinimidilo, 3-(2-piridilditio)propionato
de N-succinimidilo,
bis[2-(sulfosuccinimidooxi-carboniloxi)etil]sulfona,
tatrato de disulfosuccinimidilo,
etilenglicol-bis(sulfosuccinimidilsuccinato),
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinato),
(4-azidofenilditio)-propionato de
sulfosuccinimidilo,
6-(4'azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato
de sulfosuccinimidilo,
(4-yodoacetil)aminobenzoato de
sulfosuccinimidilo,
4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato
de sulfosuccinimidilo,
4-(p-maleimidofenil)butirato de
sulfosuccinimidilo y 2-iminotiolano.
Preferiblemente, se usan unidades de
oligomerización que pueden autoensamblarse. También pueden usarse
adicionalmente las moléculas de ligador mencionadas anteriormente
para estabilizar el oligómero.
Tal como se muestra en el ejemplo, la
pentamerización espontánea del dominio de ensamblaje de COMP no
depende de la formación de puentes disulfuro, por tanto, una
realización preferida del oligómero inventivo representa una
molécula que se autoensambla que puede oligomerizarse in
vivo y/o in vitro. Por tanto, la oligomerización de
péptidos cortos evita problemas de plegado y supera las
dificultades de expresión experimentadas previamente durante la
oligomerización de proteínas relativamente complejas tales como
fragmentos Fv de cadena simple. Además, un autoensamblaje de un
oligómero permite que experimente una desnaturalización reversible.
Por tanto, pueden obtenerse fácilmente heterooligómeros mezclando
las unidades inventivas con especificidad diferente (es decir con
ligandos de péptido diferentes) en condiciones de desnaturalización
seguida, por ejemplo, por diálisis frente a cualquier tampón
fisiológico. Esta propiedad intrínseca de los oligómeros inventivos
abre un modo fácil de producir un oligómero quelante en el que dos
o más péptidos dirigidos frente a epítopos diferentes en la misma
molécula diana podrían ensamblarse conjuntamente en un oligómero
heteropentamérico, permitiendo beneficiarse de la fuerza del efecto
quelante, tal como se demostró recientemente para los fragmentos Fv
de cadena simple. El mismo procedimiento puede usarse para producir
heterooligómeros con afinidad a dos o más receptores.
Estudios de unión de Pab-S
marcado con ^{125}I en células BCL1, por ejemplo, revelan una
avidez de aproximadamente 1 nM por el idiotipo de superficie que es
2 x 10^{5} veces superior en comparación con la CI_{50} del
propio péptido S (200 \muM). Pab-S puede
desnaturalizarse de modo reversible (4 M, urea 95°C, 15 min.),
recuperando la actividad de unión completa tras la renaturalización
mediante diálisis en PBS. Los datos muestran que
Pab-S tiene una termoestabilidad notable,
manteniendo la actividad de unión incluso tras someterse a
autoclave (120°C, 20 min.).
Además, se espera que un oligómero que alberga
un ligando de péptido con una afinidad intrínseca nanomolar puede
conseguir un intervalo de avidez femtomolar, aproximándose al de la
interacción de estreptavidina-biotina.
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en las propiedades de los compuestos
inventivos, hay varias aplicaciones para los oligómeros inventivos,
que son todos parte de la invención.
- \bullet
- Basándose en los resultados de unión en equilibrio del Pab-S de ejemplo, resulta evidente que los oligómeros inventivos son moléculas excelentes para seleccionar como diana una célula eucariota, bacterias o virus; y especialmente para seleccionar como diana células. Tal como se muestra para Pab-S, la avidez para el receptor inmovilizado en superficie celular es muy superior a la avidez para la forma soluble del mismo receptor. Esta propiedad permite, por ejemplo, una selección como diana eficaz de los linfomas de células B, incluso en presencia de un nivel relativamente alto de anticuerpo de idiotipo circulante.
- \bullet
- Basándose en la principal característica de la unión de alta avidez, especialmente para los antígenos inmovilizados en superficie, también puede usarse los oligómeros inventivos como inhibidor de interacciones proteína-proteína, especialmente las que se producen en la superficie celular y en disolución.
- \bullet
- Pueden producirse heteropentámeros reasociando entre sí dos o más unidades diferentes de los oligómeros inventivos. Estos heterodímeros pueden unirse a epítopos diferentes en las mismas o en diferentes moléculas y, por ejemplo, pueden usarse como agente quelante y/o de reticulación.
- \bullet
- Puede modificarse fácilmente el extremo C-terminal de las moléculas, por ejemplo introduciendo ligandos de péptido con una segunda especificidad, una cola citotóxica, un marcador para identificar aceptores o una cola His para quelar sustancias tóxicas diferentes (por ejemplo metales pesados) con el fin de distribuirlos a las células diana en las que pueden internalizarse, por medio de un receptor de superficie internalizado (por ejemplo receptor de inmunoglobulina) y matar las células diana.
- \bullet
- Es posible, por ejemplo, aislar un panel de ligandos de péptido específicos para C1q que pueden usarse para producir una forma biespecífica de los oligómeros inventivos que pueden fijar C1q y activar de manera complementaria o inhibir de manera complementaria.
- \bullet
- Fusión de los ligandos de péptido a un receptor Fc da como resultado una forma biespecífica Nt-Ct de los oligómeros inventivos que puede imitar la función de una región Fc de inmunoglobulina.
- \bullet
- También pueden usarse marcos de los oligómeros inventivos para crear bibliotecas de péptidos al azar presentadas en los bacteriófagos filamentosos. Esto permite la selección rápida de los oligómeros inventivos presentados en fago que entonces pueden producirse en una forma soluble, en un huésped adecuado.
- \bullet
- Debido a la longitud relativamente corta de la cadena de polipéptido monómerica, los oligómeros inventivos puede sintetizarse químicamente (por ejemplo química de péptido Fmoc normal, la síntesis parte del extremo C-terminal). La posición N-terminal de los ligandos de péptido permite sintetizar en primer lugar la molécula central (por ejemplo el dominio pentamerización y un ligador) y entonces dividir la muestra y continuar la síntesis con diferentes secuencias de péptidos en el extremo N-terminal.
- \bullet
- El mismo principio de síntesis química puede usarse para producir una biblioteca de péptidos sintética presentada en los oligómeros inventivos. Concretamente, sintetizando los péptidos N-terminales al azar (por ejemplo mediante química Fmoc tal como se describió anteriormente), puede obtenerse una biblioteca de los péptidos presentados en el marco de los oligómeros inventivos. Puede absorberse esta biblioteca en las moléculas o células dianas, eluirse, purificarse (por ejemplo usando etiqueta 6xHis) y puede secuenciarse el péptido N-terminal.
- \bullet
- Además, un marco de los oligómeros inventivos puede usarse para oligomerizar péptidos que representan un epítopo de células B conocido con el fin de obtener vacunas eficaces. La adición de diferentes péptidos conocidos para potenciar la respuesta inmunitaria (tales como epítopos de células T cooperadoras o péptidos de unión a CR derivados de C3d) también es posible.
- \bullet
- Las unidades inventivas pueden expresarse directamente en un organismo multicelular modificado mediante ingeniería genética, con el fin de proporcionar una producción in vivo de los oligómeros inventivos.
- \bullet
- Las unidades inventivas pueden expresarse in vitro usando sistemas de trascripción-traducción establecidos.
- \bullet
- Las unidades inventivas pueden usarse in vitro como uno de los reactivos de unión en inmunoensayos enzimáticos.
- \bullet
- Las unidades inventivas puede usarse para inducir apoptosis.
- \bullet
- Debido a la solubilidad y la alta especificidad de los compuestos pueden usarse en terapia génica, por ejemplo, para seleccionar como diana ciertos receptores para la activación o desactivación; o, si están conectados a compuestos tóxicos, para su destrucción.
- \bullet
- Los genes que codifican para las unidades inventivas pueden expresarse intracelularmente con el fin de inhibir la unión de factores de trascripción o moléculas de regulación de gen así como inhibir actividades enzimáticas.
- \bullet
- Las unidades inventivas pueden usarse para inhibir actividad enzimática o adhesión con el fin de impedir la metastización tumoral.
- \bullet
- Además, los epítopos de las unidades inventivas pueden usarse para el desarrollo de vacuna.
- \bullet
- Debido a su alta tendencia para la oligomerización, la proteína oligomérica de matriz del cartílago puede usarse generalmente para la pentamerización de péptidos o compuestos de bajo peso molecular que no son parte de la proteína oligomérica de matriz del cartílago.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de péptidos. Se sintetizan los
péptidos usando química en fase sólida de Fmoc normal en una
sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431A, se liofilizan,
redisuelven en ácido acético al 50%, se purifican mediante
filtración en gel a través de una columna de Sephadex
G-25 y se analizan mediante espectroscopia de
masas. Para los estudios de competición se disuelven los péptidos
en PBS, se ajusta hasta pH neutro y se determinan las
concentraciones de péptido mediante el método de Waddell basándose
en una diferencia de absorción a 215 y 225 nm.
Cepas bacterianas. Se usa E. coli
TG1 (Wertman et al., (1986)- Gene 49,
253-262) para la propagación de plásmidos y fagos y
se usa E. coli SG13009 (QIAEX) para la producción de
proteínas de fusión.
Marcaje. Normalmente, se marcan
Pab-S (17 \mug, 0,2 nmol), IgG de B1 (75 \mug,
0,5 nmol) o Fab' de B1 (50 \mug, 1 nmol) en PBS con 100 \muCi
(1 \muCi = 37 MBq) de ^{125}I en tubos cubiertos con
Iodo-Gen (Biorad, 10 \mug) durante 20 min. (2 h
para Pab-S) a 4°C. Se elimina el yodo no acoplado
mediante filtración en gel en una columna PD-10
(Pharmacia). Se recupera aproximadamente el 40% de la radiactividad
para Pab-S y el 70% para IgG de B1 y Fab' de B1. La
actividad específica oscila desde 70 hasta 200 \muCi/nmol.
Competición RIA en plástico. Se recubren
placas de 96 pocillos de polivinilo con IgM de BCL1 a 3 \mug/ml en
PBS durante 16 h a 4°C y se bloquean con MPBS al 2% durante 1 h a
37°C. Se incuban cantidades diferentes de péptidos con 10 nCi de
IgG de B1 marcado con ^{125}I durante 1 h a 37°C. Se lavan los
pocillos con PBS que contiene el 0,1% de Tween-20 y
se miden las cantidades de radiactividad retenida con contador y
multicanal automático Cobra II.
\vskip1.000000\baselineskip
Células y anticuerpos. El linfoma de
células B derivadas de BALB/c BCL_{1} (Efimov et al.,
(1994) FEBS Letters 341, 54-58) y el hibridoma de
ratón B1, que secreta un anticuerpo IgG_{1} monoclonal
anti-idiotipo (IgG de B1), se proporcionan
gentilmente por el Dr. Kris Thielemans (Medical School, VUB,
Bruselas, Bélgica). Se propagan las células BCL_{1} en ratones
BALB/c usando inyección i.p. de 10^{6} células. Se purifica la
IgM soluble de BCL_{1} del suero de un ratón esplenomegálico
mediante precipitación con sulfato de amonio al 50%, seguido de
intercambio aniónico y cromatografía de filtración en gel (Mono Q y
Superdex 200, Pharmacia). Se purifica el IgG de B1 mediante protein
G-Sepharose (Pharmacia). Se obtienen fragmentos
Fab' mediante digestión limitada con pepsina, seguido por reducción
y alquilación, usando métodos convencionales.
Selección de péptidos. Se usan ligandos
de péptido específicos para idiotipo de linfoma de célula B de
ratón (BCL_{1}), seleccionados de tres bibliotecas de péptidos
diferentes presentadas en dos bibliotecas de bacteriófagos
filamentosos de aproximadamente 10^{7} miembros independientes
que presentan hexapéptidos al azar denominados Smith (Scott y Smith
(1990) Science, 249, 386-390) y Doorbar (Doorbar y
Winter (1994) J. Mol. Biol., 244, 361-369). Además
se usa una biblioteca combinatoria de aproximadamente 10^{12}
miembros independientes que presenta un tándem de decapéptidos al
azar, denominados Fisch (Fisch et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1996), 93, 7761-7766).
Se realiza la selección de bibliotecas de
representación en fago esencialmente tal como se describe por Fisch
et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996), 93,
7761-7766). Brevemente, se recubre la IgM de
BCL_{1} purificada en inmunotubos (Nunc) a 50 \mug/ml en PBS
(fosfato 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4). Se usan aproximadamente
10^{12} unidades formadoras de colonias (u.f.c.) de fago de cada
biblioteca para cada ronda de selección. Tras tres rondas de
cribado, se aíslan clones individuales y se mide la unión de fago a
IgM de BCL_{1} recubierta en plástico (3 \mug/ml) mediante
ELISA (Barrett et al., (1992) Anal. Biochem. 204,
357-364) usando anticuerpo anti-M13
conjugado con peroxidasa del rábano (Pharmacia). Se usan placas
recubiertas con IgG de ratón o con IgM humana, como controles
negativos. Se realiza la inhibición específica de la unión de fago
a IgM de BCL_{1}, mediante la adición de IgG de B1 a 100
\mug/ml. Se amplifican los fragmentos de ADN que codifican para
los péptidos seleccionados mediante PCR y se secuencian tal como se
describe en Fisch et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1996), 93, 7761-7766).
Se seleccionan fagos específicos en la IgM de
BCL_{1} purificada, se aíslan clones de fagos individuales y se
amplifican los fragmentos de ADN que codifican para péptidos
mediante PCR y se secuencian (tabla 1). De manera interesante, dos
residuos Cys distales, que pueden potencialmente formar un bucle de
puente disulfuro, se encuentran en el hexapéptido seleccionado de
la biblioteca Smith. Se demuestra la especificidad de idiotipo de
péptidos seleccionados mediante la inhibición de unión de fago con
el anticuerpo anti-idiotipo, IgG de B1.
Se preparan péptidos sintéticos correspondientes
a las secuencias seleccionadas tal como se explica en la tabla 1.
Se oxida completamente el péptido S que contiene cisteínas con aire
perdiendo dos átomos de hidrógeno, tal como se muestra mediante
espectroscopia de masas, que está de acuerdo con la ciclación del
péptido. Se someten a prueba todos los péptidos sintéticos para
determinar la inhibición de unión de IgG de B1 marcada con
^{125}I a IgM de BCL^{1} recubierta en plástico. Los péptidos D
y los S inhiben la unión con una CI_{50} de aproximadamente 60
\muM y 200 \muM, respectivamente. No se observa inhibición con
péptido F hasta 2 mM, que se usa, después de esto, como control
negativo. De manera interesante, la sustitución de residuos Cys por
Ser en el péptido S da como resultado una pérdida de afinidad de 10
veces, lo que sugiere que la conformación de giro con puente
disulfuro del péptido es favorable para unirse al idiotipo IgM de
BCL_{1}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseña una proteína de fusión de cuerpo
pentamérico, que consiste en cuatro partes distintas.
- \bullet
- En primer lugar, un péptido seleccionado específico para el idiotipo IgM de BCL_{1} representaba el dominio de unión N-terminal.
- \bullet
- En segundo lugar, se coloca una secuencia de 24 aminoácidos seleccionada de una región bisagra de Ig de camello (Hamers-Casterman et al., (1993) Nature 363, 446-448) para proporcionar un espacio necesario para una unión multivalente.
- \bullet
- En tercer lugar, la región bisagra va seguida de un dominio de pentamerización con una longitud de 55 aminoácidos, una modificación del dominio de ensamblaje COMP helico-helicoidal descrito (Slavin y Strober (1978) Nature 272, 624-626), conocido por formar de modo espontáneo un haz de \alpha-hélice de cinco cadenas. Dos residuos de cisteína presentes en el extremo C-terminal de la secuencia de tipo natural permitieron la formación de puentes disulfuro intercatenarios. Basándose en un modelo recientemente descrito de dominio de ensamblaje de COMP (Kajava (1996) Proteins 24, 218-226) se introducen dos sustituciones Lys29Cys y Ala30Cys en la versión modificada, haciendo posible la formación de puentes disulfuro adicionales cerca de la parte N-terminal del dominio de ensamblaje con el fin de estabilizar adicionalmente el haz de \alpha-hélice.
- \bullet
- En cuarto lugar, se coloca una secuencia que codifica para seis residuos de histidina en el extremo C-terminal de la molécula de fusión para facilitar la purificación de proteínas por medio de la cromatografía de afinidad con quelación de metales.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyen los genes quiméricos que codifican
para las Pab diferentes tal como se diseñó (véase a continuación) y
se denominaron Pab-S, Pab-D y
Pab-F, en los que las últimas letras representan
los péptidos S, D, y F, respectivamente (véase la tabla 1).
Esencialmente, las secuencias de ADN que
codifican para los péptidos específicos para el idiotipo BCL_{1},
así como la región bisagra, se ensamblan a partir de dúplex de
oligonucleótidos. Se amplifica el dominio de pentamerización de COMP
mediante PCR simultáneamente introduciendo mutaciones puntuales, y
se ensamblan los genes fusión en un vector de expresión
pDS-78 modificado.
Construcción de plásmido. Se describe la
construcción de plásmido p3bCOMP que codifica para un dominio de
ensamblaje de COMP de 64 aminoácidos en (Slavin y Strober (1978)
Nature 272, 624-626). Se preparan todos los
constructos adicionales usando métodos convencionales de
manipulación de ADN (Sambrook et al., (1990) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press,
Painview, NY)). Se amplifica el fragmento de ADN que codifica para
el dominio COMP (residuos 26-80, números de
aminoácidos tal como en Slavin y Strober (1978) Nature 272,
624-626) mediante PCR de molde p3bCOMP usando
cebadores COMP- Xho-BACK (5'-AG ATC
CTC GAG GGT GGA GAC TGC TGC CCA CAG ATG CTT AGA; SEQ ID NO 4) y
COMP-Spe-FOR (5'GC ACT AGT AGA ACC
GCC ACC CGG GGT; SEQ ID NO 5). Por tanto el producto resultante
contiene dos sustituciones de aminoácido Lys29Cys y Ala30Cys así
como sitios XhoI y SpeI en el extremo 5' y 3', respectivamente. Se
preparan los dúplex de ADN que codifican para los péptidos S, F, y
D, hibridando los oligonucleótidos S-up (5'GA TCC
GCT GAC GGC GCT TGC CGT ACC CCG TGG TGC GGT C; SEQ ID NO 6) con
S-low (5'TC GAG ACC GCA CCA CGG GTT ACG GCA AGC GCC
GTC AGC G; SEQ ID NO 7), F-up (5'GA TCC ACT GCT GCA
GGT CTG TGC GAA TCC GAC CAG C; SEQ ID NO 8) con
F-low (5'TC GAG CTG GTC GAA TTC GCA CAG ACC TGC AGC
AGT G; SEQ ID NO 9) y D-up (5'GA TCC TCT GTT TGG CGT
TGG CTG CCG TAC GAC AAA TAC GAA C; SEQ ID NO 10) con
D-low (5'TC GAG TTC GTA TTT GTC GTA CGG CAG CCA ACG
CCA AAC AGA G; SEQ ID NO 11). Los tres dúplex contienen extremos
cohesivos BamHI y XhoI en el extremo 5' y 3', respectivamente. Por
medio de ligación de tres partes, los dúplex que codifican para
péptidos y el dominio de COMP amplificado por PCR, restringido con
enzimas XhoI y SpeI, se juntan entre sí en el vector pDS78,
linealizado con enzimas BamHI y SpeI, en frente de una cola de 6
histidinas presente en el vector (Stuber et al., en
Immunological Methods, eds. Lefkovits, I. y Perris, B. (Academic
Press. Nueva York), págs. 121-152). Esto generó
plásmidos pSC6H pDC6H y pFC6H que codifican para péptidos S, D y F
respectivamente. Un fragmento de ADN que codifica para la región
bisagra de 24 aminoácidos
[(PQ)_{2}PK(PQ)_{4}PKPQPK(PE)_{2}],
denominado PX, se prepara mediante hibridación de oligonucleótidos
PX-up (5TC GAG CGG CAG CCG CAG CCG AAA CCG CAG CCG
CAG CCG CAG CCG CAG CCG AAA CCG CAG CCG AAA CCG GAA CCG GAA G; SEQ
ID NO 12) y PX-low (5TC GAC TTC CGG TTC CGG TTT CGG
CTG CGG TTT CGG CTG CGG CTG CGG CTG CGG CTG CGG TTT CGG CTG CGG CTG
CGG C; SEQ ID NO 13) que codifican para cadenas positiva y negativa
del dúplex y contienen extremos cohesivos XhoI y SalI en el extremo
5' y 3', respectivamente. El dúplex PX se liga en XhoI linealizado,
plásmidos desfosforilados pSC6H pDC6H y pFC6H, para generar los
vectores de expresión pSPXC6H (DSM 11236), pDPXC6H y pFPXC6H,
respectivamente. Se verifican los constructos finales mediante
secuenciación con didesoxinucleótidos usando Sequenase 2.0 (United
States Biochemical).
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas de fusión Pab se expresan en E.
coli SG13009. Se hacen crecer los cultivos en un agitador a
37°C hasta una DO_{600} \sim0,5, entonces se añade IPTG 1 mM
para inducir la síntesis de proteínas, seguido de una incubación
adicional de 4 h a 30°C. Se recogen las bacterias mediante
centrifugación (8000 x g, 15 min., 4°C) y se congelan a -70°C. Se
resuspende el sedimento bacteriano en PBS pH 7,4, EDTA 1 mM,
lisozima 1 mg/ml, se incuban durante 30 min. a temperatura ambiente
y se someten a tres rondas de congelación/descongelación (nitrógeno
líquido/37°C). Se incuba el lisado durante 15 min. a TA con 0,1
mg/ml de ADNasa I y tras la centrifugación (23.000 x g, 15 min.,
4°C) se recoge el sobrenadante. Se añade imidazol hasta una
concentración final de 5 mM y se absorbe la proteína recombinante
en 2 ml de resina Ni-NTA (QIAGEN), equilibrada en
imidazol 5 mM, PBS pH 7,4. Tras un lavado exhaustivo con PBS que
contiene imidazol 5 mM y 20 mM, se eluyen las proteínas retenidas
con PBS que contiene imidazol 250 mM. Tras una diálisis exhaustiva
frente a PBS, EDTA 1 mM, se concentran las proteínas 5 veces con un
concentrador Centriprep 10 (Amicon), se preparan alícuotas y se
almacenan a -20°C.
Las proteínas de fusión Pab-S y
Pab-F se expresan a niveles elevados (> 30
mg/l), lo que permite una cromatografía de afinidad con quelación
de metales en una etapa eficaz en condiciones naturales. La
cantidad de proteína Pab-D soluble es inferior a la
de Pab-S y Pab-F.
Las moléculas de Pab-S y
Pab-F purificadas por afinidad se fraccionan
mediante filtración en gel mediante FPLC. Se observa un único pico
de elución que corresponde a una proteína de aproximadamente 85 kDa
para Pab-S, mientras que se observan dos picos de
elución principales que corresponden a las proteínas de
aproximadamente 90 y 180 kDa para Pab-F. El pico de
alto peso molecular resultó presumiblemente de la formación de
dímeros mediante la cisteína insaturada presente en el péptido F.
En ambos casos, las fracciones del pico de elución que corresponden
a la proteína de 85-90 kDa se recogen, se combinan
y se usan para estudios de unión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describen experimentos de dilución celular y
curvas de competición homogéneas (es decir competición para la
unión celular entre las formas marcada y no marcada del mismo
ligando) mediante un modelo de equilibrio monovalente. La
radiactividad libre (F) y unida (B) se corrigen a partir de la
fracción no inmunorreactiva (NIF) y la unión no específica (NSB)
respectivamente. Ambas se expresan en mol/l, teniendo en cuenta la
actividad específica de cada dilución isotópica (B y F,
respectivamente). Los parámetros Kd, R, NSB y NIF, en los que R es
la molaridad de los sitios de unión y Kd es la constante de
disociación en equilibrio, se ajustan mediante regresión no lineal
de la ecuación de Scatchard corregida
a los datos
experimentales.
Para determinar la inmunorreactividad máxima,
Pab-S marcada con ^{125}I, IgG de B1 o Fab' de B1
(20 nCi) se incuban con diluciones en serie de células BCL1 recién
recogidas (0,3 a 100 x 10^{5} células por 100 \mul). Para los
ensayos de competición, los compuestos marcados se incuban con una
dilución en serie de competidores no marcados y células BCL1 (25,
50 ó 100 x 10^{5} por 100 \mul). Los experimentos comparativos
se realizan el mismo día con el mismo lote de células, en placas de
96 pocillos, por triplicado, en un volumen final de 150 \mul de
PBS complementado con 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), a
4°C, con agitación y durante 2,5 h. Tras la centrifugación, se
miden las cantidades tanto de ^{125}I libre como unido tal como
anteriormente a partir de una alícuota del sobrenadante y del
sedimento lavado una vez con PBS (4°C).
En un ensayo de competición en fase sólida
preliminar se encuentra que la Pab-S compite con la
unión de IgG de B1 marcada con ^{125}I al idiotipo de IgM de
BCL_{1} recubierto sobre plástico. Sin embargo, puesto que la
disposición espacial de la molécula diana sobre la superficie puede
influir en la unión multivalente, los parámetros de unión en
equilibrio de Pab-S se determinan directamente en
células BCL_{1} vivas, que representan una superficie biológica
más relevante. La Pab-S purificada está marcada con
^{125}I y se muestra que se une al idiotipo de BCL_{1} sobre la
superficie celular. Puede tener competencia por parte de
Pab-S no marcada, IgG de B1 y por una concentración
mucho mayor de péptido S, pero no por el pentámero de
Pab-F control. Las competiciones de la unión de
Pab-S marcada con ^{125}I por parte de
Pab-S no marcada a 3 concentraciones celulares
diferentes y un experimento de dilución celular se usan
conjuntamente para el ajuste de la curva para obtener los
parámetros de unión en equilibrio.
Se encuentra que la constante de unión en
equilibrio aparente de Pab-S es similar a la de IgG
de B1 (aproximadamente 1 nM) lo que representa un aumento de
2x10^{5} veces de avidez en comparación con el propio péptido S
(CI_{50} de aproximadamente 200 \muM). Como control, se realizan
los mismos experimentos de unión con un fragmento de Fab' de B1 e
IgG de B1 marcada con ^{125}I. Las constantes obtenidas están de
acuerdo con los datos ya publicados. Las constantes de unión en
equilibrio de Scatchard son:
La menor molaridad de los sitios de unión
encontrados para Pab-S en comparación con Fab e IgG
de B1 proporciona una evidencia de la naturaleza multivalente de la
unión de Pab-S.
En otra serie de experimentos se comparan la
capacidad de la IgM de BCL_{1} soluble para competir por la unión
de Pab-S o bien IgG de B1 a células BCL_{1}. Los
resultados mostraron que se necesita una concentración mucho mayor
de IgM de BCL_{1} soluble para competir por Pab-S
en comparación con IgG de B1 (100 frente a 4 nM para un
desplazamiento del 80%). Estos datos indican una mayor avidez de
Pab-S para la IgM de BCL_{1} inmovilizada sobre la
superficie celular, en comparación con la IgM de BCL_{1} soluble.
Lo que es importante, no se observa inhibición de la unión de
Pab-S al idiotipo de IgM de BCL_{1} en presencia
de hasta el 30% (v/v) de suero de ratón BALB/c o humano.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de Pab-S
purificada se determina mediante el método de Waddell, basado en
una diferencia de absorción a 215 y 225 nm así como mediante el
ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad). La
molécula de Pab-S se caracteriza usando filtración
en gel por FPLC, SDS-PAGE y espectrometría CD. La
forma oxidada de Pab-S con puentes disulfuro
intercatenarios se forma mediante oxidación al aire durante el
procedimiento de purificación y la diálisis frente a PBS. Se
obtiene una forma completamente reducida mediante la incubación con
DTT 100 mM a 37°C durante 30 min., seguido de una diálisis
exhaustiva frente a PBS, EDTA 1 mM,
\beta-mercaptoetanol 1 mM.
En condiciones no desnaturalizantes se detecta
un único pico de elución, que corresponde a una proteína de
aproximadamente 85 kDa para ambas formas, oxidada y reducida, de
Pab-S tras la filtración en gel en una columna
Superdex G200 (equilibrada en PBS, EDTA 1 mM, \pm
\beta-mercaptoetanol 1 mM, se monitoriza la
elución a 280 nm con un detector UV integrado (las proteínas se
analizan en un gradiente del 10-15%). En
condiciones desnaturalizantes (la Pab-S se
desnaturaliza mediante ebullición durante 20 min. en urea 4 M y DTT
100 mM y se renaturaliza mediante diálisis exhaustiva frente a PBS,
EDTA 1 mM, \beta-mercaptoetanol 1 mM) en
SDS-PAGE, se observa una proteína principal con un
peso molecular aparente de aproximadamente 85 kDa para la forma
oxidada de la molécula de Pab-S, mientras que se
observa una proteína con un peso molecular aparente de
aproximadamente 17 kDa para la forma reducida de
Pab-S, de acuerdo con una estructura pentamérica
covalente. Una banda menor con una movilidad aparente de
aproximadamente 68 kDa observada para la Pab-S
oxidada corresponde a un pentámero parcialmente reducido, en el que
sólo cuatro de cinco cadenas están unidas covalentemente mediante
puentes disulfuro. A partir del análisis del espectro CD del
pentámero Pab-S se determina un contenido en
\alpha-hélice de aproximadamente el 54% ajustando
los datos experimentales con un conjunto de proteínas de referencia
tal como se describe en Vogel (Biochemistry (1987), 26,
4562-72). Esto está muy de acuerdo con la longitud
del dominio helico-helicoidal de
\alpha-hélice dentro de toda la molécula. Tomados
en conjunto, estos datos indican que la molécula de
Pab-S es un homopentámero estable de
aproximadamente 85 kDa con subunidades de un monómero de
aproximadamente 17 kDa sujetadas entre sí mediante un haz
helico-helicoidal de
\alpha-hélice, en el que las cinco cadenas están
reticuladas covalentemente mediante puentes disulfuro.
Se sabe que las estructuras
helico-helicoidales pueden experimentar una
desnaturalización reversible. De hecho, la molécula de
Pab-S se desnaturaliza en urea a 95°C en condiciones
reductoras y vuelve a plegarse dando el pentámero mediante
diálisis simple frente a PBS, tal como se demuestra mediante
filtración en gel mediante FPLC de Pab-S
renaturalizado marcado con ^{125}I. Es de notar que la
renaturalización de Pab-S restaura la actividad de
unión completa tal como se muestra mediante la competición de unión
en las células BCL1.
Para visualizar la disposición espacial de
Pab-S se realiza un modelado molecular de su
estructura tridimensional. La molécula de Pab-S se
modela usando el programa informático de gráficos
TOURBO-FRODO (Roussel y Cambillan (1989) en Silicon
Graphics Geometry Partner Directory (Fall 1989), eds. Silicon
Graphics (Silicon Graphics, Mountain View, CA), págs.
77-78). La estructura se refina adicionalmente
mediante el programa X-PLOR versión 3.1 (Brunger.
(1992) en X-PLOR versión 3.1 un sistema para la
cristalografía de rayos X y RMN, (New Haven, Yale University
Press)) usando el siguiente procedimiento: una simulación de
dinámica molecular de 5 ps a 300 K y entonces 1.000 etapas de
minimización del gradiente del conjugado, llevadas a cabo con la
constante dieléctrica dependiente 1/r.
El análisis estereoquímico muestra que la
conformación de giro \beta de tipo I que se produce frecuentemente
permite la formación de un puente disulfuro entre las cisteínas del
péptido S. Esta conformación se elige, como la más probable, para
el ligando de péptido. Para la región de articulación una
simulación dinámica molecular con posterior minimización de energía
dio como resultado un conjunto de conformaciones posibles. De este
conjunto se elige arbitrariamente una conformación "con buen
aspecto". Finalmente, se toma la estructura
helico-helicoidal de \alpha-hélice
de cinco cadenas modelada previamente para el dominio de
pentamerización. El análisis sugiere una estructura simétrica
quintuple de la proteína Pab-S. El análisis de la
estructura de cuerpo pentamérico modelada muestra que una molécula
de este tipo debe poder unirse simultáneamente a cinco receptores
de superficie, siempre que estén situados con una separación de
hasta 80 \ring{A} entre sí. Este criterio se satisface
ampliamente en el caso del receptor de inmunoglobulinas de
superficie, cuyos dominios variables pueden estar separados a
aproximadamente 50 \ring{A}, a juzgar por sus radios de contacto
de van der Waals.
\vskip1.000000\baselineskip
Para medir el nivel de un antígeno de interés
tal como el antígeno prostático específico (PSA) que es una enzima
de la familia de la calicreína, se pueden seleccionar los péptidos
visualizados en una presentación en fago para aquellos que se unen
específicamente al antígeno de interés, tal como PSA, con una gran
especificidad y avidez. La selección puede ser tal como se
describió en los ejemplos anteriores, particularmente el ejemplo 1.
Un cuerpo pentamérico que expresa el/los péptido(s)
seleccionado(s) en forma pentamérica puede construirse,
expresarse y purificarse tal como se describió en los ejemplos
anteriores, particularmente los ejemplos 2 y 3. Los cuerpos
pentaméricos seleccionados pueden marcarse con una enzima marcadora
tal como peroxidasa.
Los anticuerpos específicos para el antígeno de
interés, tales como PSA, pueden inmovilizarse en una fase sólida
tal como placas o bolas de poliestireno. Los anticuerpos
inmovilizados, no solubilizados, pueden incubarse con el fluido de
prueba, tal como suero u otro fluido biológico para la primera
etapa de inmunoabsorción. Tras la incubación puede lavarse la fase
sólida.
El cuerpo pentamérico seleccionado marcado con
una enzima marcadora puede incubarse con el antígeno
inmunoabsorbido, tal como PSA. Entonces pueden añadirse el sustrato
para la enzima marcadora conjugada con el cuerpo pentamérico y un
cromógeno. Entonces puede medirse la densidad óptica. La densidad
óptica del cromógeno será proporcional a la cantidad de antígeno,
tal como PSA, presente. Los ensayos de la invención también pueden
comprender radioinmunoensayos que usan los cuerpos pentaméricos de
la invención, el enfoque anterior y los métodos conocidos en la
técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes microorganismos están depositados
según el Tratado de Budapest en la DSM - Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares), Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig:
E. coli SG13009 pSXC6H \hskip3cm
21/10/1996 \hskip3cm DSM11236
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: CIBA-GEIGY AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Klybeckstr. 141
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4002
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +41 61 696 11 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX: + 41 61 696 79 76
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TÉLEX: 962 991
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Universidad de Lausana
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Chemin des Boveresses 155
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Epalinges
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1066
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX:
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TÉLEX:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Swiss Institute for Allergy and Astma Research (Instituto Suizo para la Investigación de la Alergia y el Asma)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Obere Stasse 22
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Davos
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 7270
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX:
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TÉLEX:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: ISREC
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Chemin des Boveresses 155
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Epalinges
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1066
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX:
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TÉLEX:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Oligómeros
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
-
6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
-
7
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
-
8
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador de PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGATCCTCGA GGGTGGAGAC TGCTGCCCAC AGATGCTTAG A
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador de PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCACTAGTAG AACCGCCACC CGGGGT
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador de PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCGCTGA CGGCGCTTGC CGTACCCCGT GGTGCGGTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador de PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGAGACCGC ACCACGGMT ACGGCAAGCG CCGTCAGCG
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador de PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCACTGC TGCAGGTCTG TGCGAATCCG ACCAGC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador de PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGAGCTGGT CGAATTCGCA CAGACCTGCA GCAGTG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador de PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCTCTGT TTGGCGTTGG CTGCCGTACG ACAAATACGA AC
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador de PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGAGTTCGT ATTTGTCGTA CGGCAGCCAA CGCCAAACAG AG
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador de PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador de PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
Claims (29)
1. Oligómero que comprende 2 o más unidades, en
el que cada unidad comprende
- (i)
- un dominio de oligomerización de la proteína oligomérica de matriz del cartílago que puede ensamblar unidades monoméricas; y
- (ii)
- un dominio de proteína o un compuesto de bajo peso molecular,
en el que dicho dominio de proteína
o dicho compuesto de bajo peso molecular no son de la proteína
oligomérica de matriz del
cartílago.
2. Oligómero según la reivindicación 1, en el
que dicho dominio de proteína es un dominio de unión que puede
unirse a una molécula diana.
3. Oligómero según la reivindicación 2, en el
que el dominio de oligomerización y el dominio de unión están
conectados mediante un espaciador.
4. Oligómero según la reivindicación 2 ó 3, que
consiste en 5 unidades.
5. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 2-4, en el que la molécula diana
es un anticuerpo o un receptor.
6. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 2-5, en el que cada una de dichas
unidades tiene menos de 600 aminoácidos.
7. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 2-6, en el que en el extremo
C-terminal de algunas o todas las unidades está
unido un dominio funcional adicional.
8. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 2-7, en el que las unidades
individuales se oligomerizan de modo espontáneo.
9. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 2-8, en el que el dominio de
oligomerización es el dominio de ensamblaje de la proteína
oligomérica de matriz del cartílago (COMP) que comprende 64
aminoácidos de los residuos 26-80 o un fragmento de
los mismos que retiene la capacidad de oligomerizar.
10. Oligómero según la reivindicación 8, en el
que el dominio de oligomerización es un mutante del dominio de
ensamblaje de la proteína oligomérica de matriz del cartílago
(COMP) que introduce dos sustituciones de Lys-29 y
Ala-30 que se cambian ambas a Cys.
11. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 2-10, en el que dicho oligómero es
un homo-oligómero en el que dichas unidades tienen
la misma especificidad para unirse a una molécula diana.
12. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 2-10, en el que dicho oligómero es
un heterooligómero en el que dichas unidades tienen una
especificidad diferente para unirse a una molécula diana.
13. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, en el que el dominio de unión
se selecciona de SEQ.ID. No. 1, SEQ ID No. 2 o SEQ. ID No. 3.
14. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-13, en el que dicho espaciador se
selecciona de SEQ.ID.No. 12 o SEQ ID No. 13.
15. Uso de un oligómero según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-14, in vitro para la
identificación y/o preparación de moléculas diana.
16. Uso de un oligómero según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-14, in vitro para
seleccionar como diana una célula eucariota, bacterias o virus.
17. Uso de un oligómero según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-14, in vitro para
seleccionar como diana una célula.
18. Uso según la reivindicación 17, para
seleccionar como diana in vitro linfomas de células B.
19. Uso de un oligómero según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-14, para la inhibición in
vitro de interacciones proteína-proteína.
20. Uso de un oligómero según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-14, in vitro como
agente quelante.
21. Uso de un oligómero según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-14, in vitro como
agente de reticulación.
22. Uso de oligómeros según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-14, para la construcción de
bibliotecas.
23. Uso de oligómeros según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-14, in vitro para la
inducción de apoptosis.
24. Uso de oligómeros según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-14, in vitro para la
inhibición intracelular de una unión de factor de trascripción,
moléculas de regulación de genes y/o actividades enzimáticas.
25. Uso de oligómeros según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-14, in vitro para
prevención de la metastatización tumoral.
26. Uso de oligómeros según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-14, in vitro como uno
de los reactivos de unión en un inmunoensayo enzimático.
27. Uso de oligómeros según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-14, in vitro como uno
de los reactivos de unión en radioinmunoensayos.
28. Método para la producción de un oligómero
según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14,
que comprende el uso de una unidad monomérica que comprende
- (i)
- un dominio de oligomerización de la proteína oligomérica de matriz del cartílago que puede ensamblar unidades monoméricas; y
- (ii)
- un dominio de proteína o un compuesto de bajo peso molecular,
en el que dicho dominio de proteína
o un compuesto de bajo peso molecular no son de la proteína
oligomérica de matriz del
cartílago.
29. Oligómero según una cualquiera de las
reivindicaciones 2-14, en el que los epítopos se
usan para el desarrollo de vacunas.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96810719 | 1996-10-28 | ||
| EP96810719 | 1996-10-28 |
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|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| EP (1) | EP0938571B8 (es) |
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