WO2007139208A1 - 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患の予防用又は治療用の医薬組成物、および、そのスクリーニング方法 - Google Patents

血小板の粘着凝集反応に関連する疾患の予防用又は治療用の医薬組成物、および、そのスクリーニング方法 Download PDF

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    • G01N2800/222—Platelet disorders

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease associated with platelet adhesion aggregation reaction, and a method for screening a substance capable of preventing or treating a disease associated with platelet adhesion aggregation reaction.
  • vWf von Willebrand factor in blood
  • Integrin a 2 J3 which is a collagen receptor of platelets, is activated and binds to collagen, thereby fixing the platelet on the collagen.
  • Glycoprotein GPV I another collagen receptor of platelets, reacts with collagen and activates platelets.
  • the first reaction does not happen at all. Therefore, it has been considered that the platelet cohesive reaction does not occur at all in the patient, or is strongly reduced (for example,
  • Non-Patent Documents 1-3 See Non-Patent Documents 1-3).
  • the interaction between platelet glycoprotein GP Ib and vWf is greatly involved.
  • factors other than the above may be involved in platelet adhesion to the vascular subendothelium in blood flow under in vivo conditions.
  • Non-Patent Document 4 reports that some platelets of vWf-deficient mice can adhere to the damaged endothelium, and other factors may be involved in the platelet adhesion aggregation reaction. Can be considered. However, such factors have not yet been identified.
  • Non-Patent Document 1 Alevriadou BR, Moake ⁇ , Turner NA et al. Realtime analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets. B ⁇ ood. 1993; 81: 1263-1276.
  • Non-Patent Document 2 Houdijk WPM, Sakariassen KS, Nievelstein PFEM, 'Sixraa JJ. Role of factor VIII-von Willebrand factor and f ibronectin in the interaction of platelets in flowing blood with monomer ic and r ibrillar human collagen types I and III. J Clin Invest. 1985; 75: 53 1-540.
  • Non-Patent Document 3 Moroi M, Jung SM, Nomura S et al. Analysis of the he involvement of the von Willebrand factor-glycoprotein lb interact ion in platelet adhesion to a collagen-coated surface under flow con ditions. Blood. 1997; 90: 4413-4424.
  • Non-Patent Document 4 Denis C, Methia N, Frenette PS et al. A mouse m odel of severe von Willebrand disease: Defects in hemostasis and thr ombosis. Proc Natl Acad Sci US A. 1998;
  • a prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition having a new mechanism of action against a disease associated with platelet adhesion aggregation reaction, and the disease is prevented or treated.
  • a screening method for a possible substance is provided.
  • the present inventor analyzed the reaction of v W f with various types of collagen in an attempt to identify factors associated with platelet adhesion aggregation.
  • step 2) in the mechanism of the adhesion aggregation reaction of blood platelets to the collagen surface, in addition to the interaction between GPI b and v W f, the integral a 2 ] 3 And found that the interaction between collagen and collagen is also involved. And even if one interaction is inhibited, the adhesion reaction of platelets to collagen occurs by the other interaction, and if the two interactions are inhibited at the same time, the adhesion reaction is very strongly inhibited. I found.
  • the present invention is as follows.
  • integrin alpha 2 containing a substance that modulates the E activity, prophylactic or pharmaceutical composition for the treatment of diseases associated with adhesive agglutination of platelets.
  • material is a substance that inhibits binding reaction between integrin 2 0 and collagen in platelets, [1] a pharmaceutical composition.
  • a test substance can be used to prevent or treat a disease associated with platelet adhesion agglutination characterized by evaluating whether or not the test substance regulates the binding reaction between integrin ⁇ 2 ] 3 i and collagen How to screen a substance.
  • integrin alpha 2 beta i including that you administration activity to the subject an effective amount of a substance that modulates the prevention or methods of treating diseases associated with adhesive agglutination of platelets.
  • [2 2] The method for prevention or treatment according to [16], wherein the substance is a substance that suppresses a binding reaction between integrin 2 ] 3 in platelets and collagen.
  • [2 4] substance is inhibitory antibody against integrin alpha 2/3 E, [2 2] or other prophylactic or therapeutic method according to [2 3].
  • [2 8] Use according to [2 7], wherein the substance is a substance that promotes a binding reaction between integrin o; 2 ] 3 i in platelets and collagen.
  • [3 4] Use according to [3 3], wherein the collagen is type I collagen. [35] substance is inhibitory antibody against integrin alpha 2 E, use of [3 3] or other [3 4].
  • the pharmaceutical compositions of the present invention a new action mechanism of controlling the binding activity of the integrin alpha 2 E and collagen in platelets incidentally, for example, von NV Les brand disease, platelet thrombosis adhesive agglutination It has a preventive or therapeutic effect on diseases related to the disease.
  • the screening method of the present invention is useful for, for example, the development of a medicament for the prevention or treatment of diseases associated with platelet adhesion aggregation such as von Willeland disease and thrombosis.
  • the platelet adhesion reaction under blood flow can be controlled by changing the activity of integrin a 2 3 i. It can be applied to the treatment of bleeding in patients with Lebrand disease or the prevention of thrombus formation.
  • Fig. 1 is a graph showing vWf binding to immobilized collagen.
  • (A) is the case of ushi collagen and
  • (b) is the case of human collagen.
  • Fig. 2A shows a graph (a) quantifying platelet adhesion to type I collagen under high shear flow in terms of surface coverage (%), and fluorescence image obtained by photographing the platelet adhesion. ((b)).
  • Figure 2B is a graph (a) quantifying the platelet adhesion to type III collagen under high shear flow in terms of surface coverage (%) and obtained by photographing the platelet adhesion. It is a fluorescence image ((b)).
  • Figure 3 is a graph showing the results of measuring the amount of collagen adhering to the glass surface.
  • Figure 4A is a graph that quantitatively expresses platelet adhesion to the surface of high-density Type I and Type I I I collagen in terms of surface coverage (%).
  • (A) is the case of high-density type I collagen (Typ e I—H)
  • (b) is the case of high density type I I I collagen (Typ e I I—H).
  • Figure 4B shows platelet adhesion to low density Type I and Type III collagen surfaces. Is a graph quantitatively expressed by surface coverage (%).
  • (A) is for low density type I collagen (Ty pe I — L)
  • (b) is for low density type II collagen (Ty pe III — L).
  • FIG. 5 is a diagram showing a fluorescence image of platelets adhered in the experiment shown in FIGS. 4A and 4B.
  • FIG. (A) is a graph showing the platelet adhesion quantitatively in terms of surface coverage (%), and (b) is a diagram showing a fluorescence image of the adhered platelets.
  • FIG. 6B shows the results of confirming the effect of integrin a 2 ⁇ activation antibody TS 2/16 and inhibitory antibody Gi 9 on platelet adhesion in low density type I collagen (Type I—L).
  • FIG. (A) is a graph showing the platelet adhesion quantitatively in terms of surface coverage (%)
  • (b) is a diagram showing a fluorescence image of the adhered platelets.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is for the prevention or treatment of a disease associated with platelet adhesion aggregation reaction, and is characterized by containing a substance that regulates the activity of integrin a 2 ⁇ .
  • platelet adhesion-associated diseases are roughly classified into diseases caused by inhibition of platelet adhesion-aggregation and diseases caused by excessive occurrence of platelet adhesion-aggregation.
  • diseases caused by the inhibition of platelet adhesion and aggregation include deficiency of von Willebrand factor (vW f), a high-molecular glycoprotein present in plasma, intravascular subcutaneous tissue, and platelets.
  • vW f von Willebrand factor
  • a high-molecular glycoprotein present in plasma intravascular subcutaneous tissue
  • platelets platelets.
  • vWD Von Willebrand disease caused by abnormalities
  • platelet glycoprotein GPI b deficiency or For example, the Bernard-Soulier syndrome, which is always derived.
  • a disease caused by excessive adhesion aggregation reaction of platelets specifically, a thrombosis caused by the formation of a thrombus in a blood vessel, and further, the thrombosis is triggered.
  • a thrombosis caused by the formation of a thrombus in a blood vessel, and further, the thrombosis is triggered. Examples include hypertension, cerebral thrombus, myocardial infarction, restenosis after percutaneous coronary artery inter-pension (PCI).
  • PCI percutaneous coronary artery inter-pension
  • integrin alpha 2/3 E activity in the present invention means collagen binding ability of the ligand.
  • collagen is a type of protein that is contained in the skin, bones, and blood vessels of animals and forms the body of animals.
  • various types of collagen such as Type I, Type I I, Type I I I, Type I V, Type V, Type V I, Type V I I, and Type V I I I.
  • collagen existing in blood vessels is preferable.
  • the substance that modulates the activity of integrin a 2 i3 contained in the pharmaceutical composition of the present invention is a substance that promotes the activity of integrin 2 i.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is suitably used for prevention or treatment of diseases caused by inhibition of platelet adhesion aggregation reaction (for example, von Villebrand disease, Bernard-Sulerie syndrome, etc.). It is done.
  • the substance that promotes the activity of the integrin a 2 i3 ⁇ , integrase]) to promote the activity of down a 2 beta i is a substance that promotes adhesion agglutination of platelets, and especially the Integuri down in platelets It is preferably a substance that promotes the binding reaction between a 2 ] 3 i and collagen. In order to minimize adverse effects on other proteins, a substance that can specifically act on integrin ⁇ 2 ] 3 is preferable.
  • activating antibody are exemplified for Integurin alpha 2 beta.
  • Activating antibodies against integrin ⁇ 2 ] 3 Is an antibody which is converted to integrin alpha 2/3 ⁇ of type integrin a 2 8 not having an plasminogen binding activity.
  • Specific examples of the activating antibody against integrin 2 ] 3e include many antibodies such as TSZi ⁇ lSGlO21C8 and B3B11. These antibodies can be easily obtained from, for example, ATCC (American Type Culture Collection).
  • TS 2Z 16 is also described in, for example, references (Moroi M, Onitsuka I, Imaizumi T, Jung SM., Thromb Haemost as.
  • 1 2 G 1 0 is, for example, reference (Mould AP, Garr att AN, Askari JA , Akiyama SK, Humphries MJ: FEBS Lett. 1995; 363: 1 18-122).
  • the pharmaceutical composition containing the substance that promotes the activity of integrin ⁇ 2 i as described above it is possible to recover the decrease in platelet adhesion reaction in collagen, as shown in Examples below. Can be prevented. That is, for example, if an activating antibody for integrin ⁇ 2 i is administered to a patient with vWD, it is thought that platelet adhesion aggregation reaction similar to normal is caused and bleeding tendency is reduced.
  • Another embodiment of the substance that regulates the activity of integrin a 2 ⁇ includes a substance that suppresses the activity of integrin 2 ] 3 i.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is suitably used for prevention or treatment of a disease (for example, thrombosis) caused by excessive adhesion of platelets.
  • substances that inhibit the integrin alpha 2 activity is a substance that inhibits the adhesive agglutination of platelets and inhibit the integrin a 2 j3 1 activity, and especially the the Integurinhi 2 J3 in platelets
  • a substance that suppresses the binding reaction with collagen is preferable.
  • the substance be able to act specifically on integrin- 2.
  • the inhibitory antibody or against integrin a 2 3 i include inhibitors of integrin alpha 2 E.
  • Integurinhi The inhibitory antibody against 2 E, in combination with integrin Nhi 2, an antibody that functions in the direction to lower the integrin alpha 2] 3 E activity.
  • the inhibitory antibody against integrin a 2 j3 may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be prepared by a well-known immunological technique.
  • the inhibitory antibody may be an antibody fragment (eg, Fab, F (ab ′) 2 ) or a recombinant antibody (eg, a single chain antibody).
  • polyclonal antibodies can be administered every 2 to 3 weeks subcutaneously or intraperitoneally in animals with commercially available adjuvants (eg, complete or incomplete Freund's adjuvant) using integrin a 2 j3 i or a fragment thereof as an antigen.
  • adjuvants eg, complete or incomplete Freund's adjuvant
  • the antibody titer of the partially collected serum is measured by a known antigen-antibody reaction and the increase is confirmed.
  • About 3 to 10 days after the final immunization whole blood is collected and antiserum is collected. Can be obtained by purification.
  • animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, guinea pigs, and hamsters.
  • Monoclonal antibodies can also be produced by cell fusion methods (for example, Takeshi Watanabe, principles of cell fusion methods and preparation of monoclonal antibodies, Akira Taniuchi, Toshitada Takahashi, “Monoclonal Antibodies and Cancer Basics and Clinical I”, 2- 14 pages, Science Forum Publishing, 1985).
  • the antibody of the present invention may be a chimeric antibody, humanized or human antibody.
  • 'Chimeric antibodies are, for example, “Experimental Medicine (Special Issue), Vol. 6, No. 10, 1988”, Japanese Patent Publication No. 3-73280, etc.
  • humanized antibodies are, for example, Japanese National Publication No. 4-506458.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 62-296890 discloses human antibodies such as “Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997”, “Nature Genetics, Vol. 7, p. 13- 21, 1994 ”, Special Publication No. Hei 4-504365 publication, International Application Publication No. W094 / 25585,“ Nikkei Science, June issue, pages 40 to 50, 19 ” 1995 ”(“ Nature, Vol.368, p.856-859, 1994 ”, Japanese Patent Publication No. 6-500233, etc.).
  • inhibitory antibody against integrin ⁇ ; 2 i include G i 9, 6 F 1, AK7, P 1 E 6 and the like. These inhibitory antibodies can be purchased commercially or can be prepared according to conventionally known methods.
  • the integrin ⁇ 2 inhibitor examples include the snake venom component a I ternagin—C, and the leech component calin and LAP P (leechantiplatelet protein).
  • the integrin ⁇ 2 ] 3 i inhibitor inhibits the binding reaction between integrin a 2 J3 i and collagen.
  • the adhesion aggregation reaction to collagen can be inhibited. Can be prevented. Furthermore, as shown in the Examples below, an inhibitory antibody or inhibitor against integrin a 2 jQe is used simultaneously with an inhibitor of the interaction between vWf and GP I b (eg, an inhibitory antibody against GP I b). It has been confirmed that the adhesion reaction between platelets and collagen can be almost completely inhibited by use.
  • integrin inhibitory antibody or inhibitor against ⁇ 2 ⁇ e, in addition to an inhibitor of the interaction between vWf and GP I b (eg, an inhibitor antibody against GP I b))
  • integrin a 2 j8 and GP I b (or vWf) bispecific antibodies exhibiting an inhibitory effect on both may be (bispecific antibodies).
  • the integrin alpha 2 E activity Still other examples of poorness to be controlled include substances obtained by the screening method of the present invention described later.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a substance that modulates the activity of integrin ⁇ 2 ] 3 i described above
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be included.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include excipients, diluents, bulking agents, disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, thickeners, solubilizers or other additives. .
  • a pharmaceutical composition in the form of an injection or the like can be prepared.
  • These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally, but are preferably administered parenterally.
  • the substance that regulates the activity of integrins 20 i contained in the composition is not particularly limited as long as it finally reaches the blood, but intravenous injection is more preferable.
  • the injection should be a non-aqueous diluent (for example, propylene glycolate, polyethylene glycol, plant oil such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.) It can be prepared as a suspension or emulsion.
  • a non-aqueous diluent for example, propylene glycolate, polyethylene glycol, plant oil such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is the subject's age, sex, body weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the active ingredient contained in the pharmaceutical composition (activate the activity of integrin 2 ) Normal adult (weight: 60 kg) per person, in the range of 10 g to 100 mg per person, preferably from 1 O mg to 50 mg A range of doses can be administered.
  • the content of the active ingredient in the pharmaceutical composition is preferably in the range of 0.1 to 99.9% by weight.
  • an amount converted in terms of the body weight of the mammal can be administered.
  • a dose smaller than the above dose may be sufficient, and a dose exceeding the above range may be necessary.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has a new mechanism of action that regulates the binding activity between integrin a 2 ⁇ i and collagen in platelets, such as adhesive aggregation of platelets such as von Willebrand disease and thrombosis. Has preventive or therapeutic effects on diseases related to reactions.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to animals including humans in need of treatment.
  • animals other than humans include mammals and birds other than humans.
  • Mammals include, for example, laboratory animals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, and rabbits, domestic animals such as pigs, rabbits, goats, horses, and higes, pets such as dogs, cats, and monkeys. Primates such as orangutans and chimpanzees.
  • birds include chickens, quails, ducks, geese, turkeys, dachiyou, and notes.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is selected from those that can be safely administered to these treatment subjects.
  • the screening method of the present invention is a screening method for a substance capable of preventing or treating a disease associated with platelet adhesion aggregation reaction, wherein the test substance is an integrin.
  • the screening method of the present invention includes, for example, the following steps ( a ) to (c). (A) contacting a Integurinhi 2/3 i and collagen in the presence and absence of the test substance;
  • the test substance evaluates whether or not the test substance promotes the binding reaction between integrin ⁇ 2 ) 3 i and collagen, and the disease associated with platelet adhesion agglutination is platelet
  • diseases that have a disorder in adhesion cohesion (for example, von Villebrand disease, Berna-Loose-Irie syndrome, etc.).
  • the binding reaction between integrin 2 j3 i and collagen is significantly promoted in the presence of the test substance compared to the absence of the test substance (for example, If the amount of the complex of integrin a 2 3 i and collagen increases significantly), select the test substance as the substance to be screened. be able to.
  • the test substance is integrin ⁇ 2 ⁇ ! It is an evaluation of whether or not the binding reaction between collagen and collagen is suppressed.
  • Diseases related to platelet adhesion aggregation are diseases in which platelet adhesion aggregation occurs excessively (for example, thrombosis, Stenosis, etc.).
  • a binding reaction between integrin alpha 2 E and collagen in the presence of a test substance is significantly suppressed (e.g., integrin alpha
  • the substance to be tested can be selected as the substance to be screened if the amount of the complex of 2 and collagen is significantly reduced).
  • the step (b) is specifically performed using an anti-integrin a 2 ⁇ antibody or an anti-collagen antibody, or by labeling integrin a 2 ⁇ or collagen itself, so that the integrin ⁇ 2 ] 3
  • the i-collagen complex is measured to examine the binding between integrin ⁇ 2 ] 3 i and collagen.
  • Integrins ⁇ 2 3 i in contact with collagen in the presence and absence of the test substance and incubate for a certain period of time, then integrin " 2 ] 3 collagen complex, free integrin ⁇ 2 i and free collagen
  • the band intensity corresponding to integrin a 2 jS i -collagen complex is measured using a labeled anti-integrin ⁇ 2 ] 3 i antibody or anti-collagen antibody.
  • an anti-integrin a 2 ] 3 i antibody or anti-collagen antibody is added to the reaction solution and immunoprecipitated, and then the precipitate is electrophoresed to obtain RI or non-RI (enzyme, perform western plotting with a fluorescent, etc.) labeled anti-integrin alpha 2 0 E antibody or anti-collagen antibody may Rukoto comparing the intensity of Pando detected.
  • Measurement of the integrin ⁇ 2 ] 3 mono-collagen complex can also be performed using a conventional immunoassay system. For example, integrin a 2 or collagen Either integrin ⁇ 2 ; 8 i or collagen and a test substance that were not bound to the solid phase was added to the solid phase, incubated, and the solid phase was washed, and then RI or non-RI (enzyme, RI a, EIA with anti-integrin alpha 2 i antibody or anti-collagen antibodies fluorescent, etc.) labeled, the complex is detected by the FIA or the like, may be compared with the signal intensity measured.
  • RI or non-RI enzyme, RI a, EIA with anti-integrin alpha 2 i antibody or anti-collagen antibodies fluorescent, etc.
  • the screening method of the present invention is useful for the development of drugs for the prevention or treatment of diseases associated with platelet adhesion agglutination. Further, the substance obtained by the screening method of the present invention is also used as a regulator of platelet adhesion agglutination reaction (ie, an accelerator for platelet adhesion agglutination reaction or an inhibitor of platelet adhesion agglutination reaction). can do.
  • a regulator of platelet adhesion agglutination reaction ie, an accelerator for platelet adhesion agglutination reaction or an inhibitor of platelet adhesion agglutination reaction.
  • Also included in the present invention is a method for controlling the adhesion aggregation reaction of platelets, which comprises regulating the activity of integrin a 2 i3.
  • the control method of the present invention can be performed, for example, by administering a substance that modulates the activity of integrin ⁇ ; 2 ⁇ i into the blood.
  • the aspect of the control method of the present invention, and (a) integrin involves promoting down a 2/3 E activity, methods for promoting platelet adhesive agglutination, (b) integrin o; the 2 i activity And a method for suppressing the adhesion-aggregation reaction of platelets.
  • integrin ⁇ 2 “Promoting sputum activity” means promoting the binding reaction between integrin a 2 ; 8 i in platelets and collagen.
  • This promotion method can be performed, for example, by administering a substance that promotes the activity of integrin a 2 i3 into the blood.
  • a substance that promotes the activity of integrin 2 ] 3 those described in the above-mentioned “(I) Pharmaceutical composition of the present invention” can be used in the same manner.
  • Examples of the administration method of the substance that promotes the activity of integrin a 2 ] 3e include intravenous administration.
  • the above-mentioned substance that promotes the activity of integrin 2 j3 can also be used as a reaction control agent (that is, a reaction accelerator) for promoting the adhesion aggregation reaction of platelets.
  • a reaction control agent that is, a reaction accelerator
  • “suppressing the activity of integrin 2 ] 3 i” refers to the binding reaction between integrin a 2 j8 i in platelets and collagen. Means to suppress.
  • This suppression method can be performed, for example, by administering a substance that suppresses the activity of integrin a 2 ] 3 into the blood.
  • a substance that suppresses the activity of integrin a 2 j3 those described in the above-mentioned “(I) Pharmaceutical composition of the present invention” can be used in the same manner.
  • Examples of the administration method of the substance that suppresses the activity of integrin a 2 ⁇ here include intravenous administration.
  • the above-mentioned substance that suppresses the activity of integrin a 2 i3 i can also be used as a reaction control agent (that is, a reaction inhibitor) for suppressing the adhesion aggregation reaction of platelets.
  • the adhesion reaction of platelets under blood flow can be controlled by changing the activity of integrin a 2 ; 8 i. Therefore, this method can be applied to the treatment of bleeding in WD patients or the prevention of thrombus formation.
  • ushicollagen Different types of ushicollagen were purchased from Koken Co., Ltd. Human type I, I I I, I V, and V collagen were purchased from Daiichi Fine Chemical Co., Ltd. Human type I I collagen was purchased from Chemicon International. The composition of ushi collagen preparation was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. As a result, it was confirmed that type I—I I I collagen was not contaminated with other types of collagen (ie, below the detection limit of silver staining of SDS-PAGE). However, Type I V collagen contained Type I collagen, and Type V collagen fiber was a copolymer of Type I and Type V collagen (data not shown).
  • VWf which does not contain coagulation factor VIII, was obtained from Dr. Tomoyoshi of the Institute for Chemical and Serum Therapy.
  • vWf is a cryogenic plasma derived from human plasma containing vW f and factor VIII according to the method described in the reference (Tomokiyo K, Kamikubo Y, Hanada et al., Blood. 2005; 105: 1078-1084.). The precipitate was purified by gel filtration from the cryoprecipitate. The purified vWf was radiolabeled with Na 125 I using I ODOBEAD S (Pierce Biochemicals) according to the instructions for use. The specific radioactivity of radiolabeled vWf was 500-1 000 cpm / ng.
  • the collagen stock solution is diluted with buffer A (1 36 mM NaCl, 2.7 mM KC 1, 0. 4 2 mM N a H 2 P_ ⁇ 4, 1 2 mM N a H C0 3, 5. 5 mM Darco one scan, and, 5mM HE PES, p H 7. 4) at 2 0 ⁇ g / m 1
  • 50 ⁇ 1 was added to each well of a microtiter plate (NUNC Imuno Module, manufactured by Nargenunk International Inc.). After reacting with collagen at 4 ° C, the wells were left at room temperature for 1 hour.
  • the collagen solution of each well was removed, and the exposed areas were blocked by reacting with buffer A 2500 ⁇ 1 containing 2% BSA (Ushi serum albumin) for 1 hour at room temperature. After removing the blocking solution, the wells were washed four times with buffer A 2 50 ⁇ l.
  • buffer A 2500 ⁇ 1 containing 2% BSA Ushi serum albumin
  • vW f The binding of vW f to immobilized collagen was analyzed. Radiolabeled vW f without Factor V I I I was reacted with different types of collagen immobilized on microtiter plates to convert the measured radioactivity into the amount of vW f bound to the well.
  • Fig. 1 The results are shown in Fig. 1.
  • the graph in Fig. 1 (a) shows the binding of vW f to ushi collagen
  • the graph in Fig. 1 (b) shows the binding of vW f to human collagen.
  • collagen types are as shown in Table 1.
  • Type V collagen As shown in Figure 1, vW f showed weak binding with Type I, Type I I, and Type V collagen, and almost no binding with Type I V collagen. In both graphs, type I I I collagen was strong and saturated. These results indicate that vWf specifically binds to ushi and human type I I I collagen. Type I V collagen did not bind to vWf, and type I, I I, and V showed very weak binding to vWf. From these data, the K d value when vW f binds is 1 1. 3 6 ⁇ 0. 6 5 1 5 / X g / m 1 and Calculated as 1 2. 2 9 ⁇ 0. 9 5 3 1 ⁇ g / ml. The other types of collagen did not bind to vWf, so reliable speed values were not obtained. These data indicate that vWf specifically binds to human and ushi-derived type I I I collagen.
  • Fluorescent images were captured with an EB-CCD camera (Hamamatsu Photonics) and recorded on video tape. The obtained photographic images were analyzed by a computer using MetaMorph software (manufactured by Japan Molecular. Devices). For quantitative analysis of platelet adhesion, video signals are acquired every 10 seconds while background removal processing and rolling average processing are performed on the captured images. The percentage of occupied surface area (ie surface coverage (%)) was calculated by the software.
  • Type I and type I I I ushi collagen was adsorbed onto a slide glass, and platelet adhesion and aggregate formation on the immobilized collagen surface were observed under blood flow.
  • blood passed through a slide glass with a high concentration of immobilized collagen it was observed that platelets adhered to the surface of Type I and Type I I I collagen to the same extent and formed aggregates.
  • Fig. 2A shows a graph ((a)) showing the platelet adhesion to type I collagen under high shear flow in terms of surface coverage (%) and the platelet adhesion.
  • the obtained fluorescence image ((b)) is shown.
  • 2B shows a graph (a) quantifying the platelet adhesion to type III collagen under high shear flow in terms of surface coverage (%), and the platelet adhesion. This is shown by the fluorescence image (b). In each graph, the concentration of collagen is as shown in Table 2.
  • type I I I collagen platelet adhesion was similarly observed under all conditions. However, type I collagen platelet adhesion decreased at low density collagen surfaces.
  • type I collagen was highly dependent on the concentration of collagen to which platelet adhesion was adsorbed (see Figure 2A). Compared to glass slides treated with a high concentration of type I collagen, platelet adhesion and especially platelet aggregate formation was observed on glass slides treated with a low concentration (10 g / m 1) of type I collagen. Decreased significantly. Platelet adhesion and aggregate formation on the type I I I collagen surface did not show a strong dependence on the density of immobilized collagen (see Figure 2B).
  • Another characteristic feature is that the adhesion of platelets on the surface of type I collagen is definitely reduced.
  • the platelet adhesion reaction on the surface of type I collagen was observed over time, and it was found in the surface coverage curve. Longer delay time. In particular, little adherent adhesion was observed on the low concentration type I collagen surface. This is supported by the fact that the surface coverage curve is horizontal (Type I D in Figure 2).
  • the amount of collagen adsorbed on the glass surface was measured using 125 I-labeled collagen. Specifically, the following procedure was used. Type I and type III collagen (1 mg / m 1) in 0.1 M sodium acetate (pH 5.0) were radiolabeled with Na 1 25 I using I ODOB EAD S. The specific radioactivity obtained was 2.:! To 2.5 X 10 5 cpg. Dilute radiolabeled collagen with buffer A to the above concentrations (10 00 ⁇ g / mL, 20 ⁇ g / mL, 10 ⁇ g ZniL, 5 g / mL) and slide with glass slide. The reaction was carried out at ° C. After the reaction, the slide glass was treated in the same manner as the blood flow experiment described above. To extract adsorbed collagen, each slide was treated twice with 1 ml 1% SDS / 3M urea. The extracts were mixed and the radioactivity was counted to calculate the amount of collagen adsorbed on the slide.
  • Blood was preincubated with antibodies and analyzed for adhesion to Type I and Type I I I collagens.
  • a collagen surface coated with 5 ⁇ g / m 1 collagen solution was used as the low-density collagen surface, and a collagen surface coated with 100 ⁇ g / m 1 collagen solution was used as the high-density collagen surface.
  • Anti-integrin a 2 j8 antibodies include Gi 9 (Immunotech International), 6 F 1 (provided by Dr. BS Coller of Rockefeller University), AK 7 (BD Bioscience) (BD Biosciences)), TS 2/16 (prepared by reference method (Moroi M, Onitsuka I, Imaizumi T, Jung SM., Thromb Haemostas. 2000; 83: 769-776.) ) It was used.
  • As the anti-GP lb antibody NNKY 5-5 (provided by Dr. Nomura of Kansai Medical University) and AK 2 (manufactured by Biogenesis) were used.
  • High density collagen surface (coated with H, 100 ⁇ g / m 1 collagen) and low density collagen surface (coated with L, 5 ⁇ g / m 1 collagen)
  • H high density collagen surface
  • L low density collagen surface
  • platelet adhesion was expressed as the percent surface coverage (%) of the adhered platelets. Platelets in whole blood are treated with anti-integrin ⁇ 2 ; 3 antibody G i 9 (20 ⁇ g / m 1) or anti-GPI b antibody NNKY 5-5 (shown as NNKY, 40 g / m 1) And the adhesion was measured. Platelet adhesion in the presence of both antibodies was also measured (shown as + NNKY + Gi9, each antibody 2 0 111 1) The results are shown in FIGS.
  • Figure 4A shows the results of measuring platelet adhesion to high density type I and type III collagen surfaces.
  • Figure 4B shows the results of measuring platelet adhesion to low density Type I and Type III collagen surfaces.
  • the anti-GP Ib antibody NNKY 5-5 slightly inhibited platelet adhesion to low density type I collagen and strongly inhibited platelet adhesion to low density type I I collagen.
  • the degree of inhibition varied from experiment to experiment. This diversity in the degree of inhibition is due to differences in the reactivity of each platelet preparation.
  • NNKY 5-5 did not significantly affect adherence to high density type I collagen in any platelet preparation. From the data of this experiment, among all patterns of inhibitory effect of NNKY5-5, the inhibitory effect of adhesion to low density type III collagen is the largest, and the inhibitory effect of adhesion to high density type I collagen is the most. It was confirmed to be small.
  • the anti-integrin ct 2 3 i antibody G i 9 inhibits adhesion to both high-density type I collagen and low-density type I collagen, and affects adhesion to type III collagen at all densities. Did not give.
  • TS 2Z16 had little effect on platelet adhesion in high density type I collagen, but increased platelet adhesion in low density type I collagen.
  • Three minutes after the start of blood flow adhesion to low density Type I collagen in the presence of TS 2/16 is indistinguishable from adhesion to high density Type I collagen (ie, approximately the same). Degree).
  • the present invention is useful as a prophylactic agent or therapeutic agent for diseases associated with platelet adhesion aggregation such as von Willebrand disease and thrombosis.
  • it can be effectively used for the development of pharmaceuticals having a new mechanism of action against diseases associated with platelet adhesion aggregation such as von Willebrand disease and thrombosis.

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Abstract

本発明の医薬組成物は、血小板の粘着凝集反応に関連する疾患の予防用又は治療用の医薬組成物であって、インテグリンα２β１の活性を調節する物質を含有する。本発明のスクリーニング方法は、血小板の粘着凝集反応に関連する疾患を予防又は治療し得る物質のスクリーニング方法であって、被験物質が、インテグリンα２β１とコラーゲンとの結合反応を調節するか否かを評価することを特徴とする。

Description

明細書
血小板の粘着凝集反応に関連する疾患の予防用又は治療用の医薬組成物、 および、 そのスクリーニング方法
技術分野
本発明は、 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患の予防用又は治療用の医薬組 成物、 ならびに、 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患を予防又は治療し得る物 質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
流血下における血小板のコラーゲン表面への粘着凝集反応は、 以下のようなメ 力二ズムで起こると考えられている。
1) 血液中のフォンヴィレブランド因子 (v o n W i 1 1 e b r a n d因子、 以下 「vWf 」 とも呼ぶ） がコラーゲンに結合する。
2) 結合した vW f が血小板糖タンパク質 GP I bと反応し、 血小板をコラーゲ ン表面に近づける。
3) 血小板のコラーゲンレセプターであるインテグリン a2 J3 が活性化され、 コラーゲンと結合することにより、 血小板はコラーゲン上に固定される。 （粘着 反応）
4) 血小板のもう一つのコラーゲンレセプターである糖タンパク質 GPV Iがコ ラーゲンと反応し、 血小板を活性化させる。
5 ) 活性化された血小板は、 インテグリンひ ∑ b ]33などを活性化し、 凝集塊の 形成にいたる。 （凝集反応）
上記のようなメカニズムで引き起こされる、 流血下の粘着凝集反応では、 最初 の GP I bと vWf との反応が重要であり、 これらのタンパク質の欠損患者では
、 最初の反応がまったく起こらない。 したがって該患者では血小板の粘着凝集反 応が全く起こらないか、 あるいは、 強く低下していると考えられてきた （例えば
、 非特許文献 1— 3など参照） 。 このように血小板の粘着凝集反応においては、 血小板糖タンパク質 GP I bと vWf との相互作用が大きく関与している。 しかしながら、 近年、 i n v i v o条件下の血流での血管内皮下層への血小 板粘着には、 上記以外の因子も関与している可能性が示唆されている。 実際、 非 特許文献 4には、 vWf 欠損マウスの何匹かの血小板は、 損傷した内皮に粘着す ることができることが報告されており、 血小板の粘着凝集反応に他の因子が関与 する可能性が考えられる。 しかし、 このような因子は未だ同定されていない。
[非特許文献 1] Alevriadou BR, Moake 几， Turner NA et al. Realtime analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets. B丄 ood. 1993;81: 1263 - 1276.
, [非特許文献 2] Houdijk WPM, Sakariassen KS, Nievelstein PFEM, ' Sixraa JJ. Role of factor VIII - von Willebrand factor and f ibronectin in the interaction of platelets in flowing blood with monomer ic and r ibrillar human collagen types I and III. J Clin Invest. 1985； 75： 53 1-540.
[非特許文献 3] Moroi M, Jung SM， Nomura S et al. Analysis of t he involvement of the von Willebrand factor - glycoprotein lb interact ion in platelet adhesion to a collagen-coated surface under flow con ditions. Blood. 1997;90:4413-4424.
. [非特許文献 4] Denis C， Methia N, Frenette PS et al. A mouse m odel of severe von Willebrand disease: Defects in hemostasis and thr ombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:9524- 9529.
発明の開示
血小板の粘着凝集反応に関与する因子の同定は、 例えば、 フォンヴィレブラン ド病、 血栓症などの血小板の粘着凝集反応に関連する疾患に対する新たな作用機 序を有する医薬品の開発につながるため有用である。
そこで本発明では、 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患に対して新たな作用 機序を有する予防用又は治療用の医薬組成物、 および、 当該疾患を予防又は治療 し得る物質のスクリーニング方法などを提供する。
本発明者は、 血小板の粘着凝集反応に関連する因子の同定を試みるべく、 v W f と種々のタイプのコラーゲンとの反応を解析した。 その結果、 上述の流血下の 血小板のコラーゲン表面への粘着凝集反応のメカニズムにおける、 上記 2 ) のス テツプにおいて、 G P I bと v W f との相互作用の他に、 インテグリ ン a 2 ]3ェ とコラーゲンとの相互作用も関与していることを見出した。 そして、 一方の相互 作用が阻害されても、 もう一つの相互作用により血小板のコラーゲンへの粘着反 応が起こり、 二つの相互作用が同時に阻害されると、 粘着反応が非常に強く阻害 されることを見出した。
かかる知見から、 インテグリン o; 2 i8 iの活性を変化させることにより、 流血 下における血小板の粘着凝集反応をコントロールすることができ、 フォンヴィレ ブランド病患者の出血の治療、 あるいは、 血栓形成の予防などに応用できると考 え、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 以下の通りである。
〔1〕 インテグリン α 2 ェの活性を調節する物質を含有する、 血小板の粘着 凝集反応に関連する疾患の予防用又は治療用の医薬組成物。
〔2〕 物質が、 血小板中のインテグリン c 2 ]3 とコラーゲンとの結合反応を 促進する物質である、 〔1〕 記載の医薬組成物。
〔3〕 コラーゲンがタイプ Iコラーゲンである、 〔2〕 記載の医薬組成物。 〔4〕 物質が、 インテグリ ン a 2 j3 iに対する活性化抗体である、 〔2〕 また は 〔3〕 に記載の医薬組成物。
〔5〕 活性化抗体が T S 2 1 6である、 〔4〕 記載の医薬組成物。
〔6〕 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患が、 フォンヴィレブランド病であ る、 〔2〕 〜 〔5〕 の何れかに記載の医薬組成物。
〔7〕 物質が、 血小板中のインテグリ ン 2 0 とコラーゲンとの結合反応を 抑制する物質である、 〔1〕 記載の医薬組成物。
〔8〕 コラーゲンがタイプ Iコラーゲンである、 〔7〕 記載の医薬組成物。 〔9〕 物質が、 インテグリン α 2 iに対する阻害抗体である、 〔7〕 または 〔8〕 に記載の医薬,且成物。
〔1 0〕 阻害抗体が G i 9である、 〔9〕 記載の医薬組成物。
〔1 1〕 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患が、 血栓症である、 〔7〕 〜 〔 1 0〕 の何れかに記載の医薬組成物。
〔1 2〕 被験物質が、 インテグリン α 2 ]3 iとコラーゲンとの結合反応を調節 するか否かを評価することを特徴とする、 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患 を予防又は治療し得る物質のスクリ一ユング方法。
〔1 3〕 疾患がフォンヴイレブランド病である、 〔1 2〕 記載のスクリーニン グ方法。
〔 1 4〕 疾患が血栓症である、 〔 1 2〕 記載のスクリーニング方法。
〔1 5〕 〔1；] 〜 〔1 1〕 の何れかに記載の予防又は治療用の医薬組成物、 及 び当該医薬組成物を血小板の粘着凝集反応に関連する疾患の予防もしくは治療の ために使用し得ること、 または使用すべきであることを記載した書類を含む商業 的ノ ッケージ。
本発明の別の態様としては、 例えば、 以下のものが挙げられる。
〔1 6〕 インテグリン α 2 β iの活性を調節する物質の有効量を対象に投与す ることを含む、 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患の予防又は治療方法。
〔1 7〕 物質が、 血小板中のインテグリン α 2 ]3 とコラーゲンとの結合反応 を促進する物質である、 〔1 6〕 記載の予防又は治療方法。
〔1 8〕 コラーゲンがタイプ Iコラーゲンである、 〔1 7〕 記載の予防又は治 療方法。 .
〔1 9〕 物質が、 インテグリン α 2 ェに対する活性化抗体である、 〔1 7〕 または 〔1 8〕 に記載の予防又は治療方法。
〔20〕 活性化抗体が T S 2/1 6である、 〔1 9〕 記載の予防又は治療方法
〔2 1〕 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患が、 フォンヴイレブランド病で ある、 〔1 7〕 〜 〔2 0〕 の何れかに記載の予防又は治療方法。
〔2 2〕 物質が、 血小板中のインテグリンひ 2 ]3 とコラーゲンとの結合反応 を抑制する物質である、 〔1 6〕 記載の予防又は治療方法。
〔2 3〕 コラーゲンがタイプ Iコラーゲンである、 〔2 2〕 記載の予防又は治 療方法。
〔2 4〕 物質が、 インテグリン α 2 /3ェに対する阻害抗体である、 〔2 2〕 ま たは 〔2 3〕 に記載の予防又は治療方法。
〔 2 5〕 阻害抗体が G i 9である、 〔2 4〕 記載の予防又は治療方法。
〔 2 6〕 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患が、 血栓症である、 〔2 2〕 〜 〔 2 5〕 の何れかに記載の予防又は治療方法。
〔2 7〕 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患の予防用又は治療用の医薬組成 物の製造のための、 インテグリン α 2 iの活性を調節する物質の使用。
〔2 8〕 物質が、 血小板中のインテグリン o; 2 ]3 iとコラーゲンとの結合反応 を促進する物質である、 〔2 7〕 記載の使用。
〔2 9〕 コラーゲンがタイプ Iコラーゲンである、 〔2 8〕 記載の使用。
〔3 0〕 物質が、 インテグリンひ に対する活性化抗体である、 〔2 8〕 または 〔2 9〕 に記載の使用。
〔3 1〕 活性化抗体が T S 2 Z 1 6である、 〔3 0〕 記載の使用。
〔3 2〕 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患が、 フォンヴイレブランド病で ある、 〔2 8〕 〜 〔3 1〕 の何れかに記載の使用。
〔3 3〕 物質が、 血小板中のインテグリン a 2 ]3 とコラーゲンとの結合反応 を抑制する物質である、 〔2 7〕 記載の使用。
〔3 4〕 コラーゲンがタイプ Iコラーゲンである、 〔3 3〕 記載の使用。 〔3 5〕 物質が、 インテグリン α 2 ェに対する阻害抗体である、 〔3 3〕 ま たは 〔3 4〕 に記載の使用。
[ 3 6〕 阻害抗体が G i 9である、 〔3 5〕 記載の使用。
〔3 7〕 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患が、 血栓症である、 〔3 3〕 〜 〔36〕 の何れかに記載の使用。
本発明の医薬組成物は、 血小板中のインテグリン α2 ェとコラーゲンとの結 合活性を制御するという新たな作用機序で、 例えば、 フォンヴイレブランド病、 血栓症などの血小板の粘着凝集反応に関連する疾患に対して予防効果又は治療効 果を奏するものである。 また、 本発明のスクリーニング方法は、 例えば、 フォン ヴィレプランド病、 血栓症などの血小板の粘着凝集反応に関連する疾患の予防用 , 又は治療用の医薬の開発等に有用である。 さらに、 本発明の血小板の粘着凝集反 の制御方法によれば、 インテグリン a 2 3 iの活性を変化させることによって 、 流血下における血小板の粘着反応をコントロールすることができるため、 例え ば、 フォンヴイレブランド病患者の出血の治療、 あるいは、 血栓形成の予防など に応用することができる。
' 図面の簡単な説明
図 1は、 固定化されたコラーゲンへの vWf の結合を示すグラフである。 （a ) はゥシコラーゲンの場合であり、 （b) はヒトコラーゲンの場合である。
図 2Aは、 高せん断流下でのタイプ Iコラーゲンへの血小板粘着を表面被覆率 (%) で量的に表したグラフ （ （a) ) 、 および該血小板粘着を.撮影して得られ た蛍光画像 ( (b) ) である。
図 2Bは、 高せん断流下でのタイプ I I Iコラーゲンへの血小板粘着を表面被 覆率 （％) で量的に表したグラフ （ （a) ) 、 およぴ該血小板粘着を撮影して得 られた蛍光画像 （ （b) ) である。
図 3は、 ガラス表面に付着したコラーゲンの量を測定した結果を示すグラフで あ
図 4 Aは、 高密度のタイプ I及びタイプ I I Iコラーゲン表面への血小板粘着 を表面被覆率 （％) で量的に表じたグラフである。 （a) が高密度のタイプ Iコ ラーゲン （Ty p e I— H) の場合であり、 （ b ) が高密度のタイプ I I Iコ ラーゲン （Ty p e I I I— H) の場合である。
図 4Bは、 低密度のタイプ I及びタイプ I I Iコラーゲン表面への血小板粘着 を表面被覆率 （％) で量的に表したグラフである。 （a ) が低密度のタイプ Iコ ラーゲン （Ty p e I — L) の場合であり、 （ b ) が低密度のタイプ I I . Iコ ラーゲン （Ty p e I I I — L) の場合である。
図 5は、 図 4 A及び図 4 Bに示す実験において粘着した血小板の蛍光画像を示 す図である。
図 6 Aは、 高密度のタイプ Iコラーゲン （Ty p e I _H) において、 イン テグリン α 2 ェの活性化抗体 T S 2/1 6および阻害抗体 G i 9の血小板粘着 における効果を確認した結果を示す図である。 （a) は血小板粘着を表面被覆率 (%) で量的に表したグラフであり、 （b) は粘着した血小板の蛍光画像を示す 図である。
図 6 Bは、 低密度のタイプ Iコラーゲン （Ty p e I—L) において、 イン テグリ ン a 2 β の活性化抗体 T S 2/1 6および阻害抗体 G i 9の血小板粘着 における効果を確認した結果を示す図である。 （a) は血小板粘着を表面被覆率 (%) で量的に表したグラフであり、 （b) は粘着した血小板の蛍光画像を示す 図である。
発明を実施するための最良の形態
( I ) 本発明の医薬組成物
' 本発明の医薬組成物は、 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患の予防用又は治 療用であって、 インテグリン a 2 β の活性を調節する物質を含有することを特 徴とする。
ここで、 血小板の粘着凝集反応 関連する疾患とは、 血小板の粘着凝集反応が 阻害されることに起因する疾患と、 血小板の粘着凝集反応が過剰に発生すること に起因する疾患とに大別される。
血小板の粘着凝集反応が阻害されることに起因する疾患として具体的には、 血 漿、 血管内皮下組織、 及び血小板に存在する高分子糖タンパク質であるフォンヴ イレブランド因子 （vW f ) の欠乏あるいは異常に起因するフォンヴイレブラン ド病 （以下、 vWDとも呼ぶ） 、 血小板糖タンパク質 G P I bの欠乏あるいは異 常に由来するべルナ一ルース一リエ （B e r n a r d— S o u l i e r) 症候群 などが挙げられる。
一方、 血小板の粘着凝集反応が過剰に発生することに起因する疾患として具体 的には、 血管内で血栓が形成されることによって発生する血栓症、 さらには当該 血栓症が引き金となって引き起こされる高血圧、 脳血栓、 心筋梗塞、 経皮的冠動 脈インターペンション （P C I ) 後の再狭窄などが挙げられる。
また、 本発明においてインテグリン α 2 /3ェの活性とは、 リガンドとしてのコ ラーゲン結合能を意味する。
ここでコラーゲンとは、 動物の皮、 骨、 及び血管などに含まれ、 動物の体を形 づくるタンパク質の一種である。 コラーゲンには、 タイプ I、 タイプ I I、 タイ プ I I I、 タイプ I V、 タイプ V、 タイプ V I、 タイプ V I I、 及びタイプ V I I Iなどといった種々のタイプのものが存在する。 本発明においては、 これらの 様々なタイプのコラーゲンの中でも、 血管中に存在するコラーゲン （タイプ Iコ ラ一ゲン、 タイプ I I Iコラーゲンなど） が好ましい。
本発明の医薬組成物に含まれる、 インテグリン a 2 i3 ェの活性を調節する物質 の一態様としては、 ィンテグリンひ 2 iの活性を促進する物質が挙げられる。 この場合、 本発明の医薬組成物は、 血小板の粘着凝集反応が阻害されることに起 因する疾患 （例えば、 フォンヴイレブランド病、 ベルナール一スーリエ症候群な ど） に対する予防または治療に好適に用いられる。
このインテグリン a 2 i3 丄の活性を促進する物質とは、 インテグ]) ン a 2 β iの 活性を促進して血小板の粘着凝集反応を促進する物質であり、 その中でも特に、 血小板中のィンテグリ ン a 2 ]3 iとコラーゲンとの結合反応を促進する物質であ ることが好ましい。 また、 他のタンパク質などに及ぼす悪影響を最小限にするた めには、 インテグリン α 2 ]3ェに特異的に作用し得る物質であることが好ましい 。
このような物質として具体的には、 ィンテグリン α 2 β に対する活性化抗体 が挙げられる。 インテグリン α 2 ]3 ェに対する活性化抗体とは、 正常時にはコラ 一ゲン結合活性を持たないインテグリン α 2 /3 ^洁性化型のインテグリン a 28 に変換させる抗体である。 インテグリンひ 2 ]3ェに対する活性化抗体として具体 的には、 TS SZi e^ l S G l O 2 1 C 8、 B 3 B 1 1などの多くの抗体が 挙げられる。 これらの抗体は、 例えば、 ATCC (American Type Culture Co llection) から容易に入手することができる。 また、 T S 2Z 1 6は、 例えば 、 参考文献 (Moroi M， Onitsuka I， Imaizumi T， Jung SM.， Thromb Haemost as. 2000；83：769-776. , Hemler ME, Sanchez - Madrid F, Flotte TJ, Krensky AM, Burakoff SJ, Bhan AK, Springer TA, Strominger 几： J Immunol. 19 84； 132： 3011-3018) に、 1 2 G 1 0は、 例えば、 参考文献 （Mould AP， Garr att AN, Askari JA, Akiyama SK, Humphries MJ: FEBS Lett. 1995; 363： 1 18-122) に記載の方法で作製して使用することができる。
上記のようなインテグリン α 2 iの活性を促進する物質を含有する医薬組成 物によれば、 後述の実施例に示すように、 コラーゲンにおける血小板の粘着反応 の減少を回復させることができるため、 出血を防止することができる。 つまり、 例えば、 vWD患者にインテグリ ン α 2 iの活性化抗体を投与すれば、 正常と 同様の血小板の粘着凝集反応が引き起こされ、 出血傾向が軽くなると考えられる 本発明の医薬組成物に含まれる、 インテグリン a 2 β の活性を調節する物質 の別の態様としては、 ィンテグリンひ 2 ]3 iの活性を抑制する物質が挙げられる 。 この場合、 本発明の医薬組成物は、 血小板の粘着凝集反応が過剰に発生するこ とに起因する疾患 （例えば、 血栓症） に対する予防または治療に好適に用いられ る。
このインテグリ ン α 2 の活性を抑制する物質とは、 インテグリ ン a 2 j31の 活性を抑制して血小板の粘着凝集反応を抑制する物質であり、 その中でも特に、 血小板中のインテグリンひ 2 J3 とコラーゲンとの結合反応を抑制する物質であ ることが好ましい。 また、 他のタンパク質などに及ぼす悪影響を最小限にするた めには、 インテグリンひ 2 に特異的に作用し得る物質であることが好ましい このような物質として具体的には、 インテグリ ン a 2 3 iに対する阻害抗体ま たはインテグリン α 2 ェの阻害剤が挙げられる。
インテグリンひ 2 ェに対する阻害抗体とは、 インテグリ ンひ 2 と結合して 、 インテグリン α 2 ]3ェの活性を低下させる方向に機能する抗体である。
インテグリン a 2 j3 に対する阻害抗体は、 ポリクローナル抗体、 モノクロ一 ナル抗体のいずれであってもよく、 周知の免疫学的手法により作製できる。 また 、 当該阻害抗体は、 抗体のフラグメント （例えば、 F a b 、 F ( a b ' ) 2 ) 、 組換え抗体 （例えば、 単鎖抗体） であってもよい。
例えば、 ポリクローナル抗体は、 インテグリン a 2 j3 iあるいはそのフラグメ ントを抗原として、 市販のアジュパント （例えば、 完全または不完全フロイント アジュパント） とともに、 動物の皮下あるいは腹腔内に 2 〜 3週間おきに 2 〜 4 回程度投与し （部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、 その上昇を確認しておく） 、 最終免疫から約 3〜約 1 0日後に全血を採取して抗 血清を精製することにより取得できる。 抗原を投与する動物としては、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ャギ、 モルモッ ト、 ハムスター等の哺乳動物が挙げられる。 また、 モノクローナル抗体は、 細胞融合法 （例えば、 渡邊武、 細胞融合法の原 理とモノクローナル抗体の作成、 谷内昭、 高橋利忠編、 「モノクローナル抗体と がん一基礎と臨床一」 、 第 2-14頁、 サイエンスフォーラム出版、 1985年） によ り作製することができる。
しかしながら、 ヒ トにおける治療効果と安全性を考慮すると、 本発明の抗体は 、 キメラ抗体、 ヒ ト化又はヒ ト型抗体であってもよい。'キメラ抗体は、 例えば 「 実験医学 （臨時増刊号） ， Vol. 6， No. 10, 1988」 、 特公平 3-73280号公報等を 、 ヒ ト化抗体は、 例えば特表平 4- 506458号公報、 特開昭 62- 296890号公報等を、 ヒ ト型抗体は、 例えば 「Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997」 、 「Na ture Genetics, Vol. 7, p. 13- 21， 1994」 、 特表平 4- 504365号公'報、 国際出願 公開 W094/25585号公報、 「日経サイエンス、 6月号、 第 4 0〜第 5 0頁、 1 9 95年」 、 （"Nature, Vol.368, p.856-859, 1994」 、 特表平 6- 500233号公報等 を参考にそれぞれ作製することができる。
インテグリン α;2 iに対する阻害抗体として具体的には、 G i 9、 6 F 1、 AK7、 P 1 E 6などが挙げられる。 これらの阻害抗体は、 市販されているもの を購入してもよレ、し、 従来公知の方法に従って作製することもできる。
また、 インテグリン α 2 の阻害剤としては、 例えば、 蛇毒成分 a I t e r n a g i n— C、 ならびにヒル成分 c a l i nおよび LAP P (l e e c h a n t i p l a t e l e t p r o t e i n) などが挙げ れる。 なお、 ここでい うインテグリン α 2 ]3 iの阻害剤とは、 インテグリン a 2 J3 iとコラーゲンとの結 合反応を阻害するものである。
上記のようなィンテグリン a 2 j8 の活性を抑制する物質を含有する医薬組成 物によれば、 後述の実施例に示すように、 コラーゲンに対する粘着凝集反応を阻 害することができるため、 血液中における血栓の形成を防止することができる。 さらに、 後述の実施例に示すように、 インテグリ ン a 2 jQェに対する阻害抗体 または阻害剤を、 vWf と GP I bとの相互作用の阻害剤 （例えば、 GP I bに 対する阻害抗体） と同時に使用することによって、 血小板とコラーゲンとの粘着 反応をほぼ完全に阻害することができることが確認されている。 したがって、 上 記の医薬組成物には、 ィンテグリン（χ 2 βェに対する阻害抗体または阻害剤に加 えて、 vWf と GP I bとの相互作用の阻害剤 （例えば、 GP I bに対する阻害 抗体） が含まれることがより好ましい。 これによつて、 血液中における血栓の形 成をより効果的に防止することができる。 また、 本発明の医薬組成物に含まれる 物質は、 インテグリ ン a 2 j8 および GP I b (または vWf ) の両方に対して 阻害作用を示す二重特異性抗体 （b i s p e c i f i c抗体） であってもよい。 また、 本発明の医薬組成物に含まれる、 インテグリン α 2 ェの活性を調節す る物貧のさらに他の例としては、 後述する本発明のスクリーニング方法で得られ る物質が挙げられる。
本発明の医薬組成物には、 上述のィンテグリン α 2 ]3 iの活性を調節する物質 以外に、 薬学的に許容され る担体が含まれていてもよい。
薬学的に許容され得る担体とは、 賦形剤、 希釈剤、 増量剤、 崩壊剤、 安定剤、 保存剤、 緩衝剤、 乳化剤、 粘稠剤、 溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げ られる。 そのような担体の一つ以上を用いることにより、 注射剤等の形態の医薬 組成物を調製することができる。 これらの医薬組成物は、 経口あるいは非経口的 に投与することができるが、 好ましくは非経口的に投与する。 当該組成物中に含 まれるィンテグリンひ 2 0 iの活性を調節する物質が最終的に血液中に到達する のであれば、 特に限定はされないが、 更に好ましくは、 静脈内注射である。
静脈内注射を行う場合には、 当該注射剤は、 必要に応じて、 非水性の希釈剤 （ 例えばプロピレングリコーノレ、 ポリエチレングリコール、 オリープ油のような植 物油、 エタノールのようなアルコール類など） 、 懸濁剤あるいは乳濁剤として調 製することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、 対象の年齢、 性別、 体重及び症状、 治療効果 、 投与方法、 処理時間、 あるいは該医薬組成物に含有される活性成分 （インテグ リンひ 2 の活性を調節する物質） の種類などにより異なるが、 通常成人 （体 重 6 0 k gとして） 一人当たり、 一回につき 1 0 gから 1 0 0 O m gの範囲、 好ましくは、 1 O m gから 5 0 O m gの範囲で投与することができる。 また、 医 薬組成物中の上記活性成分の含有量は、 0 . 0 1重量％から 9 9 . 9 9重量％の 範囲で含まれることが好ましい。 なお、 他の哺乳動物の場合も、 当該哺乳動物の 体重で換算した量を投与することができる。 しかしながら、 投与量は種々の条件 により変動するため、 上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、 また上記の 範囲を越える投与量が必要な場合もある。
本発明の医薬組成物は、 血小板中のィンテグリン a 2 β iとコラーゲンとの結 合活性を制御するという新たな作用機序で、 例えば、 フォンヴイレブランド病、 血栓症などの血小板の粘着凝集反応に関連する疾患に対して予防効果又は治療効 果を奏する。
本発明の医薬組成物は、 治療を必要とするヒトを含む動物に投与することがで き、 それらヒ ト以外の動物として、 ヒ ト以外の哺乳動物および鳥類が挙げられる 。 哺乳動物としては、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター、 モルモット、 ゥサ ギ等の実験動物、 ブタ、 ゥシ、 ャギ、 ゥマ、 ヒッジ等の家畜、 ィヌ、 ネコ等のぺ ット、 サル、 オランウータン、 チンパンジー等の霊長類が挙げられる。 鳥類とし ては、 例えば、 エワトリ、 ゥズラ、 ァヒル、 ガチョウ、 シチメンチヨウ、 ダチヨ ゥ、 ノヽ トなどが挙げられる。 本発明の医薬組成物はこれらの治療対象に安全に投 与され得るものから選択される。
( I I ) 本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患を予防 又は治療し得る物質のスクリーニング方法であって、 被験物質が、 インテグリン
Q^ jS iとコラーゲンとの結合反応を調節するか否かを評価することを特徴とす るものである。
本発明のスクリーニング方法は、 例えば、 以下の工程 （a ) 〜 （c ) を含む。 ( a ) 被験物質の存在下及び非存在下にィンテグリンひ 2 /3 iとコラーゲンとを 接触させる工程；
( b ) 両条件下におけるインテグリン 2 とコラーゲンとの結合の度合いを 比較する工程；
( c ) 上記 （b ) の比較結果に基づいて、 インテグリン α 2 3 iとコラーゲンと の結合反応の調節をもたらす被験物質を選択する工程。 '
本発明のスクリーエング方法の一態様として、 被験物質がインテグリン α 2 )3 iとコラーゲンとの結合反応を促進させるか否かを評価するものであり、 血小板 の粘着凝集反応に関連する疾患が血小板の粘着凝集に障害を有する疾患 （例えば 、 フォンヴイレブランド病、 ベルナ一ルース一リエ症候群など） であるものが挙 げられる。 この場合、 上記の （c ) の工程において、 被験物質の非存在下と比較 して、 被験物質の存在下でインテグリンひ 2 j3 iとコラーゲンとの結合反応が有 意に促進される （例えば、 インテグリン a 2 3 iとコラーゲンとの複合体の量が 有意に増加する） 場合の被験物質を、 スクリーニング対象の物質として選択する ことができる。
本発明のスクリーユング方法の別の態様として、 被験物質がインテグリン α 2 β！とコラーゲンとの結合反応を抑制するか否かを評価するものであり、 血小板 の粘着凝集反応に関連する疾患が血小板の粘着凝集が過剰に発生する疾患 （例え ば、 血栓症、 P C I後の再狭窄など） であるものが挙げられる。 この場合、 上記 の （c ) の工程において、 被験物質の非存在下と比較して、 被験物質の存在下で インテグリン α 2 ェとコラーゲンとの結合反応が有意に抑制される （例えば、 インテグリン α 2 とコラーゲンとの複合体の量が有意に減少する） 場合の被 験物質を、 スクリーユング対象の物質として選択することができる。
本発明のスク リーニング方法における上記 （b ) の工程は、 具体的には、 抗ィ ンテグリン a 2 β 抗体又は抗コラーゲン抗体を用いて、 あるいはィンテグリン a 2 β 又はコラーゲン自体を標識して、 インテグリン α 2 ]3 i—コラーゲン複合 体を測定することによりインテグリン α 2 ]3 iとコラーゲンとの結合を調べると いうものである。
より具体的には、 以下の方法が例示される。
( 1 ) 被験物質の存在下及び非存在下にィンテグリ ン α 2 3 iとコラーゲンとを 接触させて一定時間ィンキュベートした後、 インテグリ ン" 2 ]3 コラーゲン 複合体、 遊離ィンテグリン α 2 i及び遊離コラーゲンを電気泳動により分離し 、 標識抗ィンテグリン α 2 ]3 i抗体又は抗コラーゲン抗体を用いてィンテグリン a 2 jS i—コラーゲン複合体に相当するバンド強度を測定する。
( 2 ) 上記 （1 ) において、 反応液に抗インテグリン a 2 ]3 i抗体又は抗コラー ゲン抗体を加えて免疫沈降させた後で、 沈降物を電気泳動して、 R Iもしくは非 R I (酵素、 蛍光等） 標識した抗インテグリン α 2 0ェ抗体又は抗コラーゲン抗 体を用いてウェスタンプロッティングを行い、 検出されるパンドの強度を比較す ることもできる。
( 3 ) インテグリン α 2 ]3 一コラーゲン複合体の測定は、 慣用のィムノアッセ ィ系を用いて行うこともできる。 例えば、 インテグリン a 2 又はコラーゲン のいずれか一方を固相に結合させ、 固相に結合させなかったィンテグリン α 2 ;8 i又はコラーゲンと被験物質とを加えてィンキュベートし、 固相を洗浄した後、 R Iもしくは非 R I (酵素、 蛍光等） 標識した抗インテグリン α 2 i抗体又は 抗コラーゲン抗体を用いる R I A、 E I A、 F I A等により前記複合体を検出し 、 測定されるシグナル強度を比較してもよい。
(4) また、 被験物質の存在下及ぴ非存在下にインテグリ ンひ 2 ]3ェを発現させ た細胞を固相化したコラーゲンに接触させ、 インテグリンひ 2 β を発現させた 細胞のコラーゲンへの粘着反応を R I A、 E I Aなどによって測定してもよい。 また、 結合の度合いを測定する方法として、 さらに以下の方法も可能である。 (5) 蛍光標識したコラーゲンおよぴ組換えインテグリン a 2 j3 iを反応させ両 者の結合を伴う蛍光共鳴エネルギー移動 （FRET) を測定する方法。
(6) 表面プラズモン共鳴法によってコラーゲンとインテグリン 2 ]3 iとの結 合反応を測定する方法。
本発明のスクリーニング方法は、 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患の予防 用又は治療用の医薬の開発等に有用である。 さらに、 本発明のスクリーニング方 法によって得られた物質は、 血小板の粘着凝集反応の制御剤 （すなわち、 血小板. の粘着凝集反応の促進剤、 または、 血小板の粘着凝集反応の阻害剤） にも使用す ることができる。
( I I I ) 血小板の粘着凝集反応の制御方法
インテグリン a 2 i3 の活性を調節することを含む、 血小板の粘着凝集反応の 制御方法も本発明に含まれる。 本発明の制御方法は、 例えば、 インテグリン α; 2 β iの活性を調節する物質を血液中に投与することによって行うことができる。 本発明の制御方法の態様としては、 （a ) インテグリ ン a 2 /3ェの活性を促進 することを含む、 血小板の粘着凝集反応の促進方法と、 （b) インテグリン o; 2 iの活性を抑制することを含む、 血小板の粘着凝集反応の抑制方法とが挙げら れる。
上記 （a ) の血小板の粘着凝集反応の促進方法において、 「インテグリン α 2 丄の活性を促進する」 とは、 血小板中のインテグリン a 2；8 iとコラーゲンとの 結合反応を促進することを意味する。
この促進方法は、 例えば、 インテグリン a 2 i3ェの活性を促進する物質を血液 中に投与することによって行うことができる。 インテグリンひ 2 ]3 の活性を促 進する物質としては、 上述の 「 （I ) 本発明の医薬組成物」 において説明したも のを同様に使用することができる。 ここでのィンテグリン a 2 ]3ェの活性を促進 する物質の投与方法としては、 例えば、 静脈内投与が挙げられる。
このことから、 上述のインテグリン 2 j3ェの活性を促進する物質は、 血小板 の粘着凝集反応を促進するための反応制御剤 （すなわち、 反応促進剤） として利 用することもできる。
また、 上記 （b ) の血小板の粘着凝集反応の抑制方法において、 「インテグリ ンひ 2 ]3 iの活性を抑制する」 とは、 血小板中のインテグリン a 2 j8 iとコラーゲ ンとの結合反応を抑制することを意味する。
この抑制方法は、 例えば、 インテグリン a 2 ]3ェの活性を抑制する物質を血液 中に投与することによって行うことができる。 インテグリン a 2 j3 の活性を抑 制する物質としては、 上述の 「 （I ) 本発明の医薬組成物」 において説明したも のを同様に使用することができる。 ここでのインテグリン a 2 β の活性を抑制 する物質の投与方法としては、 例えば、 静脈内投与が挙げられる。
このことから、 上述のインテグリン a 2 i3 iの活性を抑制する物質は、 血小板 の粘着凝集反応を抑制するための反応制御剤 （すなわち、 反応抑制剤） として利 用することもできる。
上記の制御方法によれば、 インテグリン a 2 ;8 iの活性を変化させることによ つて、 流血下における血小板の粘着反応をコントロールすることができる。 その ため、 本方法は、 v WD患者の出血の治療、 あるいは、 血栓形成の予防などに応 用することができる。
実施例
以下に実施例を挙げて、 本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。
(コラーゲンの標品）
異なるタイプのゥシコラーゲンは、 株式会社高研より購入した。 ヒ ト タイプ I、 I I I、 I V、 および Vコラーゲンは、 第一ファインケミカル株式会社より 購入した。 また、 ヒ ト タイプ I Iコラーゲンは、 ケミコンインターナショナル (Chemicon International) より購入した。 ゥシコラーゲン標品の組成は、 S DS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動によって分析した。 その結果、 タイプ I — I I Iコラーゲンには、 他のタイプのコラーゲンが混入していない （すなわち 、 SDS— PAGEの銀染色の検出限界以下である） ことが確認された。 しかし 、 タイプ I Vコラーゲンは、 タイプ Iコラーゲンを含み、 タイプ Vコラーゲン線 維は、 タイプ I及ぴタイプ Vコラーゲンの共重合体であった （データ示さず） 。
(データ解析）
また、 速度パラメータを得るために、 各実験において得られたデータをソフト ウェア P r i sm, V e r 4 (グラフパッドソフトウェア （GraphPad Softwa re) 社製） による非線形回帰分析に付した。
〔実施例 1〕 固定化されたコラーゲンへのフォンヴイレブランド因子 （vW f ) の結合
(方法及び材料）
凝固第 V I I I因子を含まない vWf は、 財団法人化学及血清療法研究所の友 清博士から入手した。 vWf は、 参考文献 （Tomokiyo K， Kamikubo Y， Hanada Τ et al. , Blood. 2005； 105： 1078-1084. ) に記載された方法に従って、 vW f及ぴ第 V I I I因子を含むヒ ト血漿由来寒冷沈降物 （cryoprecipitate) から 、 ゲルろ過によって精製した。 精製された vWf は、 I ODOBEAD S (ピア スバイオケミカルズ （Pierce Biochemicals) 製） を使用して、 使用説明書に従 つて、 N a 125 Iで放射性標識された。 放射性標識された vWf の比放射活性は 、 500— 1 000 c pm/n gであった。
コラーゲン原液を、 緩衝液 A (1 36 mM Na C l、 2. 7 mM KC 1、 0. 4 2 mM N a H2 P〇4、 1 2 mM N a H C03、 5. 5 mM ダルコ一 ス、 及び、 5mM HE P E S、 p H 7. 4) で 2 0 μ g/m 1に希釈し、 5 0 μ 1をマイクロタイタープレート （NUNCィムノモジュール、 ナルジェヌンク インターナショナ^^株式会社製） の各ゥエルに加えた。 4°Cでー晚コラーゲンと の反応を行った後、 ゥエルを室温で一時間放置した。 各ゥエルのコラーゲン溶液 を除去し、 2%B S A (ゥシ血清アルブミン） を含む緩衝液 A 2 5 0 μ 1 と室 温で 1時間反応させることによって、 露出した領域をブロックした。 ブロッキン グ溶液を除去した後、 ゥエルを緩衝液 A 2 5 0 μ 1で 4回洗浄した。
各マイクロタイターゥエルに、 0. 2 %B S Αを含む緩衝液 Α中で標識された vW f の 5 0 μ 1を添加し、 室温で 1時間反応させた。 V W f 溶液を排出し、 0 . ひ 0 5 %Tw e e n 2 0を含む緩衝液 A 2 5 0 /i 1でゥエルを 3回洗浄し、 Tw e e n 2 0を含まない緩衝液 Aでゥエルを 1回洗浄した後、 結合した vW f をガンマカウンターで測定した。 各実験条件に対して、 4連の解析を行った。 B S Aで被覆されたゥエルへの vW f の結合によって、 vW f の非特異的結合を測 定した。
(結果）
固定化されたコラーゲンへの vW f の結合を解析した。 第 V I I I因子を含ま ない放射性標識された vW f を、 マイクロタイタープレート上に固定化された異 なるタイプのコラーゲンとともに反応させ、 測定された放射活性をゥエルに結合 した vW f の量に変換した。
具体的には、 異なるタイプのコラーゲン （2 0 g/m 1 ) を、 マイクロタイ タープレートでー晚インキュベートした後、 2%の B S Aでブロックし、 洗浄し た。 コラーゲンを被覆したゥエルを放射性標識した種々の濃度の vW f とともに 1時間インキュベートした後、 洗浄し、 ガンマカウンターでカウントした。 結合 した vW f の量を、 放射活性から算出した。
その結果を図 1に示す。 図 1 ( a ) のグラフは、 vW f のゥシコラーゲンとの 結合を示し、 図 1 (b) のグラフは、 vW f のヒ トコラーゲンとの結合を示す。 なお、 各グラフにおいて、 コラーゲンのタイプは表 1に示す通りである。
1 ]
國 ： タイプ Iコラーゲン
▲：タイプ I Iコラーゲン
V：タイプ I I Iコラーゲン
♦：タイプ I Vコラーゲン
秦：タイプ Vコラーゲン 図 1に示すように、 vW f は、 タイプ I、 タイプ I I、 タイプ Vコラーゲンと 弱い結合を示し、 タイプ I Vコラーゲンとはほとんど結合しなかった。 し力、し、 両方のグラフにおいて、 タイプ I I Iコラーゲンとは強く、 飽和的に結合した。 この結果から、 vWf がゥシおよぴヒ トのタイプ I I Iコラーゲンと特異的に 結合することを示す。 タイプ I Vコラーゲンは、 vWf と結合せず、 タイプ I、 I I、 及び Vは、 vWf と非常に弱い結合を示した。 これらのデータから、 vW f が結合するときの K d値は、 ゥシ及ぴヒ トのタイプ I I Iコラーゲンに対して それぞれ 1 1. 3 6 ± 0. 6 5 1 5 /X g/m 1および 1 2. 2 9 ± 0. 9 5 3 1 μ g/m l と算出された。 他のタイプのコラーゲンに関しては vWf にほとんど 結合しなかったため、 信頼できる速度の値は得られなかった。 これらのデータは 、 vWf がヒト及びゥシ由来のタイプ. I I Iコラーゲンと特異的に結合すること を意味する。
図 1に示す結果から、 タイプ Iコラーゲンと比較してタイプ I I Iコラーゲン はかなり多くの vW f と結合することが確認された。
〔実施例 2〕 流血条件下でのコラーゲン表面への血小板粘着
次に、 より生理学的な環境において血小板粘着及び凝集体形成に対するタイプ I及ぴタイプ I I Iコラーゲンの寄与を比較するために、 流血条件下における固 定化されたコラーゲン表面への血小板粘着を解析した。
(方法及び材料） 流血条件下での固定化されたコラーゲンへの血小板粘着を、 非特許文献 3、 及 ぴ、 参考文献 (Moroi M, Jung SM， Shinmyozu K et al. , Blood. 1996;88:20 81-2092. ) の記載に従って測定した。 異なる濃度のタイプ Iコラーゲン及びタ ィプ I I Iコラーゲンを含む緩衝液 Aを、 きれいなガラス板上で、 4°Cでー晚反 応させた。 反応したガラス板を、 2 %B S Aを含む緩衝液 Aで 1時間プロックし た後、 緩衝液 Aで洗浄し、 フローチャンパ一 （上記参考文献参照） にのせた。 メ パクリン処理された血液は、 1,6 0 0/秒の一定のせん断速度でフローチャンパ 一を通過した。 粘着した血小板を、 蛍光照射設備 （モデル T- FL- E) を取り付け た蛍光顕微鏡 （Eclipse TE- 2000；ニコン社製） で観測した。
EB— CCDカメラ （浜松ホトニクス株式会社製） によって蛍光画像をとらえ 、 ビデオテープに記録した。 得られた写真画像を、 MetaMorphソフトウェア （Ja pan Molecular. Devices製） を使用したコンピューターによって解析した。 血小 板粘着の量的な解析のために、 とらえられた画像の背景除去処理及び積算平均化 処理 （rolling average) を行いながら、 ビデオ信号を 1 0秒ごとに取得し、 粘 着した血小板によって占有された表面面積のパーセンテージ （すなわち、 表面被 覆率 （％) ) をソフトウェアによって算出した。
(結果）
タイプ I及びタイプ I I Iのゥシコラーゲンをスライ ドガラスに吸着させ、 固 定化されたコラーゲン表面上の血小板粘着及び凝集体形成を血流下で観察した。 血液が固定化された高濃度のコラーゲンを有するスライ ドガラスを通過するとき ； タイプ I及びタイプ I I Iコラーゲン表面に血小板が同程度に粘着し、 凝集体 を形成するのが観察された。
また、 固定化されたコラーゲンへの高せん断流下での血小板粘着の濃度依存性 を調べた。
1 00 μ g/m 1 (A) 、 2 0 μ g/m 1 (Β) 、 1 0 μ g/m 1 (C) 、 5 μ g/m 1 (D) のタイプ I及びタイプ I I Iコラーゲンをガラス板上で反応さ せた。 固定化されたコラーゲン表面への血小板粘着を、 せん断速度 1 6 0 0/秒 下で測定した。 流血開始から 3分後にタイプ I及びタイプ I I Iコラーゲン上に 粘着した血小板の画像を撮影した。 図 2 Aには、 高せん断流下でのタイプ Iコラ 一ゲンへの血小板粘着を表面被覆率 （％) で量的に表したグラフ （ （a ) ) 、 お よび、 その血小板粘着を撮影して得られた蛍光画像 （ （b ) ) を示す。 また、 図 2 Bには、 高せん断流下でのタイプ I I Iコラーゲンへの血小板粘着を表面被覆 率 （％) で量的に表したグラフ （ （a ) ) 、 および、 その血小板粘着を撮影して 得られた蛍光画像 （ （b) ) で示す。 なお、 各グラフにおいて、 コラーゲンの濃 度は表 2に示す通りである。
ほ 2]
■ · □： 1 0 Ο.μ g/m 1 (A)
▲ · △： 2 0 μ g/ 1 (B)
図 2 A及ぴ図 2 Bに示すように、 全ての条件下でタイプ I I Iコラーゲンの血 小板粘着が同様に観察された。 しかし、 タイプ Iコラーゲンの血小板粘着は、 低 密度のコラーゲン表面で減少した。
つまり、 タイプ Iコラーゲンに関しては、 血小板粘着が吸着されたコラーゲン の濃度に高度に依存していた （図 2 A参照） 。 高濃度のタイプ Iコラーゲンで処 理したスライドガラスと比較して、 低濃度 （く 1 0 g/m 1 ) のタイプ Iコラ 一ゲンで処理したスライドガラス上では、 血小板粘着及び特に血小板凝集体形成 が大幅に低下した。 タイプ I I Iコラーゲン表面における血小板粘着及ぴ凝集体 形成は、 固定化されたコラーゲンの密度に強い依存性を示さなかった （図 2 B参 照） 。
他の特徴的な点は、 タイプ Iコラーゲン表面において血小板の粘着が確実に減 少したことである。 タイプ Iコラーゲン表面における血小板粘着反応を、 時間を 追って観察したところ、 表面被覆曲線 (the surface coverage curve) におい てより長い遅延時間が発生した。 特に、 低濃度のタイプ Iコラーゲン表面では、 確実な粘着はほとんど観察されなかった。 このことは、 表面被覆曲線が水平状態 であることから裏付けられる （図 2におけるタイプ Iの D) 。 これらの結果は、 特にコラーゲンがより低濃度で存在する場合に、 タイプ I I Iコラーゲンは、 タ イブ Iコラーゲンと比較して、 流血条件下における血小板粘着により効果的に寄 与することを示唆する。
タイプ I及びタイプ I I Iコラーゲンがガラス表面に異なって吸着する可能性 を排除するために、 125 Iで標識されたタイプ I及びタイプ I I Iを、 上記の流 血実験と同様の手順でスライドガラス表面で反応させ、 付着したコラーゲンの放 射活性から、 吸着したコラーゲンの量を算出した。
ガラス表面に吸着したコラーゲンの量を、 125 I標識されたコラーゲンを使用 して測定した。 具体的には以下の手順により行った。 0. 1 M酢酸ナトリウム （ p H 5. 0) 中のタイプ I及ぴタイプ I I Iコラーゲン （ 1 m g/m 1 ) を、 I ODOB EAD Sを使用して N a 1 25 Iで放射性標識した。 得られた比放射能活 性は、 2. ：!〜 2. 5 X 1 05 c p gであった。 放射性標識されたコラー ゲンを、 緩衝液 Aで上述の濃度 （ 1 0 0 ^ g/mL、 2 0 μ g/mL, 1 0 μ g ZniL、 5 g/mL) に希釈し、 スライドガラスとともに 4 °Cでー晚反応させ た。 反応後、 スライ ドガラスを上記の流血実験と同様の方法で処理した。 吸着し たコラーゲンを抽出するため 、 各スライ ドを 1 m 1の 1 % S D S/ 3M 尿 素で 2回処理した。 抽出物を混合し、 スライ ド上に吸着したコラーゲンの量を算 出するために放射活性をカウントした。
その結果を図 3に示す。 図に示すように、 流血実験で使用した各コラーゲン濃 度で、 ガラスに吸着されたタイプ Iの量は、 吸着されたタイプ I I Iの量と同程 度であった。 5 0 ^ g/m 1のコラーゲンおよぴ 1 0 0 μ g/m 1のコラーゲン を使用した場合、 吸着される量はほぼ同じであり、 コラーゲン濃度が 1 0 μ g/ m lよりも減少した場合、 吸着される量は顕著に減少した。 コラーゲン濃度 1 0 μ gZm 1は、 タイプ Iコラーゲンへの血小板粘着が減少する濃度に相当する。 〔実施例 3〕 タイプ I及ぴタイプ I I Iコラーゲンへの血小板粘着における 、 インテグリンひ 2 に対する抗体の影響
続いて、 タイプ I及ぴタイプ I I Iコラーゲンへの血小板粘着のメカニズムを 解析するために、 タイプ I及ぴタイプ I I Iコラーゲンへの血小板粘着における 、 インテグリン "2 ]3 に対する抗体の影響を調べた。
血液を、 抗体とともにプレインキュベートし、 タイプ I及ぴタイプ I I Iコラ 一ゲンへの粘着を解析した。 低密度コラーゲン表面として 5 μ g/m 1のコラー ゲン溶液で被覆されたコラーゲン表面、 および、 高密度コラーゲン表面として 1 0 0 μ g/m 1のコラーゲン溶液で被覆されたコラーゲン表面を使用した。
また、 抗インテグリン a 2 j8 抗体として、 G i 9 (ィムノテックインターナ ショナル (Immunotech International) 製) 、 6 F 1 (ロックフェラー大学の B. S. Coller博士より提供されたもの） 、 AK 7 (B Dバイオサイエンス (BD Bi osciences ) 製） 、 T S 2/ 1 6 (参考文献 (Moroi M， Onitsuka I， Imaizumi T, Jung SM. , Thromb Haemostas. 2000； 83： 769-776. ) に記載の方法で調製 したもの） を使用した。 抗 G P l b抗体として、 NNKY 5— 5 (関西医科大学 の野村博士より提供されたもの） 、 AK 2 (バイオジェネシス （Biogenesis) 社製） を使用した。
(結果）
高密度コラーゲン表面 （H, 1 0 0 μ g/m 1のコラーゲンで被覆されたもの ) 、 及ぴ、 低密度コラーゲン表面 （L, 5 μ g/m 1のコラーゲンで被覆された もの） を使用して、 タイプ I及びタイプ I I Iへの血小板粘着を解析した。 血小 板粘着は、 粘着した血小板の表面被覆率 (%) (the percent surface cove rage) で表した。 全血液中の血小板を、 抗インテグリン α 2 ;3ェ抗体 G i 9 ( 2 0 μ g/m 1 ) 、 あるいは、 抗 G P I b抗体 NNKY 5— 5 (NNKYと示す、 4 0 g/m 1 ) と反応させ、 粘着を測定した。 両抗体の存在下における血小板 粘着についても測定した （+NNKY+G i 9と示す、 各抗体2 0 111 1 ) その結果を図 4 A及び図 4 Bに示す。 図 4 Aは、 高密度のタイプ I及びタイプ I I Iコラーゲン表面への血小板粘着を測定した結果を示す。 図 4Bは、 低密度 のタイプ I及びタイプ I I Iコラーゲン表面への血小板粘着を測定した結果を示 す。 これらの図は、 5つの実験において得られた典型的なデータを示す。
抗 GP I b抗体 NNKY 5— 5は、 低密度のタイプ Iコラーゲンへの血小板粘 着をやや阻害し、 低密度のタイプ I I Iコラーゲンへの血小板粘着を強く阻害し た。 しかし、 阻害の程度は各実験によって様々であった。 このような阻害の程度 の多様性は、 各血小板標品の反応性の差に起因するものである。
NNKY 5— 5は、 あらゆる血小板標品において、 高密度のタイプ Iコラーゲ ンへの粘着に大きな影響を与えなかった。 本実験のデータからは、 NNKY5— 5の阻害効果のあらゆるパターンの中で、 低密度のタイプ I I Iコラーゲンへの 粘着の阻害効果が最も大きく、 高密度のタイプ Iコラーゲンへの粘着の阻害効果 が最も小さいことが確認された。
一方、 抗インテグリン ct 23 i抗体 G i 9は、 高密度のタイプ Iコラーゲン及 び低密度のタイプ Iコラーゲンへの粘着をともに阻害し、 タイプ I I Iコラーゲ ンへの粘着についてはあらゆる密度において影響を与えなかった。
また、 この実験において、 流血開始から 3分後に粘着した血小板を撮影して得 られた蛍光画像を図 5に示す。 抗ィンテグリン α 2 /3 i抗体 G i 9は強力にタイ プ Iコラーゲンへの粘着を阻害したが、 タイプ I I Iコラーゲンへの粘着には顕 著な効果を示さなかった。 他方で、 抗 GP I b抗体は強力に低密度のタイプ I I Iコラーゲンとの固着を阻害したが、 高密度のタイプ I I Iコラーゲン固着には 弱く影響しただけであった。 これら 2つの抗体の組み合わせはタイプ Iおよぴタ ィプ I I Iコラーゲンへの粘着をほぼ完全になくした。 G i 9 +NNKYの効果 は特に低濃度のタイプ Iおよびタイプ I I Iコラーゲン表面への固着において顕 著であり、 血小板はほとんど観察されなかった。 これは、 コラーゲン表面との相 互作用が非常に強く阻害されていることを示す。 これらの結果は、 おそらく非常 に少量の vWf がタイプ Iコラーゲンと結合するため、 a 2 β iがコラ ゲン、 特にタイプ Iコラーゲンに対する粘着に寄与することを示唆している。
続いて、 ィンテグリン α 2 β iがタイプ Iコラーゲンへの粘着に寄与すること を確かめるために、 活性化抗体である、 抗インテグリンひ 2 ]3 抗体 T S 2 1 6の効果を解析した。
具体的には、'血小板粘着において、 阻害抗体である抗インテグリン 0；2 i抗 体 G i 9 (50 g/m 1 ) の効果、 及ぴ、 活性化抗体である抗インテグリン α 2 β 抗体 TS 2/1 6 ( 20 μ g /m 1 ) の効果を、 高密度タイプ ίコラーゲ ン （Ty p e I—H) 表面及び低密度タイプ Iコラーゲン （Ty p e I— L ) 表面を使用して解析した。 図 6 Aには、 高密度タイプ Iコラ^ "ゲンにおける結 果を示し、 図 6 Bには、 低密度タイプ Iコラーゲンにおける結果を示す。 図 6 A 及び図 6 Bにおいて、 （a) は表面被覆率 （％) で表した血小板粘着の量を示し 、 (b) は流血開始から 3分後に粘着した血小板の蛍光画像を示す。
これらの図に示すように、 TS 2Z1 6は、 高密度のタイプ Iコラーゲンにお ける血小板粘着にはほとんど影響を与えなかったが、 低密度のタイプ Iコラーゲ ンにおける血小板粘着を増加させた。 流血開始から 3分後には、 TS 2/1 6の 存在下における低密度のタイプ Iコラーゲンへの粘着は、 高密度のタイプ Iコラ ゲンへの粘着 （control) と区別できない程度 （すなわち、 ほぼ同程度） とな つた。 これらの結果は、 活性化されたインテグリ ンひ 2 j3 iが、 高せん断速度下 においてタイプ Iコラーゲンへの血小板粘着に寄与することを示唆する。
次に、 G i 9単独ではタイプ I I Iコラーゲンへの血小板粘着へ影響を及ぼさ なかったため、 G i 9及び NNKY 5— 5を一緒に血中へ添加し、 その粘着を測 定した。 図 4 A及び図 4 Bに示すように、 両抗体の添加によって、 タイプ Iへの 血小板粘着もタイプ I I Iへの血小板粘着も、 ともに著しく阻害された。 阻害効 果を全く示さなかった高濃度のタイプ I I Iコラーゲンへの粘着でさえも、 両抗 体を混合することによってほぼ完全に'阻害された。 図 5の蛍光画像は、 両抗体の 存在下において、 血小板が高密度のタイプ I及びタイプ I I Iコラーゲン表面へ ほとんど粘着しないこと、 及び、 血小板が低密度のコラーゲン表面へ粘着しない ことを示す。 このことは、 両抗体の存在下では、 血小板とコラーゲン表面との相 互作用が完全に阻害されていることを意味する。
他の抗体 （すなわち、 抗 G P I b抗体 AK 2、 抗インテグリ ン a 2 J3 i抗体 6 F 1及び AK 7 ) についても実験を行ったところ、 同様の効果が確認された （デ ータ示さず） 。 これらの結果は、 高せん断下でのコラーゲンへの血小板粘着は、 G P I b及びインテグリン α 2 ]3ェにともに依存することを意味する。 また、 タ ィプ Iコラーゲンへの vW f の結合が低レベルであるため、 タイプ Iコラーゲン への粘着は、 インテグリン α 2 β iにより依存しているといえる。
以上の実施例の結果からは、 タイプ I I Iコラーゲンが、 他のタイプのコラー ゲンと比較して、 vW f とより多く結合することを示すデータが得られた。 高せ ん断条件下では、 タイプ Iコラーゲンへの血小板粘着がィンテグリンひ 2 iに 依存することも確認された。 この結果から、 G P I b— vW f 相互作用、 及ぴ、 a 2 β i一コラーゲン相互作用の両方が、 高せん断条件下におけるコラーゲンへ の血小板粘着に寄与しているといえる。
産業上の利用可能性
上述したように、 本発明は、 例えば、 フォンヴイレブランド病、 血栓症などの 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患に対する予防剤おょぴ または治療剤とし て有用である。 また、 例えば、 フォンヴイレブランド病、 血栓症などの血小板の 粘着凝集反応に関連する疾患に対する新たな作用機序を有する医薬品の開発に有 効利用することができる。
本出願は、 日本で出願された特願 2 0 0 6— 1 4 7 3 0 9 (出願日 2 0 0 6年 5月 2 6日） を基礎としており、 それらの内容は本明細書に全て包含される。

Claims

請求の範囲
1. インテグリ ン α2；8ェの活性を調節する物質を含有する、 血小板の粘着凝 集反応に関連する疾患の予防用又は治療用の医薬,組成物。
2. 物質が、 血小板中のインテグリン α 2 ]3 とコラーゲンとの結合反応を促 進する物質である、 請求の範囲 1記載の医薬組成物。
3. コラーゲンがタイプ Iコラーゲンである、 請求の範囲 2記載の医薬組成物
4. 物質が、 インテグリンひ 2 iに対する活性化抗体である、 請求の範囲 2 または 3に記載の医薬組成物。
5. 活性化抗体が TS 2/1 6である、 請求の範囲 4記載の医薬組成物。
6. 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患が、 フォンヴイ レブランド病である 、 請求の範囲 2〜 5の何れかに記載の医薬組成物。
7. 物質が、 血小板中のインテグリ ン α 2 iとコラーゲンとの結合反応を抑 制する物質である、 請求の範囲 1記載の医薬組成物。
8. コラーゲンがタイプ Iコラーゲンである、 請求の範囲 7記載の医薬組成物
9. 物質が、 インテグリン
Figure imgf000028_0001
iに対する阻害抗体である、 請求の範囲 7ま たは 8に記載の医薬組成物。
1 0. 阻害抗体が G i 9である、 請求の範囲 9記載の医薬組成物。 '
1 1. 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患が、 血栓症である、 請求の範囲 7 〜 1 0の何れかに記載の医薬組成物。
1 2. 被験物質が、 インテグリン ·α 2 iとコラーゲンとの結合反応を調節す るか否かを評価することを特徴とする、 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患を 予防又は治療し得る物質のスクリーユング方法。
1 3. 疾患がフォンヴイレブランド病である、 請求の範囲 1 2記載のスクリー ニング方法。
14. 疾患が血栓症である、 請求の範囲 1 2記載のスクリーニング方法。
1 5 . 請求の範囲 1〜 1 1の何れかに記載の予防又は治療用の医薬組成物、 及 ぴ当該医薬組成物を血小板の粘着凝集反応に関連する疾患の予防もしくは治療の ために使用し得ること、 または使用すべきであることを記載した書類を含む商業 的パッケージ。
PCT/JP2007/061150 2006-05-26 2007-05-25 血小板の粘着凝集反応に関連する疾患の予防用又は治療用の医薬組成物、および、そのスクリーニング方法 WO2007139208A1 (ja)

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