ES2225961T3 - Proteina de union a antigeno multivalente y multiespecifica. - Google Patents

Proteina de union a antigeno multivalente y multiespecifica.

Info

Publication number
ES2225961T3
ES2225961T3 ES97916416T ES97916416T ES2225961T3 ES 2225961 T3 ES2225961 T3 ES 2225961T3 ES 97916416 T ES97916416 T ES 97916416T ES 97916416 T ES97916416 T ES 97916416T ES 2225961 T3 ES2225961 T3 ES 2225961T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
protein
variable domains
sequence
antigen binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES97916416T
Other languages
English (en)
Inventor
Paul James Davis
Cornelis Paul Erik Van Der Logt
Martine Elisa Verhoeyen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Unilever NV
Original Assignee
Unilever NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Unilever NV filed Critical Unilever NV
Application granted granted Critical
Publication of ES2225961T3 publication Critical patent/ES2225961T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

PROTEINA MULTIVALENTE UNIDA A ANTIGENO QUE COMPRENDE UN PRIMER POLIPEPTIDO QUE COMPRENDE, EN SERIE, TRES O MAS DOMINIOS VARIABLES DE UNA CADENA PESADA DE ANTICUERPOS Y UN SEGUNDO POLIPEPTIDO QUE COMPRENDE, EN SERIE, TRES O MAS DOMINIOS VARIABLES DE UN ANTICUERPO DE CADENA LIGERA, ESTANDO VINCULADOS LOS MENCIONADOS PRIMER Y SEGUNDO POLIPEPTIDOS POR ASOCIACION DE LOS DOMINIOS VARIABLES RESPECTIVOS DE CADENA PESADA Y CADENA LIGERA, FORMANDO CADA DOMINIO VARIABLE ASOCIADO UNA POSICION DE ENLACE DE ANTIGENO. SE DESCUBREN METODOS PARA SU PRODUCCION Y USOS DERIVADOS, EN PARTICULAR PARA APLICACIONES TERAPEUTICAS Y DE DIAGNOSTICO.

Description

Proteína de unión a antígeno multivalente y multiespecífica.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a proteínas de unión a antígenos multivalentes y multiespecíficas, procedimientos para su producción y usos de las mismas. En particular, la invención se refiere a proteínas de unión que comprenden polipéptidos que se asocian a formar multímeros multivalentes o multiespecíficos.
Antecedentes de la invención
Los anticuerpos son moléculas de proteínas que tienen una estructura basada en una unidad que comprende cuatro polipéptidos, dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, que están covalentemente unidas juntas mediante enlaces disulfuro. Cada una de estas cadenas se pliega en dominios discretos. Las regiones C-terminales de tanto las cadenas pesadas como las ligeras se conservan en secuencia y se llaman las regiones constantes, que comprenden uno o más llamados dominios C. Las regiones N-terminal de las cadenas pesadas y ligeras, también conocidas como dominios V, son variables en secuencia y determinan la especificidad del anticuerpo. Las regiones en los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas (V_{L} y V_{H} respectivamente) responsable de la actividad de la unión a antígenos se conocen como las regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad. Los anticuerpos naturales tienen al menos dos sitios de unión a antígenos idénticos definidos por la asociación de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras.
Se sabe que la digestión proteolítica de un anticuerpo puede conducir a la producción de fragmentos de anticuerpos. Tales fragmentos, o porciones, del anticuerpo entero pueden exhibir actividad de unión a antígenos. Un ejemplo de un fragmento de unión es un fragmento Fab que comprende una cadena ligera asociada a los dominios V_{H} y C_{H1} de una cadena pesada. El fragmento bivalente F(ab^{1})_{2} comprende dos de tales fragmentos F_{ab} conectados juntos a mediante la región bisagra, proporcionando dos sitios de unión a antígenos. También se pueden obtener los fragmentos F_{v}, constituidos solamente por los dominios V de las cadenas pesadas y ligeras asociadas una a otra. Estos fragmentos F_{v} son monovalentes para unirse a antígenos. Los fragmentos más pequeños tales como dominios V individuales (anticuerpos de dominios o dABs, Ward y col., Nature, 341, 544 (1989) y CDR individuales (Williams y col., Proc. Natl. Acad. Sci, Estados Unidos, 86, 5537 (1989)) también se ha mostrado que retienen las características de unión del anticuerpo precursor aunque generalmente la mayoría de los anticuerpos de origen natural necesitan tanto V_{H} como V_{L} una para retener inmunorreactividad total.
También se han descrito los fragmentos de los anticuerpos que comprenden dominios V_{H} y V_{L} asociados juntos para tener actividad de unión a antígenos. El fragmento F_{v} de la cadena individual (scFv) comprende un dominio V_{H} unido a un dominio V_{L} mediante un engarce flexible de polipéptidos de tal manera que los dominios se pueden asociar para formar un sitio de unión a antígenos (véase, por ejemplo, el documento EP-B-0281604, Enzon Labs Inc).
Los sistemas de expresión microbianos para producir fragmentos de anticuerpos activos se conocen en la bibliografía. La producción de Fab en diversos huéspedes tales como, por ejemplo, E. coli (Better y col., Science, 240, 104, (1988)), levadura (Horwitz y col., Proc. Natl. Acad. Sci, Estados Unidos, 85, 8678 (1988)) y el hongo filamentoso Trichoderma reesei (Nyyssönen y col, Bio/Technology, 11, 591 (1993) se han descrito previamente. También se sabe que las plantas se pueden usar como huéspedes para la producción de fragmentos SCFv (Owen y col, Bio/Technology, 10, 790 (1992) así como anticuerpos enteros.
Una ventaja de usar fragmentos de anticuerpos en lugar de anticuerpos enteros en diagnosis y terapia se encuentra en su tamaño más pequeño. Son probablemente menos inmunogénicos que los anticuerpos enteros y más capaces de penetrar tejido. Sin embargo, una desventaja asociada al uso de fragmentos tales como los fragmentos F_{ab}, F_{v}, y fragmentos de anticuerpos S_{c}F_{v} descritos anteriormente, es que tienen solamente un sitio de unión para unión a antígenos cuando se compara con los dos o más sitios contenidos en el anticuerpo entero, evitando la unión polivalente al antígeno y por lo tanto conduciendo a avidez reducida.
En un intento de superar este problema, se ha dirigido la atención para proporcionar proteínas multivalentes de unión a antígenos, es decir a proteínas que tienen más de un sitio de unión a los antígenos. Además, ha habido interés en la producción de proteínas de unión a antígenos que tienen múltiples especificidades capaces de unirse a diferentes determinantes antigénicos y que contienen dominios de unión a antígenos derivados de fuentes diferentes. Las proteínas de unión a antígenos que tienen especificidades distintas de unión pueden ser útiles, por ejemplo, en la dirección de células efectoras a células diana en virtud de la unión específica de los diferentes dominios de unión. A modo de ilustración, se puede usar una proteína de unión a antígenos biespecífica que tiene especificidad tanto para células tumorales como fármacos citotóxicos para dirigir específicamente fármacos citotóxicos a células tumorales de una manera eficaz. Evitando la necesidad de modificación química, se pueden evitar respuestas inmunes adversas.
Hasta ahora, la aplicación potencial de proteínas de unión a antígenos multivalentes y multiespecíficas se han impedido por las dificultades en generar y purificar tales moléculas.
Las proteínas de unión a antígenos recombinantes que tienen dos sitios de unión se puede preparar mediante procedimientos tales como reticulación química de residuos de cisteína, bien a través de residuos de cisteína introducidos en el extremo C del V_{H} de un F_{v} (Cumbre y col., J. Immunol., 149, 120 (1992), a través de los residuos de cisteína bisagras en F_{ab} para generar (Fab^{1})_{2} (Carter y col., Bio/Tech., 10, 163 (1992)) o en el extremo C del V_{L} de un scFv (Pack y Plückthun, Biochemistry, 31, 1579 (1992)). Como alternativa, se ha descrito la producción de fragmentos de anticuerpos biespecíficos bivalentes basándose en la inclusión de los fragmentos F_{ab} de las secuencias de péptidos
C-terminales que promueven la dimerización. (Kostelny y col, J. Immunol., 148, 1547).
Los fragmentos de anticuerpos bivalentes o biespecíficos que comprenden un complejo de unión que contiene dos cadenas de polipéptidos, una que comprende dos dominios variables de cadenas pesadas (V_{H}) en serie y la otra que comprende dos dominios variables de cadenas ligeras (V_{L}) en series se describen en nuestra solicitud de patente europea en trámite Nº 95307332.7.
Los fragmentos de anticuerpos multivalentes y/o multiespecíficos se describen en el documento WO 94/09131 (Scotgen Limited). Las proteínas de unión específica que tienen dos regiones de unión, contenían al menos en parte sobre las primera y segunda cadenas de polipéptidos dichas cadenas adicionalmente incorporan dominios de asociación capaces de unirse uno a cada otro produciendo que las cadenas de polipéptidos a combinarse se describen en ese documento. Se describe que la primera y segunda regiones de unión preferiblemente son dominios de anticuerpos de unión a antígenos, por ejemplo, comprendiendo las regiones V_{H} y V_{L} contenidas en un fragmento Fab o en un fragmento Fv de una cadena, o se puede derivar de exactamente una de las regiones V_{H} o V_{L} regiones de un anticuerpo. Los dominios de asociación se pueden derivar adecuadamente de un anticuerpo y pueden ser, entre otras, regiones V_{H} y V_{L} de anticuerpos. Además se describe que usando una combinación de dominios V_{H} / V_{L} para lograr la asociación conduce a la creación de un dominio F_{v} suplementario de manera que el anticuerpo producido puede ser trivalente. Las representaciones esquemáticas de las disposiciones sugeridas en el documento WO 94/09131 para producir fragmentos trivalentes se muestran en la figura 1A.
El documento WO 93/11161 (Enzon Inc) describe proteínas multivalentes de unión a antígenos que comprenden dos o más moléculas de proteínas de una cadena, cada molécula de una cadena que comprende el primer y segundo polipéptidos cada uno comprendiendo la porción de unión de la región variable de una cadena pesada y ligera de los anticuerpos estando unidos los polipéptidos juntos mediante un engarce peptídico. Se describen los trímeros y tetrámeros hipotéticos, que comprenden tres o cuatro proteínas de unión a antígenos de una cadena según sea apropiado. Las representaciones esquemáticas de las disposiciones trivalentes sugeridas se muestran en la figura 1B.
El documento WO 91/19739 (Celltech Limited) describe proteínas multivalentes de unión a antígenos que comprenden un fragmento Fv unido a al menos un fragmento adicional Fv mediante una estructura de conexión que enlaza los fragmentos juntos pero que los mantiene espaciados separados de manera que se pueden unir a los determinantes antigénicos adyacentes. Convenientemente la estructura de conexión consiste en un polipéptido espaciador y una unidad de enlace tal como un engarce de maleimida de reticulación o una molécula que permite la unión no covalente. Las estructuras de conexión particularmente preferidas que se describen están basadas sobre secuencias de regiones de acoplamiento a anticuerpos y bisagras.
Sumario de la invención
Según la presente invención se proporciona una proteína multivalente de unión a antígenos que comprende:
un primer polipéptido que comprende en serie, tres o más dominios variables de una cadena pesada de anticuerpos; y
un segundo polipéptido que comprende, en serie, tres o más dominios variables de una cadena ligera de anticuerpos, dichos primer y segundo polipéptidos estando unidos mediante la asociación de los dominios variables de las cadenas pesadas y de las cadena ligeras respectivas.
Como se ha usado en esta memoria descriptiva, el término multivalente significa más de un sitio de unión a antígenos.
Preferiblemente el primer polipéptido comprende tres dominios variables de una cadena pesada del anticuerpos y el segundo polipéptido comprende tres dominios variables de una cadena ligera del anticuerpo, proporcionando una proteína trivalente.
Se apreciará que los polipéptidos pueden comprender cadenas pesadas o ligeras, dominios variables, según sea apropiado, o equivalentes funcionales de los mismos.
Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras respectivas se pueden enlazar adecuadamente sin que intervenga ningún engarce. Sin embargo, según una realización preferida, los dominios variables contenidos en los polipéptidos individuales están unidos mediante engarces peptídicos. Preferiblemente el engarce peptídico es flexible, que permiten que los dominios variables se flexionen en relación uno a al otro de manera que se puedan unir a determinantes antigénicos múltiples simultáneamente. Se apreciará que la unión del engarce a los dominios variables de las cadenas pesadas o ligeras individuales será tal que no afecte la capacidad de unión del sitio de unión formado por el par de dominios variables asociados. Convenientemente el engarce peptídico comprende entre 16 y 19 residuos de aminoácidos. Un engarce peptídico preferido para los dominios de las cadenas pesadas es (Gly_{4}Ser)_{3}AlaGySerAla y para los dominios de las cadenas ligeras (Gly_{4}Ser)_{3}Val.
Se apreciará que si dos o más de los pares de dominios variables asociados (pares V_{H}/V_{L}) tienen la misma especificidad antigénica, por ejemplo si se derivan del mismo anticuerpo precursor o fragmento del mismo de diferentes anticuerpos que se unen al mismo epítopo, entonces se producirá una proteína de unión que se une a más de una molécula del mismo tipo.
Según una realización, donde la proteína de unión según la invención comprende tres sitios de unión a antígenos que son capaces de unirse a diferentes epítopos entre sí, se produce una proteína triespecífica trivalente.
En otra realización, donde la proteína de unión según la invención comprende tres sitios de unión de pares de dominios variables asociados, dos de dichos sitios se unen a los mismos epítopos, se proporciona una proteína trivalente, biespecífica. Cuando los tres sitios de unión tienen la misma especificidad antigénica, se proporciona una proteína de unión monoespecífica.
La invención también proporciona secuencias de nucleótidos que codifican la proteína multivalente de unión a anticuerpos según la invención y la clonación y los vectores de expresión de contienen tales secuencias de nucleótidos.
La invención también proporciona células huéspedes transformadas con vectores que contienen tales secuencias de nucleótidos y procedimientos de producción de tales polipéptidos mediante la expresión de las secuencias de nucleótidos en tales huéspedes.
La invención además proporciona un procedimiento para preparar una proteína multivalente de unión a antígenos como se ha expuesto anteriormente comprende:
(i)
transformar uno o más huéspedes mediante la incorporación de genes que codifican dicho primer y segundo polipéptidos;
(ii)
expresar dichos genes en dicho huésped o huéspedes;
(iii)
permitir que dicho primer y segundo polipéptidos para combinar y para formar la proteína de unión a antígenos.
De una manera adecuada el huésped o huéspedes se pueden seleccionar de bacterias procarióticas, tales como bacterias Gram - negativas por ejemplo E. coli, y bacterias Gram - positivas, por ejemplo B. subtilis o bacterias del ácido láctico, eucariotas inferiores tales como levaduras, por ejemplo pertenecientes al género Saccharomyces, Kluyveromyces o Trichoderma, hongos tales como los pertenecientes a género Aspergillus y Neurospora y eucariotas superiores, tales como plantas, por ejemplo tabaco, y células de animales, ejemplos de los cuales son células de mieloma y CHO, células C0S y células de insectos. Un huésped particularmente preferido para uso en conexión con la presente invención son las células C0S (riñón de mono).
Las técnicas para sintetizar genes, incorporándolos en huéspedes y expresando genes en huéspedes se conocen bien en la técnica y los expertos en la técnica serían capaces fácilmente de poner la invención en efecto usando el conocimiento general común. Las proteínas según la invención se pueden recuperar y purificar usando técnicas convencionales tales como cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de filtración sobre gel.
La actividad de las proteínas multivalentes de unión según la invención se pueden medir convenientemente mediante técnicas habituales conocidas en la técnica tales como ensayo inmunosorbente unido a enzimas (ELISA), ensayo radioinmune (RIA) o mediante el uso de biosensores.
Las proteínas multivalentes de unión a antígenos de la presente invención se pueden usar adecuadamente en diagnósticos o terapia por ejemplo en la dirección de una célula tumoral con células asesinas y agente citotóxico. Otros usos para los cuales las proteínas de unión multivalentes según la invención son útiles incluyen aquellos usos para los que se usan comúnmente anticuerpos o fragmentos de los mismos, incluyendo para inmunoensayos y en purificación. Según una realización particular preferida, complejos multienzimáticos se pueden ensamblar, en una diana, por ejemplo una superficie celular. Como una ilustración, proteínas de unión multivalentes según la invención se pueden usar para dirigir enzimas que destruyen células tales como una oxidasa (por ejemplo glucosaoxidasa) y peroxidasa (por ejemplo peroxidasa de rábano rusticano) a una especie diana que es un componente antigénico de la placa dental, tales como S. sanguis o S. mutans. Los complejos que comprenden enzima, coenzima y antígeno diana también se pueden ensamblar convenientemente.
De acuerdo con lo anterior, la invención también proporciona composiciones que comprenden las proteínas multivalentes de unión a antígenos según la invención, convenientemente en combinación con un vehículo, diluyente o excipiente cosmética o farmacéuticamente aceptable. También se proporcionan los procedimientos de tratamientos que usan las proteínas de unión a antígenos multivalentes según la invención.
Para uso en diagnosis o terapia, las proteínas multivalentes de unión a antígenos según la invención se pueden unir convenientemente a un agente apropiado diagnóstica o terapéuticamente eficaz mediante procedimientos convencionales en la técnica.
Una ventaja de usar las proteínas de unión a antígenos multivalentes según la invención en proteínas de unión multivalentes preparadas mediante técnicas existentes conocidas en la técnica es que la asociación "autoensambladora" de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras respectivas para formar sitios de unión multivalentes evita la necesidad de las etapas de acoplamiento químico o la introducción de residuos de unión para estabilizar las construcciones multivalentes, por lo tanto minimizan el riesgo de provocar una respuesta inmune a dichas moléculas cuando se usan en terapia las proteínas de unión multivalentes resultantes.
Una ventaja particular de las moléculas según la presente invención es que se pueden purificar convenientemente directamente del sobrenadante usando técnicas de purificación convencionales. Ya que son autoensambladoras, no hay necesidad de purificar las subunidades individuales antes de acoplarse según en las técnicas existentes.
La presente invención se puede entender más completamente con referencia a la siguiente descripción, cuando se lee junto con los dibujos acompañantes.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A y 1B muestran representaciones esquemáticas de las disposiciones publicadas de los fragmentos génicos de los dominios V de las cadenas pesadas y ligeras que se han sugerido que producen fragmentos de anticuerpos triespecíficos o trivalentes:
A) scFv1 - VLa + scFv2 - Vha (2 cadenas) WO 94/09131
B) Fab1 - VLa + Fab - Vha (4 cadenas) WO 94/09131
C) scFv1 - VLa - CLa + scFv1 - Vha - CHa (2 cadenas) WO 94/09131
D) Fab1 - VLa - CLa + Fab2 - Vha - CHa (4 cadenas) WO 94/09131
E) scFv1 + csFv2 + scFv3 (3 cadenas) WO 93/11161
F) VH1 - VL2 + VH2 - VL3 + VH3 - VH1 (3 cadenas) WO 93/11161
La figura 2A/B muestra la secuencia de nucleótidos de la inserción EcoRI - HindIII de pGOSA.E2t que contiene DNA que codifica guía de pelB - VH4715 - engarce - VL3418 y DNA que codifica guía de pelB - VL3418 - engarce - VH4715 - hidrófilo 2 diana (SEC ID Nº: 1).
La Figura 3
A) muestra la secuencia de nucleótidos de la inserción HindIII - EcoRI del plásmido scFv. Lys con DNA que codifica guía de pelB - VHLys - engarce - VLLys - engarce - VLLys (SEC ID Nº: 2).
B) muestra la secuencia de nucleótidos de la inserción HindIII - EcoRI del plásmido scFv.4715.2t con el DNA que codifica guía de pelB - VH4715.2t (SEC ID Nº: 3).
La figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos de la secuencia guía genómica del anticuerpo anti-NP (Jones y col, Nature, 321, 522). Las secuencias de los exones se indican con cajas sombreadas. Los sitios de restricción NcoI y PstI están en negrita y subrayados (SEC ID Nº: 4).
La figura 5 proporciona una representación esquemática del vector de expresión eucariótico pSV.51.
La figura 6 proporciona una visión general de las construcciones de cabeza doble (A) y cabeza triple (B) de pUC19. Se indican las posiciones de los nucleótidos y los sitios de restricción usados para ensamblar construcciones de pUC de doble cabeza y triple cabeza.
Figura 7
A) muestra el origen del VH - C - engarce y de los fragmentos de VH - C - engarce.
B) proporciona una representación esquemática de la construcción de los vectores pU.19 - cabeza triple.
La Figura 8
A) proporciona una representación esquemática de la construcción de los vectores Euka.VH y Euka.VL.
B) proporciona una representación esquemática de la construcción de los vectores de expresión pSV.VH.
C) proporciona una representación esquemática de la construcción de los vectores de expresión pSV.VL.
La figura 9 muestra la expresión de las proteínas de Golysan triespecíficas y un gel de SDS - PAGE que contiene sobrenadante del cultivo total de COS. Los sobrenadantes brutos de las células COS transfectados con vectores de expresión pSV se separaron sobre geles SDS - PAGE. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y los VH3 y VL3 - 2t se detectaron usando anticuerpos monoclonales específicos diana anti - VH y anti - hidrófilo 2 respectivamente. (A = anti - Hydro - II, B = anti - Hydro - II + anti - VH) Muestras: M) marcadores de pesos moleculares bajos, 1) pSV.K + pSV.V,2) pSV.K + pSV.W,3) pSV.M + pSV.V,4) pSV.M + pSV.W.
La figura 10 muestra los resultados de tres ELISA. La actividad de unión a Lisozima, glucosaoxidasa y S. sanguis se determinó en sobrenadantes de COS brutos midiendo las actividades de unión biespecífica de 1) Lisozima - glucosaoxidasa (= LYSOX), 2) glucosaoxidasa - S. sanguis (= GOSA) y 3) Lisozima - S. sanguis (= LYSAN).
La figura 11 muestra los resultados de tres ELISA. La actividad de unión a Lisozima y S. sanguis de Golysan. A purificado. (A) y Golysan. B (B) se determinó midiendo las actividades de unión biespecífica de 1) Lisozima - glucosaoxidasa (= LYSOX), 2) glucosaoxidasa - S. sanguis (= GOSA) y 3) Lisozima - S. sanguis (= LYSAN).
La figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos de la secuencia de la inserción EcoRI - HindIII de pUR.4124 que contiene DNA (véase la SEC ID Nº: 23) que codifica V_{L}Lys - engarce - V_{H}Lys.
La figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos de la inserción HindIII - EcoRI del plásmido Fv.3418 (véase la SEC ID Nº: 24) que contiene DNA que codifica guía de pelB - V_{H}3418 y guía de pelB - V_{H}3418.
La figura 14 muestra la secuencia de nucleótidos de la inserción HindIII - EcoRI del plásmido Fv.4715 - myc (véase la SEC ID Nº: 25) que contiene DNA que codifica guía de pelB - V_{H}4715 y guía de pelB - V_{H}4715 - Myc diana.
La figura 15 muestra la secuencia de nucleótidos de la inserción HindIII - EcoRI del plásmido Fv.4715 - myc que contiene DNA (véase la SEC ID Nº: 26) que codifica guía de pelB - V_{H}4715 y guía de pelB - V_{H}4715 - Myc diana.
La figura 16a/b muestra la secuencia de nucleótidos de la inserción HindIII - EcoRI de pGOSA.E (véase la SEC ID Nº: 27) que contiene DNA que codifica guía de pelB - V_{H}4715 - engarce - V_{L}3418 y guía de pelB - V_{L}3418 - 
\hbox{engarce -}
V_{H}4715.
La figura 16c proporciona una visión general de los oligonucleótidos y sus posiciones en pGOSA.E que se pueden usar para reemplazar los fragmentos génicos de los dominios V.
La figura 17 muestra la construcción del plásmido pGOSA.A.
La figura 18 muestra la construcción del plásmido pGOSA.B.
La figura 19 muestra la construcción del plásmido pGOSA.C.
La figura 20 muestra la construcción del plásmido pGOSA.D.
La figura 21 muestra la construcción del plásmido pGOSA.E.
La figura 22 muestra la fuente del fragmento PCR. I BstEII/SacI.
La figura 23 muestra la fuente del fragmento PCR. IV XhoI/EcoRI.
La figura 24 muestra la fuente del fragmento PCR. V SalI/EcoRI.
La figura 25 muestra la fuente del fragmento PCR. III NheI/SacI.
La figura 26 muestra la fuente del fragmento PCR. II SfiI/EcoRI.
La tabla 1 muestra la secuencia de nucleótidos de todos los oligonucleótidos usados en la construcción de las construcciones de doble y triple cabeza.
La tabla 2 enumera todas las construcciones de la expresión pSV descritas en esta memoria descriptiva.
Los siguientes ejemplos se proporcionan como forma de ilustración solamente.
Ejemplos
Experimental general
Cepas, plásmidos y medios
Todas las etapas de clonación se realizaron en E. coli JM109 o E. coli XL-1 azul. Los cultivos se desarrollaron en medio 2xTY/Amp/Glucosa (16 g tristona, 10 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl por litro de H_{2}O suplementado con glucosa al 2% y 100 \mug/ml de ampicilina). Las transformaciones se sembraron sobres placas de SOBAG (20 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 15 g de agar, 0,5 g de NaCl por litro de H_{2}O más MgCl_{2} 10 mM, glucosa al 2%, 100 \mug/ml de ampicilina). Los vectores de E. coli bicistrónicos usados se derivan de pUC19. El vector de expresión de COS pSV.51 (cepa LMBP nº 1829) se obtuvo de la colección de cultivos LMBP (Laboratorio de Biología molecular de la Universidad de Gent.). Células COS - 1 (ECACC Nº: 88031701; células de riñón de mono verde africano) se obtuvieron a partir de la colección europea de cultivos de células animales (abreviadamente en inglés ECACC). Todos los reactivos de cultivos de tejidos eran de Gibco BRL (Life Technologies, Paisley, Reino Unido).
Manipulaciones de DNA Oligonucleótidos y PCR
Los cebadores de oligonucleótidos usados en las reacciones de PCR se sintetizaron en un sintetizador de DNA 381A de Applied Biosystems mediante el procedimiento de fosforamidita. Las estructuras primarias de los cebadores de oligonucleótidos usados en la construcción de las construcciones pSV triespecíficas (tabla 2) se muestran en la tabla 1. La mezcla de reacción usada para la amplificación de fragmentos de DNA fueron Tris - HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 2,5 mM, KCl 50 mM, gelatina al 0,01% (p/v), Tritón X-100 al 0,1%, 400 mM de cada dNTP, 5,0 unidades de Vent DNApolimerasa (New England Biolabs), 100 ng de DNA moldeado, y 500 ng de cada cebador (para reacciones de 100 \mul). Las condiciones de reacción fueron: 94ºC durante 4 minutos, seguido de 33 ciclos cada uno de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC, y 1 minuto a 72ºC.
Preparación de DNA de plásmidos/vectores/inserciones y ligación/transformación
El DNA de plásmidos se preparó usando el sistema "preparación de DNA Qiagen P-100 y P-500 Midi/Maxi". Los vectores e inserciones se prepararon mediante digestión de 10 \mug (para preparación de vectores) o 20 \mug (para preparación de inserciones) con las endonucleasas de restricción especificadas en condiciones apropiadas (tampones y temperaturas según se especifica por los proveedores). Reacciones de sustitución de Klenow y desfosforilación con la fosforilasa de intestino de ternera se realizaron según las instrucciones de los fabricantes. Los DNA de los vectores e inserciones de separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron con membranas de DEAE NA45 (Schleicher y Schnell) como han descrito Maniatis y col., (Molecular cloning: a Laboratory manual, Cold Spring Harbour, N. Y. (1982)). Las ligaciones se realizaron en volúmenes de 20 \mug que contenían Tris - HCl 30 mM, pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, 300 - 400 ng de DNA de vectores, 100 - 200 ng de DNA de inserción y 1 unidad Weiss de ligasa de DNA de T_{4}. Después de la ligación durante 2 - 4 horas a temperatura ambiente, CaCl_{2} E. coli JM109 competente o azul XL-1 (Maniatis y col) se transformaron usando 7,5 \mul de reacción de ligación. Las mezclas de transformación se sembraron en placas SOBAG y se desarrollaron durante una noche a 37ºC. Los clones corregidos se identificaron mediante análisis de restricción y se verificaron mediante secuenciación didesoxi automática (Applieed Biosystems).
Digestión por restricción de productos de PCR
Después de la amplificación cada reacción se comprobó por la presencia de una banda del tamaño apropiado mediante electroforesis en gel de agarosa. Una o dos de mezclas de reacción de PCR de 100 \mul de cada una de las reacciones de PCR, conteniendo juntas aproximadamente 2 - 4 \mug de producto de DNA se sometieron a extracción con fenol - cloroformo, la extracción con cloroformo y precipitación con etanol. Los sedimentos de DNA se lavaron dos vecescon 70% de etanol y se dejaron secar. A continuación, los productos de PCR se digirieron durante una noche (18 h) en 200 \mul de 1 x de tampón en exceso de la enzima de restricción apropiada.
Transformación de células COS
Células Cos - 1 se mantuvieron en medio de cultivo DMEM con glutamina (2 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) que contenía F. C. S. al 10%. Para ensayos de transfección transitoria 1 - 3 x 10^{5} células COS se sembraron en discos de cultivos de tejidos de 3 cm de diámetro (2 ml). Las células se incubaron a 37ºC en un incubador con CO_{2} hasta que las células fueron confluentes al 50 - 80% (durante una noche). Para cada transfección se prepararon las siguientes mezclas: A) 1 \mug de cada uno de los DNA especificados en 100 \mul de medio de suero reducido con Opti-MEM-I, B) 1 \mul de LipofectiAmina en 100 \mul de medio de suero reducido con Opti-MEM-I. Las mezclas A y B se combinaron (suavemente). Después de dejar que los complejos DNA - liposomas se formen durante 30 - 45 minutos a temperatura ambiente, 0,8 ml de medio de suero reducido con Opti-MEM-I se añadieron a cada tubo que contenía complejo lípidos - DNA. Las células COS - 1 se lavaron una vez con 2 ml de medio de suero reducido con Opti-MEM-I y se cubrieron con la solución de complejos diluidos. Las células COS - 1 se incubaron durante 5 horas a 37ºC. Después de la incubación, se añadieron 2 ml de medio de crecimiento. 20 horas después de la transfección el medio se reemplazó con 2 ml de medio de crecimiento reciente que contenía butirato de sodio 0,1 mM. Después de 48 horas de incubación a 37ºC el sobrenadante se recogió y se ensayó para la presencia de fragmentos de
anticuerpos.
ELISA A) GOSA: actividad de la glucosaoxidasa y unión a S. sanguis
Placas ELISA de 96 pocillos (placas HC Greiner) se activaron durante una noche a 37ºC con 200 \mul/pocillo de una dilución 1/10 de un cultivo durante una noche de células de Streptococcus sanguis en tampón carbonato sódico 0,05 M pH 9,5 se usó para sensibilizar cada pocillo. Después de un lavado con PBST, las placas sensibilizadas con antígeno se prebloqueron durante 1 hora a 37ºC con 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo (BSA al 1%, Tween al 0,15% en PBS). 50 \mul de sobrenadantes de cultivo de COS (puros o diluidos con PBS) más 50 \mul de tampón de bloqueo que contenía glucosaoxidasa (50 \mug/ml) se añadieron a la placa sensibilizada por Streptococcus sanguis y se incubó durante 2 horas a 37ºC. Después de 4 lavados con PBS-T, se detectó la glucosaoxidasa unida mediante la adición de 100 \mul de sustrato a cada pocillo (citrato sódico 70 mM, fosfato sódico 320 nm, 27 mg/ml de glucosa, 0,5 \mug/ml de HRP, 100 \mug/ml de TMB). La reacción de color se detuvo después de una hora mediante la adición de 35 \mul de HCl 2 M y se midió la A450.
B) LYSOX: actividad de unión a lisozima y glucosaoxidasa
Placas ELISA de 96 pocillos (placas HC Greiner) se activaron durante una noche a 37ºC con lisozima (50 \mug/ml en tampón carbonato sódico 0,05 M pH 9,5; 200 \mul/pocillo). Después de un lavado con PBST, las placas sensibilizadas con antígeno se prebloqueron durante 1 hora a 37ºC con 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo (BSA al 1%, Tween al 0,15% en PBS). 50 \mul de sobrenadantes de cultivo de COS (puros o diluidos con PBS) más 50 \mul de tampón de bloqueo que contenía glucosaoxidasa (50 \mug/ml) se añadieron a la placa sensibilizada por Streptococcus sanguis y se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Después de 4 lavados con PBS-T, se detectó la glucosaoxidasa unida mediante la adición de 100 \mul de sustrato a cada pocillo (citrato sódico 70 mM, fosfato sódico 320 nm, 27 mg/ml de glucosa, 0,5 \mug/ml de HRP, 100 \mug/ml de TMB). La reacción de color se detuvo después de una hora mediante la adición de 35 \mul de HCl 2 M y se midió la A450.
C) LYSAN: actividad de unión a S. sanguis y lisozima
Placas ELISA de 96 pocillos (placas HC Greiner) se activaron durante una noche a 37ºC con 200 \mul/pocillo de una dilución 1/10 de un cultivo durante una noche de células de Streptococcus sanguis en tampón carbonato sódico 0,05 M pH 9,5 y se usó para sensibilizar cada pocillo. Después de un lavado con PBST, las placas sensibilizadas con antígeno se prebloqueron durante 1 hora a 37ºC con 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo (BSA al 1%, Tween al 0,15% en PBS). 50 \mul de sobrenadantes de cultivo de COS (puros o diluidos con PBS) más 50 \mul de tampón de bloqueo que contenía glucosaoxidasa (50 \mug/ml) se añadieron a la placa sensibilizada por Streptococcus sanguis y se incubó durante 2 horas a 37ºC. Después de 4 lavados con PBS-T, 50 \mul de tampón de bloqueo que contenía fosfata alcalina conjugada a lisozima (100 \mug/ml). La lisozima no unida se retiró después de 4 lavados con PBS-T. La lisozima unida se detectó mediante la adición de 100 \mul de sustrato a cada pocillo (1 mg/ml de pNNP en dietanolamina 1 M, MgCl_{2} 1mM). Después de una hora se midió la A450.
Ejemplo 1 Construcción de los vectores de expresión de pSV.Golysan
La construcción de los vectores de expresión pSV COS consistió en tres fases:
1A): ensamblar 2 dominios variables de cadenas pesadas en un vector de expresión de E. Coli basado en pUC por lo tanto construyendo los módulos VH_{A} - VH_{B} y VL_{A} - VL_{B} respectivamente.
1B) ensamblar de 3 dominios variables de cadenas pesadas y 3 dominios variables de cadenas ligeras en un vector de expresión de E. coli basado en pUC por lo tanto construyendo los módulos VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} y VL_{A} - VL_{B} - VL_{C} respectivamente.
2) unir los VH_{A} - VH_{B},VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} y VL_{A} - VL_{B}, VL_{A} - VL_{B} - VL_{C} a la secuencia guía anti - NP genómica en los vectores "EUKA" intermedios para asegurar la secreción eficiente de células COS.
3) insertar los guía - VH_{A} - VH_{B}, guía - VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} y guía - VL_{A} - VL_{B}, guía - VL_{A} - VL_{B} - VL_{C} como fragmentos hacia abajo XbaI/XbaI del promotor SV40 en el vector de expresión de COS pSV.51.
ad. 1) Vectores de expresión de E. coli
Los vectores de expresión de E. coli se derivan de pUC.19 que contienen un fragmento HindII-EcoRI que en el caso del scFv.lys.myc contiene una secuencia señal de pelB condensada al extremo 5' del dominio V de cadenas pesadas que se une directamente al dominio V de las cadenas ligeras correspondientes al anticuerpo mediante una secuencia de conexión que codifica un péptido flexible (Gly_{4}Ser)_{3} generando por lo tanto una molécula de una cadena. En el vector de expresión de "doble cabeza" tanto en los dominios V de cadenas pesadas como en las cadenas ligeras del anticuerpo está precedido de un sitio de unión a ribosomas y de una secuencia señal de pelB en el operón dicistrónico artificial bajo el control de un promotor individual inducible. La expresión de estas construcciones se dirige mediante el promotor lacZ inducible. La secuencia de nucleótidos de las inserciones HindIII - EcoRI de las construcciones scFv.lys-myc, scFv.4715.2t y pGOSA.E2t usadas para la generación de los fragmentos de anticuerpos triespecíficos se enumeran en las figuras 3 y 2 respectivamente.
ad. 1A) Ensamblaje de fragmentos biespecíficos o de cabezas dobles
La construcción pGOSA.E2t (figuras 2 y 6A) se deriva de la construcción de expresión de E. coli pGOSA.E. La construcción de pGOSA.E se ha descrito en detalle en la preparación 1 más adelante.
En contraste con pGOSA.E, pGOSA.E2t contiene una diana de péptidos en el extremo C de la cadena ligera variable. Usando los oligonucleótidos DBL3 y DBL.4 el fragmento génico VL4715 se amplificó usando scFv.4715.t como un molde. El fragmento de PCR SalI/BamHI VH4715.2t y la diana hidrófilo-2 que contiene el fragmento BamHI/EcoRI de scFv.4715.2t (figura 3B) se usaron para reemplazar el fragmento SalI/EcoRI VH4715 en pGOSA.E produciendo por lo tanto pGOSA.E2t.
El vector pGOSA.E2t y los oligonucleótidos en la tabla 1 se ha diseñado para permitir que la mayoría de las especificidades se clonen en la construcción pGOSA.E2t (figura 6A). El dominio V_{H} hacia arriba se puede reemplazar mediante cualquier fragmento génico de V_{H} PstI-BstEII obtenido con oligonucleótidos PCR.51 y PCR.89. Los oligonucleótidos DBL.1 y DBL.2 se diseñaron para introducir los sitios de restricción SfiI y NheI en los fragmentos génicos V_{H} por lo tanto permitiendo la clonación de los fragmentos génicos de V_{H} en los sitios SfiI - NheI como el dominio de V_{H} hacia abajo. Usando este planteamiento se construyeron las siguientes combinaciones de VH_{A} - VH_{B}: 
\hbox{VH4715 -}
VH3418, VH4715 - VHlys, VH3418 - VHlys, VHlys - VH3418.
Todos los fragmentos génicos de V_{L} obtenidos con los oligonucleótidos PCR.116 y PCR.90 se pueden clonar en la posición del fragmento génico de V_{L} 3418 como un fragmento SacI-XhoI. Sin embargo una complicación aquí es la presencia de un sitio SacI interno en el fragmento génico 3418 V_{H}. Los oligonucleótidos DBL.3 y DBL.4 se diseñan para permitir la clonación de los fragmentos génicos de V_{L} en la posición del fragmento génico 4715 V_{L} como un fragmento SalI - BamHI. Sin embargo una complicación aquí es la presencia de un sitio BamHI interno en el fragmento génico hidrófilo 2 - diana. Usando este planteamiento se construyeron las siguientes combinaciones de VL_{A} - VL_{B}: VL3418 - VL4715.2t, VLlys - VL4715.2t y VLlys - VL3418.2t.
ad. 1B) Ensamblaje de fragmentos triespecíficos o de cabezas triples
La amplificación de los fragmentos VH - engarce usando bien scFv (VH-engarce-VL) o construcciones biespecíficas (VH-engarce-VH) como molde con la combinación de cebadores DBL.1/DBL.5 (figura 7A) produce uno de los bloques de construcción para la construcción de los módulos VH_{A} - VH_{B} - VH_{C}. El fragmento de PCR VH - engarce DBL.1/DBL.5 se digiere con SfiI y se inserta en el sitio SfiI que está presente entre la secuencia de engarce y el dominio de VH hacia abajo en todas las construcciones biespecíficas (figura 7B) produciendo por lo tanto un módulo 
\hbox{VH _{A}  -}
VH_{B} - VH_{C}. Usando este planteamiento las siguientes combinaciones de VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} se construyeron para esta catalogación: VH4715 - VHlys - VH3418 y VHlys - VH4715 VH3418.
Usando una construcción biespecífica (VL - engarce - VL) como molde en una reacción de amplificación con la combinación de cebadores DBL.3/DBL.6 (figura 7A) produce el bloque de construcción VL - engarce para la construcción de los módulos VL_{A} - VL_{B} - VL_{C}. El fragmento VL - engarce DBL.3/DBL.6 se digiere con SalI y se inserta en el sitio SalI que está presente entre la secuencia del engarce y el dominio de VL hacia abajo en todas las construcciones biespecíficas (figura 7B) por lo tanto produciendo un módulo VL_{A} - VL_{B} - VL_{C}. Usando este planteamiento se construyeron las siguientes combinaciones de VL_{A} - VL_{B} - VL_{C}: VLlys - VL4715 - VL3418.2t y VL3418 - VLlys - VL4715-2t.
Una representación esquemática de las construcciones triespecíficas se muestra en la figura 6B.
ad. 2) Unión de los dominios de las regiones variables a la secuencia guía
El poliengarce HindIII/EcoRI de pUC19 se reemplazó con un poliengarce sintético EcoRI/HindIII "Euka". Esto se logró mediante hibridación de ácidos nucleicos e inserción de los oligonucleótidos sintéticos Euka.1 y Euka.2 (tabla 1) en el vector pUC19 digerido con EcoRI/HindIII. El vector Euka.pUC resultante contienen todos los sitios de restricción necesarios para la subclonación de la secuencia guía y los dominios VH y VL. Los fragmentos de la secuencia guía anti-NP genómica NcoI/PstI se clonaron en el vector Euka.pUC digeridos con NcoI/PstI (figura 8 A).
Los oligonucleótidos ML.1 y Ml.2 (tabla 1) se usaron en una reacción de amplificación para introducir un sitio SacI en el extremo 3' de la secuencia guía que permite la construcción de las fusiones guía - VL. El fragmento de PCR de la secuencia guía de NcoI/SacI se insertó en el vector Euka.pUC digerido con NcoI/SacI produciendo la construcción Euka.VL (figura 8 A).
Los módulos VH_{A} - VH_{B} y VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} se eliminaron de los vectores de expresión pUC como fragmentos PstI/Nhe y se insertaron en el vector Euka.VH digerido con PstI/NheI (figura 8 B). Usando este planteamiento se construyeron las siguientes combinaciones guía - VH_{A} - VH_{B} y guía - VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} - VH_{B} para esta catalogación: Euka.B: guía - VH4715 - VH3418, Euka.D: guía - VH4715 - VHlys, Euka.G: guía - VH3418 - VHlys, Euka.K: guía - VH4715 - VHlys - VH3418 y Euka.M: guía - VHlys - VH4715 - VH3418.
Los módulos VL_{A} - VL_{B} y VL_{A} - VL_{B} - VL_{C} se eliminaron de los vectores de expresión como fragmentos 
\hbox{EcoRI -}
Klenow/SacI y se insertaron en el vector Euka.VL tratado con NotI - Klenow/SacI (figura 8 C). Usando este planteamiento se construyeron las siguientes combinaciones guía - VL_{A} - VL_{B} y guía - VL_{A} - VL_{B} - VL_{C}: Euka.N: guía - VL3418 - VH4715.2t, Euka.P: guía - VHlys - VL4715.2t, Euka.S: guía - VHlys - VL3418.2t, Euka.V: guía - VLlys - VL4715 - VL3418.2t y Euka.W: guía - VL3418 - VLlys - VL4715.2t. ad. 3) Subclonación de las fusiones de los dominios guías - variables en el vector de expresión pSV.51
Todas las combinaciones guía - VH_{A} - VH_{B}, guía - VH_{A} - VH_{B} - VH_{C}, guía - VL_{A} - VL_{B} y guía - VL_{A} - VL_{B} - VL_{C}, se eliminaron de los vectores "Euka" como fragmentos de XbaI/XbaI y se subclonaron hacia abajo del promotor SV40 en pSV.51 (figura 5) mediante la inserción en el sitio XbaI (figura 8 B y 8 C). Después de la confirmación de la orientación correcta de las inserciones los vectores de expresión pSV se usaron para transfectar células COS - 1 (véase el ejemplo 2). Los vectores de expresión pSV usados se enumeran en la tabla 2.
Ejemplo 2 Actividad de unión bifuncional de las cabezas triples de Golysan
Este ejemplo describe la producción de tres tipos de actividad de unión biespecífica mediante células COS - 1 transfectadas con plásmidos de expresión que codifican los fragmentos génicos VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} y VL_{A} - VL_{B} - VL_{C}.
1. Producción de fragmentos de anticuerpos de células COS - 1
Los sobrenadantes de las células COS - 1 transfectadas con combinaciones de pSV - VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} y plásmidos de pSV - VL_{A} - VL_{B} - VL_{C} se separaron sobre SDS - PAGE al 10% y se transfectaron en nitrocelulosa. Las transferencias de Western se seleccionaron con anticuerpos monoclonales que reconocían una secuencia de péptidos en el marco conservado 4 de los dominios VH (región codificada por PCR.89: conservada n todos los dominios VH usados, {reactivo interno}) y/o un específico monoclonal para la diana hidrófila - 2. Como se muestra en la figura 9 todos los sobrenadantes contenían productos con el peso molecular esperado de los fragmentos VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} y VL_{A} - VL_{B} - VL_{C}, indicando que las células COS se transfectaron con éxito y estaban secretando los fragmentos de anticuerpos producidos en el medio de cultivo a niveles detectables.
2. Actividad de unión bifuncional
Los sobrenadantes de las células COS - 1 transfectadas con plásmidos de expresión pSV individuales y las combinaciones de los plásmidos de expresión pSV se ensayaron para la producción de actividad de unión bifuncional usando el formato ELISA:
* Los sobrenadantes de células COS - 1 transfectadas con los controles positivos biespecíficos "LYSAN" 
\hbox{(pSV.D +}
pSV.P), "LYSOX" (pSV.G + pSV.S) y "GOSA" (pSV.B + pSV.N) solamente produjeron actividad biespecífica de LISAN, LYSOX y GOSA respectivamente (figura 10). No se detectó ninguna reactividad cruzada significativa.
* Los sobrenadantes de células COS - 1 transfectadas con solamente un vector que codifica bien uno de los fragmentos VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} (pSV.K y pSV.M), o uno de los fragmentos VL_{A} - VL_{B} - VL_{C}, (pSV.V y pSV.W) no mostraron ninguna actividad de unión biespecífica, indicando que no se produce ninguna unión de fondo o una actividad de unión específica.
* Todos los sobrenadantes ensayados de las células COS - 1 transfectadas con un vector de expresión que codifica uno de los fragmentos VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} (pSV.K y pSV.M) y un vector de expresión que codifica uno de los fragmentos VL_{A} - VL_{B} - VL_{C}, (pSV.V y pSV.W) mostraron niveles significativos de las tres actividades de unión bifuncional LYSOX, GOSA y LYSAN.
Estos resultados muestran que las células COS transfectadas con los vectores de expresión que codifican VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} y los vectores de expresión que codifican los fragmentos VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} producen y secretan moléculas que contienen tres actividades de unión. En este ejemplo las tres actividades son: unión a la glucosaoxidasa, unión a S. sanguis y unión a lisozima. Además, los resultados ilustrados en la figura 10 muestran claramente que al menos dos de estas actividades de unión están presentes en un complejo molecular autoensamblador. En este ejemplo aquellas combinaciones son: GOSA (glucosaoxidasa + S. sanguis), LYSOX (lisozima + glucosaoxidasa) y LYSAN 
\hbox{(lisozima +}
S. sanguis). Ejemplo 3 Actividad de unión trifuncional de cabezas triples de Golysan
Este ejemplo describe experimentos que muestran que los tres tipos de actividad de unión biespecífica que se producen mediante células COS - 1 transfectadas con plásmidos de expresión que codifican los correspondientes fragmentos de genes VH_{A} - VH_{B} - VH_{C} y VL_{A} - VL_{B} - VL_{C} están presentes en un complejo molecular autoensamblador.
Golysan. A (VHlys - VH4715 - VH3418 + VLlys - VL4715 - VL3418.2t) y Golysan. B (VHlys - VH4715 - VH3418 + VL3418 - VLlys - VL4715.2t) se purificó mediante cromatografía de afinidad. 100 ml de sobrenadante de células COS - 1 transfectadas con plásmidos de expresión pSV.M/pSV.V (Golysan.A) o pSV.M/pSV.W (Golysan.B) se cargaron en una columna de Lisozima - Sefarosa (CNBr - Sepharose, Pharmacia; la columna se preparó según las instrucciones del fabricante). Después de lavados extensivos con PBS los fragmentos de los anticuerpos de Golysan unidos se eluyeron en tampón glicina 0,1 M a pH 2,2. Las fracciones se neutralizaron con Tris y se ensayaron para la presencia de actividad de unión triespecífica.
Como se muestra en la figura 11 no se detectó actividad de unión biespecífica en el paso a través de la columna. Las tres actividades de unión biespecífica (GOSA, LYSOX y LYSAN) se extrajeron del sobrenadante de COS - 1 pasando sobre la matriz de afinidad de lisozima. Después de elución ácida las tres actividades de unión biespecíficas (GOSA, LYSOX y LYSAN) se recuperaron de la columna. Ya que tanto Golysan.A como B se purificaron por afinidad basándose en la capacidad de unión a lisozima, el hallazgo de que estas moléculas también se unen a S. sanguis y a la glucosaoxidasa muestra que las tres actividades de unión están presentes en un complejo molecular autoensamblador.
Preparación 1
Construcción del vector de expresión de cabeza doble pGOSA.E
En los vectores de expresión pGOSA, los fragmentos de DNA que codifican tanto el V_{H} como el V_{L} del anticuerpo están precedidos por un sitio de unión a ribosomas y una secuencia de DNA que codifica la secuencia señal pelB en u operón dicistrónico artificial bajo el control de un solo promotor inducible. La expresión de estas construcciones se dirige por el promotor lacZ inducible. La secuencia de nucleótidos de las inserciones HindIII - EcoRI de los plásmidos pUR.4124 (SEC ID Nº: 23), Fv.3418 (SEC ID Nº: 24), Fv.4715-myc (SEC ID Nº: 25) y scFv.4715-myc (SEC ID Nº:26) construcciones usadas para la generación de fragmentos de anticuerpos biespecíficos se proporcionan en las figuras 12 - 15, respectivamente. Además, un cultivo de células de E. coli que contiene el plásmido scFv.4715-myc y un cultivo de células de E. coli que contiene el plásmido Fv.3418 se depositó bajo el tratado de Budapest en la colección nacional de cultivos tipo (Central Public Health Laboratory) en Londres (Reino Unido) con números de depósito NCTC 12916 y NCTC 12915, respectivamente.
De acuerdo con la regla 28 (4) EPC, o una disposición similar para un estado que no es un estado con contrato de la EPC, se requiere que una muestra de tal depósito, cuando se requiera, solamente se someterá a un experto.
La construcción de pGOSA.E (véase la figura 16 para la inserción HindIII - EcoRI de pUC19) implicó varias etapas de clonación. Los sitios de restricción apropiados en los diversos dominios se introdujeron mediante mutagénesis dirigida por PCR usando los oligonucleótidos enumerados en la tabla 1 más adelante.
La construcción de pGOSA.E implicó diversas etapas de clonación que produjeron 4 construcciones intermedias pGOSA.A a pGOSA.D (véanse las figuras 17 - 21). El vector de expresión final pGOSA.E y los oligonucleótidos en la tabla 1 se han diseñado para permitir que la mayoría de las especificidades se clonen en la construcción final pGOSA.E (figura 16c). El dominio V_{H} hacia arriba se puede reemplazar por cualquier fragmento génico de V_{H} PstI - BstEII obtenido con los oligonucleótidos PCR.51 y PCR.89 (véase la tabla 1). Los oligonucleótidos DBL.1 y DBL.2 (véase la tabla 1) se diseñaron para introducir los sitios de restricción SfiI y NheI en los fragmentos génicos V_{H} permitiendo así la clonación de aquellos fragmentos génicos de V_{H} en los sitios SfiI - NheI en el dominio de V_{H} hacia abajo. Todos los fragmentos génicos V_{H} obtenidos con los oligonucleótidos PCR.116 y PCR.90 (véase la tabla 1) se pueden clonar en la posición del fragmento génico V_{L}.3418 en forma de un fragmento SacI - XhoI. Sin embargo aquí una complicación es la presencia de un sitio interno SacI en el fragmento génico V_{H}.3418. Los oligonucleótidos DBL.3 y DBL.9 (véase la tabla 1) se diseñan para permitir la clonación de los fragmentos génicos V_{L}.4715 en forma de un fragmento SalI - NotI.
pGOSA.A
Este plásmido se deriva tanto de la construcción Fv.4715.myc (SEC ID Nº: 25) como de la construcción scFv.4715-myc (SEC ID Nº. 26). Un sitio de restricción SfiI se introdujo entre las secuencia de DNA que codifica el engarce (Gly_{4}Ser)_{3} y el fragmento génico que codifica el V_{L} de la construcción scFv.4715-myc (véase la figura 17). Esto se lleva a cabo reemplazando el fragmento BstEII - SacI de la última construcción mediante el fragmento PCR-I BstEII/SacI (figura 22) que contiene un sitio SifI entre el DNA que codifica el engarce (Gly_{4}Ser)_{3} y el fragmento génico V_{L}.4715. La introducción del sitio SfiI también introdujo 4 aminoácidos adicionales (AlaGlySerAla) entre el engarce 
\hbox{(Gly _{4} Ser) _{3} }
y V_{L}.4715 dando como resultado un engarce (Gly_{4}Ser)_{3}AlaGlySerAla (engarce A). Los oligonucleótidos usados para producir PCR-I (DBL.5 y DBL.7, véase la tabla 1) se diseñaron para igualar la secuencia de la región del marco conservado - 3 de V_{H}.4715 y para cebar en la unión del DNA que codifica el engarce (Gly_{4}Ser)_{3} y el fragmento génico V_{L}.4715, respectivamente. Así pues pGOSA.A se puede indicar como:
pelB- V_{H}4715-engarceA-(SfiI)-V_{L}.4715-myc.
pGOSA.B
Este plásmido se deriva del plásmido Fv.3418 (véase la figura 18). El fragmento XhoI-EcoI del plásmido Fv.3418 que comprende el extremo 3' del DNA que codifica el marco conservado - 4 del V_{L} que incluye el codón de parada se retiró y se reemplazó por el fragmento PCR-IV HhoI/EcoRI (figura 23). Los oligonucleótidos usados para producir PCR-IV (DBL.8 y DBL.6, véase la tabla 1) se diseñaron para igualar la secuencia en la unión del V_{L} y el engarce (Gly_{4}Ser)_{3} perfectamente (DBL.8); y para permitir cebar en la unión del engarce (Gly_{4}Ser)_{3} y el V_{H} en pUR.4124 (DBL.6). DBL.6 eliminó el sitio PstI en el V_{H} (mutación silenciosa) e introdujo un sitio de restricción SalI en la unión del engarce (Gly_{4}Ser)_{3} y el V_{H}, por lo tanto reemplazando la última Ser del engarce por un residuo Val dando como resultado un engarce (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val (engarce V). Así pues pGOSA.B se puede indicar como:
pelB- V_{H}.3418 + pelB-V_{L}3418-engarceV- (SalI-EcoRI).
pGOSA.C
Este plásmido contiene DNA que codifica V_{H}.4715 unido mediante el engarce (Gly_{4}Ser)_{3}AlaGlySerAla a V_{H}.3418 (véase la figura 19), así pues:
pel- V_{H}4715-engarceA- V_{H}3418.
Esta construcción se obtuvo reemplazando el fragmento SfiI/EcoRI de pGOSA.A que codifica V_{L}.4715 por el fragmento PCR-II SfiI/EcoRI que contiene el gen V_{H}.3418. Los oligonucleótidos usados para producir PCR-II (DBL.1 y DBL.2, véase la tabla 1) se hibridizan en la región del marco conservado - 1 y marco conservado - 4 del gen que codifica V_{H}.3418, respectivamente. DBL.1 se diseñó para eliminar el sitio de restricción PstI (mutación silenciosa) y para introducir un sitio de restricción SfiI hacia arriba del gen V_{H}. DBL.2 destruye el sitio de restricción BstEII en la región del marco conservado - 4 e introduce un sitio de restricción NheI hacia abajo del codón de parada.
pGOSA.D
Este plásmido contiene un operón dicistrónico que comprende el gen V_{H}.3418 y DNA que codifica V_{L}.3418 unido mediante el engarce (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val a V_{L}.4715 (véase la figura 20), así pues:
pelB- V_{H}.3418 + pelB-V_{L}3418-engarceV- V_{L}4715.
Esta construcción se obtuvo digiriendo el plásmido pGOSA.B con SalI/EcoRI e insertando el fragmento 
\hbox{PCR-V}
SalI/EcoRI (figura 24) que contiene el gen V_{L}.4715. Los oligonucleótidos usados para obtener PCR-V (DBL.3 y DBL.9, véase la tabla 1) se diseñaron para igualar la secuencia de las regiones del marco conservado - 1 y del marco conservado - 4 del gen V_{L}.4715, respectivamente. El DBL.3 eliminó el sitio SacI de la región del marco 
\hbox{conservado - 1}
(mutación silenciosa) e introdujo un sitio de restricción SalI hacia arriba del gen V_{L}.4715. El DBL.9 destruyó el sitio de restricción XhoI en la región del marco conservado - 4 del gen V_{L}.4715 (mutación silenciosa) e introdujo un sitio de restricción NotI y un EcoI hacia abajo del codón de parada. pGOSA.E
Este plásmido contiene un operón dicistrónico que comprende DNA que codifica V_{L}.4715 unido mediante el engarce (Gly_{4}Ser)_{3}AlaGlySerAla a V_{H}.3418 unido mediante el engarce (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val a V_{L}.4715 (véase la figura 21), así:
pelB- V_{H}4715-engarceA-V_{L}3418 + pelB-V_{L}3418-engarceV- V_{L}4715.
Ambas unidades translacionales están precedidas por un sitio de unión a ribosomas y DNA que codifica una secuencia guía pelB. Este plásmido se obtuvo mediante una ligación de tres puntos mezclando el vector resultante de pGOSA.D después de la eliminación de la inserción PstI-SacI que codifica V_{H}.3418 con la inserción PstI-NheI pGOSA.C que contiene V_{H}.4715 unido a V_{H}.3418 y el fragmento PCR-III NheISacI (véase la figura 25). El vector restante PstI-SacI pGOSA.D contiene el extremo 5' de la región del marco conservado - 1 de V_{L}.3418 hasta el sitio de restricción PstI y V_{L}.3418 unido mediante el engarce (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val a V_{L}.4715 comenzando a partir del sitio de restricción SacI en V_{L}.3418. La inserción PstI-NheI pGOSA.C contiene V_{H}.4715 unido mediante el engarce 
\hbox{(Gly _{4} Ser) _{3} }
AlaGlySerAla a V_{H}.3418, comenzando a partir del sitio de restricción PstI en la región del marco conservado - 1 en V_{H}.4715. El fragmento NheI-SacI PCR - III proporciona el sitio de unión a ribosomas y el DNA que codifica la secuencia guía pelB para la construcción V_{L}.3418-(Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val- V_{L}.4715. Los oligonucleótidos DBL.10 y PCR.116 (véase la tabla 1) usados para generar PCR-III se diseñaron para igualar la secuencia hacia arriba del sitio de unión a ribosomas de V_{L}.4715 en Fv.4715 e introducir un sitio de restricción NheI (DBL.10), e igualar la región del marco conservado - 4 de V_{L}.3418 (PCR.116).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: UNILEVER PLC
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Blackfriars
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Londres
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): EC4P 4BQ
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: (01234) 222644
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
FAX: (1234) 222633
\vskip0.500000\baselineskip
(I)
TELEX: 82229 UNILAB G
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína multivalente y multiespecífica de unión a antígenos
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 27
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE:
\vskip0.500000\baselineskip
PatentIn REL. nº 1.0, versión nº 1.25 (EPO) (SEC ID Nº: 1 a 18)
\vskip0.500000\baselineskip
PatentIn REL. nº 1.0, versión nº 1.30 (EPO) (SEC ID Nº: 19 a 27).
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1745 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
2
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 894 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 930 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 156 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGTSMAMCT GCAGSAGTCW GG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCCCTTGGCC CC 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACATTGAGC TCACCCAGTC TCCA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTAGATCTC GAGCTTGGTC CC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGGATCCGG CCGGTTCGGC CCAGGTCCAG CTGCAACAGT CAGGA 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 53 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTACATGAAT TCGCTAGCTT ATTATGAGGA GACGGTGACG GTGGTCCCTT GGC 
\hfill
53 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTGGAGTCG ACATCGAACT CACTCAGTCT CCATTCTCC 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGAATTCGGA TCCCCGTTTG ATTTCGAGCT TGGTCC 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGCGCGAGC TCGGCCGAAC CGGCCGATCC GCCACCGCCA GAGCC 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTGTCGAAT TCGTCGACTC CGCCACCGCC AGAGCC 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCTTCTAGA CCACCATGGA AAACTGCAGA GCTCAAAAGC TAGCGCGGCG GCTCTAG 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTAGAG CGGCCGCGCT AGCTTTTGAG CTCTGCAGTT TTCCATGGTG GTCTAGA 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACGGGTGAGC TCGATGTCGG AGTGGACACC TGTGGAGAGA 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAAACAGCT ATGACCATGA TTAC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: 
\hskip0,5cm
/desc = "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: cebador DBL.7
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACCATCTCC AGAGACAATG GCAAG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: 
\hskip0,5cm
/desc = "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: cebador DBL.8
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCAAGCTCG AGATCAAAC GGG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: 
\hskip0,5cm
/desc = "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: cebador DBL.9
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGAAGTGAAT TCGCGGCCGC TTAATTACCGT TTGATTTCGA GCTTGGTCCC 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: 
\hskip0,5cm
/desc = "DNA sintético"
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: cebador DBL.10
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATAAGCTA GCGGAGCTGC ATGCAAATTC TATTTC 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 737 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: 
\hskip0,5cm
/desc = "dominios de cDNA con engarce (s) sintético (s)"
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: inserción EcoRI-HindIII de pUR4124
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 11 . . 730
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "VLlys-GS-VHlys"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 11 . . 334
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "VLlys"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_RNA
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 335 . . 379
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "engarce (Gly4Ser) 3"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 380 . . 727
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "VHlys"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
9
10
100 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 920 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: 
\hskip0,5cm
/desc = "dominios de cDNA con engarce (s) sintético (s)"
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: inserción HindIII - EcoRI Fv.3418
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 36 . . 443
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "pelB-VH3418"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 36 . . 101
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "pectatoliasa"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 102 . . 440
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "VH3418"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 495 . . 884
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "pelP-VL4318"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 495 . . 560
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "pectatoliasa"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 561 . . 881
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "VL3418"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
11
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 999 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: 
\hskip0,5cm
/desc = "dominios de cDNA con engarce (s) sintético (s)"
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: inserción HindIII - EcoRI de Fv.4715-myc
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 40 . . 468
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "pelB-VH4715"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 40 . . 105
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "pectatoliasa"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 106 . . 465
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "VH4715"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 520 . . 963
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "pelP-VL4715-myc"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 520 . . 585
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "pectatoliasa"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 586 . . 927
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "VL4715"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_RNA
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 928 . . 960
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "myc_tag"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
13
14
140 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 924 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: 
\hskip0,5cm
/desc = "dominios de cDNA con engarce (s) sintético (s)"
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: inserción HindIII - EcoRI de scFv.4715-myc
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 40 . . 105
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "pectatolisasa"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 106 . . 465
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "VH4715"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_RNA
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 466 . . 510
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "(Gly4Ser)3-engarce"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 511 . . 852
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "VL4715"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_RNA
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 853 . . 885
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "myc - diana"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 40 . . 888
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "pelB-VH4715-(Gly4Ser)3-VL4715-myc"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
15
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1706 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: 
\hskip0,5cm
/desc = "dominios de cDNA con engarce (s) sintético (s)"
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: inserción HindIII - EcoRI de pGOSA.E
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 40 . . 864
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: 
\hskip0,2cm
/producto = "pelB-VH4715-LiA-VH3418"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 40 . . 105
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "pectatoliasa"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 106 . . 465
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "VH4715"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_RNA
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 466 . . 522
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: 
\hskip0,2cm
/producto = "engarceA-(Gly4Ser)3AlaGlySerAla"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 523 . . 861
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "VH3418"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 913 . . 1689
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: 
\hskip0,2cm
/producto = "pelB-VH3418-LiV-VL4715"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 913 . . 978
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "pectatoliasa"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 979 . . 1299
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "VL3418"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_RNA
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1300 . . 1344
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: 
\hskip0,2cm
/producto = "engarce V (Gly4Ser)2Gly4Val"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1345 . . 1686
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto = "VL4715"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
17
18
19
20

Claims (14)

1. Una proteína multivalente de unión a antígenos que comprende:
un primer polipéptido que comprende, en serie, tres o más dominios variables de una cadena pesada del anticuerpo; y
un segundo polipéptido que comprende, en serie, tres o más dominios variables de una cadena ligera del anticuerpo,
dicho primer y segundo polipéptidos estando unidos por asociación de los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera respectiva, cada par de dominios variables asociados formando un sitio de unión a antígenos.
2. Una proteína según la reivindicación 1 que comprende una proteína trivalente de unión a antígenos.
3. Una proteína según la reivindicación 1 o reivindicación 2 en la que los dominios variables de la cadena pesada del anticuerpo de dicho primer polipéptido están unidos por un engarce peptídico y los dominios variables de la cadena ligera del anticuerpo de dicho segundo polipéptido están unidos por un engarce peptídico.
4. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que los sitios de unión al par de dominios variables asociados son capaces de unirse a epítopos diferentes entre sí.
5. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que los sitios de unión al par de dominios variables asociados son capaces de unirse al mismo epítopo según el otro.
6. La secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos de la proteína de unión a antígenos multivalente de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. Las secuencias de nucleótidos según la reivindicación 6 contenidas en uno o más vectores de expresión.
8. Una célula huésped transformada con un vector según la reivindicación 7, y capaz de la expresión de las secuencias de nucleótidos para producir los polipéptidos de la proteína multivalente de unión a antígenos.
9. Una célula huésped según la reivindicación 8 en la que los polipéptidos sobre la expresión se asocian para formar la proteína multivalente de unión a antígenos.
10. Un procedimiento para preparar una proteína multivalente de unión a antígenos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende:
(i)
transformar uno o más huéspedes mediante la incorporación de genes que codifican dichos primer y segundo polipéptidos;
(ii)
expresar dichos genes y dicho huésped o huéspedes; y
(iii)
permitir que dichos primer y segundo polipéptidos se asocien para formar la proteína.
11. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en medicina.
12. Una composición de diagnóstico o terapéutica que comprende una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
13. Uso de una composición según la reivindicación 12 en la preparación de un agente para uso en diagnosis o terapia.
14. Uso de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un procedimiento de inmunoensayo o para purificación.
ES97916416T 1996-04-04 1997-03-26 Proteina de union a antigeno multivalente y multiespecifica. Expired - Lifetime ES2225961T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP96302412 1996-04-04
EP96302412 1996-04-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2225961T3 true ES2225961T3 (es) 2005-03-16

Family

ID=8224879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES97916416T Expired - Lifetime ES2225961T3 (es) 1996-04-04 1997-03-26 Proteina de union a antigeno multivalente y multiespecifica.

Country Status (8)

Country Link
US (1) US6239259B1 (es)
EP (1) EP0894135B1 (es)
JP (1) JP2000508892A (es)
AU (1) AU2507397A (es)
DE (1) DE69730209T2 (es)
DK (1) DK0894135T3 (es)
ES (1) ES2225961T3 (es)
WO (1) WO1997038102A1 (es)

Families Citing this family (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6027725A (en) 1991-11-25 2000-02-22 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US6670453B2 (en) 1997-10-27 2003-12-30 Unilever Patent Holdings B.V. Multivalent antigen-binding proteins
EP1137760A1 (en) 1998-12-11 2001-10-04 Unilever N.V. Bleaching enzymes and detergent compositions comprising them
ES2528794T3 (es) * 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US20030166160A1 (en) * 2001-09-06 2003-09-04 Hawley Stephen B. Compounds and molecular complexes comprising multiple binding regions directed to transcytotic ligands
US20030161809A1 (en) * 2000-10-02 2003-08-28 Houston L. L. Compositions and methods for the transport of biologically active agents across cellular barriers
EP1444267B1 (en) * 2001-10-15 2016-08-10 Immunomedics, Inc. Affinity enhancement agents
KR20040091616A (ko) * 2001-12-26 2004-10-28 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 Ｖｈ 및 ｖｌ 도메인으로부터 멀티특이성, 다원자가제제를 제조하는 방법
US20050069549A1 (en) 2002-01-14 2005-03-31 William Herman Targeted ligands
WO2004015425A1 (en) 2002-08-07 2004-02-19 Umc Utrecht Holding B.V. Modulation of platelet adhesion based on the surface exposed beta-switch loop of platelet glycoprotein ib-alpha
EP2390270A1 (en) 2003-01-10 2011-11-30 Ablynx N.V. Therapeutic polypeptides, homologues thereof, fragments thereof and for use in modulating platelet-mediated aggregation
WO2004094613A2 (en) * 2003-04-22 2004-11-04 Ibc Pharmaceuticals Polyvalent protein complex
AU2006205900B8 (en) 2005-01-14 2012-04-05 Ablynx N.V. Methods and assays for distinguishing between different forms of diseases and disorders characterized by thrombocytopenia and/or by spontaneous interaction between Von Willebrand Factor (vWF) and platelets
NZ563392A (en) 2005-05-20 2009-12-24 Ablynx Nv Improved Nanobodies(TM) for the treatment of aggregation-mediated disorders
US20090215992A1 (en) * 2005-08-19 2009-08-27 Chengbin Wu Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP2674440B1 (en) 2005-12-16 2019-07-03 IBC Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
EP2195341B1 (en) 2007-09-26 2017-03-22 UCB Biopharma SPRL Dual specificity antibody fusions
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
SG190572A1 (en) 2008-04-29 2013-06-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2010153578A (ru) * 2008-06-03 2012-07-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
CA2726087A1 (en) * 2008-06-03 2009-12-10 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2011104348A (ru) 2008-07-08 2012-08-20 Эбботт Лэборетриз (Us) Иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом против простагландина е2 и их применение
HUE033438T2 (en) 2008-09-26 2017-11-28 Ucb Biopharma Sprl Biological products
BRPI0922807A2 (pt) * 2008-12-04 2015-12-22 Abbott Lab imonuglobulinas de domínio variável duplo e usos dos mesmos
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
EP2417156B1 (en) * 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
KR20120060877A (ko) 2009-09-01 2012-06-12 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
RU2015153109A (ru) 2009-09-16 2019-01-15 Дженентек, Инк. Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применения
AU2010306677B2 (en) 2009-10-15 2013-05-23 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011068538A2 (en) * 2009-12-03 2011-06-09 Peal Biosciences, Llc General method for generating ultra-high affinity binding proteins
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
KR20130100118A (ko) 2010-08-03 2013-09-09 아비에 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
WO2012025530A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
CA2809433A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
SG191153A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Hoffmann La Roche Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
ES2549638T3 (es) 2011-02-28 2015-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Proteínas de unión a antígeno
TWI622597B (zh) 2011-03-28 2018-05-01 賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
KR101963230B1 (ko) 2011-12-26 2019-03-29 삼성전자주식회사 복수개의 단일 항체를 포함하는 단백질 복합체
TW201333035A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
KR20140127854A (ko) 2012-02-10 2014-11-04 제넨테크, 인크. 단일-쇄 항체 및 다른 이종다량체
RU2015100656A (ru) 2012-06-27 2016-08-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения конъюгатов fc-фрагмента антитела, включающих по меньшей мере одну связывающую группировку, которая специфически связывается с мишенью, и их применения
WO2014001324A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Hoffmann-La Roche Ag Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
KR101911438B1 (ko) 2012-10-31 2018-10-24 삼성전자주식회사 이중 특이 항원 결합 단백질 복합체 및 이중 특이 항체의 제조 방법
CA2890263C (en) 2012-11-01 2020-03-10 Abbvie Inc. Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US10329350B2 (en) 2012-12-26 2019-06-25 Industrial Technology Research Institute Method for producing a multivalent fab fragment with collagen-like peptide
WO2014144280A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17
MX2016003593A (es) 2013-10-11 2016-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos de cadena ligera variable comun intercambiada de dominio multiespecifico.
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
CN106103484B (zh) 2014-03-14 2021-08-20 诺华股份有限公司 针对lag-3的抗体分子及其用途
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
CN106687483B (zh) 2014-07-21 2020-12-04 诺华股份有限公司 使用人源化抗-bcma嵌合抗原受体治疗癌症
CN112481283A (zh) 2014-07-21 2021-03-12 诺华股份有限公司 使用cd33嵌合抗原受体治疗癌症
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
US20170209492A1 (en) 2014-07-31 2017-07-27 Novartis Ag Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
WO2016025880A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
MY189028A (en) 2014-08-19 2022-01-20 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
DK3194443T3 (da) 2014-09-17 2021-09-27 Novartis Ag Målretning af cytotoksiske celler med kimære receptorer i forbindelse med adoptiv immunterapi
CU20170052A7 (es) 2014-10-14 2017-11-07 Dana Farber Cancer Inst Inc Moléculas de anticuerpo que se unen a pd-l1
EP3227332B1 (en) 2014-12-03 2019-11-06 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
WO2016090034A2 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Novartis Ag Methods for b cell preconditioning in car therapy
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
SI3280729T1 (sl) 2015-04-08 2022-09-30 Novartis Ag Terapije CD20, terapije CD22 in kombinacija terapij s celico, ki izraža himerni antigenski receptor CD19 (CAR)
US20180298068A1 (en) 2015-04-23 2018-10-18 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
SI3317301T1 (sl) 2015-07-29 2021-10-29 Novartis Ag Kombinirane terapije, ki obsegajo molekule protitelesa na LAG-3
EP3316902A1 (en) 2015-07-29 2018-05-09 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
CA3007671A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
JP2019502695A (ja) 2015-12-17 2019-01-31 ノバルティス アーゲー ＰＤ−１に対する抗体分子とＣ−Ｍｅｔ阻害剤との組合せおよびその使用
EP3851457A1 (en) 2016-01-21 2021-07-21 Novartis AG Multispecific molecules targeting cll-1
EP3423482A1 (en) 2016-03-04 2019-01-09 Novartis AG Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
MX2018012615A (es) 2016-04-15 2019-05-30 Novartis Ag Composiciones y metodos para la expresion selectiva de proteinas.
US20210177896A1 (en) 2016-06-02 2021-06-17 Novartis Ag Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
JP7219376B2 (ja) 2016-07-15 2023-02-08 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体をキナーゼ阻害薬と併用して使用したサイトカイン放出症候群の治療及び予防
AU2017302668B9 (en) 2016-07-28 2023-06-22 Novartis Ag Combination therapies of chimeric antigen receptors and PD-1 inhibitors
CA3032581A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
AR110676A1 (es) 2016-10-07 2019-04-24 Novartis Ag Tratamiento del cáncer utilizando receptores de antígenos quiméricos
WO2018140725A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Novartis Ag Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
EP3589647A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Novartis AG Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
WO2018201051A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018201056A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
JP7433910B2 (ja) 2017-06-22 2024-02-20 ノバルティス アーゲー Ｃｄ７３に対する抗体分子及びその使用
WO2019006007A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Novartis Ag POSOLOGICAL REGIMES FOR ANTI-TIM3 ANTIBODIES AND USES THEREOF
MX2020000342A (es) 2017-07-11 2020-08-17 Compass Therapeutics Llc Anticuerpos agonistas que se unen a cd137 humano y sus usos.
JP2020527572A (ja) 2017-07-20 2020-09-10 ノバルティス アーゲー 抗ｌａｇ−３抗体の投薬量レジメンおよびその使用
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
JP2021503478A (ja) 2017-11-16 2021-02-12 ノバルティス アーゲー 組み合わせ治療
WO2019100052A2 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
US20210038659A1 (en) 2018-01-31 2021-02-11 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
US20210047405A1 (en) 2018-04-27 2021-02-18 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
WO2019226617A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Compositions and methods for enhancing the killing of target cells by nk cells
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2019241426A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
KR20210035173A (ko) 2018-06-19 2021-03-31 아타르가, 엘엘씨 보체 성분 5에 대한 항체분자 및 이의 용도
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
MX2021005594A (es) 2018-11-13 2021-10-22 Compass Therapeutics Llc Constructos multiespecificos de union contra moleculas de puntos de control y usos de los mismos.
JP2022514017A (ja) 2018-12-20 2022-02-09 ノバルティス アーゲー 医薬の組み合わせ
AU2019402189B2 (en) 2018-12-20 2023-04-13 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
CN109762067B (zh) * 2019-01-17 2020-02-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途
EA202192019A1 (ru) 2019-02-15 2021-11-02 Новартис Аг Производные 3-(1-оксо-5-(пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона и пути их применения
AU2020222346B2 (en) 2019-02-15 2021-12-09 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
US10871640B2 (en) 2019-02-15 2020-12-22 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects
EP3927371A1 (en) 2019-02-22 2021-12-29 Novartis AG Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
TW202102261A (zh) 2019-03-29 2021-01-16 美商艾特加有限責任公司 Fgf23之抗體分子及其用途
CN114786679A (zh) 2019-10-21 2022-07-22 诺华股份有限公司 具有维奈托克和tim-3抑制剂的组合疗法
MX2022004769A (es) 2019-10-21 2022-05-16 Novartis Ag Inhibidores de tim-3 y sus usos.
EP4065158A2 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Novartis AG Chimeric antigen receptors binding bcma and cd19 and uses thereof
WO2021123996A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
EP4090762A1 (en) 2020-01-17 2022-11-23 Becton, Dickinson and Company Methods and compositions for single cell secretomics
CN114980902A (zh) 2020-01-17 2022-08-30 诺华股份有限公司 用于治疗骨髓增生异常综合征或慢性粒单核细胞白血病的包含tim-3抑制剂和低甲基化药物的组合
EP4110377A2 (en) 2020-02-27 2023-01-04 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2021260528A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
TW202216761A (zh) 2020-07-16 2022-05-01 瑞士商諾華公司 抗β細胞素抗體、其片段及多特異性結合分子
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
CN116134027A (zh) 2020-08-03 2023-05-16 诺华股份有限公司 杂芳基取代的3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
WO2022043558A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
WO2022043557A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
EP4240765A2 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Novartis AG Antibody fc variants
MX2023005609A (es) 2020-11-13 2023-05-29 Novartis Ag Terapias de combinacion con celulas que expresan receptores quimericos para el antigeno (car).
JP2024505049A (ja) 2021-01-29 2024-02-02 ノバルティス アーゲー 抗ｃｄ７３及び抗ｅｎｔｐｄ２抗体のための投与方式並びにその使用
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
WO2023150778A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Visterra, Inc. Anti-idiotype antibody molecules and uses thereof
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5132405A (en) * 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
GB9221657D0 (en) 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant bispecific antibodies
JP3720353B2 (ja) * 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
ATE187494T1 (de) 1992-12-11 1999-12-15 Dow Chemical Co Multivalente einkettige antikörper
WO1997014719A1 (en) 1995-10-16 1997-04-24 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue

Also Published As

Publication number Publication date
EP0894135B1 (en) 2004-08-11
JP2000508892A (ja) 2000-07-18
AU2507397A (en) 1997-10-29
DK0894135T3 (da) 2004-12-06
WO1997038102A1 (en) 1997-10-16
EP0894135A1 (en) 1999-02-03
DE69730209D1 (de) 2004-09-16
US6239259B1 (en) 2001-05-29
DE69730209T2 (de) 2005-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2225961T3 (es) Proteina de union a antigeno multivalente y multiespecifica.
US5091513A (en) Biosynthetic antibody binding sites
ES2052027T5 (es) Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
US5476786A (en) Biosynthetic antibody binding sites
DE69333044T2 (de) LIGAND-BINDENDE VARIABELE DOMANE (V-MIN), DIE EINE "FRAMEWORK"-REGION ENTHÄLT MIT EINEM ZYKLISCH PERMUTIERTEN ZENTRALEN $g(b)-TUBUS
ES2162823T5 (es) Inmunoglobulinas desprovistas de cadenas ligeras.
ES2210832T3 (es) Secuencias de aminoacidos para uso terapeutico y profilactico contra enfermedades debidas a las toxinas de clostridium difficile.
ES2213148T3 (es) Anticuerpo monoclonal dirigido contra el vih.
JPH08503121A (ja) 中和反応性ヒト抗−ｇｐ１２０組換え抗体、それをコードするｄｎａおよびその使用
ES2288900T3 (es) Anticuerpo de origen humano para inhibir la agregacion de trombocitos.
CA2135408A1 (en) Chimeric multivalent protein analogues and methods of use thereof
WO1993015210A1 (en) Monomeric and dimeric antibody-fragment fusion proteins
WO1997014719A1 (en) A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
CA2087095A1 (en) Binding domains
JPH04502258A (ja) キメラ抗―ｃｅａ抗体
US20110136695A1 (en) Universal libraries for immunoglobulin
CN101155832A (zh) 抗体的改良方法
Anand et al. Synthesis and expression in Escherichia coli of cistronic DNA encoding an antibody fragment specific for a Salmonella serotype B O-antigen
ES2219640T3 (es) Anticuerpos monoclonales reformados contra un isotopo de inmunoglobulina.
AU613699B2 (en) Gene fragments coding for anti-hiv antibody variable region, anti-hiv chimeric antibody expressed using the same, and process for preparation thereof
McCarthy et al. Altering the fine specificity of an anti-Legionella single chain antibody by a single amino acid insertion
Pollock et al. Monoclonal antibodies: a powerful tool for selecting and analyzing mutations in antigens and antibodies
KR100467706B1 (ko) Ｂ형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간항체
Lafaye et al. Similar binding properties for a neutralizing anti-tetanus toxoid human monoclonal antibody and its bacterially expressed Fab
CN115028714A (zh) 一种检测冠状病毒的抗体及其应用