ES2288900T3 - Anticuerpo de origen humano para inhibir la agregacion de trombocitos. - Google Patents
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Abstract
Anticuerpo de origen humano, o derivado del mismo, para inhibir la agregación plaquetaria, caracterizado porque es eficaz por fijarse de forma sustancialmente exclusiva al estado activado del receptor de integrina plaquetario GPIIb/IIIa.
Description
Anticuerpo de origen humano para inhibir la
agregación de trombocitos.
La presente invención se dirige a un anticuerpo
para inhibir la agregación plaquetaria, y a un método para
identificar y/o aislar tal anticuerpo. Adicionalmente, la presente
invención se refiere al ADN que codifica este anticuerpo, y a una
preparación farmacéutica o diagnóstica que contiene el anticuerpo o
el ADN que lo codifica.
Las plaquetas o trombocitos desempeñan un papel
fundamental en el campo de la trombosis, el infarto de miocardio y
la angina inestable. El receptor de integrina en las plaquetas
GPIIb/IIIa reviste especial importancia, dado que actúa como
mediador de la agregación plaquetaria por la fijación de la molécula
plasmática bivalente fibrinógeno. Este receptor tiene al menos dos
estados de conformación: 1) un estado no activado, que es el estado
por defecto en las plaquetas no estimuladas. En este estado no
activado, el receptor muestra una muy baja afinidad por sus
ligandos y no es capaz de inducir la agregación plaquetaria. 2) Un
estado activado, que se manifiesta tras la activación plaquetaria,
por ejemplo, por trombina. En este estado activado, GPIIb/IIIa ha
sufrido una variación conformacional, que conduce a una fijación de
alta afinidad del fibrinógeno (Shatill et al., J. Biol. Chem.
1985:260(20):11107-11114).
En consecuencia, el bloqueo terapéutico de
GPIIb/IIIa es una estrategia antiplaquetaria muy eficaz, puesto que
afecta a la variable final común de la cascada de activación
plaquetaria. Durante los últimos años, se ha desarrollado una
extensa variedad de bloqueadores de GPIIb/IIIa. Se trata de
fragmentos Fab de ratón/hombre quiméricos de un anticuerpo
monoclonal que bloquea GPIIb/IIIa (Abciximab) (Coller B. et al.,
J. Clin. Invest. 1983, 72:325-338), péptidos
cíclicos (Eptifibatide) o peptidomiméticos sintéticos policíclicos
(por ejemplo, Tirofiban) (Bhatt DL y Topol EJ, JAMA. 2000;
284(12):1549-58; Topol EJ et al.,
Lancet. 1999; 353(9148):227-31). Esta
terapia ha demostrado ser efectiva, pero aún existen algunos
problemas en este contexto:
- Especialmente bajo la terapia con Abciximab,
existe un aumento de la prevalencia de una trombocitopenia grave
(\sim1%) (Dasgupta H. et al., Am Heart J. 2000;
140(2):206-11).
- Debido a la costosa producción, los costes de
la terapia son considerablemente elevados, en especial en el caso
de Abciximab. (Hillegass WB et al., Pharmacoeconomics.
2001;19(1):41-55).
- Existe un incremento de las complicaciones de
tipo hemorrágico, que son especialmente importantes cuando se
combinan bloqueadores de GPIIb/IIIa con trombolisis.
- Los bloqueadores de GPIIb/IIIa sintéticos, que
se administran por vía oral, han producido resultados decepcionantes
a causa de sus propiedades farmacocinéticas, en particular una
afinidad más bien baja por el receptor. (Chew DP et al.,
Circulation. 2001, 103(2):201-206).
- Hay pruebas de que los bloqueadores de
GPIIb/IIIa, en especial los agentes de bajo peso molecular,
interactúan con el receptor tras la fijación. Esto podría tener
como resultado un efecto activador intrínseco paradójico. (Peter K.
et al., Blood. 1998; 92(9):3290-).
- La reversibilidad del efecto de Abciximab es
muy lenta (>12 horas).
- Aproximadamente 6% de los pacientes tratados
con Abciximab desarrollan anticuerpos quiméricos
anti-humanos (AHAC); 11% en el caso de pacientes
tratados de forma repetida. (Gawaz M., Therapie bei koronarer
Herzerkrankung. Stuttgart, Nueva York; Thieme, 1999).
Todos los bloqueadores de GPIIb/IIIa utilizados
en la actualidad se fijan al receptor activado y no activado con
una afinidad similar. Un inhibidor específico de la activación
podría ofrecer algunas ventajas. Por ejemplo, la adhesión
plaquetaria se mantendría intacta, lo que debería tener como
consecuencia una reducción de los episodios hemorrágicos. Además,
se prevendrían las interacciones con el receptor no activado. Podría
ser deseable desarrollar un agente bloqueador de GPIIb/IIIa de
menor tamaño, con una afinidad similar a la de un anticuerpo, que
debería evidenciar mejores propiedades farmacocinéticas.
Otra aplicación para un anticuerpo específico de
activación sería la detección de plaquetas activadas, lo que resulta
de gran utilidad en una variedad de condiciones de investigación y
diagnóstico.
Por lo tanto, es objeto de la presente invención
encontrar un anticuerpo con estas propiedades mejoradas, así como
proporcionar métodos para identificar un anticuerpo de este
tipo.
Este objeto se resuelve proporcionando el
anticuerpo según la reivindicación independiente 1. Características,
realizaciones y aspectos ventajosos adicionales de la presente
invención resultarán más fácilmente comprensibles analizando las
restantes reivindicaciones independientes y dependientes, la
descripción y los dibujos.
En consecuencia, la invención se dirige a un
anticuerpo de origen humano para inhibir la agregación plaquetaria,
caracterizado porque es efectivo al fijarse de manera
sustancialmente exclusiva al estado activado del receptor de
integrina plaquetaria GPIIb/IIIa.
Los términos trombocito y plaqueta se utilizan
como sinónimos en esta especificación. La expresión general
"receptor de integrina plaquetaria" significa "receptor de la
integrina plaquetaria GPIIb/IIIa".
De acuerdo con la presente invención, el
anticuerpo se fija al receptor de integrina plaquetaria GPIIb/IIIa
(alfa IIb/beta 3) e inhibe la fijación del ligando natural
fibrinógeno. Tal como se ha señalado detalladamente más arriba,
este receptor se distingue por inducir el proceso de agregación
cuando el fibrinógeno se une a él. A través del bloqueo de este
receptor, se imposibilita el entrecruzamiento.
Debido a los efectos más selectivos que se
pueden obtener, el anticuerpo se "fija de forma sustancialmente
exclusiva" a la conformación activada del receptor de integrina
plaquetaria. Esto significa que su afinidad de fijación a la
conformación activada del receptor de integrina plaquetaria es mucho
mayor que su correspondiente afinidad por fijarse a la conformación
inactiva del receptor de integrina plaquetaria. En el mejor de los
casos, el agente es sustancialmente incapaz de fijarse a la
conformación no activada del receptor de integrina.
En la presente especificación, el término
"anticuerpo" significa inmunoglobulinas de origen humano. La
inmunoglobulina puede ser también un fragmento de inmunoglobulinas
humanas, que comprende los dominios variables de las cadenas pesada
y ligera. El fragmento puede ser un fragmento de anticuerpo de
cadena simple (scFv), Fab o construcciones recombinantes y sus
derivados. Puede ser monovalente, bivalente o multivalente.
Puede contener modificaciones de su secuencia de
aminoácidos, en comparación con anticuerpos genuinos, y exhibir una
estructura modificada del dominio. Sin embargo, debe seguir siendo
capaz todavía de adoptar la configuración de dominio típica hallada
en los anticuerpos nativos, así como una secuencia de aminoácidos
capaz de fijarse a las dianas (antígenos) con alta especificidad.
Ejemplos típicos de derivados de anticuerpos son los anticuerpos
acoplados a otros polipéptidos, dominios de anticuerpos reordenados,
o fragmentos de anticuerpos. El anticuerpo puede comprender también
un compuesto adicional, por ejemplo, un dominio de proteína, en
donde dicho dominio de proteína está unido por enlaces covalentes y
no covalentes. El enlace puede estar basado en una fusión genética,
según los métodos conocidos en la técnica. El dominio adicional
presente en la proteína de fusión, que comprende el anticuerpo
empleado de acuerdo con la invención, puede estar unido,
preferentemente, a través de un conector flexible, de manera
conveniente un conector peptídico, en donde dicho conector
peptídico comprende múltiples aminoácidos hidrófilos, unidos a
péptidos, de una longitud suficiente para cubrir la distancia entre
el extremo C-terminal del dominio proteico
adicional y el extremo N-terminal del anticuerpo, o
viceversa. La proteína de fusión anteriormente mencionada puede
comprender, adicionalmente, un conector escindible o un sitio de
escisión para proteinasas. De esta forma, por ejemplo, el
anticuerpo podría estar unido a una molécula efectora que posee una
conformación adecuada para la actividad biológica, o fijación
selectiva a un soporte sólido, una sustancia biológicamente activa
(por ejemplo, una citoquina u hormona del crecimiento), un agente
químico, un péptido, una proteína o un medicamento.
El anticuerpo de la presente invención es de
origen humano. Esta es una característica especialmente importante
de la invención, puesto que abre el uso de estos anticuerpos a una
terapia en pacientes humanos, exenta del riesgo de reacciones
inmunes adversas contra otros tipos de anticuerpos "extraños".
La fuente del anticuerpo humano puede ser una biblioteca de
expresión en fago de fragmentos de anticuerpos humanos naturales o
modificados, en la que se han rastreado anticuerpos que muestran
afinidad por los trombocitos.
Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo
de cadena sencilla, en el que un dominio VH está ligado a un
dominio VL. El término "ligado" se refiere, preferentemente, a
un enlace peptídico. Este anticuerpo de cadena sencilla es,
preferentemente, un anticuerpo scFv recombinante. Métodos para la
producción de anticuerpos de cadena sencilla de este tipo, dotados
con las propiedades mencionadas anteriormente, o de secuencias de
ADN que codifican un anticuerpo de estas características, su
expresión en hospedadores adecuados, y su recuperación y
purificación se describen, por ejemplo, en los documentos
WO-A-89/09622,
WO-A-89/01783,
EP-A-0 239 400, WO 90/07861, y
Colcher et al., Cancer Research 49 (1989), págs.
1732-1745. El scFv utilizado puede ser una
construcción recombinante de fragmento(s) de anticuerpos de
cadena sencilla, si tales reordenamientos o cambios de la secuencia
son necesarios para obtener el producto deseado. El experto conoce
métodos para modificar los respectivos dominios de
inmunoglobulinas, por ejemplo, a través de la deleción, inserciones,
sustituciones y/o recombinaciones de aminoácidos. El experto en la
técnica conoce los métodos para introducir tales modificaciones en
la secuencia de codificación de la cadena de inmunoglobulina (por
ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor (1989), N.Y.). Por otra parte, el
fragmento del anticuerpo de cadena sencilla puede derivar, por
ejemplo, de un anticuerpo IgM o IgG humano. De manera alternativa,
se pueden llevar a cabo BsAb o diacuerpos recombinantes (que
contienen dos fragmentos scFv, unidos preferentemente a través de
un conector peptídico). Asimismo, resultará conveniente construir
diacuerpos en tándem por homodimerización de fragmentos de cadena
sencilla, que comprenden cuatro dominios variables de anticuerpos
(VH y VL) de dos especificidades
diferentes.
diferentes.
Debido a la amplia variedad de procedimientos
para la generación de anticuerpos en el curso de una respuesta
inmune, puede producirse, en general, un número elevado de
diferentes secuencias adecuadas para atacar el antígeno extraño.
Para el experto en la técnica resulta evidente que, con este
objetivo, se podrían hallar diversas realizaciones de secuencias de
anticuerpos para satisfacer los requisitos de la presente invención.
Como un ejemplo que ha sido analizado y funciona correctamente, el
anticuerpo según la invención puede distinguirse porque el
fragmento comprende una región de aminoácidos que comprende el
producto de traducción de la secuencia de ácidos nucleicos de la
Fig. 2 (SEQ. No. 1). En una realización adicional preferida,
comprende la secuencia de aminoácidos según se muestra en la Fig.
2, o consiste en la secuencia de aminoácidos de la Fig. 2. En una
realización adicional, la presente invención ofrece moléculas de
ácidos nucleicos que codifican un fragmento, derivado o variación
alélica del polipéptido anterior que, sustancialmente, tienen las
mismas propiedades que el de la Fig. 2. El término "derivado"
significa, en este contexto, que la secuencia de estas moléculas
difieren de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico y/o de
la secuencia de aminoácidos de la Fig. 2 en una o varias
posiciones, pero poseen un nivel alto de homología con estas
secuencias. En este caso, homología significa una identidad de
secuencia de al menos 60%, en especial una identidad de al menos 70
u 80% y, preferentemente, mayor que 90% y, de forma especialmente
preferida, mayor que 95%. Las desviaciones de las moléculas de
ácidos nucleicos anteriormente mencionadas, o moléculas de
péptidos, se pueden haber producido por deleción, sustituciones,
inserciones o recombinación.
Otro ejemplo apropiado es una biblioteca
sintética de secuencias de anticuerpos. El fragmento identificado
comprende un dominio CDR3 de cadena pesada, que contiene la
secuencia ELEAYCRGDCYPPYYG, o un derivado del mismo, con estructura
y propiedades comparables. Se ha encontrado que esta secuencia es
capaz de unirse al receptor de integrina, tal vez porque puede
imitar la estructura del fibrinógeno.
Una realización preferida adicional se refiere a
la secuencia de ADN que codifica el anticuerpo de cadena sencilla.
Estas secuencias de ADN se pueden insertar en un vector o un vector
de expresión. De esta forma, la presente invención se refiere
también a vectores y vectores de expresión que contienen estas
secuencias de ADN. El término "vector" significa un plasmidio
(pUC18, pBR322, pBlueScript, etc.), un virus, o cualquier otro
vehículo adecuado. En una realización preferida, las secuencias de
ADN están unidas funcionalmente con elementos reguladores que
permiten su expresión en células hospedadoras procarióticas o
eucarióticas. Tales vectores contienen, además de los elementos
reguladores (por ejemplo, promotor), un origen de replicación y
genes específicos que permiten la selección fenotípica de una célula
hospedadora transformada. Los elementos reguladores para la
expresión en procariotas (por ejemplo, E. coli) son el
promotor lac, trp o el promotor T7, y para la expresión en
eucariotas, el promotor AOX1 o Gal (para la expresión de levaduras),
y el promotor CMV, SV40, RVS-40, el potenciador CMV
o SV40 (para la expresión en células animales). Ejemplos adicionales
de promotores son los promotores de metaloteína I y polihedrina.
Vectores de expresión adecuados para E. coli son pGEMEX,
derivados de pUC, pEXHAM y pGEX-2T. Promotores
apropiados para la expresión en levaduras son pY100 e Ycpad1, y
para la expresión en células de mamíferos, pMSXND, pCR, pEFBOS, cDM8
y pCEV4.
Para la construcción de los vectores de
expresión que contienen las secuencias de ADN de la presente
invención, así como los elementos reguladores apropiados, se pueden
utilizar métodos generales conocidos en la técnica. Ejemplos de
estas técnicas son técnicas de recombinación in vitro,
métodos de síntesis y técnicas de recombinación in vivo
(véase Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor (1989), N.Y.). Las secuencias de ADN
según la presente invención se pueden insertar también en un vector
en combinación con secuencias de ADN que codifican otras proteínas o
péptidos que se deben expresar como proteínas de fusión.
La presente invención se refiere,
adicionalmente, a células hospedadoras que contienen estos vectores.
Estas células hospedadoras son, por ejemplo, bacterias (por
ejemplo, cepas de E. coli XL1blue, HB101, DH1, x1776, JM101,
JM109, BL21 y SG13009), levaduras (preferentemente, S.
cerevisiae), células de insectos (preferentemente, células
cf9), y células animales (preferentemente, células de mamíferos).
Células de mamíferos preferidas son células de mieloma
(preferentemente, células de mieloma de ratón). Los métodos de
transformación de estas células hospedadoras, métodos para la
selección fenotípica de transformantes, y para la expresión de las
secuencias de ADN según la presente invención, utilizando los
vectores anteriormente mencionados, son conocidos en el presente
campo técnico.
La presente invención se refiere,
adicionalmente, a métodos para la producción recombinante del
anticuerpo (de cadena sencilla), utilizando los vectores de
expresión citados anteriormente. Este método comprende el cultivo
de las células hospedadoras antes mencionadas bajo condiciones que
permiten la expresión (preferentemente, expresión estable) de la
proteína (o proteína de fusión), y la recuperación de la proteína
del cultivo o de las células hospedadoras. El experto en la técnica
conoce las condiciones de cultivo de células hospedadoras
transformadas o transfectadas. Los métodos adecuados para la
producción recombinante de proteínas (por ejemplo, Holmgren,
Annual Rev. Biochem. 54 (1985), 237; LaValle et al.,
Bio/Technology 11 (1993), 187; Wong, Curr. Opin.
Biotech. 6 (1995), 517; Davies, Curr. Opin. Biotech. 6
(1995), 543) son conocidos. Adicionalmente, se conocen métodos de
purificación apropiados (por ejemplo, cromatografía preparativa,
cromatografía de afinidad, HPLC, etc.).
Además, la invención se dirige a un
procedimiento para identificar y/o aislar anticuerpos para inhibir
la agregación plaquetaria por su fijación a la forma activada del
receptor de integrina GPIIb/IIIa de los trombocitos hemáticos.
El procedimiento según la invención comprende
las siguientes etapas:
- -
- proporcionar una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican secuencias de candidatos;
- -
- producir una biblioteca de fagos a partir de dicha biblioteca de ácidos nucleicos;
- -
- hacer reaccionar de manera sucesiva dicha biblioteca de fagos con trombocitos no activos, trombocitos activos, otras células que expresan moléculas no activas de receptor de integrina, y otras células que expresan moléculas activas de receptor de integrina; y
- -
- eluir los fagos unidos a dichos trombocitos o a otras células que expresan moléculas activas de receptor de integrina.
Una etapa importante del procedimiento inventivo
es que la biblioteca de fagos se somete a un proceso de depleción
de los polipéptidos menos adecuados que se unen a plaquetas no
activas, o a otros componentes en la superficie de plaquetas
activas. Después de cada una de las etapas de fijación, se debe
realizar una recuperación de los fagos seleccionados, lo que se
puede llevar a cabo mediante métodos conocidos. Finalmente, se
ensaya la actividad bloqueadora de los fagos portadores de
polipéptidos que se fijan de forma específica al receptor de
integrina.
Asimismo, es posible omitir las etapas de
selección con otras células. Por medio de esta modificación, se
pueden detectar fagos que inhiben la agregación plaquetaria a través
de otros mecanismos.
De este modo, es posible obtener una
"biblioteca natural", basada en la población de anticuerpos de
los donantes.
De manera alternativa, se puede utilizar una
biblioteca sintética, situación en la que la etapa de proporcionar
una biblioteca comprende las siguientes etapas:
- -
- proporcionar un ácido nucleico que contiene una secuencia para un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla, que contiene un dominio variable pesado y un dominio variable ligero; e
- -
- introducir al menos una secuencia aleatoria de nucleótidos en una región de dicho fragmento de anticuerpo de cadena sencilla.
La región en la que se introduce la al menos una
secuencia aleatoria de nucleótidos es, preferentemente, la región
CDR3 de vH o vL tal como un scFv.
Dichas otras células pueden ser,
preferentemente, células CHO, que son bien conocidas y pueden
expresar el receptor de integrina en su superficie, después de
haber sido transformadas.
Adicionalmente, la invención se dirige al uso de
una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo, ADN o
vectores de expresión según la presente invención para bloquear el
receptor de integrina plaquetaria en los trombocitos.
Adicionalmente todavía, la invención se dirige
al uso del anticuerpo, ADN o vector de expresión según la invención
para preparar una composición farmacéutica.
El tema de la presente invención también es
interesante en el campo diagnóstico. Se puede utilizar para
determinar el número de trombocitos activados en relación con los
trombocitos no activados en un paciente. Resulta especialmente útil
para monitorizar el estado de (des)activación si el paciente
está siendo tratado con inhibidores de la agregación
plaquetaria.
La composición farmacéutica o diagnóstica puede
contener, adicionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Vehículos aceptables son soluciones salinas tamponadas con fosfato,
agua, emulsiones (por ejemplo, emulsiones de agua en aceite),
tensioactivos, soluciones estériles, etc. La administración de la
composición farmacéutica se puede realizar por vía oral o
parenteral (por ejemplo, por vía tópica, intraarterial,
intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal,
intraventricular, intraperitoneal o intranasal). La dosificación
apropiada deberá determinarla el médico y depende de diversos
factores (por ejemplo, edad, sexo, peso del paciente, tipo de
enfermedad, y vía de administración, etc.).
Las secuencias de ADN de la presente invención
se pueden insertar también en un vector adecuado para terapia
génica, por ejemplo, bajo el control de un promotor específico para
el tejido. En una realización preferida, el vector que contiene las
secuencias de ADN es un virus (por ejemplo, un adenovirus, virus
vaccinia o virus adeno-asociado). Se prefieren los
retrovirus. Ejemplos de retrovirus adecuados son MoMuLV, HaMuSV,
MuMTV, RSV o GalV. A efectos de la terapia génica, las secuencias
de ADN según la presente invención se pueden transportar en forma
de dispersiones coloidales hasta las células diana. En este sentido,
cabe citar también liposomas y complejos lipídicos (Mannino et
al., Biotechniques 6 (1988), 682).
Por último, la invención se dirige a un método
para tratar un paciente, que comprende la etapa siguiente:
administrar al paciente una composición
farmacéutica según la invención en una dosis farmacéuticamente
efectiva.
A continuación, la invención se describirá de
manera más detallada mediante realizaciones que sirven como
ejemplos no limitantes, en las que se hace referencia a los dibujos
adjuntos:
Fig. 1 muestra un análisis FACS de un clon que
expresa un fragmento de anticuerpo según una primera realización de
la invención;
Fig. 2a muestra la secuencia de ácidos nucleicos
del clon MB9 que codifica un anticuerpo scFv según la presente
invención;
Fig. 2b muestra la secuencia de aminoácidos de
MB9.
Fig. 3 muestra la secuencia de scFv C9 y scFv
E4.
Fig. 4 muestra los oligonucleótidos utilizados
para la construcción de la biblioteca sintética basada en el scFv
humano. Los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción
BbsI se muestran en negrita, y los sitios de corte están
subrayados.
Fig. 5 muestra una representación esquemática de
posiciones de hibridación de los oligonucleótidos utilizados para la
construcción de pEXHAM4/C9 y pEXHAM4/E4. Los genes de C9 y E4 de
scFv clonados en pEXHAM1 se muestran como casillas. Las zonas
pintadas en negro representan regiones CDR; los oligonucleótidos se
representan mediante flechas y se identifican con números (véase la
Fig. 4). Se indican los sitios de reconocimiento de la endonucleasa
de restricción BpiI.
Fig. 6 muestra mapas de vectores de pEXHAM4/C9 y
pEXHAM4/E4.
Fig. 7 muestra mapas de vectores de pEXHAM4/C9 y
pEXHAM4/E4.
Fig. 8 enumera los oligonucleótidos usados como
cebadores en la 1ª PCR para la amplificación de las regiones
variables de cadenas pesada y ligera humanas.
Fig. 9 enumera los oligonucleótidos usados como
cebadores en la 2ª PCR para la introducción de secuencias de
reconocimiento de la endonucleasa de restricción (marcadas en
negrita).
Fig. 10 muestra el análisis FACS de los clones
SA8, SA10 y SA11. Fijación de los scFv indicados a trombocitos
activados (curva negra) y no activados (curva gris).
Fig. 11 muestra la secuencia completa de
nucleótidos relativa al mapa de vector pEXHAM4/E4.
Fig. 12 muestra la secuencia completa de
nucleótidos relativa al mapa de vector pEXHAM4/C9.
Fig. 13 muestra la secuencia completa de
nucleótidos relativa al mapa de vector pEXHAM7/E4.
Fig. 14 muestra la secuencia completa de
nucleótidos relativa al mapa de vector pEXHAM7/C9.
A continuación, se ofrecerán ejemplos para la
producción de anticuerpos scFv humanos específicos para el receptor
de integrina plaquetaria activado GPIIb/IIIa.
Las bibliotecas de fagos para la expresión de
fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla (scFv) se generan a
partir de genes del anticuerpo IgM humano. De manera alternativa, se
genera una biblioteca sintética por aleatorización de la región
CDR3 de la cadena pesada en dos marcos maestros de scFv de origen
humano. En ambas bibliotecas se procede a la eliminación de
elementos de fijación no específicos para la activación por medio
de la incubación sobre trombocitos en reposo, antes de utilizarlas
para la selección en plaquetas activadas. Para centrar la selección
sobre el receptor GPIIb/IIIa, se llevan a cabo ciclos adicionales de
selección en células cultivadas in vitro, que expresan el
receptor GPIIb/IIIa recombinante. Tras la selección, se analiza en
los clones de scFv la fijación a trombocitos activados y la
competición con la fijación de fibrinógeno por análisis FACS.
Se aísla ARN completo de muestras del bazo de
seis donantes humanos y linfocitos de sangre periférica (PBL) de
cinco donantes humanos sanos (aprox. 1-5x10^{8}
PBL cada uno, Kit RNeasy (®) Midiprep., Qiagen). A partir del ARN
total se prepara ARN-poliA^{+} (Kit Oligotex mRNA,
Qiagen), y se utiliza para la síntesis de ADNc (Sistema
SuperScript® Preamplifications, Gibco BRL/LIFE Technologies).
Los oligonucleótidos utilizados en la PCR para
la amplificación de regiones variables de las cadenas pesada y
ligera de inmunoglobulina humana son los de la Fig. 8. Las cadenas
pesadas se amplifican usando un único cebador constante específico
para IgM, y uno de una serie de cebadores diferentes
(VH-1 a VH-7) específicos para la
región variable en reacciones de PCR separadas. De manera
equivalente, se amplifican las cadenas ligeras lambda y kappa
usando un único cebador constante específico para lambda o kappa y
uno de una serie de diferentes cebadores variables
(V\lambda-1 a V\lambda-10 y
V\kappa-1 a 6). La PCR se lleva a cabo en un
volumen de 50 \mul utilizando 0,5 \mul de ADNc, 1 unidad de
ADN-polimerasa exo^{-} Vent (New England Biolabs),
y 0,5 \muM de cada cebador, bajo las condiciones siguientes: 3
min 95ºC, 20x [30 seg 95ºC, 1 min 55ºC, 1 min 72ºC], 5 min 72ºC.
Los productos de la primera PCR se purifican usando el Kit de
purificación de PCR (Qiagen), y se usan como moldes para una
segunda PCR, en la que se emplea un conjunto correspondiente de
cebadores de oligonucleótidos de la Fig. 9 para introducir los
sitios de restricción para la clonación. La segunda PCR se lleva a
cabo de forma separada para cada conjunto de cebadores, de acuerdo
con la primera PCR, pero usando 1 min a 57ºC para la hibridación.
Los productos de la segunda PCR de la cadena pesada, la cadena
ligera lambda y la cadena ligera kappa se combinan y purifican por
medio del Kit de purificación de PCR (Qiagen).
Los fragmentos de cadena pesada se digieren con
NcoI y HindIII, y los fragmentos de cadena ligera con
MluI y NotI (cada una de New England Biolabs), de
acuerdo con las instrucciones del proveedor y, por último, se
purifican por extracción sobre gel a partir de geles de agarosa al
1%, utilizando el Kit de Extracción sobre Gel (Qiagen). Para crear
una sub-biblioteca, estas cadenas pesadas se clonan,
en primer lugar, en el vector de expresión en fago pEXHAM1 (Figura
1) que contiene un scFv "stuffer". El ADN vector se corta con
NcoI y HindIII, se purifica por extracción sobre gel,
y se liga por separado con fragmentos de cadena pesada procedentes
de diferentes donantes. La ligadura se lleva a cabo en un volumen de
20 \mul usando 50 ng de vector, 9 ng de fragmento de cadena
pesada y 1 unidad de ADN-ligasa T4 (Roche) durante
tres horas a temperatura ambiente. La mezcla de ligadura se
precipita, se resuspende en 10 \mul de agua y se mezcla con 35
\mul de células electrocompetentes de E. coli XL1blue
(Stratagene) para electroporación, de acuerdo con las instrucciones
del proveedor. Las células transformadas se siembran en placas
selectivas de LB agarosa que contienen glucosa 50 mM, 100 \mug/ml
de ampicilina y 20 \mug/ml de tetraciclina, y se incuban a 30ºC
durante la noche. El tamaño de las sub-bibliotecas
se encuentra dentro del intervalo de 1,5x10^{6} hasta
7,1x10^{7}, determinado por las diluciones en placa
apropiadas.
Los clones bacterianos se retiran de las placas
por rascado y se utilizan para la maxi-preparación
de ADN (Qiagen) para preparar el ADN del vector destinada a la
clonación de las bibliotecas completas. El ADN subsidiario se corta
con MluI y NotI, se purifica por extracción sobre gel
y se liga con los fragmentos de cadenas ligeras lambda y kappa por
separado. La ligadura se lleva a cabo en un volumen de 20 \mul
usando 1 \mul de ADN de vector y un exceso molar doble de ADN de
la cadena ligera. Tras la incubación con 1 unidad de ligasa T4
(Roche) durante la noche a 8ºC, la mezcla de ligadura se precipita y
disuelve nuevamente en 2,5 \mul de Tris 10 mM a pH 8,5. De este
resultado, se usan 2 \mul para la transformación de partes
alícuotas de 50 \mul de células XL1blue electrocompetentes. Las
células se siembran sobre placas de agar selectivas y se determina
el número de transformantes mediante la siembra en placas de
diluciones adecuadas, tal como se ha descrito anteriormente. El
tamaño total de todas las bibliotecas generadas a partir de material
esplénico y de ARN de PBL es de 1,75x10^{9}.
Para la expresión en fago de los scFv, la
biblioteca se inocula en partes alícuotas de 250 ml de medio LB,
suplementado con glucosa 50 mM, 100 \mug/ml de ampicilina y 20
\mug/ml de tetraciclina con una DO600 inicial de 0,025, lo que
garantiza que el número de células supera la complejidad en un
factor de 10. Las células se incuban a 37ºC y 200 rpm hasta una
DO600 de 0,2, y se infectan con fagos auxiliares M13K07 hasta una
multiplicidad de infección de 10. Después de incubar durante una
hora a 37ºC, se cosechan las células por centrifugación, se
resuspenden en 250 ml de medio libre de glucosa, y se incuban
durante la noche a 30ºC y 200 rpm. Los fagos se aíslan por
precipitación con PEG (PEG6000 al 20%, NaCl 2,5 M), y se disuelven
nuevamente en tampón de dilución de fagos (Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl
20 mM, EDTA 2 mM).
Rastreo de la biblioteca en busca de plaquetas
activadas para la fijación de scFv. Depleción de la biblioteca de
las plaquetas no activadas para la fijación de scFv:
Se toman 5 ml de sangre venosa humana en una
S-Monovette (Sarstedt) que contiene 25 \mul de
prostaglandina E10 (10 mM), y se centrífuga a 110 g durante 10 min.
A partir del plasma rico en plaquetas (fase superior) se transfiere
1 ml a un tubo nuevo, se mezcla con 9 ml de tampón CGS (citrato
sódico 10 mM, dextrosa 30 mM, NaCl 120 mM), y se centrifuga a 1000
g durante 10 min. El granulado se resuspende en 4 ml de tampón
Tyrode (NaCl (150 mM), NaHCO_{3} (12 mM), KCl, MgCl (2 mM cada
uno), glucosa, BSA (1 mg/ml cada uno), pH 7,4) que contiene 2% de
leche descremada en polvo, y se incuba con 1,75x10^{12}
bacteriófagos (1000 x complejidad) durante 2 horas a temperatura
ambiente. Las plaquetas se centrifugan a 1000 g durante 10 min, se
retira el sobrenadante y se almacena a 4ºC.
Se toman 5 ml de sangre venosa humana en un
S-Monovette (Sarstedt) y se centrifugan a 110 g
durante 10 min. A partir del plasma rico en plaquetas (fase
superior) se transfiere 1 ml a un tubo nuevo, se mezcla con 9 ml de
tampón CGS y se centrífuga a 1000 g durante 10 min. El granulado se
resuspende con 4 ml de solución de la que se han eliminado los
fagos, y que contiene CaCl_{2}, MgCl_{2} (2 mM cada uno), ADP
(15 \muM) y se incuba a temperatura ambiente durante 2 horas. Las
plaquetas se lavan dos veces por centrifugación (1000 g, 10 min) y
se resuspenden en 14 ml de tampón Tyrode.
Para la elución de los fagos fijados, las
plaquetas se centrifugan (1000 g, 10 min), se resuspenden en 1 ml
de tampón de glicina (0,1 M, pH 2,2) y se incuban durante 10 min a
temperatura ambiente. Después de la centrifugación (1000 g, 10 min),
el sobrenadante se neutraliza mediante la adición de Tris (2 M, pH
8,0).
Los fagos eluidos se mezclan con 10 ml de
células de E. coli XL1blue en crecimiento logarítmico, y se
incuban a 37ºC durante 30 min. Después de la centrifugación (10 min,
6000 g), las células se resuspenden en 400 \mul de medio
LB_{GAT} (medio LB que contiene glucosa 50 mM, 100 \mug/ml de
ampicilina y 20 \mug/ml de tetraciclina), se siembran sobre
placas de agar con LB_{GAT} y se incuban durante la noche a
37ºC.
Las colonias se retiran por rascado de las
placas de agar, usando dos veces 5 ml de medio LB_{GAT} y se
utilizan para la inoculación de 20 ml de medio LB_{GAT} a una
DO600 de 0,1. Las células se incuban a 37ºC y 200 rpm durante una
hora y se sobre-infectan con aprox. 1x10^{10}
fagos auxiliares M13K07. Después de una hora a 37ºC, se recogen las
células por centrifugación (5 min, 6000 g), se resuspenden en medio
LB suplementado con ampicilina (100 \mug/ml) y kanamicina (50
\mug/ml), y se incuban durante la noche a 30ºC y 200 rpm. Los
fagos se recogen por precipitación de PEG y se resuspenden en 1 ml
de tampón de dilución de fagos (como se ha descrito para el rescate
de bibliotecas).
Células de ovario del hámster chino (CHO) que
expresan el receptor GPIIb/IIIa no activado (células A5; Peter
et al., Blood, Vol. 9, 1998, págs. 3240-3249)
se someten a tripsinización, se centrifugan (10 min, 140 g) y se
resuspenden a 5x10^{6} células/ml de tampón Tyrode. Se mezclan
aprox. 10^{9} fagos empaquetados procedentes del primer ciclo de
selección con 4 ml de suspensión celular y se incuba durante 1 hora
a temperatura ambiente. Las células se centrifugan durante 20 min a
140 g y el sobrenadante se retira nuevamente por centrifugación (20
min, 3200 g).
Se cosechan por tripsinización células CHO que
presentan GPIIb/IIIa activo (células C13, Peter K y O'Toole TE,
J Exp Med. 1995, 181 (1):315-326), se
centrifugan y se lavan una vez usando 1 ml de tampón Tyrode. Se
incuban 4x10^{6} células con 4 ml de solución de la que se han
eliminado los fagos durante 30 min a temperatura ambiente.
Las células se centrifugan durante 10 min a 140
g, se resuspenden en 50 ml de tampón Tyrode, se centrifugan tres
veces durante 20 min a 700 g y se resuspenden en 1 ml de tampón
Tyrode y, por último, se resuspenden en 200 \mul de ReoPro (2
mg/ml). Después de 20 min a temperatura ambiente, las células se
retiran por centrifugación durante 10 min a 13000 rpm en una
centrifugadora de mesa.
Las células se centrifugan durante 10 min a 140
g, se resuspenden en 50 ml de tampón Tyrode modificado (tampón
Tyrode pH 6 ajustado con Hepes, que contiene CaCl_{2}, MgCl_{2}
(2 mM cada uno) y 1 mg/ml de BSA), se centrifugan dos veces durante
20 min a 700 g, y se resuspenden en 1 ml de tampón Tyrode y, por
último, se resuspenden en 1 ml de glicina (pH 2,2). Después de 15
min a temperatura ambiente, la mezcla se neutraliza por la adición
de 100 \mul de Tris (2 M, pH 8) y se retira por centrifugación a
13000 rpm durante 10 min en una centrifugadora de mesa.
Se preparan análisis de digestión por
endonucleasas de restricción a partir del ADN de clones
seleccionados entre clones de experimentos de selección, usando
columnas "spin" de ADN, siguiendo las instrucciones del
fabricante (Qiagen). El ADN se digiere con BstNI (New England
Biolabs) y se analiza sobre un gel de agarosa al 1%.
Se inoculan 5 ml de medio LB_{GAT} con 250
\mul de un cultivo durante la noche, y se incuban a 37ºC y 180
rpm durante 4 horas. Las células se cosechan por centrifugación (5
min, 6000 g), se resuspenden en 5 ml de medio LB que contiene
ampicilina (10 \mug/ml) e IPTG (100 \muM), y se incuban a 28ºC y
180 rpm durante la noche. Las células se vuelven a cosechar por
centrifugación y se resuspenden en 500 \mul de solución de choque
(Tris HCl 50 mM, pH 8,0, sacarosa al 20%, EDTA 1 mM), y se incuban a
8ºC durante una hora. Las células se retiran por centrifugación (10
min, 13000 rpm, centrifugadora de mesa), y el sobrenadante se
dializa dos veces durante 3 horas contra PBS a 4ºC.
El análisis FACS se lleva a cabo usando un
dispositivo FACSCalibur (Becton Dickinson).
Se diluye sangre citrada completa
(S-Monovette, Sarstedt) 1/50 en 50 \mul de tampón
Tyrode con o son ADP (20 \muM), y se incuba durante 20 min a
temperatura ambiente con 10 \mul de extractos periplasmáticos de
scFv. Como anticuerpo secundario, se agrega anticuerpo
anti-His marcado con FITC (Dianova), se incuba
durante 20 min y se fija con Cellfix (1x).
Se diluye sangre citrada completa
(S-Monovette, Sarstedt) 1/50 en 50 \mul de tampón
Tyrode con o son ADP (20 \muM), y se incuba durante 20 min con
anticuerpo anti-fibrinógeno marcado con FITC
(WAK-Chemie Medical), en presencia o ausencia de 20
\mul de extractos periplasmáticos de scFv, antes de la fijación
con Cellfix (1x, Becton Dickinson).
Durante un ciclo, se rastrea la existencia de
clones específicos para GPIIb/IIIa en bibliotecas de expresión en
fago de scFv humanos, procedentes del bazo y PBL, mediante la
selección en plaquetas humanas activadas. De la biblioteca se
retiran previamente las plaquetas no activadas para eliminar los
conectores específicos de no activación. El segundo y tercer ciclos
de selección se llevan a cabo en células CHO que expresan el
receptor GPIIb/IIIa recombinante activado, tras la depleción en
células que presentan una variante no activada. La elución se
realiza por medio de ácido o por competición con ReoPro. Después del
tercer ciclo de selección, se toman clones al azar y se analiza, en
primer lugar, su enriquecimiento por digestión con BstNI y la
activación de la fijación específica a trombocitos (Tabla 1). Se
detecta que un clon, MB9, se encuentra enriquecido utilizando
elución tanto ácida como competitiva a 10 de 80 clones y 10 de 60
clones, respectivamente. Igualmente, MB9 es fuertemente específico
para la activación de la fijación a plaquetas, e inhibe la fijación
de fibrinógeno a las plaquetas, tal como se determina en el análisis
FACS que se muestra en la Fig. 1. En la misma, se muestra lo
siguiente: Histograma izquierdo: demuestra la fijación de scFv MB9
a trombocitos humanos activados (negro), pero no a los no activados
(gris). Histograma derecho: fijación de fibrinógeno a trombocitos
activados (negro), pero no a trombocitos no activados. La fijación
de fibrinógeno a trombocitos activados resulta inhibida en
presencia de scFv MB9 (curva gris brillante maciza).
Adicionalmente, MB9 compite con ReoPro por la
fijación. Otros clones enriquecidos tales como MA1 mostraron
también fijación específica de activación, pero fracasaron en la
inhibición de la fijación de fibrinógeno, o no fueron fuertemente
específicos para trombocitos activados, tales como MA3 o MB1.
La secuencia de ADN del clon MB9 se ofrece en
SEQ. ID No. 1 (Fig. 2). Se indican las secuencias de reconocimiento
de la endonucleasa de restricción que flanquean las cadenas pesada y
ligeras (NcoI, HindIII y MluI, NotI,
respectivamente).
De acuerdo con el Tratado de Budapest, el 6 de
septiembre de 2001 se depositó un clon que codifica MB9 bajo la
referencia DSM 14491 (XL1blue(pEXHAM4/MP9) en la
"Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, D-38124 Braunschweig" ("Colección
Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares S.r.l,
D-38124 Braunschweig").
Para la generación de una biblioteca sintética
por aleatorización de la región CDR3 de la cadena pesada, se
seleccionan dos marcos maestros humanos (C9 y E4, Figura 3) debido a
sus excelentes características de producción en células E.
coli. Ambos scFv tienen su origen en una extensa biblioteca de
anticuerpos humanos de expresión en fago (Little, M. et al., J.
Immunol. Methods 1999, 231:3-9) y específicos
para el antígeno del virus de la hepatitis B (C9) y estradiol (E4),
respectivamente.
Los scFv C9 y E4 se clonan en ADN del vector
pEXHAM1, sustituyendo el scFv "stuffer" por técnicas de
clonación recombinante convencionales, con el uso de los sitios de
clonación de NcoI y NotI.
Para preparar un vector que permita la
aleatorización de CDR3 de la cadena pesada, sin modificar la
secuencia original, se sustituye esta región por un fragmento de
ADN "stuffer" que contiene los sitios de reconocimiento de la
enzima de restricción BbsI (BpiI) del tipo IIS. Se
llevan a cabo las reacciones de PCR convencionales, usando los
cebadores de oligonucleótidos, tal como se muestra en la Fig. 4,
para generar fragmentos de ADN de las regiones 3' y 5' de la cadena
pesada de la región CDR3 de scFv, que contienen sitios de clonación
BpiI únicos tal como se esquematiza en la Fig. 5, que es una
representación esquemática de posiciones de hibridación de los
oligonucleótidos usados para la construcción de pEXHAM4/C9 y
pEXHAM4/E4. Los genes de C9 y E4 de scFv clonados en pEXHAM1 se
muestran como casillas. Las zonas representadas en negro indican
regiones CDR; los oligonucleótidos se representan mediante flechas
y se identifican con números (véanse las definiciones de secuencia).
Se indican los sitios de reconocimiento de la endonucleasa de
restricción BpiI.
El fragmento de ADN "stuffer" se genera
directamente por hibridación de oligonucleótidos sintéticos. Los
fragmentos de ADB se cortan con BpiI y se clonan en ADN del
vector pEXHAM1 digerido con BpiI para generar pEXHAM4/C9 y
pEXHAM4/E4 (Figs. 6, 11 y 12).
El uso directo de ADN del vector pEXHAM4 para la
clonación a través de BbsI requiere la purificación de dos
fragmentos de vector, de 3,8 y 0,5 kb de tamaño. Para evitar estos
dos sitios de restricción de BbsI fuera de la secuencia de
scFv, se les elimina en varias etapas sin modificar la secuencia de
proteínas, usando como cebadores para la PCR oligonucleótidos mal
apareados, u oligonucleótidos sintéticos hibridados directamente
para sustituir los fragmentos de ADN que contienen BbsI
mediante la clonación a través de los sitios de restricción
adyacentes. Las construcciones finales se denominan pEXHAM7/C9 y
pEXHAM7/E4 (Figs. 7, 13 y 14), respectivamente.
Para generar una biblioteca, se insertan por
separado oligonucleótidos sintéticos que codifican cuatro a siete
aminoácidos aleatorios por codones NNK (VHCDR3_3.4/cortado hasta
VHCDR3_3.7/cortado; cada uno 1 \muM), utilizando oligonucleótidos
VHCDR3_for/cortado y VHCDR3_back/cortado (0,2 \muM) (Fig. 4), con
1 unidad de ADN-polimerasa exo^{-} Vent (New
England Biolabs), bajo las siguientes condiciones de PCR: 2 min a
94ºC, 5x [1min a 94ºC, 1 min a 40ºC, 1 min a 72ºC], 10 min a 72ºC
en 100 \mul de volumen. Los productos de PCR se purifican usando
el Kit de purificación de PCR (Qiagen). 2/3 del material se corta
con 100 unidades de BbsI durante 6 horas y se purifica
nuevamente mediante el citado kit. En el caso de VHCDR3_3.4/cortado
y VHCDR3_3.5/cortado, el ADN del vector pEXHAM4/C9 y pEXHAM4/E4 se
corta con BbsI (1 unidad/\mug en 6 horas), y ambos fragmentos de
vector (3,8 y 0,5 kb) se purifican por elución sobre gel a partir de
un gel de agarosa al 1% (Kit de Extracción sobre Gel, Qiagen). Para
VHCDR3_3.6/cortado y VHCDR3_3.7/cortado se utilizan pEXHAM6/C9 y
pEXHAM6/E4, por lo que sólo se debió purificar un fragmento de
vector. La ligadura se efectúa en todos los casos en una relación
equimolar de todos los fragmentos. Seguidamente, la mezcla de
ligadura se precipita, se disuelve nuevamente en Tris 10 mM, pH
8,5, y se utiliza para la transformación de células XL1blue
esencialmente de la forma descrita en el Ejemplo 1.
Además de los fragmentos de ADN sintético
aleatorios, la CDR3 de la cadena pesada se sustituye también por
secuencias de CDR3 naturales amplificadas a partir de los productos
de la primera PCR de la biblioteca natural (véase el Ejemplo 1)
para centrarse en las secuencias funcionales, utilizadas in
vivo para esta región. Los oligonucleótidos usados y descritos
en la Fig. 4 están diseñados para abarcar la mayor parte de las
regiones CDR3 de la cadena pesada humana, sin modificar las
secuencias marco de C9 o E4. La PCR se lleva a cabo de forma
separada para cada molde de PCR de VH humano, usando 1 unidad de
ADN-polimerasa exo^{-} Vent (New England Biolabs)
y 0,2 \muM de cebador en un volumen de 100 \mul bajo las
condiciones siguientes: 2 min a 94ºC, 30x [1 min a 95ºC, 1 min a
50ºC, 1 min a 72ºC], 10 min a 72ºC. Los oligonucleótidos n^{os}
42, 43 y 44 se utilizan en una mezcla equimolar. Los productos de
PCR se purifican mediante el kit de purificación y se combina el
material procedente del bazo o PBL, respectivamente. La restricción
con BbsI, la ligadura con pEXHAM6/C9 y pEXHAM6/E4,
respectivamente, y la transformación se llevan a cabo de la forma
descrita anteriormente.
\newpage
El tamaño de la biblioteca sintética completa
(CDR3 sintéticos y naturales clonados en marcos de C9 y E4) en este
Ejemplo es de 7,5x10^{8} clones.
El empaquetamiento de las bibliotecas sintéticas
se efectúa de la forma descrita para la biblioteca natural (Ejemplo
1).
El rastreo de la biblioteca sintética se lleva a
cabo exactamente en la misma forma que se ha descrito para la
biblioteca natural (Ejemplo 1), comenzando con 7,5x10^{11}
bacteriófagos (complejidad 1000x).
La biblioteca sintética derivada de los marcos
de scFv humanos (C9 y E4) se rastrea en busca de clones específicos
para GPIIb/IIIa de la misma forma que se ha descrito en el Ejemplo
1. Después del tercer ciclo de selección, los clones se recogen al
azar y se determina la secuencia de ADN de las regiones CDR3 de VH
(véase la Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los clones utilizan la secuencia marco E4.
Tres de los once clones analizados codifican la secuencia de
aminoácidos RGD (también presente en el fibrinógeno) dentro de CDR3
(SA3, SA8 y SA10). En los clones SA3 y SA8 el resto RGD está
flanqueado directamente por dos residuos cisteína que podrían
estabilizar el asa por puentes disulfuro. El clon SA3 se ha
encontrado dos veces entre los once clones analizados y, por lo
tanto, se ha enriquecido probablemente por el procedimiento de
rastreo. Lo mismo es válido para el clon SA11. Estos clones de scFv
son similares a anticuerpos tales como PAC-1 que
contienen secuencias similares a RGD e inhiben la fijación del
fibrinógeno por medio del bloqueo del receptor activado (Shatill
et al., 1985). Solamente SA8, SA10 y SA11 mostraron una
fijación específica para la activación a los trombocitos en
presencia de fibrinógeno (véase la Fig. 10).
Es probable que los clones seleccionados
interactúen exactamente con el sitio de fijación del fibrinógeno
del receptor GPIIb/IIIa, pero con una afinidad similar o menor que
el fibrinógeno. La afinidad ha sido potenciada por una mutación en
el interior del dominio VH y/o VL del fragmento de anticuerpo scFv,
o por el intercambio del dominio VL completo ("barajadura
("shuffling") de cadenas").
<110> Affimed Therapeutics AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpo de origen humano para
inhibir la agregación de trombocitos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> A 3016EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 01123851.6
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
5-10-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 145
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatenIn version 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 823
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo humano recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 808
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo humano recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 814
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento del anticuerpo humano recombinante
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de anticuerpo humano recombinante
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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Artificial: oligonucleótido
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Artificial: oligonucleótido
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<223> Descripción de la Secuencia
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<212> ADN
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<223> Descripción de la Secuencia
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
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<213> Secuencia Artificial
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Artificial: oligonucleótido
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<223> Descripción de la Secuencia
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctacagaac gcgtagaaat tgtgatgacg cagtct
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctacagaac gcgtagaaat tgtaatgacg cagtct
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctacagaac gcgtagacat cgtgatgacc cagtct
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctacagaac gcgtagaaac gacactcacg cagtct
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctacagaac gcgtagaaat tgtgctgact cagtct
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctacagaac gcgtagatgt tgtgatgaca cagtct
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcggcagg gcggccgcgg acggcgggaa cagagtgac
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcggcagg gcggccgcga cagatggtgc agccacagt
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento peptídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Leu Glu Ala Tyr Cys Arg Gly Asp Cys Tyr
Pro Pro Tyr Tyr Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento peptídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Arg Arg Tyr Arg Val Gly Phe Asp
Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento peptídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Arg Gly Ala Thr Tyr Thr Ser Arg Ser
Asp Val Pro Asp Gln}
\sac{Thr Ser Phe Asp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento peptídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Arg Asp Asp Leu Ala Tyr Cys Arg Gly
Asp Cys Ser Gly Arg}
\sac{Phe Ala Phe Asp Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento peptídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Arg Arg Phe Ser Ile Ser Arg Ala Phe
Asp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento peptídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Arg Arg Thr Gly Lys Ala Arg Ser Phe
Asp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento peptídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Lys Glu Leu Glu Ala Tyr Cys Arg Gly
Asp Cys Tyr Pro Pro}
\sac{Tyr Tyr Gly Met Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento peptídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Arg Asp Leu Phe Arg Gly Arg Gly Asp
Tyr Gly Asp Tyr Gly}
\sac{Met Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento peptídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Arg Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Arg Thr
Asp Arg Arg Pro Pro}
\sac{His Ala Phe Asp Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcctggaag acgaggacac ggctgtatat tactgtgcga
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctgagaag acggtgacca gggttccctg gccccagta
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcctggaag acgaggacac ggcygtgtat tactgt
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcctggaag acgaggacac wgccgtgtat tactgt
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcctggaag acgaggacac ggccgtatat tactgt
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctgagaag acggtgacca gggtkccctg gcccca
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 142
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Anticuerpo de origen humano, o derivado del
mismo, para inhibir la agregación plaquetaria, caracterizado
porque es eficaz por fijarse de forma sustancialmente exclusiva al
estado activado del receptor de integrina plaquetario
GPIIb/IIIa.
2. Anticuerpo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el derivado del anticuerpo es un
fragmento de una inmunoglobulina que comprende dominios variables de
sus cadenas ligeras y pesadas.
3. Anticuerpo según la reivindicación 2,
caracterizado porque el fragmento es un fragmento de
anticuerpo de cadena sencilla (scFv) o Fab.
4. Anticuerpo según la reivindicación 2 ó 3,
caracterizado porque el fragmento es una construcción
recombinante de un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla
(scFv).
5. Anticuerpo según la reivindicación 2 ó 3,
caracterizado porque el fragmento de anticuerpo de cadena
sencilla se deriva de un anticuerpo IgM o IgG.
6. Anticuerpo según la reivindicación 3 ó 4,
caracterizado porque el fragmento comprende la secuencia de
aminoácidos de la Fig. 2, o una secuencia de aminoácidos que es
homóloga en al menos 60% a la misma.
7. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque es una
construcción de anticuerpo bivalente o multivalente, que comprende
el dominio variable de un anticuerpo específico para fijarse al
estado activado del receptor de integrina plaquetario
GPIIb/IIIa.
8. Un procedimiento para identificar y/o aislar
anticuerpos para inhibir la agregación plaquetaria, mediante su
fijación a un receptor activado de integrina GPIIb/IIIa de los
trombocitos hemáticos, que comprende las etapas siguientes:
- -
- proporcionar una biblioteca de ácidos nucleicos que contiene una secuencia para un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla, que contiene un dominio variable pesado y un dominio variable ligero; e
- -
- introducir al menos una secuencia aleatoria de nucleótidos en la región CDR de dicho fragmento de anticuerpo de cadena sencilla;
- -
- producir una biblioteca de fagos a partir de dicha biblioteca de ácidos nucleicos;
- -
- hacer reaccionar sucesivamente dicha biblioteca de fagos con trombocitos no activos, trombocitos activos, otras células que expresan moléculas no activas del receptor de integrina GPIIb/IIIa, y otras células que expresan moléculas activas del receptor de integrina GPIIb/IIIa; y
- -
- eluir los fagos unidos a dichos trombocitos u otras células que expresan moléculas activas del receptor de integrina.
9. Secuencia de ADN que codifica el anticuerpo
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Vector de expresión que contiene la
secuencia de ADN según la reivindicación 9.
11. Línea celular que contiene la secuencia de
ADN según la reivindicación 9, o el vector de expresión según la
reivindicación 10.
12. Composición farmacéutica que contiene el
anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, la
secuencia de ADN según la reivindicación 9, o el vector de expresión
según la reivindicación 10.
13. Uso del anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, de la secuencia de ADN según la
reivindicación 9, o del vector de expresión según la reivindicación
10, para preparar una composición farmacéutica para bloquear el
receptor de integrina plaquetaria en los trombocitos.
14. Uso del anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, de la secuencia de ADN según la
reivindicación 9, o del vector de expresión según la reivindicación
10, como elemento de diagnóstico para determinar el número de
trombocitos activados.
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